Разработка биотехнологии получения препарата пектиназ на основе селекционированного штамма Aspergillus foetidus 379-K тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Соколова, Елена Николаевна

• Соколова, Елена Николаевна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Соколова, Елена Николаевна

ВВЕДЕНИЕ

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Классификация пектолитических ферментов

1.1.1 Пектинэстераза высших растений

1.1.2 Полигалактуроназа высших растений

1.2. Селекция и мутагенез микроорганизмов — продуцентов пектолитических ферментов

1.3. Биосинтез пектолитических ферментов микроорганизмами

1.4. Продуценты пектолитических ферментов

1.5. Аспекты практического применения пектолитических ферментов

Глава П. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Материалы и методы исследований 49 ^

2.1.1 Объекты исследований

2.1.2 Условия хранения посевного материала

2.1.3 Культивирование микроорганизмов

2.1.4 Влияние начального рН питательной среды

2.1.5 Влияние аэрации питательной среды на 50 активность пектолитических ферментов

2.1.6 Влияние возраста посевного материала

2.1.7 Получение концентрированных ферментных 51 препаратов

2.2. Методы определения активности ферментов

2.2.1 Определение общей пектолитической 51 активности

2.2.2 Определение эндо-полигалактуроназной 52 активности

2.2.3 Определение пектинэстеразной активности

2.2.4 Определение ксиланазной активности

2.2.5 Определение целлюлолитической активности

2.2.6 Определение (З-Глюканазной активности

2.2.7 Определение хитиназной активности

2.3 Методы биохимического анализа

2.3.1 Определение содержания растворимого белка по 54 методу Лоури

2.3.2 Определение термостабильности 54 пектолитических ферментов

2.3.3 Определение рН-стабильности пектолитических 55 ферментов

2.3.4 Структура исследований

Глава Ш. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ

3.1. Сравнительная оценка микромицетов, ' синтезирующих пектолитические ферменты

3.1.2 Селекция штамма A.foetidus 37 с целью повышения его биосинтетической способности

3.1.2 Подбор условий для поддержания биохимической активности в посевной культуре

3.2. Разработка ускоренного микробиологического метода отбора активных вариантов

3.3. Физиолого - биохимическая характеристика отобранного варианта

3.3.1 Оптимизация состава питательной среды для биосинтеза пектолитичеких ферментов методом аддитивно-решетчатого описания объекта

3.4. Селекция и мутагенез родительского штамма

A.foetidus 37

3.4.1 Методика по ведению и хранению штамма

Aspergillus foetidus 379-K - продуцента пектолитических ферментов

3.4.1.1 Морфологическая характеристика продуцента 79 пектолитических ферментов

3.4.1.2 Описание процесса поддержания продуцента 80 пектолитических ферментов вактивном состоянии

3.4.1.3 Приготовление суспензии конидий Aspergillus 80 foetidus 379-K

3.4.1.4 Рассев суспензии конидий продуцента 81 пектолитических ферментов на агаризованную питательную среду в чашках Петри

3.4.1.5 Выращивание колоний микромицета Aspergillus 82 foetidus 379-К в чашках Петри и проверка активности в отобранных колониях

3.4.1.6 Рассев активных колоний на косяки с 82 агаризованной питательной средой и определение активности пектолитических ферментов в култьтуре микромицета Aspergillus foetidus 379-K

3.5. Исследование процессов биосинтеза экзопектиназ и состава ферментативного комплекса, продуцируемого грибом A.foetidus 379-К

3.5.1 Влияние начального рН на синтез 84 пектолитических ферментов

3.5.2 Влияние интенсивности аэрирования на 85 биосинтез пектиназ

3.5.3 Динамика накопления пектолитических 86 ферментов и изменение рН в процессе роста культуры

3.6. Получение комплексного ФП Пектофоетидин

Г10Х иГ18Х

3.6.1 Изучение условий получения ФП 90 Пектофоетидин Г10Х и Г18Х и их биохимичекая характеристика

3.6.2 Изучение фракционного состава ФП 92 Пектофоетидин Г10Х, полученного на основе мутантного штамма Aspergillus foetidus 379-К

3.6.3 Сравнительная характеристика ФП 104 Пектофоетидин Г10Х и Пектофоетидин П10Х

3.6.4. Изучение рН и термостабильности ФП пектиназ

3.6.5. Исследование эффективности действия ФП 109 пектиназ на деструкцию клюквенного сырья при получении соков

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка биотехнологии получения препарата пектиназ на основе селекционированного штамма Aspergillus foetidus 379-K»

Актуальность темы. В настоящее время большое внимание уделяется пектиновым веществам, деполимеризация которых осуществляется ферментами, входящими в пектолитический комплекс: пектингидролазами и пектинлиазами. Пектолитические ферменты имеют большое промышленное значение в различных отраслях биотехнологии: при; получении пектинов; для интенсификации производства соков из плодово-ягодного сырья и осветления вин; для получения пищевых красителей и таннинов; при обработке текстильных волокон; Потребность в этих ферментах стабильно растет.

Эффективность расщепления пектинсодержащих веществ зависит не только от применения биопрепаратов-источников активных пектолитических ферментов, но и от соотношения пектиназ различной специфичности и механизма действия в составе пектолитического комплекса; что: обусловлено физиологическими и культуральными особенностями; штамма-продуцента. Одним из основных источников получения пектолитических ферментов являются микромицеты, которые обладают характерной особенностью синтезировать широкий спектр активных внеклеточных пектиназ.

Работы многих исследователей посвящены созданию активных штаммов-продуцентов пектиназ и технологиям производства и применения ФП пектолитического действия (Бравова Г.Б.1981, Михайлова Р.В., Сапунова Л.И. 1992, Синицын А.П., Семенова М.В.2003, Бутова С.Н.2004, Римарева Л.В., Курбатова Е.И.2004).

Ранее широкое применение в сокоморсовой? промышленности и виноделии имел ФП отечественного производства Пектофоетидин ПГОХ. В биотехнологии Пектофоетидина использовали гриб Aspergillus foetidus, культивируемый твердофазным методом. Однако, в настоящее время предприятия, основанные на поверхностном культивировании продуцентов-ферментов, отсутствуют.

На современном этапе перспективным направлением науки является создание с использованием генетических и селекционных методов нового высокоэффективного штамма-продуцента пектолитических ферментов для глубинного культивирования, с целью разработки научных основ ферментных технологий для перерабатывающих отраслей АПК. Применение отечественных биокатализаторов позволит не только интенсифицировать существующие биотехнологические процессы в пищевой промышленности и создать конкурентоспособную продукцию нового поколения с заданными свойствами, но и произвести импортозамещение, так как высокая цена биопрепаратов ограничивает их широкое применение в России.

Цель и задачи исследования. Основная цель диссертационной работы заключалась в скрининге активного штамма - продуцента внеклеточных пектиназ, подборе оптимальных условий его глубинного культивирования для получения ферментного комплексного препарата пектолитического действия.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- скрининг и селекция штаммов- продуцентов внеклеточных пектиназ;

- мутагенез селекционированного штамма для, повышения его биосинтетической способности; изучение физиолого-морфологических и биохимических особенностей отобранного продуцента;

- подбор оптимальных условий для получения ферментного препарата и исследование его биохимической характеристики; оценка эффективности применения препаратов для* биокатализа полисахаридов растительного сырья.

Научная новизна работы. Впервые методами селекции и мутагенеза осуществлен скрининг нового штамма Aspergillus foetidus 379-К -продуцента комплекса пектолитических ферментов и исследованы его культуральные и морфолого-биохимические признаки. На основе установленных физиологических особенностей селекционированного штамма подобраны условия, позволяющие продуцировать ферментативный комплекс с доминирующими ферментами пектолитического действия и сопутствующими — ксиланазой, целлюлазой, (3-глюканазой, хитиназой, маннаназой. Разработан новый экспресс-метод отбора активных вариантов при селекции микромицетов-продуцентов пектиназ. Получены, новые экспериментальные данные по составу ферментного комплекса, продуцируемого A.foetidus 379-К. Показана возможность регуляции биосинтеза отдельных ферментов комплекса штаммом A.foetidus 379-К путем изменения условий культивирования, (рН, температура, время культивирования). Получен новый ферментный препарат Пектофоетидин методом глубинного культивирования и исследована его биохимическая характеристика.

Практическая значимость работы. В результате изучения свойств, отселекционированного штамма разработана и экспериментально обоснована новая t технология ферментного препарата Пектофоетидин. Штамм ч ' г депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганимзмов под номером F-962. Разработаны паспорт на штамм Aspergillus foetidus 379-К, методика по ведению и хранению продуцента пектолитических ферментов, ТУ на ферментный препарат Пектофоетидин Г10Х и ТИ по получению ФП.

Проведены производственные испытания нового ФП на ОАО «Уржумский спирто-водочный завод» в технологии получения спиртованных соков.

Апробация работы. Основные положения представлены на следующих симпозиумах и конференциях: Международных симпозиумах «Микробные биокатализаторы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК (Москва, 2004); «Микробные биокатализаторы для перерабатывающих отраслей АПК» (Москва, 2006); Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы создания продуктов здорового питания. Наука и технологии» (Углич,2006);

Микробные биокатализаторы и их роль в нано- и биотехнологиях» (Москва,2008)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них статей- 7.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, списка литературы, включающегоисточника, из них /^/отечественных, JX иностранных. Работа изложена /SJ страницах машинописного текста, включает таблиц и j^/рисунков.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Соколова, Елена Николаевна

114 ВЫВОДЫ

1. Проведена сравнительная характеристика различных микроорганизмов — продуцентов пектолитических ферментов и отобран в качестве исходного - штамм Aspergillus foetidus -37. При селекции исходного штамма выделен активный штамм Aspergillus foetidus -37-4, биосинтетическая способность которого по отношению к экзопектиназам увеличена в 2 раза. Исследованы физиолого-биохимические и морфологические признаки отобранного штамма, подобрана питательная среда, обеспечивающая повышение активности селекционированного штамма на 30%.

2. Разработан новый экспресс-метод отбора активных вариантов при селекции микромицетов — продуцентов пектиназ.

3. На основе многоступенчатой селекции и мутагенеза осуществлен скрининг нового мутантного штамма Aspergillus foetidus -379-К, биосинтетическая активность которого превышала исходный штамм на 200%. Разработаны условия культивирования микромицета, обеспечивающие максимальный синтез полигалактуроназ (48 ч роста), пектинэстераз (96 ч роста) при оптимальной температуре роста 32°С, исходном рН среды 5,5.

4. Исследованы физико-химические свойства ФП Пектофоетидин Г10Х и установлены оптимальные условия действия пектиназ (рН 4,0-5,0, температура 35-45°С) и условия обеспечивающие стабильность ферментных препаратов и сохранение уровня активности пектолитических ферментов в течение длительного времени (рН стабильность-3,0-5,5, термостабильность 30-50°С).

5. Разработан способ и оптимальные параметры процесса получения концентрированных ферментных препаратов пектиназ: Пектофоетидин Г10Х и Г18Х. Установлено, что общая пектолитическая и полигалактуроназная активности препарата пектиназ Пектофоетидин Г10Х, полученного на основе нового мутантного штамма в 1,3 раза превосходят активности известного препарата Пектофоетидин П10Х.

6. Методом хроматографического фракционирования исследован ферментный комплекс, синтезируемый селекционированным микромицетом. Показана его многокомпонентность и состав основных (полигалактуроназа, пектинэстераза, р-глюканазы) и минорных ферментов (ксиланаза, целлюлаза, кислая протеаза, пектинлиаза, арабиназа, галактоманнаназа,).

7. Проведены производственные испытания и показана эффективность полученного комплексного ферментного препарата пектиназ в производстве соков и морсов.

8. Экономическая эффективность от производства 1т ферментного препарата пектиназ по предложенной технологии составит до 1млн.рублей в год.

116

3.7. Заключение

В результате проведенных исследований с применением методов селекции и мутагенеза был получен новый штамм - продуцент пектолитического комплекса ферментов Aspergillus foetidus 379-К.

Штамм Aspergillus foetidus 379-К депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКПМ) под номером F-962.

На основе установленных закономерностей подобраны условия культивирования, обеспечивающие максимальный синтез пектолитических ферментов.

Разработаны оптимальные условия получения концентрированного ферментного препарата методом осаждения активного белка этанолом.

Анализ биохимического состава ферментного комплекса показал, что полученный препарат содержал помимо ферментов пектолитического комплекса, ферменты, гидролизующие некрахмальные полисахариды, такие как целлюлаза, ксиланаза, хитиназа, р-глюканаза.

Сравнительные исследования биохимического состава препаратов Пектофоетидин П10Х и Пектофоетидин Г10Х показали преимущество нового ферментного препарата Пектофоетидин Г10Х.

Показана эффективность использования полученного ферментного препарата для деструкции клюквенного сырья.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Соколова, Елена Николаевна, 2008 год

1. ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса

2. Алиханян С.И. Селекция промышленных микрорганизмов. // Издательство « Наука», Москва, 1968, 392с.

3. Айзенберг В.Л., Захарченко В.А., Сырчин С.А. и др. Отбор микромицетов по способности к образованию фермента пектинэстеразы. // Экспериментальная и клиническая медицина.- 1999, №2,- с.21-23.

4. Арасимович В.В., Балтага Н.П., Пономарева H.JI. Методы анализа пектиновых веществ, гемицеллюлаз и пектолитических ферментов в плодах. // Сб. Академии наук Молдавской ССР.- Кишинев.-1970 49с.

5. Астапович Н.И. Образование пектолитических ферментов грибом S.sclerotium и A.niger- 2 в условиях глубинного культивирования. // Автореферат диссертации кандидата биологических наук. 1970, - 21с.

6. Астапович Н.И., Кондратьева Л.В., Лобанок А.Г., Головнева Н.А., Маркина В.Л., Рябая Н.Е. Влияние глюкозы на образование эндометилполигалактуроназы у Aspergillus foetidus . // Прикладная биохимимя и микробиология.- 1981, XVII, выпуск 6, с.864-869.

7. Астапович Н.И. Рябая Н.Е. Полигалактуроназа Sacch.pastorianus: выделение и некоторые свойства. // Прикладная биохимия и микробиология. 1997, - т.ЗЗ, № 3 - с. 287-291.

8. Астапович Н.И. Рябая Н.Е. Иннактивация полигалактуроназы в процессе роста дрожжей Sacch.pastorianus. // Прикладная биохимия и микробиология. — 2000 г., т. 36, стр. 160-163.

9. Бабицкая В.Г., Грель М.В. Подбор питательной среды на основе молочной сыворотки для синтеза пектолититеских ферментов. // Москва.- 1987,с.321.

10. Бетяева Е.А. Пектин, его модификации и применение в пищевой промышленности. Обзорная информация. // Москва.-АгроНИИТЭИПП. 1992 г., 32с.11.«Биохимия растительного сырья», под редакцией В.Г.Щербакова, Москва, Колосс, 1999, 376с.

11. Блиева Р. К. Изучение биосинтеза пектинрасщепляющих ферментов при глубинном культивировании плесневых грибов из рода Aspergillus. // Автореферат дисс. на соискание уч.степени канд. техн.наук. 1967 г., Алма-Ата.,25с.

12. Блиева Р.К. Белходжаева А.А. Преимущество культивирования иммобилизованной культуры Aspergillus awamori -16 по сравнению со свободным мицелием. //Биотехнология 1991 г. № 3, с. 62-65.

13. Бравова Г.Б., Калунянц К.А., Гребешова Р.Н., Дуда В.И. и Купцова Г.Б. Технология культивирования анаэробных бактерий рода Clostridium продуцентов пектолитических ферментных препаратов. // Сб.трудов, вып. 2, 1974 г., с. 71- 77.

14. Бродская С.З. Влияние различных доз УФ на получение вариантов Aspergillus, образующих активные протеазы. // Сб.трудов института микробиологии АН СССР, вып. 10, 1961 г., с.14-17.

15. Буромский И.Д. Влияние Zn, Mg и К на обмен веществ у Asp.niger. // Микробиология, т.5, выпуск 6, 1936, с.800-811.

16. Бутова С.Н. Биотехнологическая деградация отходов растительного сырья.// Москва, Издательство Россельхозакадемии, 2004, 319с.

17. Бутова С.Н. Разработка биотехнологических основ деградации отходов растительного сырья ферментами пектолитического комплекса. // Автореферат на соискание уч.степени доктора биол.наук, Москва, 2005, 46с.

18. Бутова С.Н., Стребков В.Б., Лыско К.А. Использование дрожжевой полигалактуроназы при расщеплении пектина, полученного из отходоврастительного сырья. // Хранение и переработка сельхозсырья, 2005, №5, с.3-4.

19. Васильева К.В. Гладких Г.А. Иванова JI.B. Давыдова М. А. и др. Пектолитические ферменты из Asp.niger. // «Биохимия хранения картофеля и овощей» Москва, Наука, 1990, с.77- 83.

20. Васильева К.В., Гладких Г.А., Умралина А.Р. Пектолитические ферменты фитопакогенных микроорганизмов: свойства и перспектива применения. // Сб. «Биосинтез ферментов микроорганизмами. Тезисы докладов III Всесоюзной конференции Кобулетти», 1986, с. 140.

21. Величко Б.А., Калунянц К.А., Чернова Г.А., Брунц И.А. Получение*препарата пектиназы различного комплекса при глубинном культивировании Aspergillus awamori -16. // Сб.трудов, Москва, 1974 с. 58-61.

22. Величко Б.А., Черкасова Г.В., Шутова JI.A., Полянская* Т.А. Способ приготовления питательной среды для культивирования продуцентов пектолитических ферментов. // Биотехнология, Москва, 1992,№-10.,с.22-25

23. Вербина Н.М., Цыцура О.И. Ускоренный метод отбора продуцентов пектолитических ферментов. // Микробиология, т. XXXVIII, № 2 , Москва, 1969,с. 372-375.

24. Вербина Н.М. Цыцура О.И. Пектолитическая активность некоторых грибов. // Микробиология, т. XXXVIII, № 1, Москва, 1969, с. 29-35.

25. Витол И.С. Кобелева И.Б., Траубенберг С.Е. Ферменты и их применение в пищевой промышленности. // Москва, Издательский комплекс МГУПП, 2000, 36с.

26. Возняковская Ю.М. Аврова Н.П. Анроникашвили Е.Д. Размножение и синтез пектолитических ферментов Clostridium felsineum на средах с разными источниками углерода.// Микробиология, т.ХЫИ, вып. 6, Москва, 1974, с.423.

27. Галатенко О.А., Терехова Л.П., Булина Т.И. Метод быстрого поиска актиномицетов — продуцентов антибиотиков, и эффективных в отношении метициллинрезистентного штамма Staphylococcus arreus.// Биотехнология, № 4 ,Москва, 2004, с. 17-23.

28. Гладких Т.А., Васильева К.В., Метлицкий Г.В. // Прикладная биохимия и микробиология, т. XIV, № 6,1978, с. 833-848.

29. Голубев В.Н., Жиганов И.Н. Пищевая биотехнология. // Москва, ДеЛи принт, 2001, 123с.

30. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. // Москва, Издательство «Элевар» 2000, 512с.

31. Грачева И.М., Бутова С.Н., Типисева И.А., Эль-Решстан Г.И., Теоретические основы биотехнологии. Биохимические основы синтеза биологически активных веществ. // Москва, Издательство «Элевар», 2003, 534с.

32. Грачева И.М., Покровская С.С., Нгуен Ла Ай, Бутова С.Н. Изучение и оптимизация условий культивирования, обеспечивающих максимальный уровень биосинтеза полигалактуроназы дрожжами. // Москва, ВИНИТИ, 1994, Юс.

33. Гребешова Р.Н. Способы стабилизации ферментных препаратов. // Москва Прикладная биохимия и микробиология. 1994, № 2, с. 196-203.

34. Гришутин С.Г. Свойства ксиланаз, р-глюканаз и ксилоглюканаз Aspergillus japonicus. // Диссертация на соискание степени канд.хим.наук, МГУ, Москва, 2004, 177с.

35. Гусаков А.В., Марков А.В., Гришутин С.Г., Семенова М.В., Кондратьев Е.Г., Синицын А.П. Бискозиметрический метод определения общей эндополимеразной активности пектиназ. // Москва, Биохимия, 2002 т. 67 № 6 с. 815-822.

36. Дадашев М.Н., Вагидов Я.А., Шихнебиев Д.А., Балиева Ж.С. Перспективы производства и применения пектиновых веществ. // Хранение и переработка с/х сырья, №9,2000,с.46-50.

37. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. // Пер. с англ., Москва, 1982, т.1-3, 935с.

38. Донченко JI.B. Технология пектина и пектинопродуктов. // Москва,ДеЛи, 2000, 256с.

39. Ежова А.Ю.,Шишкова Э.А.,Бравова Г.Б.,Нестеренко Е.А. Свойства пектолитических лиаз Bacillus macerans. // Биотехнология, 2002,№2,с.20-29.

40. Ермолицкий В.Н. Кислая протеиназа Aspergillus foetidus, регуляция биосинтеза и свойства. // Автореферат диссертации на соискание уч.степени кандидата биологических наук, Минск, 1989,23с.

41. Имшенецкий А.А., Ульянова О.М. Биохимическая активность мутантов Fusarium moniliforme Scheld. //Микробиология ,31,вып.5,1962, с.832.

42. Калашникова Н.А., Гребешова Р.Н., Купцова Г.Б., Киселева JI.B. и др. Обработка плодово-ягодного сырья композициями ферментных препаратов. // Консервная и овощесушильная прмышленность, 1982,№8,с. 1 -3.

43. Калунянц К.А.,Величко Б.А.,Чернова Г.А. Получение пектолитическихк ,ферментных препаратов в опытно-промышленных условиях. // Сб.трудов «Ферменты и применение в н/х», Москва, 1972, с.270-278.

44. Калунянц К.А., Величко Б.А., Брунс И.А., Малей С.М. Получение препаратов пектиназы различного комплекса при глубинном культивировании Aspergillus awamori —16. // Сб.трудов, вып.2, Москва, 1974,с.62-64.

45. Капитонова JI.C., Родионова Н.А., Фениксова Р.В. Пектолитические ферменты Clostridium felsineum. // Прикладная биохимия и микробиология, т.VIII, вып.5,1972,с.539-546.

46. Касаткина И.Д., Желтова Е.Г. О методах отбора мутантов Aspergillus niger с измененной способностью синтезировать органические кислоты. //Микробиология,т.ХХХ1У,вып.З,1965,с.511-517.

47. Келети Т. Основы ферментативной кинетики. // Москва, Мир, 1990, 350с.

48. Кислухина О.В: Ферменты в производстве пищи и кормов. // ДеЛи принт, Москва,2002,336с.

49. Коваленко А.В., Безусов А.Т. Новый пектолитический препарат. // Пищевая промышленность, 1996,№12,с.35-36.

50. Кречетникова А.Н. Разработка технологии ферментного препарата целлюлазно-пектиназного1 комплекса. // Автореферат на соисканиеь учхтепени кандидата технических наук. Москва, 1987, 24с.

51. Кувикова А.Ф. Применение пектолитических ферментных препаратов в винодельческой, промышленности. // Сборник материалов Всесоюзного совещания по- вопросам технологии и химии пектина. Москва, 1962,ГОСИНТИ, с.З.

52. Курбатова Е.И., Соколова* Е.Н., Римарева- Л.В. Использование препаратов, полученных из глубинной культуры A.foetidus МБ-4, для гидролиза клюквы. // Производство спирта и ликеро-водочных изделий, №3, 2005, с. 13-14.

53. Кюдулас И., Авиженис В. Новые ферментные препараты» для-, производства соков* и вин. // Сборник трудов II Международной-конференции « Качество,безопасность и экология пищевых продуктов' и производство», Ялта, 2001', с.202-203.

54. Лебедев BIB.', Астапович Н.И., Датунашвили Е.Н., Герхикова В.Г. Влияние различных источников азотного и фосфорного' питания нанакопление внеклеточной эндополигалактуроназы дрожжей Z.marxiana. // Вести АН, Москва, 1985, с.57-59.

55. Лисицын А.Б., Иванкин А.Н., Неклюдов А.Д. Методы практической биотехнологии. // Москва, Издательство ВНИИМП, 2002, 408с.

56. Лифшиц Д.Б., Сергиенко М.Г., Кафтанова Л.Е., Равдина О.Ю. К вопросу вискозиметрического определения эндополигалактуроназной активности ферментных препаратов. // Сб.трудов, выпуск 2, Москва, 1974,с.29-39.

57. Лобанок А.Г., Михайлова Р.В., Сапунова Л.И. Влияние компонентов птательной среды на конститутивный синтез пектолитических ферментов Penicillium digitatum. // Микология и фитопатология, т.13, выпуск 3,1979,с.213-216.

58. Лобанок А.Г., Михайлова Р.В., Сапунова Л.И. Кинетика конститутивного синтеза полиметилгалактуроназ Penicillium digitatum в зависимости от источника углерода и рН. // Микробилогия , t.XVI, выпуск 5, с.920-925.

59. Лосякова Л.С., Мушникова Л.Н., Мишина З.Н. Исследование образования пектолитических ферментов при культивировании плесневого гриба A.awamori 16. // Сб.трудов «Ферменты и применение в н/х», Москва, 1972, с.75-87.

60. Лосякова Л.С., Руденко Т.П., Струнникова Т.Р., Синякина А.А. Изучение условий биосинтеза пектолитических ферментов плесневым грибом A.foetidus. // Сб.трудов « Ферменты и применение в н/х», Москва, 1972, с.88-93.

61. Лосякова Л.С., Струнникова Т.Р. Влияние различных источников азота на биосинтез пектолитических ферментов при культивировании плесневого гриба A.foetidus на твердых питательных средах. // Сб.трудов, выпуск 2, Москва, 1974, с.97-100.

62. Маркина М.Н., Румянцева Г.Н., Птичкина Н.М. Использование отечественных ферментных препаратов для получения пектина из жома. // International Congress Biotechnology, Москва, 2002, 379с.

63. Маркина М.Н., Румянцева Г.Н., Птичкина Н.М. Использование отечественных ферментных препаратов для получения пектина из жома тыквы. // Хранение и переработка сельхозсырья, №6, 2002.С.48-52.

64. Мартисян Е.А., Жуков Н.А. Оптимизация стадии ферментативной обработки плодово-ягодного сырья при получении спиртованных соков.// Всероссийская научно-техническая конференция «Наука-производство-технология-экология» том 2, КФ, БФ, Киров, 2005,с.194

65. Махмуд С.А.З., Машхур В.А., Эль-Хаддад М.Е., Эль-Гаммал С.Е. Влияние состава среды и условий культивирования A.foetidus на биосинтез глюкоамилазы. // Микробиология, t.XLVII, выпуск 2, 1978, с.220-225.

66. Миндлин С.З. Роль индуцированных мутаций в селекции промышленных микроорганизмов. // Сб. « Генетика и селекция микроорганизмов», Москва, Наука, 1964, с.265.

67. Михайлова Р.В., Сапунова Л.И., Лобанок А.Г. Образование внеклеточных пектинлиазных комплексов грибами рода Penicilium. // Микология и фитопатология, т.26, вып.4,1992,с.273-278.

68. Михайлова Р.В., Лобанок А.Г., Сапунова Л.И. Биологические науки, №4, с. 107-113.

69. Михайлова Р.В., Лобанок А.Г., Сапунова Л.И. Катаболитная репрессия конститутивного синтеза пектинтрансэлиминазы у Pen.digitatum. // Микробиология, т.52, вып.2,1983, с.197-201.

70. Михайлова Р.В. Закономерности биосинтеза пектолитических ферментов A.alliaceus и Pen.digitatum. // Автореферат на соискание уч.степени кандидата биологических наук, Минск, 1981, 23с.

71. Михайлова Р.В. Пектиндеполимеразы грибов: особенности регуляции биосинтеза, свойства и применение. // Автореферат на соискание уч.степени доктора биологических наук, Минск, 1995, 35с.

72. Михайлова Р.В. Биотехнология микробных ферментов. // Наука и техника, Минск,1989,с.5-33.

73. Михайлова Р.В., Сапунова Л.И., Лобанок А.Г. Получение пектингидролазного ферментного препарата из A.alliaceus. // Ферменты микроорганизмов, ч.1, Москва, 1989, с. 169-174.

74. Михайлова Р.В., Сапунова Л.И., Лобанок А.Г. Регуляция образования ферментов пектингидролазного комплекса A.alliaceus. // Прикладная биохимия и микробиология, №2, 1992, с.249-255.

75. Михайлова Р.В., Лобанок А.Г., Сапунова Л.И., Шиманец С.С., Селиванова Н.Ю. Конститутивный и индуцированный синтез экзогидролаз микромицетами. // Биологические науки, №4, 1990, с. 107113.

76. Михайлова Р.В., Лобанок А.Г., Сапунова Л.И. Изучение полигалактуроназ, секретируемых грибом A.alliaceus в условиях репрессии синтеза. // Доклады АН БССР, т.35, №6, 1991, с. 545-548.

77. Моисеенко Н.В. Условия определения пектолитической активности ферментных препаратов. // Известия вузов. Пищевая технология, 1965, №4, с.150-153.

78. Морозова К.А. Разработка биотехнологии препаратов кислых протеаз на основе высокоактивного мутантного штамма Aspergillus oryzae 107 для использования в производстве спирта. // Автореферат на соискание уч.степени канд.техн.наук, Москва, 2006, 28с.

79. Мошкин А.Г.Современное состояние российского биотехнологического рынка, основные тенденции развития. // Биотехнология и бизнес. II Международная конференция, Москва, 2002, с.13-14.

80. Нгуен JIa Ань. Полигалактуроназа дрожжей и ее применение. // Автореферат на соискание уч.степени доктора биол.наук., Москва, МГАПП, 1992, 101с.

81. Павлова Н.М., Зуева Р.В., Шахова Т.В. Влияние состава питательной среды на биосинтез пектиназ мутантом A.foetidus — М-45. // ВНИИ биотехника, Москва, 1978.,с.45-48

82. Павлова Н.М. Физиолого-морфологические особенности A.foetidus -М-45 — продуцента пектолитических ферментов. // ВНИИ биотехника, Москва, 1980.,с.15-17.

83. Полыгалина Г.В., Чередниченко B.C., Римарева Л.В. Определение активности ферментов. // Справочник, Москва, ДеЛи принт, 2003, 372с.

84. Поляков В.А., Римарева JI.B. Перспективные ферментные препараты и особенности их применения в спиртовой промышленности. // Пиво и напитки, №2, 2000, с.52-55.

85. Пономарева Н.П. К определению пектиновых веществ на основе реакции галактуроновой кислоты с карбазолом. // Сб. Методы анализа пектиновых веществ, гемицеллюлаз и пектолитических ферментов в плодах, Кишинев, 1970, с. 109-112.

86. Растительный белок: новые перспективы. // Под ред. Е.Е.Браудо, Москва, Пищепромиздат, 2000, 179с.

87. Рейд В.В. Производство и применение ферментных препаратов в пищевой промышленности. // Сб. Пищепромиздат, Москва, 1963,с.35.

88. Родионова Н.А., Безбородов A.M. О локализации системферментов, катализирующих расщепление полисахаридоврастительных клеточных стенок у высших растений. Пектиназы.

89. Обзор. // Прикладная биохимия и микробиология, №5, 1997, с.467-487.k f

90. Рохленко С.Г., Калунянц К.А., Гребешова Р.Н., Кишковский З.Н.

91. Получение плодово-ягодных вин с помощью пектолитических ферментных препаратов. // Сб.трудов «Ферменты и применение в н/х», Москва, 1972, с.284-293.

92. Рухлядева' А.П., Корчагина Г.Т. Определение активности пектолитических ферментов. // Прикладная биохимия и микробиология, №6, 1973, с.922-927.

93. Рухлядева А.П., Полыгалина Г.В. Методы определения активности гидролитических ферментов. // Легкая и пищевая промышленность, Москва, 1981, 288с.

94. Рябая Н.Е. Полигалактуроназа дрожжей Saccharomyces pactorianum: образование и свойства. // Автореферат на соискание уч.степени кандидата биол.наук., Институт микробиологии АН Белоруссии, Минск, 1994, 121с.

95. Салманова Л.С., Филонова Т.Л., Соболевская Т.Н. Применение ферментативного гидролиза в производстве плодово-ягодных, овощных соков и экстрактов из растительного сырья. // Хранение и переработка с/х сырья, №2, 1995, с.38-44.

96. Самылина В.А., Садовой В.В. Влияние технологических факторов на процесс гелеобразования комплекса альгинат/пектин. // Вестник РАСХН, №1, 2005, с.79-80.

97. Сапожникова Е.В. Пектиновые вещества и пектолитические ферменты. //Биологическая химия, 1970, №5, ВИНИТИ, Москва, с.8

98. Сапунова Л.И., Михайлова Р.В., Лобанок А.Г. Изучение пектинлиазных комплексов Pen.adametzii, Pen.citrium, Pen.janthinellium. // Микология и фитопатология, т.28, 1994.С.122-126.

99. Сапунова Л.И., Лобанок А.Г., Михайлова Р.В. Условия синтеза пектиназ и протеаз грибом A.alliaceus и получение комплексного препарата мацерирующего действия. // Прикладная биохимия и микробиология, т.ЗЗ, №3, 1997, с.292-295.

100. Сапунова Л.И. Пектингидролазы A.alliaceus: биосинтез, свойства и применение. // Автореферат на соискание уч.степени кандидата биол.наук., Минск, 1990, 23с.

101. Сапунова Л.И., Михайлова Р.В., Лобанок А.Г. Получение пектингидролазного ферментного препарата из A.alliaceus. // Ферменты микроорганизмов, ч.1, Москва, 1989, с. 169-174.

102. Сапунова Л.И., Лобанок А.Г., Казакевич И.О., Евтушенков А.Н. Чашечный метод скрининга микроорганизмов- продуцентов ксилозоизомеразы. // Микробиология, т.73, №1, 2004, с.126-132.

103. Саттарова Р.К., Ташпулатов Ж.И. и др. Образование целлюлолитических и пектолитических ферментов в зависимости от условий культивирования Xanthomonas malvacearum. // Микробиология, t.XLI, вып.6, 1972, с.413.

104. Семенова М.В., Гришутин С.Г., Гусаков А.В., Окунев О.Н., Синицын А.П. Выделение и свойства пектиназ из гриба A.japonicus. // Биохимия, т.68, №5, 2003, с.686-697.

105. Сергеева Н.В., Десятник А.А. Влияние концентрации пектина на рост гриба Rhizopus arrhizus и образование пектолитических ферментов. // Кишинев, Штиница, 1975, с.22-27.

106. Сергиенко JI.T., Евтихов П.Н., Равдина О.Ю. Сравнение методов определения пектолитической активности ферментных препаратов и культур плесневых грибов. // Сб. трудов « Ферменты и применение в н/х», №1, 1972, с.48-52.

107. Силищенская О.М., Гендина С.Б. Селекция микроорганизмов спиртовой и ферментной промышленности. // Сб. трудов Всесоюзного научно-исследовательского института спиртовой и ферментной промышленности, вып. 18, Москва, Пищевая промышленность, 1967.с.32-35.

108. Силищенская О.М., Бумманова Н.Ф. Селекция плесневых грибов — активных продуцентов пектиназы. // Сб. трудов, вып.ХГХ, Москва, Пищевая промышленность, 1970.С.12-16.

109. Смирнов В.И., Шихмантер Э.Е., Чубова В.П. // Сб. Использование микроорганизмов в народном хозяйстве, вып.2,Кишинев, 1965,с.ЗЗ.

110. Снегирева С.Г. Влияние условий культивирования Sclerotinia sclerotiorum на биосинтез отдельных пектолитических ферментов. // Автореферат дисс. на соискание уч.степени кандидата биол.наук, Минск, 1974, 20с.

111. Сонина Е.Г. Совершенствование технологии производства виноградного сока и виноматериалов на основе использования пектолитических ферментов дрожжей. // Автореферат дисс. на соискание уч.степени кандидата техн.наук, Ялта, 1990, 23с.

112. Супонина Г.А., Кочнева С.В. и др. Получение порошкообразного пищевого красителя из выжимок черной смородины. // Известия вузов « Пищевая технология», №2,3, с.47-48.

113. Тананайко Т.М., Алексанян К.А., Ткачук JI.A. Использование новых ферментных препаратов в плодово-ягодном виноделии. // Сб. трудов « Микробные биокатализаторы для перерабатывающих отраслей АПК», Москва, 2006,с.229-234.

114. Тищенко В.П., Сапожникова Е.В. Качественная характеристика пектиновых веществ разных растений. // Прикладная биохимия и микробиология, т.VIII, вып.5, 1972, с.586-591.

115. Траубенберг С.Е., Андреева М.А., Куликова JI.C., Величко Б.А. Зависимость синтеза пектолитического комплекса ферментов от предварительной тепловой обработки посевного материала. // Ферментная и спиртовая промышленность, №1, 1983, с.34-36.

116. Тюрина С.С. Исследование пектолитических ферментов-виноградной лозы. // Автореферат дисс. на; соискание уч.степени кандидата биол.наук, Ялта, 1997,25с.

117. Херсонова JI.A. Исследование процесса образования пектолитических ферментов при глубинном культивировании A.niger. // Автореферат дисс. на соискание уч.степени канд.техн.наук, Москва, 1965, 20с.

118. Adisa V.A. Pectic enzymes of Aspergillus aculeatus associated with post-harvest deterioration of citrus sinensis fruit. // J. Food Biochemical 13, 1989, p.243-252.

119. Antier P., Minjares A., Roussos S., Viniegra-Gonzales G. New approach for selecting pectinases producing mutants of Aspergillus niger well adapted to solid state fermentation. // Biotechnology Adv., 1993, 11, p.429-440.

120. Arguelles M.E.A., Rojas M.G., Gonzales G.V., Torres E.F. Production and properties of three pectinolytic activities produced by Aspergillus nigerin submerged and solid-state fermentation. // Appl. Microbiol. Biotech.43, 1995, p.808-814.

121. Barras F., van Gysegem F., Chatterjee A.K. Extracellular enzymes and pathogenesis of soft rot Erwinia. // Annu Rev. Phytopathol., 1994, 32, p.221-234.

122. Cavalito S.F., Areas J.A., Hours R.A. Pectinase production profile of Aspergillus foetidus in solid state cultures at different acidities. // Biotechnology Lett., 1996, 18, p.251-256.

123. Colangelo J., Licon V., Benen J., Visser J., Bergmann C., Orlando R. Characterization of the glycosilation of recombinant endopolygalacturonase I from Aspergillus niger. // Rapid Commun. Mass Spectrom., 1999, 13, p.1448-1453.

124. Collmer A., Reid J. Assay methods for pectin enzymes. In: Purish D.L. Methods in engymology. // Academic Press, 1998, part B, p.329-355.

125. Draginja M., Antov M. Microbial polygalacturonases: a rewiew pectin. // Novi Swad. Fac. J. Technology, 1999, №30, p. 115-163.

126. El-Sawah., M.M.A. and T.S.M.Shady. Evaluation of Penicillum citrinum pectinase enzymes with special reference to production and characterization 2nd. // Int. Conf. Of Pest Control, Mansoura, Egypt, Sept., 1999, p.435-444.

127. Effect of additions on kinetic thermal stability of polygalacturonase from Aspergillus carbonarisis: mechanism of stabilization by sucrose. // J. Agr.Food Chem., 1998, vol. 46, № 9, p.3540-3545.

128. Fonseca, M.J.V. and S. Said. The pectinase produced by Tubercularia vulgaris in submerged culture using pectin or orange-pulp pellets as inducer. // Appl. Microbiol. Biotech. 42, 1994, p.32-35.

129. Gullion F., Thibault J.- F. Enzymatic hydrolysis of the "hairy" fragments of sugarbeet pectins. // Carbohydr.Res., 1989, 190, p.97-108.

130. Heinrichova K. Purification and practical characterization of endo- D-galacturonase from Aspergillus foetidus. // Biol., 1985, vol.4, № 12, p.l 1191120.

131. Kassem M.M., El-Sawah M.M.A., Selim A.E.I., Samia M.Bayoumy. Pectinolytic enzymes of Rhizoctonia solani. // J. Agric. Sci. Mansoura Univ. 17, 1992, p.502-508.

132. Kester H.C.M., Visser J. Purification and characterization of polygalacturonases produced by the hyphal fungus Aspergillus niger. // BiotechnoLAppl.Biochem., 1990, 12, p.150-160.

133. Kojima Y., Sakamoto Т., Kishida M., Sakai Т., Kawasaki H. Acidic conditioninducible polygalacturonase of Aspergillus kawachii. // J. of Mol.Catalysis B: Ensym.,1999, 6, p.351-357.

134. Maldonado M.C., de Saad A.M. Production of pectinesterase andpolygalacturonase by Aspergillus niger in submerged and solid state fermentations. // J. Industrial Microbiologial Biotechnology., 1998, 20, p.34-38.

135. Marcovic O., Jarosova A., Machova E., Slezaric A. Effect of oligomeric and polymeric D-galacturonans on the activity of pectinesterase from tomato, Aspergillus foetidus and Trichoderma reesei. Biologia, Bratislava, 1996, 51, p.293-297.

136. McNeil M., Darvill A.G., Albersheim P. The pectic polysaccharides of primary cell walls. Methods Plant Biochem., 1990, 2, p.415.

137. Naidu G.S.N., Panda T. Production of pectolytic enzymes a review. // Bioprocess Engineering, 1998, 19, p.355-361.

138. Parenicova L. Pectinases of Aspergillus niger: a molecular and biochemical characterization. PhD thesis, The Wageningen Agricultural University, Wageningen, 2000.

139. Pitt D.In: Punch D.L. Methods in enzymology. I I Academic Press, 1988,161, part B, p.353.

140. Pickersgill R., Smith D., Worboys K., Jenkins J. Crystal structure of polygalacturonase from Erwinia carotovora spp. Carotovora. // J. Biol.Chem., 1998, 273, p.24660-24664.

141. Rao M.N., Kembhavi A.A., Pant A. Implication of tryptofan and histidine in the active site of endo-polygalacturonase from Aspergillus ustus: elucidation of the reaction mechanism. // BBA, 1996, 1296, p.167-173.

142. Rexova-Benkova L., Mrackova M. Active groups of extracellular endo-D- polygalacturonase of Aspergillus niger derived from pH effect on kinetic data. //Biochem. Biophys. Acta, 1978, 523, p.162-169.

143. Sakai Т., Sakamoto Т., Hallaert J., Vandamme E.J. Pectin pectinases, and protopectinases: production, properties, and applications. // Adv. Appl.Microbiol., 1993, 39, p.213-294.

144. Shady T.S.M., Rabie M.M., Mansour S.M. Production of pectinoliticienzymes by Aspergillus foetidus in solid-state fermentation and its uses for apple juice clarification. // Annals Agric. Sci., Ain Shams Univ., Cairo, 46(1), 2001, p.35-50.

145. Schejter A., Marcus L. In: Purich D.L. Methods in enzymology. // Academic Press, 1988, 161, part B, p.366.

146. Versteeg C. Pectinesterases from the orange fruit their purification, general characteristics and juice cloud destabilizing properties. // PhD thesis, Wageningen University, Wageningen, 1979.

147. Whitaker J.R. Microbial pectolytic enzymes. In: Fogarty W.M., Kelly C.T. Microbial Enzymes and Biotechnology. // Elsivier Applied Science, London & New York, 1991, p.133-175.

148. Will F., Baukhage K., Dietrich H. Apple pomance liguefication with pectinases and cellulases- analytical data of the corresponding juices. // Eur. Food Res. And Technol., 2000, 211, p.291-297.