Анаэробные микробные сообщества, разрушающие азокрасители и их производные тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, доктор биологических наук Котова, Ирина Борисовна

• Котова, Ирина Борисовна
• доктор биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации доктор биологических наук Котова, Ирина Борисовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Введение.

2. Значение аминоароматических соединений для человеческой практики.

3. Особенности азокрасителей и ароматических аминов как загрязнителей.

4. Преимущества биологических методов очистки от ароматических азосоединений.

5. Возможности применения анаэробной микробной технологии для биоразложения азокрасителей и ароматических аминов.

6. Уровни и способы изучения микробной биодеградации.

7. Пути конверсии азокрасителей у микроорганизмов.

8. Биохимические пути конверсии аминоароматических соединений у микроорганизмов в отсутствие кислорода.

9. Микроорганизмы, участвующие в анаэробном разложении азокрасителей и аминоароматических соединений.

10. Преимущества осуществления процесса анаэробной биодеградации микробными сообществами.

11. Метаногенная деградации азокрасителей и ароматических аминов микробными сообществами и влияние различных факторов на этот процесс.

11.1. Метаногенные микробные сообщества, использующие в метаболизме азокрасители и аминоароматику.

11.2. Специфичность микробных сообществ по отношению к азокрасителям и ароматическим аминам.

11.3. Токсичность азокрасителей и ароматических аминов.

11.4. Влияние различных факторов на деструкцию азокрасителей и ароматических аминов метаногенными микробными сообществами.

11.4.1. Свойства и концентрация основного субстрата.

11.4.2. Дополнительные источники углерода и энергии.

11.4.3. Дополнительные акцепторы электронов.

11.4.4. Добавление медиаторов.

11.4.5. Температура культивирования.

11.4.6. Начальное значение рН среды.

11.4.7. Начальное содержание инокулята в среде.

11.4.8. Другие факторы.

12. Структурно-функциональная организация метаногенных микробных сообществ, осуществляющих конверсию азокрасителей и аминоароматических соединений.

12.1. Микробное сообщество как единое целое.

12.2. Синтрофия.

12.3. Пространственная организация метаногенных микробных сообществ, разрушающих вещества-загрязнители.

12.4. Компонентный состав, взаимодействия и взаимосвязи в метаногенных сообществах, осуществляющих биодеградацию ароматических загрязнителей.

12.4.1. Методы анализа компонентного состава микробных сообществ.

12.4.2. Биоразнообразие в метаногенных микробных сообществах, разрушающих органические загрязнители.

12.4.3. Микроорганизмы, способные к разрыву азосвязи и первичной трансформации соединений, содержащих бензольное кольцо.

12.4.4. Микроорганизмы,потребляющиепродукты трансформации.

12.4.5. Метаногенные археи как конечное звено процесса анаэробнойбиодеградации(амино)ароматических соединений.

12.4.6. Микроорганизмы-члены сообщества, не принимающие непосредственного участия в процессе метаногенной конверсии органических загрязнителей.

12.5. Влияние физико-химических факторов на структуру анаэробного сообщества, разрушающего органические загрязнители.

12.5.1. Природа основного субстрата и состав среды культивирования.

12.5.2. Температура культивирования.

12.6. Изменение структуры метаногенных микробных сообществ, разрушающих органические загрязнения, во времени.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Анаэробные микробные сообщества, разрушающие азокрасители и их производные»

Загрязнения, образующиеся в результате роста населения Земли и удовлетворения его потребностей, существенно влияют на окружающую среду и здоровье людей. Получение ряда веществ природного происхождения в сверхколичествах и перемещение их на значительные расстояния может оказывать избыточное давление на самоочищающую способность естественных местообитаний. Серьезной проблемой является и накопление полученных искусственным путем чуждых природе соединений (ксенобиотиков), попадание которых в окружающую среду изменяет протекание сложившегося круговорота биогенных элементов (Заварзин, 2003; Экология микроорганизмов, 2004). Природные и синтетические вещества, имеющие в молекулах ароматическое кольцо (лигнинсодержащие отходы, нефть, пестициды, красители и др.), обладают значительной стабильностью, поэтому реакции их разложения до простых соединений протекают с крайне низкими скоростями, что ведет к дисбалансу синтетических и деструктивных процессов в глобальных циклах элементов (Хоменков и др., 2008; МсЬеоё, ЕШз, 2008; Нетрусов, Котова, 2012; www.slovopedia.com).

В зависимости от химической структуры разрушаемых сложных органических веществ, условий окружающей среды и наличия конкретных биологических активностей их преобразование (биодеградация) может заключаться в незначительных изменениях молекулы (трансформации), распаде молекулы на крупные составные части (фрагментации) или в полной минерализации, т.е. в превращении в самые простые соединения (Н20, СОг, Н2, Н28, ИНз, СН4 и т.д.). Глобальная роль в осуществлении биоразрушения загрязнений (в том числе, ксенобиотиков) принадлежит представителям мира микробов, имеющим широчайшие возможности метаболизма и способным перестроиться на использование антропогенных соединений (Наумова, 1985; Остроумов, 1986; Diaz, 2004; Нетрусов, Котова, 2012; www.biotechnolog.ru). Вовлечению в микробный метаболизм веществ неприродного происхождения способствуют такие свойства представителей мира микробов, как высокая скорость размножения, метаболическая пластичность, быстрая адаптация к изменяющимся условиям окружающей среды, высокая устойчивость к экстремальным значениям физико-химических факторов, быстрый обмен генетической информацией в микробных сообществах путем горизонтального переноса (Хоменков и др., 2008). В последние десятилетия исследователи отмечают существенное значение анаэробных микроорганизмов как деструкторов ароматических и гетероциклических соединений.

В настоящее время результаты исследований по биодеградации загрязнений учитываются при разработке различных очистных сооружений. Однако пока в большинстве случаев применяют естественно сложившиеся микробные ассоциации без учёта их внутренней структуры.

2. Значение амнноароматических соединений для человеческой практики.

Азокрасители и аминоароматические соединения входят в состав многих товаров и применяются практически во всех областях человеческой деятельности. Они являются прямыми и побочными продуктами нефтехимической, лакокрасочной, фармацевтической и пищевой промышленности (Березин, Березин, 2001; Карпов, Белов, 2002; Solis et al., 2012). Азокрасители, устойчивые к изменению своих свойств под действием факторов окружающей среды, используются при изготовлении различных красок и лаков, тканей, кожаных и пластиковых изделий, в типографском деле. Они входят в состав многих продуктов питания (мармелада, конфет, газированной воды и др.), оболочек таблеток и парфюмерно-косметической продукции (например, красок для волос).

N-замещённые ароматические вещества, в частности аминоароматические, в значительных количествах содержатся в стоках и твердых отходах предприятий нефтехимической, фармацевтической и легкой промышленности, производящих пестициды, взрывчатые вещества, полимеры, красители, лекарственные препараты, пищевые добавки и товары хозяйственного назначения (Snyderwine et al., 2002). Ароматические амины попадают в окружающую среду также с выхлопными газами автомобилей и при горении растительной массы, богатой азотом (при лесных пожарах и табакокурении, Grimmer et al., 2000).

Поскольку человечество не может отказаться от использования таких веществ, важным является вопрос об их судьбе при попадании в окружающую среду и влиянии на здоровье человека. Особую актуальность приобретают исследования, направленные на изучение анаэробных микробных сообществ, использующих в своем метаболизме устойчивые и высокотоксичные аминоароматические вещества, повсеместно применяемые и значительно загрязняющие естественные местообитания.

3. Особенности азокрасителей и ароматических аминов как загрязнителей

Азокрасители являются наиболее важной и широко применяемой группой искусственных красителей из-за простоты синтеза, яркой окраски и устойчивости к внешним воздействиям (Гордон, Грегори, 1987). Разнообразные по структуре и сложности молекулы азокрасителей характеризуются наличием одной или более азогрупп (-N=N-), соединенных с бензольными или нафталиновыми кольцами (рис.1). Азогруппы относятся к важнейшим хромофорам, ответственным за окрашивание в видимой области спектра. Бензольные и нафталиновые кольца могут содержать различные заместители (-С1, -СН3, -N02, -NH2, -ОН, -СООН, -S03 и др.). Наличие карбоксильной, гидроксильной, сульфо- и аминогрупп, являющихся ауксохромами, приводит к усилению или изменению цвета красителя.

Азосвязь имеет ярко выраженный электронакцепторный характер, поэтому азокрасители устойчивы к реакциям окисления.

Ponceau S

Рис. 1. Химическая структура Ponceau S.

При производстве и использовании азокрасителей в биосферу со сточными водами сбрасывается от 10 до 50% этих веществ. Обладая большой стабильностью, азокрасители трудно поддаются разложению в присутствии кислорода и поэтому могут накапливаться в окружающей среде в значительном количестве. Среди органических загрязнителей азокрасители составляют 3-4%, однако по ряду причин они представляют собой серьезную угрозу (Slokar, Majcen Le Maréchal, 1998; Gottlieb et al., 2003). Сточные воды текстильных предприятий обычно содержат 10-200 мг/л этих веществ (Pandey et al., 2007; Annuar et al., 2009). Азокрасители и продукты их неполной аэробной трансформации могут даже в виде микропримесей оказывать токсическое и/или канцерогенное влияние на живые клетки.

Окрашивание природных водных сред приводит к поглощению солнечного света и тем самым снижает эффективность фотосинтеза водных организмов.

Присутствие азокрасителей в воде в концентрации до 1 мг/л различается человеческим глазом как посторонний цвет и вызывает у потребителя негативный эстетический эффект (Slokar, Majcen Le Maréchal, 1998). Ряд азокрасителей активно используется в пищевой промышленности для восстановления и повышения интенсивности природной окраски, утраченной в процессе обработки или хранения, окрашивания бесцветных продуктов например, безалкогольных напитков, мороженого, кондитерских изделий), а также для придания продуктам привлекательного вида и цветового разнообразия (Xu et al., 2007). Пищевые азокрасители используются по специальному разрешению в категории «добавки» (табл. 1 ). Некоторые ранее широко применявшиеся азокрасители (Суданы I-IV, Суданы Пара Ред и

Черный и др.) в настоящее время запрещены при изготовлении продуктов питания в странах Европейского Союза, поскольку в организме человека они расщепляются на канцерогенные амины. Однако на территории многих стран, в том числе и в России, эти азокрасители до сих пор обнаруживаются в некоторых продуктах и оболочках таблеток. Например, Sudan I-IV может содержаться в молотом перце чили, порошке красного (стручкового) перца, куркуме, некоторых сортах пальмового масла, порошкообразных пряностях карри), пастах, соусах, окрашенных хлебобулочных изделиях в количестве от 2,8 до 3500 мг/кг порошка (Xu et al., 2007). Эти азокрасители часто используются при фальсификации вышеперечисленных продуктов с целью придания им более интенсивной окраски (www.bestpravo.ru). Пищевые азокрасители требуют особо пристального внимания, так как они вступают в прямой контакт с человеческим организмом и оказывают непосредственное влияние на жизнедеятельность человека. Повсеместное использование в промышленности и в быту аминозамещенных ароматических веществ приводит к возрастанию их выброса в окружающую среду и принимает

15 угрожающий характер из-за их быстрого распространения по трофическим цепям и токсического, мутагенного или канцерогенного влияния на живые организмы даже в малых дозах.

Таблица 1.

Пищевые азокрасители.

Индекс Название Цвет

Е102 Тартразин Желтый

Е103 Алканет, алканин (СИгуБоте гезогсто1) Красный

Е105 Жёлтый прочный АВ (жёлтый кислотный О) Желтый

Е107 Жёлтый 2С Желтый

Е110 Жёлтый «солнечный закат», (апельсиновый жёлтый 8) Желто-оранжевый

Е121 Цитрусовый красный 2 Оранжевый

Е122 Кармазин (кармуазин, азорубин) Оранжевый

Е123 Амарант Оранжевый

Е124 Понсо 4Я Оранжевый

Е125 Понсо 8Х Красный

Е128 Красный Ю, азофлоксин Красный

Е129 Красный очаровательный АС Красный

Е151 Бриллиантовый чёрный ВЫ Черный

Е152 Черный 7984 Черный

Е155 Шоколадный коричневый НТ Коричневый

Е180 Рубиновый литол ВК Красный

Примечание: Вещества с индексом красного цвета не разрешены к применению в пищевой промышленности Российской Федерации. Зеленый цвет индекса означает, что эти вещества входили в список пищевых добавок, допущенных к применению в пищевой промышленности РФ в период с 2003 года по 1 августа 2008 года. Индекс веществ, запрещенных к применению в пищевой промышленности других стран, но разрешенных в России, отмечен синим цветом. Вещества, имеющие индекс черного цвета, допущены к применению в пищевой промышленности РФ в качестве вспомогательного средства для производства пищевой продукции (СанПиН 2.3.2.1293-03; www.codexalimentarius.net).

Высокую токсичность и мутагенность этих соединений по отношению к человеку связывают с преобразованием их в организме в реакционноспособные интермедиа™, взаимодействующие с молекулами ДНК и гемоглобином крови (Weisburger, 1997; Pinheiro et al., 2004). В последнее время исследователи особо отмечают роль ароматических аминов из непромышленных источников в связи с развитием раковых заболеваний человека. Проведены эпидемиологические исследования, показывающие негативные последствия широкого использование азокрасителей в косметической и пищевой промышленности. Например, в красках для волос содержится высокая концентрация азокрасителей, которые, распадаясь, образуют ароматические амины, также вызывающие раковые заболевания. За последние 30 лет количество людей, использующих краски для волос, существенно возросло (так, в США 85% жителей окрашивают волосы), что повышает риск таких заболеваний как лимфома, лейкемия, миелома и др. (Cantor et al., 1988; Zahm et al., 1992; Morton et al., 2007).

Среди аминоароматических соединений встречаются и природные вещества, например, 2-аминобензойная кислота является интермедиатом синтеза алкалоидов у растений, а 4-аминобензойная кислота - фолиевой кислоты в организме животных и человека, однако в концентрациях, существенно превышающих природные, они также становятся токсичными для бактерий кишечной группы (Richards et al., 1995). Все азокрасители являются синтетическими.

Негативный эффект азокрасителей и ароматических аминов на клетки во многом зависит от их гидрофобности (Ren, Schultz, 2002) и действия на цитоплазматическую мембрану (Sikkema et al., 1994, 1995). Проникновение ароматических веществ в клеточную мембрану приводит к ее «разбуханию», увеличению проницаемости и нарушению транспорта протонов. При этом коэффициент распределения таких соединений между фосфолипидным

17 бислоем мембраны и водной фазой коррелирует с коэффициентом распределения в стандартной системе октанол/вода (Sikkema et al., 1994, 1995; Slokar, Majcen Le Marechal, 1998).

Сохранение азокрасителями и аминоароматическими веществами своих свойств под действием факторов окружающей среды обусловило их повсеместное применение, однако именно это качество стало серьезным препятствием для разрушения их в сточных водах и в естественных местообитаниях. В связи с этим большое значение имеют исследования, посвященные деградации таких органических соединений до неорганических и простых нетоксичных органических веществ, в том числе и с помощью микроорганизмов (Razo-Flores et al., 1997; Guang-fei et al., 2006; Xu et al., 2007; Hong et al., 2007; Buan et al., 2009).

4. Преимущества биологических методов очистки от ароматических азосоединений.

Для очистки сточных вод от азокрасителей и ароматических аминов имеется большой арсенал способов. К физико-механическим методам относятся адсорбция, ионный обмен, фильтрация на мембранах, коагуляция и осаждение (Baughman, 1995; Bes-Pia, Mendoza-Roca, 2002; Chakraborty,

Purkait, 2003). В качестве сорбентов в ряде случаев используют биомассу бактерий и грибов. Обычно физико-механические методы применяют для удаления устойчивых и плохо растворимых в воде ароматических азосоединений в сочетании с химическими и биологическими способами обработки. К химической группе методов освобождения сточных вод от азокрасителей и аминоароматических веществ относят окисление, восстановление, фото- и электрохимическое разрушение (Bolduc, Anderson,

1997; Kanazawa, Onami, 2001; Ledakowicz et al., 2001; Bechtoldet al., 2002;

Chakraborty, Purkait, 2003). Такие методы требуют значительных затрат энергии, а образовавшиеся побочные продукты могут обладать нежелательными свойствами. Недостатки, малая эффективность и

18 экологическая опасность» перечисленных выше методов очистки заставляют исследователей искать новые, «дружественные» природе способы избавления от этих сложных ароматических ксенобиотиков с помощью биологических систем (биоремедиации, Head, 1998). Для полной минерализации слабо поддающихся биоразложению ксенобиотиков, в том числе азокрасителей и ароматических аминов, наиболее перспективно применение микроорганизмов разных групп и их ассоциаций, обладающих огромным разнообразием ферментных систем и способностью быстро «перенастраивать» их на использование новых субстратов. Многие исследователи отмечают эволюционный феномен быстрой адаптации микроорганизмов к веществам антропогенного происхождения, появление которых в окружающей среде произошло менее 50-100 лет назад. Поскольку присутствие устойчивых загрязнителей антропогенного происхождения в биосфере будет увеличиваться, то особую актуальность приобретает использование микробных сообществ для их полной и безопасной утилизации (Knackmuss, 1996).

5. Возможности применения анаэробной микробной технологии для биоразложения азокрасителей и ароматических аминов.

В настоящее время очистка сточных вод осуществляется в основном с помощью аэробных микроорганизмов. Аэробное окисление действительно термодинамически наиболее выгодно, так как при этом наблюдается наибольшее изменение свободной энергии. Однако аэробная технология имеет ряд недостатков, главные из которых — значительные энергозатраты на аэрацию и образование избыточного количества микробной биомассы (до

50% углерода загрязнителей переходит в органические вещества клеток микроорганизмов). В случае ароматических соединений окислительные условия их удаления накладывают еще ряд ограничений (Stolz, 2001). Эти вещества понижают поверхностное натяжение водных растворов и могут служить причиной неконтролируемого пенообразования при аэрации, а

19 некоторые из них являются летучими токсичными веществами, способными загрязнять атмосферу. При контакте с кислородом могут образовываться токсичные продукты неполного окисления или трудноразлагаемые продукты радикальной полимеризации (Braun, Gibson, 1984). Ряд азотсодержащих ароматических соединений быстрее и полнее разрушается в бескислородной среде. Так, азокрасители в силу электронакцепторных свойств азосвязей устойчивы к реакциям окисления и плохо поддаются разложению в аэробных условиях, в то время как реакции восстановления для них наиболее характерны и легко осуществимы в отсутствии кислорода (Bumpus, 1995). Поэтому неэффективность традиционных способов очистки по отношению к таким соединениям требует разработки процессов их анаэробной деструкции.

Отрицательные значения AG° для реакций разложения азокрасителей и ароматических аминов в анаэробных условиях при наличии разных акцепторов электронов показывают, что в стандартных условиях все они термодинамически не запрещены. При сравнении денитрифицирующей, сульфатредуцирующей и метаногенной реакций именно в результате последней происходит наименьшее изменение свободной энергии (Slokar, Majcen Le Maréchal, 1998), однако технологически она более удобна, так как не требует внесения дополнительных акцекпторов электронов в среду. В то же время, устойчивость многих ароматических ксенобиотиков в реальных условиях очистки объясняется тем, что потенциально возможные с точки зрения термодинамики реакции не происходят или идут очень медленно из-за неоптимальности физико-химических факторов, отсутствия или ингибирования необходимых ферментов. Таким образом, реализация потенциальной возможности деструкции ксенобиотика зависит от конкретных условий прохождения процесса.

Преимуществами анаэробных способов очистки являются низкие энергозатраты и образование значительно меньшего количества биомассы (в анаболические реакции вовлекается не более 7% углерода загрязнителя).

20

Анаэробные микроорганизмы способны осуществлять полную минерализацию многих сложных и токсичных ксенобиотиков, в том числе ряда азокрасителей и ароматических аминов, причем в метаногенных условиях - с образованием полезного продукта, биогаза (Slokar, Majcen Le Maréchal, 1998; Калюжный, 2004). Таким образом, на сегодняшний день анаэробная обработка сточных вод, содержащих азокрасители и ароматические амины, представляет собой выгодную альтернативу химическим и физическим, а также аэробным биологическим методам обработки. К недостаткам анаэробной технологии можно отнести большую длительность процессов, неэффективность при низких концентрациях загрязнителей и устойчивость аминоароматических веществ, содержащих сульфогруппы. Поэтому в некоторых случаях (например, для сульфоазокрасителей) предлагается сочетание аэробной и анаэробной обработки стоков, когда расщепление азосвязи происходит путем восстановления в бескислородных условиях, а образовавшиеся ароматические амины разлагаются с участием кислорода (Stolz, 2001; McMullan et al., 2001).

6. Уровни и способы изучения микробной биодеградации.

Изучение процессов деструкции сложных органических веществ, в том числе ксенобиотиков, включает в себя решение нескольких разноплановых задач. Биохимические исследования имеют целью выяснение последовательности реакций разрушения сложного соединения, определение активностей, очистку и снятие молекулярно-биологических характеристик участвующих в них ферментов, способов регуляции разных этапов и т.д.

Микробиологическая сторона вопроса предполагает выяснение микробного состава анаэробных сообществ, роли каждого компонента в нем и способов взаимодействия партнеров, изучение функционирования сообщества как единого целого и определение подходов к созданию искусственных ассоциаций с заданными свойствами. И наконец, технологический аспект

21 проблемы заключается в разработке на основе полученных данных сначала лабораторного, а затем и полномасштабного процесса по очистке модельных и производственно-бытовых сточных вод, его аппаратурного оформления, а также в создании моделей влияния ксенобиотиков на окружающую среду.

Выполнение этих задач требует применения целого комплекса методических приемов (Практикум по микробиологии, 2005). Так, для идентификации азотсодержащих ароматических субстратов и интермедиатов их деструкции используют спектрофотометрическое сканирование в диапазоне длин волн 200-600 нм, газовую хроматографию и ВЭЖХ, массспектрометрию, различные химические и биохимические методы определения основных элементов и веществ. Для выделения чистых культур микроорганизмов-членов сообщества применяют анаэробное и аэробное культивирование на минеральных и богатых, жидких и твердых средах, содержащих или не содержащих основной ксенобиотик. Поддержание выделенных чистых культур также имеет ряд особенностей, поскольку требует создания условий, моделирующих тесные трофические связи в сообществе и его физико-химическую среду (нахождение в матриксе). Затем необходимо определить систематическое положение и потенциальные метаболические возможности полученных чистых культур для составления полной трофической цепи использования ксенобиотика. Для этого применяют разные виды микроскопии, молекулярно-биологическую идентификацию и тесты определителя Берджи. Для выявления и идентификации некультивируемых микроорганизмов-членов сообщества применяют методы, основанные на экстрагировании и исследовании тотальной ДНК (Экология микроорганизмов, 2004; Практикум по микробиологии, 2005; Zengler, 2009). Микробную сукцессию в сообществе во времени вообще и по ходу разложения субстрата) контролируют микроскопически, высевами и молекулярно-биологическими методами генетического фингерпринтинга (денатурирующего и температурного

22 градиентного гель-электрофореза; анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК; анализа полиморфизма длины фрагментов рестрикции; гибридизации флуоресцирующих олигомерных нуклеотидных последовательностей с нуклеиновыми кислотами целых клеток и др.(Миугег, 1999). Подтверждением роли и места каждого микроорганизма в сообществе является создание искусственных микробных ассоциаций, способных разрушать данный ксенобиотик.

7. Пути конверсии азокрасителей у микроорганизмов.

Разложение азокрасителей можно условно разделить на две стадии: 1) разрыв азосвязи, сопровождающийся обесцвечиванием и 2) деградация образовавшихся аминов.

При расщеплении азосвязи нарушается структура хромофорной части красителя и вещество обесцвечивается. Из-за электронакцепторного характера азосвязей лишь некоторые аэробные микроорганизмы, синтезирующие фермент азоредуктазу, способны к внутриклеточному восстановлению азокрасителей с образованием ароматических аминов. Эта реакция является высокоспецифичной и происходит только в присутствии легкоусваиваемого ко-субстрата (пирувата, пептона, глюкозы). Например,

Citrobacter sp. обесцвечивает азокраситель Methyl Red (An et al., 2002), a

Bacillus subtilis — и-аминоазобензол (Zissi et al., 1997), Pseudomonas luteola осуществляет частичное и полное восстановление азосвязи у Reactive Red 22

Chang et al., 2001), a Rhodococcus erythropolis - у Orange II (Hu, 2003).

Sphingomonas sp. 1 CX в аэробных условиях восстанавливает азокрасители, имеющие в структуре изомеры аминонафтола (Coughlin et al., 1999).

Смешанная культура SB4, состоящая из 4 штаммов Bacillus sp. и клеток

Lysinibacillus sp. и Ochrobacterium sp., обесцвечивает краситель Reactive

Violet 5R с образованием 1-диазо-2-нафтола, 4гидроксибензолсульфаниловой кислоты, 2-нафтола и бензолсульфаниловой кислоты в качестве интермедиатов (Jain et al., 2012). Это же сообщество

23 активно и в отношении других азокрасителей. Показано, что культура Brevibacillus laterosporus МТСС 2298 в течение 24 ч обесцветила 87% смеси, содержащей 7 азокрасителей с различными структурами и свойствами при участии комплекса окислительно-восстановительных ферментов (алкогольоксидазы, тирозиназы, NADH-DCIP редуктазы и азоредуктазы, Kurade et al., 2011).

Дрожжи Issatchenkia occidentalis после обесцвечивания Methyl Orange и Orange II могут использовать образовавшиеся амины в качестве источников азота и углерода (Ramalho et al., 2004). Такая же возможность показана для некоторых цианобактерий (Parikh, Madamwar, 2005). Низшие грибы, в частности базидиомицет Phanerochaete chrysosporium (Bumpus, 1995; Stolz, 2001), способны быстро разлагать азокрасители в присутствии кислорода за счёт неспецифичных лигнинпероксидаз, марганцевых пероксидаз и лакказ. В работе Rajendran et al. (2011) 4 адаптированных штамма грибов Aspergillus sp., Pénicillium sp., Fusarium sp. и Mucor sp. показали способность к обесцвечиванию азокрасителей Reactive black 5, Amido black-10В, Red 5B, Reactive red 120 и Anthraquinone violet R. Сообщается, что водоросли из родов Chlorella и Spirogyra способны обесцвечивать азокрасители (Mohan et al., 2002; Acuner, Dilek, 2004).

Под действием анаэробных микроорганизмов азокрасители легко подвергаются фрагментации путем четырехэлектронного восстановления азосвязи с образованием бесцветных ароматических аминов: д, -N = N-R2^.Rl -NH-NH-R2^Rx-NH2 +H2N-R2.

2Н+ 2 H*

В анаэробных условиях восстановление азокрасителей, вероятно, является неспецифическим процессом (Bumpus, 1995; McMullan et al., 2001). Различными авторами на множестве объектов показано, что одна чистая культура или одно анаэробное микробное сообщество способно обесцвечивать целый спектр азокрасителей различной химической структуры. Среди бактерий упомянуты Proteus sp., Enterococcus sp.,

Streptococcus faecalis, Bacillus pyocyaneus, B. subtilis, B. cereus, Pseudomonas sp., Aeromonas hydrophilia, Caprococcus catus, Fusobacterium sp., Bacteroides thetaitaomicron, Bifidobacterium infantis, Eubacterium biforme,

Peptostreptococcus productus, Citrobacter sp., представители молочнокислой группы, в частности виды рода Lactobacillus (Perez-Diaz, McFeeters, 2009).

Есть данные по анаэробному обесцвечиванию некоторых технических и пищевых азокрасителей микробными сообществами из илов очистных сооружений различных предприятий, из донных осадков естественных водоемов, из микробиоты желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) человека и животных (dos Santos et al., 2005; Dafale et al., 2008, Soils et al., 2012). В то же время исследователи пока не пришли к однозначному пониманию механизма анаэробной фрагментации азокрасителей (рис. 2). Обесцвечивание в анаэробных условиях структурно различных азокрасителей микробными сообществами с разными свойствами без лаг-периода свидетельствует о неспецифичности реакции анаэробного восстановления азосвязи. Процесс обесцвечивания азокрасителя анаэробным микробным сообществом может включать в себя в качестве первой стадии адсорбцию на поверхности биомассы и последующее восстановление азосвязи жизнеспособными клетками (Baughman, 1995). При этом молекулярная масса азокрасителя и проницаемость мембраны для данного соединения не имеют значения, так как восстановление красителя происходит внеклеточно и реакция носит скорее случайный характер (Pandey et al., 2007). Высказывается мнение, что анаэробное восстановление представляет собой неспецифичную реакцию детоксикации, поскольку в результате анаэробной конверсии азокрасителей происходило частичное уменьшение токсичности для анаэробного микробного сообщества (Donlon et al., 1995). Однако следует иметь в виду, что традиционный метод оценки токсичности по снижению ацетокластической активности свидетельствует об угнетении именно

25 метаногенов и не позволяет выявить ингибирующее влияние исследуемых соединений на другие группы микроорганизмов-членов анаэробного микробного сообщества.

Прямой ферментативный ДЭ [[^Г^^уйгг-^^^!!] азокраситель ДЭок ^^—/ ароматические амины

Непрямой биологический дэ СЗ^х^-^/^!!] Мок азокраситель \ ароматические ДЭок Мвос [У V амины

Прямой химический ДЭ ^^ ГХ /""1 азокраситель ДЭок /\\ ароматические амины

Рис. 2. Возможные механизмы анаэробного восстановления азокрасителей (Pandey et al., 2007): Б - бактерия (ферментная система), ДЭ - донор электронов, ДЭок - окисленная форма донора электронов, Мок - окисленная форма медиатора, Мвос- восстановленная форма медиатора.

Есть данные (Rafii, Cerniglia, 1993), что восстановление азокрасителей может быть побочной реакцией внутриклеточного фермента, обычно «работающего» с другими субстратами. В этом случае возникают проблемы проникновения через клеточную оболочку заряженных «тяжелых» молекул азокрасителя. Предположение, что у факультативных анаэробов за неспецифическое восстановление азосвязи отвечают цитоплазматические флавин-зависимые редуктазы, образующие восстановленные флавины, было подтверждено работами Russ et al. (2000) и Stolz (2001), показавшими, что они способны действовать in vitro как азоредуктазы. Скорость разрыва азосвязи возрастала при внесении предполагаемого редокс-медиатора (флавина) (Dafale et al., 2008).

У Sphingomonas xenophaga BN6 скорость неспецифического анаэробного обесцвечивания азокрасителей увеличивалась при добавлении хинонов (антрахинон-2-сульфоната или 2-гидрокси-1,4-нафтохинона), которые выполняют функцию редокс-медиаторов и энзиматически восстанавливаются клетками микроорганизма. Восстановленные формы редокс-медиаторов взаимодействуют с азосвязью в культуральной жидкости в чисто химической реакции. Поскольку хинон-редуктазная активность локализована на мембране, то транспорт сульфонированных азосоединений в клетку в этом случае необязателен (Kudlich et al., 1997). Вовлечение систем ферментов, связанных с мембраной (НАДФН-цитохром с-редуктазы или цитохрома Р45о) в анаэробное восстановление азосвязи было описано на клетках млекопитающих (Zbaida, 1995). Для анаэробных бактерий из кишечника человека (Eubacterium sp., Clostridium sp., Butyrivibrio sp., Bacteroides sp.) было показано, что обесцвечивание сульфонированных азосоединений происходит вне клетки (Rafii et al., 1990; Rafii, Cerniglia, 1995; Rafii et al., 1995; Nam, Renganathan, 2000). Однако остается неясным, как в этом случае внеклеточные азоредуктазы получают НАДН, необходимый для восстановления азосвязи.

С другой стороны, показано, что разрыв азосвязи в анаэробных условиях может происходить без участия микробных клеток под действием как природных (НАДН, НАДФН, ФАД, рибофлавин и др.), так и синтетических антрахинон-2,6-дисульфонат) восстановителей (Nam, Renganathan, 2000;

Stolz, 2001). Окислительно-восстановительный потенциал медиаторов должен лежать между -180 и -430 мВ (dos Santos et al., 2004). В аэробных условиях этот процесс ингибируется, поскольку молекулярный кислород является более выгодным акцептором электронов для восстановленной

27 формы медиатора, чем азосвязь. Такие медиаторы могут образовываться в процессе клеточного метаболизма или могут быть внесены извне.

Другая возможность разрушения азокрасителей в биологических системах

- это химическая реакция с восстановленными неорганическими и

2+ органическими соединениями (Fe , H2S, аскорбат, цистеин и т.д.), присутствующими в стоках или являющимися конечными метаболитами некоторых строгих анаэробов (Libra et al., 1997; Yoo et al., 2000; Stolz, 2001; Yoo, 2002). В этом случае роль микробных клеток в расщеплении азосвязи сводится к производству неорганических восстановителей (Schwarzenbach et al., 1990; Perlingeretal., 1996).

Анализ данных литературы позволяет сделать вывод, что анаэробное восстановление азокрасителей, вероятнее всего, является комплексным процессом, включающим в себя различные механизмы разрыва азосвязи (ферментативный и неферментативный, нуждающийся в окислительно-восстановительных медиаторах и чисто химический), и может локализоваться как внутри, так и преимущественно вне клеток. Это зависит от многих факторов, таких как размер азосоединения, его полярность, стандартный редокс-потенциал и другие физико-химические характеристики (Kudlich et al., 1997; Rau, Stolz, 2003; dos Santos et al., 2004).

В результате восстановительного расщепления азокрасителей в анаэробных условиях образуются различные ароматические амины, которые могут быть как менее, так и более токсичными, чем исходные соединения.

8. Биохимические пути конверсии аминоароматических соединений у микроорганизмов в отсутствие кислорода.

Основной проблемой разрушения аминоароматических ксенобиотиков является химическая стабильность бензольного кольца. В аэробных условиях высокоактивный молекулярный кислород включается в ароматическое кольцо путем введения в молекулу одной или двух гидроксильных групп.

Такие реакции катализируются моно- или диоксигеназами, обладающими

28 низкой субстратной специфичностью (Dagley, 1971, 1986; Harayama et al., 1992; Harwood, Parales, 1996). При этом образуется один из центральных интермедиатов (пирокатехин, пирокатехат или гентизат, рис. 3), который далее окисляется с раскрытием кольца в результате орто- или мета-расщепления. Полученные линейные продукты претерпевают ß-окисление до простых кислот и альдегидов, которые в дальнейшем используются для конструктивного и энергетического обмена (Heider, Fuchs, 1997). он пирокатехин пирокатехат гентизат

Рис.3. Основные ароматические интермедиаты аэробного пути разложения (Dagley, 1971).

В аэробных условиях успешно разлагаются такие соединения как 4-аминофенол и 5-АСК, а наиболее трудноразлагаемыми являются соединения, содержащие сульфогруппу, которые чаще всего образуются при обесцвечивании азокрасителей (Pandey et al., 2007). Только одна чистая культура, относящаяся к роду Alcaligenes (штамм O-l), способна разрушать 2-аминобензолсульфокислоту, сульфанированные бензол и толуол, используя их в качестве субстратов для роста (Thurnheer et al., 1990; Pandey et al., 2007). Аминонафталинсульфокислоту, также часто образующуюся при обесцвечивании азокрасителей, чистые культуры, отнесенные к родам Pseudomonas, Moraxella и Arthrobacter, разлагали или использовали только как источник серы (Nortemann et al., 1986; Pandey et al., 2007).

В анаэробных условиях расщепление ароматических аминов представляет собой сложный многостадийный процесс, в котором задействованы различные ферменты. Вещества, содержащие наряду с бензольным кольцом заместители разной степени сложности, сначала с помощью реакций периферического метаболизма превращаются в центральные интермедиаты -бензоил-КоА, резорцин или флороглюцин (рис. 4, 5, 6, Heider, Fuchs, 1997; Carmona et al., 2009).

Рис 4. Периферические пути анаэробной деградации ароматических соединений, ведущие к образованию бензоил-КоА (Heider, Fuchs, 1997).

Трансформация субстрата может происходить путем окисления или восстановления, разрыва С-С-связей заместителей бензольного кольца, декарбоксилирования или отщепления от него О-метильных, серу- и азотсодержащих заместителей (иногда для использования в качестве источников соответствующих элементов). Для аминоароматических веществ на первом этапе расщепления характерна реакция удаления аминогруппы с бензольного кольца (рис. 7). Если в молекуле имеется карбоксильная группа, то этой реакции предшествует активация бензольного кольца за счет присоединения к ней кофермента А с участием растворимых, неспецифичных, индуцибельных КоА-лигаз или КоА-трансфераз и с затратой соон соон

АТФ. он

Рис. 5. Периферические пути конверсии ароматических веществ, ведущих к образованию резорцина и флороглюцина (Heider, Fuchs, 1997).

Рис. 6. Основные ароматические интермедиаты превращения моноароматических соединений в анаэробных условиях (Сагтопа е1 а1., 2009).

Далее отщепление аминогруппы происходит путем восстановительного дезаминирования, катализируемого низкоспецифичными КоА-редуктазами: NH2-C6H4-CO-SKoA+2e+2H^NH3+C6H5-CO-SKoA

Процесс восстановительного дезаминирования ряда субстратов показан в нитратредуцирующих условиях у Tauera aromatica и Azoarcus evansii, а в условиях сульфатредукции - у Desulfobacterium anilini и Desulfobacterium sp. mABl. Ароматические амины без карбоксильных групп (например, анилин) сначала активируются путем карбоксилирования и тиоэтерификации, а затем происходит их дезаминирование. Еще одним путем удаления аминогруппы может быть ее замещение на гидроксил с последующим восстановительным дегидроксилированием. Такую реакцию исследователи отмечали при разложении триптофана, 2- и 3-аминобензойных кислот метаногенными микробными сообществами, а также в денитрифицирующих условиях после карбоксилирования анилина. В литературе встречаются данные также об ацилировании и декарбоксилировании некоторых ароматических аминов (рис. 8) в условиях денитрификации и сульфатредукции, соответственно (Сиволодский и др., 1994; Gilcrease, Murphy, 1995; Noguera, Freedman, 1996). Следует отметить, что расщепление через резорцин и флороглюцин присуще небольшому количеству ароматических соединений, например, фенолам. Наиболее распространенным среди микроорганизмов считается бензоил-КоА-путь анаэробной деградации ароматических соединений. Периферические пути, приводящие к образованию этого центрального интермедиата, включают в себя различные реакции трансформации молекулы (дезаминирование, гидроксилирование, карбоксилирование, ацилирование, декарбоксилирование, восстановление карбоксильной группы и т.д., Bisaillon et al., 1993; Heider, Fuchs, 1997; Slokar, Majcen Le Maréchal, 1998; Carmona et al., 2009). В то же время несмотря на значительное число исследований, многие вопросы биохимических превращений аминоароматических субстратов на первых этапах процесса биодеградации до сих пор не выяснены. соон соон nh2 соон соон nh2

Рис. 7. Основные реакции, приводящие к удалению аминогруппы в молекуле аминоароматического вещества: А - восстановительное дезаминирование, Б - карбоксилирование и последующее дезаминирование, В - замещение аминогруппы на гидроксильную группу (Balba, Evans, 1980; Balba et al., 1981; Altenschmidt et al., 1991; Schnell, Schink, 1991, 1992; Lochmeyer et al., 1992; Boopathy et al., 1993; de Alexandra et al., 1994).

CH

NH-> nh,

COOH

OH

OH

NH/ nh2- ^ б

Рис. 8. Реакции ацилирования (А) и декарбоксилирования (Б) ароматических аминов (Сиволодский и др., 1994; Gilcrease, Murphy, 1995; Noguera, Freedman, 1996).

Анаэробное разложение бензоил-КоА включает в себя стадии насыщения ароматического кольца и его деароматизацию с образованием линейных продуктов (рис. 9, Heider, Fuchs, 1997). Затрачивая две молекулы АТФ, бензоил-КоА-редуктаза восстанавливает бензоил-КоА до циклогексо-1,5-диен-1-карбоксил-КоА. Затем происходит гидратация с образованием 6-гидроксициклогексо-1-ен-1-карбокси-КоА и дальнейшее НАД+-зависимое окисление и присоединение воды по двойной связи до 2-гидрокси-6-кето-1-циклогексанкарбокси-КоА.

Рис. 9. Схема бензоил-КоА-пути анаэробной деградации ароматических соединений (Heider, Fuchs, 1997).

Первый линейный продукт 3-гидроксипимелил-КоА образуется из него путем гидролиза и затем расщепляется на глутарил-КоА и ацетил-КоА. Далее при участии глутарил-КоА-дегидрогеназы происходит последовательное окисление и декарбоксилирование первого продукта с образованием кротонил-КоА и С02. Кротонил-КоА окисляется до двух молекул ацетил-КоА. Ацетил-КоА может использоваться клетками в метаболических реакциях, обеспечивающих микроорганизм энергией в виде восстановительных эквивалентов и АТФ, а также предшественниками для процессов биосинтеза (рис.10)

Ключевые ферменты, участвующие в анаэробной деградации ароматических соединений, легко инактивируются при контакте с кислородом. В клетках, растущих аэробно, подавляются ферменты

2АТР

Acetyl-CoA анаэробного пути, но небольшие количества неактивных форм ферментов все же имеются, как полагают, для поддержания вспомогательного пути в случае изменения условий окружающей среды. Ферменты анаэробного пути разложения ароматических соединений регулируются также степенью доступности ароматического субстрата. Если клетки растут анаэробно на неароматических субстратах, то ферменты деградации ароматики не обнаруживаются. Ферменты периферических путей деградации обычно индуцибельны и синтезируются в ответ на внесение конкретного субстрата. В некоторых случаях при анаэробном росте наблюдается субстратная диауксия (Dangel е1 а1., 1991; ЬМёег е1 а1., 1998). Есть данные, что гены, кодирующие ферменты анаэробной биодеградации, располагаются как на хромосоме, так и в плазмидах (Сагшопа ег а1., 2009).

А 2 АТР 2АОР рОБСоА 2Н20 2 Р, СОБСоА

NAD*

I < 2 Fdred 2Fdox

NADH V J

2-oxoglutarate CoA succinyl-CoA „„ 0U2

Ring opening ß-Oxidation

C02

3 Acetyl-CoA citrate-cycle

Рис. 10. Расщепление бензоил-КоА у Thauera aromatica (Dörner, Boll, 2002).

Обычно гены ферментов периферических и центральных путей организованы в два отдельных кластера (Хоменков и др., 2008). Первые часто кодируются генами плазмид (Heider, Fuchs, 1997). На крупных бактериальных плазмидах могут находиться детерминанты ферментов центральных путей (например, на плазмидах pTOL или pWWO

35 располагаются гены мета-расщепления ароматического кольца, Khomenkov et al., 2005). В то же время, гены ферментов о/?то-расщепления чаще всего располагаются на бактериальной хромосоме (Zylstra et al., 1989; Neidle et al., 1992). Гены, ответственные за деградацию аминоароматических ксенобиотиков, могут распространяться среди микроорганизмов отдаленных таксономических групп с помощью механизмов горизонтального переноса, что способствует адаптации микроорганизмов к ксенобиотикам (Хоменков и др., 2008).

Некоторые факультативные анаэробы (в частности, денитрификаторы) могут совмещать реакции аэробного и анаэробного бензоил-КоА-путей деструкции ароматических соединений (Fuchs, 2008). В такой гибридной цепи реакций на первом этапе ароматическое кольцо бензоата сенсибилизируется путем образования КоА-эфиров (как в бензоил-КоАпути), а при участии молекулярного кислорода в кольцо вводятся гидроксильные группы (как в аэробном пути). Дальнейшие стадии восстановления и гидролиза кольца не требуют присутствия кислорода, т.е. собственно деароматизация осуществляется аналогично этапам бензоил

КоА-пути. Для денитрифицирующих микроорганизмов показано, что на подготовительных стадиях периферического метаболизма они сначала превращают фенилацетат (Luengo et al., 2001; Mohamed et al., 2002), бензоат

Zaar et al., 2001) и 2-аминобензоат (Langkau et al., 1990; Schuhle et al., 2001) в бензоил-КоА или фенилацетил-КоА, которые затем конвертируются при участии диоксигеназ в соответствующие неароматические цисдигидродиолы. Эти интермедиаты повторно восстанавливают свою ароматическую структуру, образуя дигидроксилированные ароматические продукты. Антраниловая кислота через 2-аминобензоил-КоА превращается в моногидроксилированный неароматический интермедиат (Fuchs, 2008).

Наличие такого гибридного альтернативного пути у микроорганизмовчленов сообщества не только дает дополнительную возможность конверсии

36 ароматических субстратов при попадании кислорода извне, но и способствует гибкой и быстрой адаптации микробного сообщества к изменяющимся концентрациям кислорода (Fuchs, 2008).

9. Микроорганизмы, участвующие в анаэробном разложении азокрасителей и аминоароматических соединений.

Анаэробные микроорганизмы, способные разлагать аминоароматику, должны обладать некоторыми общими свойствами, несмотря на то, что относятся они к разным филогенетическим группам. Ароматические вещества являются более восстановленными, чем получающиеся из них продукты, поэтому микроорганизмы, осуществляющие деструкцию таких веществ, должны быть способны утилизировать образующиеся электроны. Их можно обнаружить среди бактерий, осуществляющих брожения, среди аноксигенных фототрофов и среди анаэробно дышащих микроорганизмов. Биодеградация широкого спектра ароматических субстратов чистыми микробными культурами показана в нитрат-, железо- и сульфатвосстанавливающих условиях, однако в зависимости от окислительно-восстановительного потенциала используемого акцептора электронов, количество запасенной энергии будет разным. Из конечных акцепторов, отличных от кислорода, самым высоким ОВП обладает нитрат (+433 мВ), далее следуют ионы Fe3+ и Мп4+ (около +200 мВ) и сульфат (-200 мВ). Некоторые микроорганизмы с бродильным типом метаболизма способны в качестве акцептора электронов использовать Н^. Однако поскольку этот процесс термодинамически невыгоден, то для отведения молекулярного водорода он требует наличия синтрофного партнера (метаногенов, сульфидогенов или гомоацетогенов).

Для большого числа микроорганизмов показана способность к обесцвечиванию азокрасителей путем восстановительного разрыва азосвязи.

Это представители родов Proteus, Enterococcus, Aeromonas, Streptococcus,

Bacillus, Pseudomonas, Coprococcus, Fusobacterium, Bacteroides, Pediococcus,

37

Peptostreptococcus, Citrobacter, Eubacterium, Clostridium, Desulfovibrio,

Sphingomonas, Escherichia, а также бактерии молочнокислой группы из родов

Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Bifidobacterium (Rafii, Cerniglia, 1993;

Yoo et al., 2000; Stolz, 2001; Perez-Diaz, McFeeters, 2009). Смешанные микробные сообщества из аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов обесцвечивают азокрасители только в бескислородных условиях, хотя могут расти и в аэробных условиях. Чистые культуры

Pseudomonas luteola, Aeromonas hydrophila, Bacillus subtilis, Pseudomonas sp. и Proteus mirabilis для фрагментации азокрасителей путем разрыва азосвязей в анаэробных условиях требуют дополнительного источника углерода и энергии (Pandey et al., 2007). При этом в зависимости от структуры начального субстрата авторы констатируют образование ароматических аминов различной сложности в качестве продуктов. Доказано, что некоторые анаэробные бактерии в кишечнике человека (Clostridium sp., С. leptum, С. clostridiiforme, С. paraputrißcum, С. perfringens, Eubacterium sp., Lactobacillus acidophilus и Lb. fermentum, Salmonella sp., Bacillus sp., Escherichia coli,

Enterococcus faecalis) могут расщеплять азокрасители, а также нитроароматические гидрокарбоны до соответствующих аминоароматических соединений с помощью конститутивных ферментов с азоредуктазной и нитроредуктазной активностью. При этом нитроароматические вещества ингибируют азоредуктазную активность.

Предполагают, что этот фермент - адениндинуклеотиддегидрогеназа может обладать двумя активностями и синтезироваться во всем пространстве клетки без привязки к каким-либо внутриклеточным структурам (Rafii, Cerniglia,

1995; Chen et al., 1999, 2009). Показана способность лактобацилл модифицировать азокраситель тартразин (Lb. casei, Lb. brevis, Lb. paracasei,

Lb. rhamnosus, Lb. plantarum, Lb. curvatus, Leuconostoc paramesenteroides, Leu. mesenteroides, Lactococcus lactis, Lc. cremoris) с образованием продукта с пиками поглощения 361 и 553 нм и массой 111 D (Perez-Diaz, McFeeters,

38

2009). В анаэробных условиях трансформация красителей лактобациллами происходила намного эффективнее, чем в аэробных. Те же лактобациллы обладали способностью в анаэробных условиях разрушать и другие азокрасители, близкие по структуре к тартразину (Methyl Orange, Acid Orange 8, Acid Orange 63). Авторы предполают, что азокрасители не могли использоваться чистыми культурами лактобацилл как источник энергии (Perez-Diaz, McFeeters, 2009). В ряде работ показана способность к разложению запрещенных к использованию, но встречающихся в некоторых фальсифицированных продуктах азокрасителей группы Sudan микробиотой ЖКТ крыс, кроликов (Chung et al., 1978; Cerniglia et al., 1982) и человека (Xu et al., 2007, рис. 11). Консорциумы из фекалий обесцвечивали азокрасители Sudan I-IV и Para Red в анаэробных условиях с образованием высокотоксичных веществ (анилина, 2,4-диметиланилина, о-толуидина и 4-нитроанилина). О полной минерализации этих соединений микробиотой ЖКТ человека не сообщается.

Появление токсичных соединений зарегистрировано при обесцвечивании азокрасителя Амарант (Е123) культурой Trametes versicolor (Shin et al., 2002). Вывод о токсичности сделан авторами на основании снижения скорости деколоризации через несколько циклов и восстановлении ее прежнего уровня только при замене питательной среды на свежую.

В настоящее время наиболее изученной представляется анаэробная деструкция ароматических аминов, содержащих карбоксильную или гидроксильную группы (аминофенолов, аминобензойных и аминосалициловых кислот). Аминоароматические соединения могут использоваться микроорганизмами в качестве источников углерода и/или энергии, при этом глубина преобразования молекулы субстрата может быть разной. Деструкторы ароматических аминов, выделенные в виде чистых культур и в разной степени охарактеризованные, относятся к разным таксономическим группам домена Bacteria (табл. 2). он нан0

ОН

Intcstind microflora

NH, оnh2

Sudani

Г1 -amino-2-naphthol] aniline

ОН

H=N—0113

ОН

Intestinal microflora

H3C Sudanll

HH3

IfcC 1 -amino-2-naphthol] 2,4-

Sudan 1П он

Intestinal microflora

NH2 H3H—Q-»* + 1 -amino-2 -naphthol] [ 1,4 -phenyien ediamine] aniline

ОН H3C H3C

Sudan IV

OH

Intestinal microflora

H3C H3C

HH2 \ \ H2H—^J)—HH2 + H2H—/^Л 1 -amino - 2 -naphlhol] [2,5-diaminotoluene] 0-to lui dine он он

H=H——HOi Intestinal microflora ^ —HH2 + HjH——HOj 1 -amino-2-naphlhol] 4-nitroaniline

Para Red

Рис. 11. Предполагаемый путь разложения азокрасителей Sudan I-IV и Para Red микробиотой ЖКТ человека (Xu et al., 2007).

Большинство видов бактерий-деструкторов для роста предпочитает средние температуры и околонейтральные значения рН и способны выдерживать повышенные концентрации аминоароматических веществ. При использовании трудноразлагаемых соединений усиливается роль кометаболизма, когда проявление способности к преобразованию сложной молекулы обуславливается наличием доступного источника углерода и энергии для поддержания жизнедеятельности, так как сам ксенобиотик не может использоваться микроорганизмом в этих целях.

Таблица 2.

Чистые культуры микроорганизмов, способных к деструкции ароматических аминов.

Микроорганизм, описание Используемые субстраты Условия Ссылка

Thauera aromatica К 172 подвижные грамотрицательные палочки, мезофилы, нейтрофилы, факультативные анаэробы, нитратредукторы с образованием N20 2-аминобензоат, толуол, фенол, бензальдегид, бензиловый спирт, п-крезол, фенилацетат, бензоат, 3,5-дигидроксибензоат, 3-и 4-гидроксибензоат и др. Нитратное дыхание Anders et al., 1995; Heider, Fuchs, 1997

Azoar cus evansii подвижные грамотрицательные палочки, мезофилы, нейтрофилы, факультативные анаэробы, нитратредукторы с образованием N20 2-аминобензоат, бензоат, «-крезол, толуол,3-и 4-гидроксибензоат, 2-фторбензоат, о-фталат, бензальдегид, бензиловый спирт и др. Нитратное дыхание Anders et al., 1995; Heider, Fuchs, 1997

Thauera chlorobenzoica З-СВ-1, 3-ВВ1, 4-FB1, 4-FB2 подвижные грамотрицательные палочки, мезофилы с topt=30°C, нейтрофилы с pHopt=7,5-8,0, факультативные анаэробы, нитратредукторы 3-аминобензоат, 3- хлорбензоат, 3-бромбензоат, 2- и 4-фторбензоат, бензоат, бензиловый спирт, 3-и 4-гидроксибензоат, протокатехоат, м- и п-крезол Нитратное дыхание Song et al., 2000, 2001

Magnetospirillum sp. CC-26 спиральные грамотрицательные клетки с биполярными жгутиками, факультативные анаэробы, нитратредукторы 2- и 3-аминобензоат, бензальдегид, бензоат, бензиловый спирт, п-крезол, 3- и 4-гидроксибензоат, фенол, фенилацетат Нитратное дыхание Shinoda et al, 2000

Delftia sp. HY99 (близок к виду Delftia acidovorans) подвижные грамотрицательные, палочковидные клетки, факультативные анаэробы, нитратредукторы анилин Нитратное дыхание Kahng et al., 2000

Desulfobacterium sp. mABl неподвижные грамотрицательные короткие палочки, мезофилы, нейтрофилы с pHopt=7,0-7,5,строгие анаэробы, сульфатредукторы 3-й 4-аминобензоат Сульфатное дыхание Schnell, Schink, 1991, 1992

Desulfobacterium anilini неподвижные короткие палочки, мезофилы с t0pt=35oC, нейтрофилы с pHopt=6,9-7,5,строгие анаэробы, сульфатредукторы анилин, 2- и 4-аминобензоат, фенол, бензоат, «-крезол, 2-, 3- и 4-гидроксибензоат, некоторые дигидроксибензоаты Сульфатное дыхание Schnei et al., 1989; Schnell, Schink, 1991

Desulfobacula toluolica «яря-мети ланилин Кометабо-лизм в Raber et al.,

То12 неподвижные короткие палочки, строгие анаэробы, сульфатредукторы присутствии толуола как донора электронов в сульфатном дыхании и как источника углерода 1998

Rhodopseudomonas palustris подвижные грамотрицательные прямые палочки, Rhodospirillum fulvum подвижные грамотрицательные спиральные палочки, Rhodocyclus purpureus неподвижные грамотрицательные сильно изогнутые клетки, иногда в виде кольца 4-аминобензоат, 4-аминофенол, бензоат, 4-гидроксибензоат, фенилсодержащие жирные кислоты, метоксизамещенные ароматические соединения Аноксиген- ный фотосинтез Khanna et al, 1992

Klebsiella pneumoniae subspp. pneumonia, ozaenae, К. mobilis, К. oxytoca подвижные грамотрицательные прямые палочки 5-аминосалицилат, п-аминофенол Кометабо-лизм при сбраживании глюкозы Сиволодс-кий и др., 1994

В условиях кометаболизма чистая культура, как правило, не размножается и трансформирует чужеродное соединение с постоянно низкой скоростью, накапливая продукты трансформации в среде. Потребление ко-субстрата, повидимому, является источником восстановительных эквивалентов для реакции трансформации.

Некоторые бродилыцики {Syntrophus aciditrophicus, Desulfotomaculum thermobenzoicum subsp. thermosyntrophicum) способны сбраживать бензоат (Elshahed, Mclnerney, 2001, Plügge et al., 2002), a Sporotomaculum hydroxybenzoicum - 3-гидроксибензоат (Muller, Schink, 2000). Информация о сбраживании чистыми культурами микроорганизмов-бродилыциков какой-либо аминоароматики отсутствует.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Котова, Ирина Борисовна

ВЫВОДЫ:

1. Из илов очистных сооружений и донных осадков природных водоемов выделены и изучены анаэробные микробные сообщества, стабильно (5-10 лет) и с высокой активностью обесцвечивающие азокрасители и конвертирующие аминоароматические кислоты (0,07-0,8 мМ/сут) в биогаз, что делает их перпективными для биотехнологического использования.

2. Установлено, что анаэробная конверсия азокрасителей в биогаз, осуществляемая микробными сообществами, включает неспецифическую стадию обесцвечивания и специфический этап трансформации образовавщихся ароматических аминов, различающиеся механизмами, регуляцией и отношением к параметрам культивирования.

3. Определены продукты фрагментации испытанных азокрасителей и впервые идентифицированы основные ароматические и линейные интермедиаты анаэробной деструкции ААК. Предложена общая схема процесса разложения ААК путем первичной трансформации до соответствующих ароматических спиртов, окисляющихся до бензойной кислоты, с ее последующей деароматизацией и образованием смеси ЛЖК, спиртов, СОг и Н2, превращающихся через синтрофную стадию в биогаз. Установлено, что метаногенные сообщества разрушают ААК по бензоил-КоА-пути.

4. Показано, что ААВ оказывают селективное воздействие на метаногенные микробные сообщества, снижая общее количество клеток и биоразнообразие в них и вызывая смену доминирующих видов. В свою очередь, активные консорциумы в определенных пределах способны к самокоррекции своей структуры в ответ на воздействие различных факторов.

5. Определен компонентный состав активных метаногенных сообществ и показано преобладание в них некультивируемых микроорганизмов, близких к Bacteroidetes и Clostridium. Выделено и идентифицировано до вида 7 чистых культур, установлены их возможные функции и предложена схема трофических связей при конверсии ААК в биогаз.

6. Показана принципиальная возможность «конструирования» сообществ с заданными свойствами как из микроорганизмов, выделенных из консорциумов различного происхождения, так и из коллекционных культур с аналогичными свойствами.

7. Путем лабораторного моделирования продемонстрирована необходимость проведения тщательного мониторинга судьбы ААВ в окружающей среде и в организме человека и животных из-за их неполного разложения в ЖКТ, способного привести к негативным изменениям структуры и функционирования нормальной микробиоты млекопитающих. Показана принципиальная возможность использования кишечных микробных сообществ для первичного тестирования пищевых азокрасителей.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность своему научному консультанту д.б.н., проф. Нетрусову А.И. и д.х.н., проф. Калюжному C.B., по инициативе которых было начато это исследование, за постоянное внимание, помощь и заинтересованное обсуждение результатов.

Автор искренне признателен своим соратникам, принимавшим участие в работе на разных ее этапах: сотрудникам, дипломникам и аспирантам каф. микробиологии биологического факультета МГУ им. Ломоносова - к.б.н. Линьковой Ю.В., Дьяконовой А.Т., к.б.н. Савельевой О.В., Есаковой A.A., Куликовой И.А., Пуреховской К.А. и сотрудникам каф. химической энзимологии химического факультета МГУ им.Ломоносова - к.х.н. Скляру

B.И., к.х.н. Емашовой H.A. и к.х.н. Гладченко М.А.

Хотелось бы выразить огромную благодарность д.б.н., проф. Егорову Н.С., в группе которого я начинала свою научную деятельность, и с бесконечной признательностью вспомнить моего первого наставника к.б.н. Н.С.Ландау.

Автор искренне благодарен д.б.н. Т.Г.Юдиной за консультации и помощь в осуществлении электронно-микроскопических исследований, к.б.н. Е.С.Милько - за консультации и методическую помощь в вопросах диссоциации микроорганизмов, к.б.н. Е.В.Семеновой - за критическое обсуждение проблем биодеградации ксенобиотиков, к.б.н. Т.А.Чердынцевой - за участие в работе с лактобациллами, постоянную экспериментальную помощь и моральную поддержку.

Автор признателен д.б.н. Т.П.Туровой (Институт микробиологии им.

C.Н.Виноградского РАН) и сотрудникам группы молекулярно-биологической идентификации Центра «Биоинженерия» РАН за помощь в проведении и интерпретации результатов филогенетического анализа.

Хочется поблагодарить проф. А.Стамса и сотрудников его лаборатории (Университет Вагенингена, Нидерланды) за предоставление аппаратурной базы, методическую помощь, обсуждение результатов и советы по дальнейшим направлениям исследований.

Автор выражает признательность всем сотрудникам и преподавателям кафедры микробиологии, оказывавшим разнообразную помощь и поддержку в процессе выполнения работы.

Большое спасибо членам моей семьи и моим друзьям за постоянную моральную поддержку и веру в успех.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Природные и синтетические вещества, содержащие в молекулах ароматическое кольцо, обладают значительной стабильностью, что препятствует их разложению до простых соединений и приводит к дисбалансу синтетических и деструктивных процессов в глобальных циклах элементов. Повсеместное использование в промышленности и в быту азокрасителей и аминозамещенных ароматических веществ ведет к возрастанию их выброса в окружающую среду, создает избыточное давление на самоочищающую способность естественных местообитаний и принимает угрожающий характер из-за их быстрого распространения по трофическим цепям и токсического, мутагенного или канцерогенного влияния на живые организмы даже в малых дозах. Неэффективность традиционных способов очистки по отношению к таким соединениям стимулировала нас к изучению их анаэробной деструкции с упором на полную минерализацию загрязнителя с образованием биогаза как альтернативного источника энергии. Поскольку метаногенное разложение природных органических отходов давно и успешно применяется в очистке сточных вод, оно и было взято нами за основу. Главной целью работы было детальное изучение процесса полной метаногенной деструкции ААВ и соотнесение с ним изменений в структурно-функциональной организации активного сообщества. Такие исследования к моменту написания нашего труда в литературе представлены не были.

Выбор биологического материала диктовался наличием или теоретической возможностью осуществления метаногенного разложения органических веществ у его источника, т.е. из доступных это могли быть анаэробные донные отложения природных водоемов, анаэробные осадки очистных сооружений, а также ЖКТ животных. Нами проведен скрининг одиннадцати видов анаэробных осадков различного происхождения на их способность разрушать ААВ. Выделен ряд активных микробных сообществ, полностью минерализующих субстрат с образованием биогаза в качестве конечного продукта и сохраняющих такую способность при повторных добавлениях новых порций субстрата и при многократных пересевах в свежую среду. Такие активные сообщества выделены нами как из источников, где подобные загрязнения могли иметь место, так и из естественных водоемов, не загрязнённых соответствующими веществами.

Для исследования полной трофической цепи метаногенной конверсии ААВ и изучения структурно-функциональной организации осуществляющих ее сообществ был применен комплексный подход с использованием микроскопических, микробиологических, молекулярно-биологических и химических методов. Поскольку априори результат был непредсказуем, то на начальной стадии работы задействовали максимально возможный спектр сред и условий культивирования: применяли анаэробную и аэробную инкубацию на минеральных и богатых, жидких и твердых средах, содержащих или не содержащих основной ксенобиотик, а также предполагаемые интермедиаты его деструкции. Наше предположение, что классическая схема анаэробного разложения биополимеров с превращением в биогаз, изменится на начальных этапах (см. рис. 22), подтвердилось. Нам удалось получить анаэробные микробные сообщества, которые стабильно (более 5-10 лет) с высокой скоростью разрушают азокрасители и ААК до биогаза, что делает их перпективными для технологического использования. Множественность подходов к решению глобальной проблемы очистки окружающей среды от отходов и загрязнений, особенно антропогенных и ксенобиотических, позволяет надеяться в будущем на их полную переработку в полезные продукты наиболее «дружественными» природе способами.

Несмотря на разнообразие использованных сочетаний температуры инкубации и кислотности среды, оптимальными для процесса биодеградации в

382 целом оказались 30°С и рН=6,5-7,5, хотя для реакции обесцвечивания нами продемострированы несколько отличающиеся параметры. Так, самая лучшая в испытанном диапазоне температура для обесцвечивания азокрасителей (55°С) приводила к полному ингибированию деструкции ААК (т.е. последующих реакций в цепи полной минерализации). Стадии трансформации и деароматизации требовали значительной плотности инокулята (50% и более), тогда как для разрыва азосвязи было достаточно 5-10% содержания посевного материала. Эти данные еще раз свидетельствуют о различном механизме этапов обесцвечивания азокрасителей и дальнейшего преобразования аминов-интермедиатов. Следует также особо подчеркнуть, что в природных местообитаниях, из которых происходят илы донных отложений, физико-химические параметры не соответствуют оптимальным для эффективного и полного процесса деструкции ААВ. Это несоответствие является одним из существенных ограничителей протекания анаэробной биодеградации таких соединений при показанной нами его потенциальной возможности и наличии микроорганизмов необходимых функциональных групп. Медленная и неполная биодеструкция может приводить к появлению и длительному персистированию в природных водоемах токсичных для живых организмов (амино)ароматических интермедиатов. Эти соединения, быстро накапливаясь, могут оказывать значительное влияние на структуру всей экосистемы. Поскольку в природных водоемах невозможно привести физико-химические факторы к требуемым значениям, то при сбросе стоков, загрязненных ААВ, необходимо применять дополнительные методы очистки в искусственных системах с использованием специально разработанных препаратов на основе анаэробных микробных сообществ.

Выделенные нами микробные сообщества с высокой скоростью и без лагпериода обесцвечивали структурно различные азокрасители путем восстановления азосвязей, что свидетельствует о неспецифичности этой реакции. Интересен также факт, что микробные сообщества, полученные из

383 ила КСА, обычно растущего и функционирующего при значительной аэрации (активный ил КСА), при культивировании без доступа кислорода обесцвечивали азокрасители. При длительной инкубации в анаэробных условиях у них проявилась устойчивая способность не только к обесцвечиванию (что неудивительно, так как в дальнейшем нами показано участие в этом процессе факультативных и аэротолерантных анаэробов), но и к осуществлению дальнейшей деструкции ароматических аминов вплоть до полной метаногенной минерализации. Это подтверждает имеющиеся в литературе сведения о присутствии строго анаэробных микроорганизмов в аэробных местообитаниях, если они входят в состав сложных агрегированных ассоциаций (находятся в их глубинных локусах) совместно с аэробными и факультативно анаэробными партнерами (Elvers, Lappin-Scott, 2000; Leadbetter, 2000; Заварзин, 2003; Литти, 2012).

Нашими исследованиями установлено, что реакция восстановления азосвязей в анаэробных сообществах имеет преимущественно внеклеточную локализацию и неспецифический характер и происходит под действием восстановленных веществ-медиаторов (сульфида, НАДН и др.), являющихся продуктами метаболизма микробного сообщества в анаэробных условиях.

Живые микробные клетки постоянно пополняют пул таких веществ за счет ферментативного восстановления их окисленной формы. Широко распространенный в живых клетках медиатор рибофлавин может участвовать в переносе восстановительных эквивалентов для этой реакции. Попаданию в среду определенного количества внутриклеточных восстановительных эквивалентов способствует происходящий в любом микробном сообществе лизис части популяции. Следует отметить, что возможен также лизис клеток за счет экзогидролаз, выделяемых микроорганизмами группы целлюлозолитиков, вида Proteiniphilum acetatigenes и штаммов Pseudomonas aeruginosa в виде Мдиссоциантов, наличие которых в сообществах показано нами. Поскольку в сообществах отмечено присутствие факультативных анаэробов, не исключена

384 возможность участия в процессе обесцвечивания азокрасителей и каких-то специфических механизмов (например, восстановление азоредуктазами этих микроорганизмов), однако, предложенный нами механизм, вероятно, является преобладающим в случае именно анаэробных микробных сообществ.

Образующиеся в результате восстановительного расщепления азокрасителей в анаэробных условиях различные ароматические амины могут быть как менее, так и более токсичными, чем исходные соединения. Наши исследования подтвердили, что традиционный быстрый и удобный метод оценки токсичности по снижению ацетокластической активности свидетельствует об угнетении именно метаногенов и не позволяет выявить ингибирующее влияние исследуемых соединений на другие группы микроорганизмов-членов анаэробного микробного сообщества. Проверка влияния ААВ, осуществленная нами на выделенных из сообществ чистых культурах, показала, что одно и то же соединение может не ингибировать ацетокластический метаногенез и одновременно значительно подавлять развитие других членов трофической цепи (например, Тп в концентрации 1 мМ не влиял на ацетокластический метаногенез в сообществе, но на 12-40% подавлял рост лактобацилл; нетоксичная в концентрации 9 мМ для ацетокластической активности сообщества 5-АСК в той же концентрации полностью ингибировала рост С. /геипсШ Д¥А1). Доказательством «небезразличности» ААВ для микроорганизмов-членов сообщества также является наблюдаемое снижение общего количества клеток и изменение соотношения морфотипов, более выраженное в случае ароматических аминов как начальных субстратов.

Если первая стадия деструкции азокрасителей «микробиологически» неспецифическая и протекает сравнительно быстро и, как правило, без лагпериода, то следующий этап, наоборот, требует значительных периодов адаптации и наличия определенных микроорганизмов, способных к реакциям трансформации и деароматизации. Поскольку образующиеся в качестве продуктов обесцвечивания ароматические амины различаются по

385 биодеградабельности, то полная минерализация азокрасителей в метаногенных условиях иногда затруднительна. Более того, ряд аминов-интермедиатов, которые подвергались преобразованиям в случае деструкции азокрасителя как основного субстрата, при использовании в качестве исходных субстратов либо не потреблялись совсем (как ДМФ), либо минерализовались более медленно как 4-аминорезорцин, изомеры АБК и 5-АСК). Довольно длительные лагпериоды при адаптации к ААК и сходные природа и последовательность появления промежуточных и конечных продуктов, наблюдаемые у микробных сообществ из различных источников, говорят об универсальности цепи реакций утилизации этих субстратов, имеющей в основе классическую схему метаногенной минерализации биополимеров. Выявленный нами наиболее вероятный в данных условиях путь разложения ААК (бензоил-КоА-путь) считается преобладающим анаэробным путем в мире микробов (Heider, Fuchs,

1997). Реализация альтернативных (флороглюцинового и резорцинового) путей в изученных сообществах нами не обнаружена. Внесение доступного косубстрата в микробное сообщество существенно увеличивало скорость деградации субстратов, однако этанол, действенный для стадии обесцвечивания, был малоэффективен на стадии трансформации и деароматизации, что может объясняться тем, что С. freundii WA1, ответственный за эту стадию, не растет на этаноле. Пиру ват же является важнейшим амфиболитом клеток и обеспечивает многочисленные пути взаимопревращений органических веществ, поэтому его использование в качестве легкодоступного субстрата приводило к стимуляции процесса кометаболизма ААК. Увеличение скоростей обесцвечивания азокрасителей и деструкции ААК при внесении доступного ко-субстрата в сообщества и его необходимость в случае потребления ААВ выделенными чистыми культурами подтверждает «энергетическую напряженность» метаногенной конверсии ААВ для сообществ) и невозможность использования ААВ в качестве ростовых субстратов (для чистых культур). Внесение дополнительного акцептора

386 электронов в активные метаногенные сообщества, длительно контактирующие с ААВ, имело разные последствия для стадий обесцвечивания азокрасителей и деструкции ААК. Так, наличие сульфата и особенно нитрата в среде резко замедлило деколоризацию на фоне прохождения сульфат- или нитратредукции, что было ожидаемо, а вот в сообществах, разрушающих ААК, восстановления нитрата и сульфата не наблюдали, хотя в исходных илах сульфат- и нитратредуцирующая активность присутствовала, а при определении количества сульфатредукторов в активных сообществах их количество составило более 106 клеток/мл. Даже в «свежих» накопительных культурах из исходных илов добавление нитрата и сульфата, вопреки ожиданиям, либо стимулировало незначительно, либо вообще ингибировало разложение ААК по сравнению с условиями метаногенеза. Таким образом, нами установлено, что в сообществах присутствуют микроорганизмы, способные к сульфат- (WSR) и нитрат- (P. aeruginosa ASA2 и Tsaydam-5-ASA, С. freundii WA1, В. subtilis ЕР-ABA) редукции, но эта функция у них «выключена», реализуется при каких-то дополнительных условиях либо количество клеток недостаточно для ее проявления.

Ингибирование последней метаногенной стадии процесса биодеградации при отсутствии доступного углеродного субстрата полностью прекращает деструкцию ААК и практически не влияет на активность обесцвечивания азокрасителей, что еще раз говорит о «дополнительности» и неспецифичности реакции восстановления азосвязи, за которую могут отвечать сразу несколько групп микроорганизмов и она, вероятно, регулируется другим способом.

Очевидно, именно специфические стадии и ответственные за них микроорганизмы являются определяющими при формировании структуры активного сообщества (его компонентного состава, морфологии агрегатов, соотношения членов). Даже такой простой и грубый, но наглядный способ изучения изменений состава сообществ как подсчет морфотипов клеток под микроскопом, продемонстрировал, что контакт с ароматическими аминами приводит к более серьезным подвижкам структуры сообщества, чем с азокрасителями. Именно при деградации аминов (на примере ААК) отмечено соответствие фазы процесса деструкции и изменений культуральных признаков и микроскопической картины сообществ. Особенно четко это прослеживалось в первых циклах потребления субстратов, когда скорость процесса была невелика и удалось зарегистрировать основные ароматические и линейные интермедиаты. В последующих циклах при стабилизации активности эти волнообразные повторяющиеся колебания параметров сглаживались (интермедиаты практически не улавливались, колебания структуры не наблюдали). Активные и стабильные анаэробные сообщества независимо от происхождения представляли собой сбалансированные микробные ассоциации с минимизированным числом компонентов.

Отсутствие прямой корреляции между концентрацией и степенью морфологического разнообразия исходного биологического материала и последующей активностью биодеградации в выделенных из него сообществах мы объясняем следующими причинами. Во-первых, на сегодняшний день не существует метода, адекватно отражающего реальное содержание живых клеток в агрегированном биоматериале, поскольку его значительную часть составляет матрикс и заключенные в нем метаболиты. Во-вторых, для протекания процесса биодеградации важны скорее не систематические позиции микроорганизмов, а их метаболические (функциональные) возможности, а морфологическое разнообразие может отражать большее присутствие «сателлитных» (необязательных для процесса) микроорганизмов.

Для определения состава активных сообществ мы сочетали молекулярнобиологические и микробиологические методы анализа. Следует отметить, что не все микроорганизмы, присутствующие в сообществе по данным ДГГЭ, были получены в виде чистых культур, так же как и ряд выделенных культур не был выявлен при молекулярно-биологическом анализе. Такое частичное несовпадение результатов из-за отсутствия универсального, единого, не имеющего ограничений способа определения состава сложных многокомпонентных сообществ отмечают многие авторы (Diaz et al., 2006; da

Cruz Pedrozo Miguel et al., 2010; 2011; Chen et al., 2011). Как и ожидалось, большинство микроорганизмов в сообществе оказалось некультивируемыми, а те, которые удалось выделить в виде чистых культур, являлись представителями рутинных систематических групп, факультативными или аэротолерантными анаэробами с довольно пластичным метаболизмом.

Присутствующий в сообществе и зарегистрированный с помощью ДГГЭанализа штамм Proteiniphilum acetatigenes нам выделить пока не удалось. В то же время, ряд штаммов, не детектированных путем ДГГЭ-анализа, были получены в виде чистых культур при рассевах (С. freundii WA1, P. aeruginosa

ASA2 и Tsaydam-5-ASA). Следует отметить, что легче выделяться будут не только штаммы, которые численно преобладают в сообществе, но и те группы микроорганизмов, которым больше подходят условия культивирования на использованных в работе средах. При вхождении в состав агрегата большого количества видов микроорганизмов может не происходить четкого разделения материала при ПЦР и форезе. Кроме того, могут не разделиться ампликоны близкородственных и немногочисленных по количеству клеток штаммов, которые в то же время могут хорошо расти на использованных средах, накапливаться там и легко выделяться в виде чистых культур. Действительно, мы наблюдали на гелях многочисленные полосы низкой интенсивности или размытые участки, которые было невозможно амплифицировать. С другой стороны, и микробиологический анализ из-за отсутствия универсальных сред и неполного соблюдения условий естественного развития микроорганизмов в ассоциациях не может считаться всеобъемлющим. Поэтому наиболее полно удалось охарактеризовать состав активного метаногенного сообщества с помощью комплекса методов (ДГГЭ-анализ, классические микробиологические приемы выращивания и выделения культур и прямые микроскопические наблюдения). Однако точное определение метаболических

389 возможностей и других свойств микроорганизмов, входящих в изучаемые сообщества, возможно только после выделения их в виде чистых культур. Такие исследования необходимы для определения роли каждого члена сообщества в процессе образования конечного продукта.

По нашим данным выделенные микроорганизмы могут осуществлять в сообществе несколько функций. Так, С. freundii WA1 проводит реакцию первичной трансформации изомеров АБК и АСК, за короткое время (25-32 ч) восстанавливая и одновременно дезаминируя их до бензилового (БС) и 2-гидроксибензилового (2-ГБС) спиртов, соответственно, а также восстанавливая бензальдегид (БА) до БС. Это первый из микроорганизмов, способный к такой реакции, поскольку другой известный «первичный деструктор» Desulfovibrio vulgaris PY1 (Bock et al., 2000) восстанавливает 3-АБК на фоне сбраживания пиру вата только до 3-аминобензилового спирта (без отщепления аминогруппы) со значительно более низкой скоростью (17-20 сут). Так как С. freundii WA1 не может восстанавливать соответствующие незамещенные карбоксильные ароматические кислоты, то вероятно восстановление ААК включает два этапа (см. рис. 113), как показано для ряда бактерий (Genthner et al., 1997; van den Ban et al., 1999; Bock et al., 2000), с образованием БА как промежуточного продукта. Однако в культуральной жидкости С. freundii WA1 БА не обнаруживался. Это может свидетельствовать о том, что культура восстанавливает альдегид до спирта намного быстрее, чем превращает ААК в БА, аналогично клеткам P. furiosus (van den Ban et al., 1999). Интересно, что в сообществе зарегистрировано превращение 2-ГБС в БА, который затем окислялся до БК. У С. freundii WA1 нами не обнаружена способность к дисмутации Б А, показанная Parshina et al. (2003) для Soehngenia saccharolytica, когда БА эквимолярно восстанавливался до БС и окислялся до БК. Наши данные также показывают «предпочтения» культуры в положении заместителя ароматического кольца. Так, 5-АСК и ее стерео-изомер 3-АБК (по аминогруппе) восстанавливались С. freundii WA1 с высокой скоростью, тогда как другие изомеры - значительно менее эффективно.

Нам не удалось выделить микроорганизмы, осуществляющие раскрытие кольца, хотя эксперименты показывают, что активные сообщества потребляют БК, превращая ее в линейные интермедиаты. Вероятно, за эту реакцию могут отвечать детектированные в сообществе некультивируемые микроорганизмы, близкие к роду Clostridium, и сульфатредукторы из выделенных нами ко-культур или это интегральная функция, возникающая при наличии определенного сочетания микроорганизмов. Первое предположение основано на сведениях об универсальности клостридий, которые способны сбраживать широкий спектр химически разных субстратов, включая салицин и метоксилированные бензоаты (Clostridium methoxybenzovorans, Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2009). Вторая возможность базируется на наличии у ко-культуры WSR сульфатредуцирующей активности и сведений из литературы о сбраживании бензоата и 3-гидроксибензоата Desulfotomaculum thermobenzoicum subsp. thermosyntrophicum (Plugge et al., 2002) и Sporotomaculum hydroxybenzoicum (Muller, Schink, 2000), а также об окислении ароматики Desulfobacterium sp. тАВ1и Desulfobacterium anilini (Schnel et al., 1989; Schnell, Schink, 1991, 1992) в условиях сульфатредукции. Наконец, нельзя исключать, что свойство раскрывать бензольное кольцо может возникать при сочетании метаболических возможностей нескольких микроорганизмов, что подтверждается фактами деароматизации в искусственных сообществах, созданных нами из микроорганизмов и ко-культур, отдельно не показавших такой способности.

Основным «местом действия» других выделенных нами чистых и кокультур (кроме псевдомонад), очевидно, является «бродильный блок» трофической цепи разложения ААВ. Они способны осуществлять различные виды брожений образовавшихся линейных интермедиатов деароматизации.

Присутствующий в сообществе и зарегистрированный с помощью ДГГЭ

391 анализа штамм Proteiniphilum acetatigenes нами пока не выделен, однако предположение о его функциях основаны на описании штаммов этого вида, полученных также из UASB-реактора, обрабатывающего стоки пивоваренного производства (Chen, Dong, 2005). Изученные авторами штаммы не использовали сахара, спирты и жирные кислоты, но конвертировали пируват в ацетат и С02. Поэтому в цепи реакций сообщества он должен быть поставлен на стадию брожения. Ко-культура WAC, обладающая активностью гомоацетогенеза, может также обеспечивать дополнительный небольшой «поток» ацетата. «Классических» синтрофных микроорганизмов в сообществе выявить не удалось, однако, как известно, сульфатредукторы могут становиться синтрофами в отсутствие сульфата, что в данном случае и может иметь место. Завершающие этапы полной минерализации ААВ в сообществе осуществляют выявленные с помощью Д11 Э-анализа Methanosarcina mazeii (в основном, водородотрофный и Ci-метаногенез) и Methanosaeta concilii (ацетокластический метаногенез).

Таким образом, основные члены метаногенных сообществ, разрушающих ААК, выделены в виде чистых или ко-культур. Изучение их свойств и последующее совместное культивирование позволило нам проследить возможные трофические связи в сообществе (см. рис. 128) и подтвердить цепь реакций конверсии ААК в биогаз (см. рис. 78). В активном сообществе, где отсутствуют какие-либо другие источники углерода, кроме ААК, восстановительные эквиваленты, необходимые для первых стадий трансформации субстрата, поставляются, вероятно, последующими реакциями окисления ароматических спиртов (БС или 2-ГБС) или бензоата (БК).

В качестве дополнительных возможностей выделенных лактобацилл и С. freundii WA1 нами показана их способность к восстановлению азосвязей. Не исключено, что выделенные нами штаммы псевдомонад, В. subtilis и М. osliensis тоже могут участвовать в этой реакции, но нам не удалось создать им подходящие для этого условия роста вне сообщества. Другие авторы отмечают

392 такую способность для представителей этих видов (Pandey et al., 2007; Dafale et al., 2008). По-видимому, обесцвечивание азокрасителей сообществами следует рассматривать как «надстроечную», необязательную (дополнительную) функцию, что подтверждается ее наличием у консорциумов, разрушающих ААК, но никогда ранее не контактировавших с азокрасителями.

Роль в процессе биодеградации ААК выделенных из активных сообществ представителей вида P. aeruginosa нам выявить не удалось, поскольку в условиях существования сообщества они не участвовали ни в одной из стадий процесса. Однако показанная нами возможность функционирования химического пути трансформации ААК подтверждена созданием искусственных ассоциаций P. aeruginosa ASA2+nrraMM WH. Впервые показана возможность опосредования клетками псевдомонад химической реакции трансформации ААК за счет биологической нитратредукции в присутствие нитрата. Реакция образования арилдиазония (диазонирования) в нашем случае, в отличие от литературных данных, наблюдалась при нейтральном рН и низком значении окислительно-восстановительного потенциала. Искусственная ассоциация P. aeruginosa АБА2+штамм WH продемонстрировала вероятность протекания таких микропроцессов в реальных стоках как альтернативную метаногенной конверсии при изменении физико-химических условий и как дополнительную и локальную внутри агрегированного сообщества.

Другие свойства выделенных культур, возможно, реализуемые в активных сообществах, могут быть проанализированы с привлечением литературных данных. Так, для факультативных анаэробов-членов сообщества одной из защитных функций может считаться поглощение проникшего кислорода для поддержания анаэробных условий. Снабжение партнеров различными ростовыми факторами также следует отметить как дополнительную роль в консорциуме для таких культур как Proteiniphilum acetatigenes, Мдиссоцианты P. aeruginosa, лактобациллы и В. subtilis, для которых

393 установлено наличие экзогидролазной (в частности, протеолитической) активности (Chen, Dong, 2005; Милько и др., 2008, 2010; Bergey's Manual of

Systematic Bacteriology, 2005, 2009). Это качество важно при создании легкоусваиваемых (ко-)субстратов внутри сообщества для осуществляющего в процессе кометаболизма трансформацию ААК С. freundii WA1, а также для развития лактобацилл, требующих богатой среды для роста. Выделяющие значительное количество слизи клетки М-диссоциантов псевдомонад-членов сообщества могут участвовать в образовании матрикса агрегатов. Для В. subtilis показана способность продуцировать обладающие перекрёстным действием адаптогены, защищающие клетки от стрессорных воздействий (в том числе, от влияния токсических веществ, Николаев, 2011). В микробном сообществе, где имеют место межвидовые взаимодействия, осуществляющиеся с участием низкомолекулярных видонеспецифичных метаболитов, перекрёстное действие внеклеточных адаптогенов может обеспечивать его устойчивое функционирование. Входящие в состав консорциума представители рода Pseudomonas, способные, по данным литературы, к синтезу внеклеточных поверхностно-активных веществ (ПАВ)биосурфактантов (Милько и др., 2010; Семенова и др., 2011), могут помогать более эффективному проникновению гидрофобных и малорастворимых ксенобиотиков через цитоплазматическую мембрану клеток (Fuchedzhieva et al., 2008). Внесение ПАВ используется как один из приемов при очистке почвы и воды от ксенобиотиков, поэтому микроорганизмы, вырабатывающие биосурфактанты, часто включают в биопрепараты. Так, выделенный из почвы, загрязнённой тринитротолуолом (ТНТ), штамм Pseudomonas putida BS320, активно трансформирует данный ксенобиотик в присутствии глюкозы и одновременно синтезирует ПАВ, ускоряющие деградацию ТНТ в почве и воде

Воробьёв и др., 2007). Штамм Pseudomonas sp. 51, обладающий способностью образовывать ПАВ, при внесении в разлагающую нефть микробную ассоциацию повышает эффективность деструкции нефти с 50 до 80%

394

Семёнова и др., 2011). Вероятно, одной из функций выделенных нами штаммов P. aeruginosa может быть синтез внеклеточных ПАВ, увеличивающих эффективность биодеструкции ААК микробным сообществом. Для псевдомонад также показана способность синтезировать алкилоксибензолы (АОБ) с радикалами С2-С8 (Николаев, 2011), проявляющие ауторегуляторные и адаптогенные эффекты. АОБ повышают физиологическую активность клеток в неоптимальных для роста условиях, проявляя в том числе антиоксидантное действие. Адаптогенный эффект в этих случаях может выражаться в существенном повышении пролиферативной активности клеток при «дозах» стрессового фактора, приближающихся к границам толерантности для вида.

Таким образом, микроорганизмы в составе сообщества могут иметь не только основные «биохимические» функции по выполнению этапов процесса деструкции ААК, но и участвовать в стабилизации, регуляции и защите консорциума, тем самым повышая его активность. Возможности регуляции метаболизма сообщества, по-видимому, не ограничиваются отмеченными нами индукцией аминоароматическими кислотами и влиянием конечного продукта («прекращением» метаногенеза), но и включают такие механизмы как ауторегуляция, диссоциация (показана нами для С. freundii WA1 и псевдомонад) и воздействие специфическими и неспецифическими продуктами жизнедеятельности членов сообщества (кислоты, аммиак, антибиотические и низиноподобные вещества, Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2001, 2005, 2009).

Неполная деградация AAB в условиях искусственно созданных микробных ассоциаций свидетельствует о неполноте их состава и несоблюдении пропорций содержания партнеров, вероятно, сказывается также отсутствие полноценной агрегации сообщества. Тем не менее, сведения, полученные при конструировании искусственных сообществ, могут быть использованы для корректировки состава микробиоты анаэробных реакторов с целью увеличения

395 эффективности и оптимизации процесса деградации ААВ. Микробные ассоциации из чистых культур микроорганизмов с известными свойствами могут помочь проследить и имитировать вероятные модификации и ответвления основного процесса при изменении условий (например, повышении содержания нитратов и нитритов в сточных водах). Наши исследования показали, что «сборка» искусственных сообществ возможна как из микроорганизмов с аналогичными функциями, но из других источников, так и из выделенных в чистые культуры членов разных консорциумов, выполняющих одинаковый процесс биоразложения ААВ.

Для моделирования реальной ситуации поступления загрязнителя в очистные сооружения были изучены влияние смены субстрата (кросс-акклиматизации) и температурного режима культивирования, а также внесения бинарной смеси ААК на эффективность «работы» анаэробных консорциумов. Выделенные нами активные и стабильные метаногенные сообщества показали способность без адаптационного периода переходить на деструкцию другой ААК, использовать субстраты из их бинарных смесей и выдерживать кратковременные перепады температуры культивирования в диапазоне 20-55°С, т.е они проявляли значительную устойчивость к изменению условий культивирования без потери деградирующей активности.

Наши исследования подтвердили, что ААВ проявляют селективный эффект по отношению к микробным сообществам. Наиболее тесный контакт человека с веществами этого ряда происходит через его нормальную микробиоту при потреблении с едой, питьем, косметикой и лекарствами пищевых азокрасителей, которые давно и активно используются в промышленности и в быту. Анализ собственных данных и описанных в литературе научных исследований показывает необходимость проведения тщательного мониторинга судьбы этих соединений не только в окружающей среде, но и в организме человека и животных. Выяснение самого процесса разрушения азокрасителей в пищеварительной системе млекопитающих необходимо для

396 понимания механизмов пагубного воздействия этих соединений на организм человека. Первым шагом является лабораторное моделирование, которое мы осуществили в своей работе. Показано, что кишечные сообщества млекопитающих разрушают азокрасители по той же схеме, что и анаэробные консорциумы из илов разного происхождения. Детекция ароматических и линейных интермедиатов в кишечных сообществах легко осуществима и позволяет судить о возможных превращениях азокрасителя внутри ЖКТ. Даже в условиях наших опытов, которые не вполне соответствовали реальной ситуации, было установлено, что не только запрещенные к использованию (Chung et al., 1978; Cerniglia et al., 1982; Xu et al., 2007), но и разрешенные пищевые азокрасители подвергаются неполному разложению за времена нахождения в организме, а значит могут вызывать негативные изменения в структуре и функционировании нормальной микробиоты человека и животных. Поскольку отказ от их использования в современной жизни не представляется реальным, то следует прежде всего ограничить контакт с пищевыми азокрасителями чувствительных групп населения (особенно детей) и проводить очистку сточных вод от этих соединений вследствие риска для здоровья.

Таким образом, наши исследования показали, что не только микробные сообщества могут преобразовывать азокрасители и ААК вплоть до полного превращения в биогаз, но и ААВ, в свою очередь, воздействуют на микробные сообщества, изменяют их структуру и функционирование. Еще раз подтвержден огромный потенциал анаэробных микробных сообществ, который должен быть использован в области очистки окружающей среды от токсичных веществ.

Моделирование в лаборатории поведения резидентных микроорганизмов в ответ на «вброс» загрязняющего вещества, а также мониторинг активности внесенных извне, в том числе и искусственно созданных, микробных сообществ поможет прогнозировать их поведение в природных экосистемах

397 как по отношению к ксенобиотику, так и по отношению к естественной микробиоте. Данные по взаимодействию партнеров внутри сообщества помогут осмысленно и более грамотно управлять процессами биодеструкции в нем как при промышленной переработке отходов, так и при естественном самоочищении природных экосистем. Практическое воплощение полученных знаний может выразиться в стимуляции активности уже имеющихся микробных ассоциаций, либо в грамотной интродукции структурно оформленных анаэробных микробных сообществ, заведомо обладающих необходимой активностью в отношении определённой группы ксенобиотиков, в загрязнённые места. При этом микробные консорциумы могут быть как получены из естественных мест обитания и адаптированы к соответствующим веществам, так и "сконструированы" из микроорганизмов, имеющих аналогичные функции.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Котова, Ирина Борисовна, 2013 год

1. Адамович В. В., Дегерменджи А. Г. Статистические закономерности организации маловидовых стационарных сообществ микроорганизмов. Журнал общей биологии, 1985, 46 (4), Р. 527-532.

2. Березин Б.Д., Березин Д.Б. Курс современной органической химии: Учебн. пособие для вузов. М.: Высш. шк., 2001.

3. Брюханов А.Л., Рыбак К.В., Нетрусов А.И. Молекулярная микробиология: учебн. для вузов. М.: Изд-во Моск. Ун-та, 2012.

4. Воробьёв A.B., Руднева O.A., Марченко С.А., Ермоленко З.М., Боровик Р.В. Штамм бактерий Pseudomonas putida ВКПМ В-8811, используемый для очистки почв, грунтовых и поверхностных вод от тринитротолуола in situ. Патент РФ 2292391 от 27.01.2007.

5. Гордон П., Грегори П. Органическая химия красителей. М.: Мир, 1987.

6. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: «Мир», 1991.

7. Емашова H.A., Калюжный C.B. Анаэробная и аэробная биоконверсия азокрасителей и продуктов их распада. Материалы III Моск. межд. Конгресса «Биотехнология. Состояние и перспективы развития», 14-18 марта 2005 г., Москва, 2005а, ч. 2, С.42-43.

8. Емашова H.A., Калюжный C.B. Микробная конверсия азокрасителей. Матер. Междунар. Конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды», 14-16 сентября 2005, Саратов, 20056, С. 18

9. Емашова H.A., Калюжный C.B. Конверсия азокрасителей под действием анаэробных микроорганизмов. Успехи совр. биол., 2005в, 125 (4), С. 379389.

10. Ю.Заварзин Г. А. Трофические связи в метаногенном сообществе. Изв. АН СССР, сер.биол., 1986, 3, С. 341-360.

11. Н.Заварзин Г.А. Лекции по природоведческой микробиологии. М.: Наука, 2003.12.3аварзин Г. А., Колотилова H. Н. Введение в природоведческую микробиологию.Учебное пособие. М.: Книжный дом "Университет", 2001.

12. Зарубина Н.П. Взаимосвязь между амфифильностью кислотных красителей и их поведением в процессах крашения шерстяного волокна. Автореф. дисс. канд. хим. наук, Ивановский государственный химико-технологический университет, Иваново, 2004.

13. Калюжный C.B. Высокоинтенсивные анаэробные биотехнологии очистки промышленных сточных вод. Катализ в промышленности, 2004, 6, С. 4250.

14. Калюжный С.В., Данилович Д. А., Ножевникова А.Н. Анаэробная биологическая очистка сточных вод. Итоги науки и техники. Серия «Биотехнология». М., 1991.

15. Карпов В.В., Белов А.Е. Современное состояние производства и потребления красителей . Рос. Хим. Ж., 2002, XL VI (1), С. 67-71.

16. Коцюрбенко О.Р. Метаногенные микробные сообщества из холодных наземных экосистем. Дисс. докт. биол. наук. Москва, 2005.

17. Коцюрбенко О. Р., Ножевникова А. Н., Заварзин Г. А. Анаэробное разложение органического вещества психрофильными микроорганизмами. Журнал общей биологии, 1992, 53 (2), Р. 159-175.

18. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: пер. с англ. М.: "Мир", 1984.

19. Милько Е.С., Крейер В.Г., Егоров Н.С., Лойко Н.Г., Голод H.A. Развитие и популяционный состав смешанных (S + М) культур Pseudomonas aeruginosa в поздней стационарной фазе роста. Микробиология, 2008, 77 (3), С. 318-323.

20. Милько B.C., Максимович М.О., Лопатина Л.И., Породенко Е.В. Особенности роста диссоциантов углеводородокисляющих родококков и псевдомонад в моно- и смешанных культурах. Прикл. биохим. микробиол., 2010, 46 (5), С. 538-542.

21. Лейбо А.И., Нетрусов А.И., Конрад Р. Исследование влияния концентрации водорода на структуру сообщества гидрогенотрофных метаногенов методом T-RFLP-анализа ампликонов генов 16S рРНК. Микробиология, 2006, 75 (6), Р. 786-791.

22. Литти Ю.В. Анаэробное окисление аммония и метаногенез в системах аэробной очистки сточных вод с иммобилизацией микроорганизмов. Автореферат дисс. канд. биол. наук, ИнМи РАН, Москва, 2012.

23. Лурье Ю.Ю. Аналитическая химия промышленных сточных вод. -М.:Химия, 1984.

24. Наумова Р.П. Микробный метаболизм неприродных соединений. -Казань: Изд-во Казанского ун-та, 1985.

25. Неронова Н. М., Ибрагимова С. И., Иерусалимский Н. Д. Влияние концентрации пропионата на удельную скорость роста Propionibacterium shermanii. Микробиология, 1967, 36 (3), Р. 404-409.

26. Нетрусов А.И., Котова И.Б. Микробиология. Университетский курс: учебник для студ. учреждений высш. проф. образования. Бакалавриат. 4-е изд., перераб. и доп. - М.: Изд. центр «Академия», 2012.

27. Николаев Ю.А. Ауторегуляция стрессового ответа микроорганизмов. Автореф. докт. дисс. Москва, 2011.

28. Остроумов С.А. Введение в биохимическую экологию. М.: Изд-во Московского университета, 1986.

29. Печуркин Н. С. Смешанные проточные культуры микроорганизмов— новый этап в развитии теоретической и прикладной микробиологии. В кн.: Смешанные проточные культуры микроорганизмов. Новосибирск: Наука, 1981, С. 3-25.

30. Практикум по микробиологии: Учеб. для студ. вузов. Под ред.А.И.Нетрусова. М.: Издательский центр «Академия», 2005.

31. СанПин 2.3.2.1293-03. Гигиенические требования по применению пищевых добавок, утвержденные главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 18 апреля 2003 года Г. Г. Онищенко 2003.

32. Сиволодский Е.П., Ровнов Н.В., Петров Л.Н. Механизм специфической хромогенной реакции Klebsiella spp. на питательной среде с 5-аминосалициловой кислотой. Микробиология, 1994, 63 (3), С. 489-494.

33. Скляр В.И. Биокаталитические системы получения водорода и метана: Дисс. канд. хим. наук. Фрунзе: Институт Органической Химии АН Киргизской ССР, 1987.

34. Трухина А.И., Гладченко М.А., Калюжный C.B. Кинетические закономерности анаэробной биодеградации смеси азокрасителей. Катализ в промышленности, 2008, 3, С. 58-64.

35. Фуряева А. В. Экспериментальные исследования динамики смешанных дрожжевых культур в проточных системах. В кн.: Смешанные культуры микроорганизмов. Новосибирск: Наука, 1981, С. 116-144.

36. Шабаров Ю.С. Органическая химия. М.: Химия, 1994, С. 732-753.

37. Щербакова В.А. Анаэробная биодеградация алкилбензолсульфонатов. Автореф. дисс. канд. биол. наук. Пущино, 2000.

38. Экология микроорганизмов: Учеб. для студ. вузов. Под ред.А.И.Нетрусова. М.: Издательский центр «Академия», 2004.

39. Acuner E., Dilek F.B. Treatment of tectilon yellow 2G by Chlorella vulgaris. Proc. Biochem., 2004, 39, P. 623-631.

40. Aftring R.P., Taylor B.F. Aerobic and anaerobic catabolism of phthalic acid by a nitrate-respiring bacterium. Arch. Microbiol., 1981, 130, P. 101-104.

41. Alphenaar P.A., Visser A., Lettinga G. The effect of liquid upflow velocity and hydraulic retention time on granulation in UASB rectors treating wastewater with high sulphate-content. Biores. Technol., 1993, 43, P. 249-258.

42. Altenschmidt U., Oswald B., Fuchs G. Purification and characterization of benzoate-coenzyme A ligase and 2-aminobenzoate-coenzyme A ligase from denitrifying Pseudomonas sp. J. Bacteriol., 1991, 173 (17), P. 5494-5501.

43. An S.-Y., Min S.-K., Cha I.-H., Choi Y.-L., Cho Y.-S., Kim C.-H., Lee Y.-C. Decolorization of triphenylmethane and azo dyes by Citrobacter sp. Biotechnol. Lett., 2002, 24, P. 1037-1040.

44. Annuar M.S.M., Adnan S., Vikineswary S., Chisti Y. Kinetics and energetics of azo day decolorization by Pycnoporus sanguineus. Water Air Soil Pollut, 2009, 202, P. 179-188.

45. Anson M.L. Crystelline carboxypeptidase. Science, 1935, 81, P. 467-470.

46. Arfman H.A., Abraham W.R. Microbial reduction of aromatic carboxylic acids. Z. Naturforsch., 1993, 48 (1), P. 52-57.

47. Asano Y., Sekigawa T., Inukai H., Nakazawa A. Purification and properties of formate dehydrogenase from Moraxella sp. strain C-l. J. Bacteriol., 1988, 170 (7), P. 3189-3193.

48. Auburger G., Winter J. Isolation and physiological characterization of Syntrophus buswelli strain GA from a syntrophic benzoate-degrading, strictly anaerobic coculture. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1995, 44, P. 241-248.

49. Bachman D.M., Dragoon B., John S. Reduction of salicylate to saligenin by Neurosopra. Arch. Biochem. Biophys., 1960, 91 (1), P. 326.

50. Balba M.T., Evans W. Ch. Methanogenic fermentation of the naturally occurring aromatic amino acid by a microbial consortium. Biochem. Soc. Trans., 1980, 8, P. 625-627.

51. Barker H.A. Studies upon the methane fermentation. IV. The isolation and culture of Methanobacterium omelianskii. Antonie Leeuwenhoek, 1940, 6 (2), P. 201-220.

52. Baughman G. L. Fate of dyes in aquatic systems. Part 3: The role of suspended sediments in adsorption and reaction of acid and direct dyes. Dyes and Pigments, 1995, 27 (3), P. 197-210.

53. Bechtold T., Mader C., Mader J. Cathodic decolourization of textile dyebaths: Test with full scale plant. J. App. Electrochem., 2002, 32, P. 943-950.

54. Becker J.G., Berardesco G., Rittmann B.E., Stahl D.A. Effects of Endogenous Substrates on Adaptation of Anaerobic Microbial Communities to 3-Chlorobenzoate. Appl. Env. Microbiol., 2006, 72 (1), P. 449 456.

55. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. New York, Heidelberg, Berlin: Springer-Verlag, 2001, 2005, 2009, V. 1, 2, 3

56. Berry D.F., Francis A.J., Bollag J.M. Microbial metabolism of homocyclic and heterocyclic aromatic compounds under anaerobic conditions. Microbiol. Rev., 1987, 51(1), P. 43-59.

57. Bes-Pia A., Mendoza-Roca J. A. Reuse of wastewater of textile industry after its treatment with a combination of physico-chemical treatment and membrane technologies. Desalination, 2002, 149 (1-3), P. 169-174.

58. Bitton G. Wastewater microbiology. Third edition. Hoboken, New Jersey: John

59. Wiley and Sons, Inc., 2005.

60. Bock M., Kneifel H., Schoberth S.M., Sahm H. Reduction of halogenated derivatives of benzoic acid to the corresponding alcohols by Desulfovibrio vulgaris PY1. Acta Biotechnol., 2000, 20 (3/4), P. 189-201.

61. Bolduc L., Anderson W.A. Enhancement of the biodegradability of model wastewater containing recalcitrant or inhibitory chemical compounds by photocatalytic pre-oxidation. Biodegradation, 1997, 8 (4), P. 237-249.

62. Boopathy R., Kulpa C. F., Wilson M. Metabolism of 2,4,6-trinitrotoluen (TNT) by Desulfovibrio sp. (B strain). Appl. Microbiol. Biotechnol., 1993, 39, P. 270275.

63. Bossert I. D., Young L. Y. Anaerobic oxidation of p-cresol by a denitrifying bacterium. Appl. Env. Microbiol., 1986, 52 (5), P. 1117-1122.

64. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 1976, 72, P. 248-254.

65. Bras R., Ferra M.I.A., Pinheiro H.M., Goncalves I.C. Batch tests for assessing decolourisation of azo dyes by methanogenic and mixed cultures. J. Biotechnol., 2001,89, P. 155-162.

66. Bryant M.P., Wolin E.A., Wolin M.J., Wolfe R.S. Methanobacillus omelianskii, a symbiotic association of two species of bacteria. Arch. Microbiol., 1967, 59 (1), P. 20-31.

67. Buan A. C. J., Lynn A., Decena-Soliven A., Cao E. P. Congo Red Decolorizing Activity Under Microcosm and Decolorization of other Dyes by Congo Red Decolorizing Bacteria. Philippine J. Science, 2009, 138 (2), P. 125-132.

68. Bumpus J.A. Microbial degradation of azo dyes. Prog. Ind. Microbiol., 1995, 32, P. 157-176.

69. Calli B., Mertoglu B., Roest K., Inane B. Comparison of longterm performances and final microbial compositions of anaerobic reactors treating landfill leachate. Biores. Technol., 2006, 97, P. 641-647.

70. Calli B., Mertoglu B., Tas N., Inane B., Yenigun O., Oztyrk I. Investigation of variations in microbial diversity in anaerobic reactors treating landfill leachate. Water Sci. Technol., 2003, 48 (4), P. 105-112.

71. Cantor K.P., Blair A., Everett G., VanLier S., Burmeister L., Dick F.R., Gibson R.W., Schuman L. Hair dye use and risk of leukemia and lymphoma. Am J Public Health., 1988, 78 (5), P. 570-571.

72. Carmona M., Zamarro M.T., Blazquez B., Durante-Rodriguez, Juarez J.F., Valderrama J.A., Barragan M.J.L. Garcia J.L., Diaz E. Anaerobic Catabolism of aromatic compounds: a genetic and genomic view. Microbiol. Molbiol. Rev., 2009, 73 (1), P. 71-133.

73. Cerniglia C.E., Freeman J.P., Franklin W., Pack L.D. Metabolism of benzidine and benzidine-congener based dyes by human, monkey and rat intestinal bacteria. Biochem Biophys Res Commun., 1982, 107 (4), P. 1224-1229.

74. Chakraborty S., Purkait M. K. Nanofiltration of textile plant effluent for color removal and reduction in COD. Separation and Purification Technol., 2003, 31 (2), P. 141-151.

75. Chang J.-S., Chou C., Lin Y.-C., Lin P.-J., Ho J.-Y., Hu T.L. Kinetic characteristics of bacterial azo-dye decolorization by Pseudomonas luteola. Water Res., 2001, 35 (12), P. 2841-2850.

76. Chen K.C., Huang W.T., Wu J.Y., Houng J.Y. Microbial decolorization of azo dyes by Proteus mirabilis. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 1999, 23, P. 686-690.

77. Chen H., Xu H., Heinze T. M., Cerniglia C. E. Decolorization of water and oil soluble azo dyes by Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus fermentum. J Ind Microbiol Biotechnol., 2009, 36, P. 1459-1466.

78. Chen S.,Dong X. Proteiniphilum acetatigenes gen. nov., sp. nov., from a UASB reactor treating brewery wastewater. Int J Syst Evol Microbiol., 2005, 55, P. 2257-2261.

79. Chen Sh.-J., Wang Q., Han J.-R., Wang Y., Li Z.-W. Comparison of DNA extraction methods for the PCR-single-strand-conformation polymorphism analysis of kefir. World J. Microbiol. Biotechnol., 2011, 27, P. 193-196.

80. Chin K. J., Lukow T., Conrad R. Effect of temperature on structure ahd function of methanogenic archael community in an anoxic rice field soil. Appl. Env. Microbiol., 1999, 65 (6), P. 2341-2349.

81. Chiu P. C., Lee M. 2-Bromoethanesulfonate affects bacteria in a trichloroethene-dechlorinating culture. Appl. Env. Microbiol., 2001, 67, P. 2371-2374.

82. Chung K.T., Fulk G.E., Egan M. Reduction of azo dyes by intestinal anaerobes. Appl Environ Microbiol., 1978, 35 (3), P. 558-566.

83. Conrad R., Bak F., Mayer H. P., Schutz H. Hydrogen turnover by psychrotrophic homoacetogenic and mesophilic bacteria in anoxic paddy soil and lake sediment. FEMS Letters. Microb. Ecology, 1989, 62, P. 285-294.

84. Conrad R., Phelps T. J., Zeikus J. G. Gas metabolism evidence in support of the juxtaposition of hydrogen-producing and methanogenic bacteria in sewage sludge and lake sediments. Appl. Environ.Microbiol., 1985, 50, P. 595-601.

85. Dafale N., Rao N. N., Meshram S. U., Wate S. R. Decolorization of azo dyes and simulated dye bath wastewater using acclimatized microbial consortium -Biostimulation and halotolerance. Biores. Technol., 2008, 99, P. 2552-2558.

86. Dagley S. Catabolism of aromatic compounds by microorganisms. Adv. Microbiol. Physiol., 1971, 6, P. 1-76.

87. Dagley S. Biochemistry of aromatic hydrocarbon degradation in pseudomonads. In: The Bacteria Vol. 10. J.R. Sokatch L.N. Ornston, Eds., 1986, New York : Academic Press., C. 527-555.

88. Dalton H. M., Poulsen L. K., Halasz P., Angles M. L., Goodman A. E., Marshall K. C. Substratum-induced morphological changes in a marine bacterium and their relevance to biofilm structure. J. Bacterid., 1994, 176, P. 6900-6906.

89. Davey M.E., O'Toole G. A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 2000, 64, P. 847-867.

90. Deriell E., Comeau J., Villemur R. Two-luquid-phase bioreactors for enchanced degradation of hydrophobic/toxic compounds. Biodégradation, 1999, 10, P. 219-233.

91. Diaz E. Bacterial degradation of aromatic pollutants: a paradigm of metabolic versatility. Int. Microbiology, 2004, 7, P. 173-180.

92. Diaz E., Amils R., Sanz J. L. Molecular ecology of anaerobic granular sludge grown at different conditions. Water Sci. Technol., 2003, 48 (6), P. 5764.

93. Diaz E.E., Stams A. J. M., Amils R., Sanz J. L. Phenotypic properties and microbial diversity of methanogenic granules from a full-scale Upflow Anaerobic Sludge Bed Reactor treating brewery wastewater.Appl. Env. Microbiol., 2006, 72 (7), P. 4942-4949.

94. Doetsch R.N. Determinative methods of light microscopy. In: Manual of methods for general bacteriology. Eds. Gerhardt P. et al., Washington, D.C.: American Society of Microbiology, 1981, P. 21-33.

95. Dolfing J., Criffoen A., Neerwen A. R. W. Chemical and bacteriological composition of granular methanogenic sludge. Can. J. Microbiol., 1985, 31 (8), P. 744-750.

96. Donlon B.A., Razo-Flores E., Field J.A., Lettinga G. Toxicity of N-substituted aromatics to acetoclastic methanogenic activity in granular sludge. Appl. Environ. Microbiol., 1995, 61 (11), P. 3889-3893.

97. Dôrner E., Boll M. Properties of 2-Oxoglutarate:Ferredoxin Oxidoreductase from Thauera aromatica and Its Role in Enzymatic Reduction of the Aromatic Ring. J Bacterid., 2002, 184 (14), P. 3975-3983.

98. Dubin P., Wright K. L. Reduction of azo food dyes in cultures of Proteus vulgaris. Xenobiotica, 1975, 5 (9), P. 563-571.

99. Dutton P.L., Evans W.C. The metabolism of aromatic compounds by Rhodopseudomonas palustris. A new, reductive method of aromatic ring metabolism. Biochem J., 1969, 113, (3), P. 525-536.

100. Edwards E.A., Grbic-Galic D. Anaerobic degradation of toluene and o-xylene by a methanogenic consortium. Appl. Env. Microbiol., 1994, 60, P. 313322.

101. Ekici P., Leupold G., Parlar H. Degradability of selected azo dye metabolites in activated sludge systems. Chemosphere, 2001, 44 (4), P. 721-728.

102. El-Mamouni R., Leduc R., Guiot S.R. Influence of synthetic and natural polymers on the anaerobic granulation process. Water Sci.Technol., 1998, 38, P. 341-347.

103. Engbersen J.F.J., de Groot JE. Bioorganische chemie. Wageningen: Pudoc, 1988, P. 121-129.

104. Elshahed M.S., Mclnerney M.J. Benzoate fermentation by the anaerobic bacterium Syntrophus aciditrophicus in the absence of hydrogen-using microorganisms. Appl. Environ. Microbiol., 2001, 67 (12), P. 5520-5525.

105. Elvers K.T., Lappin-Scott H.M. Biofilms and biofouling. Encyclopedia of Microbiology. Second ed. Vol. 1. Academic Press. Elsevier, 2000, P. 478-485.

106. Fang H. H. P. Microbial distribution in UASB granules and its resulting effects. Water Sci.Technol., 2000, 42 (12), P. 201-208.

107. Fang H. H. P., Chui H. K., Li Y.Y. Microbial structure and activity of UASB granules treating different wastewaters. Water Sci. Technol., 1994, 30, P. 87-96.

108. Fang H. H. P., Chui H. K., Li Y.Y. Effect of degradation kinetics on the microstructure of anaerobic biogranules. Water Sci. Technol., 1995, 32, P. 165172.

109. Fang Z.M., Li T.L., Zhou P., Fang W., Hong Y.Z., Zhang X.C., Peng H., Xiao Y.Z. A new marine bacterial laccase with chloride-enhancing, alkaline-dependent activity and dye decolorization ability. Biores. Technol., 2012, 111, P.36-44

110. Fawcett J.K., Scott J.E. A rapid and precise method for the determination of urea. J. Clin. Path., 1960, 13, P. 156-159.

111. Ferrera I., Massana R., Casamayor E. O., Balague V., Sanchez O., Pedros-Alio C., Mas J. High-diversity biofilm for the oxidation of sulfide-containing effluents. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2004, 64, P. 726-734.

112. Fey A., Conrad R. Effect of temperature on carbon and electron flow and on the archael community in methanogenic rice field soil. Appl. Env. Microbiol., 2000, 66 (11), P. 4790-4797.

113. Fraisse L., Simon H., Observations on the reduction of non-activated carboxylates by Clostridium formicoaceticum with carbon monoocide or formate and the influence of various viologens. Arch. Microbiol., 1988, 150 (3), P. 381-386.

114. Francese A., Cordoba P., Duran J., Sineriz F. High velocity and organic loading rate improve granulation in UASB reactors. World J. Microbiol. Biotechnol., 1998, 14, P. 337-341.

115. Franklin R.B., Garland J.Y., Bolster C.H., Mills A.L. Impact of dilution on microbial community structure and functional potential: comparison of numerical simulations and batch culture experiments. Appl. Env. Microbiol., 2001,67 (2), P. 702-712.

116. Fredrickson A. G. Behavior of mixed culture of microorganisms. Ann. Rev. Microbiol., 1977, 31, P. 63-87.

117. Fu Y., Viraragharan T. Fungal decolorization of dye wastewaters: a review. Biores. Tecnol., 2001, 79, P. 251-262.

118. Fuchedzhieva N., Karakashev D., Angelidaki I. Anaerobic biodegradation of fluoranthene under methanogenic conditions in presence of surface-active compounds. J. Hazard. Mat., 2008, 153 (1-2), P. 123-127.

119. Fuchs G. Anaerobic metabolism of aromatic compounds. Ann. N. Y. Acad. Sci., 2008, 1125 (1),P. 82-99.

120. Gilcrease P.C., Murphy V.C. Bioconversion of 2,4-diamino-6-nitrotoluene to a novel metabolite under anoxic and aerobic conditions. Appl. Environ. Microbiol., 1995, 61, P. 4209-4214.

121. Gonzalez-Gil G., Lens P. N. L., Versprille A. I., Lettinga G. Cluster structure of anaerobic aggregates of an expanded granular sludge bed reactor. Appl. Env. Microbiol., 2001, 67 (8), P. 3683-3692.

122. Gottlieb A., Shaw C., Smith A., Wheatley A., Forsythe S. The toxicity of textile reactive azo dyes after hydrolysis and decolourisation. J. Biotechnol., 2003, 101, P.49-56.

123. Grimmer G., Dettbarn G., Seidel A., Jacob J. Detection of carcinogenic aromatic amines in the urine of non-smokers. Sci. Tot. Environ., 2000, 247, P. 81-90.

124. Grotenhuis J. T. C., Smit M., Plugge C. M., Zehnder A. J. B. Hydrophobities and electrophoretic mobilities of anaerobic bacterial isolates from methanogenic granular sludge. Appl. Env. Microbiol., 1992, 58, P. 1054-1056.

125. Guang-fei L., Ji-ti Z., Jing W., Zhi-yong S., Yuan-yuan Q. Bacterial decolorization of azo dyes by Rhodopseudomonas palustris. World J. Microbiol. Biotechnol., 2006, 22, P. 1069-1074.

126. Guiot S.R., Pauss A., Costerton J.W. A structured model of the anaerobic granules consortium. Water Sci. Technol., 1992, 25, P. 1-10.

127. Hagglbom M.M., Rivera M.D., Young L.Y. Influence of alternative electron acceptors on the anaerobic biodegradability of chlorinated phenols and benzoic acids. Appl. Env. Microbiol., 1993, 59, P. 1162-1167.

128. Hagihara B., Matsubara H., Nakai M., Okunuki K. Crystalline bacterial proteinase. I. Preparation of crystalline proteinase of Bacillus subtilis. J. Biochem., 1958, 45,185-194.

129. Harayama S., Kok M., Neidle E.L. Functional and evolutionary relationships among diverse oxygenases. Annu. Rev. Microbiol., 1992, 446, P. 565-601.

130. Harwood C. S., Parales R.E. The (3-ketoadipate pathway and the biology of self identity. Annu. Rev. Microbiol., 1996, 50, P. 553-590.

131. He Z., Wiegel J. Purification and characterization of an oxygen-sensitive reversible 4-hydroxybenzoate decarboxylase from Clostridium hydroxybenzoicum. Eur. J. Biochem., 1995, 229 (1), P. 77-82.

132. He Z., Wiegel J. Purification and characterization of an oxygen-sensitive, reversible 3,4-dihydroxybenzoate decarboxylase from Clostridium hydroxybenzoicum. J. Bacterid., 1996, 178 (9), P. 3539-3543.

133. Head I.M. Bioremediation: towards a credible technology. Microbiology, 1998, 144, P. 599-608.

134. Heider J., Fuchs G. Anaerobic metabolism of aromatic compounds. Eur. J. Biochem., 1997, 243, P. 577-596.

135. Heider J., Fuchs G. Microbial anaerobic aromatic metabolism. Anaerobe, 1997a, 3 (1), P. 1-22.

136. Hildenbrand S., Schmahl F.W., Wodarz R., Kimmel R., Dartsch P.C. Azo dyes and carcinogenic aromatic amines in cell cultures. Int. Arch. Occup. Environ. Health., 1999, 72 (3), P. M52-M56.

137. Hirsh R. Microcolony formation and consortia. In: Microbial adhesion and aggregation. Marshall KC, ed. Berlin: Springer, 1984, P. 373-93.

138. Hong Y., Xu M., Guo J.,.Xu Z, Chen X., Sun G. Respiration and Growth of Shewanella decolorationis S12 with an Azo Compound as the Sole Electron Acceptor. Appl. Env.Microbiology, 2007, 73 (1), P. 64-72.

139. Hori T., Haruta S., Ueno Y., Ishii M., Igarashi Y. Dynamic transition of a methanogenic population in response to the concentration of volatile fatty acids in a thermophilic anaerobic digester. Appl. Env. Microbiol., 2006, 72 (2), P. 1623-1630.

140. Hu T.-L. Color removal ability of a streptomycin resistant decolorizing strain Rhodococcus erythropolis (ATCC 4277.1). Water Sci. Technol., 2003, 47 (10), P. 169-174.

141. Ishii S., Kosaka T., Hori K., Hotta Y., Watanabe K. Coaggregation facilitates interspecies hydrogen transfer between Pelotomaculum thermopropionicum and Methanothermobacter thermautotrophicus. Appl.Environ. Microbiol., 2005, 71, P. 7838- 7845.

142. Isik M., Sponza D. T. A batch kinetic study on decolorization and inhibition of Reactive Blak 5 and direct Brown 2 in an anaerobic mixed culture. Chemosphere, 2004, 55, P. 119-128.

143. Ito T., Okabe S., Satoh H., Watanabe Y. Successional development of sulfate-reducing bacterial populations and their activities in a wastewater biofilm growing under microaerophilic conditions. Appl. Environ. Microbiol., 2002, 68, P. 1392-1402.

144. Jackson B. E., Mclnerney M. J. Anaerobic microbial metabolism can proceed close to thermodynamic limits. Nature, 2002, 415, P. 454-456.

145. James G. A., Korber D. R., Costerton J. W. Digital image analysis of growth and starvation responces of a surface-colonizing Acinetobacter sp. J. Bacterid., 1995, 177, P. 907-915.

146. Jensen J., Cornett C., Olsen C.E., Tjornelund J., Hansen S.H. Identification of major degradation products of 5-aminosalicylic acid formed in aqueous solutions and in pharmaceuticals. Int. J. Pharm., 1992, 88 (2), P. 177-187.

147. Jezo I., Zemek J. Enzymatische reduktion einiger aromatischer Carboxysauren. Chem. Papers, 1986, 40, P. 279-281.

148. Junnarkar N., Srinivas Murty D., S. Bhatt N., Madamwar D. Decolorization of diazo dye Direct Red 81 by a novel bacterial consortium. World J. Microbiol. Biotechnol., 2006, 22, P. 163-168

149. Kahng H.-Y., Kukor J. J., Oh K.-H. Characterization of strain HY99, a novel microorganism capable of aerobic and anaerobic degradation of aniline. FEMS Microbiol. Lett., 2000, 190 (2), P. 215-221.

150. Kalogo Y., Seka A.M., Verstraete W. Enhancing the start-up of a UASB-reactor treating domestic wastewater by adding a water extract of Moringa oleifera seeds. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2001, 55, P. 651-664.

151. Kalyuzhnyi S., Sklyar V. Biomineralization of azo dyes and their breakdown products in anaerobic-aerobic hybrid and UASB reactors. Water Sci. Technol., 2000, 41 (12), P. 23-30.

152. Kalyuzhnyi S.V., Sclyar V.I., Mosolova T.P., Kucherenko I.A., Russkova I.A., Degtyarova N.N. Methanogenic biodégradation of aromatic amines.Water Sci. Technol., 2000, 42, (5-6), P. 363-370.

153. S.Kalyuzhnyi, N.Yemashova, V.Fedorovich. Kinetics of anaerobic biodecolourisation of azo dyes. In: Proceedings of VIII Latin American Workshop and Symposium on Anaerobic Digestion, 2-5 October 2005, Punta del Este, Uruguay, 2005, P. 109-114.

154. Kalyuzhnyi S., Yemashova N., Fedorovich V. Kinetics of anaerobic biodecolourisation of azo dyes. Wat. Sci. Technol., 2006, v.54 (2), p. 73-79.

155. Kanazawa H., Onami T. Mechanism of the degradation of Orange G by sodium hypochlorite. Color. Technol., 2001, 117, P. 323-327.

156. Kasper H.F., Wuhrmann K. Kinetic parameters and relative turnover of some important catabolic reactions in digesting sludge. Applied and Environmental Microbiology, 1978, 36 (1), P. 1-7.

157. Kato N., Konishi H., Uda K., Shimao M., Sakazawa C. Microbial reduction of benzoate to benzyl alcohol. Agric. Biol. Chem., 1988, 52 (8), P. 1885-1886.

158. Kengen S.W.M., Stams A.J.M., de Vos W.M. Sugar metabolism of hyperthermophiles. FEMS Microbiol. Rev., 1996, 18 (1), P. 5-63.

159. Khanna P., Rajkumar B., Jothikumar N. Anoxygenic degradation of aromatic substances by Rhodopseudomonas palustris. Curr. Microbiol., 1992, 25 (1), P.63-67.

160. Khehra M.S., Saini H.S., Sharma D.K., Chadha B.S., Chimni S.S. Comparative studies on potential of consortium and constituent pure bacterial isolates to decolorize azo dyes. Water Res., 2005, 39 (20), P. 5135-5141.

161. Kleinsteuber S., Schleinitz K.M., Breitfeld J., Harms H., Richnow H.H., Vogt C. Molecular characterization of bacterial communities mineralizing benzene under sulfate-reducing conditions. FEMS Microbiol.Ecol., 2008, 66 (1), P. 143-157.

162. Knackmuss H.-J. Basic knowledge and perspective of bioelimination of xenobiotic compounds. J. Biotechnol., 1996, 51, P. 287-295.

163. Koch J., Fuchs G. Enzymatic reduction of benzoyl-CoA to alicyclic compounds, a key reaction in anaerobic aromatic metabolism. Eur. J. Biochem., 1992, 205, (1), P. 195-202.

164. Kong Y. H., Beer M., Rees G. N., Seviour R. J. Functional analysis of microbial communities in aerobic-anaerobic sequencing batch reactors fed with different phosphorus/carbon (P/C) ratios. Microbiology, 2002, 148, P. 22992307.

165. Kurade M.B., Waghmode T.R., Govindwar S.P. Prefential biodégradation of structurally dissimilar dyes from a mixture by Brevibacillus laterosporus. J Hazer Mater., 2011, 192 (3), P. 1746-1755.

166. Langkau B., Ghisla S., Buder R., Fuchs G. 2-Aminobenzoyl-CoA monooxygenase/reductase, a novel type of flavoenzyme. Identification of the reaction products. Eur. J. Biochem., 1990, 191, P. 365-371.

167. La Para T. M., Nakatsu C. H., Pantea L., Alleman J. E. Phylogenetic analysis of bacterial communities in mesophilic and thermophilic bioreactors treating pharmaceutical wastewater. Appl. Environ. Microbiol., 2000, 66, P. 3951-3959.

168. Leadbetter E.R. Soil dynamics and organic matter, decomposition. Encyclopedia of Microbiology. Second ed. Vol. 4. Academic Press. Elsevier, 2000, P. 316-335.

169. Ledakowicz S., Soleska M., Zylla R. Biodégradation, decolorisation and detoxification of textile wastewater enhanced by advanced oxidation processes. J. Biotechnol., 2001, 89, P. 175-184.

170. Lens P. N., de Beer D., Houwen F. P. Heterogeneous distribution of microbial activity in methanogenic aggregates: pH and glucose microprofiles. Appl. Env. Microbiol., 1993, 59, P. 3803-3815.

171. Lettinga G., van Velsen A.F.M., Hobma S.W., de Zeeuw W., Klapwijk A. Use of the UASB reactor concept for biological waste water treatment especially for anaerobic treatment. Biotechnol.Bioeng., 1980, 22, P. 699-734.

172. Liu W. T., Chan O. C., Fang H. H. P. Microbial community dynamics during start-up of acidogenic anaerobic reactors. Water Res., 2002, 36, P. 32033210.

173. Liu Y., Xu H.L., Yang S.F., Tay J.H. Mechanisms and models for anaerobic granulation in upflow anaerobic sludge blanket reactor. Water Res., 2003, 37, P. 661-673.

174. Lochmeyer C., Koch J., Fuchs G. Anaerobic degradaton of 2-aminobenzoic acid (anthranilic acid) via benzoyl-coenzyme A (CoA) and cyclohex-1-enecarboxyl-CoA in a denitrifying bacterium. J. Bacteriol., 1992, 174 (11), P. 3621-3628.

175. Lourenco N.D., Novais J.M., Pinheiro H.M. Effect of some operational parameters on textile dye biodégradation in sequential batch reactor. J. Biotechnol., 2001, 89, P. 163-174.

176. Luengo J.M., Garcia J.L., Olivera E.R. The phenylacetyl-CoA catabolon: a complex catabolic unit with broad biotechnological applications. Mol. Microbiol., 2001, 39, P. 1434-1442.

177. MacLeod F. A., Guiot S. R., Costerton J. W. Layered structure of bacterial aggregates produced in UASB- and filter reactor. Appl. Env. Microbiol., 1990, 56, P. 1598-1607.

178. Malic A., Sakamoto M., Hanazaki S., Osawa M., Suzuki T., Tochigi M., Kakii K. Coaggregation among nonflocculating bacteria isolated from activated sludge. Appl. Env. Microbiol., 2003, 69, P. 6056-6063.

179. Marshall K.C. Microbial ecology: whither goes thou. In: Trends in microbial ecology. Guerrerro R, Pedros-Alio C (eds.). Barcelona: Spanish Society for Microbiology, 1993, P. 5-8.

180. Martin W., Muller M. The hydrogen hypothesis for the first eukaryote. Nature, 1998, 392, P. 37-41.

181. Massol-Deya A. A., Whallon J., Hickey R. F., Tiedje J. M. Channel structures in aerobic biofilms of fixed-films reactors treating contaminated groundwater. Appl. Env. Microbiol., 1995, 61, P. 769-777.

182. Matsushita T., Sakuma S., Nakamuro K., Matsui Yo. The variation of the mutagenicity of CNP during anaerobic biodégradation. Water Res., 2001, 35 (11), P. 2589-2594.

183. Mazumder R., Logan J.R., Mikell Jr. A.T., Hooper S.W. Characteristics and purification of an oxygen insensitive azoreductase from Caulobacter subvibrioides strain C7-D. J. Indl. Microbiol. Biotechnol., 1999, 23, P. 476-483.

184. McLeod M.P., Eltis L.D. Genomic insights into the aerobic pathways for degradation of organic pollutants. In E.Diaz (ed.), Microbial degradation: genomics and molecular biology. Caister Academic Press: Norfolk, United Kingdom, 2008. P. 1-23.

185. McMullan G., Meehan C., Conneely A., Kirby N., Robinson T., Nigam P., Banat I.M., Marchant R. Microbial decolourisation and degradation of textile dyes. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2001, 56, P. 81-87.

186. McNaughton S. J. Stability and diversity of ecological communities. Nature, 1978, 274, P. 251-253.

187. Mohamed M.E., Ismail W.,Heider J., Fuchs G. Aerobic metabolism of phenylacetic acids in Azoarcus evansii. Arch. Microbiol., 2002, 178, P. 180— 192.

188. Mohan S.V., Rao N.C., Srinivas S., Prasad K.K., Karthikeyan J. Treatment of simulated Reactive Yellow 22 (azo) dye effluents using Spirogyra species. Waste Manag., 2002, 22, P. 575-82.

189. Moller S., Korber D. R., Wolfaard G. M., Molin S., Caldwell D. E. Impact of nutrient composition on a degradative biofilm community. Appl. Env. Microbiol., 1997, 63 (6), P. 2432-2438.

190. Morales A., Garland J. L., Lim D. V. Survival of potentially pathogenic human-associated bacteria in the rhizosphere of hydroponically grown wheat. FEMS Microbiol. Ecol., 1996, 20, P. 155-162.

191. Mountfort D. O., Brulla W. J., Krumholz L. R., Bryant M. P. Syntrophus buswelli gen. Nov., sp. nov.: a benzoate catabolizer from methanogenic ecosystems. Int. J. Syst. Bacteriol., 1984, 34, P. 216-217.

192. Mukund S., Adams M.W.W. The novel tungsten-iron-sulfur protein of the hyperthermophilic archaebacterium, Pyrococcus furiosus, is an aldehyde ferredoxin oxidoreuctase. J. Biol. Chem., 1991, 266 (18), P.14208-14216.

193. Muller J.A., Schink B. Initial steps in the fermentation of 3-hydroxybenzoate by Sporotomaculum hydroxybenzoicum. Arch. Microbiol., 2000, 173 (3), P. 288295.

194. Nachiyar C.V., Rajkumar G.S. Degradation of tannery and textile dye, Navitan Fast Blue S5R by Pseudomonas aeruginosa. World J. Microbiol. Biotechnol., 2003, 19, P. 609-614.

195. Nakano M.M., Dailly Y.P., Zuber P., Clark D.P. Characterization of anaerobic fermentative growth of Bacillus subtilis : identification of fermentation end products and genes required for growth. J. Bacteriol., 1997, 179 (21), P. 6749-6755.

196. Nam S., Renganathan V. Non-enzymatic reduction of azo dyes by NADH. Chemosphere., 2000, 40, P. 351-357.

197. Nay H., Snozzi M., Zehnder A. J. B. Fate and behavior of organic compounds in an artificial saturated subsoil under controlled redox conditions: The sequential soil column system. Biodégradation, 1999, 21 (1), P. 75 82.

198. Nealson K. H., Inagaki F., Takai K. Hydrogen-driven subsurface lithoautotrophic microbial ecosystems (SLiMEs): do they exist and why should we care? Trends Microbiol., 2005, 13, P. 405^110.

199. Noguera D.R., Freedman D.L. Reduction and acetilation of 2,4-dinitrotoluene by a Pseudomonas aeruginosa strain. Appl. Environ. Microbiol., 1996, 62, P. 2257-2263.

200. Nortemann B., Baumgarten J., Rast H.G., Knackmuss, H.-J. Bacterial communities degrading amino and naphthalene-2-Sulfonates. Appl. Environ. Microbiol., 1986, 52, P. 1195-1202.

201. Noyola A., Merengo G. Granulation production from raw waste activated sludge. Water Sci. Technol., 1994, 30, P. 339-346.

202. Nozawa T., Maruyama Y. Denitrification by a soil bacterium with phthalate and other aromatic compounds as substrates. J. Bacteriol., 1988, 170 (8), P. 2501-2505.

203. Nozhevnikova A. N., Holliger C., Ammann A., Zehnder A. G. B. Methanogenesis in sediments from deep lakes at different temperatures (2-70°C). Water Sci. Technol., 1997, 36 (6-7), P. 57-64.

204. O'Connor O.W., Young L.Y. Effect of nitrogen limitation on the biodegradability and toxicity of nitro- and aminophenol isomers to methanogenesis. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 1993, 25 (2), P. 285-291.

205. O'Connor O.W., Young L.Y. Effects of six different functional groups and their position on the bacterial metabolism of monosubstituted phenols under anaerobic conditions. Environ. Sci. Technol., 1996, 30 (5), P. 1419-1428.

206. O'Flaherty V., Lens P.N., de Beer D., Colleran E. Effect of feed composition and upflow velocity on aggregate characteristics in anaerobic upflow reactors. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1997, 47, P. 102-107.

207. O'Neill C., Lopez A., Esteves S., Hawkes F.R., Hawkes D.L., Wilcox S.J. Azo-dye degradation in anaerobic-aerobic treatment ststem operatiog on simulated textile effluent. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2000, 53, P. 249-254.

208. Pains S.S., Loewenthal R.E., Dold P.L., Marais G.R. Hypothesis for pelletisation in upflow anaerobic sludge blanket reactor. Water SA, 1987, 13, P. 69-80.

209. Pandey A., Singh P., Iyengar L. Bacterial decolorization and degradation of azo dyes. Rev. Int. Biodeterioration & Biodégradation, 2007, 59, P. 73-84.

210. Panswad T., Luangdilok W. Decolorization of reactive dyes with different molecular structures under different environmental conditions. Water Res., 2000, 34(17), P. 4177-4184.

211. Parikh A. Madam war D. Textile dye decolorisation using cyanobacteria. Biotechnol. Lett., 2005, 27 (5), P. 323-326.

212. Parshina S. N., Kleerebezem R., van Kempen E., Nozhevnikova A. N., Lettinga G., Stams A. J. M. Benzaldehyde conversion by two anaerobic bacteria isolated from an upflow anaerobic sludge bed reactor. Proc. Biochem., 2000, 36, P. 423-429.

213. Perez-Diaz I.M., McFeeters R.F. Modification of azo dyes by lactic acid bacteria. J. Appl. Microbiol., 2009, 107, P. 584-589.

214. Perlinger J., Angst W., Schwarzenbach R.P. Kinetics of reduction of hexachloroethane by juglone in solutions containing hydrogen sulfide. Environ. Sci. Technol., 1996, 30, P. 3408-3417.

215. Picioreanu C., van Loosdrecht M. C. M., Heijnen J. J. Mathematical modeling of biofilm structure with a hybrid differential-discrete cellular automaton approach. Biotechnol. Bioeng., 1998, 58, P. 101-116.

216. Picioreanu C., van Loosdrecht M. C. M., Heijnen J. J. Discrete- differential modeling of biofilm structure. Water Sci. Technol., 1999, 39, P. 115-122.

217. Pinheiro H.M., Touraud E., Thomas O. Aromatic amins from azo dye reduction: status review with emphasis on direct UV spectrophotometricdetection in textile industry wastewarers. Dyes and Pigments, 2004, 61, P. 121139.

218. Plugge C.M., Balk M., Stams A.J.M. Desulfotomaculum thermobenzoicum subsp. thermosyntrophicum subsp. nov., a thermophilic, syntrophic, propionate-oxidizing, spore-forming bacterium. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2002, 52 (2), P. 391-399.

219. Plumb J.J., Bell J., Stuckey D.C. Microbial populations associated with treatment of an industrial dye effluent in an anaerobic baffled reactor. Appl. Environ. Microbiol., 2001, 67, P. 3226-3235.

220. Raber T., Gorontzy T., Kleinschmidt M., Steinbach K., Blotevogel K.H. Anaerobic degradation and transformation of p-toluidine by the sulfate-reducing bacterium Desulfobacula toluolica. Curr. Microbiol., 1998, 37, P. 172-176.

221. Rafii F., Cerniglia C.E. Comparison of the azoreductase and nitroreductase from Clostririum perfringens. Appl. Environ. Microbiol., 1993, 59 (6), P. 17311734.

222. Rafii F., Cerniglia C. E. Reduction of azo dyes and nitroaromatic compounds by bacterial enzymes from the human intestinal tract. Environ Health Perspect., 1995, 103 (Suppl 5), P. 17-19.

223. Rafii F., Franklin W., Cerniglia C.E. Azoreductase activity of anaerobic bacteria isolated from human intestinal microflora. Appl. Environ. Microbiol., 1990, 56, P. 2146-2151.

224. Rafii F., Moore J.D., Ruseler-van Embden J.G.H., Cerniglia C.E. Bacterial reduction of azo dyes used in foods, drugs and cosmetics. Microecol. Ther., 1995, 25, P. 147-156.

225. Rajaguru P., Kalaiselvi K., Palanivel M., Subburam V. Biodégradation of azo dyes in sequential anaerobic-aerobic system. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2000, 54, P. 268-273.

226. Rajendran R., Karthik Sundaram S., Prabhavathi P., Sridevi B.V., Gopi V. Comparative analysis of bioremediation potential of adapted and non-adapted fungi on azo dye containing textile effluent. Pak. J. Biol. Sci., 2011, 14 (11), P. 610-618.

227. Ramalho P.A., Cardoso M.H., Cavaco-Paulo A., Ramalho T. Characterization of azo reduction activity in novel ascomycete yeast strain. Appl. Environ. Microbiol., 2004, 70 (4), P. 2279-2288.

228. Raman T.S., Shanmugasundaram E.R.B. Metabolism of some aromatic acids by Aspergillus niger. J. Bacteriol., 1962, 84 (9), P. 1340-1341.

229. Rao R.A., Ajmal M., Ahmad M., Siddigui B.A. Adsorption behaviour of some aromatic amines on pyrolusite and activated carbon and recovery of beta napthylamine from water sample. Environ. Monit. Assess., 2001, 68 (3), P. 235247.

230. Rau, J., Stolz, A. Oxygen-insensitive nitroreductases NfsA and NfsB of Escherichia coli function under anaerobic conditions as lawsone-dependent azo reductases. Appl. Environ. Microbiol., 2003, 69, P. 3448-3455.

231. Razo-Flores E. Biotransformation and Biodégradation of N-Substituted Aromatics in Methanogenic Granular Sludge. Ph.D. Thesis. Wageningen University. Wageningen, The Netherlands, 1997.

232. Razo-Flores E., Donlon B., Lettinga G., Field J. A. Biotransformation and biodégradation of N-substituted aromatics in methanogenic granular sludge. FEMS Microbiol. Rev., 1997, 20, P. 525-538.

233. Razo-Flores E., Lettinga G., Field J.A. Biotransformation and biodégradation of selected nitroaromatics under anaerobic conditions. Biotechnol. Prog., 1999, 15 (3), P.358-365.

234. Razo-Flores E., Luijten M., Donlon B., Lettinga G., Field J.A. Complete biodégradation of the azo dye azodisalycylate under anaerobic conditions. Environ. Sci. Technol., 1997a, 31 (16), P. 2098-2103.

235. Razo-Flores E., Luijten M., Donlon B., Lettinga G., Field J.A. Biodégradation of selected azo dyes under methanogenic conditions. Wat. Sci. Technol., 19976, 3 (6/7), P. 65-72.

236. Ren Sh., Schultz T.W. Identifying the mechanism of aquatic toxicity of selected compounds by hydrophobicity and electrophilicity descriptors. Toxicol. Lett., 2002, 129, P. 151-160.

237. Richards R.M.E., Xing D.K.L., King T.P. Activity of p-aminobenzoic acid compared with other organic acids against selected bacteria. J. Appl. Bacteriol., 1995, 78 (2), P. 209-215.

238. Rintala J., Lepisto S., Ahring B. Acetate degradation at 70 deg C in Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactors and Temperature Response of Granules Grown at 70 deg C. Appl. Env. Microbiol., 1993, 59 (6), P. 1742-1746.

239. Robinson T., McMullan G., Marchant R., Nigam R. Remediation of dyes in textile effluent: a critical review on current treatment technologies with proposed alternative. Biores. Technol., 2001, 77, P. 247-255.

240. Roest K., Heilig H. G., Smidt H., de Vos W. M., Stams A. J. M., Akkermans A. D. L. Community analysis of a full-scale anaerobic bioreactor treating paper mill wastewater. Syst. Appl. Microbiol., 2005, 28, P. 175-185.

241. Russ R., Rau J., Stolz A. The function of cytoplasmatic flavin reductases in the bacterial reduction of azo dyes. Appl. Environ. Microbiol., 2000, 66, P. 1429-1434.

242. Saiki Y., Iwabuchi C., Katami A., Kitagawa Y. Microbial analyses by fluorescence in situ hybridisation of well-settled granular sludge in brewery wastewater treatment plants. J. Biosci. Bioeng., 2002, 93, P. 601-606.

243. Sam-Soon P.A., Looewenthal R.E., Dold P.L., Marais D.V.R. Peptization in upflow anaerobic sludge bed reactors. In: Anaerobic digestion. Hall ER, Hobson PN, eds. Oxford, UK: Pergamon Press, 1988, P. 55-60.

244. Sanchez J.M., Arijo S., Munoz M.A., Morinigo M.A., Borrego J.J. Microbial colonization of different support materials used to enhance the methanogenic process. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1994, 41, P. 480-486.

245. Satoh H., Miura Y., Tsushima I., Okabe S. Layered structure of bacterial and archaeal communities and their in situ activities in anaerobic granules. Appl. Environ. Microbiol., 2007, 73 (22), P. 7300-7307.

246. Schnell S., Bak F., Pfennig N. Anaerobic degradation of aniline and dihydroxybenzenes by newly isolated sulfate-reducing bacteria and description of Desulfobacterium anilini. Arch. Microbiol., 1989, 152 (6), P. 556-563.

247. Schnell S., Schink B. Anaerobic aniline degradation via reductive deamination of 4-aminobenzoyl-CoA in Desulfobacterium anilini. Arch. Microbiol., 1991, 155 (2), P. 183-190.

248. Schnell S., Schink B. Anaerobic degradation of 3-aminobenzoate by a newly isolated sulfate reducer and a methanogenic enrichment culture. Arch. Microbiol., 1992, 158 (4), P. 328-334.

249. Schuhle C., Jahn M., Ghisla S., Fuchs G. Two similar gene clusters coding for the enzymes of a new type of aerobic 2-aminobenzoate (anthranilate) metabolism in the bacterium Azoarcus evansii. J. Bacterid., 2001, 183, P. 52685278.

250. Schwarzenbach R.P., Stierli R., Lanz K., Zeyer J. Quinone and iron porphyrine mediated reduction of nitroaromatic compounds in homogenous aqueous solution. Environ. Sci. Technol., 1990, 24, P. 1566-1574.

251. Senan R.C., Abraham T.E. Bioremediation of textile azo dyes by aerobic bacterial consortium. Biodégradation, 2004, 15 (4), P. 275-280.

252. Shin M., Nguyen T., Ramsay J. Evaluation of support materials for the surface immobilization and decoloration of amaranth by Trametes versicolor. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2002, 60 (1-2), P. 218-23.

253. Schink B. Syntrophism among prokaryotes. In: The prokaryotes, 2nd ed. Ed. Balows A., Truper H.G., Dworkin M., Schleifer K.H. NY: Springer-Verlag, 1991, P. 276-299.

254. Schink B. Diversity, ecology, and isolation of acetogenic bacteria. In: Acetogenesis. Ed. Drake H.L., 1994. NY: Chapman & Hall, P. 197-235.

255. Schink B. Energetics of syntrophic cooperation in methanogenic degradation. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 1997, 61, P. 262-280.

256. Schmidt J. E., Ahring B. K. Effects of hydrogen and formate on the degradation of propionate and butyrate in thermophilic granules from an UASB-reactor. Appl. Environ. Microbiol., 1993, 59 (8), P. 2546-2551.

257. Sekiguchi Y., Kamagata Y., Syutsubo K., Ohashi A., Harada H., Nakamura K. Phylogenetic diversity of mesophilic and thermophilic granular sludges determined by 16S rRNA gene analysis. Microbiology, 1998, 144, P. 26552665.

258. Shinoda Y., Sakai Y., Ue M., Hiraishi A, Kato N. Isolation and characterization of a new denitrifying spirillum capable of anaerobic degradation of phenol. Appl. Environ. Microbiol., 2000, 66 (4), P. 1286-1291.

259. Sikkema J., de Bond J.A.M., Poolman B. Interaction of cyclic hydrocarbons with biologycal membranes. J. Biol. Chem., 1994, 269 (11), P. 8022-8028.

260. Sikkema J., de Bond J.A.M., Poolman B. Mechanisms of menbrane toxicity of hydrocarbons. Microbiol. Rev., 1995, 59 (2), P. 201-222.

261. Silveira E., Marques P. P., Macedo A. C., Mazzola P. G., Porto A. L. F., Tambourgi E. B. Decolorization of industrial azo dye in an anoxic reactor by PUF immobilized Pseudomonas oleovorans. J.Water Reuse and Desalination, 2011, 1 (1), P. 18-26.

262. Slokar Y. M., Majcen Le Maréchal A. Methods of decoloration of textile wastewaters. Dyes and Pigments, 1998, 37 (4), P. 335-356.

263. Slyter L. L., Weaver J. M. Tetrahydrofolate and other growth requirements of certain strains of Ruminococcus flavifaciens. Appl. Environ. Microbiol., 1977, 33 (2), P. 363-369.

264. Smibert R.M., Krieg N.R. General characterization. In: Manual of methods for general bacteriology. Eds. Gerhardt P. et al. Washington, D.C.: American Society of Microbiology, 1981, P. 409-444.

265. Snyderwine E.G., Sinha R., Felton J.S., Ferguson L.R. Highlights of eight international conference on carcinogenic/mutagenic N-substituted aryl compounds. Mutat. Res., 2002, 506-507, P. 1-8.

266. Solís M., Solís A., Pérez H.I., Manjarrez N., Flores M. Microbial decolouration of azo dyes: A review. Proc. Biochem., 2012, 47 (12), P. 17231748.

267. Song B., Palleroni N.J., Haggblom M.M. Description of strain 3CB-1, a genomovar of Thauera aromatica, capable of degrading 3-chlorobenzoate coupled to nitrate reduction. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2000, 50 (2), P. 551558.

268. Soo-Young K., Jin-Young A., Byung-Woo K. The effects of reductant and carbon source on the microbial decolorization of azo dyes in an anaerobic sludge process. Dyes and Pigments, 2008, 76, P. 256-263.

269. Spain J.C., Gibson D.T. Pathway for biodégradation of />nitrophenol in a Moraxella sp. Appl. Environ. Microbiol., 1991, 57 (3), P. 812-819.

270. Sponza D. T. Rapid granulation and sludge retention for tetrachloroethylene removal in an UASB reactor. Biotechnol. Lett., 2001, 23, P. 1209-1216.

271. Sponza D., Isik M. Decolorization and inhibition kinetic of Direct Black 38 azo with granulated anaerobic sludge. Enz. Microb. Technol., 2004, 34, P. 147158.

272. Stackebrandt E., Goebel B.M. Taxonomic note: A place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology. Int. J. Syst. Bacterid., 1994. 44 (4), P. 846-849.

273. Stams A. J. M. Methabolic interactions between anaerobic bacteria in methanogenic environments. Antonie van Leewenhoek, 1994, 66, P. 271-294.

274. Stams A.J.M., Plugge C.M. Electron transfer in syntrophic communities of anaerobic bacteria and archaea. Nature Rev. Microbiol., 2009, 7 (8), P. 568-577.

275. Stoffels M., Amann R., Ludwig W., Hekmat D., Schleifer K. H. Bacterial community dynamics during start-up of a trickle-bed bioreactor degrading aromatic compounds. Appl. Environ. Microbiol., 1998, 64 (3), P. 930-939.

276. Stolz A. Basic and applied aspects in the microbial degradation of azo dyes. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2001, 56, P. 69-80.

277. Tan N. C. Integrated and Sequential Anaerobic/Aerobic Biodégradation of Azo Dyes. Ph.D. Thesis, Wageningen University, Wageningen, The Netherlands, 2001.

278. Thauer R.K., Jungermann K., Decker K. Energy conservation in chemotropic anaerobic bacteria. Bacteriol. Rev., 1977, 41 (2), P. 100-180.

279. Thaveesri J., Daffonchio D., Liessens B., Vandermeren P., Verstraete W. Granulation and sludge bed stability in upflow anaerobic sludge bed reactors in relation to surface thermodynamics. Appl. Environ. Microbiol., 1995, 61 (10), P. 3681-3686.

280. Thurnheer T., Zurrer D., Hoglinger O., Leisinger T., Cook A.M. Initial steps in the degradation of benzenesulfonic acid, 4-toluene sulfonic acid and orthanilic acid in Alcaligenes sp. Strain O-l. Biodégradation, 1990, 1, P. 55-64.

281. Tresse O., Mounien F., Levesque M. J., Guiot S. Comparison of the microbial population dynamics and phylogenetic characterization of a CANOXIS reactor and a UASB reactor degrading trichloroethane. J. Appl. Microbiol., 2005, 98, P. 440-449.

282. Truper H.G., Schlegel H.G. Sulfur metabolism in Thiorhodaceae: 1. quantitative measurement of growing cells of Chromatium okenii. Antonie van Leeuwenhoek, 1964, 30 (3), P. 225-238.

283. Tschech A., Fuchs G. Anaerobic degradation of phenol by pure cultures of newly isolated denitrifying pseudomonads. Arch. Microbiol., 1987, 148 (3), P. 213-217.

284. Tschech A., Schink B. Methanogenic degradation of antranilate (2-aminobenzoate). System. Appl. Microbiol., 1988, 11 (1), P.9-12.

285. Tsuda Y., Kawai K., Nakajima S. Assymmetric reduction of 2-methyl-2-aryloxyacetic acids by Glomerella cingulata. Agric. Biol. Chem., 1984, 48 (11), P. 1373-1374.

286. Tsuda Y., Kawai K., Nakajima S. Microbial reduction of 2-phenylpropionic acid , 2-benzyloxypropionic acid and 2-(2-furfuryl)propionic acid. Chem. Pharm. Bull., 1985, 33 (15), P. 4657-4661.

287. Vavilin V. A., Lokshina L. Y., Rytov S. V., Kotsyurbenko O. R., Nozhevnikova A. N. Description of two-step kinetics in methane formation during psychrophilic H2/CC>2 and mesophilic glucose conversions. Biores. Technol., 2000, 71, P. 195-209.

288. Vaz-Moreira I., Silva M.E., Manaia C.M., Nunes O.C. Diversity of bacterial isolates from commercial and homemade composts. Microb. Ecol., 2008, 55 (4), P. 714-722.

289. Vijaya P.P., Sandhya S. Decolorization and complete degradation of Methyl red by a mixed culture. The Environmentalist, 2003, 23, P. 145-149.

290. Wagner M., Loy A. Bacterial community composition and function in sewage treatment systems. Curr. Opinion Biotechnol., 2002, 13, P.218-227.

291. Wallrabenstein C., Gorny N., Springer N., Ludwig W., Schink B. Pure cultures of Syntrophus buswelli, definition of its philogenetic status, and description of Syntrophus gentianae sp. nov. Syst. Appl. Microbiol., 1995, 18, P. 62-66.

292. Warikoo V., Mclnerney M. J., Robinson J. A., Sulfita J. M. Interspecies acetate transfer influences the extent of anaerobic benzoate degradation by syntrophic consortia. Appl. Environ. Microbiol., 1996, 62, P. 26-32.

293. Weber S. D., Ludwig W., Schleifer K.-H., Fried J. Microbial Composition and Structure of Aerobic Granular Sewage Biofilms. Appl. Environ. Microbiol., 2007, 73 (19), P. 6233-6240.

294. Weisburger J.H. A perspective on the history and significance of carcinogenic and mutagenic N-substituted aryl compounds in human health. Mutat. Res., 1997, 376, P. 261-266.

295. White H., Feicht R., Huber C., Lottspeich F., Simon H. Purification and some properties of the tungsten-containing carboxylic acid reductase from Clostridium formicoaceticum. Biol. Chem. Hoppe. Seyler, 1991, 372 (8), P. 9991005.

296. White H., Huber C., Feicht R., Simon H. On a reversible molybdenum-containing aldehyde oxidoreductase from Clostridium formicoaceticum. Arch. Microbiol., 1993, 159 (2), P. 244-249.

297. White H., Simon H. The role of tungsten and/or molybdate in the formation of aldehyde oxidoreductase in Clostridium formicoaceticum and other acetogens; immunological distances of such enzymes. Arch. Microbiol., 1992, 158(1), P. 81-84.

298. White H., Strobl G., Feicht R., Simon H. Carboxylic acid reductase: a new tungsten enzyme catalyses the reduction of non-activated carboxylic acids to aldehydes. Eur. J. Biochem., 1989, 184 (1), P. 89-96.

299. Whitman W. B., Bowen T. L., Boone D. R. The methanogenic bacteria. In: The Procaryotes ,vol. 1 . Ed. A. Balows, H.G. Truper, K.H. Schleifer. -New York: Springer, 1992, P. 719-767.

300. Wiegant W. M., de Man A. W. Granulation of biomass in thermophilic UASB reactors treating acidified wastewaters. Biotechnol. Bioeng., 1986, 28, P. 718-727.

301. Wittich R.M., Rast H.G., Knackmuss H.J. Degradation of naphthalene-2,6-and naphthalene-1,6-disulfonic acid by a Moraxella sp. Appl. Environ. Microbiol., 1988, 54 (7), P. 1842-1847.

302. Wolfe A.J. The Acetate Switch. Microbiol. Mol.Biol. Rew., 2005, 69 (1), P. 12-50.

303. Wong P. K., Yuen P. Y. Decolorization and biodégradation of methyl red by Klebsiella pneumoniae RS-13. Water Res., 1996, 30, P. 1736-1744.

304. Wu W.M., Bhatnagar L., Zeicus J. G. Performance of anaerobic granules for degradation of pentachlorophenol. Appl. Environ. Microbiol., 1993, 59, P. 389397.

305. Wu W. M., Hickey R. F., Zeicus J. G. Characterization of metabolic performance of methanogenic granules treating brewery waste-water: role of sulfate-reducing bacteria. Appl. Environ. Microbiol., 1991, 57, P. 3438-3449.

306. Wu W. M., Jain M. K., Zeicus J. G. Microbial composition and characterization of prevalent methanogens and acetogens isolated from syntrophic methanogenic granules. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1992, 38, P. 282-292.

307. Wu W.M., Jain M. K., Zeicus J. G. Formation of fatty acid-degrading, anaerobic granules by defined species. Appl. Environ. Microbiol., 1996, 62, P. 2037-2044.

308. Wu J. H., Liu W. T., Tseng I. C., Cheng S. S. Characterization of microbial consortia in a terephthalate-degrading anaerobic granular sludge system. Microbiology, 2001, 147, P. 373-382.

309. Xu H., Heinze Th., Chen S., Cerniglia C. E., Chen H. Anaerobic metabolism of l-Amino-2-Naphthol-Based azo dyes (Sudan Dyes) by humen intestinal microflora. Appl. Environ.Microbiology, 2007, 73 (23), P. 7759-7762.

310. Yatome C., Matsufuru H., Taguchi T., Ogawa T. Degradation of 4'-dimethylaminoazobenzene-2-carboxylic acid by Pseudomonas stutzeri. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1993, 39, P. 778-781.

311. Ye D., Quensen J.F. Ill, Tiedje J.M., Boyd S.A. Anaerobic dechlorination of polychlorobiphenyls (Aroclor 1242) by pasteurized and ethanol-treated microorganisms from sediments. Appl. Environ. Microbiol., 1992, 58, P. 11101114.

312. Ye D., Quensen J.F. Ill, Tiedje J.M., Boyd S.A. 2-Bromoethanesulfonate, sulfate, molybdate and ethanesulfonate inhibit anaerobic dechlorination of polychlorobiphenyls by pasteurized microorganisms. Appl. Environ. Microbiol., 1999, 65, P. 327-329.

313. Yemashova N., Kalyuzhnyi S. Microbial conversion of selected azo dyes and their breakdown products. Wat. Sci. Technol., 2006, 53 (11), P. 163-171.

314. Yoo E.S. Kinetics of chemical decolorization of the azo dye C.I. Reactive Orange 96 by sulfide. Chemosphere, 2002, 47 (9), P. 925-931.

315. Yoo E. S., Libra J., Wiesmann U. Reduction of azo dyes by Desulfovibrio desulfuricans. Water Sci. Technol., 2000, 41 (12), P. 15-22.

316. Youngster L.K.G., Kerkhof L.J., Haggblom M.M. Community characterization of anaerobic methyl tert-butyl ether (MTBE)-degrading enrichment cultures. FEMS Microbiol. Ecol., 2010, 72 (2), P. 279-288.

317. Yu H.Q., Fang H.H.P., Tay J.H. Enhanced sludge granulation in upflow anaerobic sludge blanket (UASB) reactors by aluminium chloride. Chemosphere, 2001b, 44, P. 31-36.

318. Yu H.Q., Tay J.H., Fang H.H.P. The role of calcium in sludge granulation during UASB reactor start-up.Water Res., 2001a, 35, P. 1052-1060.

319. Yu J., Wang X., Yue P.L. Optimal decolorization and kinetic modeling of synthetic dyes by Pseudomonas strains. Water Res., 2001, 35 (15), P 35793586.

320. Zaar A., Eisenreich W., Bacher A., Fuchs G. A novel pathway of aerobic benzoate catabolism in the bacteria Azoarcus evansii and Bacillus stearothermophilus. J. Biol. Chem., 2001, 276, P. 24997-25004.

321. Zahm S.H., Weisenburger D.D., Babbitt P.A., Saal R.C., Vaught J.B., Blair A. Use of hair coloring products and the risk of lymphoma, multiple myeloma, and chronic lymphocytic leukemia. Am. J. Pub. Health, 1992, 82 (7), P. 990997.

322. Zengler K. Central role of the cell in microbial ecology. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 2009, 73 (4), P. 712-729.

323. Zhang X., Mandelco L., Wiegel J. Clostridium hydroxybenzoicum sp. nov. , an amino acid-utilising, hydroxybenozate-decarboxylating bacterium isolated from methanogenic freshwater pond sediment. Int. J. Syst. Bacteriol., 1994, 44 (1), P. 214-222.

324. Zilie A., Ramalho P., Tzanov T., Millward R., Aires V., Cardoso M.H., Ramalho M.T., Gubitz G.M., Cavaco-Paulo A. Predicting dye biodegradation from redox potentials. Biotechnol. Prog., 2004, 20, P. 1588-1592.

325. Zissi U., Lyberatos G., Pavlou S. Biodegradation of p-aminoazobenzene by Bacillus subtilis under aerobic conditions. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 1997, 19, P. 49-55.

326. Zitomer D.H., Shrout J.D. Feasibility and benefits of methanogenesis under oxygen-limited conditions. Waste Management, 1998, 18 (6), P. 107-116.