Новые высокоэффективные ферментные препараты для гидролиза пектин- и целлюлозосодержащих субстратов на основе рекомбинантных штаммов грибов рода Penicillium тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат химических наук Бушина, Екатерина Вячеславовна

• Бушина, Екатерина Вячеславовна
• кандидат химических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат химических наук Бушина, Екатерина Вячеславовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ПЕКТИН- И ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩИЕ МАТЕРИАЛЫ

1.1. Строение клеточной стенки растений с высоким содержанием пектиновых веществ

1.2. Состав пектин-и целлюлозосодержащих материалов

1.3. Виды технологической схемы переработки пектин- и целлюлозосодержащих отходов

ГЛАВА 2. ПРОДУЦЕНТЫ МУЛЬТИФЕРМЕНТНЫХ КОМПЛЕКСОВ

2.1. Преимущества грибных штаммов

2.2. Рекомбинантные штаммы гриба Pénicillium verruculosum

2.2.1. Основные компоненты комплекса внеклеточных ферментов гриба P.verruculosum

2.2.2. Этапы получения и возможности применения реципиентных штаммов P.verruculosum BlniaD^HFlOniaD"

2.3. Рекомбинантные штаммы гриба Pénicillium canescens

2.3.1. Основные компоненты ферментного комплекса гриба P.canescens

2.3.2. Возможности применения реципиентного штамма P.canescens RN3-11-7 niaDH для создания штаммов-продуцентов

2.4. Пектолитические ферменты

ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ ШТАММОВ-ПРОДУЦЕНТОВ

3.1. Этапы создания штамма-продуцента

3.2. Системы переноса генов

3.2.1. Селективные маркеры

3.2.2. Интеграция трансформированной ДНК

3.3. Трансформация мицелиальных грибов

3.3.1. Методы получения протопластов различных видов мицелиальных грибов

3.3.2. СаСЬ/ПЭГ трансформационный метод 39 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

4.1. Используемые плазмидные конструкции

4.2. Реактивы для клонирования генов целевых белков

4.3. Реактивы и оборудование для трансформации мицелиальных грибов СаС12/ПЭГ методом

4.4. Использованные ферментные препараты

4.5. Субстраты и реактивы для анализа

4.6. Клонирование методом независимого лигирования

4.7. Получение протопластов и трансформация реципиентных штаммов

4.8. Тесты на стабильность секреции целевых ферментов

4.9. Культивирование грибных штаммов

4.10. Методы определения активностей

4.11. Определение концентрации белка

4.12. Гидролиз свекловичного жома

4.13. Определение концентрации восстанавливающих Сахаров, глюкозы, арабинозы

4.14. Методы выделения и очистки белков

4.15. Определение рН- и температурного оптимумов действия ферментов.

4.16. Изучение термостабильности ферментов 51 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 5. ПОЛУЧЕНИЕ ШТАММОВ-ПРОДУЦЕНТОВ ЦЕЛЕВЫХ БЕЛКОВ 52 5.1. Клонирование генов целевых белков

5.1.1. Плазмиды для трансформации штамма P.canescens RN3-11-7 niaD()

5.1.2. Плазмиды для трансформации реципиентного штамма P.verruculosum BI niaD() 54 5.3. Скрининг трансформантов, отбор штаммов-продуцентов

5.3.1. Культивирование рекомбинантных штаммов

5.3.2. Первичный скрининг трансформантов

5.3.3. Тестирование штаммов-продуцентов на стабильность секреции целевых ферментов

ГЛАВА 6. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗ ПЕКТИН- И ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩИХ

СУБСТРАТОВ

6.1. Сравнение гидролитической активности коммерческих ферментных препаратов и ферментных препаратов, полученных с помощью реципиентных штаммов, к свекловичному жому

6.2. Результаты гидролиза свекловичного жома смесями гомогенных ферментов

6.3. Сравнение гидролитической активности новых ферментных препаратов по отношению к свекловичному жому

6.4. Результаты гидролиза цитрусовых и яблочных выжимок культуральной жидкостью созданных штаммов P.canescens, являющихся продуцентами пектинлиазы, эндо-1,4-р-глюканазы и Р-глюкозидазы

ГЛАВА 7. СВОЙСТВА НОВЫХ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ

7.1. Оптимум Т и рН стабильность новых ферментных препаратов

7.2. Компонентный состав ферментных препаратов, полученных с помощью рекомбинантных штаммов гриба Pénicillium canescens

7.3. Свойства рекомбинантной эндо-1,5-а-арабиназы

7.4. Компонентный состав ферментных препаратов, полученных с помощью штаммов гриба Pénicillium verruculosum

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Новые высокоэффективные ферментные препараты для гидролиза пектин- и целлюлозосодержащих субстратов на основе рекомбинантных штаммов грибов рода Penicillium»

В настоящее время существует широкий спектр продуктов, получаемых на основе возобновляемого сырья растительного происхождения. Так, из растительных материалов с высоким содержанием пектиновых веществ производят различные пищевые продукты, например, сахар, вина, плодово-овощные соки и пюре, ягодные морсы и т.д. Применение ферментных препаратов, обладающих высокой гидролитической активностью по отношению к пектин- и целлюлозосодержащим субстратам, позволяет увеличить выход целевых конечных продуктов, способствует повышению качества и улучшению их органолептических показателей.

Ферментативный гидролиз также является ключевым звеном в процессе переработки отходов пищевой промышленности. Полученные в результате гидролиза простые сахара в последующих стадиях используют в качестве основы для получения различных полезных продуктов - топлива (метана [1], этанола [2]), исходных соединений для получения полимеров (молочной кислоты [3], янтарной кислоты [4]), кормовых добавок (ветеринарных антибиотиков [5], аминокислот, кормовых дрожжей [6], ферментных препаратов [7, 8] и пр.). Отметим, что в последние десятилетия особое значение приобрела концепция переработки природных ресурсов, реализация которой подразумевает снижение выбросов в окружающую среду отходов производства, более рациональный подход к использованию растительного сырья - извлечение из него максимума полезных продуктов [2, 8].

В частности, наиболее популярным биотопливом является этанол, объемы производства которого в мире за 2011 год составили 84,5 млн тонн [9]. Большая часть биотоплива, 69 % от общего количества по данным [10] за 2010 год, производится в США и Бразилии. Основным сырьем для получения биоэтанола в США является кукуруза [9], в Бразилии - отходы переработки сахарного тростника (по данным организации "European biofuels", http://www.biofuelstp.eu/globaloverview.html). Наиболее многотоннажным отходом пищевой промышленности России является свекловичный жом. По данным Росстата за 2009 год, только малая его часть - 13 %, используется как кормовая добавка, большая же часть жома остается невостребованной. Существующие избытки свекловичного жома целесообразно использовать для получения различных полезных продуктов.

Одним из основных этапов переработки отходов растительного происхождения является превращение сложных полисахаридов клеточной стенки растений в простые сахара. Эффективность проведения этого процесса определяет выход конечного продукта и экономическую целесообразность процесса переработки растительного сырья в целом. Основу клеточной стенки растений с высоким содержанием пектиновых веществ, к которым, в частности, относится сахарная свекла, составляют волокна целлюлозы, покрытые слоем гемицеллюлоз. Пространство между волокнами заполняют пектиновые вещества, снижающие доступ соответствующих ферментов к целлюлозе и гемицеллюлозам. Следовательно, комплекс ферментов для эффективного превращения такого сырья в простые сахара помимо целлюлаз и гемицеллюлаз [11], обеспечивающих гидролиз соответствующих полисахаридов, должен также содержать пектиназы, способствующие повышению эффективности гидролиза за счет разрушения пектиновых веществ.

Коммерческие ферментные препараты, применение которых возможно по отношению к пектин- и целлюлозосодержащим материалам, можно разделить на две категории. К первой принадлежат ферментные препараты с высоким содержанием пектолитических ферментов, используемые при производстве пищевых продуктов и обладающие относительно невысокой гидролитической активностью по отношению к целлюлозе и гемицеллюлозам. Ко второй категории относятся ферментные препараты целлюлаз и гемицеллюлаз, предназначенные для гидролиза растительной биомассы с низким содержанием пектиновых веществ и не обеспечивающие высокоэффективный гидролиз пектин- и целлюлозосодержащих материалов вследствие вышеупомянутых особенностей их строения. Ферментные препараты, содержащие в оптимальном соотношении пектиназы, целлюлазы и гемицеллюлазы, на рынке не представлены. Согласно литературным данным, гидролиз пектин- и целлюлозосодержащих отходов пищевой промышленности, например, выжимок различных цитрусовых, проводят смесью ферментных препаратов пектиназ и целлюлаз, подбирая их оптимальное соотношение для каждого конкретного вида сырья [12, 13]. В условиях современного биотехнологического производства приготовление смесей ферментных препаратов является нецелесообразным, поскольку вносит дополнительную стадию в технологическую схему переработки отходов и увеличивает расходы.

В ходе систематических исследований, проводимых в нашей лаборатории, было показано, что комплекс внеклеточных ферментов гриба Pénicillium verruculosum по гидролитической активности к лигноцеллюлозным материалам превосходит ферментный комплекс гриба Trichoderma reseei [14], наиболее часто использующийся в качестве основы для производства коммерческих ферментных препаратов целлюлаз. Кроме того, было показано, что гриб Pénicillium çanescens секретирует эффективный комплекс гемицеллюлаз [15]. Однако пектолитические ферменты являются минорными компонентами комплекса внеклеточных ферментов как P. canescens, так и P.verruculosum. Следовательно, создание продуцентов ферментов-карбогидраз (пектиназ и других недостающих ферментов) на основе штаммов грибов P.canescens и P.verruculosum с последующим получением ферментных препаратов оптимального состава на их основе, обладающих высокой .гидролитической активностью по отношению к пектин- и целлюлозосодержащим материалам, является актуальной задачей.

Таким образом, целью работы являлось получение высокоактивных комплексных ферментных препаратов на основе рекомбинантных штаммов грибов рода Pénicillium для гидролиза природных пектин- и целлюлозосодержащих субстратов. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

S клонировать гены целевых ферментов,

S осуществить трансформацию штаммов-реципиентов грибов рода Pénicillium,

S подобрать оптимальное соотношение компонентов ферментного комплекса,

S определить гидролитическую активность новых ферментных препаратов, полученных на основе созданных штаммов-продуцентов, по отношению к природным пектин- и целлюлозосодержащим субстратам на примере свекловичного жома, яблочных и цитрусовых выжимок,

•S изучить биохимические свойства и определить компонентный состав полученных ферментных препаратов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», Бушина, Екатерина Вячеславовна

выводы

1. Созданы новые рекомбинантные штаммы-продуценты пектинлиазы А, эндо-1,4-(3-глюканазы II, р-глюкозидазы, эндо-1,5-а-арабиназы и эндо-1,4-а-полигалактуроназы на основе грибов Р. сапехсет и Р. уеггисиЬяит с применением подходов генетической инженерии и микробиологии. Доказано наличие генов целевых белков в хромосомах рекомбинантных штаммов; ферментные препараты, полученные с помощью созданных штаммов, обладали заданными целевыми активностями.

2. Показано, что ферментные комплексы новых рекомбинантных штаммов Р.сапезсет эффективнее при гидролизе свекловичного жома (на 26-38% по выходу арабинозы) по сравнению с ферментным комплексом исходного реципиентного штамма 1ШЗ-11-7, а ферментные комплексы новых рекомбинантных штаммов Р.уеггисгйозит эффективнее (на 20-30% по выходу глюкозы) по сравнению с ферментным комплексом исходного реципиентного штамма В1.

3. Новые ферментные препараты, полученные с помощью созданных штаммов-продуцентов и обладавшие максимальной гидролитической способностью по отношению к свекловичному жому, имели следующий компонентный состав: Р.\erruculosum В1РВ 5 - 27% пектинлиазы А, 11% Р-глюкозидазы, 33% целлобиогидролазы и 13% эндо-1,4-Р-глюканазы; Р. сапехсет АР 16 - 10% ксиланазы, 10% пектинлиазы А и 26% эндо-1,5-а-арабиназы от общего количества белка ФП.

4. Изучена гидролитическая способность ферментных композиций по отношению к свекловичному жому. Установлено, что для обеспечения максимального выхода глюкозы оптимальной являлась смесь гомогенных пектинлиазы А (10-50%) и Р-глюкозидазы (5-9%») в сочетании с ферментным комплексом реципиентного штамма Р.\еггиси1о$ит В1 (45-80% от добавляемого белка). Для обеспечения максимального выхода арабинозы оптимальной являлась смесь гомогенных эндо-1,5-а-арабиназы (15-30%) и пектинлиазы А (10-50%) с ферментным комплексом реципиентного штамма Р.сапезсет 1ШЗ-11-7 (35-60%). Оптимальное соотношение компонентов мультиферментных композиций соответствовало составу ферментных препаратов с максимальной гидролитической способностью, полученных с помощью новых штаммов-продуцентов.

5. Оптимальные значения целевых активностей ферментных препаратов с максимальной гидролитической способностью наблюдаются при рН 4,0-5,0 и температуре 45-70°С. При температуре 25-50°С и рН 4,0-5,0 ферментные препараты теряют в водном растворе в течение 3 часов не более 5-30% целевой активности.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Бушина, Екатерина Вячеславовна, 2012 год

1. Kaparaju P.L., Rintala J.A. Termophilic anaerobic digestion of industrial orange waste //Environ. Technol. -2006. -V. 27. -P. 623-633.

2. Lopez J.A., Li Q., Thomson I.P. Biorefinery of waste orange peel //Crit. Rev. in Biotech. -2010. -V. 30. -P. 63-69.

3. Bustos G., Moldes A.B., Cruz J.M., Dominigues J.M. Production of fermentable media from vine-trimming wastes and bioconversion into lactic acid by Lactobacillus pentosus //J. Sci. Food Agric. -2004. -V. 84. -P. 2105-2112.

4. Li Q., Siles J.A., Tompson I.P. Siccinic acid production from orange peel and wheat straw by batch fermnetation of Fibrobacter succinogenes S85 //Appl. Microbiol. Biotechnol. -2010. -V. 88. -P. 671-678.

5. Asagbra A.E., Sanni A.I., Oyewole O.B. Solid state fermentation production of tetracycline by Streptomyces strains using some agricultural wastes as substrate //World J. Microbiol. Biotechnol. -2005. -V. 21. -P. 107-114.

6. Tripodo M.M., Lanuzza F., Micali G., Coppolino R. Citrus waste recovery: a new environmentally friendly procedure to obtain animal feed //Bioresour. Technol. -2004. -V. 91.-P.111-115.

7. Silva D., da Silva Martins E., da Silva R., Gomes E. Pectinase production by Pénicillium viridicatum RFC3 by solid state fermentation using agricultural wastes and agro-industrial by-products //J. Microbiol. -2002. -V. 91, -P. 318-324.

8. Mamma D., Kourtoglou E., Christakopoulos P. Fungal multienzyme production on industrial by-products of the citrus-processing industry //Bioresour. Technol. -2008. -V. 99. -P. 2373-2383.

9. Renewable Fuels Association. Acelerating Industry Innovation. Ethanol Industry Outlook. /Renewable Fuels Association. -2012. -3, 8, 10, 22 and 23 p.

10. BP Statistical Review of World Energy /bp.com/statistical review. -2011. -39 p.11. van Den Brink J., de Vries R.P. Fungal enzyme sets for plant polysaccharide degradation//Appl. Microbiol. Biotechnol. -2011. -V. 91. -P. 1477-1492.

11. Wilkins M.R., Widmer W.W., Grohmann K., Cameron R.G. Hydrolysis of grapefruit peel waste with cellulase and pectinase enzymes //Bioresour. Technol. -2008. -V. 98. -P. 1596-1601.

12. Boluda-Aguilar M., Garcia-Vidal L., Del Pilar Gonsalez-Castaneda F., Lopez-Gomez A. Mandarin peel wastes pretreatment with steam explosion for bioethanol production //Bioresour. Technol. -2010. -V. 101. -P. 3506-3513.

13. Синицына О.А., Бухтояров Ф.Е., Гусаков А.В., Окунев О.Н., Беккаревич А.О., Винецкий Ю.П., Синицын А.П. Выделение и свойства основных компонентов внеклеточного ферментного комплекса Pénicillium canescens //Биохимия. -2003. -Т. 68. -С. 1494-1505.

14. Carpita N., Mccann M.C. The cell wall //Biochem. and Molec. Biol, of plants. -2000. -V. 29. -P. 52-108.

15. Растительная клеточная стенка как динамичная система /Горшкова Т.А. М.: Наука, 2007. -429 с.

16. Zykwinska A., Thibault J.F., Ralet M.C. Competitive binding of pectin and xyloglucan with primary cell wall cellulose //Carbohydr. Polym. -2008. -V. 74. -P. 957-961.

17. Carpita N.C., Mccann M.C. The functions of cell wall polysaccharides in composition and architecture revealed through mutations //Plant Soil. -2002. -V. 274. -P. 7180.

18. Vorwerk S., Somerville S., Somerville C. The role of plant cell wall polysaccharide compositionin disease resistance //Trend Sin Plant Science. -2004. -V. 9. -P. 203-209.

19. Mohnen D. Pectin structure and biosynthesis //Curr. Opin. Plant Biol. -2008. -V. 11.-P. 266-277.

20. Caffalla K.H., Mohnen D. The structure, function, and biosynthesis of plant cell wall pectic polysaccharides //Carbohydrate Res. -2009. -V. 344. -P. 1879-1900.

21. Yincken J., Schols H.A., Oomen R.J., Mccann M.C. If homogalacturonan were a side chain of rhamnogalacturonan I. Implications for cell wall architecture //Plant. Physiol. -2003. -V. 132.-P. 1781-1789.

22. O'neill ma Ishii Т., Albersheim P., Darvill Ag. Rhamnogalacturonan II: structure and function of a borate cross-linked cell wall pectic polysaccharide //Annu. Rev. Plant. Biol.2004. -V. 55. -P. 109-39.

23. Matsunaga Т., Ishii Т., Matsumoto S. Occurrence of the primary cell wall polysaccharide ramnogalacturonan II in pteridophytes, lycophytes and bryophytes. Implication for the evolution of vascular plants //Plant Physiol. -2004. -V. 134. -P. 339-351.

24. Arnous A., Meyer A.S. Quantitative prediction of cell wall polysaccharide composition in grape (Vitis vinifera L.) and apple (Malus domestica) skins from acid hydrolysis monosaccharide profiles //Agric. Food Chem. -2009. -V. 57. -P. 3611-3619.

25. Kurita O., Fujiwara Т., Yamazaki E. Characterization of the pectin extracted from citrus peel in the presence of citric acid //Carbohydr. Polym. -2008. -V. 74. -P. 725-730.

26. Taherzadeh M.J., Karimi K. Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production: a review //Int. J. Mol. Sci. -2008. -V. 9. -P. 1621-1651.

27. Edwards M.C., Doran-Peterson J. Pectin-rich biomass as feedstock for fuel ethanol production//Appl. Microbiol. Biotechnol. -2012. -V. 95. -P. 565-575.

28. Wilkins M.R., Widmer W.W., Cameron R.G., Grohmann K. Effect of seasonal variations on enzymatic hydrolysis of Valencia orange peel //Proc. Fla State Hort. Soc.2005. -P. 419-422.

29. Ферменты в производстве пищи и кормов /Кислухина. О.В. М.: ДеЛи-принт, 2002. -273 с.

30. Micard M., Renard C., Thibault J.F. Enzymatic saccharification of sugar-beet pulp //Enzyme and Microb. Technol. -1996. -V. 19. -P. 162-170.

31. Hutnan M., Drtil M., Mrafkova L. Anaerobic biodégradation of sugar beet pulp //Biodegradation. -2000. -V. 11. -P. 203-211.

32. Matora A.V., Korshunova V.E., Shkodina O.G., Zhemerichkin D.A., Ptitchkina N.M. Morris E.R. The application of bacterial enzymesfor extraction of pectin from pumpkin and sugar beet //Food Hydrocolloids. -1995. -V. 9. -P. 43-46.

33. Handbook of food enzymology /Whitaker J.R., Voragen A.G., Wong D. New York: Marcel Dekker Inc. Basel, 2003. 1108 p.

34. Cosgrove D.J. Growth of the plant cell wall. Nat. Rev //Mol. Cell Biol. -2005. -V. 6. -P. 850-861.

35. Cardoso P.G., Ribeiro J.B., Teixeira J.A., De Queiroz M.V. Overexpression of the plgl gene encoding pectin lyase in Pénicillium griseoroseum //J. of Industrial Microbiol, and Biotech. -2008. -V. 35, -P. 159-166.

36. Olofsson K., Bertillson M., Liden G. A short review on SSF an interesting process option for ethanol production from lignocellulosic feedstocks //Biotechnology for Biofuels. -2008. -V. 1. -P. 7-14.

37. Zhisheng Y., Hongxun Z. Ethanol fermentation of acid-hydrolyzed cellulosic pyrolysate with Saccharomyces cerevisiae //Bioresour. Technol. -2003. -V. 90. -P. 95-100.

38. Stavrinides A.J., Phipps D. A., Al-Shamma'a A. Current and developing lignocellulosic pretreatment methods for bioethanol production. BEAN (Built Environment & Natural Environment) 5th Annual Conference. Liverpool, UK. 2010. -233 p.

39. Martens-Uzunova E.S. Schaap P.J. Assessment of the pectin degrading enzyme network of Aspergillus niger by functional genomics //Fungal Genet. Biol. -2009. -V. 46. -P. 170-179.

40. Deboy R.T., Mongodin E.F., Fouts D.E., Tailford L.E. Insight into plant cell wall degradation from the genome sequence of the soil bacterium Cellvibro japonicus //J. of Bacteriology. -2008. -V. 190. -P. 5455-5463.

41. Morozova V.V., Gusakov A.V., Andrianov R.M., Pravilnikov A.G., Osipov D.O., Sinitsyn A.P. Cellulases of Pénicillium verruculosum //Biotechnol. J. -2010. -V. 5. -P. 871-880.

42. Синицына О.А., Федорова E.A., Правильников А.Г., Рожкова A.M. Выделение и свойства ксилоглюканаз Pénicillium sp //Биохимия. -2010. -Т. 75. -С. 52-62.

43. Короткова О.Г., Семенова М.В., Морозова В.В., Зоров И.Н., Бубнова Т.М., Окунев О.Н., Синицын А.П. Выделение и свойства грибных р-глюкозидаз //Биохимия. -2009. -Т. 74. -С. 699-709.

44. Зоров И.Н., Гусаков А.В., Баразненок В.А., Беккаревич А.О., Окунев О.Н., Синицын А.П., Кондратьева Е.Г. Выделение и свойства целлобиазы из Pénicillium verruculosum //Прикл. биохим. микробиол. -2001.-Т. 37. -С. 687-693.

45. Скомаровский А.А., Марков А.В., Гусаков А.В., Кондратьева Е.Г., Окунев О.Н., Беккаревич А.О., Матыс В.Ю., Синицын А.П. Новые целлюлазы для высокоэффективного гидролиза лигноцеллюлозной биомассы //Прикл. биохимия и микробиол. -2006. -Т. 6. -С. 674-680.

46. Короткова. О.Г. Получение целлюлазных комплексов с увеличенной осахаривающей способностью на основе рекомбинантных штаммов Pénicillium verruculosum. M.: МГУ. 2011. -171 с.

47. Klyosov А.А. Trends in biochemistry and enzymology of cellulose degradation //Biochem. -1990. -V. 129. -P. 10577-10585.

48. Szakacs G., Reczey K., Hernadi P., Dobozi M. Pénicillium verruculosum WA 30 a new source of cellulase //European J. Appl. Microbiol. Biotechnol. -1981. -V. 11. -P. 120-124.

49. Короткова О.Г., Рожкова A.M., Матыс Ю.В. и др. Получение комплексных биокатализаторов на основе ферментных препаратов из рекомбинантного гриба

50. Pénicillium verruculosum и применение их в гидролизе отходов деревообрабатывающей промышленности //Катализ в промышленности. -2011. -Т. 5. -С. 61-68.

51. Синицына О.А., Федорова Е.А., Вакар И.М. и др. Выделение и свойства а-галактозидаз Pénicillium canescens //Биохимия. -2008. -Т. 73. -С. 119-130.

52. Синицына О.А., Федорова Е.А., Семенова М.В. и др. Выделение и свойства внеклеточной пектинлиазы Pénicillium canescens //Биохимия. -2007. -Т. 72. -С. 699-706.

53. Серебряный В.А., Вавилова Е.А., Чулкин А.М., Винецкий Ю.П. Клонирование гена эндо-1,4-Р-ксиланазы Pénicillium canescens получение мультикопийных штаммов //Прикл. биохим. и микробиол. -2002. -Т. 38. -С. 495-501.

54. Чулкин А.М., Вавилова Е.А., Беневоленский C.B. Транскрипционный регулятор углеродной катаболитной репрессии Cre А мицелиального гриба Pénicillium canescens //Молекулярная биология. -2010. -Т. 44. -С. 1-11.

55. Рожкова А.М., Волков П.В., Кондратьева Е.А., Сатрутдинов А.Д. и др. Создание продуцентов биотехнологически важных ферментов на основе рекомбинантного штамма гриба Pénicillium canescens //Хранение и переработка сельхозсырья. -2010. -Т. 7. -С. 37-39.

56. Jensen M.H., Otten H., Christensen U. et ail. Structural and biochemical studies elucidate the mechanism of rhamnogalacturonan lyase from Aspergillus aculeatus //J. Mol. Biol. -2010. -V. 404. -P. 100-111.

57. Yadav S., Kumar P., Yadav D. et ail. Pectinlyase: a review //Proc. Biochem. -2009. -V. 44.-P. 1-10.

58. Семенова M.В., Гришутин С.Г. и Синицын А.П. Выделение и свойства пектиназ из гриба Aspergillus japonicus //Биохимия. -2003. -Т. 68. -С. 686-697.

59. Sharma N., Rathore M., Sharma M. Microbial pectinase: sources, characterization and applications //Rev. Environ. Sci. Biotechnol. 2012. in publishing: DOI 10.1007/sl 1157-0129276-9.

60. Вавилова Е.А., Винецкий Ю.Л. Индукция синтеза эндо-1,4-/?-ксиланазы и ß-галактозидазы в исходных рекомбинантных штаммах гриба P.canescens //Прикл. биохим. и микробиол. -2003. -Т. 39. -С. 167-172.

61. Aleksenko A.Y., Makarova N.A., Nikolaev I.V. et all. Integrative and replicative transformation of Penicillium canescens with a heterologous nitrate-reductase gene //Curr. Genet. -1995. -V. 28. -P. 474-477.

62. Brygoo Y., Debuchy R. Transformation by integration in Podospora anserina I. Methodology and phenomenology //Mol. and Gen. Genet. -1985. -V. 200. -P. 128-131.

63. Ballance D.J., Turner G. Gene cloning in Aspergillus nidulans: isolation of iscitrate lyase gene {acuD) //Molec. and General Genetics. -1986. -V. 202. -P. 271-275.

64. Tilburn J., Scchazzocchio C., Taylor G.G. et all. Transformation by integration in Aspergillus nidulans //Gene. -1983. -V. 26. -P. 205-221.

65. Buxton F.P., Gwynne D.I. and Davies R.W. Transformation of Aspergillus niger using the argB gene of Aspergillus nidulans //Gene. -1985. -V. 37. -P. 207-214.

66. Durrens P., Green P.M., Arst H.N. and Scchazzocchio C. Heterologous insertion of transforming DNA and generation of new deletions associated with transformation in Aspergillus nidulans //Mol. and Gen. Genet. -1986. -V. 203. -P. 544-549.

67. Horng J.S., Linz J.E. and Pestka J.J. Cloning and characterization of the trpC gene from an aflatoxigenic strain of Aspergillus parasiticus //Appl. and Env. Microbiol. -1989. -V. 55.-P. 2561-2568.

68. Kelly J.M., Hynes M.J. Transformation of Aspergillus niger by the amdS gene of Aspergillus nidulans //J. EMBO -1985. -V. 4. -P. 475-479.

69. May G.S., Gambino J., Weatherbee J.A. and Morris N.R. Identification and functional analysis of ß-tubulin genes by site-specific integrative transformation in Aspergillus nidulans Hi. of Cell Biol. -1985. -V. 100. -P. 712-718.

70. Kolar M., Punt P.J., van Den Hondel C.A.M.J.J. and Schwab H. Transformation of Penicillium chrysogenum using dominant selection markers and expression of an Escherihia coli lacZ fusion gene //Gene. -1988. -V. 62. -P. 127-134.

71. Banks G.R. Transformation of Ustilago maydis by a plasmid containing yeast 2 micron DNA //Curr. Genet. -1983. -V. 7. -P. 73-77.

72. Ward M., Wilson M.J., Carmona C.L. and Turner G. . The oliC3 gene of Aspergillus niger: isolation, sequence and use as a selectable marker for transformation //Curr. Genet. -1988. -V. 14. -P. 37-42.

73. Carramolino L., Lozano M., Pérez-Arando A. et all. Transformation of Penicillium chrysogenum to sulfonamide resistance //Gene. -1989. -V. 77. -P. 31-38.

74. Orbach M.J., Porro E.B. and Yanofsky C. Cloning and characterization of the gene for |3-tubulin from a benomyl-resistant mutant of Neurosporra crassa and its use as a dominant selectable marker //Mol. And Cell Biol. -1986. -V. 6. -P. 2452-2461.

75. Varadarajalu L.P., Punekar N.S. Cloning and use of sC as homologous marker for Aspergillus niger transformation //J. Microbiol. Methods. -2005. -V. 61. -P. 219-224.

76. Fontaine Т., Simenel C., Dubreucq G. et all. Molecular organization of the alkali-insoluble fraction of Aspergillus fumigatus cell wall //J. Biol. Chem. -2000. -V. 275. -P. 27594-27607.

77. Bernard M., Latge J.P. Aspergillus fumigatus cell wall: composition and biosynthesis //Med. Mycol. -2001. -V. 39. -P. 9-17.

78. Ito H., Fukuda Y., Murata K. and Kimura A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations Hi. Bacteriol. -1983. -V. 153. -P. 163-168.

79. Suzuki S., Tada S., Fukuoka M. et all. A novel transformation system using a bleomycin resistance marker with chemosensitizers for Aspergillus oryzae //Biochem. Biophys. Res. Commun. -2009. -V. 29. -P. 42-47.

80. Gruber S. and Seidl-Seiboth V. Self versus non-self: fungal cell wall degradation in Trichoderma //Microbiology. -2012. -V. 158. -P. 26-34.

81. Haakana H., Miettinen-Oinonen A., Joutsjiki V. et all. Cloning of cellulase genes from Melanocarpus albomyces and their efficient expression in Treechoderma reesei //Enzyme and Microbial Technol. -2004. -V. 72. -P. 159-167.

82. Kubodera Т., Yamashita N. and Nishimura A. Transformation of Aspergillus sp. and Trichoderma reesei using the pyrithiamine resistance gene (ptrA) of Aspergillus oryzae //Biosci. Biotechnol. Biochem. -2002. -V. 66. -P. 404-406.

83. Meyer V., Mueller D., Strowig T. et all. Comparison of different transformation methods for Aspergillus giganteus //Curr. Genet. -2003. -V. 43. -P. 371-377.

84. Gruber F., Visser J., Kubicek C.P. and de Graaf L.H. Cloning of the Trichoderma reesei pyrG gene and its use as a homologous marker for a high-frequency transformation system//Curr. Genet. -1990. -V. 18. -P. 447-451.

85. Mach R.L., Schindler M., Kubicek C.P. Transformation of Trichoderma reesei based on the hygromycin В resistance using homologous expression signals //Curr. Genet. -1994. -V. 25. -P. 567-570.

86. Aslanidis C.J., de Jong P. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR) //Nucleic. Asid. Research. -1990. -V. 18. -P. 6069-6075.

87. Методы изучения и свойства целлюлолитических ферментов /Синицын А.П., Черноглазов В.М. и Гусаков А.В. М.: Биотехнол, 1993. -152 с.

88. Doner L.W., Irwin P.L. Assay of reducing end groups in oligosaccharide homologues with 2,2'-bicinchoninate //Anal. Biochem. -1992. -V. 202. -P. 50-53.

89. Collmer A. and Reid J. Assay methods for pectic enzymes. //Methods in enzymology. Academic Press. -1988. -V. 161, part B. -P. 329-335.

90. Pitt D. //Methods in enzymology. Academic Press. -1988. -V. 161, part B. -P. 353-359.

91. Справочник биохимика. /Досон P., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. М.: Мир, 1991. -481 с.

92. Березин И.В., Рабинович М.Л., Синицын А.П. Исследование возможностей кинетического спектрофотометрического метода определения глюкозы //Биохимия. -1977.-Т. 42.-С. 1631-1636.

93. Martens-Uzunova E.S. and Schaap P.J. Assessment of the pectin degrading enzyme network of Aspergillus niger by functional genomics //Fungal. Genet. Biol. -2009. -V. 46. -P. 170-179.

94. Morozova V.V. Gusakov A.G., Andrianov R.M., Pravilnikov A.G., Osipov D.O., Sinitsyn A.P. Cellulases of Penicillium verruculosum //Biotechnol. J. -2010. -V. 5. -P. 8718801. БЛАГОДАРНОСТИ