Тканеспецифичные особенности экспрессии генов, ассоциированных со стрессом эндоплазматического ретикулума под действием гомоцистеина тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.03, кандидат биологических наук Меситов, Михаил Валентинович

• Меситов, Михаил Валентинович
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Меситов, Михаил Валентинович

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Функции и структурные компоненты эндоплазматического 15 ретикулума

1.2. Сигнальные пути системы UPR (Unfolded Protein Response) 27 эндоплазматического ретикулума

1.2.1. Сигнальный путь IRE 1 -ХВР

1.2.2. Сигнальный путь ATF

1.2.3. Сигнальный путь PERK-ATF

1.2.4. Механизмы апоптоза, индуцированного стрессом ЭПР

1.3. Гипергомоцистеинемия и клеточный стресс

1.3.1. Метаболизм гомоцистеина

1.3.2. Токсичность гомоцистеина

1.3.3. Гипергомоцистеинемия и сердечно-сосудистые 66 заболевания

Глава 2. Материалы, объекты и методы исследования

2.1. Материалы и объекты исследования

2.1.1. Реактивы

2.1.2. Клеточные линии человека

2.1.3. Животные

2.2. Методы исследования

2.2.1. Субкультивирование клеток Jurkat

2.2.2. Субкультивирование клеток EA.hy

2.2.3. Оценка жизнеспособности клеток методом исключения 75 красителя (трипановый синий)

2.2.4. Инкубация клеток с В,Ь-гомоцистеином и дитиотрейтолом

2.2.5. Моделирование токсического действия гомоцистеина in 75 vivo

2.2.6. Получение клеточной суспензии из ткани печени

2.2.7. Проточно-цитофлуориметрический анализ

2.2.8. Определение апоптотических клеток по окрашиванию 78 ДНК пропидий йодидом

2.2.9. Анализ клеточного цикла

2.2.10. Иммуноцитохимия

2.2.11. Выделение суммарной РНК из культивируемых клеток

2.2.12. Спектрофотометрическое определение содержания 83 суммарной РНК в образцах

2.2.13. Электрофорез РНК в агарозном геле

2.2.14. Приготовление образцов суммарной РНК, свободной от 85 ДНК

2.2.15. Флуориметрическое определение содержания суммарной 86 РНК в образцах

2.2.16. Синтез первой цепи комплементарной ДНК

2.2.17. Полимеразная цепная реакция «в реальном времени» 87 (ПЦР-РВ)

2.2.18. Анализ результатов ПЦР-РВ

2.2.19. Статистическая обработка данных

Глава 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение

3.1. Морфофункциональные особенности эндоплазматического 91 ретикулума в клеточных линиях EA.hy926 и Jurkat

3.2. Изменения экспрессии генов системы UPR в клетках линий 93 человека EA.hy926 и Jurkat, под воздействием В,Ь-гомоцистеина и дитиотрейтола

3.2.1. Изменение уровня сплайсинговой формы гена ХВР

3.2.2. Изменение уровня мРНК гена BiP

3.2.3. Изменение уровня мРНК гена CHOP

3.2.4. Изменения уровней мРНК генов PDIA3, PERK и GADD

3.3. Динамика внутриклеточной концентрации белковых продуктов 104 генов стрессового ответа в клетках линий человека EA.hy926 и Jurkat, под воздействием 0,Ь-гомоцистеина и дитиотрейтола

3.3.1. Изменение внутриклеточного содержания белка BiP

3.3.2. Изменение внутриклеточного содержания белка CHOP

3.4. Иммуноцитохимическое исследование экспрессии ЭПР- 109 резидентных белков в клетках линий человека EA.hy926 и Jurkat, под воздействием 0,Ь-гомоцистеина и дитиотрейтола

3.5. Оценка клеточной гибели и распределения клеток по фазам 112 клеточного цикла при действии индукторов стресса

3.6. Изменения экспрессии белковых маркеров стресса ЭПР при 117 действии избытка гомоцистеина in vivo

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Тканеспецифичные особенности экспрессии генов, ассоциированных со стрессом эндоплазматического ретикулума под действием гомоцистеина»

Актуальность проблемы

Клеточный стрессовый ответ относится к числу механизмов, лежащих в основе патогенеза широкого спектра заболеваний. Изменения внутренней среды организма при патологических состояниях могут индуцировать стрессовые ответы определенных типов клеток в зависимости от их чувствительности к меняющимся факторам среды.

Клеточный стресс представляет собой универсальную неспецифическую форму системной реакции клетки на любую форму макромолекулярных повреждений, превышающих пороговую величину (Кубатиев A.A. и др., 2012; Kültz D., 2003). Стрессовая реакция необходима для временного увеличения толерантности к повреждениям макромолекул посредством использования филогенетически консервативных наборов генов и биохимических путей, которые опосредуют макромолекулярную стабилизацию и репарацию в клетке для обеспечения клеточной и организменной целостности в субоптимальных условиях (Kültz D, 2003). Структурированность эукариотической клетки, наличие отличающихся по составу внутренней среды компартментов с мембранами, выполняющими барьерные функции, и защитными системами, индуцируемыми независимо от цитоплазматических, обусловливают неодинаковую чувствительность к воздействиям и разную степень вовлеченности структурно-функциональных модулей клетки в стрессовый ответ. Факт наличия активных, стабилизирующих структуру и функцию биологического модуля, неспецифических «буферных» механизмов позволил масштабировать и использовать понятие «стресс» на субклеточном уровне, то есть рассматривать компартментализованный вариант клеточного стресса.

К числу компартментов эукариотической клетки, способных к инициации специальной формы стрессового ответа, относится эндоплазматический ретикулум (ЭПР) - многофункциональная органелла, одной из важнейших функций которой является конформационное созревание белков - в ЭПР осуществляется фолдинг около 30% белков эукариот (Hetz С., 2012). Нарушения процессов конформационного созревания белков могут стать причиной развития протеотоксического стресса, динамика которого определяется интенсивностью de novo синтеза и обновления клеточных и экстраклеточных белков. Продукты незаконченной трансляции, интермедиаты фолдинга с некорректной конформацией, а также субъединицы, не включенные в олигомерные белковые комплексы, могут экспонировать гидрофобные области (Hartl F.U., Hayer-Hartl М., 2009), которые становятся дополнительными, «незаконными» интерфейсами для межмолекулярного взаимодействия и могут приводить к агрегации белков, формированию токсичных и иммуногенных продуктов. Накопление конформационно-дефектных белков в люмене ЭПР в связи со множественностью функций и единым объемом этого компартмента может инициировать нарушения работы других систем ЭПР, и тем самым индуцировать состояние, характеризуемое как стресс эндоплазматического ретикулума (Ron D., Walter P., 2007).

Для защиты от протеотоксического стресса и ошибок работы системы конформационного созревания белков в ЭПР эукариот возникли следующие приспособления: 1) рецепция белков с ненативными конформациями в ЭПР; 2) обработка и передача информации в ядро о детектированных белках с дефектными или незрелыми конформациями; 3) адаптационные изменения ЭПР и ассоциированных структур, общим результатом действия которых должно стать снижение концентрации дефектных белков в люмене ЭПР.

Перечисленные функции реализуются посредством нескольких механизмов, действующих зачастую совместно: 1) система сигнальных каскадов ответа на белки с ненативными конформациями (Unfolded Protein Response, UPR); 2) контроль трансляции - аттенюация кеп-зависимой трансляции, опосредуемая киназой PERK; 3) активация транскрипционного фактора ATF6; 4) ответ на избыток белка в люмене ЭПР, или «перегрузку» ЭПР (endoplasmic reticulum overload response, EROR), опосредуемый активированным транскрипционным фактором NF-kappaB.

Таким образом, в компартменте ЭПР при различных нарушениях может иметь место локализованный протеотоксический стресс. При дефектах или функциональной недостаточности системы контроля качества стресс может быть «генерализован» во внутри- и внеклеточном пространстве. Невозможности компенсации стресса индуцирует программированную клеточную гибель (Szegezdi Е. et al, 2006).

Несмотря на значительный интерес исследователей, динамические аспекты регуляции стресса ЭПР в клетках человека различных типов изучены недостаточно. Способность клеток различных типов к эффективной реализации во времени адаптивной фазы стресса ЭПР определяет устойчивость клеток к стрессу и их дальнейшую выживаемость. В этой связи, анализ тканеспецифичных особенностей временных профилей экспрессии генов системы UPR, в частности, BiP, ХВР1, кинетики сплайсинга ХВР1 и соотнесение динамики этих процессов с индукцией проапоптотического гена CHOP, а также анализом клеточной гибели представляются актуальными задачами исследования.

При гипергомоцистеинемии - распространенном патологическом состоянии (Hashimoto Т. et al, 2007), ассоциированном с сердечно-сосудистыми, нейродегенеративными заболеваниями, инсулиннезависимым диабетом и рядом других патологий, возросший уровень аминокислоты гомоцистеина в плазме крови может оказывать стресс-индуцирующее действие на клетки. Предполагается, что гомоцистеин может активировать стрессовый ответ эндотелиоцитов и быть причиной развития эндотелиальной дисфункции, при этом формой стрессовой реакции может быть стресс ЭПР и IRE 1-зависимый апоптоз (Zhang С. et al, 2001).

ЭПР-стресс как результат нарушений конформационного созревания белков может играть ключевую роль в патогенезе ассоциированных с гипергомоцистеинемией заболеваний и способен рассматриваться как типовой молекулярно-патофизиологический процесс. В связи с этим, исследование ЭПР-стрессовых ответов клеток разных типов и различной тканевой принадлежности имеет важнейшее фундаментальное и прикладное значение для патофизиологии и биомедицинской науки в целом. С учетом вовлеченности сосудистой стенки в развитие патологического состояния гипергомоцистеинемии (Kubatiev A. et al, 2005), изучение стресса эндоплазматического ретикулума в эндотелиоцитах и взаимодействующих с ними клетках иммунной системы является актуальной задачей.

Цель исследования:

Целью настоящего исследования является сравнительный анализ экспрессионных профилей генов, вовлеченных в стресс эндоплазматического ретикулума, а также выявление неизвестных ранее тканеспецифических особенностей их регуляции под действием гомоцистеина in vitro и в условиях экспериментальной гипергомоцистеинемии in vivo.

Задачи исследования:

1. Провести исследование уровней мРНК генов ХВР1, BiP и CHOP, ассоциированных со стрессом ЭПР, в клетках Т-лимфоцитарной линии Jurkat и эндотелиоцитарной линии EA.hy926 под действием гомоцистеина in vitro.

2. Изучить динамику внутриклеточных концентраций белков стрессового ответа BiP и CHOP в клетках линий Jurkat и EA.hy926 под действием гомоцистеина.

3. Установить взаимосвязь временных профилей экспрессии генов стрессового ответа и концентраций их белковых продуктов с процессами клеточной гибели и распределением клеток по фазам клеточного цикла.

4. Выявить особенности экспрессии генов стрессового ответа на модели гипергомоцистеинемии in vivo.

Научная новизна исследования

Впервые проанализирована экспрессия генов BiP, CHOP и ХВР1, участвующих в формировании стрессового ответа, в клетках линии Т-лимфобластной лейкемии человека Jurkat. Получены временные профили экспрессии генов в линиях клеток Jurkat и EA.hy926, свидетельствующие о клеточно-специфичной динамике стрессового ответа, определяемой морфофункциональными особенностями эндоплазматического ретикулума этих клеток. Впервые показано отсутствие корреляции между изменением уровня мРНК гена CHOP и его белкового продукта в клетках Jurkat и EA.hy926, что может указывать на важность посттранскрипционных механизмов в регуляции экспрессии генов системы сигнальных каскадов UPR, участвующих в принятии решения клеткой о запуске про- или антиапоптотических механизмов.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные в работе данные углубляют существующие представления о динамике развития стрессового ответа в линиях клеток, различающихся по морфофункциональным свойствам эндоплазматического ретикулума, но имеющих идентичную организацию системы сигнальных каскадов UPR. Обнаруженные в работе особенности экспрессии проапоптотического гена

CHOP могут указывать на существование нового регуляторного механизма при стрессе эндоплазматического ретикулума. Практическая значимость полученных данных состоит в возможности использования белков BiP и CHOP в качестве маркеров для диагностики стресса ЭПР in vivo.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Гомоцистеин способен вызывать стресс ЭПР в клетках различного тканевого происхождения (клетки Т-лимфоцитарной линии Jurkat и эндотелиоцитарной линии EA.hy926).

2. Степень чувствительности и устойчивости к стрессу ЭПР под действием гомоцистеина зависит от типа клеток и их тканевого происхождения.

3. Специфичность функционирования системы UPR в клетках Т-лимфоцитарной линии Jurkat и эндотелиоцитарной линии EA.hy926 выражается в различной динамике и уровнях экспрессии генов стрессового ответа.

4. Неполная корреляция между уровнями мРНК и концентрациями белковых продуктов генов стрессового ответа, прежде всего CHOP, указывает на возможность вовлечения дополнительных посттранскрипционных механизмов регуляции в систему сигнальных каскадов UPR.

5. Ключевую роль при стрессе ЭПР играет времязависимая регуляция системы UPR.

Заключение диссертации по теме «Патологическая физиология», Меситов, Михаил Валентинович

ВЫВОДЫ

1. Гомоцистеин в исследованном диапазоне концентраций приводит к развитию стресса ЭПР и активации системы сигнальных путей UPR в клетках EA.hy926 и Jurkat; гомоцистеин является более слабым индуктором стресса ЭПР по сравнению с дитиотрейтолом.

2. Продолжительность активации IRE 1-опосредованного сигнального пути различна в клетках двух типов. Снижение уровня мРНК сплайсинговой формы ХВР1 в клетках EA.hy926 является признаком более ранней аттенюации ЭПР-ядерного сигнала.

3. Различия в экспрессии гена BiP в клетках двух линий свидетельствуют о неодинаковой интенсивности и времени развития пикового стрессового ответа в клетках EA.hy926 и Jurkat.

4. Для клеток линии EA.hy926 характерно падение уровня мРНК проапоптотического гена CHOP после кратковременной фазы роста и более низкий процент клеточной гибели при исследованной продолжительности стресс-индуцирующего воздействия. В клетках Jurkat уровень мРНК гена CHOP имел более стабильный характер и поддерживался на сравнительно высоком уровне, рост концентрации белка CHOP в клетках Jurkat был более выражен.

5. Наблюдавшееся несоответствие между уровнями мРНК и концентрацией белковых продуктов ряда генов стрессового ответа (в частности, CHOP) свидетельствует о вовлечении дополнительных посттранскрипционных механизмов регуляции экспрессии генов системы UPR.

6. Высокие концентрации гомоцистеина способны индуцировать стресс ЭПР в клетках печени крыс.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе охарактеризованы особенности экспрессии генов стрессового ответа при действии повышенных концентраций гомоцистеина, характерных для тяжелых форм гомоцистеинемии и гомоцистинурии.

Впервые показаны различия в функционировании системы сигнальных каскадов, индуцируемых при стрессе эндоплазматического ретикулума (UPR, ответ на белки с ненативными конформациями) в клетках эндотелиоцитарного и лимфоцитарного типов. Эти отличия заключаются не только в уровнях индуцируемых мРНК при стрессе ЭПР, что может быть обусловлено разным количеством молекул, выполняющих функцию рецепции белков с дефектами конформаций в ЭПР, и, соответственно, разной концентрацией активирующих транскрипционных факторов. Обнаруженные изменения на уровне белковых продуктов свидетельствуют также о наличии дополнительных, клеточно-специфичных механизмов регуляции ЭПР-стрессового ответа.

Новизна работы заключается в анализе не только величины, но и длительности сигналов в регуляции стресса ЭПР. В частности, различная продолжительность активации IRE-¡-опосредованного сигнального каскада и отличия временных профилей экспрессии проапоптотического гена CHOP могут свидетельствовать о разной длительности «фазы принятия решения» об индукции апоптоза и обуславливать различия в устойчивости клеток двух типов к ЭПР-стрессу. На основе проведенного анализа сформулировано предположение о времязависимой регуляции в системе UPR. Для уточнения механизмов, лежащих в основе подобной времязависимой регуляции, требуется проведение дополнительных исследований - в частности, анализ стабильности мРНК.

Исследования, проведенные на самцах крыс, показали, что внутрибрюшинное введение гомоцистеина приводило к значительному увеличению экспрессии белков BiP и CHOP по сравнению с подкожным введением. Это свидетельствует о развитии стресса ЭПР в клетках печени крыс при действии избытка гомоцистеина.

Полученные результаты уточняют картину молекулярных и субклеточных процессов при стрессе ЭПР. Установленные особенности экспрессии стресс-респонсивных генов, регуляции стресса ЭПР и апоптоза при действии избытка гомоцистеина могут быть использованы для выработки подходов к лечению гипергомоцистеинемии.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Меситов, Михаил Валентинович, 2012 год

1. Иванов А.В., Лузянин Б.П., Московцев А.А., Роткина А.С., Кубатиев

2. А.А. Определение фракции восстановленного гомоцистеина в сыворотке крови методом ВЭЖХ-МС // Патол. физиол. и эксперим. тер. 2011. - № 2. - С. 55-60

3. Павлова Н.Н. Роль гомоцистеина в механизмах стресс-индуцированной дисфункции тромбоцитов и сосудистого эндотелия: Автореф. канд. мед. наук. М., 2006. - 21 с.

4. ПЦР "в реальном времени" / Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю. и др. Под ред. д.б.н. Ребрикова Д.В. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009.-215 с.

5. Austin R.C., Lentz S.R., Werstuck G.H. Role of hyperhomocysteinemia in endothelial dysfunction and atherothrombotic disease // Cell Death and Differentiation. 2004. - V. 11. - P.56-64

6. Bader M., Muse W., Ballou D.P., Gassner C., Bardwell J.C.A. Oxidative Protein Folding Is Driven by the Electron Transport System // Cell. 1999. -V. 98.-P. 217-227

7. Baker K.M., Chakravarthi S., Langton K.P., Sheppard A.M., Lu H.,Bulleid N.J. Low reduction potential of Erola regulatory disulphides ensures tight control of substrate oxidation // The EMBO Journal. 2008. - V. 27. - P. 2988-2997

8. Bergmann J.E., Fusco P.J. The G Protein of Vesicular Stomatitis Virus Has Free Access into And Egress from the Smooth Endoplasmic Reticulum of UT-1 Cells // The Journal of Cell Biology. 1990. - V. 110. - P. 625-635

9. Bertolotti A., Zhang Y., Hendershot L.M., Harding H.P., Ron D. Dynamic interaction of BiP and ER stress transducers in the unfolded-protein response // Nat Cell Biol. 2000. - V. 2. - № 6. - P. 326-332

10. Brewer J.W., Diehl J.A. PERK mediates cell-cycle exit during the mammalian unfolded protein response // PNAS. 2000. - V. 97. - № 23. - 12625-12630

11. Brosnan J.T., Brosnan M.E. The sulfur-containing amino acids: an overview // J Nutr. 2006. - V. 136. - № 6. - P. 1636S-1640S

12. Buchberger A., Bukau B., Sommer T. Protein Quality Control in the Cytosol and the Endoplasmic Reticulum: Brothers in Arms // Molecular Cell. 2010. -V. 40. - P. 238-252

13. Christis C., Lubsen N.H., Braakman I. Protein folding includes oligomerization examples from the endoplasmic reticulum and cytosol // FEBS Journal. - 2008. - V. 275. - P. 4700-4727

14. Chuikov S., Kurash J.K., Wilson J.R., Xiao B., Justin N., Ivanov G.S., McKinney K., Tempst P., Prives C., Gamblin S.J., Barlev N.A., Reinberg D. Regulation of p53 activity through lysine methylation // Nature. 2004. - V. 432.-№7015.-P. 353-360

15. Cochella L., Green R. Fidelity in protein synthesis // Current Biology. 2005.- V. 15. -№ 14. - P. 536-540

16. Cole N.B., Sciakyt N., Marotta A., Song J., Lippincott-Schwartz J. Golgi Dispersal during Microtubule Disruption: Regeneration of Golgi Stacks at Peripheral Endoplasmic Reticulum Exit Sites // Molecular Biology of the Cell.- 1996.-V. 7.-P. 631-650

17. Connor J.H., Weiser D.C., Li S., Hallenbeck J.M., and Shenolikar S. Growth Arrest and DNA Damage-Inducible Protein GADD34 Assembles a Novel Signaling Complex Containing Protein Phosphatase 1 and Inhibitor 1 //

18. Molicular and Cellular Biology. 2001. - V. 21. - № 20. - P. 6841-6850

19. Cuozzo J.W., Kaiser C.A. Competition between glutathione and protein thiols for disulphide-bond formation // Nature Cell Biology. 1999. - V. 1. - P. 130135

20. Cusinato F., Pighin I., Luciani S., Trevisi L. Synergism between staurosporine and drugs inducing endoplasmic reticulum stress // Biochemical pharmacology. 2006. - V. 71. - P. 1562-1569

21. Dai J., Wang X. Immunoregulatory effects of homocysteine on cardiovascular diseases // Acta Physiologica Sinica. 2007. - V. 59. - № 5. - P. 585-592

22. Davis R.J. Signal transduction by the JNK group of MAP kinases // Cell. -2000. V. 103. - № 2. - P. 239-252

23. Dayel M.J., Horn E.F.Y., Verkman A.S. Diffusion of Green Fluorescent Protein in the Aqueous-Phase Lumen of Endoplasmic Reticulum // Biophysical Journal. 1999. - V. 76. - P. 2843-2851

24. DeJong J.L., Morgenstern R., Jornvall H., DePierre J.W., Tu C.-P. D. Gene Expression of Rat and Human Microsomal Glutathione S-Transferases // The Journal Of Biological Chemistry. 1998. - V. 263. - № 17. - P. 8430-8436

25. Diamant S., Ben-Zvi A.P., Bukau B., Goloubinoff P. Size-dependent Disaggregation of Stable Protein Aggregates by the DnaK Chaperone Machinery // The Journal of Biological Chemistry. 2000. - V. 275. - № 28. -P. 21107-21113

26. Ellgaard L., Molinari M., Helenius A. Setting the Standards: Quality Control in the Secretory Pathway // Science. 1999. - V. 286. - P. 1882-1888

27. Ferri K.F., Kroemer G. Organelle-specific initiation of cell death pathways // Nature Cell Biology. 2001. - V. 3. - P. 225-263

28. Finkelstein J.D. Methionine metabolism in mammals // J. Nutr. Biochem. -1990. -V. 1. -№ 5. P. 228-237

29. Finkelstein J.D. The metabolism of homocysteine: pathways and regulation // Eur. J. Pediatr. 1998. - V. 157. - № 2. - P. S40-44

30. Frand A.R., Kaiser C.A. The EROl Gene of Yeast Is Required for Oxidation of Protein Dithiols in the Endoplasmic Reticulum // Molecular Cell. 1998. -V. 1. - P. 161-170

31. Freedman R.B. Protein Disulfide lsomerase: Multiple Roles in the Modification of Nascent Secretory Proteins // Cell. 1989. - V. 57. - P. 10691072

32. Fukada, S., Shimada, Y., Morita, T., Sugiyama, K. Suppression of methionineinduced hyperhomocysteinemia by glycine and serine in rats // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2006. - V. 70. - P. 2403-2409

33. Galvin K.M., Shi Y. Multiple mechanisms of transcriptional repression by YY1 // Mol. Cell Biol. 1997. - V. 17. - № 7. - P. 3723-3732

34. Gess B., Hofbauer K.-H., Wenger R.H., Lohaus C., Meyer H.E.,Kurtz A. The cellular oxygen tension regulates expression of the endoplasmic oxidoreductase EROl-La // Eur. J. Biochem. 2003. - V. 270. - P. 2228-2235

35. Goldberg I J. Lipoprotein lipase and lipolysis: central roles in lipoprotein metabolism and atherogenesis // J. Lipid Res. 1996. - V. 37. - № 4. - P. 693707

36. Goldberger R.F., Epstein C.J. Characterization of the Active Product Obtained by Oxidation of Reduced Lysozyme // The Journal of Biologycal Chemistry. -1963. V. 238. - № 9. - P. 2988-2991

37. Goloubinoff P., De Los Rios P. The mechanism of Hsp70 chaperones: (entropic) pulling the models together // TRENDS in Biochemical Sciences. -2007. V. 32. - № 8. - P. 372-380

38. Gunn K.E., Gifford N.M., Mori K., Brewer J.W. A role for the unfolded protein response in optimizing antibody secretion // Mol. Immunol. 2004. -V. 41. -№9. - p. 919-927

39. Hansrani, M., Stansby, G., 2008. The use of an in vivo model to study the effects of hyperhomocysteinaemia on vascular function. J. Surg. Res. 145, 1318.

40. Harding H. P., Novoa I., Zhang Y., Zeng H., Wek R., Schapira M., Ron D. Regulated Translation Initiation Controls Stress-Induced Gene Expression in Mammalian Cells // Molecular Cell. 2000. - V. 6. - P. 1099-1108

41. Harding H.P., Zhang Y., Bertolotti A., Zeng H., Ron D. Perk Is Essential for Translational Regulation and Cell Survival during the Unfolded Protein Response // Molecular Cell. 2000. - V. 5. - P. 897-904

42. Harding H.P., Zhang Y., Ron D. Protein translation and folding are coupled by an endoplasmic-reticulumresident kinase // Nature. 1999. - V. 397. - P. 271-274

43. Hartl F.U., Hayer-Hartl M. Converging concepts of protein folding in vitro and in vivo // Nature Structural and Molecular Biology. 2009. - V. 16. - № 6.-P. 574-581

44. Hashimoto T., Shinohara Y., Hasegawa H. Homocysteine metabolism // The Pharmaceutical Society of Japan. 2007. - V. 127. - № 10. - P. 1579-1592

45. Hetz C. The unfolded protein response: controlling cell fate decisions under ER stress and beyond // Nature Reviews. 2012. - V. 3. - P. 89-102

46. Hirao A., Kong Y.Y., Matsuoka S., Wakeham A., Ruland J., Yoshida H., Liu D., Elledge S.J., Mak T.W. DNA damage-induced activation of p53 by the checkpoint kinase Chk2 // Science. 2000. - V. 287. - № 5459. - P. 1824-1827

47. Hirota M., Kitagaki M., Itagaki H. and Aiba S. Quantitative measurement of spliced XBP1 mRNA as an indicator of endoplasmic reticulum stress // The Journal of Toxicological Sciences. 2006. - V. 31. - № 2. - P. 149-156

48. Hitomi J., Katayama T., Taniguchi M., Honda A., Imaizumi K., Tohyama M. Apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress depends on activation of caspase-3 via caspase-12 // Neuroscience Letters. 2003. - V. 357. - P. 127130

49. Hollien J., Lin J.H., Li H., Stevens N., Walter P., Weissman J.S. Regulated Ire 1-dependent decay of messenger RNAs in mammalian cells // J. Cell Biol.2009. V. 186. - № 3. - P. 323-331

50. Hollien J., Weissman J.S. Decay of Endoplasmic Reticulum-Localized mRNAs During the Unfolded Protein Response // Science. 2006. - V. 313.-P. 104-107

51. Hosokawa N., Wada I., Hasegawa K., Yorihuzi Т., Tremblay L.O., Herscovics A., Nagata K. A novel ER a-mannosidase-like protein accelerates ER-associated degradation // EMBO reports. 2001. - V. 21. - № 51. - P. 4215-4221

52. Hunt M.J., Tyagi S.C. Peroxisome proliferators compete and ameliorate Hcy-mediated endocardial endothelial cell activation // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2002. - V. 283. - № 4. - P. 1073-1079

53. Ingram A.J., Krepinsky J.C., James L., Austin R.C., Tang D., Salapatek A.M., Thai K., Scholey J.W. Activation of mesangial cell МАРК in response to homocysteine // Kidney Int. 2004. - V. 66. - № 2. - P. 733-745

54. Jakubowski H. Pathophysiological consequences of homocysteine excess // J. Nutr. 2006. - V. 136. - № 6. - P. 1741S-1749S

55. Ji C., Kaplowitz N. Hyperhomocysteinemia, endoplasmic reticulum stress, and alcoholic liver injury // World J. Gastroenterol. 2004. - V. 10. - № 12. -P. 1699-1708

56. Jia F., Wu C., Chen Z., Lu G. Atorvastatin Inhibits Homocysteine-Induced Endoplasmic Reticulum Stress through Activation of AMP-Activated Protein Kinase // Cardiovascular Therapeutics. 2011. - P. 1-9

57. Juin P., Hueber A.O., Littlewood T., Evan G. c-Myc-induced sensitization to apoptosis is mediated through cytochrome c release // Genes Dev. 1999. - V. 13.-№ 11.-P. 1367-1381

58. Kawai T., Fan J., Mazan-Mamczarz K., Gorospe M. // Global mRNA stabilization preferentially linked to translational repression during the endoplasmic reticulum stress response // Mol. Cell Biol. 2004. - V. 24. - № 15.-P. 6773-6787

59. Klefstrom J., Verschuren E.W., Evan G. c-Myc augments the apoptotic activity of cytosolic death receptor signaling proteins by engaging the mitochondrial apoptotic pathway // J. Biol. Chem. 2002. - V. 277. - № 45. -P. 43224-43232

60. Kokame K., Agarwala K.L., Kato H., Miyata T. Herp, a New Ubiquitin-like Membrane Protein Induced by Endoplasmic Reticulum Stress // J. Biol. Chem. 2000. - V. 275. - № 42. - P. 32846-32853

61. Kokame K., Kato H., Miyata T. Homocysteine-respondent genes in vascular endothelial cells identified by differential display analysis. GRP78/BiP and novel genes // J. Biol. Chem. 1996. - V. 271. - № 47. - P. 29659-29665

62. Kokame K., Kato H., Miyata T. Nonradioactive Differential Display Cloning of Genes Induced by Homocysteine in Vascular Endothelial Cells // Methods.- 1998. V. 16. - № 4. - P. 434-443

63. Korennykh A.V., Korostelev A.A., Egea P.F., Finer-Moore J., Stroud R.M., Zhang C., Shokat K.M., Walter P. Structural and functional basis for RNA cleavage by Irel // BMC Biology. 2011. - V. 9. - P. 47

64. Kramer K., Harrington E.O., Lu Q., Bellas R., Newton J., Sheahan K.L., Rounds S. Isoprenylcysteine carboxyl methyltransferase activity modulates endothelial cell apoptosis // Mol. Biol. Cell. 2003. - V. 14. - № 3. - P. 848857

65. Kultz D. Evolution of the cellular stress proteome: from monophyletic origin to ubiquitous function // The Journal of Experimental Biology. 2003. - V. 206. - P. 3119-3124

66. Kyriakis J.M. Life-or-death decisions // Nature. 2001. - V. 414. - № 6861. -P. 265-266

67. Laboissiere M.C.A., Sturley S.L., Raines R.T. The Essential Function of Protein-disulfide Isomerase Is to Unscramble Non-native Disulfide Bonds // The Journal of Biologycal Chemistry. 1995. - V. 270. - № 47. - P. 2800628009

68. Lee A.-H., Iwakoshi N.N., Glimcher L.H. XBP-1 Regulates a Subset of Endoplasmic Reticulum Resident Chaperone Genes in the Unfolded Protein Response // Mol. Cell Biol. 2003. - V. 21. - P. 7448-7459

69. Lee S.J., Lee H.K. Sanguiin H-6 blocks endothelial cell growth through inhibition of VEGF binding to VEGF receptor // Arch. Pharm. Res. 2005. -V. 28. -№ 11. - P. 1270-1274

70. Lekstrom-Himes J., Xanthopoulos K.G. Biological Role of the CCAAT/Enhancer-binding Protein Family of Transcription Factors // The Journal of Biological Chimistry. 1998. - V. 273. - № 44. - P. 28545-28548

71. Li J., Lee B., Lee A.S. Endoplasmic Reticulum Stress-induced Apoptosis. Multiple pathways and activation of p53-up-regulated modulator of apoptosis (PUMA) and NOXA by p53 // The Journal Of Biological Chemistry. 2006. -V. 281. -№ 11. - P. 7260-7270

72. Li X., Zhang K., Li Z. Unfolded protein response in cancer: the Physician's perspective // Journal of Hematology and Oncology. 2011. - V. 4. - № 8. - P. 1-10

73. Livak K.J. and Schmittgen T.D. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2"DDCt Method // Methods. 2001. . V. 4. p. 402-408

74. Matsumoto T., Claesson-Welsh L. VEGF receptor signal transduction // Sci STKE. 2001. - V. 2001. -№ 112.-P. 21.

75. McKeever M.P., Weir D.G., Molloy A., Scott J.M. Betaine-homocysteine methyltransferase: organ distribution in man, pig and rat and subcellular distribution in the rat // Clin. Sci. (Lond). 1991. - V. 81. - № 4. - P. 551-556.

76. Merksamer P.I. and Papa F.R. The UPR and cell fate at a glance // Journal of Cell Science. 2010. - V. 1. - P. 1003-1006

77. Mudd S.H., Poole J.R. Labile methyl balances for normal humans on various dietary regimens // Metabolism. 1975. - V. 24. - № 6. - P. 721-735

78. Nadanaka S., Okada T., Yoshida H., Mori K. Role of Disulfide Bridges

79. Formed in the Luminal Domain of ATF6 in Sensing Endoplasmic Reticulum

80. Stress // Mol. Cell Biol. 2007. - V. 27. - № 3. p. 1027-1043

81. Nishitoh H., Saitoh M., Mochida Y., Takeda K., Nakano H., Rothe M., Miyazono K., Ichijo H. ASK1 is essential for JNK/SAPK activation by TRAF2 // Mol Cell. 1998. - V. 2. - № 3. - P. 389-395

82. Novoa I., Zeng H., Harding H.P., Ron D. Feedback Inhibition of the Unfolded Protein Response by GADD34-mediated Dephosphorylation of eIF2a // The Journal of Cell Biology. -2001. V. 153. -№ 5. - P. 1011-1021

83. Ogle J.M., Ramakrishnan V. Structural insights into translational fidelity // Annu. Rev. Biochem. 2005. - V. 74. P. 129-177

84. Ohoka N., Hattori T., Kitagawa M., Onozaki K., and Hayashi H. Critical and Functional Regulation of CHOP (C/EBP Homologous Protein) through the N-terminal Portion // The Journal of Biological Chemystry. 2007. - V. - 282. -№ 49. - P. 35687-35694

85. Ohoka N., Yoshii S., Hattori T., Onozaki K. and Hayashi H. TRB3, a novel ER stress-inducible gene, is induced via ATF4-CHOP pathway and is involved in cell death // The EMBO Journal. 2005. - V. 24. - P. 1243-1255

86. Oikawa D., Kimata Y., Kohno K., Iwawaki T. Activation of mammalian

87. E 1 alpha upon ER stress depends on dissociation of BiP rather than on direct interaction with unfolded proteins // Exp. Cell Res. 2009. - V. 315. - № 15. -P. 2496-2504

88. Ord T., Ord D., Koivomagi M., Juhkam K., Ord T. Human TRB3 is upregulated in stressed cells by the induction of translationally efficient mRNA containing a truncated 5'-UTR // Gene. 2009. - V. 444. - № 1-2. - P. 24-32

89. Outinen P.A., Sood S.K., Liaw P.C.Y., Sarge K.D., Maeda N., Hirsh J., Ribau J., Podor T.J., Weitz J.I., Austin R.C. Characterization of the stress-inducing effects of homocysteine // Biochem. J. 1998. - V. 332. - P. 213-221

90. Oyadomari S., Mori M. Roles of CHOP/GADD153 in endoplasmic reticulum stress // Cell Death and Differentiation (2004) 11, 381-389

91. Park S.H., Blackstone C. Further assembly required: construction and dynamics of the endoplasmic reticulum network // EMBO reports. 2012. - V. 11. -№ 7. - P. 515-521

92. Pavlova N., Cherkasova K., Rudko I., Romanova E., Kubatiev A. Effects of Hyperhomocysteinemia on the Anticoagulant System and Platelet Function Under Stress // Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2005. - V. 3. -Suppl. 1

93. Pavlova N., Cherkasova K., Rudko I., Romanova E., Kubatiev A. Stress-induced platelet activation in hyperhomocysteinemic rats // Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2005. - V. 3. - Suppl. 1

94. Perna, A.F., Ingrosso, D., Galletti, P., Zappia, V., De Santo, N.G. Membraneprotein damage and methylation reactions in chronic renal failure // Kidney Int. 1996.-V. 50.-P. 358-366

95. Prinz W.A., Grzyb L., Veenhuis M., Kahana J.A., Silver P.A., Rapoport T.A. Mutants Affecting the Structure of the Cortical Endoplasmic Reticulum in Saccharomyces cerevisiae II The Journal of Cell Biology. 2000. - V. 150. -№3. - P. 461-474

96. Pollard M.G., Travers K.J., Weissman J.S. Erolp: A Novel and Ubiquitous Protein with an Essential Role in Oxidative Protein Folding in the Endoplasmic Reticulum // Molecular Cell. 1998. - V. 1. - P. 171-182

97. Reimold A.M., Iwakoshi N.N., Manis J., Vallabhajosyula P., Szomolanyi-Tsuda E., Gravallese E.M., Friend D., Grusby M.J., Alt F., Glimcher L.H. Plasma cell differentiation requires the transcription factor XBP-1 // Nature. 2001 Jul 19;412(6844):300-7.

98. Rodriguez F., Arsene-Ploetze F., Rist W., Rudiger S., Schneider-Mergener J., Mayer M.P., Bukau B. Molecular Basis for Regulation of the Heat Shock Transcription Factor a by the DnaK and DnaJ Chaperones // Molecular Cell. -2008. -V. 32. P. 347-358

99. Rolls M.M., Hall D.H., Victor M., Stelzer E.H.K., Rapoport T.A. Targeting of Rough Endoplasmic Reticulum Membrane Proteins and Ribosomes in Invertebrate Neurons // Molecular Biology of the Cell. 2002. - V. 13. - P. 1778-1791

100. Ron D., Habener J.F. CHOP, a novel developmentally regulated nuclear protein that aimerizes with transcription factors C/EBP and LAP and functions as a dominantnegative inhibitor of gene transcription // Genes Dev. 1992. -V. 6. - P. 439-453

101. Ron D., Walter P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response // Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2007. - V. 5. -P. 1-11

102. Rosenberger F.R., Hilton J. The Frequency of Transcriptional and Translational Errors at Nonsense Codons in the lacZ Gene of Escherichia coli II Mol Gen Genet. 1983. - V. 191. - P. 207-212

103. Rutkowski D.T., Hegde R.S. Regulation of basal cellular physiology by the homeostatic unfolded protein response // J. Cell Biol. V. 189. - № 5. - P. 783-794

104. Shen J., Chen X., Hendershot L., Prywes R. ER Stress Regulation of ATF6 Localization by Dissociation of BiP/GRP78 Binding and Unmasking of Golgi Localization Signals // Developmental Cell. 2002. - V. 3. - № 1. - P. 99-111

105. Shen J., Snapp E.L., Lippincott-Schwartz J., Prywes R. Stable Binding of ATF6 to BiP in the Endoplasmic Reticulum Stress Response // Molecular and Cellular Biology. 2005. - V. - 25. - № 3. - P. 921-932

106. Sidrauski C., Walter P. The Transmembrane Kinase Irelp Is a Site-Specific Endonuclease That Initiates mRNA Splicing in the Unfolded Protein Response//Cell. 1997.-V. 90. - P. 1031-1039

107. Schindler A.J., Schekman R. In vitro reconstitution of ER-stress induced ATF6 transport in COPII vesicles // Proc. of the Nat. Acad, of Sei. of the USA. 2009. - V. 106. - № 42. - P. 17775-17780

108. Schroder M., Kaufman R.J. ER stress and the unfolded protein response // Mutation Research. 2005. - V. 569. -P. 29-63

109. Schroder M., Kaufman R.J. The mammalian unfolded protein response // Annu. Rev. Biochem. 2005. - V. 74. - P. 739-89

110. Snapp E. Design and Use of Fluorescent Fusion Proteins in Cell Biology // Curr Protoc Cell Biol. Author manuscript. 2010

111. Stevens F.J. and Argon Y. "Protein folding in the ER", seminars in CELL & DEVELOPMENTAL BIOLOGY, Vol 10, 1999: pp. 443-454

112. Subramanian K., Meyer T. Calcium-Induced Restructuring of Nuclear Envelope and Endoplasmic Reticulum Calcium Stores // Cell. 1997. - V. 89. -P. 963-971

113. Suzuki Y.J., Lorenzi M.V., Shi S.S., Day R.M., Blumberg J.B. Homocysteine exerts cell type-specific inhibition of AP-1 transcription factor // Free Radic. Biol. Med. 2000. - V. 28. - № 1. - P. 39-45

114. Svardal A., Refsum H., Ueland P.M. Determination of in vivo protein binding of homocysteine and its relation to free homocysteine in the liver and other tissues of the rat // J. Biol. Chem. 1986. - V. 261. - № 7. - P. 3156-3163

115. Szegezdi E., Logue S.E., Gorman A.M., Samali A. Mediators of endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis // EMBO reports. 2006. - V. 7. - P. 880885

116. Takayanagi S., Fukuda R., Takeuchi Y., Tsukada S., Yoshida K. Gene regulatory network of unfolded protein response genes in endoplasmic reticulum stress // Cell Stress and Chaperones, 2012

117. Tan H., Jiang X., Yang F., Li Z., Liao D., Trial J., Magera M.J., Durante W., Yang X., Wang H. Hyperhomocysteinemia inhibits post-injury reendothelialization in mice // Cardiovasc. Res. 2006. - V. 69. - № 1. - P. 253-262

118. Tate G., Kishimoto K., Hirayama Y., Suzuki T., Mitsuya T. A novel missense mutation of the XBP1 gene in diffuse large B-cell lymphoma // Cancer Genet Cytogenet. 2009. - V. 190. - № 2. - P. 131-133

119. Terasaki M. Dynamics of the Endoplasmic Reticulum and Golgi Apparatus during Early Sea Urchin Development // Molecular Biology of the Cell. -2000. -V. 11. P. 897-914

120. Terasaki M., Slater N.T., Fein A., Schmidek A., Reese T.S. Continuous network of endoplasmic reticulum in cerebellar Purkinje neurons // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - V. 91. - P. 7510-7514

121. Todd D.J., Lee A.-H., Glimcher L.H. The endoplasmic reticulum stress response in immunity and autoimmunity // Nat. Rev. Immunol. 2008. - V. 8.- № 9. P. 663-674

122. Travers K.J., Patil C.K., Wodicka L., Lockhart D.J., Weissman J.S., Walter P. Functional and Genomic Analyses Reveal an Essential Coordination between the Unfolded Protein Response and ER-Associated Degradation // Cell. -2000.-V. 101. P. 249-258

123. Troen, A.M., Lutgens, E., Smith, D.E., Rosenberg, I.H., Selhub, J. The atherogenic effect of excess methionine intake // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.- 2003. V. 100. - P. 15089-15094

124. Tu B.P., Weissman J.S. The FAD- and (VDependent Reaction Cycle of Erol-Mediated Oxidative Protein Folding in the Endoplasmic Reticulum // Molecular Cell. 2002. - V. 10. - P. 983-994

125. Undas A., Brozek J., Jankowski M., Siudak Z., Szczeklik A., Jakubowski H. Plasma homocysteine affects fibrin clot permeability and resistance to lysis inhuman subjects // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2006. - V. 26. - № 6. -P. 1397-1404

126. Vandesompele J., de Preter K., Pattyn F., Poppe B., van Roy N., de Paepe A., Speleman F. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes // Genome Biol. -2002.-V. 3.-№7.

127. Vattem K.M., Wek R.C. Reinitiation involving upstream ORFs regulates ATF4 mRNA translation in mammalian cells // PNAS. 2004. - V. 101. - № 31. - P. 11269-11274

128. Verkhratsky A. The endoplasmic reticulum and neuronal calcium signalling // Cell Calcium. 2002. V. - 32. - № 5-6. - P. 393-404

129. Voeltz G.K., Rolls M.M., Rapoport T.A. Structural organization of the endoplasmic reticulum // EMBO reports. 2002. - V. 3. - № 10. - P. 944-950

130. Wek R.C., Jiang H.-Y., Anthony T.G. Coping with stress: eIF2 kinases and translational control // Biochem. Soc. Trans. 2006. - V. 34. - P. 7-11

131. Wiest D.L., Burkhardt J.K., Hester S., Hortsch M., Meyer D.I., Argon Y.

132. Membrane Biogenesis during B Cell Differentiation: Most Endoplasmic

133. Reticulum Proteins Are Expressed Coordinately // The Journal of Cell

134. Biology. 1990. - V. 110.-P. 1501-1511

135. Woehlbier U., Hetz C. Modulating stress responses by the UPRosome: amatter of life and death // Trends Biochem. Sei. 2011. - V. 36. - № 6. - P.329.337

136. Wong M.L., Medrano J.F. Real-time PCR for mRNA quantitation //

137. BioTechniques. 2005. - V. 39. - P. 75-85

138. Woo C.W., Siow Y.L., Pierce G.N., Choy P.C., Minuk G.Y., Mymin D., O K.

139. Hyperhomocysteinemia induces hepatic cholesterol biosynthesis and lipidaccumulation via activation of transcription factors // Am. J. Physiol.

140. Endocrinol. Metab. 2005. - V. 288. - № 5. - P. El002-1010

141. Wu J., Kaufman R.J. From acute ER stress to physiological roles of the

142. Unfolded Protein Response // Cell Death and Differentiation. 2006. - V. 13.1. P. 374-384

143. Ye J., Rawson R.B., Komuro R., Chen X., Dave' U.P., Prywes R., Brown

144. M.S., Goldstein J.L. ER stress induces cleavage of Membrane-Bound ATF6by the Same Proteases that Process SREBPs // Molecular Cell. 2000. - V. 6.-P. 1355-1364

145. Yoneda T., Imaizumi K., Oono K., Yui D., Gomi F., Katayama T., Tohyama

146. M. Activation of caspase-12, an endoplastic reticulum (ER) resident caspase,through tumor necrosis factor receptor-associated factor 2-dependentmechanism in response to the ER stress // J. Biol. Chem. 2001. - V. 276. - №17.-P. 13935-13940

147. Yoshida H., Matsui T., Yamamoto A., Okada T., Mori K. XBP1 mRNA Is Induced by ATF6 and Spliced by IRE1 in Response to ER Stress to Produce a Highly Active Transcription Factor // Cell. 2001. - V. 107. - P. 881-891

148. Yoshida H, Oku M., Suzuki M., Mori K. pXBP 1 (U) encoded in XBP1 pre-mRNA negatively regulates unfolded protein response activator pXBPl(S) in mammalian ER stress response // The Journal of Cell Biology. 2006. - V. 172.-№4.-P. 565-575

149. Zhang K., Wong H.N., Song B., Miller C.N., Scheuner D., Kaufman R.J. The unfolded protein response sensor IRE la is required at 2 distinct steps in B cell lymphopoiesis // J. Clin. Invest. 2005. - V. 115. - P. 268-281

150. Zinszner H., Kuroda M., Wang X., Batchvarova N., Lightfoot R.T., Remotti H., Stevens J.L., Ron D. CHOP is implicated in programmed cell death in response to impaired function of the endoplasmic reticulum // Genes Dev. -1998. V. 12. - № 7. - P. 982-995