Трансформация 2,4,6-тринитротолуола молочнокислыми бактериями тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Суворова, Елена Степановна

• Суворова, Елена Степановна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Суворова, Елена Степановна

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Восстановление арильных нитрогрупп

2.2. Основные пути микробного метаболизма ТНТ

2.2.1. Трансформация ТНТ в аэробных условиях

2.2.2. Трансформация ТНТ в анаэробных условиях

2.3. Нитроредуктазы

2.3.1. Кислород-нечувствительные нитроредуктазы

2.3.2. Кислород-чувствительные нитроредуктазы

2.4. Молекулярные основы токсичности нитроароматических соединений

2.4.1. Цитотоксичность нитроароматических соединений

2.4.2. Генотоксичность нитроарилов

3. Материалы и Методы

3.1. Микроорганизмы и условия культивирования.

3.2. Идентификацию молочнокислых бактерий.

3.3. НП-ПЦР Фингерпринтинг геномов и выделение тотальной ДНК лактобацилл

3.4. Проверка чувствительности штаммов к ТНТ

3.5. Эксперименты по трансформации ТНТ

3.5.1. Трансформация ТНТ клеточными суспензиями

3.5.2. Трансформация ТНТ суспензиями протопластов

3.5.3. Трансформация ТНТ клеточными экстрактами

3.6. Тест на восстановление мембранонепроницаемых акцепторов электронов

3.7. Определение ферментативных активностей

3.8. Очистка нитроредуктаз Ь./егтепШт В83601 32 3.8.1. Нитроредуктаза

3.8.2. Нитроредуктаза

3.9. Определение кинетических параметров нитроредуктаз

3.10. Определение молекулярного веса нитроредуктаз

3.11. Определение типа флавиновых кофакторов

3.12. Аналитические методы

3.12.1. НРЬС-анализ

3.12.2. ТЬС-анализ

3.12.3. Масс-спектрометрический анализ

3.12.4. !Н-ЯМР - анализ

3.12.5. Химический синтез стандартов: 2-АДНТ, 4-АДНТ и ГАДНТ

3.13. Определение концентрации белка

3.14. 808-РААС электрофорез

4. Обоснование выбора объекта исследования

5. Результаты

5.1.Выделение и идентификация лактобацилл, способных трансформировать ТНТ

5.1.1. Идентификация изолятов с использованием классических физиолого-биохимических тестов

5.1.2. Использование фингерпринтинга геномов для дифференциации изолятов лактобацилл

5.2. Метаболизм ТНТ, ксенобиотика из класса полинитроароматических соединений

5.2.1. Активность трансформации ТНТ и ингибирование роста лактобацилл, осуществляющих гомо- и гетероферментативное брожение

5.2.2. Идентификация основных продуктов трансформации ТНТ лактобациллами

5.2.3. Активность оксидоредуктаз молочнокислого брожения исследуемых штаммов лактобацилл

5.2.4. Нитроредуктазная активность клеточных экстрактов лактобацилл

5.2.5. Ингибирование активности ключевых дегидрогеназ лактобацилл под действием ТНТ и ГАДНТ

5.2.6. Локализация нитроредуктазной активности в клетках

Ь./егтепШт В83601 и Ь.р1агйагит В83604 53 5.3. Очистка и характеристика нитроредуктаз штамма Ь./егтепШт В

5.3.1. Выделение и очистка нитроредуктазы (НР1) из мембранной фракции

5.3.2. Очистка внутриклеточной нитроредуктазы (НР2) штамма

Ь. /егтеШитВ^

5.3.3. Анализ кофакторной специфичности НР1 и НР

5.3.4. Влияние температуры на активность и стабильность НР1 и НР

5.3.5. рН-зависимость активности НР1 и НР

5.3.6. Кинетические параметры НР1 и НР

5.3.7. Молекулярный вес и субъединичный состав НР1 и НР

5.3.8. Ингибиторы ферментативной активности нитроредуктаз штамма Ь. /егтепШт В

5.3.9. Определение спектра утилизуемых нитроароматических субстратов НР1 и НР

5.3.10. Интермедиаты и продукты реакций нитровосстановления, катализируемых нитроредуктазами НР1 и НР

6. Обсуждение результатов

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Трансформация 2,4,6-тринитротолуола молочнокислыми бактериями»

1.1. Актуальность проблемы. Устойчивое функционирование биосферы предполагает вовлечение химических соединений антропогенного происхождения в природные биогеохимические циклы. К числу экологически опасных, трудно-разлагаемых соединений относятся нитроароматические ксенобиотики, производство которых обусловлено использованием в ряде отраслей промышленности и сельского хозяйства. Кроме традиционного применения в качестве взрывчатых веществ, сырья и полупродуктов для производства красителей, синтетических полимеров и растворителей, они известны как избирательно токсические вещества для медицины и сельского хозяйства - лекарства и пестициды.

Одним из наиболее экологически опасных полинитроарилов является взрывчатое вещество, 2,4,6-тринитротолуол (ТНТ). Проблема биодеградации ТНТ привлекла к себе особенно пристальное внимание в последние годы в связи с выявлением новых фактов загрязнения ^Ёрриторий, связанных с производством и использованием взрывчатых веществ. Даже в случае прекращения их производства, а также операций с боеприпасами, ТНТ продолжает обнаруживаться спустя 50 лет на территориях заводов соответствующего профиля и военных баз, причем его содержание достигает величин, измеряемых десятками и сотнями мг кг*1 загрязненных почв, что, в свою очередь, ведет к загрязнению грунтовых вод (Gard et al., 1995, Comfort et al., 1995).

Биотрансформация нитроароматических соединений, особенно производных бензола, толуола, полициклических углеводородов, в большинстве случаев включает в качестве первого этапа восстановление нитрогрупп. Независимо от того, имеет ли место вначале одно- или двухэлектронная атака арильных нитрогрупп, последующие этапы их полного восстановления соответствуют общей схеме (Spain, 1995):

Aryl-N02 -> Aryl-NO Aryl-NHOH -> Aryl-NH2 Наличие трех нитрогрупп у ароматического кольца ТНТ обуславливает его выраженную электрофильность, снижающуюся уже после восстановления первой нитрогруппы. Поэтому образование моноаминопроизводных ТНТ характерно для его микробной атаки, и триада: ТНТ, 2-амино-4,6-динитротолуол (2-АДНТ) и 4-амино-2,6-динитротолуол (4-АДНТ) циркулирует в объектах окружающей среды (Pereira et al., 1979, Neumeier et al., 1990), в организме человека (Woolen et al., 1988; Liu et al., 1995), в растениях (Harvey et al., 1990). Хотя авторы нескольких работ продемонстрировали принципиальную возможность полного разложения ТНТ (Наумова с соавт., 1988, Funk et al., 1993, Bumpus, Tatarko, 1994; Michels, Gottschalk, 1994) актуальной остается проблема ограниченного воздействия многих микроорганизмов на данный ксенобиотик и факторов, ограничивающих этот процесс. Это подтверждают новые работы с использованием равномерно меченого [14С]ТНТ (Pasty-Grigsby et al., 1996, Boopathy, Manning, 1996).

Ограниченная трансформация ТНТ привлекает внимание и в связи с тем, что образование Aryl-NO и Aryl-NHOH как интермедиатов трансформации нитро-арилов может быть основой их метаболической активации, ответственной за токсические и генотоксические эффекты исходных соединений (Feifer et al, 1986, Einisto et al, 1991, Rafii et al, 1994, Neumann et al, 1995, Spanggord et al, 1995). Сравнительное изучение мутагенной активности ТНТ и устойчивых продуктов его нитровосстановления свидетельствует о вероятной генотоксичности его ре-акционноспособных интермедиатов - нитрозо- и/или гидроксиламинопроизвод-ных (Spanggord et al, 1995).

Многочисленные данные о невозможности существенной минерализации ТНТ при моделировании его биодеградации в различных условиях, с использованием разных микроорганизмов, а также неэффективность большинства известных биотехнологий в отношении рекультивации ТНТ-загрязненных территорий (Hoffsommer, Rosen, 1972, Bennett, 1995, Palmer et al, 1997, Shen et al, 1997) свидетельствуют о необходимости выявления «узких мест» на путях биодеградации данного ксенобиотика.

С учетом реальных масштабов локального и рассеянного загрязнения ТНТ, в том числе выявленного у отдельных групп населения, представляет интерес выбор в качестве модели для исследования трансформации ТНТ микроорганизмов, способных функционировать в условиях специализированных технологий реме-диации ТНТ-загрязненных почв, с использованием отходов некоторых пищевых производств. С этих позиций заслуживают внимания бактерии, осуществляющие молочнокислое брожение органических субстратов растительного происхождения. Самостоятельный интерес представляет то, что эти бактерии входят в состав нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека и животных. Более того, лечебные препараты на основе живых клеток молочнокислых бактерий (пробиотики) широко используются, в соответствии с концепцией И. И. Мечникова для оздоровления человека и животных путем усиления роли данной группы микроорганизмов в составе микробных популяций пищеварительного тракта.

1.2. Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение особенностей трансформации ТНТ молочнокислыми бактериями из различных экологических ниш. Ставились следующие задачи:

• выделить из различных мест обитания молочнокислые бактерии, способные расти в присутствии ТНТ и идентифицировать их;

• выяснить возможность трансформации ТНТ полученными изолятами, изучить пути его превращения наиболее активными штаммами и идентифицировать основные метаболиты;

• оценить в исследуемых штаммах активность ключевых оксидоредуктаз молочнокислого брожения, участвующих в формировании пула восстановительных эквивалентов, потребляемых в реакциях нитроредукции ТНТ, и влияние на их активность как исходного ксенобиотика, так и продуктов его частичного нитровосстановления;

• очистить и охарактеризовать ферменты, ответственные за нитроредукцию ТНТ у наиболее активного штамма молочнокислых бактерий.

1.3. Научная новизна. Проведенное исследование впервые выявило способность микроорганизмов осуществлять практически полное (до 95-97%) превращение высоких концентраций ТНТ (400-600 мкМ) в продукты его ограниченного нитровосстановления - изомерные гидроксиламинодинитротолуолы (ГАДНТ), что несоизмеримо выше масштабов образования этих метаболитов всеми известными микроорганизмами, способными к трансформации ТНТ. Комплексное изучение возможностей трансформации данного ксенобиотика целыми клетками, клеточными экстрактами и изолированными нитроредуктазами позволило выявить лимитирующий этап в механизме трансформации ТНТ. Сущность этого «узкого места» (или одного из таких мест) заключается в ингибировании ключевых оксидоредуктаз молочнокислого брожения, ответственных за создание пула редуцирующих эквивалентов. Получены в очищенном состоянии и охарактеризованы две новые нитроредуктазы, проявляющие активность по отношению к ТНТ.

1.4. Практическая значимость. С учетом реальных масштабов локальной и рассеянной контаминации трйнитротолуолом почв и водных ресурсов, важное значение имеет прогнозирование поведения этого ксенобиотика в природных сферах и в организме человека. В этой связи могут быть использованы полученные данные о трансформации ТНТ в экологически опасные продукты его ограниченного восстановления, ответственные за проявление его генотоксических свойств. Обнаруженный в данной работе механизм торможения более глубокой трансформации ТНТ, опосредованный ингибированием ключевых оксидоредуктаз, может служить моделью при выявлении факторов, лимитирующих биодеградацию ТНТ и ответственных за неэффективность известных биотехнологий применительно к минерализации и детоксикации данного вещества.

Выявлен новый аспект реальной опасности контакта человека и животных с ТНТ, поскольку лактобациллы, трансформирующие ТНТ в метаболиты с токсическими и мутагенными свойствами, принадлежат к нормальной микрофлоре пищеварительного тракта, а также являются основой пробиотических препаратов, используемых для коррекции этой микрофлоры и для повышения иммунного статуса человека.

2.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ

В последнее время внимание большого числа исследователей направлено на решение острой экологической проблемы - ремедиации объектов окружающей среды от остатков взрывчатых смесей и продуктов их трансформации в естественных условиях. К самым распространенным соединениям этого ряда относятся нитрозамещенные ароматические соединения, такие как тринитротолуол (ТНТ), тринитробензойная кислота (ТНБК), тринитрофенол или пикриновая кислота (ТНФ), К-метил->1,2,4,6-тетранитроанилин (TETRIL), 2,2',4,4',6,6'-гексанитро-дифениламин (HEXIL). Загрязнение окружающей среды соединениями аналогичной природы происходит также при производстве и использовании пестицидов, лекарств, красителей.

Недавние исследования выявили ряд микробных систем, осуществляющих трансформацию или полную минерализацию нитроараматических соединений. Однако, как отмечено в обзоре Спейна (Spain, 1995), процесс биодеградации этого класса ксенобиотиков требует преодоления ряда барьеров, обусловленных: а) - токсичностью нитроароматических соединений для микроорганизмов, б) - их низкой растворимостью и высокой сорбционной способностью, в) - одновременным присутствием, смеси нитроароматических соединений и г) - отсутствием в микробных сообществах специфических катаболических систем для эффективной деградации нитроароматических ксенобиотиков. Однако, тот факт, что нитроорганические соединения встречаются в природе, например, хлорамфени-кол, пиролнитрин, нитроспорин, 3-нитропропионовая кислота и соответствующий спирт, может влиять на адаптацию микроорганизмов и их способность к деградации аналогичных по природе ксенобиотиков.

За последние несколько лет интенсивные исследования биоразложения нитроароматических соединений привели к значительному прогрессу в понимании микробных механизмов деградации этого класса ксенобиотиков.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Суворова, Елена Степановна

8. Выводы

1. Из различных экологических ниш выделены и идентифицированы восемь штаммов лактобацилл, способных к росту в присутствии ТНТ.

2. Впервые показана возможность почти стехиометрической трансформации высоких концентраций ТНТ интактными клетками лактобацилл в продукты его ограниченной нитроредукции: 2- и 4-гидроксиламинодинитротолуолы. Выявлена обратная зависимость между активностью трансформации ТНТ и устойчивостью к его токсическому действию.

3. Обнаруженное НАД(Ф)Н-зависимое нитровосстановление ТНТ значительно активнее в экстрактах клеток гетероферментативных штаммов, чем гомофер-ментативных, что согласуется с соотношением активностей трансформации ТНТ интактными клетками.

4. ТНТ и ГАДНТ оказывают ингибирующее действие на Г-6-Ф-дегидрогеназную и ЗФГА-дегидрогеназную активности клеточных экстрактов лактобацилл. Тем самым, выявлено одно из вероятных «узких мест», ограничивающих трансформацию ТНТ интактными клетками лактобацилл.

5. Штамм Ь./егтепШт В83601, наиболее активный среди исследуемых изолятов, имеет две кислород-нечувствительные ФМН-содержащие НАДФН-зависимые нитроредуктазы, НР1 и НР2. Ферменты имеют молекулярный вес 55 и 56 кДа для НР1 и НР2 и составлены из двух идентичных субъединиц. По физико-химическим и каталитическим свойствам нитроредуктазы имеют ряд как общих свойств, так и принципиальных различий.

6. В отличие от целых клеток нитроредуктазы Ь. /егтепШт В 83601 катализируют процесс полного восстановления нитрогрупп во втором и/или четвертом положениях ароматического кольца ТНТ.

7. Заключение

Таким образом, проведенное исследование выявило способность микроорганизмов осуществлять практически полное (до 95-97%) превращение ТНТ в ближайшие продукты его восстановления - изомерные гидроксиламинодинитротолуолы. С точки зрения прогнозирования отдаленных последствий загрязнения больших территорий компонентами взрывчатых смесей, в составе которых преобладает ТНТ, особое значение следует придавать факту возможной аккумуляции генетически опасных гидроксиламинопроизводных различных нитроароматических соединений. О роли последних в мутагенном эффекте ТНТ косвенно свидетельствуют результаты сравнительного тестирования ТНТ и продуктов завершенного восстановления одной из его нитрогрупп - 2-АДНТ и 4-АДНТ (Spanggord, 1995). Тот факт, что эти соединения менее мутагенны, чем ТНТ, для Salmonella typhimurium ТА 100 (имеющего нитроредуктазу), но не для TA100NR (лишенного этой активности) свидетельствует в пользу решающей роли частично восстановленных интермедиатов, и, прежде всего, гидроксиламинопроизводных, в реализации мутагенного эффекта ТНТ.

Исследование ингибирующей активности нитроарилов и продуктов их трансформации для белков клетки может служить моделью для выявления факторов, лимитирующих биодеградацию ТНТ, в связи с выявлением причин неэффективности известных биотехнологий применительно к минерализации и детоксика-ции данного вещества.

Рассмотренные результаты работы проливают свет на еще один аспект реальной опасности контакта человека и животных с ТНТ, поскольку лактобациллы, способные с высокой скоростью трансформировать ТНТ в метаболиты с токсическими и мутагенными свойствами, принадлежат к нормальной микрофлоре пищеварительного тракта, а также являются основой пробиотических препаратов, используемых для коррекции этой микрофлоры и для повышения иммунного статуса человека.

Ранее была показана возможность направленного воздействия на глубину биотрансформации ТНТ путем варьирования терминального акцептора электронов (нитрата или кислорода) у факультативно анаэробных бактерий (Наумова с соавт., 1988). Дальнейшее изучение механизмов регуляции трансформации ТНТ, в том числе у молочнокислых бактерий, может послужить основой для активизации процессов обезвреживания и глубокого разложения экологически опасных токсикантов нитроароматической природы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Суворова, Елена Степановна, 1999 год

1. Амерханова H.H., Наумова Р.П. 1975. Микроорганизмы, разрушающие а-тринитротолуол. Сборник аспирантских работ. Серия биол. Казань. Изд-во КГУ. с. 144-146.

2. Амерханова H.H., Наумова Р.П. 1977. Токсикологическая оценка превращения 2,4,6-тринитротолуола водными микроорганизмами. Пробл. Охр. Водн. Рыбн. Ресурс. Поволжья. Тезисы докладов. Казань, с. 123.

3. Амерханова H.H., Наумова Р.П. 1978. 2,4,6-Тринитротолуол как источник питания для бактерий. Микробиология. 47:393.

4. Амерханова H.H., Наумова Р.П. 1979. Сравнительное исследование острой токсичности а-тринитротолуола и продуктов его биодеградации для гидро-бионтов. Биологические науки. N 2. 26-28.

5. Карамова Н.С., Ильинская О.Н., Иванченко О.Б. 1994. Мутагенная активность 2,4,6-тринитротолуола: роль метаболизирующих ферментов. Генетика, 30: 898-902.

6. Карамова Н.С., Мынина И.И., Гараева Г.Г, Иванченко О.Б, Ильинская О.Н. 1995. 2,4,6-триниротолуол и 2,4-диамино-6-нитротолуол: отсутствие гесА-зависимого мутагенеза? Генетика, 31: 617-621.

7. Квасников Е.И., Нестеренко O.A. 1975. Молочнокислые бактерии и пути их использования. М.: Наука. 389с.

8. Методы общей бактериологии 1984. (под.ред. Ф.Герхардта), т.1. М.: Мир. 254с.

9. Наумова Р.П. 1985. Микробный метаболизм неприродных соединений. Казань: Изд-во КГУ. 240с.

10. Наумова Р.П. Сел ивановская С.Ю., Мингатина Ф.А. 1988а. Изучение возможности глубокой бактериальной деструкции 2,4,6-тринитротолуола. Микробиология. 57: 218-222.

11. Наумова Р.П., Амерханова H.H., Шайхутдинов В.А. 1979. Изучение первого этапа превращения тринитротолуола под действием Pseudomonas deni-trificans. Прикл. Биох. Микробиол. 15:45-50.

12. Наумова Р.П., Селивановская С.Ю., Черепнева И.Е. 1988. Превращение 2,4,6-тринитротолуола в условиях кислородного и нитратного дыхания Pseudomonas fluorescens. Прикл. Биох. Микробиол. 24:493-498.

13. Фонштейн JI.M., Калинина Л.М., Полухина Г.М., Абилев С.К., Шапаро A.A. 1977. Тест-система оценки мутагенной активности загрязнителей среды на Salmonella. Москва.

14. Ahlborg G.Jr., Bergstrom В., Hogstedt С., Einisto P., Sorsa M. 1985. Urinary screening for potentially genotoxic exposures in a chemical industry. Br. J. Ind. Med. 42:691-699.

15. Altman, F. P. 1976. Tetrazolium salts and formazans. Progr. Histochem. Cyto-chem. 9:1-51.

16. Alvarez M.A., Kitts C.L., Botsford J.L., Unkefer P.J. 1995. Pseudomonas aeruginosa strain MAOl aerobically metabolizes the aminodinitrotoluenes produced by 2,4,6-trinitrotoluene nitro-group reduction. Can. J. Microbiol. 41: 984991.

17. Angermaier L. and H.Simon. 1983a. On nitroaryl reductase activities in several Clostridia. Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 364: 1653-1663.

18. Angermaier L. and H.Simon. 1983b. On the reduction of aliphatic and aromatic nitro compounds by Clostridia, the role of ferredoxin and its stabilization. Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 364: 961-975.

19. Averiii B.A. 1995. Transformation of inorganic N-oxides by denitrifying and nitrifying bacteria: pathways, mechanisms, and revealance to transformation of nitroaromatic compounds, in Biodegradation of nitroaromatic compounds, New York, Plenum.

20. Axelsson L.T. 1993. Classification and Physiology, in: Lactic acid bacteria. Salminen,. S and von Wight, A., Eds. New York et al.: Marcel Dekker. 34p.

21. Bayman P.; Radkar G.V. 1997. Transformation and tolerance of TNT (2,4,6-trinitrotoluene) by fungi. Intern. Biodeterior. Biodegradat. 39: 45-53.

22. Beauchamp R.O.Jr., Irons R.D., Rickert D.E., Couch D.B., Hamm T.E.Jr. 1983. A critical reweiv of the literature on nirobenzene toxicity. CRC Crit. Rev. Toxicol. 11:33-96.

23. Bennett J.W. 1994. Prospects for fungal bioremediation of TNT munition waste. Intern. Biodeterior. Biodegradat. 34: 21-34.

24. Bican P., Spahni A. 1989. Lactobacillus lactis protoplasts at different stages of cell cultivation. FEMS Microbiol. Lett. 58:91-94.

25. Biodegradation of nitroaromatic compounds. Ed. J. C. Spain. Plenum. New York, 1995.

26. Blasco R., Castillo F. 1993. Characterization of a nitrophenol reductase from the phototrophic bacterium Rhodobacter capsulatus E1F1. Appl. Environ. Microbiol. 59: 1774-1778.

27. Boopathy R., Kulpa C.F. 1992. Trinitrotoluene (TNT) as a sole nitrogen source for a sulfate-reducing bacterium Desulfovibrio sp (B strain) isolated from an anaerobic digester. Curr. Microbiol. 25: 235-241.

28. Boopathy R., Kulpa C.F., Wilson M. 1993. Metabolism of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) by Desulfovibrio sp. (B-strain). Appl. Microbiol. Biotechnol. 39: 270-275.

29. Boopathy R., Manning J., Montemagno C., Kulpa C. 1994. Metabolism of 2,4,6-trinitrotoluene by a Pseudomonas consortium under aerobic conditions. Curr. Microbiol. 28: 131-137.

30. Boopathy R., Manning J.F. 1996. Characterization of partial anaerobic metabolic pathway for 2,4,6-trinitrotoluene degradation by a sulfate-reducing bacterial consortium. Can. J. Microbiol. 42: 1203-1208.

31. Bradford M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72:248-254.

32. Brown J.P., VanDemak P.J. 1968a. Respiration of Lactobacillus casei. Can. J. Microbiol. 14:829-835.

33. Brown J.P., Edwards M.R., VanDemak P.J. 1968b. Ultrastructure and sites of tetranitro-blue tetrazolium reduction of Lactobacillus casei. Can. J. Microbiol. 14:823-827.

34. Bryant C., DeLuca M. 1991. Purification and characterization of an oxygen-insensitive NAD(P)H nitroreductase from Enterobacter cloacae. J. Biol. Chem. 266: 4119-4125.

35. Bryant C., Hubbard L., McEIroy W.D. 1991. Cloning nucleotide, and expression of the nitroreductase gene from Enterobacter cloacae. J. Biol. Chem. 266: 4126-4130.

36. Bryant C., McEIroy W.D. 1991. Nitroreductases. In Chemistry and biochemistry offlavoenzymes (ed. F. Muller), v.2. CRC Press, Boca Raton, Fla. 291-304.

37. Bumpus J.A., Tatarko M. 1994. Biodégradation of 2,4,6-trinitrotoluene by Phanerochaete chrysosporium identification of initial degradation products and the discovery of a TNT metabolite that inhibits lignin peroxidases. Curr. Microbiol. 28: 185-190.

38. Caton J.E., Ho C., Williams R.T., Griest W.H. 1994. Characterization of insoluble fractions of TNT transformed by composting. // J. Environ. Sci. Health, A29: 659-670.

39. Chandra A.M.S., Quails C.W., Reddy G., Meinkoth J.H. 1995. Hematological effects of 1,3,5-trinitrobenzene (TNB) in rats in vivo and in vitro. J. Toxicol, and Environ. Health. 46: 57-72.

40. Cody T.E., Witherup S., Hastings K., Stemmer K., Christian R.T. 1981. 1,3-Dinitrobenzene: Toxic effects in vivo and in vitro. J. Toxicol. Environ. Health. 7: 829-847.

41. Comfort S.D., Shea P.J., Hundal L.S., Li Z., Woodbury B.L., Martin J.L., Powers W.L. 1995. TNT transport and fate in contaminated soil. J. Eniron. Qual. 24: 1174-1182.

42. Consolo M.C., Monika A., Howard P.C. 1989. Mutagenicity of the phenolic mi-crocomal metabolites of 3-nitrofluorantrene and 1-nitropyrene in strains of Salmonella typhimurium. Mutat. Res. 210: 263-269.

43. Costa V., Boopathy R., Manning J. 1996. Isolation and characterization of a sul-fate-reducing bacterium that removed TNT (2,4,6-trinitrotoluene) under sulfate-and nitrate-reducing conditions. Resource Technol. 56: 273-278.

44. Craig A.M., Bilich D., Will Y., Lee T., Hovervale J. 1994. Biotransformation of trinitrotoluene by anaerobic ruminai bacteria. Abstr. 94th Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol. 409.

45. Crawford R.L. 1995. Biodégradation of nitrated munition compounds and herbicides by obligately anaerobic bacteria. In: Biodégradation of nitroaromatic compounds. Ed. By J.C.Spain, New York, Plenum. Press,. 87-98.

46. De Master E.G. 1997. Mechanism for the inhibition of aldehyde by nitric oxide. Alcohol, 14(2): 181-189

47. Delclos K.B., Heflich R.H. 1992. Mutation induction and DNA adduct formation in Chinese hamster ovary cells treated with 6-nitrochrysene, 6-aminostyrene and their metabolites. Mutat. Res. 279: 153-164.

48. Dilley J.V., Tyson C.A., Spanggord R.J., Sasmore P.D., Newell G.W., Dacre J.C. 1982. Short-term oral toxicity of 2,4,6-trinitrotoluene in mice, rats and dogs. J. Toxicol. Environ. Health. 9: 565-585.

49. Doi T., Yoshimura H., Tatsumi K. 1983. Properties of nitrofiiran reductases from Escherichia coli B/r. Chem. Pharm. Bull. 31: 1105-1107.

50. Duque E., Haidour A., Godoy F., Ramos J.L. 1993. Construction of a Pseudomonas hybrid strain that mineralized 2,4,6-trinitrotoluene. J. Bacteriol. 175:2278-2283.

51. Ederer M.M.; Lewis T.A.; Crawford R.L. 1997. 2,4,6-Trinitrotoluene (TNT) transformation by Clostridia isolated from a munition-fed bioreactor: Comparison with non-adapted bacteria. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 18: 82-88.

52. Einisto P., Watanabe M., Ishidate M.Jr., Nohmi T. 1991. Mutagenicity of 30 chemicals in Salmonella typhimurium strains, possessing different nitroreductase or O-acetyltransferase activities. Mut. Res. 209: 95-102.

53. Fiorella P.D.; Spain J.C. 1997. Transformation of 2,4,6-trinitrotoluene by Pseu-domonaspseudoalcaligenes JS52. Appl. Environ. Microbiol. 63: 2007-2015.

54. Fu P.P., Heflich R.H., vonTungeln L.S., Yang D.T.C., Fifer E.K., Beland F.A. 1986. Effect of nitro group conformation on the rat liver microsomal metabolism and bacterial mutagenicity of 2- and 9-nitroantracene. Carcinogenesis, 7:11.

55. Funk S.B., Roberts D.J., Crawford D.L., Crawford R.L. 1993. Initial-phase optimization for bioremediation of munition compound-contaminated soils. Appl. Environ. Microbiol. 59: 2171-2177.

56. Gard R., Grasso D., Hoag G. 1991. Treatment of explosives contaminated lagoon sludge. Hazard Waste, Hazard. Mater., 8: 319-340.

57. Gilcrease P.C., Murphy V.G. 1995. Bioconversion of 2,4-diamino-6-nitrotoluene to a novel metabolite under anoxic and aerobic conditions. Appl. Environ. Microbiol. 61: 4209-4214.

58. Gingell R. 1973. Substrate non-specificity of Streptococcus faecalis azoreductase. Xenobiotica. 3:165.

59. Gorontzy T., Drzyzga O., Kahl M.W., Brunsnagel D., Breitung J., Vonloew E., Blotevogel K.H. 1994. Microbial degradation of explosives and related compounds. Crit. Rev. Microbiol. 20: 265-284.

60. Groenewegen P.E.J., Breeuwer P., van Holvoort J.M.Z.M., Landenholff A.A.M., de Vries E.P., de Bont J.A.M. 1992. Novel degradative pathway of 485nitrobenzoate in Comamonas acidovorans NBA-10. J.Gen. Microbiol. 138:15991605.

61. Harvey S.D., Fellows R.J., Cataldo D.A., Bean R.M. 1990. Analysis of 2,4,6-trinitrotoluene and its transformation products in soils and plant tissues by highperformance liquid chromatography. J. Chromatogr. 518: 361-374.

62. Hatcher J.F., Yamamoto K., Ishikawa M., Brian G.T., Swaminathan S. 1995. Metabolic reduction of novel 3,4-dichloro-5-nitrofuranes in Salmonella typhimu-rium. Environ. Molec. Mutagenesis. 25: 58-66.

63. Heflich R.H., Unruh L.E., Thornton-Manning J.R., von Tungeln L.S., Fu P.P. 1989. Mutagenicity of l-,3- and 6-nitrosobenzoa.pyrene in Salmonella typhimu-rium and Chinese hamster ovary cells. Mutat. Res. 225: 157-163.

64. Herrero-Saens D., Heflich R.H., von Tungeln L.S., Lewtas L., Fu P.P. 1994. DNA adduct formation by 2-nitrofluorantracene in Salmonella typhymurium and neonatal B6C6F. mice. Polycyclic Aromatic Compounds, 6: 79-85.

65. Hoffsommer J.C., Rosen J.M. 1990. Analysis of explosives in sea water. Bull. Environ. Contamin. Toxicol. 7:177-181.

66. Honeycutt M.E.; Jarvis A.S.; McFarland V.A. 1996. Cytotoxicity and mutagenicity of 2,4,6-trinitrotoluene and its metabolites. Ecotoxicol. Environ. Safety 35: 282-287.

67. Inouye S. 1994. NAP(P)H-flavin oxidoreductase from the bioluminiscent bacterium Vibrio fischeri ATCC 7744, is a flavoprotein. FEBS Lett. 347: 163-168.

68. Iyanagi T. 1990. On the mechanism of one electron reduction of quinones by microsomal flavin enzymes: the kinetic analysis between cytochrome b5 and menadione. Free Radic. Res. Commun. 8:259-268.

69. Kandler, O., Weiss, N. 1986. Regular, non-sporing gram-positive rods, in Ber-gley's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 2 (P.H.A. Sneath, N.S. Mair, M.E. Sharpe, and J.G. Holt, eds.), Williams and Wilkins, Baltimore, p. 1208-1234.

70. Khan T.A.; Bhadra R.; Hughes J. 1997. Anaerobic transformation of 2,4,6-TNT and related nitroaromatic compounds by Clostridium acetobutylicum. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 18: 198-203.

71. Kinouchi T., Morotomi M., Mutai M., Fifer E.K., Beland F.A., Ohnishi Y. 1986. Metabolism of 1-nitropyrene in germ-free and conventional rats. Jpn. J. Cancer Res. (Gann), 77: 356-369.

72. Kinouchi T., Ohnishi Y. 1983. Purification and characterization of 1-nitropyrene nitroreductase from Bacteroides fragilis. Appl. Environ. Microbiol. 46: 596-604.

73. Knox R.J. Friedlos F., Boland M.P. 1993. The bioactivation of CB1954 and its use as a prodrug in antybody-directed enzyme prodrug therapy (ADEPT). Cancer and Metastasis Rev. 12:195-212.

74. Knox R.J., Connors T.A. 1995. Antibody-Directed Enzyme Prodrug Therapy. Potential in cancer. Clin. Immunother. 3(2): 136-153.

75. La D.K., Swenberg J.A. 1996. DNA adducts: biological markers of exposure and potential applications to risk assessment. Mutat. Res. 365: 129-146.

76. Laemmli U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature (London). 227:680-685.

77. Lee H., Chering S.H., Liu T.Y. 1994. Bacterial mutagenicity, metabolism, and DNA-adduct formation by binary mixtures of benzoa.pyrene and 1-nitropyrene. Environ, Molec. Mutagenesis. 24: 229-234.

78. Levine B.S., Rust J.H., Barkley J.J., Furedi E.M., Lish P.M. 1990. Six month oral toxicity study of trinitrotoluene in beagle dogs. Toxicology. 63:233-244.

79. Lewis T.A., Goszczynski S., Crawford R.L., Korus R.A., Admassu W. 1996. Products of anaerobic 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) transformation by Clostridium bifermentans. Appl. Environ. Microbiol. 62: 4669-4674.

80. Lewis T.A.; Ederer M.M.; Crawford R.L.; Crawford D.L. 1997. Microbial transformation of 2,4,6-trinitrotoluene. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 18: 89-96.

81. Liu M., Sussman N., Klopman G., Rosenkranz H.S. 1996. Estimation of the optimal data base size for structure-acivity analyses: The Salmonella mutagenicity data base. Mutat. Res. 358: 63-72.

82. Mc Coy E.C., Rosenkranz H.S., Howard P.C. 1990. Salmanella typhimurium TA100Tn5-1012, a strain deficient in arylhydroxylamine o-esterificase, exhibits a reduced nitroreductase activity. Mutat. Res. 243:141-144.

83. McCormick N.C., Feenerry F.E., Levinson H.S. 1976. Microbial transformation of 2,4,6-trinitrotoluene and other nitroaromatic compounds. Appl. Environ. Microbiol. 31: 949-958.

84. Michael N.P., Brehm J.K., Anlezark G.M., Minton N.P. 1994. Physical characterisation of the Escherichia coli B gene encoding nitroreductase and its overexpression in Escherichia coli K12. FEMS Microbiol. Lett. 124: 195-202.

85. Michels J., Gottschalk G. 1994. Inhibition of the lignin peroxidase of Phanero-chaete chrysosporium by hydroxylamino-dinitrotoluene, an early intermediate in the degradation of 2,4,6- trinitrotoluene. Appl. Environ. Microbiol. 60: 187-194.

86. Michels J., Gottschalk G. 1995. Pathway of 2,4,6-trinitrotoluene degradation by Phanerochaete chrysosporium. in Biodégradation of nitroaromatic compounds, New York, Plenum.

87. Neumann H.G., Albrecht O., Vandorp C., Zwirnerbaier I. 1995. Macromo-lecular adducts caused by environmental chemicals. Clin. Chem. 41: part 2, suppl. S, 1835-1840.

88. Neumann, HG. 1996. Toxic equivalence factors, problems and limitations. Food Chem. Toxicol. 34: 1045-1051.

89. Neumeier, W., von Loew E., Kaminski R., Haas R., Steinbach K. 1990. Migration and microbial metabolism of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) in ground-water. Zbl. Hyg. Umweltmed. 189: 374.

90. Nielsen A. T., Henry R.A., Norris W.P., Atkins R.A., Noore D.W., Coon C.L., Spanggord R.J., Son D.W.H. 1979. Synthetic routs to aminodinitrotoluenes. J. Org. Chem. 14:2499-2504.

91. Norambuena E., Videla L.A., Lissi E.A. 1994. Interaction of nitrobenzoates with haemoglobin in red blood cells and a haemolysate. Human Experim. Toxicol. 13: 345-351.

92. Otsuka S. 1961. Studies on nitro-reducing enzymes of swine liver. J.Biochem. 50:85-94.

93. Palmer W.G., Beaman J.R., Walters D.M., Creasia D.A. 1997. Bioavailability of TNT residues in composts of TNT-contaminated soils. J.Toxicol Environ. Health. 51: 97-108.

94. Pasti-Grigsby M. B., Lewis T.A., Crawford D.L., Crawford R.L. 1996. Transformation of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) by actinomycetes isolated from TNT-contaminated and uncontaminated environments. Appl. Environ. Microbiol. 62:1120-1123.

95. Pereira W.E., Short D.L., Marigold D.B., Roscio P.K. 1979. Isolation and characterization of TNT and its metabolites in groundwater by gas-chromatograph-mass-spectrometer-computer techniques. Bull. Environ. Contamin. Toxicol. 21:554-562.

96. Preuss A., Fimpel J., Diekert G. 1993. Anaerobic transformation of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT). Arch. Microbiol. 159: 345-353.

97. Raffi F., Franklin W., Heflich R.H., Cergnilia C.E. 1991. Reduction of ni-troaromatic compounds by anaerobic bacteria isolated from the human gastrointestinal tract. Appl. Eviron. Microbiol. 57: 962-968.

98. Rafii F., Cerniglia C.E. 1993. Comparison of the azoreductase and nitroreductase from Clostridium perfringens. Appl. Environ. Microbiol. 59:1731-1734.

99. Rafii F., Selby A.L., Newton R.K., Cerniglia C.E. 1994. Reduction and mutagenic activation of nitroaromatic compounds by a Mycobacterium sp. Appl. Environ. Microbiol. 60: 4263-4267.

100. Reddy T.V., Olson G.R., Wiechman B., Reddy G., Robinson M., Torsella J.A., Daniel F.B. 1996. Fourteen-day toxicity study of 1,3,5-trinitrobenzene in Fischer 344 rats. J. Appl. Toxicol. 16: 289-295.

101. Rogosa M., Mitchell J.A., Wiesman R.F. 1951. A selective medium for isolation and enumeration of oral and fecal lactobacilli. J.Bacteriol. 62:132-133.

102. Sabbioni G., O.Sepai. 1995. Comparison of hemoglobin binding, mutagenicity, and carcinogenicity of arylamines and nitroarenes. Chimia, 49: 374-380.

103. Sabbioni G., Wei J.F., Liu Y.Y. 1996. Determination of hemoglobin adducts in workers exposed to 2,4,6-trinitrotoluene. J. Chromatogr. B-Biomedical Appl., 682: 243-248.

104. Saz A.K., Martinez M.L. 1956. Enzymatic basis of resistance to aureomycin. I. Differences between flavoprotein reductases of sensitive and resistance Escherichia coli. J. Biol. Chem. 223:285-292.

105. Smith P.K., Krohn R.I., Hermanson G.T., Mallia A.K., Gartner F.H., Proven-zano M.D., Fugimoto E.K., Goeke N.M., Olsen B.J., Klenk D.S. 1985. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150:76-85.

106. Soomerville C.S., Nishino S.F., Spain J.C. 1995. Purification and characterization of nitrobenzene nitroreductase from Pseudomonas pseudoalcaligenes JS45. J. Bacteriol. 177: 3837-3842.

107. Spain J.C. 1995. Biodégradation of nitroaromatic compounds. Annu. Rev. Microbiol. 49: 523-555.

108. Spanggord R.J., Mortelmans K.E., Griffins A.F., Simmon V.F. 1982. Mutagenicity in Salmonella typhimurium and structure-activity relationships of wastewater compounds emanating from the manufacture of trinitrotoluene. Environ. Mutagen. 4:163-179.

109. Stahl J.D., Aust S.D. 1995. Properties of a transplasma membrane redox system of Phanerochaete chrysosporium. Arch. Biochem. Biophys. 320: 369-374.

110. Strittmatter C.F. 1959à. Electron transport to oxygen in Lactobacilli. J. Biol. Chem. 234: 2789-2793.

111. Strittmatter C.F. 1959b. Flavin-linked oxidative enzymes of Lactobacillus casei. J. Biol. Chem. 234: 2794-2793

112. Tan E.L., Ho C.H., Griest W.H., Tyndall R.L. 1992. Mutagenicity of trinitrotoluene and its metabolites formed during composting. J. Toxicol. Environ. Health, 36: 165-175.

113. Tannock G.W. 1997. Probiotic properties of lactic-acid bacteria: plenty of scope for fundamental R&D. TIBTECH, 15: 270-274.

114. Tatsumi K., Doi T., Yoshimura H., Koga H., Horiuchi. 1982. Oxigen-insensitive nitrofuran reductases in Salmonella typhimurium TA100. J. Pharmaco-bio-Dyn. 5:423-429.

115. Thornton-Manning J.R., Smith B.A., Beland F.A., Heflich R.H. 1991. Muta-genes and DNA adducts formation by 1-nitropyrene in Chinese hamster ovary cells without exogenous metabolic activation. Toxicol. Appl. Pharm., 109:538546.

116. TraxIer R.W. 1974. Biodégradation of trinitrotoluene (a-TNT) and its production isomers. AD-A 029346. Department of plant Pathology-entomology, University of Rhode Island, Kingston.

117. VoshaIl D., Carr D.O. 1973. pH-Dependency of the non enzymatic oxidation of dihydroflavin by p-nitrobenzoic acid and its methyl ester. Biochem. Pharmacol. 22:1521.

118. Walker G.A., Kilgour G.L. 1965. Pyridine nucleotide oxidising enzymes of Lactobacillus casei. I. Diaphorase. II. Oxidase and peroxidase. Arch. Biochem. Biophys. Ill: 529-539.

119. Watanabe M., Ishidate Jr., Nohmi T. 1990. Nucleotide sequence of Salmonella Typhimurium nitroreductase gene. Nucleic Acid Res. 18:1059.

120. Watanabe T., Kohan M.J., Walsh D., Ball L.M., DeMarini D.M., Lewtas J. 1995. Mutagenicity of nitrodibenzopyranones in the Salmonella plate-incorporation and microsuspension assay. Mutat. Res. 345: 1-9.

121. Welsh J., McClelland M. 1990. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acid Res. 18:7213-7218.

122. Westerfild W.W., Richert D.A., Higgins E.S. 1957. The metabolic reduction of organic nitro groups. J. Biol. Chem. 227: 379.

123. Won W.D., Disalvo L.H., James N.G. 1976. Toxicity and mutagenicity of 2,4,6-trinitrotoluene and its microbial metabolites. Appl. Environ. Microbiol. 34: 576580.

124. Won W.D., Heckly R.J., Glover D.J., Hoffsommer J.C. 1974. Metabolic disposition of 2,4,6-trinitrotoluene. Appl. Microbiol. 27: 513-516.

125. Woolen B.W., Hall M.G., Graig R., Steel G.T. 1986. Trinitrotoluene: assessment of occupational absorption during manufacture of explosives. Brit. J. Ind. Med. 31:576-580.

126. Wyman J.F., Serve M.P., Hobson D.W., Lee L.H., Uddin D.E. 1992. Acute toxicity, distribution, and metabolism of 2,4,6-trinitrophenol (picric acid) in fischer 344 rats. J. Toxicol, and Environ. Health, 37: 313-327.

127. Zeyer J., Kearney P.C. 1983. Microbial metabolism of 14C. nitroanilines to [14C] carbon dioxide. J. Agric. Food. Chem. 31: 304-308.

128. Zucker M., Nason A. 1955. Nitroaryl reductases from Neurospora crassa. In Methods in Enzymology, v.2, (Colowick S.P., Kaplan N.O., eds), 406-411, Academic Press, New York.