Изучение динамики митохондриального ретикулума при окислительном стрессе тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.25, кандидат биологических наук Непряхина, Ольга Константиновна

• Непряхина, Ольга Константиновна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Непряхина, Ольга Константиновна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Фрагментация и слияние митохондрии.

Белковый аппарат фрагментации митохондриального ретикулума.

Drpl - основной компонент аппарата фрагментации митохондрий.

Fisl - адапторная молекула.

Другие белки, участвующие в фрагментации митохондрий.

Механизм фрагментации митохондрий.

Белковый аппарат слияния митохондрий.

ОРА1 - белок внутренней мембраны митохондрий.

Митофузины Mfnl и Mfh2 - многофункциональные белки.

Фрагментация митохондрий при клеточном делении.

Фрагментация митохондрий при апоптозе.

Сигнальные механизмы, регулирующие фрагментацию митохондрий при апоптозе.

Фрагментация митохондрий и механизм выхода цитохрома С в цитоплазму при апоптозе.

Изменение структуры митохондриальных крист.

Пермеабилизация внешней митохондриальной мембраны.

Участие митохондриальной поры в процессе выхода цитохрома С из митохондрий.

Комплекс «митохондриальной поры» и фрагментация митохондрий.

Участие белков В ах и Bäk в пермеабилизации внешней мембраны митохондрий.

Взаимодействие Вах с белками аппарата фрагментации митохондри.

Участие Вс1-2 и Bcl-xL в пермеабилизации внешней мембраны и фрагментации митохондрий.

Фрагментация митохондриалыюго ретикулума при изменении уровня кальция внутри клетки.

Фрагментация митохондрии при окислительном стрессе.

Митохондриально-направленные антиоксиданты.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Реагенты.

Объект исследования.

Измерение продукции АФК методом проточной цитофлуориметрии.

Визуализация митохондрий и цитоскелета.

Анализ клеточного цикла.

Определение клеточной гибели.

Фракционирование клеток.

Метод «Western Blotting».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Окислительный стресс в клетках HeLa.

1.1. Пероксид водорода вызывает эндогенную продукцию АФК.

1.2.АФК, образующиеся в клетках, имеют митохондриальную природу.

1.3. Изменения цитоскелета при окислительном стрессе.

1.4. Клеточный цикл и гибель клеток при окислительном стрессе.

2. Изучение роли АФК в фрагментации митохондрий.

2.1. Окислительный стресс приводит к фрагментации митохондриального ретикулума.

2.2. АФК необходимы для фрагментации митохондрий при окислительном стрессе.

2.3. Фрагментацию митохондрий вызывают АФК митохондриального происхождения.

2.4. Фрагментация митохондрий при окислительном стрессе не сопровождается транслокацией белка Drp-1.

3. Изучение транслокации белка Вах при окислительном стрессе.

3.1. Митохондриальные АФК вызывают транслокацию Вах при окислительном стрессе.

3.2. Перераспределение Вах зависит от конформации переносчика адениновых нуклеотидов.

3.3. Ингибиторы циклоспорин-зависимой митохондриальной поры не предотвращают транслокацию Вах.

3.4. Транслокация Вах и фрагментация митохондрий могут происходить независимо друг от друга.

4. Влияние белка Вс1-2 на морфологию митохондрий и локализацию Вах при окислительном стрессе.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение динамики митохондриального ретикулума при окислительном стрессе»

Митохондриальный ретикулум является динамической системой энергообеспечения клетки. Для выполнения множества разнообразных функций он претерпевает постоянные морфологические перестройки: фрагментацию и слияние. Фрагментация митохондрий происходит при различных клеточных процессах: делении клетки, изменении условий среды, апоптозе или в ответ на различные внутриклеточные сигналы. Одним из таких сигналов служит изменение окислительно-восстановительного статуса клетки (окислительный стресс). Окислительный стресс сопровождается повышенной продукцией активных форм кислорода (АФК) и окислительным повреждением молекулярных компонентов клетки. Взаимоотношения между этими явлениями остаются не до конца выясненными, но, вероятно, большую роль при этом играет окислительное повреждение митохондрий, приводящее к усилению генерации АФК внутри этих органелл. Механизмы образования АФК митохондриями в условиях окислительного стресса до сих пор остаются не выясненными.

Изучение митохондриальной динамики занимает значительное место в современных научных исследованиях. Накоплен большой массив данных, описывающих механизм фрагментации митохондрий при апоптозе, известны основные белки, участвующие в этом процессе. Однако множество вопросов о роли различных компонентов белкового аппарата митохондриальной фрагментации до сих пор остаются открытыми. Неотъемлемой частью начальных этапов апоптоза является нарушение редокс-статуса клетки. Роль активных форм кислорода в фрагментации митохондрий на данный момент неизвестна, и ее исследование представляет большой научный интерес. Генетические нарушения в последовательностях ДНК, кодирующих белки, участвующие в фрагментации и слиянии митохондрий, приводят к развитию наследственных заболеваний, например синдрома Шарко-Мари-Тут. Окислительный стресс, сопровождающийся повреждением митохондрий, является причиной многих серьезных патологий, в частности инфарктов, инсультов. Патофизиология многих нейродегенеративных заболеваний также связана с окислительным стрессом, например, болезни Альцгеймера, Паркинсона. Изучение механизма фрагментации митохондрий при окислительном стрессе позволит разработать более эффективные методы борьбы с этими заболеваниями.

Цель и задачи работы

Целью данной работы было исследование фрагментации митохондрий при окислительном стрессе, не приводящем к гибели клеток. Были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать вторичную продукцию АФК при окислительном стрессе. Используя ингибиторы дыхания и митохондриально-направленные антиоксиданты, выяснить роль митохондрий в этом процессе.

2. Изучить роль АФК, образующихся в митохондриях, в фрагментации митохондриального ретикулума.

3. Исследовать роль белка Огр-1 в фрагментации митохондрий при окислительном стрессе.

4. Проанализировать изменение распределения белка Вах в клетке при окислительном стрессе и роль в этом процессе митохондриальных АФК.

5. Изучить взаимосвязь фрагментации митохондрий и транслокации белка Вах из цитоплазмы на внешнюю мембрану митохондрий.

Обзор литературы

Фрагментация и слияние митохондрий

В клетках эукариот митохондрии являются динамичной структурой. Отдельные митохондрии находятся в постоянном движении, они могут разделяться и сливаться друг с другом. Во многих клетках митохондрии ассоциированы в единую сеть, которая в 1978 году получила название «reticulum mitochondriale» [1]. В этой работе В.П. Скулачев выдвинул гипотезу о том, что митохондриальный ретикулум внутри клетки функционирует как единый электрический кабель. Благодаря этому в миофибриллах наблюдается разделение функций между органеллами на периферии и в центральной области клетки. Области митохондриального ретикулума, расположенные возле цитоплазматической мембраны, в основном, обеспечивают образование Ац(Н+) за счет дыхания, а митохондрии, расположенные около ядра, используют Ац(Н+) для образования АТФ. Такое разделение функций в пространстве может играть дополнительную защитную роль: поглощение кислорода в периферических областях приводит к снижению окислительной нагрузки на генетический аппарат клетки. Также изменения мембранного потенциала, концентрации кальция и других веществ, распространяющиеся по всей длине митохондриального ретикулума, играют важную роль в передаче различных сигналов внутри клетки. (Обзор см. [2])

Митохондриальный ретикулум способен претерпевать морфологические изменения в ответ на различные сигналы, сам термин «митохондрия» в переводе с греческого означает «нить-зерно». Фрагментация митохондриального ретикулума с образованием множества мелких шарообразных органелл необходима для разделения митохондрий между дочерними клетками при делении, а также происходит при гибели клеток и в ответ на различные изменения клеточного гомеостаза, вызванные внутренними или внешними сигналами. (Обзор см. [3]). Предполагают, что фрагментация митохондрий обеспечивает также защитную функцию. При деполяризации участка митохондриального ретикулума снижение мембранного потенциала затрагивает обширный участок органеллы. При фрагментации митохондрий функциональные нарушения одной из органелл не распространяются на соседние. Известно также, что такие «поврежденные» митохондрии могут удаляться из клеток путем аутофагии или выбрасывания из клетки [2].

Белковый аппарат фрагментации митохондриального ретикулума

Ргр! - основной компонент аппарата фрагментации митохондрий

Изучение аппарата фрагментации и слияния митохондрий было начато на дрожжах, БасНаготусез сегеуша и ЗЫгоБасИаготусеБ ротЬе. На данный момент идентифицировано несколько белков, участвующих в фрагментации митохондрий дрожжей. Все они относятся к группе малых ГТФаз, т.е. имеют небольшую молекулярную массу и осуществляют свои функции за счет энергии гидролиза ГТФ. Первый из этих белков, Впш1р, по аминокислотной последовательности гомологичен динамину, который обеспечивает образование перетяжки на мембране при отделении эндоцитозных везикул. Было показано, что Опш1р может образовывать олигомеры и локализован в клетках в виде точечных структур. В дрожжах с делецией по этому белку митохондриальный ретикулум слит в единую сеть. При реэкспресии в таких клетках Впш1р морфология митохондрий восстанавливается. Варианты Опш1р, содержащие точечные мутации в ГТФазном домене, или вообще без этого домена, не способны восстанавливать нормальную морфологию митохондрий. [4]

В 1997 году был найден гомолог Опш1р в клетках млекопитающих. В разных группах он был назван по-разному: Бгр1 [5, 6], БЬР1 [7], Бутр1е

8], ОУЬР [9]. Было обнаружено, что он имеет высокую степень гомологии с белком динамином. На этом основании исходно предполагали, что он играет важную роль в эндоцитозе или внеклеточной секреции. В подтверждение этому было показано, что в клетке Огр1 в основном расположен в точечных образованиях, ассоциированных с внутриклеточными структурами: ЭПР, микротрубочками и митохондриями. Однако мутации в его ГТФазном домене не приводили к нарушениям транспорта в ЭПР, а обработка культуры клеток брефельдином А, ингибитором везикулярного транспорта, не влияла на локализацию Бф1 в клетке. На основании этих данных гипотеза об участии Огр1 в эндоцитозе была отвергнута. [10].

Участие Бгр1 в фрагментации митохондрий было подтверждено экспериментами с гиперэкспрессией различных вариантов данного белка. При гиперэксперссии доминант-негативного варианта Огр1, не способного гидролизовать ГТФ (замена К38А), митохондрии приобретали удлиненную трубчатую форму единой разветвленной сети, и часто концентрировались в перинуклеарной области. Морфология других органелл при этом не изменялась. [11] Аналогичные результаты были получены и методом РНК-интерференции. [12]

Предполагают, что Огр1, как и гомологичный ему белок динамин, обеспечивают образование перетяжки и физическое разделение мембран митохондрий при делении. Подтверждает эту гипотезу ряд фактов. Во-первых, Бгр1 был обнаружен в клетке на концах митохондрий, а также в локусах, в которых затем происходит разделение митохондрий. Было показано, что Бгр-1 находится в динамическом равновесии между сайтами на внешней мембране митохондрий и цитоплазмой. После индукции фрагментации митохондрий миграция Огр-1 прекращается, и белок полностью стабилизируется на мембране. [13] Во-вторых, для дрожжевого белка Бпш1р было показано, что в присутствии ГТФ этот белок самопроизвольно образует спиралевидные структуры. В растворе, а также в присутствии липосом, эти спирали формируют комплексы, по диаметру совпадающие с областями перешнуровки митохондрий. [14]

- адапторная молекула Как на дрожжах, так и на клетках млекопитающих был идентифицирован еще один белок, принимающий участие в фрагментации митохондрий - Е1з1рЛгР1з1. Этот белок так же, как и Огр1, способен гидролизовать ГТФ, но, в отличие от него, равномерно распределен по внешней мембране митохондрий. С-конец и его трансмембранный домен необходимы для локализации в мембране, а И-конец может быть связан с ОГР. Было обнаружено, что данный белок существует в мембране митохондрий в форме олигомеров. [15] Как и для Огр1, участие Р1з1 в фрагментации митохондрий было подтверждено экспериментами с РНК-интерференцией и гиперэкспрессией доминант-негативных мутантных форм белка, в которых наблюдали образование характерной слитной митохондриальной сети. Гиперэкспрессия в таких клетках Г1б1 без мутаций стимулировала фрагментацию митохондрий. Важно отметить, что в этом случае гиперэкспрессия доминант-негативного Огр1К38А восстанавливала морфологию митохондрий, правда, подавление было неполным. [16] Методом резонансного переноса энергии флуоресценции и иммунопреципитации было показано, что Р1з1 способен напрямую связываться с Вгр1. [17] Оказалось, что способность ЬР1з1 к олигомеризации значительно влияет на его способность связывать Огр1. Гиперэкспрессия мутантных форм этого белка, не способных к образованию олигомеров, практически не вызывала фрагментации митохондрий. [18] Предполагают, что он служит адапторной молекулой, обеспечивающей связь эффекторных белков, в частности Бгр1, с внешней мембраной митохондрий.

Другие белки, участвующие в фрагментации митохондрий

Помимо основных белков, роль которых в фрагментации митохондрий исследована уже достаточно хорошо, были обнаружены и другие белки, влияющие на митохондриальную морфологию. В клетках дрожжей известно два таких белка. Первый из них, Мс1у1р, является белком внешней мембраны митохондрий и образует в ней олигомеры. Этот белок способен связываться как с Опт1р, так и с Р1з1р. Предполагают, что он служит адапторной молекулой, опосредующей взаимодействие Впш1р и ^р. [19, 20] Был также обнаружен еще один белок, связывающийся с Бпш1р и 1р, Caf4p, однако, делеция по кодирующему его гену не привела к значительному изменению морфологии митохондрий. Возможной ролью данного белка является, совместно с МсМр, привлечение Опш1р на митохондриальную мембрану.[21] В клетках млекопитающих гомологов данных белков на данный момент не найдено.

При изучении Р13-сигналлинга в клетках НаСаТ был обнаружен новый белок МТР18. Было показано, что он расположен во внутренней мембране митохондрий. Увеличение количества данного белка приводит к фрагментации митохондриального ретикулума, а снижение - к слиянию. Этот белок напрямую не взаимодействует ни с Бгр1, ни с . Однако в клетках, гиперэкспрессирующих 1, снижение количества МТР18 ингибировало фрагментацию митохондрий. Таким образом, вероятно, МТР18 каким-то образом опосредует взаимодействие Бгр1 и [22] Был также обнаружен белок снижение экспрессии которого также приводит к слиянию митохондриального ретикулума. Этот белок не взаимодействует с Огр1 или Р1з1 и расположен во внешней мембране митохондрий. Его роль в фрагментации митохондрий также неизвестна. [23]

Механизм фрагментации митохондрий

Итак, на данный момент известно, что в фрагментации митохондрий участвуют Бгр1 и Р1з1. Бгр1 в норме расположен в цитоплазме клетки, а также ассоциирован с локусами на внешней мембране митохондрий. Р1з1 равномерно распределен по мембране митохондрий.

Одним из самых ранних событий в процессе фрагментации митохондриального ретикулума является транслокация Огр1 на мембрану митохондрий из цитоплазмы клетки. Предполагают, что на мембране он связывается с Р1з1. Что обеспечивает точечное распределение Бгр1 на мембране, на данный момент неизвестно.

Изменение морфологии митохондрий начинается с образования перетяжки (схему см. рис. 1) за счет Огр1, опоясывающего митохондрию. Затем, благодаря энергии гидролиза ГТФ, по-видимому, происходит сокращение этого кольца, что приводит к разделению митохондрий. После фрагментации комплекс Огр1 остается связан с одной из разделившихся органелл, а затем диссоциирует в цитоплазму. [24] Каким образом фрагментация внешней мембраны митохондрий синхронизируется с фрагментацией внутренней, неизвестно, предполагают, что в этом процессе какую-то роль играет эндофилин В1. Данный белок способен модифицировать фосфолипиды, и тем самым обеспечивать необходимую кривизну мембране для отделения везикул друг от друга. КагЬолузк! с

5з

0ф1о ^ о о V,,

3 3 а

Образование ^ ^^Транслокация перетижки^г Огр1 за. ^-^Лк. о о А "\

Г 33 2

О о

Сокращение белков, гидролиз ГТФ о Г \ Й ""><=>

1 зз

Рисунок 1. Схема фрагментации митохондрий эукариот. Приводится по [24] с изменениями. коллегами обнаружили, что снижение экспрессии эндофилина В1 приводит к изменению морфологии митохондриального ретикулума. В культуре, гиперэкспрессирующей интерферирующую РНК к последовательности, кодирующей эндофилин В1, авторы обнаружили клетки, в которых присутствует внешняя мембрана, но не митохондриальный матрикс. Таким образом, они предполагают, что эндофилин В1 участвует в синхронизации фрагментации внешней и внутренней митохондриальных мембран. [25]

Белковый аппарат слияния митохондрий

Для поддержания морфологии митохондриального ретикулума помимо фрагментации необходимо также слияние митохондрий. Как в клетках дрожжей, так и у млекопитающих, работу обоих механизмов обеспечивают белки семейства малых ГТФаз. В организме человека мутации генов, кодирующих белки аппарата слияния митохондрий, приводят к развитию различных наследственных заболеваний.

ОРА1 - белок внутренней мембраны митохондрий

Мутация по гену, кодирующему белок ОРА1, является причиной доминантной оптической нейропатии, наследственного заболевания, приводящего к полной слепоте. ОРА1 локализован в митохондриях клеток млекопитающих и является гомологом белка дрожжей 1^т1р. [26] Его >1-конец необходим для заякоривания белка в мембране митохондрий. Изучение электронных микрофотографий, а также обработка митохондрий при различной кислотности среды позволило выяснить, что ОРА1 локализован во внутренней митохондриальной мембране, и обращен в межмембранное пространство. [27] Гиперэкспрессия ОРА1 в клетках, обладающих слитным митохондриальным ретикулумом, таких, как НеЬа, приводила к образованию больших кластеров, состоящих из слившихся митохондрий, сконцентрированных около ядра. В клетках, в которых митохондриальный ретикулум в норме представлен отдельными органеллами (мышиные эмбриональные фибробласты), гиперэкспрессия ОРА1 вызывала слияние митохондрий. Методом сайт-специфического мутагенеза были получены мутанты белка ОРА1, с помощью которых, а также с помощью РНК-интерференции, было показано, что морфология митохондрий определяется ГТФазной активностью данного белка, структурой его С-конца и количеством данного белка в клетке. [28] Нокаут ОРА1 с помощью РНК-интерференции вызывал фрагментацию митохондриального ретикулума в клетках НеЬа через 72 часа после трансфекции. [29] Было обнаружено, что ОРА1 существует в клетках млекопитающих в нескольких формах, определяющихся альтернативным сплайсингом кодирующей его мРНК. Различные варианты этого белка при гиперэкспрессии в клетках НеЬа по-разному влияли на морфологию и мембранный потенциал митохондрий. Было показано, что экспрессия форм ОРА1 органоспецифична. [30]

Помимо участия в фрагментации митохондрий было также обнаружено, что ОРА1 участвует в поддержании структуры крист внутренней мембраны митохондрий. Нокаут ОРА1 приводил к изменению структуры крист - они становились бесформенными, и между мембранами появлялось значительное пространство. Это сопровождалось протеолизом РАИР, выходом цитохрома С в цитоплазму и значительной клеточной гибелью. [29] Для поддержания структуры крист ОРА1 образует комплексы, которые при апоптозе протеолитически расщепляются, что и приводит к изменению структуры крист и высвобождению цитохрома С. [31]. ¥rezza и коллеги показали, что участие белка ОРА1 в слиянии митохондрий не связано с его функцией перестройки крист внутренней мембраны. В клетках, не содержащих митофузин 1 (еще один белок слияния митохондрий), гиперэкспрессия ОРА1 предотвращала выход цитохрома С в цитоплазму, вызванный ставроспорином или пероксидом водорода. Однако в таких клетках митохондрии были полностью фрагментированы. [31].

Митофузипы Mfnl и Mfn2 — многофункциональные белки Для поддержания морфологии митохондрий белок ОРА1 взаимодействует с другими белками аппарата сияния митохондрий, в частности, с Mini. [28] Белки Mini и Mfn2 являются гомологами белка Fzo дрозофилы и дрожжей. Они так же, как и белки Drpl, Fisl, обладают ГТФазной активностью. Мутации в генах, кодирующих данные белки, является причиной различных наследственных мышечных дистрофий. Изучение мышей, нокаутных по генам Mfnl/2 показало, что оба белка необходимы для эмбрионального развития и слияния митохондрий. Эти митофузины способны образовывать гомо- и гетеро-олигомеры для обеспечения слияния митохондриальных мембран. [32] Белки Mfnl/2 расположены на внешней митохондриальной мембране, частично сконцентрированы в определенных локусах, часть из которых содержит Drpl и Вах. [33] Заякоривание в митохондриальной мембране обеспечивают С-концы данных белков. Они содержат также домены типа «coiled-coil», которые способны взаимодействовать друг с другом. Это взаимодействие обеспечивает сближение митохондриальных мембран. [34] ГТФазная активность белка Mfn2 необходима для поддержания нормальной морфологии митохондрий. В клетках, в которых экспрессирован мутантный вариант, лишенный ГТФазной активности, митохондрии фрагментированы. Гиперэкспрессия Mihi приводила к образованию длинных митохондриальных структур, предположительно, из внешней митохондриальной мембраны. Морфология становилась нормальной при дополнительной экспрессии в данных клетках белка Mfn2. Эти данные указывают на совместное участие белков Mfnl/2 в поддержании морфологии митохондрий. [35] Аналогичный результат был получен и при исследовании клеток, содержащих мутации в одном или в обоих белках М£п1/2. Также было обнаружено, что при слиянии клеток, одна из которых является мутантной по обоим генам, а вторая — нормальная, слияния митохондрий не происходит. Это указывает на то, что для слияния митохондрий необходимо присутствие митофузинов на обеих сливающихся митохондриях. [36] Снижение экспрессии белков МЙ11/2 методом РНК-интерференции приводит к нарушению слияния митохондрий. [37]

Данные, полученные при изучении слияния митохондрий млекопитающих и дрожжей, позволяют утверждать, что белки МШ/2 обеспечивают сближение мембран соседних митохондрий друг с другом. С-концы белков, содержащие гидрофобные повторы, способны образовывать антипараллельную структуру типа «соПеё-соП», при чем во взаимодействии участвуют белки разных сближающихся митохондрий (схему см. рис. 2). Однако, такого сближения недостаточно для слияния. Предполагают, что дальнейшее слияние митохондриальных мембран включает конформационное изменение этих белков, энергетически поддерживаемое гидролизом ГТФ.

Рисунок 2. Механизм слияния митохондрий.

Белки Mfnl или М/п2 способны взаимодействовать друг с другом с образованием антипараллелъных спиралей типа «coiled coil». Приводится по [24].

Мкггохондрия

Белки Mfnl

OP*

Теоретически возможно два пути слияния митохондрий: с одновременным и раздельным слиянием внутренних и внешних мембран. Данные Ма1ка и коллег [38] указывают на то, что, по всей видимости, слияние внутренней мембраны митохондрий является отдельным событием, и может быть разделено во времени со слиянием внешней мембраны. Механизм слияния внутренней мембраны митохондрий на данный момент представляет собой загадку. Наиболее вероятным участником этого процесса представляется белок ОРА1, но как именно он участвует в слиянии митохондрий, на данный момент неизвестно. [24]

Помимо важнейшей роли в слиянии митохондрий митофузины также, по всей видимости, обладают и другими функциями. На клетках, не экспрессирующих Мйг1/2, было обнаружено, что нарушена не только морфология митохондрий, но и их подвижность. [37] Также предполагают, что наблюдаемые в этих клетках нарушения энергетического обмена (падение мембранного потенциала митохондрий, снижение скорости дыхания клеток и темпов размножения культуры) могут быть связаны не с ингибированием слияния, а с прямым действием митофузинов. Было обнаружено, что снижение количества белка Мйг2 в клетке приводит к нарушению окислительного фосфорилирования, в то время как гиперэкспрессия этого белка стимулировала экспрессию белков дыхательной цепи. [39] Было также показано, что МЙ12 регулирует пролиферацию гладкомышечных клеток эндотелия сосудов. Уровень экспрессии этого гена изменяется в ответ на различные нарушения обмена глюкозы (обзор см. [40]). Наконец, было показано, что МТп2 необходим для формирования контактов между митохондриями и эндоплазматическим ретикулумом. В клетках, не экспрессирующих данный белок, количество сайтов взаимодействия этих органелл было снижено. Это приводило к нарушению поступления кальция из ЭПР в митохондрии. [41] Эти данные указывают на возможный механизм нейродегенерации при заболевании Шарко-Мари-Тут IIa. Это наследственное заболевание, вызванное мутацией гена Mfn2. В свете новых данных предполагают, что патогенез заболевания связан с нарушением синаптической передачи, важную роль в которой играет взаимодействие ЭПР и митохондрий.

Таким образом, на настоящий момент уже накоплен достаточно большой массив знаний о слиянии митохондрий, состоящий из разрозненных разделов данных. Связь между этими разделами -механизмы взаимодействия белков Mfnl/2 и ОРА1 друг с другом, роль митофузинов в окислительном фосфорилировании, патология наследственных заболеваний, ассоциированных с мутациями в генах Mfnl/2 и Opal, механизм функционирования дополняющих друг друга белков Mfnl и Mfn2 - еще предстоит исследовать.

Фрагментация митохондрий при клеточном делении

Фрагментация или слияние митохондрий сопровождают все значительные события в жизни клетки. В частности, при делении необходимо обеспечить равномерное расхождение митохондрий в дочерние клетки. Для этого при подготовке к делению происходит фрагментация митохондриального ретикулума. На дрожжах было показано, что ни один из известных белков, участвующих в фрагментации митохондрий, не является необходимым для деления клеток. Однако нарушение фрагментации митохондрий приводит к образованию большого количества клеток, не содержащих митохондрии, которые вскоре гибнут. [42] В клетках млекопитающих фрагментация происходит в ранней митофазе, после чего отдельные митохондрии распределяются между дочерними клетками. Затем морфология митохондриального ретикулума восстанавливается. Необходимость для этого процесса белка Drpl позволяет предполагать, что, скорее всего, при делении клеток и апоптозе фрагментация митохондрий опосредована единым белковым аппаратом.

20

Гиперэкспрессия доминант-негативного Drpl, хотя и предотвращала дробление митохондрий, не нарушала нормальный ход митоза. Было также обнаружено, что белки, регулирующие клеточный цикл - циклин-зависимая киназа 1 и циклин В - фосфорилируют белок Drpl при митозе. Мутация по сайту фосфорилирования, серину 585, также не предотвращала деление клеток, несмотря на влияние на морфологию митохондрий. [43] Предполагагают, что фосфорилирование Drpl вызывает его переселение на мембрану митохондрий, что индуцирует процесс фрагментации митохондрий.

В общем, имеющиеся в литературе данные указывают на то, что нарушение фрагментации митохондриального ретикулума не приводят к остановке клеточного цикла.

Фрагментация митохондрий при апоптозе

Апоптоз является важным механизмом клеточной гибели, а, кроме того - удобной моделью для изучения многих белковых механизмов, путей передачи сигнала и других аспектов функционирования клетки. В 2001 году было обнаружено, что апоптоз клеток, вызываемый различными реагентами, такими как ставроспорин, этопозид, цисплатин, а так же гиперэкспрессией белков Вах и tBid, сопровождается фрагментацией митохондриального ретикулума. Гиперэкспрессия доминант-негативных вариантов к белкам, участвующим в фрагментации митохондрий Drpl и Fisl [11] и снижение их количеств в клетке методом РНК-интерференции [44, 45] предотвращали не только изменение морфологии митохондрий, но и гибель клеток, а также падение трансмембранного потенциала и выход цитохрома С. Как оказалось, важную роль в апоптозе играют и белки, участвующие в слиянии митохондрий. Было обнаружено, что снижение экспрессии белка ОРА1 повышает чувствительность клеток к апоптозу, вызванному актиномицином D. [45] К аналогичному эффекту также приводила экспрессия интерферирующих РНК к последовательностям,

21 кодирующим белки Mfnl/2. Гиперэкспрессия белка Fzo (аналога белков Mfnl/2 у крыс) в человеческих клетках, напротив, предотвращала гибель клеток, а также транслокацию Вах и выход цитохрома С. [46] В общем, стимуляция слияния митохондрий предотвращала развитие апоптоза, а манипуляции, приводящие к фрагментации митохондриального ретикулума, повышали чувствительность клеток к апоптозу.

Существуют системы, в которых фрагментация митохондриального ретикулума и гибель клеток не связаны друг с другом. Так, гиперэкспрессия Fisl вызывает быструю фрагментацию митохондрий, в то время как выход цитохрома С и последующая гибель клеток наблюдаются лишь через 16 часов после этого. [47] Кроме того, известно, что в клетках, не содержащих Вах и Bäk, митохондрии фрагментированы, несмотря на то, что они являются очень устойчивыми к апоптозу. [48] В присутствии пан-каспазного ингибитора zVAD-FMK апоптоз не развивается, в то время как фрагментация митохондрий проходит нормально. [46, 49] Sheridan и коллеги обнаружили, что гиперэкспрессия Вс1-2 подавляет апоптоз, вызванный Вах (механизм - см. ниже), но не влияет на фрагментацию митохондрий в этой системе. [50] Ингибирование фрагментации митохондрий путем понижения экспрессии Drpl не предотвращало выход из митохондрий эффекторных проапоптозных белков Smac/DIABLO, Omi/HtrA2, АК2 и DDP/TIMM8a, несмотря на то, что выход цитохрома С был нарушен. [51, 52] Аналогичные результаты были получены и на мутантных по белкам аппарата слияния или фрагментации эмбрионах С. elegans. [53] Таким образом, все описанные данные свидетельствуют о том, что фрагментация митохондрий не является событием, необходимым для гибели клеток апоптотическим путем. Однако, существуют данные, указывающие на то, что белки, участвующие в фрагментации или слиянии митохондрий, могут иметь какие-то дополнительные функции, связанные с апоптозом. Так, Breckenridge и коллеги обнаружили, что Drpl и Fis2 играют важную роль в элиминации митохондрий в процессе гибели клеток, a Drpl является субстратом каспазы CED3. [53] Возможно, в результате расщепления Drpl приобретает какие-то новые, еще не изученные функции.

Сигнальные механизмы, регулирующие фрагментацию митохондрий при апоптозе

Какие же факторы вызывают фрагментацию митохондрий при апоптозе? Было обнаружено, что в этом процессе ключевую роль играет белок Drpl. Этот белок находится в динамическом равновесии между сайтами на внешней мембране митохондрий и цитоплазмой. При апоптозе Drp-1 полностью стабилизируется на мембране митохондрий. Было обнаружено, что стабилизация зависит от наличия в клетке белков Bax/Bak, и сопровождается сумоилированием Drpl. [13] Сумоилирование -это ковалентная посттрансляционная модификация, которая опосредуется белками семейства SUMO - small ubiquitin-like modifiers. Было обнаружено, что только функциональный Drpl подвергается сумоилированию. Гиперэкспрессия Sumol вызывает фрагментацию митохондрий в клетках. [54] Предполагают, что сумоилирование стабилизирует белок Drpl в клетке, ингибирует его протеолитическое расщепление. Отщепление SUMO от белков осуществляют SUMO протеазы. При снижении экспрессии одного из таких белков, SEN5, митохондрии фрагментировались. Это сопровождалось увеличением количества сумоилированного Drpl. Однако, функции этой протеазы, по-видимому, не ограничиваются взаимодействием с Drpl, так как в этих клетках наблюдали также повышение продукции АФК и замедление процесса слияния митохондрий. [55]

Помимо убиквитин-подобных белков SUMO группы были также обнаружены убиквитин-лигазы, участвующие в поддержании морфологии митохондрий. Одна из них, MARCH V, находится во внешней митохондриальной мембране и способна взаимодействовать с Mfn2 и Drpl.

23

При гиперэкспрессии этого белка стимулируется слияние митохондрий, а при мутации функционально-важного участка - фрагментация. Было показано, что MARCH V обеспечивает убиквитинилирование Drpl. [56] Другие авторы [57] показали, что аномальная морфология митохондрий, вызванная гиперэкспрессией мутантного варианта MARCH V, восстанавливается при эктопической экспрессии Drpl, но не Fisl. Они предполагают, что данная убиквитин-лигаза участвует в регуляции внутриклеточного транспорта Drpl, обеспечивая сборку или разборку комплекса Drpl в локусах митохондриальной фрагментации. Была обнаружена также другая убиквитин-лигаза, MITOL, которая способна взаимодействовать с hFisl. Было показано, что снижение экспрессии данного белка приводит к Drp-зависимой фрагментации митохондрий. Гиперэкспрессия MITOL предотвращала фрагментацию митохондрий, вызываемую гиперэкспрессией hFisl. Это указывает на возможную роль убиквитин-лигазы в регуляции количества hFisl в клетках. [58]

Белок Drpl при апоптозе подвергается не только убиквитинилированию, но и фосфорилированию и дефосфорилированию. В частности, при апоптозе нейронов, вызванном ставроспорином, активируется протеин киназа 5. Ее ингибирование полностью предотвращает Drpl -зависимую фрагментацию митохондрий. [49] Было обнаружено, что в регуляции Drpl участвует также цАМФ-зависимая протеин киназа А. Гиперэкспрессия мутантного варианта Drpl по серину 637, не подвергающегося фосфорилированию, приводила к образованию взаимосвязанных разветвленных митохондриальных сетей. Было показано, что фосфорилирование белка Drpl по этому сайту воздействует на его ГТФазную активность, и тем самым влияет на морфологию митохондрий. Однако прямое увеличение количества цАМФ в цитоплазме или активация протеин киназы А не приводили к фрагментации или слиянию митохондриального ретикулума, что может отражать возможные компенсаторные механизмы. [59]

Было обнаружено, что фосфорилированная форма Бгр1 не является функционально активной. Дефосфорилирование (и, следовательно, активация) Бгр1 осуществляется посредством кальциневрина. Кальциневрин является кальций-зависимой фосфатазой, и активируется в ответ на выход кальция из эндоплазматического ретикулума. Ингибиторы кальциневрина предотвращали транслокацию Бгр1 на мембрану митохондрий и фрагментацию митохондриального ретикулума. [60] Также было показано, что дефосфорилирование Вгр1 играет важную роль в апоптозе. Ингибитор клеточных протеинкиназ ставроспорин предотвращал фосфорилирование Огр1 и усиливал его дефосфорилирование. Клетки, гиперэкспрессирующие мутантную, конститутивно фосфорилированную форму Эф 1, были более устойчивы к ставроспорину и другим индукторам апоптоза, а в случае гиперэкспрессии другого мутанта, не способного к фосфорилированию, клетки были более чувствительны к клеточной гибели. [61]

В общем, гипотетическая модель сигнального каскада, вызывающего фрагментацию митохондриального ретикулума при апоптозе, такова. В результате индукции апоптоза происходит активация кальциневрина, обеспечивающего отщепление фосфатной группы от Огр1, активация белков, обеспечивающих сумоилирование Бгр1, а также ингибирование убиквитин-лигаз, которые стимулирую деградацию этого белка. Эти события и вызывают транслокацию Бгр1 на мембрану митохондрий. Было показано, что для фрагментации митохондрий при митозе, напротив, необходимо фосфорилирование Бгр1. Таким образом, при различных клеточных событиях реализуются различные способы регуляции этого процесса.

Фрагментация митохондрий и механизм выхода цитохрома С в цитоплазму при апоптозе

Одним из центральных событий апоптоза является выход из митохондрий различных белков, обладающих про-апоптозной активностью. Одним из таких белков является цитохром С. Логично предположить, что белки, участвующие в фрагментации митохондрий, могут каким-то образом регулировать выход цитохрома С из межмембранного пространства.

Выход цитохрома С из межмембранного пространства является результатом комплекса взаимосвязанных событий. Во-первых, необходимо высвободить цитохром С, зафиксированный в кристах внутренней мембраны митохондрий. Во-вторых, необходимо пермеабилизовать внешнюю мембрану так, чтобы цитохром С мог проникнуть в цитоплазму.

Изменение структуры митохондриальных крист

Внутренняя мембрана митохондрий разделена на участки, контактирующие с внешней мембраной, и образующие складки - кристы. Трансмембранное пространство, таким образом, оказывается разделено на компартменты. В 2002 году было обнаружено, что около 85 % цитохрома С зафиксировано внутри крист внутренней мембраны митохондрий. В ответ на индукцию апоптоза происходит изменение морфологии крист. Из тонких пластинок они превращаются в объемные структуры, и пространство внутри них значительно увеличивается. Полагают, что именно такое изменение морфологии обеспечивает высвобождение цитохрома С, зафиксированного внутри крист. В соответствии с этим выход этого белка из митохондрий при апоптозе происходит в две фазы: вначале выходит небольшое количество белка, а затем выходит основная его часть. [62]

Оказалось, что белок ОРА1, необходимый для слияния митохондрий, контролирует изменение структуры митохондриальных крист при апоптозе и выход цитохрома С. Важно отметить, что эта функция непосредственно не связана с его способностью обеспечивать слияние митохондриальных мембран. [31] ОРА1 в норме локализован во внутренней мембране митохондрий. Небольшая его часть с помощью протеазы PARL переходит в растворимую форму, которая локализуется в межмембранном пространстве. [63] Было обнаружено, что растворимая форма ОРА1 вместе с мембранной формой участвуют в образовании олигомеров. При апоптозе эти олигомеры быстро разрушаются. Предполагают, что эти олигомеры служат «замком», закрывающим митохондриальные кристы в здоровых клетках. [31] Эту гипотезу подтверждает тот факт, что выход небольшого количества цитохрома С происходит OPA 1-независимо, а для массового выхода этого белка необходимо разрушение олигомеров ОРА1. [64] Существуют указания на то, что в разрушении олигомеров ОРА1 участвуют каспазы группы IETD [65], а также может участвовать белок Drpl. [52]

Описанные данные указывают на то, что белки, участвующие в поддержании морфологии митохондрий, играют непосредственное участие в выходе цитохрома С при апоптозе.

Пермеабилизация внешней митохондриалъной мембраны

Участие митохондриалъной норы в процессе выхода цитохрома С из митохондрий

Помимо высвобождения цитохрома С из крист внутренней мембраны, важным этапом апоптоза является выход этого белка в цитоплазму клетки, для чего ему необходимо преодолеть внешнюю мембрану митохондрий. Механизм пермеабилизации внешней мембраны на данный момент неизвестен. Существует множество гипотез о том, как происходит выход цитохрома С из межмембранного пространства в цитоплазму. Наиболее распространены две из них. Одна из гипотез предполагает участие в этом процессе комплекса т.н. «митохондриальной поры» (permeability transition роге, РТР). Открытие митохондриальной поры во внутренней мембране приводит к неконтролируемому поступлению воды в митохондрии. Матрикс набухает, внутренняя мембрана расправляется и в какой-то момент становится больше внешней мембраны митохондрий. Внешняя мембрана разрывается, и цитохром С выходит в цитоплазму клетки. По другой гипотезе основную роль в пермеабилизации мембраны митохондрий играет Вах/Вак-зависимая пора. Согласно этой гипотезе, в ответ на индукцию апоптоза Вах образует во внешней мембране митохондрий комплексы, через которые цитохром С и выходит в цитоплазму.

В первой гипотезе центральная роль отводится «митохондриальной поре». Основная масса исследований по изучению митохондриальной поры была проведена на искусственных липидных системах и выделенных митохондриях. Существует общепринятая точка зрения о составе этого порового комплекса. Считается, что основными компонентами этого комплекса служат потенциал-зависимый анионный канал (VDAC), расположенный во внешней мембране, транслокатор адениновых нуклеотидов (ANT) во внутренней мембране митохондрий, а также циклофилин D, растворимый белок матрикса. Также в состав РТР различные авторы включают такие белки, как креатин-киназа, гексокиназа, периферийный рецептор бензодиазепина, цитохром С, Вах. (рис. 3).

Рисунок 3. Модель митохондриальной поры. Приводится по [66]. ANT- транслокатор адениновых нуклеотидов BPR - периферийный рецептор бензодиазепина СК - креатин киназа НК - гексокиназа

VDAC - потенциал-зависимый анионный канал

Сигналом к открытию митохондриальной поры служат повышение концентрации кальция, снижение концентрации адениновых нуклеотидов, неорганического фосфата, изменение митохондриального потенциала или кислотности, активные формы кислорода и, возможно, Вах. При открытии РТР происходит резкое падение мембранного потенциала, возрастание проницаемости митохондриальной мембраны для веществ массой до 1,5 кДа и нарушение мембранного фосфорилирования. [66] Предполагают, что для открытия РТР необходимо образование комплекса из белков на внешней и внутренней мембране митохондрий - так называемых «контактных сайтов». Контактные сайты были описаны еще в 1983 году при исследовании электронных микрофотографий митохондрий как

29

Вода и низкомалекулярные вещества

Атра <тилози д. Са»\ ДФ1С Вах

Бонпсре ков^я кислота; АТФ

Мэтрикс Циютослорин А

Wilis « Се» В-соду

Межмембран ное пространство внутренняя мембрана небольшие области, в которых две мембраны находятся в непосредственной близости друг от друга. Количество этих контактов изменялось в зависимости от энергетического состояния митохондрий. [67] В настоящее время предполагают, что образование контактных сайтов связано с взаимодействием белков VDAC и ANT. (рисунок из [68])

Глюкоза G-6-P

Митохондриальная лора Митохондриальная лора чакпытя пткпьгга

Рисунок 4. Гипотетическая схема работы митохондриальной поры.

Гексокинаш, глицерол киназа и рецептор бензодиазепина связываются с комплексом

VDAC/АКТ. Под действием кальция пора открывается, что позволяет веществам до

1,5 кДа проникать через мембраны митохондрий. Сокращения см. рис. 3.

Приводится по [68].

В норме ANT в кооперации с VDAC обеспечивают выход АТФ в цитоплазму в обмен на АДФ. ANT может находиться в двух конформациях: одна из них фиксируется бонгкрековой кислотой и называется ш-конформацией. При этом активный центр белка обращен в матрикс митохондрий. Атрактилозид фиксирует транслокатор в с-конформации, при этом белок обращен в межмембранное пространство, и способен взаимодействовать с VDAC, что и происходит при образовании контактных сайтов. [69]

Циклоспорин А, ингибитор циклофилина D, является важнейшим ингибитором митохондриальной поры. Циклоспорин А предотвращает падение трансмембранного потенциала и пермеабилизацию внешней мембраны митохондрий, вызванную основными стимулами, вызывающими открытие митохондриальной поры. [70] Помимо взаимодействия с циклофилином D, циклоспорин А также способен связываться с циклофилином А. Образующийся комплекс ингибирует кальций-зависимую фосфатазу кальциневрин (также см. выше). [71] Это побочное действие циклоспорина D, с одной стороны, позволяет использовать его в качестве иммуносупрессора при лечении многих заболеваний, а с другой стороны создает много сложностей при изучении комплексов митохондриальной поры в лаборатории. Разработаны аналоги циклоспорина D, не влияющие на активность кальциневрина, например, N-метил-изолейцин-циклоспорин. [72]

Генетические исследования подвергли сомнению тот факт, что именно комплекс ANT/VDAC служит основным компонентом циклоспорин-зависимой митохондриальной поры. Было показано, что в митохондриях из печени мышей, нокаутных по ANT1 и 2, происходит открытие митохондриальной поры в ответ на FCCP и кальций, ингибируемое циклоспорином А. Т.е. ANT не является необходимым компонентом митохондриальной поры. [73] VDAC не способен формировать каналы, проницаемые для цитохрома С, в искусственных билипидных мембранах. [68] Кроме того, на митохондриях или эмбриональных фибробластах, выделенных из мышей, нокаутных по Vdac 1,2,3, было показано, что выход цитохрома С в ответ на различные стимулы, такие как окислительный стресс, белки tBid или Вах, происходит нормально. [74] Предполагают, что в системах, не содержащих ANT или VDAC, их функцию могут выполнять другие белки.

В свете имеющихся на настоящий момент данных можно утверждать, что механизм выхода цитохрома С, предусматривающий набухание внутренней мембраны митохондрий и последующий разрыв внешней, при апоптозе в клетках эукариот не реализуется. Этот механизм, возможно, является этапом гибели клеток при некрозе.

Существуют данные, указывающие на то, что митохондриальная пора все же играет какую-то роль в апоптозе. На клеточных культурах ингибитор митохондриальной поры циклоспорин А предотвращает выход цитохрома С и апоптоз. Кроме того, в экспериментах на выделенных митохондриях было показано, что открытие митохондриальной поры с помощью атрактилозида приводит к выходу цитохрома С. [68]

Возможно, открытие митохондриальной поры обеспечивает слабое набухание митохондриального матрикса, что механически способствует изменению структуры крист. Эту гипотезу подтверждают данные о том, что циклоспорин А ингибирует изменение структуры митохондриальных крист во внутренней мембране, вызванное апоптотическими стимулами. [62]

С другой стороны, нельзя исключить вариант, при котором комплекс митохондриальной поры вообще не играет в этом процессе никакой роли. Мишень действия циклоспорина А, циклофилин Б, может напрямую взаимодействовать с комплексом белка ОРА1, фиксирующим цитохром С внутри митохондриальных крист.

Комплекс «митохондриальной поры» и фрагментация митохондрий

На данный момент известно, что белки, составляющие комплекс «митохондриальной поры», каким-то образом участвует в высвобождении цитохрома С из крист внутренней мембраны митохондрий. Фрагментация митохондриального ретикулума не является причиной или следствием выхода цитохрома С в цитоплазму клетки. На основании имеющихся данных можно заключить, что открытие митохондриальной поры и фрагментация митохондриального ретикулума являются независимыми событиями. Данных о взаимодействии белков ANT, VDAC, циклофилина D и белков аппарата фрагментации или слияния митохондрий на настоящий момент нет. Однако изменение морфологии митохондриального ретикулума и открытие митохондриальной поры при апоптозе все же могут быть каким-то образом связаны друг с другом. На природу этой взаимосвязи указывают два явления. Во-первых, как Drpl, Mfn2, так и белки митохондриальной поры способны взаимодействовать с белками Вс1-2 семейства: Вах, Bäk, Bcl-2. Кроме того, состояние митохондриальной поры и морфология митохондрий определяются концентрацией кальция в цитоплазме клеток (см. ниже). Изучение взаимосвязи этих явлений является очень интересной и актуальной задачей клеточной биологии.

Участие белков Box и Bäk в пермеабилизации внешней мембраны митохондрий

Вах и Bäk обеспечивают пермеабилизацию внешней мембраны митохондрий. Они являются проапоптозными членами Вс1-2 семейства, и содержат три ВН-домена, необходимых для образования гомо- или гетеродимеров с другими белками семейства. На N-конце Вах содержит трансмембранный домен, который обеспечивает внедрение его в мембрану митохондрий. Известно, что Вах имеет как минимум два стабильных конформационных состояния. Первое из них является закрытым, глобулярным состоянием, и обеспечивает существование этого белка в цитоплазме (CLIC). В ответ на различные стимулы Вах претерпевает конформационные изменения, в результате которых многие его активные сайты оказываются экспонированы в раствор, что позволяет ему связываться с другими белками и липидиыми мембранами. Становится доступной N-концевая а-спираль, что позволяет ему образовывать гетеродимеры с белком Bcl-xL. Аминокислоты с 20 по 37 содержат последовательность, направляющую этот белок в митохондрии, однако, для включения Вах во внешнюю митохондриальную мембрану также необходимы первые 20 аминокислот белка. Данная последовательность является регуляторной, и была названа «Apoptosis Regulating Target» домен. Средние альфа-спирали белка, пятая и шестая, также становятся доступны при изменении конформации белка Вах. Данная область способна встраиваться в митохондриальную мембрану и необходима для формирования порового комплекса. Также известно, что при слабых стимулах Вах способен открывать первую альфа-спираль, что сопровождается его транслокацией на митохондрии, однако, это не сопровождается образованием поры или выходом цитохрома С. С-терминальный домен, возможно, ингибирует взаимодействие Вах с другими белками Вс1-2 семейства, и может являться вторым доменом, регулирующим апоптозную активность этого белка. Поэтому переселение Вах на митохондрии может требовать последовательного или одновременного снятия обоих блоков как с С-конца, так и с N-конца. [75]

Существует гипотеза, согласно которой Вах образует пору во внешней мембране митохондрий, через которую выходит цитохром С. На искусственных мембранных системах было показано, что Вах способен включаться в мембраны, содержащие нейтральные липиды и образовывать в нем каналы, активные в широком диапазоне рН и с низкой СГ селективностью. Проводимость этих каналов варьирует от 26 pS до 2 nS. Было показано, что Вах необходим для формирования митохондриальной поры белками ANT и VDAC в изолированных митохондриях. Вс1-2 ингибирует открытие поры, и данный его эффект опосредуется доменом, необходимым для связывания с Вах. [76] Однако, в билипидных слоях Вах сам по себе не способен образовывать пору, проницаемую для цитохрома

С. [68] Некоторый свет на проблему участия Вах в механизме пермеабилизации внешней мембраны митохондрий пролили эксперименты на клетках, не содержащих Вах и его гомолог, частично компенсирующий его функции, белок Bäk. Было показано, что эти клетки значительно устойчивее к апоптозу, чем их аналоги дикого типа, и не отвечают выходом цитохрома С на многие проапоптозные стимулы. [64] Это подтверждало предположения о необходимости белка Вах для выхода цитохрома С при апоптозе. Однако в прошлом году было обнаружено, что Вах-зависимая пермеабилизация внешней митохондриальной мембраны может не сопровождаться выходом цитохрома С. Этот эффект Sheridan и коллеги наблюдали при одновременной гиперэкспрессии белков Вах и Bcl-xL, а также при индукции апоптоза ВНЗ-only белками Bid, Bim или PUMA, действие которых также опосредовано белком Вах, в присутствии антиапоптозных Вс1-2 или Bcl-xL. [50] Эти данные можно объяснить с точки зрения гипотезы двухэтапного выхода цитохрома С из митохондрий: пермеабилизации внешней мембраны митохондрий, которая опосредована белком Вах, недостаточно для выхода цитохрома С, зафиксированного внутри крист, образованных внутренней мембраной. Это указывает на то, что, по-видимому, антиапоптозные белки Вс1-семейства каким-то образом участвуют именно в поддержании структуры митохондриальных крист.

В 2007 году было показано, что, возможно, существует Bax/Bak независимый механизм выхода цитохрома С из митохондрий. На мышиных эмбриональных фибробластах, не содержащих белков Вах и Bäk, комбинация кальциевого ионофора и арахидоновой кислоты вызывала выход цитохрома С и гибель клеток. Защитным эффектом в данном случае не обладали ни ингибиторы митохондриальной поры, такие как циклоспорин А, бонгкрековая кислота и L-карнитин, ни Bcl-xL, однако, значительный эффект оказывал naH-Kacná3Hbiñ ингибитор zVAD-FMK. Эти данные указывают на существование альтернативного, Вах-независимого механизма выхода цитохрома С из межмембранного пространства митохондрий [77]

Взаимодействие Вах с белками аппарата фрагментации митохондрий

Итак, белок Вах является важным, и часто - необходимым участником апоптоза. Какую же роль он играет в фрагментации митохондрий?

При апоптозе Вах перемещается из цитоплазмы на внешнюю мембрану митохондрий. Уже через полчаса после добавки ставроспорина Вах обнаруживают на внешней митохондриальной мембране. [78] Известно также, что после переселения Вах внедряется в мембрану и образует олигомерные комплексы. В клетках, гиперэкспрессирующих Вс1-2, таких комплексов не образуется, что указывает на возможный механизм антиапоптозного действия белка Вс1-2. [79] Однако, транслокацию Вах антиапоптозные белки Вс1-2 и Вс1-хЬ предотвратить не способны. [80, 81] Было обнаружено, что локусы, в которых Вах связывается с мембраной митохондрий, служат местами будущей перешнуровки митохондрий. В этих локусах также расположен белок М&2, необходимый для слияния митохондрий, и белок Огр1. [33] Транслокация Вах совпадает по времени с остановкой слияния митохондрий при индукции апоптоза ставроспорином или актиномицином Р. Окраской специфическими антителами 6А7 было показано, что в этом случае конформационное изменение Вах строго кореллирует с изменением морфологии митохондрий. [82] Ингибирование фрагментации митохондрий с помощью мутантных форм Огр1 или не предотвращало внедрение Вах во внешнюю мембрану митохондрий. [51] Таким образом, транслокация Вах предшествует фрагментации митохондрий и не зависит от нее.

Гиперэкспрессия Вах в клетках млекопитающих вызывает фрагментацию митохондриального ретикулума и апоптоз. [11] Если в таких клетках дополнительно гиперэкспрессировать Вс1-2, он заблокирует выход цитохрома С и апоптоз, но фрагментация митохондрий все равно будет происходить. [50] Как ни странно, в клетках, не содержащих Вах и Bäk, митохондрии тоже раздроблены, при чем гиперэкспрессия в них одного из данных белков восстанавливает нормальную морфологию митохондрий. Делеция только одного из генов Вах или Вак не приводит к значительному изменению морфологии митохондрий. [48] Прямого взаимодействия между Вах и компонентами механизма фрагментации или слияния митохондрий не было показано. Имеющиеся данные говорят о том, что транслокация Вах, фрагментация митохондрий и апоптоз являются независимыми событиями, однако, по всей видимости, в норме Вах участвует в поддержании баланса между слиянием и фрагментацией митохондрий.

Участие Bcl-2 и Bcl-xL в пермеабилизации внешней мембраны и фрагментации митохондрий

Белки Вс1-2 семейства разделяют на три группы. Вах и Bäk относятся к группе мультидоменных проапоптотических белков. Их постоянными антагонистами являются белки Вс1-2 и Bcl-xL. Они были открыты благодаря своей способности ингибировать проницаемость внешней мембраны митохондрий для различных проапоптозных факторов, таких как цитохром С, Smac/DIABLO, AIF и другие. Известно, что они, как и другие белки этого семейства, способны образовывать гетеродимеры между про- и антиапоптотическими белками, что приводит к ингибированию активности партнера. Домены ВН1, ВН2 и ВН4 белков Вс1-2 и Bcl-xL необходимы для антиапоптозной активности.[83] Механизм их работы не совсем понятен. Очевидно, что Вс1-2 и Bcl-xL способны связываться с Вах как в неклеточных системах, так и внутри клетки. Известно, что Вс1-2 блокирует образование каналов белками Вах и ANT в искусственных билипидных мембранах. Гиперэкспрессия этого белка предотвращает олигомеризацию Вах, вызванную различными проапоптозными стимулами, но не предотвращает транслокацию этого белка на мембрану митохондрий. Здесь важно отметить, что в клетках млекопитающих белок Вс1-2 ассоциирован с мембранами митохондрий, и небольшая фракция также обнаруживается на мембране ЭПР. [84] По всей видимости, Вс1-2 блокирует проапоптозное действие Вах уже после того, как он прошел первые этапы активации.

Данных об участии Вс1-2 и Bcl-xL в фрагментации митохондрий очень мало. Известно, что, в отличие от проапоптозных членов семейства, антиапоптозный белок Вс1-2 способен взаимодействовать с аппаратом фрагментации митохондрий, в частности, с Fisl. Было также обнаружено, что фрагментация митохондрий, вызываемая гиперэкспрессией hFisl, в присутствии Вс1-2 значительно снижена. Было высказано предположение о том, что Вс1-2 и Drpl могут конкурировать за связывание с белком hFisl. [85] Brooks и коллеги наблюдали снижение фрагментации митохондрий при апоптозе в клетках, гиперэкспрессирующих Вс1-2 или Bcl-xL. [86] Однако, в отсутствие апоптоза гиперэкспрессия Bcl-xL стимулирует фрагментацию митохондрий в клетках HeLa. Этот эффект опосредован его способностью связываться как с белком Вах, так и Bäk. [50] В общем, однозначных данных о том, какую функцию выполняет Вс1-2 в фрагментации митохондрий, на данный момент нет.

Фрагментация митохондриального ретикулума при изменении уровня кальция внутри клетки

Помимо апоптоза, существуют другие стрессовые воздействия, вызывающие изменение морфологии митохондриального ретикулума. Одним из них является изменение концентрации кальция внутри клеток. В клетках эукариот митохондрии служат депо кальция, наряду с цистернами ЭПР. Концентрация кальция в ЭПР, цитоплазме и митохондриях постоянно изменяется. Уровень цитоплазматического кальция значительно влияет на морфологию митохондрий. Оказалось, что поступление кальция из ЭПР в цитоплазму и митохондрии может быть связано с аппаратом поддержания морфологии митохондрий. Было показано, что Drpl [10], а также белки Вс1-семейства Вс1-2 [84], Вах и Bäk [87, 88], помимо мембраны митохондрий, также могут образовывать комплексы в мембране ЭПР. Повышение концентрации кальция в цитоплазме с помощью тапсигаргина или посредством повышения концентрации калия в среде инкубации вызывало фрагментацию митохондрий в клетках. Тапсигаргин - вещество, ингибирующее поступления кальция в ЭПР, и тем самым вызывающее его пассивный выход в цитоплазму. Это явление было Drpl-и Fis 1-зависимым. [89] Было также показано, что фрагментация митохондрий, вызванная гиперэкспрессией Drpl, нарушала распространение кальциевых волн по митохондриям, при чем в некоторых органеллах которых концентрация кальция вообще не возрастала. [90]

Хорошо известно, что повышение концентрации кальция в цитоплазме вызывает активацию различных кальций-зависимых киназ и фосфатаз. Среди них была обнаружена киназа CaMKI, которая способна фосфорилировать Drpl по серину 600. Мутация по серину 600 предотвращала фрагментацию митохондрий. Ингибитор этой киназы также предотвращал переселение Drpl на мембрану митохондрий. Было показано, что мутант по серину 600, не способный к фосфорилированию, равномерно распределен по цитоплазме в норме, и не переселяется в ответ на калий, а фосфомиметический мутант тоже равномерно распределен в норме, и в ответ на калий перераспределяется. Фосфорилирование по серину 600 стимулирует связывание этого белка с Fisl. [91] И, наконец, в работе Cereghetti представлен механизм регуляции распределения Drpl в клетке посредством кальций-зависимой фосфатазы кальциневрина (см. выше). [60] Каким именно образом активация различных кальций-зависимых киназ и фосфатаз обеспечивает транслокацию Бгр1 на митохондрии, неизвестно.

Апоптоз сопровождается значительными изменениями уровня кальция в клетке. Было обнаружено, что это значительно влияет на морфологию митохондрий. Так, снижение уровня кальция в среде предотвращало фрагментацию митохондрий при апоптозе, вызванном церамидом в клетках НеЬа. Аналогичное действие оказывало связывание кальция с помощью хелатора ВАРТА. [92] Также оказалось, что апоптоз, вызываемый гиперэкспрессией Р1б1, не связан напрямую с фрагментацией митохондрий, и зависит от уровня кальция в клетке. Было показано, что гиперэкспрессия не влияет на уровень кальция в цитоплазме или на морфологию ЭПР, однако, значительно замедляет поступление кальция в митохондрии. [93] Снижение концентрации кальция в цитоплазме клеток предотвращало апоптоз, вызываемый гиперэкспрессией Ычз1. [94] На основании этих данных можно предположить, что прекращение поступления кальция в митохондрии (или повышение его концентрации в цитоплазме клетки) служит сигналом для фрагментации митохондриального ретикулума и последующего апоптоза. Возможно, в поступлении кальция в митохондрии какую-то роль играет

Фрагментация митохондрий сопровождается увеличением количества контактных сайтов между ЭПР и митохондриями. [95] Необходимым участником этих сайтов оказался белок слияния митохондрий МГп2. Было показано, что М&2, находящийся на мембране ЭПР, способен связываться с МЙ1-белками на мембране митохондрий. Нокаут белка М&2 в клетках приводил к снижению количества контактных сайтов между ЭПР и митохондриями. В этих клетках скорость поступления кальция в митохондрии была значительно снижена. Важно отметить, что в таких клетках как митохондриальный, как и эндоплазматический ретикулум были полностью фрагментированы. [41]

Оказалось, что белки, участвующие в фрагментации митохондрий, влияют на количество кальция, индуцирующего открытие митохондриальной поры. При гиперэкспрессии hFisl или Drpl пороговое количество кальция было значительно ниже, чем в контрольной культуре. Оказалось, что эффект Drpl зависит от количества Вс1-2 в клетке: клетки, в которых количество Вс1-2 наибольшее, практически не реагируют на гиперэкспрессию Drpl. [85] В общем, имеющиеся данные указывают на то, что белки Drpl и Fisl, стимулируют открытие митохондриальной поры при апоптозе в ответ на повышение концентрации цитоплазматического кальция, или в ответ на ингибирование его поступления в митохондрии.

Таким образом, кальциевый гомеостаз является важнейшим регулятором морфологии митохондрии в клетке и, возможно, служит недостающим звеном, связывающим белки фрагментации митохондрий с митохондриальной порой, белками Вс1-2 семейства и апоптозом.

Фрагментация митохондрий при окислительном стрессе

Одним из наиболее распространенных изменений гомеостаза клеток является нарушение окислительно-восстановительного баланса. При этом происходит продукция активных форм кислорода. Они играют важную роль в передаче сигналов как внутри клетки, так и между соседними клетками. Избыточная продукция АФК может приводить к повреждению белков, липидов и нуклеиновых кислот, и вызывает гибель клеток путем апоптоза или некроза. Известно, что при апоптозе, вызванном различными стимулами, например, ставроспорином, происходит интенсивная продукция АФК внутри клеток. [96] Вещества, нейтрализующие активные формы кислорода, такие как N-ацетилцистеин или производное витамина Е Trolox, предотвращают апоптоз, указывая на важную роль АФК в развитии клеточной гибели. [97, 98]

В клетке существует множество источников АФК. Активные формы кислорода образуются в результате работы различных ферментных систем

41 в пероксисомах, митохондриях, в цитоплазме клетки, при чем как внутри мембран, так и в водных компартментах. Среди всех источников АФК митохондрияи отведена особая роль. Причиной этому служит постоянная работа дыхательной цепи, на которой образуются свободные электроны, при постоянном присутствии сильнейшего окислителя - кислорода. Поэтому митохондрии образуют наибольшее из всех клеточных систем количество АФК.

Генерация АФК в митохондриях может происходить на различных участках дыхательной цепи в процессе окислительного фосфорилирования. Окислительное фосфорилирование катализируется полиферментной системой, локализованной на внутренней мембране митохондрий. Она представлена пятью липопротеидными комплексами: NADH:yбиxинoн-oкcидopeдyктaзoй (Комплекс I), сукцинат-убихинон-оксидоредуктазой (Комплекс II), убихинол-цитохром С-оксидоредуктазой (Комплекс III), цитохром С-кислород-оксидоредуктазой (Комплекс IV, цитохромоксидаза) и Р0-РгАТР-синтазой (Комплекс V).

Главными комплексами, продуцирующими АФК в митохондриях, являются компоненты начальной и средней части дыхательной цепи -Комплекс I и Комплекс III [99]; [100]. При прямом переносе электронов в Комплексе I дыхательной цепи АФК способны генерироваться между флавином и ротенон-связывающим участком [101], [102] или в одном из центров связывания КА1)Н - 11-центре [103]. При этом различные ингибиторы комплексов дыхательной цепи, например, ингибиторы Комплекса I ротенон и пиерицидин [104], индуцируют образование АФК, приводя к накоплению восстановленных редокс-переносчиков и, как следствие, переносу электронов на кислород.

Генерация АФК в Комплексе III дыхательной цепи происходит следующим образом. Электроны с дегидрогеназ комплекса I и II переносятся на коэнзим <3 (убихинон) в процессе двух последовательных одноэлектронных восстановлений с участием цитохромов Ь и С). В результате первого одноэлектронного восстановления образуется радикал семихинона, который является хорошим донором электронов, и при наличии свободного кислорода легко взаимодействует с ним с образованием супероксид-радикала. Супероксид может быть превращен в пероксид водорода в результате реакции дисмутации, катализируемой супероксиддисмутазой. Пероксид водорода может восстанавливаться до воды и молекулярного кислорода в результате реакции, катализируемой катал азой.

Было показано, что in vitro в митохондриях около 1-2 % молекул потребляемого кислорода превращается в супероксид-анион [105]. С учетом того, что эти оценки были получены на изолированных митохондриях в присутствии высоких, нефизиологических концентраций кислорода, скорость генерации супероксид-радикала in vivo, безусловно, значительно меньше. Понимание механизмов регуляции генерации АФК, а также систем антиоксидантной защиты может помочь в разработке методов борьбы с избыточной генерацией АФК.

Генерация АФК происходит как при прямом, так и при обратном переносе электронов в дыхательной цепи. Обратный перенос электронов представляет собой последовательность реакций, в результате которых электроны в дыхательной цепи переносятся против градиента редокс-потенциалов переносчиков электронов, то есть от восстановленного убихинона к NAD+ матрикса, а не к кислороду, как это происходит при прямом переносе электронов. Это термодинамически невыгодный процесс, требующий затрат энергии. Известно, что обратный перенос электронов сопровождается значительной генерацией пероксида водорода. Ингибиторы комплекса III дыхательной цепи предотвращают обратный перенос электронов. [99].

Таким образом, митохондрии концентрируют в себе большую часть окислительных метаболических путей и многочисленные редокспереносчики и центры, потенциально способные к одноэлектронному восстановлению кислорода.

На рис. 5 схематически показана генерация митохондриальных АФК в различных участках дыхательной цепи. Супероксид-радикал генерируется в Комплексе I и в Комплексе III на внутренней мембране митохондрий и поступает в матрикс (около 70-80 %) и в межмембранное пространство (20-30 %) [106]. Супероксид может выходить в межмембранное пространство через митохондриальные поры, содержащие VDAC [107]. Как супероксид, так и пероксид водорода способны быть вторичными мессенджерами, взаимодействуя с сенсорами АФК, которые, в свою очередь, посылают сигналы к ядру для активации генов антиоксидантных систем клетки [106].

HjO; Мшвяткчпд I ■ 1Я члгрин

Рисунок 5. Генерация митохондриальных АФК.

Приводится по обзору [1061

Индукторами окислительного стресса, вызывающими эндогенную продукцию АФК, могут служить самые различные стимулы. Среди них, например, повышенная концентрация глюкозы [108], инфракрасное облучение [109]. Продукция активных форм кислорода происходит также при ишемии-реперфузии, поражающей нейроны и кардиомиоциты. В головном мозге в существенных количествах присутствуют активные формы азота, в частности NO. Оксид азота (II) является важным нейтротрансмиттером, который необходим для процессов обучения и памяти. Однако в присутствии супероксида он превращается в пероксинитрит, обладающий высокой нейротоксичностью. Было показано, что NO вызывает фрагментацию митохондрий нейронов. Фрагментация митохондрий происходила до гибели нейронов и наблюдалась также при ишемии головного мозга крыс in vivo. Повреждение митохондрий сопровождалось также эндогенной продукцией АФК. [110] Индукция фрагментации митохондрий была показана и в ответ на пероксид водорода. [111]

Нарушение аппарата поддержания морфологии митохондрий, в свою очередь, также вызывает нарушение функционирования митохондрий и падение мембранного потенциала. Снижение экспрессии Drpl вызывает снижение темпов роста культуры, продукцию АФК, а также нарушением митохондриальных функций: снижение дыхания клеток, количества АТФ и падение мембранного потенциала. [112, 113] Гиперэкспрессия белка Fisl также приводит к нарушению биоэнергетических функций митохондрий. Было показано, что отвечающий за это участок белка не участвует в поддержании морфологии митохондриального ретикулума. [114]

Таким образом, известно, что повреждение аппарата поддержания морфологии митохондриального ретикулума приводит к продукции АФК внутри клеток. Экзогенные индукторы окислительного стресса, в свою очередь, вызывают фрагментацию митохондрий. Однако, механизм этого процесса неизвестен.

Митохондриально-направленные антиоксиданты

Митохондрии в клетках эукариот являются основным источником активных форм кислорода при окислительном стрессе. Поэтому специфические митохондриально-направленные антиоксиданты могут служить важными инструментами для исследования регуляции редокс-статуса клетки, а в дальнейшем — гурр Ц- и для терапии заболеваний, связанных с окислительным стрессом. Вещества, способные проникать через мембрану митохондрий, были разработаны в группе Скулачева В.П. еще в конце 60х годов. Основной особенностью данных веществ был положительный заряд, равномерно распределенный по большой гидрофобной молекуле. Это приводило к тому, что гидратная оболочка вокруг таких веществ не образовывалась. Примером таких веществ служит тетрафенилфосфоний (ТРР+). Было показано, что такие вещества способны проникать через искусственные билипидные слои, а также и внутрь выделенных митохондрий. Отрицательный заряд внутри митохондриального матрикса приводил к тому, что тетрафенилфосфоний накапливался внутри митохондрий благодаря своему положительному заряду. Тогда же было высказано предположение, что положительно заряженные гидрофобные вещества способны проникать через мембрану митохондрий также и в случае, если они связаны с другим незаряженным веществом. Эксперименты с карнитином, связанным с остатком пальмитиновой кислоты, полностью подтвердили эту гипотезу. [115]

В 2001 году Michael Murphy разработал специфический митохондриально-направленный антиоксидант MitoQ. Он состоит из катиона трифенилфосфония, десятизвенной алифатической цепи, и остатка убихинола. Это вещество может существовать в окисленной (митохинон) или восстановленной форме (митохинол).

Способность служить акцептором для АФК, О образуемых в дыхательной цепи, была показана в следующих опытах.

Дышащие митохондрии в присутствии сукцината или глутамата и малата окисляли митохинол, ингибиторы дыхательной цепи ротенон или миксотиазол значительно снижали количество окисленного вещества. БССР предотвращал поступление этого вещества в митохондрии, тем самым также предотвращал его окисление. МйоС) способен достаточно быстро (20-40 минут) проникать в клетки, что также предотвращается БССР. При фракционировании примерно половина вещества была обнаружена в митохондриальной фракции. В высоких концентрациях М11;оС) токсичен для клеток: 25 мкМ Мко(^ ингибировали дыхание выделенных митохондрий и приводили к снижению мембранного потенциала, а также гибели клеток. В более низких концентрациях он проявляет свои антиоксидантные свойства: предотвращает окисление жирных кислот, вызванное пероксидом водорода, а также предотвращает активацию каспаз и гибель клеток 1игка1, вызванную пероксидом водорода. Было также показано, что он эффективно восстанавливается дыхательной цепью митохондрий после окисления пероксинитритом, что подтвердило гипотезу о то, что он способен рециркулировать в живых системах. Важно отметить, что (^1, антиоксидант хинольной природы, равномерно распределяющийся по клетке, не обладал защитным эффектом. Это указывает на то, что именно митохондриальная направленность МкоС) необходима для защитного действия при НгОг-индуцированном апоптозе.

Помимо антиоксидантного эффекта, МкоС) также имеет достаточно сильные прооксидантные свойства. Было показано, что в результате аутоокисления МкоС) продуцирует супероксид-анион и вызывает

116] выработку пероксида водорода интактными митохондриями. [117] В работе Бог^Иап и коллег этот антиоксидант в концентрации 10-100 нМ вызывает продукцию АФК как в выделенных митохондриях, так и в клетках эукариот. [118] Сильный прооксидантный эффект является значительной помехой использованию МйоС) в качестве терапевтического средства для лечения заболеваний животных и людей.

В.П. Скулачевым был разработан новый антиоксидант, также направленный в митохондрии. В качестве основного акцептора активных форм кислорода в этом веществе, получившем название БкС), выступает пластохинон. Эта замена была основана на предположении, что пластохинон может обладать лучшими антиоксидантными свойствами по сравнению с убихиноном, так как пластохинон является основным акцептором электронов в растениях в условиях более сильного окислительного стресса, чем в животных клетках. Кроме того, прооксидантное действие пластохинона могло быть слабее, чем убихинона. Были созданы различные производные этого вещества. В качестве основного митохондриально-направленного антиоксиданта в работе был использован БкС)1, состоящий из пластохинона, десятизвенной углеродной цепи и трифенилфосфония в качестве положительно заряженного катиона. Дли исследования внутриклеточного транспорта и локализации данного вещества был использован его аналог - БкС^!?!, в котором трифенилфосфоний был замещен флуоресцирующим в красной области спектра родамином 19.

Было показано, что 8к(^1 и БкС^!*! чрезвычайно эффективно проникают через билипидные слои, а также способны связывать активные формы н н кислорода, продуцируемые выделенными митохондриями в присутствии сукцината в качестве субстрата для дыхания, а также Fe2+ и аскорбата в качестве восстановителя. Контролем в данных экспериментах, как и в остальных опытах с использованием митохондриально-направленных антиоксидантов, выступает С12ТРР, аналог SkQl, не содержащий хинон. Важно отметить, что MitoQ в этих экспериментах продемонстрировал более низкую антиоксидантную активность, чем производные пластохинона, а также более высокую прооксидантную активность, как было показано в экспериментах по неферментативному окислению кислорода до супероксид-радикала. [119]

В нашей группе было показано, что длительная преинкубация с антиоксидантами MitoQ или SkQl вызывает изменение морфологии клеточных линий: увеличение площади клеток, усиление стресс-фибрилл и клеточных контактов. Это сопровождалось появлением в фибробластах маркера миофибробластов альфа-гладкомышечного актина. [115, Agapova, 2008 #367] Кроме того, митохондриально-направленные антиоксиданты эффективно предотвращали гибель клеток, вызванную различными стимулами: окислительным стрессом [120, 121], или фотоактивацией MitoTracker Red. [122].

Митохондриально-направленные антиоксиданты продемонстрировали свою эффективность в подавлении окислительного стресса в различных системах, моделирующих заболевания человека. На модели сепсиса, когда у крыс инъекцией липополисахаридов-пептидогликанов вызывали нарушение работы внутренних органов, было показано, что MitoQ значительно снижает уровень биохимических маркеров повреждения печени и почек. [123] На фибробластах от больных атаксией Фридриха, в которых блокирован синтез глутатиона, что приводит к сильному окислительному стрессу, MitoQ гораздо эффективнее предотвращал гибель клеток, чем ненаправленные антиоксиданты. [124] Также было показано, что в случае инкубации фибробластов с низкими концентрациями 10-20 нМ в течение недели МкоС) предотвращал репликативное старение этих клеток. Было показано, что это действие опосредовано сохранением длины теломеров в ряде клеточных делений. [125] 8кС>1 на препарате изолированного сердца крыс предотвращал аритмию, вызванную пероксидом водорода или возникающую в результате ишемии-реперфузии, а также значительно снижал площадь поврежденной ткани в крысиных моделях инфаркта и инсульта. Также БкСН, применяемый в виде капель, предотвращал или останавливал развитие катаракты и ретинопатии у крыс ОХУБ, у которых уровень окислительного стресса постоянно значительно повышен по сравнению с контрольной линией крыс, а также предотвращал развитие глаукомы в экспериментальной модели на кроликах. [126]

Митохондриально-направленные антиоксиданты в силу своей высокой специфичности являются незаменимым инструментом для исследования роли митохондриальных активных форм кислорода в различных внутриклеточных процессах. В данной работе мы использовали 8кС)1, БкСЖЛ и МкоС) для изучения процессов фрагментации митохондрий и передачи сигнала в клетке при окислительном стрессе.

Материалы и методы Реагенты

Все использованные реагенты (если не указано иначе) были производства Sigma-Aldrich, St. Louis, МО. Для исследования продукции АФК в митохондриях были использованы новые митохондриально-направленные антиоксиданты SkQl (Ю-(б'-пластохинолил) децилтрифенилфосфоний) и его флуоресцентный аналог SkQRl, а также MitoQ (Ю-(б'-убихинолил)децилтрифенилфосфоний) и контрольное соединение децилтрифенилфосфоний (С12ТРР), синтезированные в НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского под руководством В.П. Скулачева (любезно предоставлены Г.А. Коршуновой). Также использовали ингибитор клеточных протеинкиназ ставроспорин (Apotech), ингибиторы дыхательной цепи митохондрий: Комплекса III - миксотиазол (2 мкМ и 4 мкМ) и антимицин А (2 мкМ) (Invitrogen), Комплекса I - пиерицидин (10 мкМ) (Invitrogen), ингибиторы переносчика адениновых нуклеотидов: бонгкрековую кислоту (10 мкМ, Calbiochem) и атрактилозид (100 мкМ, Sigma).

Объект исследования

В работе использовали клетки карциномы шейки матки человека HeLa.

Культуры клеток выращивали в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы (25 мМ), без пирувата, с добавлением 100 ед/мл стрептомицина и 100 ед/мл бензилпенициллина (Gibco) в присутствии 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки (НуClone) в атмосфере 5% СОг при 37°С. Для открепления клеток от субстрата использовали смесь трипсина 0,25 % и версена 1:1 (НЛП «ПанЭко») Клетки HeLa-Bcl-2 с гиперэкспрессией белка Вс1-2 были любезно предоставлены Г.А. Беловым (ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН) и подробно охарактеризованы в нашей лаборатории ранее [127]

Для экспериментов с пероксидом водорода использовали культуры 30 % конфлюэнтности.

Измерение продукции АФК методом проточной ц итофлуор и метр и и

Для исследования общего количества АФК в клетках использовали флуоресцентный индикатор АФК CM-DCFH2-DA (5'-6'-хлорметил-2,,7|-дихлородигидрофлуоресцеина диацетиловый эфир) (Ex/Em = 492-495 нм /517-527 нм, Molecular Probes, Invitrogen). Клетки окрашивали раствором красителя в концентрации 1,8 мкМ в среде DMEM без сыворотки в течение 15 мин при 37°С. Флуоресценцию анализировали с помощью проточного цитофлуориметра Beckman Coulter Cytomics FC 500 (содержит однофазный аргоновый лазер, длина волны возбуждающего света которого равна 488 нм, мощность 20 мВт, узкополосный оптический фильтр 525 нм ВР). Содержание АФК определяли по среднему значению интенсивности флуоресценции красителя (x-mean) для пиков, аналогичных гауссовскому распределению.

Статистическую обработку результатов проводили в программах Statistica 6.0 и Microsoft Excel 2003.

Визуализация митохондрий и цитоскелета

Митохондрии в живых клетках окрашивали с помощью специфического флуоресцентного красителя MitoTracker Green (Molecular Probes) 100 нМ 30 мин. Для количественной оценки фрагментации митохондриального ретикулума анализировали 100 клеток в каждом эксперименте, и вычисляли содержание клеток с фрагментированными митохондриями в культуре.

Для иммунофлуоресцентного окрашивания клетки фиксировали 15 мин в 3,7% формальдегиде и пермеабилизировали с помощью 0,5% тритона X-100 10 мин. Для окрашивания использовали антитела к цитохрому С (Pharmingen), тубулину (Sigma), белку Вах (Pharmingen) и вторичные антитела, конъюгированные с красителями Oregon Green и Texas Red-X

Pharmingen). Для окрашивания актиновых филаментов использовали фаллоидин, коньюгированный с TRITC (Sigma). Клетки на покровных стеклах заключали в среду Vectashield (Vector, США). Препараты анализировали с помощью традиционной и конфокальной флуоресцентной микроскопии, используя конфокальный микроскоп LSM 510 (Carl Zeiss) и флуоресцентный микроскоп Axiovert 200М (Carl Zeiss), количественную обработку фотографий проводили в программе ImageJ.

Для изучения электрической проводимости митохондриального ретикулума клетки HeLa предынкубировали с MitoQ 20 нМ в течение 7 дней. Митохондрии визуализировали с помощью тетраметилродамина (TMRM, 100 нМ, 15 мин). Клетки облучали аргоновым лазером конфокального микроскопа на масляном иммерсионном объективе Plan Neofluar xlOO, площадь облучаемой поверхности составляла 6x60 пикселов. Фотографии сделаны через 15 минут после облучения.

Анализ клеточного цикла

Для изучения клеточного цикла клетки переводили в суспензию, фиксировали 100 % спиртом на льду, окрашивали раствором йодистого пропидия (50 мкг/мл) в течение 1 часа при 37°С в темноте и анализировали на проточном цитофлуориметре.

Определение клеточной гибели

Для определения апоптоза и некроза клетки переводили в суспензию, добавляли к ним 100 мкл буфера, содержащего 10 мМ HEPES; 140 мМ NaCl и 2,5 мМ СаС12 (pH 7,4), добавляли аннексии V, конъюгированный с AlexaFluor 488 (Invitrogen, разведение 1:100) и йодистый пропидий (1 мкг/мл), инкубировали в темноте 10-15 минут и анализировали на проточном цитофлуориметре. Также гибель клеток оценивали с помощью реагента CellTiter Blue (Promega) согласно инструкции изготовителя.

Фракционирование клеток

Для выделения митохондрий из клеточной культуры мы переводили клетки в суспензию, затем центрифугировали 15 мин при 900 об/мин. Клетки ресуспендировали в буфере (220 мМ маннитол, 68 мМ сахароза, 80 мМ КС1, 0,5 мМ Mg(CH3COO)2, 10 мМ HEPES, рН 7.4, 2 мг/мл бычий сывороточный альбумин, коктейль ингибиторов протеаз (RocheDiag.)) и растирали в гомогенизаторе Поттера на холоду. Полученные лизаты центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин, 4°С. При этом осаждаются целые неразрушенные клетки и ядерная фракция. Отбирали супернатант, центрифугировали снова 15 мин при 10 000 об/мин, 4°С. На этом этапе осаждается митохондриальная фракция и легкие мембраны. Отбирали супернатант, содержащий цитоплазматическую фракцшо. Все пробы замораживали на -20°С. Для определения концентрации белка в каждой пробе методом RCDC использовали набор для измерения концентрации белка (BioRad).

Метод «Western Blotting»

Для приготовления образцов использовали 2х буфер для образца (20 мМ дитиотрейтол, 6 % SDS, 0,25 % Tris рН 6.8, 10 % глицерин, 10 мМ NaF и бромфеноловый синий). Образцы подвергали электрофорезу в 12 % полиакриламидном геле. Перенос осуществляли на PVDF мембрану (Amersham Sciences, Hybond-P). Сайты неспецифического связывания блокировали с помощью 5 % обезжиренного молока в ТБСТ (25 mM Tris рН 7,4, 0,15 М NaCl, 0,1% Tween20) буфере. Обработку первичными антителами (анти-Н8Р60 R&D Systems, анти-COXI Invitrogen, анти-DLPl BD Transduction) проводили при 4°С 18 часов в 3 % растворе молока в ТБСТ буфере, вторичными (биотинилированные антитела к мышиным иммуноглобулинам, полученные в результате иммунизации козла, Sigma) -1 час при 25°С, и затем промывали ТБСТ буфером. Белки визуализировали с использованием ECL-набора по инструкции производителя (GE Healthcare).

Результаты и обсуждение

Заключение диссертации по теме «Гистология, цитология, клеточная биология», Непряхина, Ольга Константиновна

Выводы

1. Пероксид водорода индуцирует эндогенную продукцию активных форм кислорода (АФК) в клетках. Ингибиторы дыхательной цепи митохондрий ускоряют продукцию АФК, а митохондриально-направленные антиоксиданты предотвращают ее, что указывает на митохондриальное происхождение этих АФК.

2. При окислительном стрессе АФК, образуемые в митохондриях, вызывают фрагментацию митохондриального ретикулума. Митохондриально-направленные антиоксиданты защищают митохондрии от фрагментации.

3. Фрагментация митохондрий при окислительном стрессе не сопровождается транслокацией белка Бгр-1 на мембрану митохондрий, характерной для фрагментации митохондрий при апоптозе.

4. Митохондриальные АФК вызывают транслокацию белка Вах из цитоплазмы на внешнюю мембрану митохондрий. При сублетальном окислительном стрессе транслокация Вах предшествует фрагментации митохондрий и не приводит к выходу цитохрома С из митохондрий.

5. Транслокация Вах под действием митохондриальных АФК зависит от конформационного состояния переносчика адениновых нуклеотидов, но не от циклоспорин-чувствительной поры во внутренней мембране митохондрий. Транслокация Вах и фрагментация митохондрий могут происходить независимо друг от друга.

Благодарности

Автор выражает благодарность ГА. Коршуновой за предоставленные реагенты БкСП и ЗкС^Ю, а также Г.А. Белову за предоставленную культуру клеток НеЬа, гиперэкспрессирующую белок Вс1-2. Кроме того, автор также благодарит Л.В. Домнину и О.Ю. Иванову за помощь в работе над диссертацией. Также автор выражает глубокую признательность научному руководителю академику В.П. Скулачёву и научному консультанту Б.В. Черняку за полученные знания, заботу, внимание и ценные советы во время выполнения диссертационного исследования. Особую благодарность выражаю О. Ю. Плетюшкиной за помощь в освоении методов, плодотворные дискуссии, за постоянную поддержку и терпение.

Заключение

Исследование нетоксического окислительного стресса в культуре клеток НеЬа показало, что в ответ на пероксид водорода в клетках активируется эндогенная продукция активных форм кислорода. Накопление АФК стимулируется ингибитором дыхательной цепи митохондрий миксотиазолом, и ингибируется специфическим митохондриально-направленным антиоксидантом БкСН. Это говорит о том, что АФК при окислительном стрессе образуются внутри митохондрий.

При окислительном стрессе происходит фрагментация митохондрий, которая усиливается под действием ингибиторов дыхательной цепи, и предотвращается митохондриально-направленными антиоксидантами. Можно предполагать, что АФК образующиеся в митохондриях в ответ на пероксид водорода, вызывают активацию механизмов, приводящих к фрагментации митохондриального ретикулума.

Мы обнаружили, что при окислительном стрессе происходит транслокация проапоптозного белка Вах из цитоплазмы на поверхность митохондрий, но при этом не наблюдается выход цитохрома С из митохондрий и другие признаки апоптоза. Митохондриально-направленные антиоксиданты блокируют транслокацию Вах, следовательно, для этого процесса необходимо накопление АФК в митохондриях. Оказалось, что локализация Вах в клетке зависит от конформации транслокатора адениновых нуклеотидов во внутренней мембране митохондрий. Мы полагаем, что митохондриальные АФК вызывают окисление критического дитиола в транслокаторе, что изменяет его конформацию и служит сигналом к транслокации Вах при окислительном стрессе. Транслокация Вах происходит значительно раньше, чем фрагментация митохондрий. Ингибитор транслокатора адениновых нуклеотидов бонгкрековая кислота предотвращает транслокацию Вах, но не останавливает фрагментацию митохондрий. Таким образом, можно полагать, что транслокация Вах не является сигналом к фрагментации митохондрий при окислительном стрессе.

Таким образом, использование митохондриально-направленных антиоксидантов позволило нам описать возможные механизмы фрагментации митохондрий и транслокации Вах при окислительном стрессе. Полученные результаты позволяют составить более полное представление о функционировании клеток в условиях нарушения редокс-статуса и вносят существенный вклад в понимание механизмов окислительного стресса.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Непряхина, Ольга Константиновна, 2009 год

1. Bakeeva, L.E., Yu.S. Chentsov and V.P. Skulachev. Mitochondrial framework (reticulum mitochondrial) in rat diaphragm muscle.// Biochim Biophys Acta. 501(3): p. 349-369 (1978).

2. Bereiter-Hahn, J. and M. Voth. Dynamics of mitochondria in living cells: shape changes, dislocations, fusion, and fission of mitochondria.// MicroscRes Tech. 27(3): p. 198-219 (1994).

3. Otsuga, D., B.R. Keegan, E. Brisch, J.W. Thatcher, G.J. Hermann, W. Bleazard and J.M. Shaw. The dynamin-related GTPase, Dnmlp, controls mitochondrial morphology in yeast.// J Cell Biol. 143(2): p. 333-349 (1998).

4. Smirnova, E., D.L. Shurland, S.N. Ryazantsev and A.M. van der Bliek. A human dynamin-related protein controls the distribution of mitochondria.// J Cell Biol. 143(2): p. 351-358 (1998).

5. Imoto, M., I. Tachibana, and R. Urrutia. Identification and functional characterization of a novel human protein highly related to the yeast dynamin-like GTPase Vpslp.// J Cell Sci. Ill ( Pt 10): p. 1341-1349 (1998).

6. Yoon, Y., K.R. Pitts, S. Dahan, and M.A. McNiven. A novel dynamin-like protein associates with cytoplasmic vesicles and tubules of the endoplasmic reticulum in mammalian cells.// / Cell Biol. 140(4): p. 779793 (1998).

7. Kamimoto, Т., Y. Nagai, H. Onogi, Y. Muro, T. Wakabayashi, and M. Hagiwara. Dymple, a novel dynamin-like high molecular weight GTPase lacking a proline-rich carboxyl-terminal domain in mammalian cells.// J BiolChem. 273(2): p. 1044-1051 (1998).

8. Shin, H.W., C. Shinotsuka, S. Torii, K. Murakami, and K. Nakayama. Identification and subcellular localization of a novel mammalian dynamin-related protein homologous to yeast Vpslp and Dnmlp.// J Biochem. 122(3): p. 525-530 (1997).

9. Pitts, K.R., Y. Yoon, E.W. Krueger, and M.A. McNiven. The dynamin-like protein DLP1 is essential for normal distribution and morphology ofthe endoplasmic reticulum and mitochondria in mammalian cells.// Mol Biol Cell. 10(12): p. 4403-4417 (1999).

10. Frank, S., B. Gaume, E.S. Bergmann-Leitner, W.W. Leitner, E.G. Robert, F. Catez, C.L. Smith, and R.J. Youle. The role of dynamin-related protein 1, a mediator of mitochondrial fission, in apoptosis.// Dev Cell. 1(4): p. 515-525 (2001).

11. Benard, G., N. Beilance, D. James, P. Parrone, H. Fernandez, T. Letellier, and R. Rossignol. Mitochondrial bioenergetics and structural network organization.///Cell Sei. 120(Pt 5): p. 838-848 (2007).

12. Wasiak, S., R. Zunino, and H.M. McBride. Bax/Bak promote sumoylation of DRP1 and its stable association with mitochondria during apoptotic cell death.// J Cell Biol. 177(3): p. 439-450 (2007).

13. Ingerman, E., E.M. Perkins, M. Marino, J. A. Mears, J.M. McCaffery, J.E. Hinshaw, and J. Nunnari. Dnml forms spirals that are structurally tailored to fit mitochondria.// J Cell Biol. 170(7): p. 1021-1027 (2005).

14. Yu, T., R.J. Fox, L.S. Burwell, and Y. Yoon. Regulation of mitochondrial fission and apoptosis by the mitochondrial outer membrane protein hFisl .//J Cell Sei. 118(Pt 18): p. 4141-4151 (2005).

15. Yoon, Y., E.W. Krueger, B.J. Oswald, and M.A. McNiven. The mitochondrial protein hFisl regulates mitochondrial fission in mammalian cells through an interaction with the dynamin-like protein DLP1.// Mol Cell Biol. 23(15): p. 5409-5420 (2003).

16. Stojanovski, D., O.S. Koutsopoulos, K. Okamoto, and M.T. Ryan. Levels of human Fisl at the mitochondrial outer membrane regulate mitochondrial morphology./// Cell Sei. 117(Pt 7): p. 1201-1210 (2004).

17. Serasinghe, M.N. and Y. Yoon. The mitochondrial outer membrane protein hFisl regulates mitochondrial morphology and fission through self-interaction.//Exp Cell Res. 314(19): p. 3494-3507 (2008).

18. Tieu, Q. and J. Nunnari. Mdvlp is a WD repeat protein that interacts with the dynamin-related GTPase, Dnmlp, to trigger mitochondrial division.// J Cell Biol. 151(2): p. 353-366 (2000).

19. Tondera, D., F. Czauderna, K. Paulick, R. Schwarzer, J. Kaufmann, and A. Santel. The mitochondrial protein MTP18 contributes to mitochondrial fission in mammalian cells .//J Cell Sei. 118(Pt 14): p. 3049-3059 (2005).

20. Gandre-Babbe, S. and A.M. van der Bliek. The novel tail-anchored membrane protein Mff controls mitochondrial and peroxisomal fission in mammalian cells.//Mol Biol Cell. 19(6): p. 2402-2412 (2008).

21. Chan, D.C. Mitochondrial fusion and fission in mammals.// Annu Rev Cell Dev Biol. 22: p. 79-99 (2006).

22. Karbowski, M., S.Y. Jeong, and R.J. Youle. Endophilin B1 is required for the maintenance of mitochondrial morphology.// J Cell Biol. 166(7): p. 1027-1039(2004).

23. Cipolat, S., O. Martins de Brito, B. Dal Zilio, and L. Scorrano. OPA1 requires mitofusin 1 to promote mitochondrial fusion.// Proc Natl Acad Sei USA. 101(45): p. 15927-15932 (2004).

24. Chen, H., S.A. Detmer, A.J. Ewald, E.E. Griffin, S.E. Fraser, and D.C. Chan. Mitofusins Mini and Mfii2 coordinately regulate mitochondrial fusion and are essential for embryonic development.// J Cell Biol. 160(2): p. 189-200 (2003).

25. Rojo, M., F. Legros, D. Chateau, and A. Lombes. Membrane topology and mitochondrial targeting of mitofusins, ubiquitous mammalian homologs of the transmembrane GTPase Fzo.// J Cell Sei. 115(Pt 8): p. 1663-1674 (2002).

26. Eura, Y., N. Ishihara, S. Yokota, and K. Mihara. Two mitofiisin proteins, mammalian homologues of FZO, with distinct functions are both required for mitochondrial fusion.// JBiochem. 134(3): p. 333-344 (2003).

27. Koshiba, T., S.A. Detmer, J.T. Kaiser, H. Chen, J.M. McCaffery, and D.C. Chan. Structural basis of mitochondrial tethering by mitofusin complexes.//Science. 305(5685): p. 858-862 (2004).

28. Chen, H., A. Chomyn, and D.C. Chan. Disruption of fusion results in mitochondrial heterogeneity and dysfunction.// J Biol Chem. 280(28): p. 26185-26192(2005).

29. Malka, F., O. Guillery, C. Cifuentes-Diaz, E. Guillou, P. Belenguer, A. Lombes, and M. Rojo. Separate fusion of outer and inner mitochondrial membranes.//EMBO Rep. 6(9): p. 853-859 (2005).

30. Okamoto, K. and J.M. Shaw. Mitochondrial morphology and dynamics in yeast and multicellular eukaryotes.// Annu Rev Genet. 39: p. 503-536 (2005).

31. Taguchi, N., N. Ishihara, A. Jofuku, T. Oka, and K. Mihara. Mitotic phosphorylation of dynamin-related GTPase Drpl participates in mitochondrial fission.// J Biol Chem. 282(15): p. 11521-11529 (2007).

32. Lee, Y.J., S.Y. Jeong, M. Karbowski, C.L. Smith, and RJ. Youle. Roles of the mammalian mitochondrial fission and fusion mediators Fisl, Drpl, and Opal in apoptosis J/Mol Biol Cell. 15(11): p. 5001-5011 (2004).

33. Sugioka, R., S. Shimizu, and Y. Tsujimoto. Fzol, a protein involved in mitochondrial fusion, inhibits apoptosis.// J Biol Chem. 279(50): p. 52726-52734 (2004).

34. James, D.I., P.A. Parone, Y. Mattenberger, and J.C. Martinou. hFisl, a novel component of the mammalian mitochondrial fission machinery.// J Biol Chem. 278(38): p. 36373-36379 (2003).

35. Karbowski, M., K.L. Norris, M.M. Cleland, S.Y. Jeong, and R.J. Youle. Role of Bax and Bak in mitochondrial morphogenesis.// Nature. 443(7112): p. 658-662 (2006).

36. Sheridan, C., P. Delivani, S.P. Cullen, and S.J. Martin. Bax- or Bak-induced mitochondrial fission can be uncoupled from cytochrome С release.//Mo/ Cell. 31(4): p. 570-585 (2008).

37. Parone, P.A., D.I. James, S. Da Cruz, Y. Mattenberger, O. Donze, F. Barja, and J.C. Martinou. Inhibiting the mitochondrial fission machinery does not prevent Bax/Bak-dependent apoptosis.//Mol Cell Biol. 26(20): p. 7397-7408 (2006).

38. Estaquier, J. and D. Arnoult. Inhibiting Drpl-mediated mitochondrial fission selectively prevents the release of cytochrome с during apoptosis.// Cell Death Differ. 14(6): p. 1086-1094 (2007).

39. Harder, Z., R. Zunino, and H. McBride. Sumol conjugates mitochondrial substrates and participates in mitochondrial fission.// Curr Biol. 14(4): p. 340-345 (2004).

40. Zunino, R., A. Schauss, P. Rippstein, M. Andrade-Navarro, and H.M. McBride. The SUMO protease SENP5 is required to maintain mitochondrial morphology and function.// J Cell Sei. 120(Pt 7): p. 1178-1188(2007).

41. Nakamura, N., Y. Kimura, M. Tokuda, S. Honda, and S. Hirose. MARCH-V is a novel mitofusin 2- and Drpl-binding protein able to change mitochondrial morphology.// EMBO Rep. 7(10): p. 1019-1022 (2006).

42. Karbowski, M., A. Neutzner, and R.J. Youle. The mitochondrial E3 ubiquitin ligase MARCH5 is required for Drpl dependent mitochondrial division.// J Cell Biol. 178(1): p. 71-84 (2007).

43. Chang, C.R. and C. Blackstone. Cyclic AMP-dependent protein kinase phosphorylation of Drpl regulates its GTPase activity and mitochondrial morphology.//Chem. 282(30): p. 21583-21587 (2007).

44. Cereghetti, G.M., A. Stangherlin, O. Martins de Brito, C.R. Chang, C. Blackstone, P. Bernardi, and L. Scorrano. Dephosphorylation by calcineurin regulates translocation of Drpl to mitochondria.// Proe Natl Acad Sei USA. 105(41): p. 15803-15808 (2008).

45. Cribbs, J.T. and S. Strack. Reversible phosphorylation of Drpl by cyclic AMP-dependent protein kinase and calcineurin regulates mitochondrial fission and cell death.//EMBO Rep. 8(10): p. 939-944 (2007).

46. Scorrano, L., M. Ashiya, K. Buttle, S. Weiler, S.A. Oakes, C.A. Mannella, and SJ. Korsmeyer. A distinct pathway remodels mitochondrial cristae and mobilizes cytochrome c during apoptosis.// Dev Cell 2(1): p. 55-67 (2002).

47. Desagher, S. and J.C. Martinou. Mitochondria as the central control point of apoptosis.// Trends Cell Biol. 10(9): p. 369-377 (2000).

48. Knoll, G. and D. Brdiczka. Changes in freeze-fractured mitochondrial membranes correlated to their energetic state. Dynamic interactions of the boundary membranes.//Biochim Biophys Acta. 733(1): p. 102-110 (1983).

49. Vyssokikh, M.Y. and D. Brdiczka. The function of complexes between the outer mitochondrial membrane pore (VDAC) and the adenine nucleotide translocase in regulation of energy metabolism and apoptosis.// Acta Biochim Pol. 50(2): p. 389-404 (2003).

50. Brdiczka, D.G., D.B. Zorov, and S.S. Sheu. Mitochondrial contact sites: their role in energy metabolism and apoptosis.// Biochim Biophys Acta. 1762(2): p. 148-163 (2006).

51. Zoratti, M. and I. Szabo. The mitochondrial permeability transition.// Biochim Biophys Acta. 1241(2): p. 139-176 (1995).

52. Kroemer, G. and J.C. Reed. Mitochondrial control of cell death.// Nat Med. 6(5): p. 513-519 (2000).

53. Waldmeier, P.C., J.J. Feldtrauer, T. Qian, and J.J. Lemasters. Inhibition of the mitochondrial permeability transition by the nonimmunosuppressive cyclosporin derivative NIM811.//Mol Pharmacol. 62(1): p. 22-29 (2002).

54. Kokoszka, J.E., K.G. Waymire, S.E. Levy, J.E. Sligh, J. Cai, D.P. Jones, G.R. MacGregor, and D.C. Wallace. The ADP/ATP translocator is not essential for the mitochondrial permeability transition pore.// Nature. 427(6973): p. 461-465 (2004).

55. Baines, C.P., R.A. Kaiser, T. Sheiko, W.J. Craigen, and J.D. Molkentin. Voltage-dependent anion channels are dispensable for mitochondrial-dependent cell death.//Nat Cell Biol. 9(5): p. 550-555 (2007).

56. Lalier, L., P.F. Cartron, P. Juin, S. Nedelkina, S. Manon, B. Bechinger, and F.M. Vallette. Bax activation and mitochondrial insertion during apoptosis.//Apoptosis. 12(5): p. 887-896 (2007).

57. Zamzami, N., C. Brenner, I. Marzo, S.A. Susin, and G. Kroemer. Subcellular and submitochondrial mode of action of Bcl-2-like oncoproteins.// Oncogene. 16(17): p. 2265-2282 (1998).

58. Mizuta, T., S. Shimizu, Y. Matsuoka, T. Nakagawa, and Y. Tsujimoto. A Bax/Bak-independent mechanism of cytochrome c release.// J Biol Chem. 282(22): p. 16623-16630 (2007).

59. Wolter, K.G., Y.T. Hsu, C.L. Smith, A. Nechushtan, X.G. Xi, and RJ. Youle. Movement of Bax from the cytosol to mitochondria during apoptosis.//J Cell Biol. 139(5): p. 1281-1292 (1997).

60. Antonsson, B., S. Montessuit, B. Sanchez, and J.C. Martinou. Bax is present as a high molecular weight oligomer/complex in the mitochondrial membrane of apoptotic cells.// J Biol Chem. 276(15): p. 11615-11623 (2001).

61. Nechushtan, A., C.L. Smith, Y.T. Hsu, and RJ. Youle. Conformation of the Bax C-terminus regulates subcellular location and cell death.// EMBO J. 18(9): p. 2330-2341 (1999).

62. Rosse, T., R. Olivier, L. Monney, M. Rager, S. Conus, I. Fellay, B. Jansen, and C. Borner. Bcl-2 prolongs cell survival after Bax-induced release of cytochrome c.//Nature. 391(6666): p. 496-499 (1998).

63. Tsujimoto, Y. Bcl-2 family of proteins: life-or-death switch in mitochondria.//BiosciRep. 22(1): p. 47-58 (2002).

64. Hsu, Y.T., K.G. Wolter, and RJ. Youle. Cytosol-to-membrane redistribution of Bax and Bcl-X(L) during apoptosis.// Proc Natl Acad Sci USA. 94(8): p. 3668-3672 (1997).

65. Kong, D., L. Xu, Y. Yu, W. Zhu, D.W. Andrews, Y. Yoon, and T.H. Kuo. Regulation of Ca2+-induced permeability transition by Bcl-2 is antagonized by Drpl and hFisl.//Mo/ Cell Biochem. 272(1-2): p. 187-1992005).

66. Brooks, C., Q. Wei, L. Feng, G. Dong, Y. Tao, L. Mei, ZJ. Xie, and Z. Dong. Bak regulates mitochondrial morphology and pathology during apoptosis by interacting with mitofusins.// Proc Natl Acad Sci USA. 104(28): p. 11649-11654(2007).

67. Mathai, J.P., M. Germain, and G.C. Shore. ВНЗ-only BIK regulates BAX,BAK-dependent release of Ca2+ from endoplasmic reticulum stores and mitochondrial apoptosis during stress-induced cell death.// J Biol Chem. 280(25): p. 23829-23836 (2005).

68. Scorrano, L., S.A. Oakes, J.T. Opferman, E.H. Cheng, M.D. Sorcinelli, T. Pozzan, and S.J. Korsmeyer. BAX and ВАК regulation of endoplasmic reticulum Ca2+: a control point for apoptosis.// Science. 300(5616): p. 135-139 (2003).

69. Horn, J.R., J.S. Gewandter, L. Michael, S.S. Sheu, and Y. Yoon. Thapsigargin induces biphasic fragmentation of mitochondria through calcium-mediated mitochondrial fission and apoptosis.// J Cell Physiol. 212(2): p. 498-508 (2007).

70. Szabadkai, G., A.M. Simoni, M. Chami, M.R. Wieckowski, RJ. Youle, and R. Rizzuto. Drp-1-dependent division of the mitochondrial network blocks intraorganellar Ca2+ waves and protects against Ca2+-mediated apoptosis.//Mol Cell. 16(1): p. 59-68 (2004).

71. Han, X.J., Y.F. Lu, S.A. Li, T. Kaitsuka, Y. Sato, K. Tomizawa, A.C. Nairn, K. Takei, H. Matsui, and M. Matsushita. CaM kinase I alpha-induced phosphorylation of Drpl regulates mitochondrial morphology.// J Cell Biol. 182(3): p. 573-585 (2008).

72. Frieden, M., D. James, C. Castelbou, A. Danckaert, J.C. Martinou, and N. Demaurex. Ca(2+) homeostasis during mitochondrial fragmentation and perinuclear clustering induced by hFisl.// J Biol Chem. 279(21): p. 22704-22714(2004).

73. Alirol, E., D. James, D. Huber, A. Marchetto, L. Vergani, J.C. Martinou, and L. Scorrano. The mitochondrial fission protein hFisl requires the endoplasmic reticulum gateway to induce apoptosis.// Mol Biol Cell. 17(11): p. 4593-4605 (2006).

74. Varadi, A., V. Cirulli, and G.A. Rutter. Mitochondrial localization as a determinant of capacitative Ca2+ entry in HeLa cells.// Cell Calcium. 36(6): p. 499-508 (2004).

75. Kruman, I., Q. Guo, and M.P. Mattson. Calcium and reactive oxygen species mediate staurosporine-induced mitochondrial dysfunction and apoptosis in PC 12 cells J/JNeurosci Res. 51(3): p. 293-308 (1998).

76. Hockenbery, D.M., Z.N. Oltvai, X.M. Yin, C.L. Milliman, and SJ. Korsmeyer. Bcl-2 functions in an antioxidant pathway to prevent apoptosis.// Cell. 75(2): p. 241-251 (1993).

77. Андреев, А.Ю., Кушнарева, Ю.Е., Старков, А.А. Метаболизм активных форм кислорода в митохондриях.// Биохимия. 70(2): с. 18 (2005).

78. Skulachev, V.P. Uncoupling: new approaches to an old problem of bioenergetics.//Biochim Biophys Acta. 1363(2): p. 100-124 (1998).

79. Herrero, A. and G. Baija. Localization of the Site of Oxygen Radical Generation inside the Complex I of Heart and Nonsynaptic Brain Mammalian Mitochondria.// J Bioenerg Biomembr. 32(6): p. 609-615 (2000).

80. Виноградов, А.Д., Гривенникова, В.Г. Генерация супероксид-радикала NADH: Убихинон оксиредуктазой митохондрий сердца.// Биохимия. 70(2): с. 9 (2005).

81. Lenaz, G., R. Fato, M.L. Genova, С. Bergamini, С. Bianchi, and A. Biondi. Mitochondrial Complex I: structural and functional aspects.// Biochim Biophys Acta. 1757(9-10): p. 1406-1420 (2006).

82. Finkel, T. and N.J. Holbrook. Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing./УNatwe. 408(6809): p. 239-247 (2000).

83. Storz, P. Reactive oxygen species-mediated mitochondria-to-nucleus signaling: a key to aging and radical-caused diseases.// Sci STKE. 2006(332): p. re3 (2006).

84. Crompton, M. The mitochondrial permeability transition pore and its role in cell death.//Biochem J. 341 ( Pt 2): p. 233-249 (1999).

85. Yu, Т., J.L. Robotham, and Y. Yoon. Increased production of reactive oxygen species in hyperglycemic conditions requires dynamic change ofmitochondrial morphology.// Proc Natl Acad Sci USA. 103(8): p. 26532658 (2006).

86. Nie, C., C. Tian, L. Zhao, P.X. Petit, M. Mehrpour, and Q. Chen. Cysteine 62 of Bax is critical for its conformational activation and its proapoptotic activity in response to H202-induced apoptosis.// J Biol Chem. 283(22): p. 15359-15369 (2008).

87. Parone, P.A., S. Da Cruz, D. Tondera, Y. Mattenberger, D.I. James, P. Maechler, F. Barja, and J.C. Martinou. Preventing mitochondrial fission impairs mitochondrial function and leads to loss of mitochondrial DNA.// PLoS ONE. 3(9): p. e3257 (2008).

88. Lee, S., S.Y. Jeong, W.C. Lim, S. Kim, Y.Y. Park, X. Sun, R.J. Youle, and H. Cho. Mitochondrial fission and fusion mediators, hFisl and OPA1, modulate cellular senescence.// J Biol Chem. 282(31): p. 22977-22983 (2007).

89. Gomes, L.C. and L. Scorrano. High levels of Fisl, a pro-fission mitochondrial protein, trigger autophagy.// Biochim Biophys Acta. 1777(7-8): p. 860-866 (2008).

90. Skulachev, V.P. How to clean the dirtiest place in the cell: cationic antioxidants as intramitochondrial ROS scavengers.// IUBMB Life. 57(4-5): p. 305-310(2005).

91. Doughan, A.K. and S.I. Dikalov. Mitochondrial redox cycling of mitoquinone leads to superoxide production and cellular apoptosis.// Antioxid Redox Signal. 9(11): p. 1825-1836 (2007).

92. Скулачев, В.П. Попытка биохимиков атаковать проблему старения: "Мегапроект" по проникающим йонам. Первые итоги и перспективы (обзор).//Биохимия. 72(12): с. 1385-1396 (2007).

93. Jauslin, M.L., T. Meier, R.A. Smith, and M.P. Murphy. Mitochondria-targeted antioxidants protect Friedreich Ataxia fibroblasts fromendogenous oxidative stress more effectively than untargeted antioxidants.//i^SEi? J. 17(13): p. 1972-1974 (2003).

94. Saretzki, G., M.P. Murphy, and T. von Zglinicki. MitoQ counteracts telomere shortening and elongates lifespan of fibroblasts under mild oxidative stress .//Aging Cell. 2(2): p. 141-143 (2003).

95. Щепина, JI.A., E.H. Попова, О.Ю. Плетюшкина, и Б.В. Черняк. Апоптоз клеток HeLa и антиапоптозное действие онкобелка Вс1-2 не зависят от дыхания и мембранного потенциала митохондрий // Биохимия. 67(2): с. 222-226 (2002).

96. Murphy, M.P. How mitochondria produce reactive oxygen species.// Biochem J. 417(1): p. 1-13 (2009).

97. Chang, T.S., W. Jeong, D.Y. Lee, C.S. Cho, and S.G. Rhee. The RING-H2-finger protein APC11 as a target of hydrogen peroxide.// Free Radic Biol Med. 37(4): p. 521-530 (2004).

98. Kim, B.J., S.W. Ryu, and BJ. Song. JNK- and p38 kinase-mediated phosphorylation of Bax leads to its activation and mitochondrial translocation and to apoptosis of human hepatoma HepG2 cells.// J Biol Chem. 281(30): p. 21256-21265 (2006).

99. Kantrow, S.P. and C.A. Piantadosi. Release of cytochrome c from liver mitochondria during permeability transition.// Biochem Biophys Res Commun. 232(3): p. 669-671 (1997).

100. Choksi, K.B., W.H. Boylston, J.P. Rabek, W.R. Widger, and J. Papaconstantinou. Oxidatively damaged proteins of heart mitochondrial electron transport complexes.//Biochim Biophys Acta. 1688(2): p. 95-1012004).