Структура и генетика биосинтеза О-антигенов энтеробактерий рода Providencia тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Овчинникова, Ольга Геннадьевна

• Овчинникова, Ольга Геннадьевна
• кандидат химических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат химических наук Овчинникова, Ольга Геннадьевна

1 ВВЕДЕНИЕ.

2 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

Биосинтез липополисахаридов грамотрицательных бактерий

2.1 Общая характеристика липополисахарида.

2.2 Биосинтез нуклеотидных предшественников Сахаров.

2.3 Биосинтез кора-липида А.

2.4 Биосинтез О-антигена.

2.5 Лигирование и экспорт липополисахарида на внешнюю мембрану.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1 Классификация бактерий рода Providencia.

3.2 Установление строения О-полисахаридов бактерий Providencia.

3.2.1 Общие подходы к структурному анализу О-полисахаридов.

3.2.2 Строение О-полисахаридов различных О-серогрупп.

3.3 Характеристика генных кластеров О-антигенов Providencia.

3.3.1 Локализация и организация генных кластеров О-антигенов.

3.3.2 Функциональный анализ генов гп silico.

3.3.3 Биохимическое подтверждение функций генов биосинтеза GDP-колитозы.

4 ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1 Особенности состава и строения О-антигенов Providencia.

4.2 Серологические взаимосвязи О-антигенов Providencia и других бактерий.

4.3 Генетика биосинтеза О-антигенов Providencia.

5 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

5.1 Бактериальные штаммы и выращивание бактерий.

5.2 Выделение и деградация липополисахаридов.

5.3 Химические и физические методы.

5.4 Генетические и биохимические методы.

ВЫВОДЫ.

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структура и генетика биосинтеза О-антигенов энтеробактерий рода Providencia»

Соматические О-антигены наряду с капсульными К-антигенами и жгутиковыми Н-антигенами представляют собой три основных типа биомолекул, на которых традиционно основывается серологическая классификация и идентификация грамотрицательных бактерий. С химической точки зрения О-антиген или О-специфический полисахарид (О-полисахарид) представляет собой полисахаридную цепь Б-формы липополисахарида (ЛПС). Липидная часть ЛПС (липид А) образует внешний слой бислойной наружной мембраны клеточной стенки и удерживает молекулу ЛПС на поверхности клетки за счет гидрофобных взаимодействий с фосфолипидами, образующими внутренний слой мембраны. Липид А также отвечает за большинство биологических активностей ЛПС, в том числе за его узнавание специфическими клеточными рецепторами иммунной системы хозяина, служащее сигналом для включения защитных механизмов врожденного иммунитета. О-Полисахарид обычно построен из повторяющихся олигосахаридных единиц (О-звеньев) и присоединяется к липиду А через олигосахарид, называемый кором. Он ориентирован в сторону окружающей среды и несет на себе иммунодетерминанты (эпитопы), которые являются сайтами связывания для специфических антител, вырабатываемых иммунной системой в ответ на инфекцию и необходимых для эффективного фагоцитоза. В ходе эволюции сформировалось широкое структурное разнообразие О-антигенных форм даже у бактерий одного вида, что, как полагают, способствует адаптации бактерий в различных экологических нишах, а также помогает патогенам избегать адаптивного иммунитета организма-хозяина. Иммуноспецифичность и вариабельность О-антигенов служат основой для разработки серологических классификаций медицински значимых микроорганизмов, востребованных при серодиагностике бактериальных инфекций и эпидемиологическом мониторинге. В этих классификациях серологически идентичные штаммы одного вида или нескольких близкородственных видов бактерий объединены в О-серогруппы.

В последнее время активно развиваются методы молекулярного типирования бактерий, такие как полимеразная цепная реакция и технология на основе микрочипов. На генетическом уровне различия между структурами О-полисахаридов бактериальных клонов обусловлены полиморфизмом генного кластера О-антигена (ГКО) - определенного локуса генома, отвечающего за биосинтез О-антигена. Секвенирование и последующий анализ ГКО позволяют выявлять гены, специфичные для каждой О-серогруппы, и использовать их в качестве специфических маркеров для молекулярного типирования штаммов. Функциональный анализ генов, участвующих в сборке и полимеризации О-звеньев, имеет практическое значение для разработки биотехнологических подходов к получению гликовакцин нового поколения, в которых требуемые фрагменты О-полисахаридов частично или полностью продуцируются in vivo. Структурно-генетические исследования О-антигенов ставят своей целью также ряд фундаментальных задач, таких как изучение молекулярных и. механистических основ биосинтеза гликоконьюгатов и выяснение эволюционных путей формирования разнообразия О-антигенных форм.

Настоящая работа посвящена установлению строения О-полисахаридов и характеристике ГКО представителей рода Providencia семейства энтеробактерий (Enterobacteriaceae). Провиденсии широко распространены в природе. Они обитают в почве, сточных водах и загрязненных водоемах; их также выделяют из большого круга живых организмов по всему миру от насекомых до акул, морских черепах и пингвинов. Бактерии Providencia составляют часть нормальной микрофлоры кишечника человека, но в то же время они являются условными патогенами, вызывая у людей с ослабленным иммунитетом воспаления мочеполовых путей, раневые инфекции и кишечные заболевания. Нередко они становятся причиной внутрибольничных инфекций.

Объектом настоящей работы стали три наиболее важных в медицинском отношении вида Providencia - P. alcalifaciens, P. stuartii и P. rustigianii. Начиная с конца 1990-х годов, систематическое химическое и иммунохимическое изучение ЛПС этих бактерий проводится в лаборатории химии углеводов ИОХ РАН совместно с Институтом микробиологии, биотехнологии и иммунологии Университета Лодзи (Польша). Оно ставит своей основной целью создание молекулярной основы для классификации провиденсий. Объединенная серологическая классификация рассматриваемых трех видов Providencia включает 63 О-серогруппы, из которых к началу нашей работы в отношении строения О-полисахаридов были изучены 13 О-серогрупп. В ходе данного исследования установлены структуры О-антигенов еще 23 О-серогрупп. Наряду с распространенными компонентами бактериальных полисахаридов, в их составе, обнаружены и идентифицированы производные моносахаридов, редко встречающиеся в природных гликополимерах или найденные впервые. Выявлена корреляция структурных данных с иммуноспецифичностью О-антигенов, что позволило обосновать на молекулярном уровне серологическое родство внутри рода Providencia и между штаммами этого и других родов энтеробактерий {Proteus, Escherichia, Salmonella).

Еще одной целью работы было изучение генетики биосинтеза О-антигенов Providencia, первым этапом которого стал поиск ГКО в полногеномных последовательностях штаммов трех видов Providencia, имеющихся в доступной базе генетических данных. Локализация полиморфного ГКО на хромосоме между консервативными генами «домашнего хозяйства» срхА и yibK дала возможность разработать праймеры и провести секвенирование области cpxA-yibK в штаммах 8 О-серогрупп. Биоинформатический анализ на основе гомологии предсказанных аминокислотных последовательностей и с учетом полученных данных о строении О-полисахаридов позволил выявить характерные особенности организации ГКО и предположительно определить функции генов, кодирующих ферменты биосинтеза О-антигенов, включая синтез специфических моносахаридных компонентов О-полисахаридов. Нуклеотидные последовательности ГКО Providencia, депонированные в международную базу данных GenBank, могут быть использованы для разработки методов молекулярного типирования изолятов провиденсий и молекулярной диагностики вызываемых ими инфекций.

Результаты работы опубликованы в 24 статьях [1-24] и 9 тезисах докладов и представлены автором на III Немецко-польско-российской конференции по бактериальным углеводам (Вроцлав, Польша, 2004 г.), XIV и XV Европейских симпозиумах по углеводам (Любек, Германия, 2007 г.; Вена, Австрия, 2009 г.), XXIV и XXVI Международных симпозиумах по углеводам (Осло, Норвегия, 2008 г.; Мадрид, Испания, 2012 г.), XII Всероссийской молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, 2009 г.), IV и V Балтийских конференциях по микробным углеводам (Хюитиэле, Финляндия, 2010 г.; Суздаль, 2012 г.) и Летней исследовательской конференции FASEB «Микробные полисахариды, имеющие значение для медицины, сельского хозяйства и промышленности» (Кэрфри, Аризона, США, 2011 г.).

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов, а также включает список литературы, список сокращений и приложения (табулированные данные спектров ЯМР, характеристика генов в генных кластерах О-антигенов). Литературный обзор посвящен биосинтезу липополисахаридов грамотрицательных бактерий. Глава «Результаты» начинается со вступительного раздела, затрагивающего вопросы таксономической и серологической классификации провиденсий, за которым следуют два основных раздела В первом разделе описана общая стратегия структурного анализа и приведены данные по установлению строения О-полисахаридов провиденсий. Второй раздел посвящен локализации и биоинформатическому анализу секвенированных ГКО Providencia с использованием полученных структурных данных, а также биохимическому подтверждению функций генов пути биоснтеза нуклеотидного предшественника 3,6-дидезокси-ь-лгшю-гексозы (колитозы) - одного из редко встречающихся компонентов гликополимеров. В главе «Обсуждение» рассматриваются особенности состава и строения всех 36 изученных к настоящему времени О-полисахаридов Providencia, дается обоснование иммуноспецифичности О-антигенов на уровне их детального химического строения, обсуждаются сходство и отличия ГКО Providencia от ГКО других энтеробактерий, подчеркивается фундаментальное и практическое значение проведенного исследования. Работа изложена на 164 страницах, содержит 43 рисунка, 33 таблицы и 215 литературных ссылок.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Овчинникова, Ольга Геннадьевна, 2013 год

1.S., Ovchinnikova O.G, Kocharova N.A., Blaszczyk A., Toukach F.V., Torzewska A., Shashkov A.S., Knirel YA., Rozalski A. Structure of the O-polysaccharide of Providencia stuartii 049 // Carbohydr. Res. 2004,339,1557-1560.

2. Ovchinnikova O.G, Kocharova N.A., Bakinovskiy L.V., Torzewska A., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Rozalski A. The structure of the O-polysaccharide from the lipopolysaccharide of Providencia stuartii 047 // Carbohydr. Res. 2004,339,2621-2626.

3. Kocharova N.A., Ovchinnikova O.G, Torzewska A., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Rozalski A. The structure of the O-polysaccharide from the lipopolysaccharide of Providencia alcalifaciens 030 // Carbohydr. Res. 2006,341, 786-790.

4. Ovchinnikova O.G., Kocharova N.A., Wykrota M., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Rozalski A. Structure of a colitose-containing O-polysaccharide from the lipopolysaccharide of Providencia alcalifaciens 06 // Carbohydr. Res. 2007,342,2144-2148.

5. Kocharova N.A., Kondakova A.N., Vinogradov E., Ovchinnikova O.G, Lindner B., Shashkov A.S., Rozalski A., Knirel Y.A. Full structure of the carbohydrate chain of the lipopolysaccharide of Providencia rustigianii 034 // Chem. Eur. J. 2008,14, 6184-6191.