цАМФ- и Ca2+/кальмодулин - зависимые системы фосфорилирования нейрональных белков как мишень для действия антиконвульсантов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.13, кандидат биологических наук Савина, Татьяна Александровна

• Савина, Татьяна Александровна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Савина, Татьяна Александровна

Список сокращений.

Введение.

Глава I. Обзор литературы.

1.1. Модели эпилепсии на животных.

1.1.1. Модели судорожной активности in vivo. Киндлинг.

1.1.2. Этиология аудиогепных судорог.

1.1.3. Аудиогенная эпилепсия человека.

1.1.4. Модели приобретенной аудиогенной эпилесии на животных.

1.1.5. Наследственные аудиогенные судороги грызунов.

1.1.6. Аудиогенный киндлинг.

1.1.7. Биохимические изменения мозга при аудиогенной эпилепсии.

1.2. Нейробиологические основы эпилептогенеза развивающегося мозга.

1.3. Участие систем вторичных посредников в механизмах эпилептогенеза.

1.3.1. С а2 +/кал ьмодул ин -зав исимое фосфорилирование белков.

1.3.2. Внутриклеточные пути реализации сигнала, опосредуемого цАМФ. цАМФ-зависимое фосфорилирование белков.

1.3.3. Серин/треониновые протеинфосфатазы. Кальцинейрин.

1.3.4. Участие систем вторичных посредников в регуляции пластичности мозга и эпилептогенезе.

1.3.5. Взаимосвязь - и цАМФ-зависимых систем вторичных посредников.

1.4. Современные стретегии применения антиконвульсантов. Мелатонин и вальпроат натрия.

Глава II. Материалы и методы исследования.

2.1. Материалы.

2.2. Лабораторные животные.

2.3. Исследование поведения крыс КМ в тесте «Открытое поле».

2.4. Оценка аудиогенной судорожной активности крыс линии КМ. Аудиогенный киндлинг.

2.5. Аудиогенный киндлинг крыс КМ на фоне хронического употребления мелатонина и вальпроата натрия.

2.6. Однократное введение мелатонина половозрелым крысам линии КМ и КМ после аудиогенного киндлинга.

2.7. Однократное введение вальпроата натрия половозрелым крысам линии КМ и КМ после аудиогенного киндлинга.

2.8. Введение мелатонина крысам линии КМ в течение 7 дней с последующим тестированием на аудиогенные судороги.

2.9. Введение мелатонина крысятам линии КМ в различные сроки раннего постнатального развития (1-7,7-14 и 14-21 постнатальные дни).

2.10. Выделение структур мозга.

2.11. Приготовление гомогенатов.

2.12. Определение концентрации белка.

2.13. In vitro фосфорилирование белков мозга.

2.13.1. сАМФ- зависимое фосфорилирование.

2.13.2. Саг+/кальмодулин-зависимое фосфорилирование.

2.13.3. Электрофорез и идентификация белков.

2.14. Измерение активностей протеинкиназ.

2.14.1. Измерение активности сАМФ-зависимой протеинкиназы.

2.14.2. Измерение активности Са2+/кальмодулин-зависимой протеинкиназы 7/.

2.14.3. Оценка включения фосфата в пептидные субстраты протеинкиназ.

2.15. Иммунохимические методы оценки содержания а-CaMKII, кальцинейрина и МАР с помощью иммунноблотинга.

2.16. Электронно-микроскопические исследования.

2.17. Статистическая обработка результатов исследований.

Глава III. Результаты исследования и их обсуждение.

3.1. Исследование систем Са /кальмодулин- и цАМФ-зависимого фосфорилирования белков в различных структурах мозга крыс линии КМ и крыс Вистар.

3.2. Исследование Са2+/кальмодулин - и цАМФ-зависимого фосфорилирования белков в различных структурах мозга крыс линии КМ через 2 суток после однократного звукового воздействия и после АК.

3.3. Исследование действия мелатонина и вальпроата натрия на активность

САМКИ и РКА.

3.4. Влияние вальпроата натрия и мелатонина на аудиогенную судорожную активность крыс линии КМ и системы фосфорилирования.

3.4.1. Исследование действия мелатонина (50 и 75 мг/кг) и вальпроата натрия

200 мг/кг) на аудиогенные судороги крыс линии КМ.

3.4.2. Исследование действия мелатонина (50 и 75 мг/кг) и вальпроата натрия (200 мг/кг) на миоклонические судороги крыс линии КМ после аудиогенного киндлинга.

3.4.3 Хроническое введение мелатонина крысам КМ в течение 7 дней с последующим тестированием на аудиогенные судороги.

3.5. Влияние хронического потребления вальпроата натрия и мелатонина крысами

КМ на аудиогенную судорожную активность во время аудиогенного киндлинга.

3.6. Исследование отставленного действия раннего постнатального введения мелатонина на аудиогенные судороги половозрелых крыс линии КМ.

3. б. 1. Введение мелатонина в возрасте с 1-го по 7-й Р дни.

3.6.2. Введение мелатонина в возрасте с 14-го по 21-й Р дни.

3.6.3. Введение мелатонина в возрасте с 7-го по 14-й Р дни.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «цАМФ- и Ca2+/кальмодулин - зависимые системы фосфорилирования нейрональных белков как мишень для действия антиконвульсантов»

Актуальность проблемы:

Эпилепсия представляет собой большую группу клинических заболеваний, которым подвержено около 1% взрослого населения, при этом только 40% случаев заболевания эпилепсией поддается медикаментозному лечению, в то время как нейрохирургическое вмешательство (резекция ткани мозга у больных или нейротрансплантации) не всегда дает положительный эффект (Карлов, 1990). В настоящее время считается, что наследственные формы эпилепсий являются заболеванием мозга в целом (Богданов, 1997; Акимова и др., 2000). С этой точки зрения правомерен вопрос о том, в какой степени изменения функциональных или морфологических свойств индивидуальных нейронов, а также нейронов определенных структур головного мозга могут быть ответственны за эпилептогенез. Широкое разнообразие клинических форм эпилепсии свидетельствует о необходимости анализа клеточных и молекулярных механизмов инициации и развития заболевания.

На различных моделях эпилепсии на животных показано, что эпилептогенез сопровождаться многочисленными метаболическими нарушениями в нейронах, включающими в себя изменения экспрессии генов, внутриклеточного гомеостаза Са2+ и энергетики нейронов, изменением кластеризации и свойств различных рецепторных комплексов, в частности, ГАМК- и глутаматных, изменением проводимости ионных каналов, а так же морфологическими перестройками, приводящими к созданию гипервозбудимости нейрональных сетей. Нарушение функционирования нейронов в значительной степени определяется изменениями внутриклеточной системы регуляции различных клеточных процессов - системы вторичных посредников. Конечными эффекторами системы вторичных посредников являются протеинкиназы (протеинфосфотрансферазы) — ферменты, осуществляющие регуляцию большинства рецепторных и канальных белков, а так же белков цитоскелета посредством одной из наиболее распространенных посттрансляционных модификаций — фосфорилированием. Са2+/кальмодулин- (СаМКП) и цАМФ- (РКА) зависимые протеинкиназы, а также Са2+/кальмодулин-активируемая протеинфосфатаза 2В (кальцинейрин), локализованные как пре-, так и постсинаптически, являются ключевыми ферментами взаимомодулирующих путей реализации действия двух важных внутриклеточных вторичных посредников - Са2+ и цАМФ. Начиная с открытия Э.Сазерлендом регуляторного действия цАМФ (Sutherland, 1972), последующие исследования л , функционирования белков-эффекторов систем цАМФ- и Са /зависимого проведения сигнала показали, что различные пути вторичных посредников взаимомодулируют друг друга, образуя разветвленную регуляторную сеть, специфичность ответа которой определяется рецепторными комплексами, запускающими внутриклеточные каскады фосфорилирования/дефосфорилирования, набором и компартментализацией белков-эффекторов. Большой интерес представляет изучение фосфорилирования ассоциированного с микротрубочками белка 2 (МАР2), который является одним из связующих звеньев между данными регуляторными внутриклеточными системами, а также морфологией и функциональной активностью нейрона. Фосфорилирование этого белка CaMKII и РКА регулирует динамику сборки/разборки тубулинового цитоскелета и взаимодействие микротрубочек с другими элементами цитоскелета, что, в свою очередь оказывает влияние на внутриклеточный транспорт, кластеризацию рецепторов, синаптическую передачу и поддержание формы дендритов. Изменения фосфорилирования белков, а также активности или содержания CaMKII, PICA и кальцинейрина показаны при долговременной потенциации синаптической передачи, процессах, связанных с обучением и некоторыми патологическими состояниями мозга. Кратковременное увеличение уровня внутриклеточного Са2+ и цАМФ вследствие судорожной активности запускает каскад как морфологических (изменением состояния цитоскелета посредством изменения фосфорилирования цитоскелетных белков), так и биохимических изменений, приводящих к долговременной активации генома и образованию так называемых "эндогенных антиконвульсантов" - адаптационных перестроек, препятствующих развитию гипервозбудимости и являющихся мишенями действия некоторых антиконвульсантов (Post, 2004). Известно, что такие антиконвульсанты, как вальпроат натрия и мелатонин являются "универсальными" антисудорожными агентами при различных формах эпилепсии. Антиэпилептическое действие данных препаратов в основном объясняется их влиянием на ГАМК-ергическую систему мозга, однако представляется вероятным, что их эффективность может опосредоваться влиянием на систему внутриклеточной регуляции, опосредованную Са2+ и цАМФ. Комплексный анализ изменений в системах цАМФ- и Са2+/кальмодулин-зависимого фосфорилирования нейрональных белков в мозге животных с наследственной предрасположенностью к судорогам, вызываемым звуком, несомненно, позволит выявить механизмы, ответственные за генерацию и поддержание судорожной активности и дать заключение о взаимосвязи между антисудорожным действием мелатонина и вальпроата натрия и изменениями в системах цАМФ- и Са2+/кальмодулин-зависимого фосфорилирования нейрональных белков, что позволит обогатить существующие на сегодняшний день знания о механизмах действия антиконвульсантов широкого спектра действия и, возможно, дать дополнительное направление для разработки новых актиконвульсантов.

Цель и задачи исследования.

Целью диссертационной работы является изучение участия систем цАМФ- и Са2+/кальмодулин-зависимого фосфорилирования нсйрональных белков в механизмах развития и поддержания судорожной активности, а также в реализации действия антиконвульсантов широкого спектра действия мелатонина и вальпроата натрия.

Конкретные задачи исследования:

1. Выявление особенностей функционирования систем цАМФ- и Са2+/кальмодулин-зависимого фосфорилирования белков в мозге крыс линии Крушинского-Молодкиной (КМ), обладающих наследственной предрасположенностью к аудиогенным судорогам по сравнению с нечувствительными к звуковому воздействию крысами В и стар;

2. Сравнительный анализ изменений систем фосфорилирования нейрональных белков в мозге крыс линии КМ после однократных аудиогенных судорог и после хронического звукового воздействия (аудиогенного киндлинга);

3. Исследование влияния мелатонина и вальпроата натрия на активности протеинкиназ CaMKII и РКА in vitro;

4. Анализ влияния однократного введения мелатонина и вальпроата натрия на исследуемые системы фосфорилирования и аудиогенные судороги крыс линии КМ;

5. Изучение действия хронического потребления мелатонина и вальпроата натрия крысами КМ на параметры судорог и динамику развития миоклонуса при аудиогенном киндлинге;

6. Исследование отставленного действия введения мелатонина (50 мг/кг) крысятам КМ в критические для развития мозга периоды постнатального развития (1-7Р, 7-14Р и 14-21Р дни) на реализацию чувствительности к звуку в половозрелом возрасте, а также на системы цАМФ- и Са2+/кальмодулин-зависимого фосфорилирования нейрональных белков и состояние синаптических контактов пирамидных нейронов поля САЗ гиппокампа.

Научная новизна.

В представленной работе впервые показано, что у животных с наследственной предрасположенностью к судорогам в различных структурах мозга, вовлеченных в реализацию судорожной активности, существует генетически детерминированное изменение содержания Са2+/кальмодулин-ре1улируемых ферментов - протеинкиназы CaMKII и протеинфосфатазы кальцинейрина, что может являться одним из механизмов, участвующих в формировании нейрональной гипервозбудимости. Показано, что даже однократное судорожное воздействие вызывает долговременные изменения содержания 8 а-субъединицы CaMKII и кальцинейрина в отдельных структурах мозга крыс КМ. Выявлено антисудорожное действие мелатонина и вальпроата натрия на различные типы аудиогенных припадков, а также потенциирующее действие мелатонина на антисудорожную активность вальпроата натрия при совместном применении антиконвульсантов. Впервые продемонстрировано, что антисудорожное действие мелатонина и вальпроата натрия при однократном введении сопровождается изменениями в системах цАМФ- и Са2+/кальмодулин-зависимого фосфорилирования нейрональных белков. Показано, что применение мелатонина на ранних стадиях постнатального развития может оказывать как анти-, так и просудорожное отставленное действие в зависимости от постнатальных сроков введения, сопровождающееся изменениями исследуемых систем фосфорилирования и морфологическими модификациями синаптических контактов пирамидных нейронов поля САЗ гиппокампа, что предполагает более осторожный выбор антисудорожной терапии при лечении ювенильных эпилептических синдромов.

Научно-практическое значение.

Результаты, полученные в данной работе указывают на вовлечение систем фосфорилирования/дефосфорилирования нейрональных белков и белков цитоскелета в механизмы предрасположенности и реализации судорожных состояний и намечают подходы к разработке нового класса антиэпилептических препаратов, мишенью которых является система вторичных посредников.

Заключение диссертации по теме «Физиология», Савина, Татьяна Александровна

Выводы:

1. Выявленные особенности содержания а-изоформы CaMKII, кальцинейрина и МАР2, а также активностей протеинкиназ CaMKII и РКА в отдельных структурах мозга крыс линии КМ по сравнению с Вистар, а также модификации функционирования систем цАМФ- и Са2+/кальмодулин-зависимого фосфорилирования после однократных аудиогенных судорог и аудиогенного киндлинга указывают на вовлечение этих систем фосфорилирования в механизмы инициации и генерализации нейрональной гипервозбудимости.

2. Установлено, что in vitro мелатонин и вальпроат натрия ингибируют общую активность CaMKII, константа ингибирования для вальпроата натрия по сайту связывания фермента с комплексом Са /кальмодулин составляет 35 мкМ.

3. Ослабление аудиогенных припадков при однократном введении мелатонина и вальпроата натрия сопровождается увеличением функциональной активности CaMKII в ряде структур мозга крыс КМ и, в меньшей степени, изменением активности РКА. Кроме того, введение вальпроата натрия вызывает увеличение Са2+/кальмодулин-зависимого и снижение цАМФ-зависимого фосфорилирования МАР2 в гиппокампе крыс линии КМ.

4. Хроническое потребление мелатонина не оказывает влияния на характер аудиогенных припадков крыс КМ при аудиогенном киндлинге, в то время как вальпроат натрия приводит к ослаблению судорожной реакции. Применение мелатонина совместно с вальпроатом натрия потенциирует антисудорожное действие последнего.

5. Выявлено отставленное действие введения экзогенного мелатонина крысятам КМ в ранний постнатальный период развития на реализацию судорожной готовности крыс в половозрелом возрасте: введение мелатонина с 1-7Р и 14-21Р оказывает слабое антисудорожное действие, в то время как применение препарата в период с 7-14Р имеет выраженный проэпилептогенный эффект.

6. На примере изучения антиконвульсантов двух различных фармакологических классов (мелатонин и вальпроат натрия) показано, что их действие реализуется с участием цАМФ- и Са /кальмодулин-зависимых систем фосфорилирования нейрональных белков. 1 2 3 4 5 6 7 8 9

10

11

12

13

14

15

Заключение.

Выявленные нами особенности функционирования цАМФ- и Са2+/кальмодулин-зависимых систем фосфорилирования нейрональных белков в мозге крыс линии КМ (изменение содержания и фосфосостояния МАР2 в неокортексе, увеличение функциональной активности CaMKII в н.б.ч. и неокортексе и активности РКА в н.б.ч., снижение содержания кальцинейрина в гиппокампе), свидетельствуют о существовании особого нейрохимического статуса ЦНС животных, обладающих генетической предрасположенностью к аудиогенным судорогам. Долговременные модификации этих систем при индукции однократных судорожных припадков и аудиогенном киндлинге, в первую очередь, значительное увеличение содержания нейроспецифической а-субъединицы CaMKII и кальцинейрина в гиппокампе крыс КМ после однократных аудиогенных судорог, служат подтверждением вовлечения цАМФ- и Са2+/кальмодулин-зависимых систем фосфорилирования в механизмы инициации и генерализации нейрональной гипервозбудимости. Можно предположить, что наблюдаемые нами изменения содержания а-САМКН и кальцинейрина после однократных аудиогенных припадков крыс КМ являются следствием судорожной активности, в то время как дальнейшие изменения содержания этих ферментов после аудиогенного киндлинга могут отражать сложное взаимодействие процессов эпилептогенеза и антогонистичных ему эндогенных перестроек, направленных на снижение возбудимости нейронов неокортексе и гиппокампе крыс КМ.

Следует отметить, что между исследуемыми системами фосфорилирования существует сложная взаиморегуляция, которая осуществляется через систему низкомолекулярных фосфопротеинов - ингибиторов протеинфосфатазы I (РР1) (Рис.3.32). Впервые такое взаимодействие путей было предложено П.Грингардом для белка DARP32 дофаминергических синапсов, являющегося изоформой ингибитора I, широко распространенного в различных отделах ЦНС (Greengard et al., 1998; Rakhilin et al., 2004). PP1 дефосфорилирует как CaMKII, так и регуляторную субъединицу РКА, изменяя кинетику активации последней. В результате цАМФ-зависимого фосфорилирования ингибитор I подавляет активность РР1, что, в свою очередь, приводит к снижению дефосфорилирования активной автофосфорилированной формы CaMKII, продлевая время

113 ее существования. В свою очередь, дефосфорилирование ингибитора I кальцинейрином устраняет его действие на РР1. Кальцинейрин также дефосфорилирует РКА (Rusnak and Mertz, 2000). цАМФ-зависимое фосфорилирование Са31-активируемой цистеиновой протеазы кальпаина, значительная часть которого в клетках заякорена на микротрубочках около МАР2, приводит к увеличению активности кальпаина, вызывая частичный протеолиз кальцинейрина и его активацию (Krebs and Graves, 2000; Wu et al., 2003). цАМФ-зависимая протеинкиназа и CAMKII имеют частично перекрывающуюся субстратную специфичность, но фосфорилируют различные остатки Ser или Thr субстрата, что также приводит к различной модуляции активности белка-эффектора.

Предполагаемая схема действия мелатонина и вальпроата натрия на уровне взаимодействия между системами цАМФ- и Са2Укачьмодулин-зависимого фосфорилирования нейрональных белков.

К числу таких субстратов относятся синапсин I, МАР2, субъединицы потенциал-зависимых Са2+ и Na+ каналов, а также АМРА-рецепторов и др. Изменение фосфорилирования ядерных субстратов CaMKII и РКА также регулирует активность генома. Так, субстратом РКА в ядре является, в частности, CRE-связывающий белок CREB. Недавно выявлено, что сплайсинговая варианта а»-СаМК11 имеет ядерную локализацию, хотя ее ядерные субстраты не установлены (Bayer and Schulman, 2001). Дополнительным регулирующим фактором, вероятно, может выступать уровень свободного кальмодулина, «доступного» для Са2+/кальмодулин-регулируемых ферментов (CaMKII, кальцинейрина), содержание которого в нейронах различных отделов мозга обычно меньше уровня кальмодулин-регулируемых ферментов, что предполагает наличие в клетках сложной регуляции его распределения. Таким образом, нарушение того или иного звена этой взаиморегуляции может не только вызывать нарушение фосфосостояния определенных белков в различных клеточных компартментах, но и напрямую влиять на геном.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что антисудорожное действие вальпроата натрия и мелатонина опосредуется влиянием этих антиконвульсантов на системы вторичных посредников. В отличие от вальпроата натрия, влияние мелатонина на судорожную активность определяется также его ядерными ROR/RTZ-рецепторами, регулирующими активность хроматина, поэтому применение мелатонина в критические для становления нервной системы периоды развития может оказывать не только антисудорожное, но и проэпилептогенное действие. В настоящее время модуляторное действие мелатонина и вальпроата натрия на возбудимость нервной системы связывают, в основном, с их действием на ГАМК-рецепторы (Смирнов, 2003; Johannessen, 2000). Учитывая высокую липофильность мелатонина и вальпроата натрия, выявленный нами линейный характер ингибирования ими активности CaMKII свидетельствует о возможном действии этих веществ непосредственно на уровне клеточных мишеней, например, через кальмодулин. Наиболее вероятным представляется, что наблюдаемые нами при введении антиконвульсантов изменения активностей протеинкиназ и фосфорилирования МАР2 (при введении вальпроата натрия) являются следствием сложной совокупности процессов взаимомодуляции различных структур мозга, действием мелатонина и вальпроата натрия на ГАМК-ергическую передачу и непосредственного влияния антиконвульсантов на уровне их клеточных мишеней, результатом которой является общее ослабление судорожного припадка. Учитывая универсальность цАМФ- и Са /кальмодулин-зависимых систем фосфорилирования, а также полифункциональность СаМКИ, РКА и кальцинейрина, введение животным мелатонина и вальпроата натрия в значительной степени меняет биохимический статус нервных клеток и может частично объяснять широкий спектр антисудорожного действия этих препаратов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Савина, Татьяна Александровна, 2005 год

1. Акимова И.М., Гурчии Ф.А., Королева Н.Ю., Л. А. Мелючева, Е.А.Тайц. Клиническое проявление трансплантации эмбриональных зачатков мозга при заболевании эпилепсией // Физиология человека, 2000, Т.26, № 3, стр. 67-78.

2. Батуев А.С., Братина Т.А., Александров А.С., Рябинская Е.А. Аудиогенная эпилепсия: морфофункциональный анализ // Журнал высшей нервной деятельности, 1997, Т.47,Вып.2., стр. 431-438.

3. Богданов Н.Н. Значение интегральных подходов в поиске предикторов и изучении механизмов возникновения и развития эпилепсии // Успехи физиол. наук, 1997, Т.28, №2, стр. 21-39.

4. Веретенников Н.А., Куликова Д.А., Панин В.М., Корочкин Л.И. Биологические аспекты эпилепсии: морфологические и молекулярные исследования аудиогенной эпилепсии //Успехи соврем, биологии., 1996, Т.116, Вып.4., стр.407-417.

5. Годухин О.В. Клеточно-молекулярные механизмы киндлинга. // Успехи физиологических наук, 2005, Т.36, №2, стр. 41-54.

6. Зенков Л. Р. , Притыко А. Г. Фармакорезистентные эпилепсии: Руководство для врачей. М: МЕДпресс-информ, 2003 208 с.

7. Зенков Л.Р. Клиническое значение изменений электроэнцефалограммы при лечении эпилепсии вальпроатом (Депакин хроно). // Журн. невропатол. и психиатр. 2002, № 102,стр. 20-26.

8. Карлов В. А. Эпилепсия. М.: Медицина, 1990. 336 с.

9. Кветная Т.В. Мелатонин: роль и значение в возрастной патологии. // Т. В. Кветная, И.В.Князькин; Под ред. В.Х.Хавинсона. С-Пб;ВМедА, 2003. 93с.

10. Ковальзон В.М. Мелатонин, эпифиз и сон млекопитающих. //Нейрохимия, 2003, Т.20, №2, стр.93-100.

11. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики . М.: Мир, 1979 282 с.

12. Крушинский Л. В. Формирование поведения животных в норме и патологии. М.; Из-во МГУ, I960-264с.

13. Кулинский В.И.,.Колесниченко Л.С. Молекулярные механизмы действия гормонов I. Рецепторы. Нейромедиаторы. Системы со вторыми посредниками. // Биохимия, 2005, Вып.70, №1, стр. 33-51.

14. Семиохина А.Ф., Федотова И.Б., Кузнецова Л.М. Крысы линии Крушинского-Молодкиной как модель для изучения патологических состояний и методов их16