Выявление герпесвируса сибирского осетра с помощью ПЦР в режиме реального времени и молекулярно-генетическая характеристика изолятов вируса тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.02, кандидат наук Калабекова, Фатима Султанхамидовна

• Калабекова, Фатима Султанхамидовна
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Калабекова, Фатима Султанхамидовна

1.1 Актуальность работы.................................................................................8

1.2 Степень разработанности проблемы........................................................9

1.3 Цель и задачи исследований....................................................................10

1.4 Научная новизна результатов исследований.........................................11

1.5 Теоретическая и практическая значимость работы..............................11

1.6 Степень достоверности и апробация работы.........................................11

1.7 Соответствие содержания диссертации паспорту специальности, по которой она рекомендуется к защите...........................................................12

1.8 Публикации...............................................................................................13

1.9 Структура и объем диссертации.............................................................13

1.10 Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту..............................................................................................................13

1.11 Личный вклад автора в выполнение работы........................................14

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................15

2.1 Состояние осетроводства в мире и проблемы его развития................15

2.2 Вирусы и вирусные болезни рыб............................................................16

2.3 Герпесвирусы рыб....................................................................................19

2.4 Герпесвирусы осеровых рыб...................................................................23

2.5 Герпесвирусная болезнь сибирского осетра..........................................24

2.6 Эпизоотологические особенности герпесвируса сибирского осетра..25

2.7 Свойства возбудителя герпесвируса сибирского осетра......................26

2.8 Клинические признаки и патологоанатомические изменения.............27

2.9 Диагностика герпесвирусной болезни сибирского осетра..................30

2.10 Профилактика герпесвирусной болезни сибирского осетра..............33

2.11 Филогенетический анализ генома герпесвирусов рыб.......................34

2.12 Заключение по обзору литературы.......................................................40

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.....................................................42

3.1 Материалы.................................................................................................42

3.1.1 Вирус....................................................................................................42

3.1.2 Рыба......................................................................................................43

3.1.3 Культуры клеток.................................................................................43

3.1.4 Плазмида и бактериальные штаммы.................................................43

3.1.5 Питательные среды, дезагрегирующие растворы, сыворотка и антибиотики..................................................................................................43

3.1.6 Растворы и реактивы..........................................................................44

3.1.7 Лабораторное оборудование и принадлежности.............................45

3.2 Методы.......................................................................................................46

3.2.1 Расчет праймеров и зонда..................................................................46

3.2.2 Выделение ДНК..................................................................................47

3.2.3 Оценка специфичности тест-системы..............................................47

3.2.4 Параметры постановки ПЦР с электрофоретической детекцией и ПЦР в режиме реального времени.............................................................47

3.2.5 Оценка аналитической чувствительности тест-системы................48

3.2.6 Оценка воспроизводимости тест-системы.......................................49

3.2.7 Нуклеотидное секвенирование и филогенетический анализ.........49

3.2.8 Культивирование герпесвируса сибирского осетра в перевиваемых культурах клеток осетровых рыб и определение его инфекционной активности....................................................................................................49

3.2.9 Экспериментальное заражение рыб..................................................50

3.2.10 Выделение вируса от зараженных рыб...........................................50

3.2.11 Программное обеспечение и интернет-ресурсы............................50

3.2.12 Статистическая обработка результатов исследований.................50

3.3 Результаты собственных исследований.................................................50

3.3.1 Разработка тест-системы для выявления генома герпесвируса сибирского осетра на основе ПЦР в режиме реального времени...........50

3.3.2 Определение специфичности тест-системы для выявления герпесвируса сибирского осетра................................................................54

3.3.3 Оценка аналитической чувствительности тест-системы................56

3.3.4 Оценка повторяемости результатов, полученных при использовании тест-системы......................................................................57

3.3.5 Схема подготовки проб различных органов и тканей рыб и оценка их диагностической ценности....................................................................59

3.3.6 Сравнительная эффективность выявления герпесвируса сибирского осетра на основе ПЦР в режиме реального времени и вирусовыделения в культуре клеток..........................................................61

3.3.7 Конструирование рекомбинантного положительного контроля амплификации к тест-системе для выявления генома герпесвируса сибирского осетра........................................................................................63

3.3.8 Молекулярно-генетическая характеристика изолятов вируса.......66

3.3.9 Мониторинговые исследования осетроводных хозяйств на наличие герпесвируса сибирского осетра.................................................74

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ........................80

5. ВЫВОДЫ......................................................................................................86

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.....................................................87

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ...................................88

ПРИЛОЖЕНИЯ.............................................................................................104

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

а.о. - аминокислотные основания Бестер - гибрид белуга х стерлядь; БОЕ - бляшкообразующая единица;

ВНИИВВиМ - Всероссийский научно-исследовательский институт

ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии;

ВНИТиБП - Всероссийский научно-исследовательский и технологический

институт биологической промышленности;

ВВК - весенняя виремия карпа;

ВГС - вирусная геморрагическая септицемия;

ГНУ - государственное научное учреждение;

ГТЦ - гуанидинтиацианат;

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

ИФА - иммуноферментный анализ;

КЗТО - Конаковский завод товарного осетроводства;

КЗ-контрольное заражение;

мРНК - матричная РНК;

НТР - нетранс л ируемый регион;

MEM - минимально необходимая среда Игла;

мкл - микролитр;

мМ - миллимоль;

МЭБ - Международное Эпизоотическое Бюро;

НТД-нормативно-техническая документация

н.о. - нуклеотидные основания;

нм - нанометр;

п.о.- пар оснований;

ПК - положительный контроль;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

PH - реакция нейтрализации;

РТГА - реакция торможения гемагглютинации;

РФ - Российская Федерация;

С - цитозин;

СПК - сыворотка крови плода коровы; США -Соединенные Штаты Америки; Т - тимидин;

ТАЕ - трис-ацетатный буфер; ТУ-технические условия;

ТФ ИФА - твердофазный иммуноферментный анализ;

ТЦД5о - тканевая цитопатогенная доза, вызывающая поражение 50%

ФГУ - федеральное государственное учреждение;

ФГУП ВНИИПРХ - Федеральное государственное унитарное предприятие

Всероссийский научно-исследовательский институт пресноводного

рыбного хозяйства;

ЦПД - цитопатогенное действие;

ЦПЭ - цитопатический эффект;

ЭДТА (EDTA) - этилендиаминтетрауксусная кислота;

2МЕМ - минимально необходимая среда Игла с двойным набором;

А - аденин;

dNTPs - дезоксирибонуклеотидтрифосфаты; F - прямой праймер (forward); G - гуанидин;

IHN - инфекционный некроз гемопоэтической ткани лососевых; IPN - инфекционный некроз поджелудочной железы; R - обратный праймер (reverse); SbSHV - герпесвирус сибирского осетра;

SSO-2- перевиваемая линия клеток пула печени, почки, селезенки сибирского осетра, Acipenser baeri;

VHSV - вирусная геморрагическая септицемия

WSS-2 - перевиваемая линия клеток селезенки белого осетра, Acipenser trans montanus.

SPD -Болезнь поджелудочной железы атлантического лосося/

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Выявление герпесвируса сибирского осетра с помощью ПЦР в режиме реального времени и молекулярно-генетическая характеристика изолятов вируса»

1.1 Актуальность работы

В связи с угрозой исчезновения ценных видов осетровых рыб и возрастающим спросом на товарную осетровую продукцию в последние годы все большее развитие получает индустриальное осетроводство. В то же время интенсификация аквакультуры осложняется возникновением болезней гидробионтов. По данным Международного эпизоотического бюро основной ущерб мировой аквакультуре наносят вирусные болезни рыб [39].

В середине восьмидесятых годов двадцатого века в США от осетровых рыб был выделен первый вирус - иридовирус [36]. В результате мониторинга внутренних водоемов страны и регулярных обследований рыбоводных хозяйств позднее были выделены и другие вирусы от осетровых рыб. В настоящее время у североамериканских осетровых обнаружено 10 разных вирусов, из которых наиболее опасны - аденовирус, иридовирус и два герпесвируса белого осетра. Эти вирусы вызывают болезни у мальков и сеголетков белого осетра, являющегося главным объектом осетроводства США [36; 75; 76]. Помимо США вирусы у осетровых были обнаружены в Италии и Бельгии [69].

Первое сообщение об обнаружении вирусной болезни осетровых рыб, в Российской Федерации, появилось в 2006 г., когда в весенний период в Тверской области на Конаковском заводе товарного осетроводства началась массовая гибель молоди сибирского осетра {АЫрепзег Ъаегг) с признаками некрогеморрагического синдрома, типичными для герпесвирусной инфекции. Выявленный патоген был изучен и идентифицирован как герпесвирус сибирского осетра [23].

Мировая аквакультура развивается столь высокими темпами, что возможности ветеринарной науки по разработке средств и методов борьбы с болезнями существенно отстают от запросов практики. Исходя из этого,

МЭБ определило главным направлением борьбы с болезнями культивируемых гидробионтов профилактику заболеваний, основным принципом которой является предотвращение проникновения патогенов в регионы, где они прежде отсутствовали. Это достигается путем проведения эпизоотологического мониторинга на рыбоводных предприятиях и регулированием межхозяйственных перевозок объектов разведения с учетом полученных при этом результатов.

В настоящее время в Российской Федерации утвержден только один метод идентификации выделяемых изолятов герпесвируса сибирского осетра - реакция нейтрализации с использованием референсной гипериммунной антисыворотки, получаемой во ВНИИВВиМ [30].

Данная реакция обладает известными достоинствами, но требует предварительного выделения вируса в культуре клеток, и поэтому ее использование затруднено при исследовании большого количества полевых материалов. Существенным недостатком реакции является невозможность определения с ее помощью филогенетических взаимоотношений выделенных изолятов, что достигается только с использованием молекулярно-биологических методов, в том числе и ПЦР, которая является главным инструментом активно развивающейся сегодня молекулярной эпизоотологии вирусных инфекций рыб [19].

1.2 Степень разработанности проблемы

Изучению биологических, физико-химических и в меньшей мере молекулярно-генетических свойств герпесвируса сибирского осетра посвящена работа А.И. Щелкунова. В данной работе представлено описание выявленной болезни и свойств вируса-возбудителя, оптимизированы условия его культивирования, определено таксономическое положение [20].

Работа И.Б. Прокаевой посвящена изучению гуморального иммунного ответа осетровых рыб при герпесвирусной болезни сибирского

осетра, предложен способ выявления противогерпетических антител в сыворотках крови осетровых рыб на основе твердофазного иммуноферментного анализа для ретроспективной диагностики данной болезни [16].

Однако недостаточно изучены молекулярно-генетические свойства выделенных изолятов герпесвируса сибирского осетра [58; 59]. Не разработаны методы молекулярно-генетической диагностики герпесвирусной инфекции осетровых рыб, основанных на использовании полимеразной цепной реакции (ПЦР), отличающихся высокой чувствительностью и специфичностью получаемых результатов [142].

1.3 Цель и задачи исследований

Целью исследования являлась разработка тест-системы для выявления ДНК герпесвируса сибирского осетра на основе ПЦР в режиме реального времени и проведение молекулярно - генетического анализа изолятов вируса.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) С использованием данных ОепВапк рассчитать специфичные праймеры и зонд, определить оптимальные условия проведения ПЦР в режиме реального времени;

2) Разработать тест-систему для выявления ДНК герпесвируса сибирского осетра методом ПЦР в режиме реального времени и рекомбинантный положительный контроль для тест-системы;

3) Отработать методику пробоподготовки и оценить диагностическую ценность проб различных органов и тканей рыб для выявления ДНК герпесвируса сибирского осетра методом ПЦР в режиме реального времени;

4) Определить филогенетические взаимоотношения выделенных изолятов герпесвируса сибирского осетра.

и

1.4 Научная новизна результатов исследований

Впервые разработана тест-система на основе ПЦР в режиме реального времени для выявления ДНК герпесвируса сибирского осетра в пробах инфицированных культур клеток, органов и тканей рыб.

Впервые в Российской Федерации определены нуклеотидные последовательности фрагментов гена ДНК-пролимеразы штамма SK1/0406 и изолятов герпесвируса сибирского осетра, выделенных на территории нашей страны.

1.5 Теоретическая и практическая значимость работы

Разработана методика выявления ДНК герпесвируса сибирского осетра методом ПЦР в режиме реального времени.

Проведен молекулярно-генетический анализ участков гена ДНК-полимеразы штамма SKI/0406 и 8 изолятов герпесвируса сибирского осетра, выделенных в период 2006-2013 гг., и изучены их филогенетические взаимоотношения.

Разработаны «Методические положения по выявлению ДНК герпесвируса сибирского осетра методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени», утвержденные академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии A.M. Смирновым 28.05.2012 г.

1.6 Степень достоверности и апробация работы

Степень достоверности результатов проведённых исследований подтверждена статистическими исследованиями и комиссионными испытаниями. Акт комиссионных испытаний утвержден директором ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии 31.10.2011 г. Статистическая обработка включала расчёты средних арифметических значений, стандартных отклонений результатов полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, вычисления эволюционных дистанций с помощью программы «MEGA 5.0». Научные положения, выводы и практические

предложения диссертационной работы аргументировано отражают содержание диссертации.

Результаты исследований, выполненных по теме диссертационной работы, представлены, заслушаны и обсуждены на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (Покров 2010-2013 гг.), Международной научно-практической конференции (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, Покров, 2011 г.), Международной конференции «Проблемы патологии, иммунологии и охраны здоровья рыб и других гидробионтов» (Борок - Москва, 2011 г.), Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения» (УГСХА им. П.А. Столыпина, Ульяновск, 2012 г.; ГНУ ВНИТиБП Россельхозакадемии, Щелково, 2012 г.).

1.7 Соответствие содержания диссертации паспорту специальности, по которой она рекомендуется к защите

В соответствии с формулой специальности 03.02.02 Вирусология, охватывающей проблемы исследования вирусов, генетики, биохимических и молекулярно-генетических аспектов, разработки мер диагностики вызываемых вирусами заболеваний, включая области исследований: проблемы генетики вирусов, структурной организации генома вирусов, проблемы генной инженерии, разработки мер диагностики вирусных заболеваний, совершенствование лабораторных диагностических систем, в диссертационной работе описано проведение исследований по созданию тест-системы на основе полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, использование которой позволяет идентифицировать ДНК герпесвируса сибирского осетра. Также представлены результаты разработки рекомбинантной конструкции на основе плазмидного вектора, применяемого в качестве положительного контроля амплификации в данной тест-системе. Определены нуклеотидные последовательности

участка гена ДНК- полимеразы штамма ЭК 1/0406 и 8 изолятов герпесвируса сибирского осетра, выделенных на территории Российской Федерации. Проведён филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей, полученных в данной работе. Результаты научного исследования соответствуют пунктам паспорта специальности 4, 5, 10.

1.8 Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 1 статья в журнале «КубГАУ», включённом в перечень изданий, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации.

1.9 Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 105 страницах машинописного текста и состоит из разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения, список использованной литературы, включающий 34 отечественных и 108 иностранных источников; дополнена приложениями.

Диссертация содержит 11 таблиц и 22 рисунка. В приложении представлены документы, подтверждающие достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.

1.10 Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту

1) Разработанная тест-система на основе ПЦР в режиме реального времени позволяет выявлять ДНК герпесвируса сибирского осетра методом в инфицированных культурах клеток, проб органов и тканей рыб.

2) Метод изоляции герпесвируса сибирского осетра в культуре клеток и полимеразная цепная реакция в режиме реального времени позволяют выявить ДНК вируса на разных стадиях течения инфекционного процесса

3) Результаты сравнительного анализа нуклеотидного состава участка гена ДНК-полимеразы штамма 8К1/0406 и 8 изолятов герпесвируса сибирского осетра, выделенных на территории Российской Федерации, и их филогенетические взаимоотношения.

1.11 Личный вклад автора в выполнение работы Основной объем исследований проведен автором самостоятельно. Отдельные этапы исследований выполнены при консультативной и практической помощи сотрудников лабораторий Здоровья гидробионтов и Биофизики ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Состояние осетроводства в мире и проблемы его развития

В природных условиях резко снижается численность осетров. Они на грани исчезновения в Европе, и сейчас состояние их в Каспийском море находится на критическом уровне. Специалисты из Италии, Венгрии, России, Узбекистана, Азербайджана, Румынии, Казахстана и Китая обобщили данные о сохранении осетровых и состоянии управления их запасами в Евразии [98]. Повсеместное снижение их численности свидетельствует о неадекватности практических мер по их сохранению в природе. В США пять из десяти видов осетрообразных отнесены к категории исчезающих. В мире 41% видов находится под угрозой исчезновения, 22% относятся к категории уязвимых.

Одной из причин, приведших к данной ситуации, является коренное изменение среды обитания и прежде всего отсутствие условий для размножения. Осетровых будет столько, сколько способны воспроизвести их специализированные заводы и сколько сможет родиться в оставшихся природных нерестилищах. Для решения этой проблемы требуются большие капиталовложения и, главное, длительный период [3].

Следующая причина - незаконный вылов, или браконьерство. Нелегальный лов сейчас в 10-12 раз выше, чем легальный промысел. Это уже проблема государственного уровня.

В США и Европе развита коммерческая осетроводная культура. Мировая практика свидетельствует о том, что в тех районах, где крупномасштабный промысел давно не ведется, а осуществляются охранные меры с целью поддержания оставшихся в природе популяций, производство товарной осетрины сосредоточено в коммерческой аквакультуре. Существует высокая заинтересованность в создании новых коммерческих хозяйств. Предполагается, что товарное производство продуктов из осетрины в перспективе полностью перекроет объем их

экспорта из природных систем.

2.2 Вирусы и вирусные болезни рыб

Серьезным препятствием на пути успешного развития аквакультуры являются болезни объектов культивирования, из которых основной ущерб наносят вирусные болезни рыб [75]. Подтверждением тому служит список наиболее опасных (декларируемых) болезней гидробионтов, приводимый в «Кодексе здоровья водных животных» МЭБ [14].

В целом эпизоотическая обстановка по вирусным болезням рыб в РФ неблагополучная. Это обусловлено наличием у культивируемых в стране рыб опасных вирусных инфекций, среди которых две относятся к МЭБ-декларируемым, неопределенностью эпизоотического статуса по вирусным инфекциям практически всех рыбоводных хозяйств и отсутствием реального ветеринарного контроля межхозяйственных перевозок, экспорта и импорта рыбы и оплодотворенной икры [14].

Наиболее распространенными вирусными болезнями в отечественном рыбоводстве во времена СССР были весенняя виремия карпа (ВВК) и вирусная геморрагическая септицемия радужной форели (ВГС). Обе эти инфекции являются МЭБ-декларируемыми. Природные очаги ВВК существовали в Краснодарском крае и Ростовской области, Центральной черноземной зоне, Украине, Молдавии и Белоруссии. Болезнь была отмечена в Литве и Грузии. С 2003 г. ВВК регистрируют в рыбоводных хозяйствах Московской области [33; 34]. ВГС широко распространена в европейских странах с развитым форелеводством, обнаружена в США и Канаде. Вспышки заболевания отмечены в Финляндии, Норвегии и Швеции, странах Балтии, Абхазии и Краснодарском крае, на Украине. Резервуары инфекции существуют в Балтийском и Северном морях, а также в Тихом океане, у побережья США, Канады и Японии.

Начиная с 2000 г., на рыбоводных предприятиях России были

зарегистрированы две экзотические вирусные инфекции - инфекционный некроз гемопоэтической ткани лососевых рыб (IHN) и инфекционный некроз поджелудочной железы (IPN), из которых первая является МЭБ-декларируемой, а вторая находится в списке III Евросоюза. Оба инцидента (первый - в Московской области, второй - в Мурманской области) были связаны с завозом оплодотворенной икры или рыбопосадочного материала (в первом случае - внутри страны, во втором - из Норвегии. С 2001 г. вирус IHN регулярно обнаруживают у тихоокеанских лососевых (нерка), заходящих на нерест в реки Камчатки. При этом, вспышки заболевания были зарегистрированы как на лососевых рыбоводных заводах, так и у диких рыб.

Двигаясь вдоль границы России с запада на восток, можно наблюдать следующее изменение эпизоотической ситуации. Наибольшую угрозу представляет Норвегия с ее высоко интенсивными формами морской аквакультуры. Здесь имеется несколько не установленных в России вирусных инфекций, проходящих по спискам МЭБ и ЕЭС, из которых наиболее опасны инфекционная анемия атлантического лосося, болезнь поджелудочной железы атлантического лосося, нодавироз, инфекционный некроз поджелудочной железы и вирусная геморрагическая септицемия ВГС. Указанные болезни, за исключением ВГС, в Норвегии широко распространены, а IPN регистрируют практически во всех морских лососевых хозяйствах страны. Значительно лучше положение в Финляндии и Швеции, где интенсивность аквакультуры не столь высока. Однако и там время от времени регистрируют случаи появления ВГС и IPN, причем в Финляндии в последнее время участились вспышки ВГС у радужной форели в морских садковых хозяйствах, расположенных в Финском заливе. В этой связи необходимо заметить, что Балтийское и Северное моря, как недавно было установлено, являются большим природным очагом данной инфекции. Прибалтийские государства сегодня едва ли представляют

какую-либо угрозу, но риск завоза ВГС оттуда все же нельзя недооценивать. Беларусь, Украина и Молдова опасны завозом новых штаммов вируса SVC, а Украина и Грузия таят в себе угрозу VHS. Далее до самых восточных границ России ситуация неясная, хотя и менее напряженная, чем на западе. Исключение составляет Каспийское море, где в 2004 г. иранскими исследователями был установлен нодавироз у кефалевых рыб. Это первая вирусная болезнь рыб, достоверно диагностированная в акватории Каспия. Вспышки болезни носят массовый характер и сопровождаются высоким уровнем смертности рыбы. На Дальнем Востоке существует риск проникновения таких опасных агентов и болезней как вирус геморрагической болезни белого и черного амуров, SVC, IHN, ВГС, герпесвирус лососевых типа 2 (SalHV-2), герпесвирус кои-карпа (KHV), нодавироз (VNN) и др. из Китая, Японии и стран Юго-Восточной Азии. На Камчатке в дополнение к уже выявленному там IHN существует реальная угроза появления VHS, которая может быть занесена мигрирующими лососевыми, как это имело место в США и Канаде.

За рубежом выявлено около 10 вирусов осетровых рыб, из которых наиболее опасными являются вирусы семейств Adenoviridae, Iridoviridae, Herpesviridae. До 2006 г. в России вирусологические исследования осетровых носили эпизодический характер. Тогда впервые на территории Российской Федерации от сибирского осетра был выделен герпесвирус. Первая вспышка была в Тверской области. На сегодняшний день болезнь регистрируют в Ленинградской, Тульской, Вологодской, Псковской, Смоленской, Ижевской областях, в республике Бурятия, а также в Казахстане и Финляндии. В связи с активным развитием как мирового, так и отечественного осетроводства распространение указанного вируса может существенно повлиять на состояние данной отрасли. Поэтому большое внимание уделяется разработке методов диагностики герпесвируса сибирского осетра, необходимых для предотвращения проникновения

патогена на новые территории.

2.3 Герпесвирусы рыб

Герпесвирусы вызывают заболевания многих представителей животного мира, включая людей, обезьян, птиц, крупный рогатый скот, лошадей, тюленей и морских котиков, собак, грызунов, змей, черепах, лягушек, устриц и рыб. Герпесвирусы, поражающие рыб, вызывают несколько серьёзных болезней, а некоторые из них регулируются государственными и международными законами. Во избежание серьёзных экономических потерь, причинения ущерба для репутации производителя и потери доступа к рынкам сбыта предпринимателям, занимающимся разведением рыбы, необходимо знать об этих заболеваниях.

Герпесвирус американского канального сома 1&а1игт рипс(а(т

Герпесвирус рыб впервые был выявлен при остром заболевании американского канального сома, Ша1игт рипМаШя, в юго-западной части США. Болезнь сопровождалась массовой гибелью молоди массой до 10 г. Производители, рыбы с большой массой тела и другие виды рыб к данному вирусу невосприимчивы. У заболевших рыб на брюшке и у основания плавников наблюдали геморрагии, увеличение брюшка, экзофтальм и бледность жабр. В скелетной мускулатуре, печени, почках и селезенке при вскрытии отмечали геморрагии, в желудке и в полости тела обнаруживалась жидкость желтоватого цвета. Перенесшие болезнь мальки отставали в росте.

В наибольших концентрациях вирус содержался в почках, печени и кишечнике, а также вирус был выделен из селезенки, мозга и мышц.

Вспышки болезни происходили при температуре воды 25 °С и выше. При снижении температуры воды с 28°С до 19°С уменьшился процент гибели инфицированных рыб с 98% до 14%.

В разгар эпизоотии или в последующие несколько дней вирус без труда выделяли от больных мальков и сеголетков.

Наиболее чувствительны к данному вирусу клеточные линии, полученные из тканей икталуровых: ВВ - хвостового стебля канального сома, I. punctatus, и ССО.

Оптимальной для репродукции вируса является температура в диапазоне от 25 до 30 °С.

Герпесвирус лососевых 1 типа (Salmonid herpesvirus 1, Herpesvirus salmonis, HPV)

Герпесвирус лососевых 1 типа выделен от внешне здоровых культивируемых производителей радужной форели, Oncorhynchus mykiss, и диких стальноголовых лососей в США. Вирус вызывал заболевание и высокую смертность только после инъекции младшим возрастным группам радужной форели.

У лососевых рыб при герпесвирусной болезни отмечается кровоизлияние в глазное яблоко, увеличение брюшка, экзофтальм, кровоизлияния в межлучевой ткани плавников, обильные псевдофекальные выделения из ануса. У большинства рыб сердце имело некротические изменения и следы отека. Жаберный эпителий был отечным и гипертрофированным.

К данному вирусу чувствительны клеточные линии только лососевых рыб: CHSE-214, RTG-2, RTF-1 - целого малька радужной форели, KF-1- целого малька нерки, Oncorhynchus nerka. Репродукция вируса происходит при температурах от 8° - 10°С.

Герпесвирус лососевых 2 типа (Salmonid herpesvirus 2)

В Японии от лососей из рода Oncorhynchus (сима, О. masou, нерка, О. nerka, кижуч, О. kisuch, радужная форель, О. mykiss) выделено несколько штаммов герпесвируса, которые вызывают гибель их молоди, а у части рыб, выживших после заболевания, - образование папиллом.

Герпесвирус NeVTA был выделен во время массовой гибели от мальков жилой нерки. В хозяйстве, где ежегодно отмечалась низкая

выживаемость мальков, из овариальной жидкости здоровых производителей симы был выделен OMV. Из естественно развившихся опухолей у симы выделен YTV. Все штаммы вируса, выделенные от лососей в Японии (OMV, NeVTA, YTV, CSTV, COTV, OKV T, OKV M, RKV, RHV), рассматриваются как один вирус, получивший название -герпесвирус лососевых 2 типа, т.к. они имеют тесное антигенное родство, схожие свойства in vitro и вызывают одинаковые гистопатологические изменения in vivo. Герпесвирус 2 типа отличается от герпесвируса 1 типа, выделенного от лососевых в США [158, 203].

Наиболее хорошо из герпесвирусов 2 типа изучен OMV. Характерные признаки при остром течении инфекции - выраженный экзофтальм, петехии на поверхности тела, отсутствие пищевых масс в пищеварительном тракте, некроз эпидермальных клеток в ротовой полости, вокруг рта и на голове, где впоследствии развиваются опухоли [150, 172].

К вирусу чувствительны, главным образом, клеточные линии лососевого происхождения: СНН-1, CHSE-214, RTG-2, КО-6 - яичников нерки [107], YNK - почки симы [48].

Оптимальной для репродукции вируса в культурах клеток является температура в диапазоне от 10-15 °С.

Герпесвирус некроза гемопоэтической ткани золотой рыбки (Cyprinid herpesvirus 2)

В Японии 1992 г. во время эпизоотии весной от сеголетков и годовиков золотой рыбки, Carassius auratus, впервые был выделен герпесвирус некроза гемопоэтической ткани золотой рыбки [93].

Болезнь протекает весной при температуре воды 15-20 °С и угасает при подъеме температуры выше 25 °С без специфических клинических признаков, наблюдают лишь вялость и скопление рыбы на дне пруда.

К вирусу чувствительны линии клеток карпового происхождения

(FHM, EPC) и тиляпии - TO-2.

Герпесвирус карпа кои (Koi herpesvirus)

Впервые герпесвирус карпа кои был выделен в Израиле в 1998 г. Болезнь быстро распространялась и к концу 2000 г. примерно 90 % рыбхозов оказались неблагополучными по данной болезни [28,131].

Поиски источников распространения этой герпесвирусной инфекции привели в страны Юго-Восточной Азии, являющиеся основными мировыми поставщиками карпа кои.

К 2004 г. неблагополучными по герпесвирусу кои были уже 11 европейских стран, из которых наиболее тяжело страдали Германия и Нидерланды. В Германии в 2002 г. было зарегистрировано около 80 случаев заболевания, и более 100 в 2003 г.

В Англии случаи гибели карпов кои отмечены в 1999 и 2000 гг., а в 2003 г. вирус был выделен от обыкновенного карпа из естественного водоёма [88, 184,185,186]. В США при массовой вспышке данной болезни среди дикого карпа ежегодная гибель достигала 5000-50000 штук половозрелых особей [53].

На конец 2009 г. болезнь была официально установлена в 30 странах мира: Австрия, Бельгия, Великобритания, Германия, Гонконг, Дания, Италия, Ирландия, Индонезия, Израиль, КНР, Канада, Южная Корея, Коста-Рика, Люксембург, Малайзия, Нидерланды, Новая Зеландия, Польша, Сингапур, Словения, США, Таиланд, Тайвань, Франция, Чехия, Швеция, Швейцария, ЮАР и Япония [16, 21, 28, 65, 82, 115, 123, 124, 129, 147, 167, 174, 178].

Возбудителем болезни является герпесвирус, генетически родственный, но не идентиченый вирусу оспы карпов [16, 57, 76, 85, 119]. Наиболее тяжело болезнь протекает при температуре 17 - 26°С.

К вирусу восприимчивы только прудовый карп, карп кои и сазан, принадлежащие к одному виду Cyprinus carpio L.

К вирусу чувствительны некоторые линии клеток карповых рыб: KF-1 [16], ССВ [124], CaF-2 [125] и др. Даже в наиболее чувствительных к нему культурах клеток карпа выделить вирус удается далеко не всегда. Для репродукции вируса в культуре клеток оптимальной является температура от 15-25 °С.

2.4 Герпесвирусы осеровых рыб

Герпесвирус белого осетра 1 типа (WSHV-1, Acipenserid herpesvirus 1, AciHV-1)

Этот вирус впервые был выделен от молоди белого осетра, Acipenser transmontanus, в США во время повышенного отхода рыбы без видимых признаков только в одной культуре клеток, полученной из кожи белого осетра - WSSK-1 [42, 89]. В клетках других линий осетрового происхождения: WSH-1 и WSS-2 [42, 89], а также в клетках линии лососевых - CHSE-214 [128] и карповых - ЕРС [162] ЦПД не наблюдали.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Калабекова, Фатима Султанхамидовна, 2013 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Вирусные болезни осетровых [Электронный ресурс]. - Режим доступа URL: http://pisciculture.ru/action/disease?id=234. - Заглавие с экрана.

2. Герпесвирусная болезнь сибирского осетра [Электронный ресурс]. -Режим доступа URL: http://www.fsvps.ru/fsvps/iac/illness/geфes■html■ - Заглавие с экрана.

3. Здоровая рыба. Профилактика, диагностика и лечение болезней/ Р. Рахконен [и др.]. - Хельсинки: ПИИ охотничьего и рыбного хозяйства, 2003. - 163 с.

4. Ихтиопатология / под ред. H.A. Головиной. - М.: МИР, 2003. - 448 с.

5. Завьялова, Е.А. Культура тканей и клеток рыб в диагностике вирусных болезней/Е.А. Завьялова [и др.] // Проблемы патологии, иммунологии и охраны здоровья рыб и других гидробионтов: сборник тезисов докладов научно-практической конференции, 16-18 июля 2003,- М.,2003.- С. 45-46.

6. Казарникова, A.B. Заболевания осетровых рыб при искуственном воспроизводстве и товарном выращивании / A.B. Казарникова, Е.В. Шестаковская. - М.: Апатиты, 2005. - 58 с.

7. Кесслер Ю.М., Зайцев А.Л. Сольвофобные эффекты. Теория, эксперимент, практика. Л.: Химия, 1989. - 3 с.

8. Клеточные линии из тканей сибирского осетра / Т.И. Щелкунова, O.A. Купинская, H.A. Мащенко, И.С. Щелкунов //Первый конгресс ихтиологов России: тез. докл. - Астрахань, 1997. - С. 302-303.

9. Лабораторный практикум по болезням рыб/ ред. В.А. Мусселиус. -М.: Легкая и пищевая промышленность, 1983. - 296 с.

Ю.Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. - М.: Высшая школа, 1990. -352 с.

П.Лярски, 3. Диагностика вирусных болезней животных/ 3. Лярски. -М.: Колос, 1980.-400 с.

12.Методические указания по идентификации вирусов и лабораторной диагностике вирусных болезней рыб//Сборник инструкций по борьбе с болезнями рыб. 4.1.-М.: Отдел маркетинга АМБ-агро, 1998.- С. 60113.

13. Методические рекомендации по диагностике герпесвирусной болезни сибирского осетра / РАСХН, ГНУ ВНИИВВиМ.-М.,2009.-14 с.

14.Наумова, А.Ю. Особо опасные болезни рыб и других гидробионтов // Эпизоотологический мониторинг в аквакультуре: состояние и перспективы: расширенные материалы Всероссийской научно-практической конференции - семинара/РАСХН.-М., 2005.-С. 77-78.

15.Практическая вирусология/ пер. с нем.; под ред. В.Н. Сюрина. - М.: Колос, 1970.-352 с.

16.Прокаева, И.Б. Гумморальный иммунный ответ осетровых рыб на возбудитель герпесвирусной болезни: дис. ... канд. биол. наук/ Прокаева Инна Борисовна. - Покров, 2013. - 153 с.

17.Герпесвирусная болезнь сибирского осетра. Эпизоотическая ситуация / Россельхознадзор [Электронный ресурс]. - Режим доступа URL: http://www.fsvps.ru/fsvps/iac/inness/gerpes.html. - Заглавие с экрана.

18.Герпесвирусное заболевание молоди сибирского осетра/ И.С. Щелкунов, Т.И. Щелкунова, А.И. Щелкунов, Ю.П. Колбасова, JT.B. Диденко, А.Ф. Быковский// Тепловодная аквакультура и биологическая продуктивность водоемов аридного климата: материалы и докл. Междунар. симпозиума. - Астрахань: АГТУ,2007. -С. 522-525.

19. Состояние осетроводства в мире и проблемы ее развития

[Электронный ресурс].- Режим доступа URL: http://osetrovie.ru/bolezni-ryb/sostoanie-osetrovodstva-v-mire-i-problemy-razvitia.html.-Заглавие экрана.

20.Щелкунов, А.И. Биологические, физико-химические и молекулярно-генетические свойства герпесвируса сибирского осетра: дис. ... канд. биол. наук / Щелкунов Артем Игоревич. - Покров, 2010. - 137 с.

21.Щелкунов, А.И., Щелкунова Т.И Биологические свойства герпесвируса сибирского осетра in vitro // Вопросы рыбного хозяйства Беларуси: сб. науч. трудов. - Минск: РУП Институт рыбного хозяйства, 2008. - Вып. 24. - С. 501-503.

22.Щелкунова, Т.И. Перевиваемые линии клеток карпа (Cyprinus carpio) и сибирского осетра (Acipenser baeri), их использование в ихтиовирусологии: автореф. дис. ... канд. биол. наук: 03.00.06. -Покров, 2008. - 24 с.

23.Щелкунов, И.С. Герпесвирусная болезнь у осетровых рыб в России/ И.С. Щелкунов [и др.]// Российский ветеринарный журнал (Сельскохозяйственные животные). - 2007. - № 1. - С. 10-12.

24.Щелкунов, И.С. Вирусные инфекции у осетровых рыб/ И.С. Щелкунов// Рыбное хозяйство. Аналитическая и реферативная информация. Серия: Болезни гидробионтов в аквакультуре. - М.: ВНИЭРХ, 2000. - Вып. 1. - С. 3-16.

25.Щелкунов, А.И. Сохранность герпесвируса сибирского осетра при разных условиях хранения/ А.И. Щелкунов // Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных: труды Междунар. науч. -практ. конф., посвященной 50-летию ВНИИВВиМ. - Покров, 2008. -С. 205-209.

26.Щелкунова, Т.И., Чувствительность к вирусам рыб постоянных клеточных линий, полученных из тканей сибирского осетра/Т.И.

Щелкунова, Ю.П. Колбасова, И.С. Щелкунов // Цитология. - 2006.-Т.48.- № 9.-С. 814-815.

27.Щелкунов, А.И. Герпесвирусная болезнь сибирского осетра/ А.И. Щелкунов, И.С. Щелкунов // Ветеринария. - 2010. - № 1. - С. 18-21.

28.Щелкунов, А.И. Покровно-тканевой тропизм герпесвируса сибирского осетра/А.И. Щелкунов // Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел: материалы Междунар. науч.-практ. конф. - М., 2008. - С. 437-440.

29.Щелкунов, А.И. Оптимизация условий культивирования герпесвируса сибирского осетра /А.И. Щелкунов //Труды ВИЭВ.-М., 2009.-Т. 75.-С. 670-675.

30.Щелкунов, А.И. получение гипериммунных антисывороток к герпесвирусу сибирского осетра/ А.И. Щелкунов, И.Б. Прокаева// Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины: материалы конф. молодых ученых. - Покров, 2009. - С. 127-130.

31.Щелкунов, А.И. Влияние химических и физических факторов на инфекционность герпесвируса сибирского осетра/А.И .Щелкунов, Т.Н. Щелкунова, В.И. Балышева // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2010. - № 2. - С. 47-49.

32.Щелкунов, И.С. Вирусные инфекции у осетровых рыб/ И.С. Щелкунов // Рыбное хозяйство. Аналитическая и реферативная информация. Серия: Болезни гидробионтов в аквакультуре. - М.: ВНИЭРХ, 2000. - Вып. 1. - С. 3-16.

33.Щелкунов, И.С. Эпизоотическая ситуация по вирусным болезням культивируемых рыб/ И.С. Щелкунов // Ветеринария. - 2006. - № 4. -С. 22-25.

34.Щелкунова, Т.И. Клеточные линии из тканей сибирского осетра/

Т.И. Щелкунова, O.A. Купинская, H.A. Мащенко//Первый конгресс ихтиологов России. - Астрахань, 1997. - С. 302-303.

35.Adeno-like virus associate with a disease of cultured white sturgeon (Acipenser transmontanus)/ R.P. Hedrick [et al.] //Canad. J. Fish. Aquat. Seien. - 1985. - Vol. 42. - P. 1321-1325.

36.Adkison, M.A. Identification of an iridovirus in Russian sturgeon (Acipenser gueldenstaedti) from northern Europe/ M.A. Adkison, M. Cambre, R.P. Hedrick// Bull. Eur. Ass. Fish Pathol. - 1998. - Vol.18. - P. 29-32.

37.Andy Goodwin. Herpesviruses in Fish/ SRAC Publication No. 4710 May 2012.

38.Aoki, T. Genome sequences of three koi herpesvirus isolates representing the expanding distribution of an emerging disease threatening koi and common carp worldwide/ T. Aoki [et al.] //J. Virol. - 2007. Vol. 81. -P.5058-5065.

39.Aquatic Animal Health Code. 12th ed./ OIE.- Paris, 2009.

40. A herpesvirus associated with mass mortality of juvenile and adult koi, a strain of a common carp/ R.P. Hedrick [et al.] // J. Aquat. Anim. Health. -2000.-Vol. 12.-P. 44-57.

41.Amita, K.Oe.M. A survey of koi herpesvirus and carp edema virus in color carp cultured in Nigara Prefecture, Japan/ K.Oe.M. Amita, H. Matoyama, N. Yamaguchi // Fish Pathol. - 2002. - Vol. 37. - P. 197-198.

42.A novel class of herpesvirus with bivalve hosts/ A.J. Davison [et al.] // J. Gen. Virol. - 2005. - Vol. 86. - P. 41-53.

43.Ariav, R. First report of newly emerging viral disease of Cyprinus carpio species in Israel/ R. Ariav, S. Tinman, I. Bejerano// Diseases of Fish and Shellfish: 9th International Conference EAFP. - Rhodes, 1999. - P. 151.

44.Beurden, S. J. Complete genome sequence and taxonomic position of anguillid herpesvirus 1/S.J. Beurden [et al.]// J Gen Virol. [Epub ahead of

print]. - 2010. - Vol. - 91. - P.880-887/

45.Characteristics of a new herpesviral isolate from salmonid fish/ Y. Hayashi [et al.]//Jpn. J. Vet. Sci. - 1986. - Vol. - 48. - P. 915-924.

46.Characteristics of two viruses isolated from white sturgeon, Acipenser transmontanus/ R.P. Hedrick [et al.] // Proceedings of Second International Symposium on Viruses of Lower Vertebrates/ Fryer J.L. (ed.). - Corvallis, OR: Oregon State University Press, 1991. - P. 165-174.

47.Council Directive 2006/88/EC of 24 October 2006 on animal health requirements for aquaculture animals and products thereof, and on the prevention and control of certain diseases in aquatic animals// Official Journal of the European Union, 24.11.2006, L328- P. 14-56.

48.Chen, S.N. A cell line derived from tilapia ovary/ S.N. Chen, Y. Ueno, G.H. Kou // Fish Pathol. - 1984. - Vol. 18. - P. 13-18.

49.Continuous cell line derived from the kidney of yamame, Oncorhynchus masou/ T. Watanabe [et al.] // Bull. Jap. Soc. Sci. Fish. - 1978. - Vol. 44. -P. 415-418.

50.Davison A.J. Channel catfish virus: A new type of herpesvirus. Virology. 1992; 186:9-14.

51.Davison, A.J. Channel catfish virus: a new type of herpesvirus/ A.J. Davison// Virology. - 1992. - Vol. 186. - P. 9-14.

52.Davison, A.J. The genome of salmonid herpesvirus 1/ A.J. Davison/./ J. Virol. - 1998. - Vol. 72. - P. 1974-1982.

53.Davison, A.J. The order Herpesvirales/ A.J. Davison //Arch Virol. - 2009. -Vol. 154. - P. 171-177.

54.Davison, A.J. Evolution of the herpesviruses/ A.J. Davison// Vet. Microbiol. - 2002. - Vol. 86. - P. 69-88.

55.Davison, A.J. Genome sequences of two frog herpesviruses/ A.J. Davison, C. Cunningham, W. Sauerbier // J. General Virology. - 2006. - Vol. - 87. -P. 3509-3514.

56.Development of a polymerase chain reaction for the detection of Anguillid herpesvirus DNA in eels based on the herpesvirus DNA polymerase gene/ F. Rijsewijk [et al.] // J. Virol. Methods. - 2005. - Vol. 124.-P. 87-94.

57.Dixon, P.F. Status of koi herpesvirus disease in Europe, and research on the virus in the United Kingdom/ P.F. Dixon, O.L.M. Haenen, N. Beevers// KHV infection: present status and future prospects for prevention. - Tokyo Japan, 2004. - P. 5-7.

58.Doszpoly A., Shchelkunov I.S. Partial genome analysis of Siberian sturgeon alloherpevirus suggests its close relation to AciHV-2 - short communication/ A. Doszpoly, I. S. Shchelkunov // Acta Veterinaria Hungarica. - 2010. - Vol. 58(2). - P. 269-274.

59.Doszpoly, A. Molecular confirmation of a new herpesvirus from catfish (Ameiurus melas) by testing the performance of a novel PCR method, designed to target the DNA polymerase gene of alloherpesviruses/ A. Doszpoly [et al.] // Arch. Virol.- 2008.- Vol. 153.- P. 2123-2127.

60.Ehlers B, Borchers K, Grund C, Frolich K, Ludwig H, Buhk HJ. Detection of new DNA polymerase genes of known and potentially novel herpesviruses by PCR with degenerate and deoxyinosine-substituted primers. Virus Genes. 1999; 18:211-220.

61.Felsenstein, J. PHYLIP - Phylogeny inference package/ J. Felsenstein // Cladistics. - 1989. - Vol. 5. - P. 164-166.

62.First detection of a viral agent causing disease in farmed sturgeon in Russia/ I.S. Shchelkunov, T.I. Shchelkunova, A.I. Shchelkunov, Y.P. Kolbasova, L.V. Didenko, A.Ph. Bykovsky // Dis. Aquat. Org. - 2009. -Vol. 86. - P. 193-203.

63.Fung, S.K.L. Quarantine, surveillance and monitoring of koi herpesvirus in Singapore/ S.K.L. Fung, L.K. Huat, P.Y. Kwang// International Symposium KHV disease - strategy for KHV disease control. - Pacifico

Yokohama Japan, 2004.

64.Genetic relationships among herpes-like viruses isolated from sturgeon/ G.O. Kelley [et al.] // J. Aquat. Anim. Health. - 2005. - Vol. 17. - P. 297303

65.Genome sequences of three koi herpesvirus isolates representing the expanding distribution of an emerging disease threatening koi and common carp worldwide/ T. Aoki [et al.] // J. Virology. - 2007. - Vol. 81. -P. 5058-5065.

66.Genomic studies of the Lucke tumor herpesvirus (RaHV-1)/ A.J. Davison [et al.] // J. Cancer Research Clin. Oncology. - 1999. - Vol. 125. - P. 232238.

67.Gravell, M. A permanent cell line from the fathead minnow (Pimephales promelas)/ M. Gravell, R.C. Malsberger // Ann. N.Y. Acad. Sci. - 1965. -Vol. 126.-P. 555-565.

68.Gray W.L., Williams R.J., Jordan R.L., Griffin B.R. Detection of channel catfish virus DNA in latently infected catfish. J. Gen. Virol. 1999;80:1817-1822.

69.Ghittino, P. Probabile adenovirosi nel giovane storione d'allevamento (Acipenser trasmontanus)/ P. Ghittino, C. Ghittino// RIV. IT. PISCIC. ITTIOP. - 1985. - Vol. XX, N 4. - P. 137-139.

70.Goldfish hematopoietic necrosis herpesvirus (Cyprinid Herpesvirus 2) in the USA: molecular confirmation of isolates from diseased fish/ A.E. Goodwin [et al.] // J. Aquat. Animal Health. - 2006. - Vol. 18. - P. 11-18.

71.Haenen, O. Koi herpesvirus workshop/ O. Haenen, R.Hedrick //Bull. Eur. Ass. Fish Pathol.- 2006,- Vol.26.- P. 26-37.

72.Hall, T. A.: BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT /T.A. Hall // Nucl. Acids. Symp.- 1999. - Ser. 41.-P. 95-98.

73.Hanson L.A., Rudis M.R., Vasquez-Lee M., Montgomery R.D. A broadly

applicable method to characterize large DNA viruses and adenoviruses based on the DNA polymerase gene. Virol. J. 2006;3:28.

74.Hedrick, R.P. Two cell lines from white sturgeon/ R.P. Hedrick [et al.] // Trans. Am. Fish Soc. - 1991. - Vol. 120. - P. 528-534.

75.Hedrick R.P., Isolation of an epitheliotropic herpesvirus from white sturgeon (Acipenser transmontanus) II Dis/ R.P.Hedrick // Aquat. Org. -1991.-Vol. 11.-P. 49-56.

76.Hedrick, R.P. Characteristics of two viruses isolated from white sturgeon, Acipenser transmontanus II Proceedings Second Intern. Symp. Viruses Lower Verteb. Ed.: J.L. Fryer - Corvallis, OR: Oregon State Univ. Press, 1991b. - P. 165-174.

77.Hedrick, R. P. Systemic herpeslike virus in catfish Ictalurus melas (Italy) differs from Ictalurid herpesvirus-1 (North America)/ R.P. Hedrick [et al.] // Dis. Aquat. Org. - 2003. - Vol. 55. - P. 85-92.

78.Hedrick, R. P. Systemic herpeslike virus in catfish Ictalurus melas (Italy) differs from Ictalurid herpesvirus-1 (North America)/ R.P. Hedrick [et al.] // Dis. Aquat. Org. - 2003. - Vol. 55. - P. 85-92.

79.Kelley, G. O.Genetic relationships among herpes-like viruses isolated from sturgeon/ G. Kelley [et al].// J. Aquat.Anim. Health.- 2005. - Vol. 17.-P. 297-303.

80.Hedrick, R.P. A Workshop on sturgeon diseases/ R.P. Hedrick, S. LaPatra, T. McDowell // Conducted at the Forth International Symposium on Sturgeon. - Oshkosh, Wisconsin, 2001. - 23 p.

81.Hedrick, R.P. Initial isolation and characterization of a herpes-like virus (KHV) from koi and common carp/ R.P. Hedrick, O. Gilad, O. Yun// International Symposium Koi herpesvirus disease - strategy for koi herpesvirus disease control. - Pacifico Yokohama, 2004. - P. 1-4.

82.Hoffmann, R. Koiseuche bedroht Karpfenteichwirtschaft/ R. Hoffmann// Fischer und Teichwirt. - 2000. - Bd. 11. - S. 432.

83.1gari, T. The restriction endonuclease cleavage patterns of the salmonid herpesvirus strain's DNAs/ T. Igari., H. Fukuda., T. Sano// Fish Pathol. -1991.-Vol. 12.-P. 45-46. 84.Initial characteristics of koi herpesvirus and development of a polymerase chain reaction assay to detect the virus in koi, Cyprinus carpio koi/ O. Gilad [et al.] //Diseas. Aquat. Org. - 2002. - Vol. 48. - P. 101-108. 85.Isolation of a herpesvirus during disease outbreaks in adult koi carp, Cyprinus carpio, in the UK/ K. Way [et al.] // Diseases of Fish and Shellfish: 10th International Conference EAFP. - Dublin, 2001. - P. 50. 86.Isolation of an epitheliotropic herpesvirus from white sturgeon (Acipenser transmontanus)/ R.P. Hedrick [et al.]// Diseas. Aquat. Org. - 1991. - Vol. 11.- P. 49-56.

87.Ito J, Braithwaite DK. Compilation and alignment of DNA polymerase sequences. Nucleic Acids Res. 1991;19:4045-4057.

88.Kimura, T. Studies on a new virus (OMV) from Oncorhynchus masou - I. Characteristics and pathogenicity/ T. Kimura, M. Yoshimizu, M. Tanaka// Fish Pathol. - 1981.-Vol. 15.-P. 143-147.

89.Kimura, T. Studies on a new virus (OMV) from Oncorhynchus masou -1. Characteristics and oncogenicity/ T. Kimura, M. Yoshimizu, M. Tanaka// Fish Pathol. - 1981.-Vol. 15.-P. 149-153. 104.

90.Kumagai, A. Optimal conditions for isolation of salmonid herpesvirus type 2 from maricultured coho salmon/ A. Kumagai, H. Fukuda, K. Takahashi// Fish Pathol. - 1994. - Vol. 29. - P. 205-209.

91.Koi herpesvirus represents a third cyprinid herpesvirus (CyHV-3) in the family Herpesviridae/ T.B. Waltzek [et al.] // J. General Virolgy. - 2005. -Vol. 86.-P. 1659-1667.

92.Kumar, S. MEGA2: molecular evolutionary genetics analysis software/ S. Kumar, K. Tamura, I. Jakobsen // Bioinformatics. - 2001. - Vol. 17. -1244 -1245.

93.Kurobe, T. Revised phylogenetic relationships among herpesviruses isolated from sturgeons/ T. Kurode, G.O. Kelly, T.B. Waltzek // J. Aquat. Anim. Health. - 2008. - Vol. 20. - P. 96-102.

94.Knusel, R. at all Virus isolation vs RT-PCR: which method is more successful in detecting VHSV and IHNV in fish tissue sampled under field conditions?/ Kntisel R, Bergmann SM, Einer-Jensen K, Casey J, Segner H, Wahli T.// J Fish Dis. 2007 Sep;30(9):559-68.

95.Kunec, D., Recombination herpesvirus cloning system with negative selection that produces vectorless progeny// J. Virol. Methods. 2009;155:82-86.

96.Lannan, C.N. Fish cell lines: establishment and characterization of nine cell lines from salmonids/ C.N. Lannan, J.R. Winton, J.L. Fryer // In Vitro. - 1984. - Vol. 20. - P. 671-676.

97.Lewis, D.H. Micricultures of Sarotherodon mossambicus (Peters) cells: their use in detecting fish viruses/ D.H. Lewis, J.E. Marks // J. Fish Dis. - 1985. - Vol. 8. - P. 477-478. 122.

98.Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals. 6th ed. - Paris: Office International des Epizooties, 2009.

99.Mass mortalities in koi carp, Cyprinus carpio, associated with gill and skin disease/ A. Bretzinger [et al.] // Bull. Eur. Ass. Fish Pathol. - 1999. -Vol. 19, N5.-P. 182-185.

100. Molecular comparison of isolates of an emerging fish pathogen, koi herpesvirus, and the effect of water temperature on mortality of experimentally infected koi/ O. Gilau [et al.]// J. Gener. Virology. - 2003. -Vol. 84.-P. 2661-2667.

101. Molecular confirmation of a new herpesvirus from catfish (Ameiurus melas) by testing the performance of a novel PCR method, designed to target the DNA polymerase gene of alloherpesvirus/ A. Doszpoly [et al.] // Arch. Virol. - 2008. - Vol. 153. - P. 2123-2127.

102. Nagasava, K. KHV infection in Southeast Asia and response of SEAFDEC to this new threat to regional aquaculture/ K. Nagasava// KHV infection: present status and future prospects for prevention. - Tokyo Japan, 2004.-P. 21-23.

103. Neukirch, M. Isolation of a virus from koi with altered gills/ M. Neukirch, K. Böttcher, S. Bunnajirakul// Bull. Eur. Ass. Fish Pathol. -1999. - Vol. 19, N 5. - P. 221-224.

104. Neukirch, M. Isolation and preliminary characterization of several viruses from koi (Cyprinus carpio) suffering gill necrosis and mortality/ M. Neukirch, U. Kunz // Bull. Eur. Ass. Fish Pathol. - 2001. - Vol. 21, N. 4.-P. 125-135.

105. Nims, L. Studies of replication of four selected viruses in two cell lines derived from salmonids fish/ L. Nims, J.L. Fryer, K.S. Pilcher // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. - 1970. - Vol. 135. - P. 6-12.

106. Oh, M.-J. A viral disease occurring in cultured carp Cyprinus carpio in Kore/ M.-J. Oh, S.-J. Jung, T.-J. Choi // Fish Pathol. - 2001. - Vol. 36. -P. 147-151.

107. Perelberg, A. Epidemiological description of a new viral disease afflicting cultured Cyprinus carpio in Israel/ A. Perelberg, M. Smirnov, M. Hutoran// Israeli J. Aquat. - 2003. - Vol. 55. - P. 5-12.

108. Plumb, J.A. Effects of temperature on mortality of fingerling channel catfish (Ictalurus punctatus) experimentally infected with channel catfish virus/ J.A. Plumb// J. Fish. Res. Board Can. - 1973. - Vol. 30. - P. 568-570.

109. Plumb, J.A. Susceptibility of blue catfish to channel catfish virus/ J.A. Plumb, J. Chappell// Proc. Annu. Conf. Southeast. Assoc. Fish Wildl. Agencies. - 1978. - Vol. 32. - P. 680-685.

110. Plumb, J.A. Channel catfish virus disease/ J.A. Plumb, J.L. Gaines// The pathology of fishes/ W.E. Ribelin, G. Migaki (eds). - Madison: Univ.

Wisconsin Press, 1975. - P. 287-302.

111. Plumb, J.A. Resistence of the Europen catfish (Silurus glanis) to channel catfish virus/ J.A. Plumb, V. Hilge, E.E. Quinlan/ J. Appl. Ichthyol. - 1985. - Vol. - P. 87-89.

112. Plumb J.A., Gaines J.L., Mora E.C., Bradley G.G. Histopathology and electron microscopy of channel catfish virus in infected channel catfish, ictalurus/>w«cto?w5(rafinesque) J. Fish. Biol. 1974;6:661-664.

113. Risk factors for outbreaks of disease attributable to white sturgeon iridovirus and white sturgeon herpesvirus-2 at a commercial sturgeon farm/ M.P. Georgiadis [et al.] //AJVR. - 2000. - Vol. 61, N 10. - P. 12321240.

114. Rukyani, A. Koi herpesvirus infection in Indonesia: Suspicion [Электронный ресурс]. - режим доступа: at:http://www.promedmail.org. - Загл. с экрана.

115. Sano, Т. Yamame tumor virus: lethality and oncogenicity/ T. Sano, H. Fukuda, N. Okamoto // Bull. Jap. Soc. Scient. Fish. - 1983. -Vol. 49. -P. 1159-1163.

116. Serological relationships of five herpesviruses isolated from salmonid fishes/ R.P. Hedrick [et al.] // J. Appl. Ichthyol. - 1987. - Vol. 3.-P. 87-92.

117. Some properties of the Epithelioma papulosum cyprini (EPC) cell line from carp Cyprinus carpio/ N. Fijan [et al.] // Ann. Virol. (Inst. Pasteur). - 1983. - Vol. 134. - P. 207-220.

118. Staden, R. The Staden sequence analysis package/ R. Staden // Mol. Biotechnol.-1996.-Vol. 5. - P. 233-241.

119. Silverstein P.S., Bosworth B.G., Gaunt P.S. Differential susceptibility of blue catfish, ictalurus furcatus (valenciennes), channel catfish, i. Punctatus (rafinesque), and blue x channel catfish hybrids to channel catfish virus. J. Fish Dis. 2008;31:77-79.

120. Sunarto, A. Indonesian experience on the ourbreak of koi herpesvirus in koi and carp (Cyprinus carpio)/ A. Sunarto, A. Rukyani// International Symposium KHV disease - strategy for KHV disease control. - Pacifico Yokohama Japan, 2004. - P. 17.

121. Sunarto A., McColl K.A., Crane M.S., Sumiati T., Hyatt A.D., Barnes A.C., Walker P.J. Isolation and characterization of koi herpesvirus (khv) from indonesia: Identification of a new genetic lineage. J. Fish Dis. 2011;34:87-101.

122. Suzuki, S. Characteristics of DNA polymerase induced by salmon herpesvirus, Oncorhynchus masou virus/ S. Suzuki, T. Kimura, M. Saneyoshi// J. Gen. Virol. - 1986. - Vol. 67. - P. 405-408.

123. Swofford, D.L. PAUL: phylogenetic analysis using parsimony (and other methods), version 4.0./ D.L. Swofford. - Sunderland Massachusetts: Sinauer Associates, 1998.

124. Tanaka, M. Herpesvirus infection of salmonid fish/ M. Tanaka, M. Yoshimizu T. Kimura// Salmonid diseases/ Kimura T. (ed.). - Sapporo: Hokkaido University Presss, 1992. - P. 111-117.

125. The emergence of koi herpesvirus and its significance to European aquaculture / O.L.M. Haenen [et al.]// Bull. Eur. Ass. Fish Path. - 2004. -Vol. 24, N. 6. - P. 293-307.

126. Thompson, J.D. Clustal W: improving the sensitivity of progressive multiple-sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties, and weight matrix choice/ J.D. Thompson, D.G. Higgins, T.J. Gibson//' Nucleic Acids Research - 1994. - Vol. 22. - P. 4673-4680.

127. Tu, C. Detection of koi herpesvirus in koi Cyprinus carpio in Taiwan/ C. Tu, M.-C. Weng, J.-R. Shiau // Fish Pathol. - 2004. - Vol. 39. -P. 109-110.

128. Two continuous cell lines from carp, Cyprinus carpio L/ I.S.

Shchelkunov [et al.]// Diseases of Fish and Shellfish: 7th International Conference EAFP. - Palma de Mallorca, 1995. - P. 49.

129. Villarreal LP, DeFilippis VR. A hypothesis for DNA viruses as the origin of eukaryotic replication proteins. J Virol. 2000;74:7079-7084.

130. Waltzek, T. B. Phylogenetic relationships in the family Alloherpesviridae / T.B.Waltzek [et al.] // Dis. Aquat. Org..- 2009. -Vol. 84. - P.179-194.

131. Walster, C.I. Clinical observations of severe mortalities in koi carp, Cyprinus carpio, with gill disease/ C.I. Walster// Fish Vet. J. - 1999. -Vol. 3.-P. 54-58.

132. Walster, C.I. Koi carp mortality syndrome: an update/ C.I. Walster// Fish Vet. J. - 2000. - Vol. 5. - P. 72-75.

133. Walster, C.I. Koi carp mortality syndrome: an update/ C.I. Walster// Fish Vet. J. - 2000. - Vol. 5. - P. 72-75.

134. Watson, L.R. Characteristics and pathogenicity of a novel herpesvirus isolated from adult and sub adult white sturgeon Acipenser transmontanus/ L.R. Watson, S.C. Yun, J.M. Groff// Dis. Aquat. Org. -1995.-Vol. 22.-P. 199-210.

135. Wolf, K. Fish viruses and fish viral diseases/ K. Wolf. - Ithaca; London: Cornell University Press, 1988. - 476 p.

136. Wolf, K. Poikiloterm vertebrate cell lines and viruses: a current listing for fishes/ K. Wolf, J.A. Mann// In Vitro. - 1980. - Vol. 16. - P. 168-179.

137. Wolf, K. Established eurythermic line of fish cells in vitro/ K. Wolf, M.C. Quimby//Science.- 1962.-Vol. 135.-P. 1065-1066.

138. Wolf, K. Fish cell and tissue culture/ K. Wolf, M.C. Quimby // Fish Physiology/ W.S. Hoar, D.J. Randall (eds.). - N.Y.: Acad. Press, 1969. -Vol. 3.-P. 253-305.

139. Wolf, K. Herpesvirus salmonis: pathological changes in

parenterally infected rainbow trout, Salmo gairdneri Richardson, fry/ K. Wolf, C.E. Smith//J. FishDis. - 1981. - Vol. 4. - P. 445-447.

140. Wolf, K. Lymphocystis virus: isolation and propagation in centrarchid fish cell lines/ K. Wolf, M.C. Quimby // Science. - 1966. -Vol. 151.-P. 1004-1005.

141. Wolf, K. Salmonid viruses: a syncytium-forming agent from rainbow trout/ K. Wolf, W.G. Taylor// Fish Health News. - 1975. - N. 3. -P. 4.

142. Yoshimizu, M. Salmonid herpesvirus 2. Epizootiology and serological relationship/M. Yoshimizu, H. Fukuda, T. Sano // Vet. Res. -1995.-Vol. 26.-P. 486-492.