Структурные основы сворачивания белка и амилоидных конформационных болезней: На примере лизоцимов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, доктор физико-математических наук Морозова-Рош, Людмила Александровна

• Морозова-Рош, Людмила Александровна
• доктор физико-математических наук
• 2002

Оглавление диссертации доктор физико-математических наук Морозова-Рош, Людмила Александровна

I. ВВЕДЕНИЕ

П. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

11.1. Проблема сворачивания белка.

11.2. Парадокс Левинталя. 9 П.З. «Новый» взгляд на сворачивание белка. 10 П. 4. Исследование равновесных промежуточных состояний белка. 15 11.6. Исследование кинетических промежуточных состояний белка. 17 11. 7. Функциональная роль промежуточного состояния типа расплавленной глобулы.

II. 8. Исследования амилоидных фибрилл w 5iiw. 26 П. 9. Исследования амилоидных фибрилл in vitro. 31 П. 10. Рентгеноструктурпый анализ амилоидных фибрилл. 33 П. 11. Белковая агрегация и конфирмационные болезни. 34 П. 12. Патологические проявления амилоидозов.

III. МАТЕРИАЛЫ И ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

III. 1. Выделение лизоцимных белков. 43 III. 2. Экспрессирование лизоцимных белков в Aspergillus niger. 44 III. 3. Синтез пептида АК21 с Ь-полипролиповой II структурой. 45 III. 4. Производство дейтерированных образцов. 45 III. 5. Оптические методы.

III. 6. Окрашивание амилоидных образцов Конго красным и тиофлавином.

III. 7. Структурный анализ белка.

III. 8. Метод ЯМР спектроскопии.

III. 9. Кинетическая ЯМР спектроскопия в реальном времени.

III. 10. Эксперименты по водородному обмену в равновесных условиях.

III. 11. Эксперименты по сворачиванию белка и одновременному водородному обмену, производимые путем ручного смешивания.

III. 12. Сворачивание и водородпо-дейтериевый обмен белка, осуществляемый с помощью установки по быстрому смешиванию.

III. 13. Математическая обработка данных по водородному обмену, происходящему в процессе сворачивания белка.

III. 14. Эксперименты по сворачиванию белка с использованием оптических методов "остановленной струи".

III. 15. Кинетические эксперименты по связыванию АНС белком в процессе сворачивания.

III. 16. Метод Рамановской оптической активности.

III. 17. Дифференциальная сканирующая микрокалориметрия.

III. 18. Электронная микроскопия.

III. 19. Атомная силовая микроскопия.

III. 20. Рентгеноструктурный анализ амилоидных фибрилл. 67 IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

IV. 1. Часть I. Изучение промежуточных состояний лизоцимов в равновесных условиях.

IV. 1. 1. Лошадиный лизоцим как основной объект исследований. 68 IV. 1. 2. Промежуточные, компактные состояния лошадиного лизоцима при равновесных условиях.

IV. 1.3. А-форма лошадиного лизоцима.

IV. 1. 4. Исследование нативпого состояния лошадиного лизоцима методом ЯМР.

IV. 1. 5. Водородный обмен нативной формы лошадиного лизоцима.

IV. 1. 6. Водородный обмен А-формы. Структурные основы стабильности расплавленной глобулы.

IV. 1. 7. Гидрофобный кластер А-формы.

IV. 2. Часть П. Изучение кинетических промежуточных состояний лошадиного лизоцима.

IV. 2. 1. Эксперименты по водородному обмену в ходе сворачивания лошадиного лизоцима при рН 7.5.

IV. 2. 2. Измерение водородного обмена в лошадином лизоциме с миллисекундным временным разрешением.

IV. 2. 3. Множественные пути сворачивания белка.

IV. 2. 4. Отсутствие зародышевого ядра в развернутом состоянии.

IV. 2. 5. Исследование сворачивания лошадиного лизоцима спектральными методами. 137 IV. 2. 6. Роль множественных центров нуклеации и участков с локальной кооперативностью в процессе сворачивания лошадиного лизоцима.

IV. 3. Часть III. Образование лизоцимом амилоидных фибрилл. 151 IV. 3. 1. Условия образования фибриллярных структур. Роль промежуточного состояния. 151 IV. 3. 2. Поли Ь-пролиновая II спираль как важный элемент вторичной структуры, ведущий к развитию амилоида.

IV. 3.3. Структурные характеристики амилоидных фибрилл.

IV. 3. 4. Инициация образования амилоида внесением затравки.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Морозова-Рош, Людмила Александровна

VI. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ.

Из представленного в диссертации широкого спектра экспериментальных исследований были суммированы основные результаты и выводы, которые приведены ниже:

Впервые обнаружены и охарактеризованы промежуточные состояния кальций-связывающего лизоцима лошади, которые отличаются различной степенью упорядоченности.

На основании экспериментальных данных по водородному обмену и спектральных исследований предложена оригинальная модель расплавленной глобулы, в которой в отличие от 'классической' расплавленной глобулы, характеризующейся разупорядоченной третичной структурой. присутствует очень стабильное ядро с нативпой упаковкой трех из четырех главных а-спиралей, окруженное менее упорядоченной, но компактной полипептидной цепью. На примере логиадиного лизоцима показаны молекулярные основы стабильности белка и роль отдельных аминокислотных остатков в поддержании стабильности молекулярной глобулы, как в наливном, так и в промежуточном состояниях.

Впервые с использованием широкого набора экспериментальных методов на примере лошадиного лизоцима было показано структурное подобие гидрофобных кластеров или ядер равновесной расплавленной глобулы и кинетического промежуточного состояния, образуюш,егося в миллисекундном диапазоне времени после инициации сворачивания белка, которые определяют стабильность этих промежуточных состояний.

На примере лошадиного лизоцима экспериментально было показано, что сворачивание белка является очень некооперативным и гетерогенным процессом, который включает множественные центры нук-леации и множественные траектории, ведушие к нативному состоянию. Выявлено независимое образование в молекуле белка областей, которые характеризуются локальной кооператвностью. Показано, что сворачивание в нативпую упаковку происходит через ассоциацию областей с локальной кооперативностью, которая осуществляется в различном порядке в разных популяциях белковых молекул лошадиного лизоцима. Представленные в диссертации экспериментальные данные о сворачивании белка отражают сложную физическую природу энергетических поверхностей сворачивания, которые были расчитаны в теоретических, статистико-ме-ханических моделях.

Впервые было экспериментально показано, что человеческий лизо-цим дикого типа, ненесущий никаких изменений в своей первичной структуре, способен образовывать амилоидные структуры с такими же свойствами, как и амилоидные фибриллы, образованные мутантными ли-зоцимами и выделенные из печени пациентов, страдающих амилоидными болезнями.

Было обнаружено, что к образованию амилоидных фибрилл приводит промежуточное компактное состояние человеческого лизоцима с разупорядоченной третичной структурой и частично развернутой вторичной структурой.

В диссертации была найдена структурная детерминанта в молекуле человеческого лизоцима, способствующая образованию амилоида. Было показано, что частичное разворачивание вторичной структуры в промежуточном состоянии белка коррелирует с переходом одной из главных а-спиралей человеческого лизоцима в состояние типа поли Ь-пролино-вой II спирали, которая обладает большой конформационной подвижностью и способна играть ключевую роль в образовании (З-складчатых фибрилл.

Были изучены структурные и физико-химические свойства амилоидных фибрилл человеческого лизоцима дикого типа и его мутантов. Было показано, что упаковка протофилламентов в фибрилле и структура самой фибриллы зависит от аминокислотной последовательности белка и от условий внешней среды.

Была показана ключевая роль затравки в инициации лизоцимного амилоидоза, которая значительно ускоряет развитие этого процесса, а также влияет на морфологию амилоидных фибрилл. Было показано, что наибольший эффект вызывает затравка той же природы, что и мономерпый белок. Амилоидные фибриллы, образованные из белков или пептидов другого вида, чем белок предшественник, не служат для него затравками.

VIL СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ. Статьи в отечественных журналах.

L Пермяков Е.А., Калиниченко Л.П., Морозова Л.А., Ярмоленко В.В., Бурштейн Е.А. (1982) Связывание ионов магния а-лактальбумипом, исследованное методом флуоресцентной спектроскопии. Биофизика, 27, 578 - 583.

2. Пермяков Е.А., Ярмоленко В.В., Калиниченко Л.П., Морозова Л.А., Бурштейн Е.А. (1982) Связывание ионов кальция с а-лактальбумином коров. Изучение методом собственной флуоресценции белка. Биофизика, 27,380- 385.

3. Ярмоленко В.В., Пермяков Е.А., Калиниченко Л.П., Морозова Л.А., Бурштейн Е.А., Вайткус В. (1982) Связывание ионов кальция с а-лактальбумином молока коров. Ежегодный обзор. Литовский филиал

Всесоюзного исследовательского института масло-сырного производства, Вильнюс, 16, 134 - 140.

4. Сорокин В.А., Благой Ю.П., Валеев В.А., Хоменко С.А., Морозова Л.А. (1982) Влияние двухвалентного иона меди на конформацию полирибоадениловой кислоты. Мол. Биология, 16, 369-378.

5. Морозова Л.А., Пермяков Е.А., Бурштейн Е.А. (1983) Свойства а-лактальбумина, как металл-связывающего белка. Ежегодный обзор, Научный центр биологических исследований, РАН, Пущино, ст. 16 - 21.

6. Пермяков Е.А., Калиниченко Л.П., Морозова Л.А., Дережков В.Ю., Багелова Ж., Анталик М. (1988) Взаимодействие катионов меди и цинка с каньций-связывающим белком. Мол. Биология, 22, 984 - 991.

7. Морозова Л.А., Гусев Н.Б., Шниров В.Л., Пермяков Е.А. (1988) Исследование физико-химических свойств тропонина 1 и тропонина Т из сердечной и скелетной мышц каллориметрическим и флуоресцентным методами. Биохимия, 53, 531 - 540.

Статьи в международных журналах.

1. Morozova-Roche L.A., Zurdo J., Spencer A., Noppe W., Receveur V., Archer D., Joniau M., Dobson CM. (2000) Amyloid fibril formation and seeding by wild tзфe human lysozyme and its disease related mutational variants./. Struct. Biol, Special Issue on Amyloidosis, 130, 339-351.

2. Blanch E.W., Morozova-Roche L.A., Cochran D.A.F., Doig A.J., Hecht L., Barron L.D. (2000) Is polyproline II helix the killer conformation ? A Raman optical activity study of the amyloidogenic prefibrillar intermediate of human lysozyme. J. Mol. Biol, 301,553-563.

3. Morozova-Roche L. A., Chamberlain A.K., MacPhee C.E., Zurdo J., Hill H.A.O., Dobson CM., Davis J.J., four first authors contributed equally to this work. (2000) The ultrastructural organisation of amyloid fibrils by atomic force microscopy. Biophys. J., 79, 3282-3293.

4. Blanch E.W., Morozova-Roche L.A., Hecht L., Barron L.D. (2000) Raman optical activity characterisation of native and molten globule states of equine lysozyme and comparison with hen lysozyme and bovine a-lactalbumin. Biopolymers:Biospectroscopy, 57, 235-248.

5. Hill H.A.O., Dobson CM., Davis J.J., MacPhee C, Morozova-Roche L.A. (2000) Visualising biological molecules at surface. New Fronties in Science, UK Royal Society, London, 46-47.

6. Morozova-Roche L.A., Jones J.A., Noppe W., Dobson CM. (1999) Independent nucleation and heterogeneous assembly of structure during folding of equine lysozyme. /. Mol Biol, 289,1055 -1073.

7. Spencer A., Morozova-Roche L.A., Noppe W., MacKenzie D.A., Jeenes D.J., Joniau M., Dobson CM., Archer D.B., two first authors contributed equally to this work. (1999) Expression, purification and characterisation of the recombinant calcium-binding equine lysozyme secreted by filamentous fungus Aspergillus niger. Comparison with the production of hen egg white and human lysozymes. Protein Expression & Purification, 16, 111 - 180.

8. Morozova-Roche L.A., van Nuland N., Uversky N.V., Noppe W., Dobson C M . (1998) A hydrophobic core in the equilibrium molten globule and kinetic intermediate of equine lysozyme. Biophys. J., 74, Part 2, A174.

9. Morozova-Roche L. A., Arico-Muendel C, Haynie D. T., Emelyanenko V. I., Van Dael H., Dobson C M . (1997) Structural characterisation and comparison of the native and A-states of equine lysozyme. J. Mol. Biol, 268, 903 - 921.

10. Morozova, L.A., Haynie D.T., Arico-Muendel C, Van Dael H., Dobson CM. (1995) Structural basis of the stability of a lysozyme molten globule. Nature Struct. Biol, 10, 171 - 175.

11. Rohrig U., Gerisch G., Morozova L., Schleicher M., Wegner A. (1995) Coactosin interferes with the capping of actin filaments. FEBS Letters, 374, 284 - 286.

12. Morozova L., Desmet J., Joniau M. (1993) Complexes of the polyamines spermine, spermidine and putrescine with a-lactalbumins. Eur. J. Biochem. 218, 303 - 309.

13. Van Dael H., Haezebrouck P., Morozova L., Arico-Muendel C, Dobson C M. (1993) Partially folded states of equine lysozyme. Structural characterization and significance for protein folding. Biochemistry, 32, 11886 -11894.

14. Morozova L.A., Shnyrov V.L., Gusev N.G., Permyakov E.A. (1991) Thermal transitions in cardiac troponin and its subunits. NATO ASI Series "Cellular Regulation by Protein Phosphorylation", Ed. L.M.G.Heilmeyer, Springer-Verlag, 56, 67 - 71.

15. Morozova L., Van Cauwelaert F. (1991) Stability of equine lysozyme. Thermal unfolding transitions. Arch. Int. de Physiologic de Biochimie, 99, B16.

16. Haezebrouck P., Morozova L., Van Cauwelaert F. (1991) The thermal stability of equine and pigeon lysozymes. J. Inorg. Biochem., 43 , 395.

17. Morozova L., Haezebrouck P., Van Cauwelert F. (1991) Stability of equine lysozyme. Thermal unfolding behaviour. Biophys. Chem., 41, 185 - 191.

Тезисы отечественных конференций.

1. Морозова-Рош Л. А., Джонс Дж., Добсон K.M. Гетерогенные процессы сворачивания лошадинного лизоцима. Взаимосвязь равновесных и кинетических промежуточных состояний. 2-ой биофизический конгресс, Москва, Россия, лекция, с.63, 1999.

2. Емельяненко В.И., Кузнецова СМ., Морозова-Рош Л.А., Филимонов, В.В. Термодинамические характеристики нативного и промежуточных состояний лошадиного лизоцима. 2-ой биофизический конгресс, Москва, Россия, с. 32-33, 1999.

3. Морозова Л.А., Шныров В.Л., Гусев Н.Б. Пермяков Е.А. Взаимодействие субъединиц тропонина сердечной мышцы в двойных и тройных комплексах. 5-я конференция по биоорганической химии, Пущино, Россия, с.70, 1988.

4. Пермяков Е.А., Морозова Л.А., Калиниченко Л.П., Дережков В.Ю. Взаимодействие кальций-связывающих белков с катионами меди и цинка, исследованное методом флуоресцентной спектроскопии. 6-я Всесоюзная конференция "Спектроскопия биополимеров", Харьков, Украина с. И, 1988.

5. Морозова Л.А., Шниров В.Д., Гусев Н.Б., Пермяков Е.А. Взаимодействия субъединиц тропонина сердечной мышцы исследованные методами флуоресценции и микрокалориметрии, б-я Всесоюзная конференция "Спектроскопия биополимеров", Харьков, Украина, с. 11, 1988.

6. Морозова Л.А., Калиниченко Л.П., Дережков В.Ю Взаимодействие кальций-связываюпдих белков с катионами меди и цинка. Всесоюзная конференция Кальциевый обмен в физиологии и патологии сердечнососудистой системы", Томск, Россия, с. 160, 1988.

7. Морозова Л.А., Шниров В.Л., Гусев Н.Б., Пермяков Е.А. Физико-химические свойства комплекса тропонина сердечной мышцы и его субъединиц. Всесоюзная конференция "Кальциевый обмен в физиологии и патологии сердечно-сосудистой системы", Томск, Россия, с. 149, 1988.

8. Морозова Л.А., Шныров В.Л., Пермяков Е.А. Термическая денатурация тропонинового комплекса и его компонентов. 8-я конференция "Биофизика и биохимия биологической подвижности", Пушино, Россия, с. 25, 1987.

9. Морозова Л.А., Шныров В.Л., Гусев П.Б., Пермяков Е.А. Физико-химические свойства тропонинового комплекса скелетной мышцы. 2-я международная конференция "Молекулярные основы биотехнологии", Пушино, Россия, с. 12, 1987.

10. Морозова Л.А., Креймер Д.Л., Пермяков Е.А. Физико-химические свойства а-лактапьбумина исследованные методом флуоресцентной спектроскопии. 5-я Всесоюзная конференция "Спектроскопия биополимеров", Харьков, Украина, с. 162, 1984.

10. Пермяков Е.А., Морозова Л.А., Бурштейн Э.А. Связывание катионов металлов а-лактальбумином и его эффект на устойчивость белка к термической, рН и мочевинной денатурации, б-я конференция "Химия белков и пептидов", Рига, Латвия, с.74-75, 1983.

11. Морозова Л.А., Пермяков Е.А., Ярмоленко В.В., Свойства а-лактальбумина как металл-связывающего белка. 1-й Всесоюзный биофизический конгресс, Москва, Россия, 1, с. 19, 1982.

12. Ярмоленко В.В., Вайткус В., Пермяков Е.А., Калиниченко Л.П., Морозова Л.А., Бурштейн Е.А. а-лактальбумин как кальций-зависимый компонент лактозосиптетазы. 21-й международного молочный конгресс, Москва, Россия, 1, с. 153, 1982.

13. Валеев В.А., Морозова Л.А., Сорокин В.А., Силина Е.В., Благой Ю.П. Влияние ионов кальция, меди и цинка па конформацию полирибоадениловой кислоты. 5-я конференция "Конформационные изменения биополимеров в растворах", Телави, Грузия, с.25, 1981.

14. Пермяков Е.А., Ярмоленко В.В., Калиниченко Л.Р., Морозова Л.А. Взаимодействие белков с ионами металлов изученные методом флуоресцентной спектроскопии. 4-я Всесоюзная конферен1р1Я "Спректроскопия биополимеров", Харьков, Украина, с. 138-139, 1981.

Тезисы международных конференций.

1. Morozova-Roche L.A. Folding and amyloid of lysozyme. Intermediate state as a switch between normal and pathogenic paths. Second multidisciplinary workshop. Self-assembly of peptides and proteins in biology, medicine and engineering, Crete, Greece, Lecture, p. 27, 13-17 June 2001.

2. Morozova-Roche L.A. Heterogeneous folding of equine lysozyme. 2d Annual Meeting EU Training & Mobility of Researchers Network "Structure and Dynamics of Intermediate States in Protein Folding", Rome, Italy, Lecture, 24-26 Mar. 1999.

3. Morozova-Roche L.A. Independent nucleation and heterogeneous assembly of structure during equine lysozyme folding. 2d International Workshop "Structural characterisation of proteins by NMR, x-ray diffraction and computational methods", Verona, ltdXy, Lecture, 17-22 Feb. 1999.

4. Morozova-Roche L.A., Noppe W.' Dobson CM. Refolding of equine lysozyme. 3rd European Conference "Stable isotopes aided NMR of biomolecules", Oxford, UK, p.67, 4-7 Apr. 1998.

5. Morozova-Roche L.A., Uversky V.N., Noppe W.' Dobson, CM. Refolding and unfolding of equine lysozyme outside the cell. EMBO Workshop "Protein folding and misfolding inside and outside the cell", Oxford, UK, 24-28 Mar. 1998.

6. Morozova-Roche L.A., van Nuland N., Uversky V.N., Noppe W., Dobson CM. A hydrophobic core in the equilibrium molten globule and kinetic intermediate of equine lysozyme. 42th Annual Meeting of the Biophysical Society, Kansas City, Missouri, USA, p.A174, 22-26 Feb. 1998.

7. Morozova-Roche L.A., Forge V., van Nuland N., Noppe, W., Dobson, C M . Relating structural properties of equilibrium molten globule states and kinetic intermediates of equine lysozyme. Conference 'Molecular structural biology", Vienna, Austria, p.l09, 10-14 Sept. 1997.

8. Morozova-Roche L., Forge V., van Nuland N., Noppe W, Dobson C M . The refolding of equine lysozyme. Comparison of the kinetic intermediates with the equilibrium molten globule. Conference "NMR in molecular biology", Oxford, UK,p.50, 23-28 Aug. 1997.

9. Morozova-Roche L.A., Arico-Muendel C C , Haynie D.T., Noppe W., van Dael H., Dobson, C M . Molecular basis of the stabilty of the native and molten globule states of equine lysozyme. Protein Science v. 6, p. 80. 2d European Symposium of Protein Society, Cambridge, UK, 12-16 Apr. 1997.

10. Morozova L.A., Arico-Muendel C C , van Dael H., Dobson C M . Effect of calcium binding on protein structure and stability. NMR studies of equine lysozyme. European Research Conference "Protein folding and stability ", San Felu de Guixols, Spain, p.80, 8-13 Apr. 1995.

11. Morozova L.A., Siegert F. & Weijer C.J. Characterization of the cAMP response of the triple mutant ofDictyostelium discoideum. NATO-ASI Summer-School "Tyrosine phosphrilation/dephosphorilation and downstream signalling", Acquafredda di Maratea, Italy, p. 153, Sept. 1992.

12. Haezebrouck P., Morozova L., Van Cauwelaert F. Thermal stability of equine and pigeon lysozymes. 4th International Conference on Circular Dichroism, Bochum, Germany, p.266-267, Sept. 1991.

13. Morozova L., Haezebrouck P., Joniau P., Van Cauwelert F. Circular dichroism of bovine a-lactalbumin complexes with polyamines. 4th

International Conference on Circular Dichroism, Bochum, Germany, September 1991, p.292-293.

14. Desmet J., Haezebrouck P., Morozova L., Van Cauwelaert F. The effect of the calcium-binding loop on the stability of lysozyme and a-lactalbumin.

International Workshop "Structure and function of mutated proteins", Florence, Italy, p. 168-169, Aug. 1991.

15. Morozova L.A., Shnyrov V.L., Gusev N.B., Permyakov E.A. Thermal transitions in cardiac troponin and its subunits. NATO-FEBS Summer School "Cellular regulation by protein phosphorylation". Chateau La Londe Les Maures, France, p. 186, Sept. 1990.

16. Musatov A., Morozova L. Tryptophan fluorescence of cytochrome с oxidase. Czechoslovakian Biochemical Meeting, Olomouz, Czechoslovakia, p.57, 1989.

V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В результате теоретических предпосылок (Chan & Dill, 1998; Dinner et al., 2000; Finkelstein, 1997; Onuchic et al., 1997) и решения поставленных целей и задач в данной диссертационной работе на примере лизоци-мов впервые было показана тесная взаимосвязь между сворачиванием белка и образованием амилоидозов. Впервые на детальном субмолуеку-лярном уровне было показано структурное подобие ядерных структур равновесных и кинетических промежуточных состояний. Знание свойств промежуточных состояний позволило перейти к изучению и выяснению механизмов как сворачивания белка, так и образования амилоидных структур. Исследование свойств кинетических промежуточных состояний привело к развитию модели гетерогенного сворачивания белковых молекул и выяснению молекулярных механизмов такого процесса. Особенно гетерогенная модель сворачивания важна для понимания образования нативной структуры в многодоменных и больших белках, которые в силу своей иерархичной третичной и четвертичной структуры не могут сворачиваться в соответствии с простой кооперативной схемой перехода между развернутым и нативным состояниями и их процесс сворачивания неизбежно включают множественные стадии. Отдельные стадии в сворачивании многодоменных белков могут соответствовать образованию областей с локальной кооперативностью, описанных в данной работе. Представленная в диссертации экспериментальная модель гетерогенного сворачивания белка впервые наиболее детально продемонстрировала физическую природу энергетических поверхностей сворачивания, рассчитанных в статистических теоретических исследованиях (Dinner et al., 2000).

В данной диссертации было показано, что образования амилоидных фибрилл прогрессирует в том случае, если физико-химические условия среды позволяют образоваться равновесным промежуточным состояниям белка. Поскольку кинетические промежуточные состояния имеют структурные свойства, подобные равновесным промежуточным состояниям, они также могут спровоцировать образование амилоидных фибрилл, в том случае если белок задерживается в этих промежуточных состояниях. В диссертации впервые было показано, что человеческий лизоцим дикого типа столь же способен образовывать амилоидные фибриллы (Могогоуа-КосЬе е1 а1., 2000"'л) как и мутантные лизоцимы, найденные у семей, особенно подверженных амилоидным болезням (Реруз е1 а1., 1993). Было продемонстрировано, таким образом, что хотя мутации способствуют развитию болезни, но образование амилоидных фибрилл продиктовано свойствами самой полипептидной цепи.

Представленный фактический материал позволяет определить следующие научные направления, развитые в диссертации. В диссертации были разработаны методы и подходы к изучению равновесных и кинетических промежуточных состояний, образующихся в ходе сворачивания белка и на примере лошадиного лизоцима показана их структурная взаимосвязь, особенно в области упорядоченного гидрофобного ядра. В диссертации были предложены конкретные молекулярные механизмы, объясняющие сложность и гетерогенность сворачивания белка, а именно, образование множественных центров нуклеации, формирование областей с локальной кооперативностью, присутствие множественных путей сворачивания белка и образование ансамбля промежуточных состояний на пути из развернутого к нативному состоянию белка. Были выявлены молекулярные механизмы возникновения лизоцимных амилоидозов и на примере лизоцимов показано, что образование амилоида является следствием не патогенных мутаций, а естественно присущих полипептидной цепи конформационной пластичности и способности образовывать Р-складча-тые структуры. В диссертации было показано, что если в результате изменений физико-химических свойств среды в белковой структуре высвобождаются аминокислотные последовательности, способные образовывать ß-складку, то это может привести к образованию фибрилл. Была определена структурная детерминанта, ведущая к возникновению амилоида, которой служит L-полипролиновая II спираль.

В диссертации были изучены структурные свойства амилоидных фибрилл на различных стадиях их формирования, а также найдены пути воздействия на их структуру, что может достигаться выбором соответствующей затравки, мутациями и изменением растворителя. Таким образом, были выявлены начальные механизмы, которые могут позволить воздействовать на патогенность амилоидных фибрилл, существенно зависящую от их морфологии. Показанная в работе решающая роль затравки в провоцировании и быстром развитии амилоидозов и наблюдаемая внутривидовая специфичность к затравке того же типа, что и белок предшественник, важны для понимания механизмов преодоления межвидовых барьеров в случае инфекционных амилоидных болезней, что происходит в частности в случае с прионными инфекциями (Scott et al., 1999).

Подведя итоги сказанному выше, следует отметить взаимосвязь всех трех частей работы. Исследование развивалось в соответствии с теми научно-практическими задачами, которые оказывались актуальными в данный момент. Большим стимулом послужило также развитие методологий, таких как методы быстрого смешивания, которые в сочетании с ЯМР и спектральными методами, позволили изучать структурные изменения в ходе сворачивания белка в миллисекундном диапазоне времени. Растущая численность нервно-дегенеративных болезней, связанных со старением, и особенно распространение прионных болезней, вызвало смещение основного фокуса исследований от правильного сворачивания, ведущего к на-тивной структуре, к ошибочному сворачиванию белка, вызывающему болезнь. По мере усложнения задач и объектов исследований результаты каждой предыдущей части позволяли решать следующий класс задач, являясь фундаментом для следующего этапа. Таким образом, результаты по сворачиванию белка послужили основой и практической методологией для исследования структурных механизмов образования амилоидных структур.

Список литературы диссертационного исследования доктор физико-математических наук Морозова-Рош, Людмила Александровна, 2002 год

1. Бычкова В.Е. (1997) О функциональной роли ненативных белков. Успехи биологической химии", 37, 49-99.

2. Бычкова В.Е., ПТИЦЫН О.Б. (1995) Функциональное состояниеденатурированных белков: принципы моделирования и первыерезультаты. Цитология, 37, 1238-1250.

3. Волькенштейн М.В. (1981) Биофизика. Москва, Наука.

4. Есипова Н.Г., Лобачев В.М., Рогуленко В.П., Макаров A.A., Шибнев В.А.1984) Исследование структуры левой спирали поли-Е-пролинового типа1. в пептидах. Мол. Биол., 18, 725-73 5.

5. Ибрагимова Г.Т., Киваева Л.С, Кутышенко В.П. (1999) Исследование компактного денатурированного состояния белков методом молекулярной динамики. Биофизика, 44, 27-3 1.

6. Колб, В.А., Коммер, A.A., Спирин, A.C. (1987) Есть ли канал для пептидного синтеза па рибосоме? Мечение рибосомы в процессе трансляции тритием. Докл. Акад. Наук СССР, 29, 1497-1501.

7. Кутышенко В. П. (1995) Спиновая диффузия как метод иссследования динамики глобулярных белков. Диссертация докт. ф.-м. н. 03.00.02, Пущино.

8. Кутышенко, A.B., Кутышенко, В.П., Киваева Л.С (1997) ЯМР исследования бета-слойных структур в компактных ненативных состояниях глобулярных белков. Биофизика, 101, 5-9.

9. Рубин А.Б. (1999) Биофизика. Т.1. Москва, Книжный дом "Университет".

10. Сокхадзе В.М., Мревлишвили Г.М., Есипова Н.Г. (1990) Калориметрические исследования гистона HI и поли-Ь-пролина 11 при низких температурах. Биофизика, 35, 410-414.

11. Степанов В.М. (1996) Молекулярная биология. Структуры и функции белков. Москва, Высшая Школа.

12. Ступин В. А. (1969) Справочник терапевта. Москва, Медицина. Туманян В.Г., Есипова Н.Г. (1996) Специфический комплекс между полипептидом в лево-спиральной конформации полипролинового типа II и малой бороздкой Б-ДНК. Биофизика, 41, 246-248.

13. Юсупов. М.М., Спирин, А.С. (1986) Исследование поверхности рибосом Escherichia соИ и рибосомных частиц с помошью бомбардировки тршшм. Биохимия, 11,1858-1867.

14. Abóla Е., Bernstein Р., Bryant S., Koetzle Т., Weng, J. (1987) Protein Data Bank in Crystallographic Databases Information Content, Software Systems, Scientific Applications. Bonn. Data Commission of the International Union of Crystallography.

15. Abrami L, Fivaz M, van der Goot F.G. (2000) Adventures of a pore-forming toxin at the target cell surface. Trends Microbiol., 8, 168-172. Review.

16. Alexandrescu A., Broadhurst R., Wormald C, Chyan C, Baum J., Dob son C. M . (1992) 1H-NMR assignments and local environments of aromatic residues in bovine, human and guinea pig variants of a-lactalbumins. Eur. J. Biochem., 210, 699-709.

17. Anfmsen, CB. (1973) Principles that govern the folding of protein chain. Science, 181, 223-230.

18. Ancsin J.B., Kisilevsky R. (2001) Serum amyloid A peptide interactions with glycosaminoglycans. Evaluation by affinity chromatography. Methods Mol. Biol, 171, 449-456.

19. Aramini J.M., Drakeberg T., Hiraoki T., Ke Y., Nitta K., Vogel H.J. (1992) Calcium-43 NMR studies of calcium-binding lysozymes and a-lactalbumins. Biochemistry, 31, 6761-6768.

20. Archer D. B., Jeens DJ., MacKenzee D. A., Brightwell G., Lambert N., Lowe G., Radford S.E., Dobson C.M. (1990) Hen egg white lysozyme expressed and secreted from Aspergillus niger is correctly processed and folded Biotechnology, 8, 741-745.

21. Aue W.P., Bartholdi E., Ernst R.R. (1976) Two-dimensional nuclear Overhauser enhancement (2D NOE) experiment for the elucidation of complete proton-proton cross-relaxation networks in biological macromolecules. J.Chem.Phys., 64, 2229-2246.

22. Badretdinov A. Ya., Finkelstein A. V. (1998) How homologs can help to predict protein folds even though they cannot be predicted for individual sequences. /. Comput. Biol, 5, 369-376.

23. Bai Y., Milne J. S., Mayne L., Englander S. W. (1993) Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins: Struct., Func. and Genet., 17, 75-86.

24. Balbach J., Forge V., van Nuland A. A. J., Winder S. L., Hore P. J., Dobson C. M. (1995) Following protein folding in real time using NMR spectroscopy. Nature Struct. Biol, 2, 865-870.

25. Balbach J., Forge V., Lau W.S., Jones J. A., van Nuland N. A., Dobson C. M. (1997) Detection of residue contacts in a protein folding intermediate. Proc. Natl Acad. Sei. USA, 94, 7182-7185.

26. Baldwin R. L. (1993) Pulsed H/D-exchange studies of folding intermediates.

27. Curr.Opin.Struct.Biol, 3, 84-91.

28. Baldwin R. L. (1995) The nature of protein folding pathways: the classical versus the new view. J. Biomol. NMR, 5, 103-109.

29. Bartik K., Dobson CM., Redfield C. (1993) 1H-NMR analysis of turkey egg-white lysozyme and comparison with hen egg-white lysozyme. Eur. J. Biochem., 215, 255- 266.

30. Baum J., Dobson CM., Evans P.A., Hanley C. (1989) Characterization of a partially folded protein by NMR methods: studies on the molten globule state of guinea pig aA&cidilhuTxvm Biochemistry, 28,7-13.

31. Bax A., Davis D.G. (1985) MLEV-17-based two-dimensional homonuclearmagnetization transfer spectroscopy. /. Mag. Res., 65, 353-360.

32. Bax A., Drobny G. (1985) Optimization of two-dimensional homonuclearrelayed coherence transfer NMR spectroscopy. /. Mag. Res., 61, 306-320.

33. Benoit M., Gabriel D., Gerisch G., Gaub H.E. (2000) Discrete interactions incell adhesion measured by single-molecule force spectroscopy. Nat. Cell Biol.,2,313-317.

34. Blake C.C.E., Serpell L. C (1996) Synchrotron X-ray studies suggest that the core of the transthyretin amyloid fibrils is a continuous P-sheet helix. Structure, 4,989-998.

35. Branden C, Tooze J. (1995) Introduction to protein structure. W.HFreeman & Company, New York.

36. Büchner J., Schmidt M., Fuchs M., Jaenicke R., Rudolf R., Schmidt F.X., KeifhaberT. (1991) GroE facilitates refolding of citrate synthase by suppressing aggregation. Biochemistry, 30, 1586-1591.

37. Buck M., Radford S. E., Dobson C. M. (1994) Amide hydrogen exchange in a highly denatured state. Hen egg-white lysozyme in urea. J. Mol. Biol, 237, 247-254.

38. Bullock A. N., Fersht A. R. (2001) Rescuing the function of mutant p53.

39. Nature Rev. Cancer., 1, 68-76.

40. Burstein E.A. (1996) An improved algorithm of resolution of fluorescence spectrainto quencher accessibility-associated components. Photochem. PhotobioL, 63, 278-280.

41. Burstein E.A., Emelyanenko V.l. (1996) Log-normal description of fluorescence spectra of organic fluorophores. Photochem. PhotobioL, 64, 316320.

42. Carell R.W. , Lomas D.A. (1997) Conformational disease. The Lancet, 350, 134-138.

43. Chan H. S., Dill K. A. (1998) Protein folding in the landscape perspective: chevron plots and non-Arrhenius kinetics. Proteins: Struct. Fund. Genet., 30, 2-33.

44. Chelvanayagam G., Reich Z., Bringas R., Argos P. (1992) Prediction ofprotein folding pathways. J. Mol. Biol, 227,901-916.

45. Chiang H.-L., Terlecky S.R., Plant CP., Dice J.F. (1989) A role of 70-kilodalton heat shock protein in lysosomal degradation of intracellular proteins.1. Science, 246, 382-385.

46. Chiti F, Taddei N, Baroni F, Capanni C, Stefani M, Ramponi G, Dobson CM. (2002) Kinetic partitioning of protein folding and aggregation. Nature Struct. Biol, 9, 137-143.

47. Chothia C. (1976) The nature of the accessible and buried surfaces in proteins. J. Mol Biol, 105, 1-14.

48. Chyan C.L., Wormald C, Dobson CM., Evans P. A., Baum J. (1993) Structure and stability of the molten globule state of guinea-pig a-lactalbumin: a hydrogen exchange study. Biochemistry, 32, 5681-5691.

49. Cohen A.S. (1986) General introduction and a brief history of the amyloidfibrils. Amiloidosis, Ed. Marrink J. and Van Rijswijk, M.H., p. 3-19.

50. Cohen A.S., Calkins E. (1964) Isolation of amyloid fibrils and study of effectof collagenase and hyaluronidase. J. Cell Biol., 21, 481-486.

51. Cohen J.R. (2001) Journey of a lamb. Walking through dementia together.

52. J. Christ. Nurs., 18, 9-14.

53. Cysl27).lysozyme: a stopped-flow absorbence and fluorescence study.

54. Biochemistry, 33, 11225-11236.

55. Dill K.A., Chan H.S. (1997) From Levinthal to pathways to funnels. Nature Struct. Biol, 4, 10-19.

56. Dinner A., Karplus M. (1998) A metastable state in folding simulations of a protein model. Nature Struct. Biol, 5, 236-241.

57. Dinner A.R, Sali A, Smith L.J., Dobson CM., Karplus M. (2000) Understanding protein folding via free-energy surfaces from theory and experiment. Trends Biochem Scl, 25, 331-339. Review.

58. Divry P., Florkin M. (1927). Sur les propriétés optiques de L'amiloide, C.R. Soc.Biol, 97, 1808-1810.

59. Dobson C M . (1994) Protein folding. Solid evidence for molten globules. Curr.Biol, 4, 636-640.

60. Dobson CM. (1995) Folding and Binding. Editorial Overview. Curr. Op. Struct. Biol., 5 .56-57.

61. Dobson C M. (1999) Protein misfolding, evolution and disease Trends Biochem. Sci., 24, 329-332.

62. Dobson, C M . (2001) Protein folding and its links with human disease. Biochem. Soc. Symp., 68, 1-26. Review.

63. Dobson C M . (2001) The structural basis of protein folding and its links withhuman disease. Philos Trans R Soc LandB Biol Sci. 356,133-145.

64. Dobson CM., Evans P.A., Radford S.E. (1994) Understanding how proteinsfold: The lysozyme story so far. Trends Biochem. Sci., 19, 31-37.

65. Dobson CM., Sail A., Karplus M. (1998) Protein folding: a perspective fromtheory and experiment. Angew. Chem. Int. Ed., 37, 868-893.

66. Dobson CM., Karplus M. (1999) The fundamentals of protein folding:bringing together theory and experiment. Curr.Opin. Struct. Biol., 9, 92-101

67. Dolgikh D.A., Gilmanshin R.I., Brazhnikov E.V., Bychkova V.E., Semisotnov

68. G.V., Venyaminov S.Yu., Ptitsyn O.B. (1981) a-lactalbumin: compact statewith fluctuating tertiary structure? FEBS Letters, 136,311-315.

69. Dolgikh D.A., Kolomiets A.P., Bolotina I.A., Ptitsyn O.B. (1984) 'Moltenglobule' state accumulates in carbonic anhydrase folding.1. FEBS Lett., 165, 88-92.

70. Dyson H. J., Wright P.E. (1996) Insights into protein folding from NMR. Annu. Rev. Phys. Chem., 47, 369-395.

71. Eftink M.R., Giron CA . (1982) Fluorescence quenching. Studies with proteins.

72. Analit. Biochem., 114, 199-227.

73. Eyles S.J., Radford S.E., Robinson C.V., Dobson C. M. (1994) Kinetic consequences of the removal of a disulfide bridge on the folding of hen lysozyme. Biochemistry, 33, 13038-13048.

74. Fandrich M., Fletcher M. A., Dobson C M . (2001) Amyloid fibrils from muscle myoglobin. AaAwre, 410, 165-166.

75. Farahbakhsh Z.T., Baldwin R.L.,Wisnievski B.J. (1987). Effect on low pH on

76. Pseudomonas exotoxin A. Biol. Chem., 262, 225 6-2261.

77. Feng y., Sligar S.G., Wand A.J. (1994) Solution structure of apocytochromebS2- Nature Struct. Biol., 1, 30-35.

78. Feng Y ., Wand A.J., Sligar S.G. (1991) ' H and IANMR resonance assignments and preliminary structural characterisation of E.coli apocytochrome hsei. Biochemisry, 30, 7711-7717.

79. Fersht A.R. (1993). The sixth Datta lecture. Protein folding and stability: Thepathway of folding of bamase. FEBSLetters, 325, 5-16.

80. Fersht A. R. (1995) Optimization of rates ofprotein folding: the nucleationcondensation mechanism and its implications Proc. Natl Acad. Sci. USA, 92,10869-10873.1. Finkelstein A.V.

81. Protein structure: what is it possible to predict now? (1997) Curr. Opin. Struct. Biol, 7, 60-71. Review.

82. Finkelstein A.V. (1997) Can protein unfolding simulate protein folding?

83. Protein Eng., 10, 843-845.

84. Finkelstein A.V., Shakhnovich E.I. (1989) Theory of cooperative transitions in protein molecules. II. Phase diagram for a protein molecule in solution.

85. Biopolymers, 28, 1681-1694.

86. Forge v., Wijesingha R., Balbach J., Brew K., Robinson C.V., Redfield C, Dobson CM. (1998) Refolding of bovine a-lactalbumin. /. Mol. Biol, 287, 673-683.

87. Funahashi J., Takano K., Ogasahara K., Yamagata Y., Yutani K. (1996) The structure, stability and folding process of amyloid mutant human lysozyme. J. Biochem., 120, 1216-1223.

88. Galzitskaya O.V., Finkelstein A.V. (1999) A theoretical search for folding/unfolding nuclei in three-dimensional protein structures. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 11299-11304.

89. Galzitskaya O.V., Ivankov D.N., Finkelstein A.V. (2001) Folding nuclei in proteins. FEBSLett., 489, 113-118. Review.

90. Gehrs B.C., Friedberg R. C (2002) Autoimmune hemolytic anemia. Am. J. HematoL, 69,258-271.

91. Glover J.R., Kowal A.S., Schirmer E.G., Patino M.M., Liu J.J., Lindquist S. (1997) Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of PSlA., a heritable prion-like factor of S. cerevisiae. Cell, 89 811-819.

92. Goldman R., Rottenberg H. (1973) Ion distribution in lysosomal suspensions. FEBSLett., 33, 233-238.

93. Griesinger C., Otting G., Wuthrich K., Emst R.R. (1988) Clean TOCSY for 1h spin system identification in macromolecules. J. Am. Chem. Soc., 110, 78707872.

94. Griko Y.V., Friere E., Privalov P.E. (1994) Energetics of the a-lactalbumin states: a calorimetric and statistical thermodynamic study. Biochemistry, 33, 1889-1899.

95. Haezebrouck P., Noppe W., Van Dael H., Hanssens, I. (1992) Hydrophobic interaction of lysozyme and a-lactalbumin from equine milk whey. Biochem. Biophys. Acta, nil, 305-310.

96. Haezebrouck P., De Baetselier A., Joniau M., Van Dael H., Rosenberg S., Hanssens J. (1993) Stability effects associated with the introduction of a partial and a complete CaA"A-binding site into human lysozyme Protein Eng., 6, 643649.

97. Haezebrouck P., Joniau M., Van Dael H., Hooke S .D., Woodruff N. D., Dobson C M . (1995) An equilibrium partly folded state of human lysozyme at low pH, J. Mol. Biol, 246,384-389.

98. Handoh H.H.G. (1985; D.Phil thesis, University of Oxford, UK. Hardin C, Eastwood M.P., Prentiss M., Luthey-Schulten Z., Wolynes P.O. (2002) Folding funnels: the key to robust protein structure prediction. J. Comput. Chem., 15, 138-146.

99. Harper J.D., Lansbury P.T. (1997) Models of amyloid seeding in Alzheimer's disease and scrapie: Mechanistic truths and physiological consequences of the time-dependent solubility of amyloid proteins. Annu. Rev. Biochem., 66, 385407.

100. Haynie D.T. (1993/ Ph.D. thesis. The Johns Hopkins University, USA. Haynie D.T., Freiré, E. (1993) Structural energetics of the molten globule state.

101. Proteins: Struct., Func. and Genet., 16, 115-140.

102. Herold M., Krirschner K. (1990) Reversible dissociation and unfolding of aspartate aminotransferase from Escherichia coli: Characterization of monomeric intermediate. Biochemistry, 29, 1907-1913.

103. Hill A.F., Desbruslais M., Joiner S., Sidle K.C., Gowland I., Collinge J., Doey L.J., Lantos P. (1997) The same prion strain causes vCJD and BSE Nature, 389, 448-450.

104. Holtzman E. (1989) Lysosomes, Plenum, New York.

105. Hooke S.D., Radford S.E. Dobson CM. (1994) The refolding of human lysozyme: a comparison with the structurally homologous hen lysozyme. Biochemistry, 33, 5867-5876.

106. Jaikaran E.T., Higham C.E., Serpell L.C., Zurdo J., Gross M., Clark A., Eraser P.E. (2001) Identification of a novel human islet amyloid polypeptide betasheet domain and factors influencing fibrillogenesis. J. Mol. Biol., 308, 515525.

107. Johnson W.C. (1990) Protein secondary structure and circular dichroism: Apractical guide Proteins: Struct. Funct. Genet., 7, 205-214.

108. Karplus M. (1997) The Levinthal paradox:yesterday and today. Fold. Des., 2,1. S69-S75.

109. Kim P.S., Baldwin R.L. (1990) Intermediates in the folding reactions of small of urea on hydrogen exchange rates of bovine pancreatic trypsin inhibitor.

110. Biochemistry, 32, 9609-9613.

111. Klunk W.E., Pettegrew J.W., Abraham DJ. (1989'') Two simple methods for quantifying low-affmity dye-substrate binding. J. Histochem. Cytochem., 37, 1293-1297.

112. Koo E.H, Lansbury P.T., Kelly J.W. (1999) Amyloid diseases: abnormal protein aggregation in neurodegeneration. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 9989-9990.

113. Koponen I. (1995). Random transition rate model of stretched exponential relaxation. J. Non-Cryst. Solids, 189,154-160.

114. Koponen I., Lintunen P., (1996) Random transition rate model of stretched exponential relaxation II. Self-similar rates from a complex energy landscape.

115. J. Non-Cryst. Solids, 197, 247-249.

116. Kumar A., Snyder M. (2002) Protein complexes take the bait. Nature, 415,123124.

117. Kataoka M., Goto Y. (1996) X-ray solution scattering studies of protein folding. Folding and Design, 1,R107-R114.

118. Kuroki Y., Kawakita S., Nakamura H., Yutani K. (1992) Entropic stabilization of a mutant human lysozyme induced by calcium-binding. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 6803-6907.

119. Kutyshenko V.P., Cortijo M. (2000) Water-protein interactions in the molten-globule state of carbonic anhydrase b: an NMR spin-diffusion study. Protein Sci.,S, 1540-1547.

120. Kuwajima K., Nitta K., Yoneyama M., Sugai S. (1976) Three-state denaturation of a-lactalbumin by guanidine hydrochloride. /. Mol. Biol., 106, 359-373.

121. Kuwajima K. (1989) The molten globule as a clue for understanding the folding and cooperativity of globular protein structures. Proteins: Struct., Func. and Genet., 6, 87-103.

122. Kuwajima K., Semisotnov G.V., Finkelstein A.V., Sugai S., Ptitsyn O.B. (1993) Secondary structure of globular proteins at the early and the final stages in protein folding. FEBSLett., 334, 265-268.

123. Matthews CR. (1993) The mechanism of protein folding. Annu. Rev. Biochem., 62, 653-683.

124. Melrose J., Ghosh P., Taylor T.K.F. (1989) Lysozyme, a major low-molecular-weight cationic protein of the intervertebral disc, which increases with ageing and degeneration. Gerontology, 35, 173-180.

125. Merz P.A., Wisniewski H.M., Somerville R.A., Bobin S.A., Masters C.L. (1983) Ultrastructural morphology of amyloid fibrils from neuritic and amyloidplaques. Acta Neuropathol., 60, 113-124.

126. Miller S., Janin J., Lesk A.M., Chothia C. (1987) Interior and surface of monomeric proteins. J. Mol. Biol, 196, 641-656.

127. Miranker A., Radford S.E., Dobson C M . (1991) An NMR demonstration of folding domains in lysozyme. Nature, 349, 633-636.

128. Miranker A., Dobson CM. (1996) Collapse and cooperativity in protein folding. Curr. Opin. Struct. Biol, 6, 31-42.

129. Mirny L. A., Finkelstein A. V., Shakhnovich E.I. (2000) Statistical significance of protein structure prediction by threading. Proc. Natl. Acad. Set. USA, 97, 9978-9983.

130. Mizuguchi M., Aral M., Ke Y., Nitta K., Kuwajima K. (1998) Equilibrium and kinetic of the folding of equine lysozyme studied by circular dichoism spectroscopy. /. Mol.Biol., 283, 265-277.

131. Moore R. C, Xiang F., Monaghan J., Han D., Zhang Z., Edstrom L., Anvret M., Prusiner S.B. (2001) Huntington disease phenocopy is a familial prion disease. Am. J. Hum. Genet, 69,1385-1388.

132. Morgan C.J., Miranker A., Dobson C M . (1998). Characterization of collapsed states in the early stages of the refolding of hen lysozyme. Biochemistry, 37, 8473-8480.

133. Morton A., Matthews B.W. (1995) Specificity of ligand binding in a buried nonpolar cavity of T4 lysozyme: linkage of dynamic and structural plasticity. Biochemistry, 34, 8576-8588.

134. Moult J., Unger R. (1991). An analysis of protein folding pathways. Biochemistry, 30, 3816-3824.

135. Mullins J. (1993) Crystallisation, Butterworth-Heinemann. Noppe W. Hanssens 1. De Cuyper M. (1995) Simple two-step procedure for the preparation of highly active pure equine milk lysozyme. J. Chromatogr. Sect., A 719, 327-331.

136. Muraki M., Goda S., Nagahora H., Harata K. (1997) Importance of van der Waals contact between Glu 35 and Trp 109 to the catalytic action of human lysozyme. Protein Sci., 6, 473-476.

137. Neri D., BiUeter M., Wider G., Wuthrich K. (1992) NMR determination of residual structure in a urea-denatured protein, the 434-repressor. Science, 257, 1559-1563.

138. Nesmelova I.V., Skirda V. D., Fedotov V. D. (2002) Generalized concentration dependence of globular protein self-diffusion coefficients in aqueous solutions.1. Biopolymers, 63, 132-140.

139. Nitta K., Tsuge H., Iwamoto H. (1993) Comparative study of the stability of the folding intermediates of the calcium-binding lysozymes. Int. J. Peptide Protein. Res., 41, 118-123.

140. Noppe W., Hanssens 1., De Cuyper M. (1995) Simple two-step procedure for the preparation of highly active pure equine milk lysozyme. J. Chromatogr., 719, 327-331.

141. Oesterheh F., Oesterheh D., Pfeiffer M., Engel A., Gaub H E., Müher D.J. (2000) Unfolding pathways of individual bacteriorhodopsins. Science, 288,143146.

142. Ohkuma S., Poole B. (1978) Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation ofpH by various agents.

143. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75, 3327-3331.

144. Ohkuma S. (1987) The lysosomal proton pump and its effect on protein breakdown (Glaumann H. Ballard F. J. Eds.) Lysosomes: Their Role in Protein Breakdown, 115-151 Academic Press, New York.

145. Onuchic J. N., Luthey-Schulten Z., Wolynes P. G. (1997) Theory of protein folding: the energy landscape perspective. Annu. Rev. Phys. Chem., 48, 545600.

146. Otting G., Wuthrich K. (1987) Pre-TOCSY, a new experiment for obtaining complete 2D AH NMR spectra ofproteins in H 2 O solution. J. Mag. Res., 75, 546-549.

147. Perutz, M. (1992) Protein structure. New approach to disease and therapy. W.H.Feeman & Company, New York.

148. Perutz M.F. (1997) Amyloid fibrils-Mutations make enzyme polymerize Nature, 385, 6619-6620.

149. Perutz, M.F. (1999) Glutamine repeats and neurodegenerative diseases: molecular aspects. Trends. Biochem. Sei., 24, 58-63.

150. Peterson FC, Gettins PG. (2001) Insight into the mechanism of serpin-proteinase inhibition from 2D 1H-15N. NMR studies of the 69 kDa alpha 1-proteinase inhibitor Pittsburgh-trypsin covalent complex. Biochemistry, 40, 6284-6292.

151. Pfeil W., Privalov P.L. (1976) Thermodynamic investigation of proteins: I. Standard functions for proteins with lysozyme as an example. Biophys. Chem., 4,23-32.

152. Pfeil W., Bychkova V.E., Ptitsyn O.B. (1986) Physical nature of the phase transition in globular proteins. Calorimetric study of human a-lactalbumin.1. FEBSLett., 198,287-291.

153. Philo J.S., Rosenfeld R., Arakawa T., Wen J., Narhi L.O. (1993) Refolding of brain-derived neurotrofic factor from guanidine hydrochloride: kinetik trapping in a collapsed form, which is incompetent for dimerization. Biochemistry, 32, 10812-10818.

154. Privalov, P.L. (1979) Stability of proteins: small globular proteins. Adv. Protein. Chem., 33, 167-241. Review.

155. Prusiner, S.B. (2001) Shattuck lecture-neurodegenerative diseases and prions. N. Engl.J. Med. 344, 1516-1526. Review.

156. Ptitsyn O.B. (1992) The molten globule state. Protein Folding. (Creighton T.E., ed.), 243-300, Freeman, New-York.

157. Ptitsyn O. B. (1995) Molten globule and protein folding Advan. Protein Chem. 47, 83-229.

158. Ptitsyn O.B., Pain R.H., Ptitsyn O.B., Semisotnov G.V., Zerovnik E., Razgulyaev O.I. (1990) Evidence for a molten globule state as a general intermediate in protein folding. FEBSLett., 262, 20-24.

159. Radford S.E. (2000") Protein folding: progress made and promises ahead. Trends Biochem Sci., 25, 611-618.

160. Radford S.E. (2000°) Protein folding: pulling back the frontiers. Curr. Biol., 21, R662-664.

161. Radford S.E., Dobson C. M., Evans P.A. (1992) The folding ofhen lysozyme is a complex process involving partially structured intermediates and multiple pathways. Nature, 358, 302-307.

162. Radford S.E., Buck M., Topping K.D., Dobson CM., Evans P.A. (1992) Hydrogen exchange in native and denatured states of hen lysozyme". Proteins: Struct., Func. and Genet., 14, 237-248.

163. Radford S.E., Dobson C M . (1995) Insights into protein folding using physical techniques: studies of lysozyme and a-lactalbumin. Phil. Trans. R. Soc. Lond. 348, 17-25.

164. Ranee M., Sorensen O. W., Bodenhausen G., Wagner G., Ernst R.R., Wiithrich

165. Redfield C, Dobson CM. (1988) Sequential 1H-NMR assignments and secondary structure of hen egg-white lysozyme in solution. Biochemistry, 21, 122-136.

166. Redfield C, Dobson CM. (1990) 1H NMR studies of human lysozyme: spectral assignment and comparison with hen lysozyme. Biochemistry, 29, 7201-7214.

167. Redfield C, Schulman B.A., Milhollen M.A., Kim P.S., Dobson CM . (1999) a-lactalbumin forms a compact molten globule in the absence of disulfide bonds. Nature Struct. Biol., 6, 948-952.

168. Reva B.A., Finkelstein A.V., Sanner M., Olson A.J., Skolnick J. (1997) Recognition of protein structure on coarse lattices with residue-residue energy functions. Protein Eng., 10, 1123-1130.

169. Robinson CV, Gross M, Eyles SJ, Ewbank JJ, Mayhew M, Hartl FU, Dobson CM, Radford SE. (1994) Conformation of GroEL-bound alpha-lactalbumin probed by mass spectrometry. Nature, 372, 646-651.

170. Roder H., Elove G.A., Englander S.W. (1988) Structural characterization of folding intermediates in cytochrome c by H-exchange labelling and proton

171. NMR. Nature, 335, 700-704.

172. Rooman M.J., Wodak SJ. (1992) Extracting information on folding from the amino acid sequence: Consensus regions with preferred conformation in homologous proteins. Biochemistry, 30, 3816-3824.

173. Sava G. (1996) Pharmacological aspects and therapeutic applications oflysozymes. (Jolles P. Ed.) Lysozymes: Model Enzymes in Biochemistry and

174. Biology, 433-448, Birkhauser Verlag, Basel, Switzerland.

175. Schulman B. A., Redfield C, Peng Z. Y., Dobson C. M., Kim P. S. (1995)

176. Different subdomains are most protected from hydrogen exchange in themolten globule and native states of human a-lactalbumin J. Mol. Biol., 253,651.657.

177. Schulman B., Peng Z., Kim P., Dobson CM., Redfield C (1995) A comparison of structure and dynamics in the native and molten globule states of human a-lactalbumin. J. Mol.BioL, 253, 651-657.

178. Schulman B.A., Kim P.S., Dobson CM ., Redfield C. (1997) A residue-specific NMR view of the non-cooperative unfolding of a molten globule. Nature Struct. BioL, 4, 630-634.

179. Shoemaker B.A., Wolynes P.G. (1999) Exploring structures in protein folding funnels with free energy functionals: the denatured ensemble. J. Mol Biol, 287, 657-674.

180. Shoemaker BA, Portman JJ, Wolynes PG. (2000) Speeding molecular recognition by using the folding funnel: the fly-casting mechanism. Proc. Natl Acad. Scl USA., 97, 8868-8873.

181. Siligardi, G. & Drake, A.F. (1995) The importance of extanded conformations and, in particular, the Рц conformation for the molecular recognition of peptides. Biopolymers, 37, 281-292.

182. Smith L. J., Redfield C., Smith R.A., Dobson CM., Clore G.M., Gronenbom A.M., Walter M.R., Naganbushan T.E., Wlodawer A. (1994) Comparison offour independently determined structures of human recombinant interleukin-4. Nature Struct. Biol, 1, 301-310.

183. Smith L. J., Fiebig K. M., Schwalbe H., Dobson C M . (1996) The concept of a random coil. Residual structure in peptides and denatured proteins. Folding Des.l, R95-R106.

184. Smittmater W. J., Roses A. D. (1996) Apolipoprotein E and Alzheimer's disease. Annu. Rev. NeuroscL, 19, 53-77.

185. Song J., Bai P., Peng Z-y. (1998) Contribution of individual residues to formation of the native-like tertiary topology in the a-lactalbumin molten globule. J. Mol Biol, 280, 167-174.

186. Stryer L. (1965) The interaction of a naphthalene dye with apomyoglobin and apohemoglobin. A fluorescent probe of non-polar binding sites. J. Mol. Biol. 13, 482-495

187. Sunde M., Blake. C. C. F. (1997) The structure of amyloid fibrils by electron microscopy and X-ray diffraction. Adv. Protein Chem., 50, 123-159.

188. Sunde M., Serpen L.C., Bartlam M., Fraser P.E., Pepys M.B., Blake C.C. (1997) Common core structure of amyloid fibrils by synchrotron X-ray diffraction. /. Mol. Biol, 113, 729-739.

189. Tsuge H., Ago H., Noma M., Nitta K., Sugai S., Miyano M. (1992) Crystallographic studies of a calcium binding lysozyme from equine milk at 2.5Aresolution. J. Biochem., Ill, 141-143.

190. Wedin R.E., Delepierre M., Dobson CM., Poulsen P.M. (1982) Mechanisms of hydrogen exchnage in proteins from nuclear magnetic resonance studies of individual tryptophan indole NH hydrogens in lysozyme. Biochemistry, 21, 1098-1103.

191. Westermark P., Sletten K., Johnson K.H. (1996) Ageing and amyloid fibrillogenesis: Lessons from apolipoprotein AI, transthyretin and islet amyloid polypeptide. The Nature and Origin of Amyloid Fibrils, Ciba Foundation Symposium, 199, 205-217.

192. Wolynes P.G., Onuchic J.N., Thimmalai D. (1995) Navigating the folding routes. Science, 267, 1619-1620.

193. Woodward C. (1993) Is the slow-exchange core the protein folding core? TrendsBiochem. ScL, 18, 359-360.

194. Wright P.E., Dyson HJ., Lemer R.A. (1988) Conformation of peptide fragments of proteins in aqueous solution: implications for initiation of protein folding. Biochemistry, 11, 7167-7175.

195. Wiithrich K. (1986) NMR of proteins and nucleic acids, John Wiley Sons, Inc., New York.

196. Выражаю искреннюю благодарность Кристоферу Добсону за его постоянное внимание, поддержку и интерес к работе и за стимулирующие и плодотворные обсуждения.

197. Выражаю свою признательность М.Н. Грудень, В.Е. Бычковой, С. Удальцову, В. Замотину и Е. Ржепишевской за благожелательность и помощь в организационных вопросах.

198. Выражаю признательность многим сотрудникам Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН за благожелательность и интерес к работе.

199. Пользуяь такой возможностью, выражаю огромную благодарность моему отцу A.n. Морозову, который поддерживал меня во всех моих начинаниях и вдохновил написать эту работу.