Анализ транспортной функции вирусов растений с тройным блоком генов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, доктор биологических наук в форме науч. докл. Соловьев, Андрей Геннадьевич

• Соловьев, Андрей Геннадьевич
• доктор биологических наук в форме науч. докл.
• 2002

Оглавление диссертации доктор биологических наук в форме науч. докл. Соловьев, Андрей Геннадьевич

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ ВИРУСНЫХ ГЕНОМОВ

Клонирование и анализ первичной структуры генома ВМПА

Вирус мозаики подорожника азиатского (ВМПА; Plantago asiatica mosaic virus, PIAMV) на основании размеров геномной РНК и данных о структуре вирионов был предварительно классифицирован как новый представитель группы потексвирусов (Минская и др., 1979). Используя в качестве матрицы для обратной транскрипции геномную РНК ВМПА, выделенную из препарата вируса, была синтезирована кДНК, которую клонировали в плазмидных векторах. Затем с помощью перекрестной гибридизации и частичного определения первичной структуры был выявлен набор рекомбинантных клонов, ВМПА-специфические вставки в которых содержали практически всю последовательность вирусной РНК за исключением прилежащего к 5'-концу небольшого участка генома, который был направленно клонирован с использованием специфического олигонуклеотида. Определение первичной структуры этого набора клонированных фрагментов генома позволило определить полную нукпеотидную последовательность геномной РНК ВМПА, которая составила, не считая З'-концевой poly(A), 6128 нуклеотидных остатков.

Анализ последовательности генома ВМПА выявил наличие пяти открытых рамок трансляции (ОРТ). Их расположение, размеры и последовательности кодируемых белков типичны для геномов вирусов рода Potexvirus (Рис. 1 А).

5'-проксимальная ОРТ в геноме ВМПА способна кодировать 156-кДа белок, несущий в своей последовательности три домена, типичных для репликативных белков Синдбис-подобных вирусов (Koonin and Dolja, 1993), а именно метилтрансферазный, нуклеотид-связывающий/хеликазный и домен, характерный для РНК-полимераз (Рис. 1А) (Morozov et al., 1997). Сравнение аминокислотных последовательностей 156К-белка с последовательностями соответствующих доменов большого количества Синдбис-подобных вирусов растений выявило, что последовательности ВМПА имеют наибольшее сходство с таковыми потексвирусов

Х-вируса картофеля (ХВК, типовой представитель рода) (50% идентичных остатков для метилтрансферазного, 51% для нуклеотид-связывающего/хеликазного и 65% для полимеразного домена) и вируса мозаики папайи (55% идентичных остатков для метилтрансферазного, 65% для нуклеотид-связывающего/хеликазного и 63% для полимеразного домена). Таким образом, данные анализа генома ВМПА позволили доказать принадлежность ВМПА к группе потексвирусов. Сходные филогенетичесие дендрограммы, полученные для трех доменов 156К-белка ВМПА (данные не показаны), позволяют сделать вывод о том, что эволюция репликативных белков потексвирусов происходила без межвирусной рекомбинации или «перетасовки» функциональных доменов, что, как предполагается может являться одной из составляющих эволюции РНК-геномов (Могогоу е1 а!., 1989).

В З'-концевой области генома ВМПА расположен ген белка оболочки вируса (Рис. 1А). Такой вывод был сделан на основании сходства аминокислотного состава кодируемого этим геном белка и аминокислотного состава белка оболочки ВМПА, ранее определенного экспериментально (Минская и др., 1979), а также на основании высокой степени сходства аминокислотной последовательности этого белка ВМПА и белков оболочки других потексвирусов.

PHKß | . ' .'Г

Рис. 1. Схематическое изображение организации геномов ВМПА (А) и гордеивирусов ВШМЯ, ПЛВМ и ВКПЛ (В). Прямоугольниками обозначены открытые рамки трансляции, мол. масса кодируемых продуктов указана в килодальтонах. БО, белок оболочки. МТ, HEL и POL, консервативные домены репликативных белков: метилтрансферазный, хеликазный и домен РНК-зависимых РНК-полимераз, соответственно.

Между генами вирусного репликативного белка и белка оболочки расположены три перекрывающиеся гена, способные кодировать белки с мол. массой 25 кДа (ОРТ2), 12 «Да (ОРТЗ) и 13 кДа (ОРТ4) (Рис. 1А). ОРТЗ перекрывается с ОРТ2 на участке длиной 35 нукпеотидных остатков и с ОРТ4 на участке в 194 нуклеотидных остатка. Такое расположение генов и свойства кодируемых ими белков (анализ которых представлен ниже) характерны для белков ТБП

Клонирование и анализ первичной структуры геномов гордеивирусов

Род Hordeivirus включает четыре вируса, из которых только один, вирус штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ, типовой представитель группы), был охарактеризован с точки зрения организаций генома и свойств кодируемых им белковых продуктов (Jackson et al., 1989; 1991). Геном ВШМЯ представлен тремя РНК положительной полярности, называемыми РНКа, РНКр и РНКу, которые несут "кэп" на 5'-конце и тРНК-подобную структуру на З'-конце (Agranovsky et al., 1979, 1981,1982; Kozlovetal., 1984).

Геномы двух гордеивирусов, полулатентного вируса мятлика (ПЛВМ; роа semilatent virus, PSLV) и вируса кольцевой пятнистости лихниса (ВКПЛ; lychnis ringspot virus, LRSV), также состоящие из трех РНК, были клонированы в виде фрагментов кДНК, которые, перекрываясь, включали последовательность всего вирусного генома за исключением коротких районов, прилежащих к 5'-концам геномных РНК. Последовательность этих участков была определена прямым секвенированием РНК. Длины геномных РНК двух гордеивирусов составили: для ПЛВМ - 3870 н. (РНКа), 3605 н. (РНКр) и 3167 н. (РНКу); для ВКПЛ - 3723 (РНКа), 3084 (РНК(3) и 2634 (РНКу).

Сравнение последовательностей ПЛВМ, ВКПЛ и ВШМЯ показало, что геномы гордеивирусов организованы сходным образом (Рис. 1В). РНКа кодирует один полипептид, называемый белком аа и имеющий мол. массу 131 кДа (ПЛВМ), 129 кДа (ВКПЛ) или 130 кДа (ВШМЯ). Белки аа содержат два домена, высококонсервативных в репликативных белках Синдбис-подобных вирусов (Gustafson et al., 1989; Rozanov et al., 1992; Koonin and Dolja, 1993), а именно N-концевой метилтрансферазный домен и С-концевой хеликазный домен (Рис. 1А). Попарное сравнение последовательностей показало, что оба этих домена имеют наибольшее сходство с таковыми вируса мозаики пшеницы, передающегося через почву (SBWMV, род Furovirus), и вируса скрученноси арахиса (PCV, род Pecluvirus) (Табл. 1). Сходство белков аа гордеивирусов выявляется и за пределами этих двух доменов, за исключением разделяющего их района длиной от 77 до 80 остатков. Этот район варьирует по длине и последовательности у различных Синдбис-подобных вирусов и является, по-видимому, подвижным шарниром, обеспечивающим физическое и функциональное взаимодействие между метилтрансферазным и хеликазным доменами аа-подобных репликативных белков фитовирусов (Rozanov et al., 1990;

Таблица

Сходство последовательностей консервативных доменов репликативных белков гордеивирусов.

PSLV LRSV PCV SBWMV TRV TMV CMV BMV AIMV RBDV BYV

BSMV 73 66 41 39 32 30 19 26 27 27 21 МЕТ

70 63 43 42 39 29 24 28 26 23 22 HEL

86 81 66 67 54 33 25 26 25 25 30 POL

PSLV 64 41 35 32 29 19 24 25 27 19 МЕТ

62 41 44 38 26 25 26 27 24 22 HEL

76 65 64 53 33 27 27 26 25 31 POL

LRSV 41 34 31 26 19 23 27 27 17 МЕТ

41 44 40 27 26 26 24 24 23 HEL

66 63 52 33 25 27 25 26 31 POL

Указан процент идентичных аминокислотных остатков в выравниваниях последовательностей, построенных для метилтрансферазного (МЕТ), хеликазного (HEL) и полимеразного (POL) доменов репликативных белков вирусов, принадлежащих к эволюционной ветви тобамовирусов по классификации Koonin and Dolja, 1993.

Koonin and Dolja, 1993).

В С-концевой области белка уа гордеивирусов расположен консервативный домен РНК-зависимых РНК-полимераз, включающий мотив GDD (Afanasiev et al., 1986; Gustafson et al., 1987; Agranovsky et al., 1992). Этот универсальный мотив был обнаружен в консервативных районах полимераз (+)РНК-содержащих вирусов и, позднее, - в репликативных белках вирусов, содержащих двуцепочечную РНК и (-)РНК (Ishihama and Barbier, 1994). Сравнение этого домена гордеивирусов и других вирусов растений показывает, что последовательности гордеивирусов проявляют наибольшее сходство с таковыми SBWMV, PCV и вируса погремковости табака (TRV, род Tobravlrus). В целом, данный домен близок к гомологичным районам репликативных белков вирусов, принадлежащих к эволюционной ветви тобамовирусов (Koonin and Dolja, 1993) (Табл. 1). Филогенетические дендрограммы, построенные на основе множественных выравниваний последовательностей метилтрансферазного и хеликазного доменов гордеивирусов и других вирусов, принадлежащих к эволюционной ветви тобамовирусов, имели сходную топологию как между собой, так и с аналогичным образом построенной дендрограммой для домена РНК-зависимых РНК-полимераз, что указывает на то, что эволюция репликативных белков данных вирусов происходила без существенных перетасовок генов или обмена генами. Это наблюдение позволило нам построить обобщенную филогенетическую дендрограмму репликативных белков, которая предположительно отражает эволюционные взаимоотношения вирусов ветви тобамовирусов (Рис. 2).

Цистеин-богатый белок yb ВШМЯ является РНК-связывающим и участвует регуляции экспрессии генов вируса (Donald and Jackson, 1994; 1996). Сходные функции описаны также для 14-кДа цистеин-богатого белка вируса некротического

Анализ последовательностей белков ТБГ2 и ТБГЭ

Ранее было обнаружено, что белки ТБГ2 и ТБГЗ содержат протяженные гидрофобные сегменты, потенциально способные ассоциировать с мембранами (Morozov et al,, 1987; 1989). Это предсказание было подтверждено экспериментальными данными, показывающими, что белки ТБГ2 и ТБГЗ потеке- и карлавирусов способны взаимодействовать с мембранами in vitro (Morozov et al., 1990, 1991), и, кроме того, что белок ТБГ2 ВШМЯ и BNYW обнаруживается во фракциях клеточной стенки и мембран зараженных тканей растений (Donald et al., 1993; Richards and Tamada, 1992).

Анализ последовательностей белков ТБГ2 показывает высокую степень их сходства (Рис. 5). Белки ТБГ2 всех известных ТБГ-содержащих вирусов имеют N-концевой гидрофобный сегмент, центральный участок последовательности, проявляющий весьма высокую степень сходства даже у вирусов отдаленных групп, С-концевой гидрофобный сегмент и следующую за ним короткую область, обогащенную остатками цистеина (Рис. 5).

В отличие от белков ТБГ2, сходным образом организованных у всех вирусов, белки ТБГЗ могут иметь различную организацию. У вирусов, относящихся к группам гордеи-, помо- и пеклувирусов, белки ТБГЗ в значительной степени сходны между собой и представляют группу I. Эти белки, молекулярная масса которых варьирует от 18 до 24 кДа, имеют два гидрофобных сегмента последовательности, между которыми располагается высококонсервативная область, и характерный консенсус НХХХСХСХХС на N-конце (Рис. 5). Группу II белков ТБГЗ составляют белки потеке-, карла- и аллексвирусов, которые существенно меньше белков группы I (мол. масса 6 - 13 кДа) и имеют только один гидрофобный сегмент, расположенный в N-концевой области белка, и консервативный участок в центральной области белка (Рис. 5). Важно отметить, что гидрофильные районы, консервативные в белках ТБГЗ этих двух групп, не имеют сходства между собой. Белки ТБГЗ вируса мозаики Nicotiana velutina и вируса некротического пожелтения жилок свеклы, подобно белкам группы I, содержат два гидрофобных сегмента, но аминокислотные последовательности этих белков не имеют сходства как друг с другом, так и с белками группы I. Таким образом, в отличие от белков ТБГ2, которые образуют монофилетическое семейство, белки ТБГЗ, по-видимому, имеют разное происхождение.

Ориентация молекул интегральных белков в мембране зависит от суммарного заряда N-концевой части белка, предшествующей гидрофобному сегменту. Согласно современной точке зрения, положительно и отрицательно заряженные N-концевые части белков имеют различную ориентацию в мембране: положительно заряженные сегменты экспонированы в цитоплазму, а отрицательно заряженные - в экстрацеллюлярное пространство (Von Heijne, 1988). Основываясь на этом, мы предполагаем, что молекулы ТБГ2 могут быть» интегрированы в мембране в V-образной конфигурации, причем N- и С-концевые сегменты при этом обращены в

Группа I ТБГ

РБЬУ МРАКТТЗУ(аКШКУМР1УАО1СУУОЬРА?Ы]^0КНВТВВ -бНИ-КРКЩЗЙЙЯН^^ЖНЮгаР

ВЭМУ MKTTVGSRPЫKYWPIVAGIGWGLF^YLIgSNOKHSTES-^iM-K^'M^Ш^HR^ШsISШSIШP

ШвУ МРТ0УА0ЕРМКУИР1УУОУ8ЬХОЬРДУЬ1РТМОКНат08-™ш-кгАЫ^8Я0ШЮ11фДКЩ|М рмту мташЕ тадкршстерууААУУАгсьрерьтумокнАтов-ШяШ,-краяжшш^щй иф/сжр

РСУ МУКвТ-УРТНРНКУУУРбУУАХОЬУЗЬРГРЬЗУбЫОКНЗТТЗ

Группа II ТБГ

Р1АМУ М80АННЬТРРТРУВКРУЬАА5ХС1аЬАЬЬУУТАТК5ТЬРНУ

§

РУХ МВА0ОНЯЪТАРУИЗЕКУУ1У1,СЬЗРА1,У31ТРЬЬЗ№ЗЬРНУ

ШУ МРСЬТРРУИУЕОУУКУЬАХОРЬЬСАЗ IУСЬИЗШЬРНУ-В

РУМ МРЬТРРРРГТКУУЬ8ААЦЭТГ8ЬАЬУУИ1&1К8Т1.РУУ-И

ЭЬУХ М8РАРРРРУЗК1У1^ШЗС6Х,С1ДРУУУАЗНУШЬРНУ~а Прочие

ВИУУУ MSREITARP^П<HVPIWGVCWAFFVLIДШQQKHKTHSGg^GVPTFS^^I^2Ш^qR™NSNKH

ИУМУ МАТОдСКРЬТОКбРКТИЬУ1А6УВУЬ61.УУ1,УОУ1ДТЗ РМКТАЗС^УМУРТРАЫЩГд1^^^1У

§13МТО Группа I ТБГ

РЗХЛГ РАУ0МАЗЗРВМЬЬРТЬРТ1161У5УЬИАтаСЕ1М0ОМЗРЬЬО1Ш'ШЁЕЁАВЕ.еУНОЬРНеБЬРШЗУ

ВЭМУ РАтоидвзРамы.РАмьтиаивуьугеткрбУххзрао- -онив^ифоовеиганвкйвьъетяо ьягу ьАУбУкоь8ЫА35УРьимьсьс1АА1Аао1УбЕУь-----нтещатЁсттврраавайовик

РМТУ НАУМСМЗЗШГРЗОЬРЬРУЫ.ГСААЫГАШге1- - -.ТКРРОЗУГСКеВССЕЗУСС

РСУ ЬАУМЗЗЗЗЫЩЪРИЬСЬЬСЪВМУИХАУУКЗЬБО-------ОШЗС(5НРЮ(ЕШРЬРЕЕРЕ

Группа II ТБГ

Р1АМУ 8кгаррррр&ры111.'п1501»ш1ьвнваа-----------данзерзсвтрНА

РУХ оааУВМШКЮДОААТОЫ.ТЦДУОЗКтаа.-ЮПИЙАССЗЫЫНаЗН

ШУ ЗТЗТМНКУТАЬСАУЬТЬЗЬЬIРАОТИХЛАСУШТЭУБ- - -1ешЙ88Сб8ЬЗСЮ!ПЮКУ8вНВВ1.РТТ

РУМ ЬМЗХЕАНКАРЬЬСОРИАХУУЬЬУЬХЛИАБНКЬ--------йгРИЙКАСАОеНТ

ЭЬУХ ОВ8РТШЬИРР1ТУХАЬТ1А1ЬЬТ8СР-------------ЮЖУетсЭОНН

Прочие

ВЫУУУ НАУскхюзаозуззкуоооыуццуауьхуэц.- - -оныщррЕнгакзАСхз

ШШУ МАТОИРРИАИгеКЗ ВЬУРУУУ! IЫIБ VI ЬШет----ЗОЕУНЖКХЗбШУЗНТС

ЗХЗдаЗРБА .ИЮГвРШ. ^УЩРЕРНЭ

УЙЙ*зр<Ж уьу.чвгкз

Группа I ТБГ

МЕАРАИЕЕБ!

В5Р1ЙЗОЗЗЕ8РР1У5РРЕЕКЪМЕБТРР85АТХУЕШАРЕМУРУАВ1РКИУЬЫЪС51ДЬЬЗ

ВРСЙЬРЗЗЕЗРРХУйЕаЕХРСЗЕТОАЕТТРУЕКТУЯАЩ/ЬТР-----ХЬПРНУУЫЬАЗЬР

ВзШУЬРРЬаЯЕРТЕЗХУАЫЕМШЗАРРАРОТАКЗУУСОРР------ЬРЬММУВРЬАеУЬЬ

1зЩОИ5еЗРТУРТКУУХ.ОЗСГНАЫТТКТКЕТЗРЬЗУЬМСН-.- -АИЬРУ! А мррруи|зр1ЩзЁо

§ззЕЬРЗтнтсездротурьнУЕАТААенмЕУга1РЗЬО--------УУЬЬУАРУЗУЪЬ

Р5ЬУ У51АУ1УРТЗСНШРУУК<

ВБМУ 11АЬИЬЬУ1УЬ331РТЕТСР^

ЬЙЗУ ТЬЬУХИЗУССТТСЗИРОКАЗ!

РСУ АЬ1ЬСЬ УР11ЗКРНУРАУУТЕ

РМТУ ОРбРСтеЪКБМБЖЕАВиТ

ЗУЕУЛ-РСЙ ¡УК1--У6ХСЖ ¡К1ЕМЕУАР08в1!

РЗМК1АРСУ11: ¡ЗУЕХ-къбкнр:'

ЗвЬИВСЦЖ-ХЛ'БЗХЛГЗ ¡Вв^ИСВ----ЫЭУЬЗI тшьоимруттьутуи

ВрЫИ-----МУТ31У

I Ав X ИКЕАЕ РРУОИРЕ в

- АЬКРУУвЬЬРЬЬЬЫ 11РК

- ыжриютльз РРЬЬЬЭ э иг

РвЬУ

ВБМУ

ХЖЗУ -------------------------------Еткьгшшррртууиад

РСУ ---------------.-------------ОЬНН5РС1ЬЬЬУУУЬЬУУУСНКР

РМТУ ВАУУЬЗО8НШЯН0УА8ТРСЕ1МУЬЬКЬУ1КРРЪЗРТ11АУТУЪУСУИ11АКС

Группа II ТБГ

Р1АМУ 40 ЭРРЭРУУ Р1АААУ1ЬТААЬАААЬЬТРМР! РУХ 3 УШТГША! 1ЬУЬУУТХ XАУ1 этзьтатЕ:

ШУ 34 рьвБНкшьшиАцлгеьуухтаАис

РУМ 1 М1\ПГУ1ЛгеьЗАРС1 УЬУЫ 30605: ЭЬУХ 65 8РУД|УР8ЬУА1ДАУГАУАУШ1ШдгТ0айЫ'

Врхроьуьаанрноьзьеоуькртм аКЬРАЕТ1ЙА1АСЬКР1,ЗУЕ1?Ь8РН ороинакшьвриюбукрры, .хшЕгазУьвкхжргасозркз 5РЬЕ-Нхрзу1кзрризкнеыснрьрн

Рис. 5. Выравнивание аминокислотных последовательностей белков ТБГ2 м ТБГЗ. Выделены консервативные остатки. Гидрофобные участки подчеркнуты. Перед последовательностями ТБГЗ группы II указан номер первого приведенного остатка.

Таблица

Способность ВТМ, ВШМЯ, ЯСЫМУ и рекомбинантов Вв-ТМУ и Вв-ЯС заражать различные виды растений-хозяев

Вв-ТМУ

Инокулум Растение-хозяин

Ячмень N. 1аЬасит N. Ьвп№аттпа

ВТМ - + +

ВШМЯ + - +

В8-ТМУ - - +

ВЭ-ИС

Инокулум Растение-хозяин

Ячмень N. с1еуе1апбп N. ЬепШаш/ала

РЮШУ - + +

ВШМЯ + - +

ВЭ-ЯС ± - + наблюдался только в растениях-хозяевах, общих для двух вирусов, использованных для конструирования данного рекомбинантного генома. Так, рекомбинант ВБ-ТМУ был способен заражать N. 6ел№ат/ала, растение-хозяин и для ВШМЯ, и для ВТМ, но был неинфекционен для ячменя (растение-хозяин для ВШМЯ) и для N. (аЬасит (растение-хозяин для ВТМ) (Табл. 2). Аналогичным образом, ВЗ-ИС заражал N. Ьёп№ат1апа, растение-хозяин и для ВШМЯ, и для ВНМКК, но не заражал N. с№е!апс1Н, растение хозяин для ВНМКК. В ячмене (растении-хозяине для ВШМЯ) детектировались очень низкие количества белка оболочки и РНК рекомбинанта Вв-(Табл. 2).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что функциональная совместимость транспортного белка с геномом неродственного вируса ограничена определенными растениями-хозяевам. Это указывает на то, что факторы хозяина вовлечены в экспрессию вирусных детерминант транспортной функции. Кроме того, транспортные белки, функциональные в определенных растениях-хозяевах, не способны обеспечивать эффективный межклеточный транспорт чужеродных геномов, не адаптированных к этим хозяевам.

АНАЛИЗ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ СОВМЕСТИМОСТИ БЕЛКОВ ТБГ Комплементационный анализ ТБГ гордеивирусов

С целью исследования функциональной совместимости генов тройного блока между собой и с другими вирусными белками на основе генома ВШМЯ были сконструированы гибридные геномы, в которых область ТБГ была замещена на гомологичную область геномов двух других гордеивирусов. Рекомбинант, несущий ТБГ ПЛВМ (Р684, Рис. 8) был функционален в протестированных растениях-хозяевах, что указывает на то, что белки ТБГ ПЛВМ полностью совместимы с pslv US! LRSV I II

N.benthamiana p

P684 P

Рис 8. Инфекционность рекомбинантных гордеивирусов для различных растений-хозяев. Инфекционность ВШМЯ, BJ1BM и ВКПЛ показана в верхней части таблицы. В остальных случаях инокулум содержал полученные in vitro транскрипты РНКа и РНКу, а также указанного рекомбинанта РНКр. (+) и (-) обозначают наличие или отсутствие накопления вируса по данным иммуноблота. Изображение РНКр представлено не в масшатабе. * */ fftff***J tfttt • * f « « • I f I/TP

Рис. 9. Анализ АТФазной активности экспрессированных в Е. coli белков ТБГ1. Тонкослойная хроматография продуктов АТФазной реакции; справа показано положение АТФ и неорганического фосфата. PSLV 63К, BSMV 58К и PVX 25К, белки ТБГ1 ПЛВМ, ВШМЯ и ХВК, соответственно. РР1, UA19, PS3 и PS7, гибридные белки ТБГ1. DHFR, дигидрофолатредуктаза мыши. Е. co|i proteins, белки, выделенные из индуцированной культуры, не несущей вектора экспрессии. концевого домена ТБГ1 и белков ТБГ2/ТБГЗ сохранял инфекционность в С. amäranticolor, тогда как ММ4, в котором эти районы были гетерологичными, был неинфекционным, что можно считать указанием на существование зависимых от хозяина взаимодействий N-концевого домена ТБГ1 и белков ТБГ2/ТБГЗ.

В целом, анализ рекомбинантных гордеивирусных геномов показывает, что ТБГ ПЛВМ как целое полностью совместим с другими компонентами генома ВШМЯ, тогда как ни один их протестированных гибридных ТБГ не функционален полностью. Вероятно, это отражает сложные взаимодействия, необходимые для вирусного транспорта, определяемого ТБГ. Приведенные эксперименты позволяют сделать следующие общие выводы: (1) для межклеточного транспорта необходимо взаимодействие белков ТБГ; (2) взаимодействие белков ТБГ зависит от растения-хозяина; (3) N-концевой домен ТБГ1 участвует в системном транспорте вирусной инфекции.

Комплементационный анализ белков ТБГ1 потексвирусов

Данные рентгеноструктурного анализа РсгА, бактериальной ДНК-хеликазы суперсемейства I (Subramanya etal., 1996), и сравнение последовательностей РсгА и хеликазных доменов белков ТБГ1 (Рис. 4) позволяют предположить, что эти вирусные хеликазы имеют два структурных субдомена, соответсвующих субдоменам 1а и 2а, являющихся консервативными элементами структуры известных хеликаз (Caruthers and McKay, 2002). Ранее было показано, что делеция С-концевого района белка ТБГ1 ХВК, включаещего почти полностью структурный субдомен 2а, делает его нефункциональным (Morozov et al., 1997). Можно с большой долей уверенности предположить, что удаление этой части белка, включающей консервативные мотивы V и VI хеликазного домена, нарушает возможную хеликазную активность, поскольку этот район вовлечен в структурные взаимодействия с мотивом II, и, вероятно, во взаимодействие с АТФ (Caruthers and McKay, 2002). С другой стороны, поскольку известно, что в белках ТБГ1 потексвирусов участок связывания РНК находится в N-концевой области перед мотивом I (Liou et а)., 2000), можно предположить, что делеция С-концевого района белка ТБГ1 ХВК не оказывает влияния на РНК-связывание. Чтобы выяснить, выполняет ли структурный субдомен 2а белков ТБГ1 только функции, общие для всех хеликаз, или несет также другие функции, специфические для межклеточного транспорта, был применен комплементационный анализ.

В этих экспериментах использовалась полная инфекционная копия генома ХВК, клонированная под контролем 35S промотера вируса мозаики цветной капусты и несущая маркерный ген p-глукоронидазы (GUS) (pPVX-GUS; Рис. 10; Morozov et al., 1997), и мутант pPVX-GUS-Bsp со сдвигом рамки трансляции гена ТБГ1, в результате которого белок ТБГ1 был укорочен на 72 аминокислотных остатка (Рис. 10; Morozov et al., 1997). Для введения векторов в клетки эпидермиса листьев N. benthamiana использовался метод бамбардировки микрочастицами металла, несущими плазмидную ДНК (Darnell, 1993). При гистохимичесткй детекции GUS через 48 часов после бомбардировки в случае pPVX-GUS районы распространения инфекции выявляются в виде окрашенных синих локусов диаметром до 2 мм, тогда как в случае pPVX-GUS-Bsp фокусы инфекции едва видны невооруженным глазом и состоят либо из отдельных клеток, либо из маленьких групп клеток (Рис. 11 А; Morozov et al., 1997). Дефект PVX-GUS-Bsp по функции транспорта может быть комплементирован при временной ко-экспрессии нативного белка ТБГ1 ХВК. При бомбардировке листьев микрочастичами, несущими смесь pPVX-GUS-Bsp и pRT-PVX.25K, вектора, эксрпессирующего белок ТБГ1 ХВК, гистохимическая детекция GUS, проведенная через 48 часов, обнаруживает локусы инфекции диаметром до 1 мм (Рис. 11 В; Morozov et al., 1997) pPVX-GUS

35S I

3t>5 l pPVX-GUS-Bsp

TGBp2 TGBpl 11 GUS

CP ter

Рис, 10. Схема клонов на основе полной инфекционной кДНК-копии генома ХВК. pPVX-GUS, последовательность вирусного генома расположена между 35S промотером и терминатором транскрипции (ter). Ген GUS клонирован под контролем дуплицированной копии промотера субгеномной РНК гена белка оболочки (СР). pPVX-GUS-Bsp, мутантный вариант pPVX-GUS, несущий мутацию сдвига рамки считывания в гене ТБГ1.

Для проверки возможности комплементации межклеточного транспорта мутанта PVX-GUS-Bsp белками ТБГ1 других вирусов, листья N. berithamiana были подвергнуты ко-бомбардировке плазмидами pPVX-GUS-Bsp и pRT-PIAMV.25K, вектором экспрессии, несущий ген ТБГ1 ВМПА. Гистохимическая детекция GUS показала (Рис. 11D), что белок ТБГ1 ВМПА, в отличие от гомологичного белка ХВК, не восстанавливал способность PVX-GUS-Bsp к межклеточному транспорту несмотря на то, что эти белки являются близкородственными (Рис. 4). Эти данные подтверждают предположение о том, что для межклеточного транспорта необходимы специфические взаимодействия белка ТБГ1 с другими вирусными белками. Для выяснения роли С-концевого структурного субдомена в этих взаимодействиях был сконструирован вектор pRT-P!AP.25K, несущий химерный ген ТБГ1, в котором N-концевая часть, включающая мотивы I - IV соответствовала белку ВМПА, а С-концевой район был ХВК-специфическим. Гистохимическая детекция GUS через 48 часов после ко-бомбардировки листьев N. benthamiana плазмидами pPVX-GUS-Bsp и pRT-PIAP.25K (Рис. 11С) показала, что замена С-концевого района белка ТБГ1 ВМПА длиной 77 аминокислотных остатка на гомологичный район белка ТБГ1 ХВК делала белок ВМПА функционально совместимым с другими компонентами генома ХВК. Эти данные представляют собой прямое указание на то, что именно С-концевой структурный субдомен 2а белков ТБГ1 потексвирусов участвует во взаимодействиях, необходимых для межклеточного транспорта. Анализ серии рекомбинантных гордеивирусных геномов показал, что белок ТБГ1 должен функционально взаимодействовать с белками ТБГ2 и ТБГЗ. Результаты комплементационного анализа белков ТБГ1 потексвирусов дают возможность предположить, что в такого рода взаимодействиях может принимать участие именно С-концевой район ТБГ1.

Рис. 11. Комплементационный анализ белков ТБГ1 потексвирусов. Показана комплементация межклеточного транспорта PVX-GUS-Bsp в присутствии различных ТБГ1. После гистохимической детекции активности GUS листья фотографировали при равном увеличении. Показываны области листьев размером 12 х 8.8 мм. Для бомбардировки листьев использовали следующие конструкции: А, pPVX-GUS-Bsp; В, pPVX-GUS-Bsp + pRT-PVX.25K; С, pPVX-GUS-Bsp + pRT-PIAP.25K; D, pPVX-GUS-Bsp + pRT-PIAMV.25K

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ВЕЛКА ТБГ1 РНК-связываюшая активность белка ТБГ1 in vitro

Вирусы растений различных групп могут кодировать различное число транспортных белков, и свойства этих белков также могут быть различны, но во всех известных случаях один из вирус-специфических полипептидов, участвующих в межклеточном транспорте, обладает РНК-связывающей активностью (Carrington et al., 1996; Lazarowitz and Beachy, 1999; Tzfira et al., 2000). Эта активность, как полагают, необходима для формирования специфических РНП, представляющих собой транспортную форму вирусного генома (Atabekov and Dorokhov, 1984; Dorokhov et al., 1984; Brakke et al., 1988; Citovsky and Zambryski, 1991; Carrington et al., 1996). Функции белков, формирующих транспортные РНП, могут заключаться в (1) отборе суб-популяции геномных РНК, предназначенных для транспорта в соседние клетки; (2) внутриклеточном транспорте РНП к плазмодесмам; и (3) образовании РНК-содержащих структур, обладающих способностью транспортироваться через микроканалы плазмодесм (Citovsky and Zambryski, 1991; Citovsky and Zambryski, 1993; Lazarowitz and Beachy, 1999; Lucas, 1999; Tzfira et al., 2000).

У гордеивирусов РНП формирует белок ТБГ1 (Brakke et al., 1988; Donald et al., 1997), тогда как y потексвирусов транспортная форма генома либо включает ТБГ1 и БО (Lough et al., 1998), либо представлена вирионами, которые, возможно, модифицированы белком ТБГ1 (Santa Cruz et ai., 1998; Atabekov et al., 2000). Таким образом, роль ТБГ1 в транспорте потеке- и гордеивирусов, или, в общем случае, вирусов, несущих ТБГ групп I и Ii, может быть различна. Это различие связано со способностью белка ТБГ1 формировать комплексы с РНК и, как можно предположить, связано с различием в структуре белка ТБГ.

Чтобы сравнить РНК-связывающие активности белков ТБГ1, принадлежащих к ТБГ групп I и II, экспрессированные в Е. coli белки ТБГ1 ПЛВМ и ХВК анализировали методом сдвига в геле. В предварительных экспериментах, когда в качестве пробы использовали немеченую РНК различной специфичности, были получены сходные результаты, что соответствовало имевшимся данным о том, что взаимодействие fBSSIt

Ш- - ^и?

PVX 25-kDa TGBpl PSLV 63-kDa TGBpl

Рис. 12. Анализ РНК-связывающей способности белков ТБГ1 ХВК (слева) и ПЛВМ (справа) методом сдвига в геле. Электрофорез проводили в агарозном геле, содержащем бромистый этидий. Указано молярное соотношение белок:РНК. RNA, РНК без добавления белка.

ПОВЕДЕНИЕ И ФУНКЦИИ БЕЛКОВ ТБГ2 И ТБГЗ IN VIVO Внутриклеточная локализация белков ТБГ2 и ТБГЗ

Для изучения внутриклеточной локализации белков ТБГ2 и ТБГЗ ПЛВМ мы применили в качестве молекулярного маркера зеленый флуоресцирующий белок (green fluorescent protein, GFP) Aequorea victoria. Для работы был выбран мутант GFP-S65T, несущий замену остатка Ser на остаток Thr в положении 65 полипептидной цепи, которая приводит к смещению максимума возбуждения флуоресценции белка до 489 нм и существенному увеличению яркости его свечения (Heim et al., 1995).

Для экспрессии в клетках растений был получен набор рекомбинантных плазмид, несущих гены белков ТБГ2 и ТБГЗ ПЛВМ под контролем 35S промотера вируса мозаики цветной капусты. Векторы экспрессии pRT-15K и pRT-18K несли гены 15-кДа белка ТБГ2 и 18-кДа белка ТБГЗ, соответственно (Рис. 16). В плазмидах pRT-GFP-15K и pRT-GFP-18K были клонированы гены этих белков, слитые с геном GFP (Рис. 16). Контрольная конструкция pRT-GFP содержала клонированный аналогичным образом ген GFP-S65T. Белки временно экспрессировапи в клетках листьев N. benthamiana с помощью бомбардировки микрочастицами, несущими соответствующие плазмидные векторы.

Флуоресцентная микроскопия листьев, подвергнутых бомбардировке вектором экспрессии pRT-GFP-15K показала, что белок ТБГ2 ПЛВМ слитый с геном GFP (GFP-15К), ассоциирован с клеточными мембранными структурами. Флуоресценция GFP наблюдалась в полигональной сети кортикального эндоплазматического ретикулума (ЭР), в оболочке ядра и многочисленных мелких тельцах (Рис. 17В). Ко-локализация

PRT-GFP-18K

PRT-15K

PRT-18K

PRT-GFP-15K I 35S pRT-DsRed-18К| 35S DsRed I

Рис. 16. Рекомбинантные плаэмиды, использованные для временной экспрессии белков ТБГ2 и ТБГЗ ПЛВМ. 35S, промотер вируса мозаики цветной капусты, ter, участок терминации транскрипции. GFP и DsRed, гены зеленого и красного флуоресцирующих белков, соответственно.

Рис. 17. Субклеточная локализация белка ТБГ2 ПЛВМ спитого с вРР в эпидермальных клетках N. ЬепШат1апа. А. Локазизация вРР. В. Локализация белка ТБП2 в структурах эндомембранной системы клетки. С и О, локализация белка ТБГ2 в подвижных флуоресцентных везикулах, ассоциированных с элементами эндоплазматического ретикулума. Е - 6, ко-локализация флуоресценции СРР-ТБГ2 с мембранными структурами в периферических районах клетки. Е, локализация ТБГ2 (зеленый канал). Р, окрашивание мембран гексиловым эфиром родамина В (красный канал). 6, наложение изображений в Е и Р. Масштабная линия соответствует 50 мкм (А, В и С) и 10 мкм (Ъ и Е).

6РР-15К с мембранными структурами в периферических районах клетки была прямо показана с помощью обработки клеток, экспрессирующих этот белок, гексиловым эфиром родамина В (Рис. 17Е-в), который специфически окрашивает клеточные мембраны (СгаЬэк) е1 а1., 1993; ЯуаЬоу е1 а1., 1998). Чтобы сравнить локализацию вРР-15К с локализацией" какого-либо белка, для которого известна локализация в ЭР, мы использовали т-СРРб-ЕР?, модифицированный ген вРР, несущий Ы-концевую сигнальную последовательность хитиназы АгаЬ/с/орв/з (Ла/йпа и С-концевой сигнал локализации в ЭР (любезно предоставлен йг. J. Назе1оА).

А ч■ - ' > В : 1 • - - » V - "» -4. С Т ♦ ' '*> й ♦ \ > Г о % * - * % ^ , Е . -.¿Г ' . Р ' .Г' 1 * * V" «а# » / V н ! г : V,-: 1 ** * А -\ г х • ■» ♦ V . V Л у, • «■ ) \ / 1.

Рис. 18. Субклеточная локализация белка ТБГЗ ПЛВМ слитого с йРР и ТБГЗ-зависимый внутриклеточный транспорт ТБГ2. А - В, локализация вРР-18К в эпидермапьной клетке N. Ьвп1Ьат'тпа. А, оптический срез клетки, выявляющий периферические тельца, содержащие СРР-18К. В, изображение той же клетки, реконструированное с помощью наложения серии оптических срезов. С, локализация ТБГ2 в периферических тельцах в присутствии ТБГЗ; показана клетка, экспрессирующая йРР-15К и 18К. Э - Р, Ко-локапизация флуоресценции ТБГЗ слитого с вРР с мембранными структурами, прилежащими к клеточной стенке. О, флуоресценция ОРР-18К (зеленый канал). Е, окрашивание мембранных структур гексиловым эфиром родамина В (красный канал). Р, наложение изображений в Э и Е. О -1, Ко-локализация ТБГ2 слитого с йРР и ТБГЗ слитого с ЬэКес!. Показана эпидермальная клетка, экспрессирующая вРР-15К и Св^сМвК. в, флуоресценция СРР-15К (зеленый канал). Н, флуоресценция Ов1Чес1-18К (красный канал). I, наложение изображений в в и Н.

Локализация т-СРРб-ЕЯ в эпидермальных клетках N. ЬвпШат/апа (Рис. 20А) была сходной с СРР-15К и характеризовалась ассоциацией белка с элементами эндомембранной системы клетки (Воеумк е1 а1., 1996). Однако, в клетках, экспрессирующих m-GFP5-ER, не наблюдались мелкие мембранные тельца, обнаруживаемые в клетках, экспрессирующих GFP-15K. Эти флуоресцентные тельца находились в тесном взаимодействии с структурами ЭР (Рис. XC-D) и находились в постоянном движении вдоль элементов ЭР. Размер этих телец и характерное для них движение были сходными с таковыми для структур аппарата Гольджи в клетках растений (Boevink et at., 1998). Действительно, структуры аппарата Гольджи не наблюдались в клетках, экспрессирующих m-GFP5-ER, несущий С-концевой сигнал внутриклеточной сортировки, препятствующий накоплению белка в аппарате Гольджи.

Слитый с GFP белок ТБГЗ ГШВМ (GFP-18K) локализовался в периферических тельцах различного размера (Рис. 18А-В). Такие тельца располагались только по периферии клетки, и во внутренних областях клетки флуоресценция не наблюдалась, что проиллюстрировано на Рис. 18А, представляющем собой полученный на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе оптический срез клетки, экспрессирующей GFP-18K. Компьютерное наложение серии последовательных оптических срезов, представленное на Рис. 18В, показывает, что различного размера тельца, содержащие GFP-18K, располагаются также вдоль верхней и нижней поверхностей клетки. Обработка гексиловым эфиром родамина В позволила показать, что флуоресцентные периферические тельца, содержащие GFP-18K, представляют собой мембранные структуры, расположенные около плазматической мембраны (Рис. 18D-F),

ТБГЗ-зависимый внутриклеточный транспорт белка ТБГ

Для изучения возможного влияния ТБГ2 на локализацию ТБГЗ и наоборот, белки ко-экспрессировали в клетках N. benthamiana. Было обнаружено, что при ко-бомбардировке векторными плазмидами pRT-15K и pRT-GFP-18K экспрессия ТБГ2 не оказывала влияния на локализацию ТБГЗ слитого с GFP. С другой стороны, при ко-бомбардировке векторными плазмидами pRT-GFP-15K и pRT-18K белок ТБГЗ существенным образом менял локализацию слитого с GFP белка ТБГ2. В присутствии ТБГЗ флуоресценция GFP-15K обнаруживалась не в элементах эндомембранной системы, таких как ЭР и ядерная оболочка, а в периферических тельцах, расположенных вдоль клеточной стенки (Рис. 18С) и сходных с аналогичными структурами, наблюдаемыми в клетках, экспрессирующих слитый с GFP белок ТБГЗ (Рис. 18А). Следует отметить, что в контрольном эксперименте по ко-экспрессии GFP и белка ТБГЗ диффузная локализация GFP, типичная для клеток растений (Рис. 17А), не изменялась.

Таким образом, белок ТБГЗ изменял внутриклеточную локализацию белка ТБГ2, направляя его, как можно предположить, в места локализации самого белка ТБГЗ. Для проверки этого предположения был сконструирован вектор экспрессии, несущий ген белка ТБГЗ ГШВМ слитый с геном красного флуоресцирующего белка

Discosoma sp. (DsRed, Matz et al., 1999). Предварительные эксперименты показали, что локализация DsRed-18K была идентичной GFP-18K. Затем было обнаружено, что при ко-экспрессии GFP-15K и DsRed-18K наблюдалась локализация флуоресценции GFP в периферических тельцах, содержащих ТБГЗ слитый с DsRed (Рис. 18G-I).

Эти данные прямо показывают, что белок ТБГЗ направляет белок ТБГ2 из структур ЭР в места собственной локализации белка ТБГЗ , представляющие собой мембранные периферические тельца, расположенные вдоль клеточной стенки. Сходное явление внутриклеточного ко-транспорта малых мембранных белков в периферические компартменты было описано для кавеолинов, основных структурных белков кавеол, омегаобразных инвагинаций плазматической мембраны клеток животных (Okamoto et al., 1999). Кавеолин-1 локализован в мембранах кавеол, тогда как кавеолин-2, экспрессируемый в отсутствие кавеолина-1, обнаруживается в аппарате Гольджи. Однако в клетках, экспрессирующих кавеолин-1, кавеолин-2 локализуется в кавеолах (Mora et al., 1999; Parolini et al., 1999).

Сигналы субклеточной локализации белков ТБГ2 и ТБГЗ

С целью картирования участков ТБГ2 и ТБГЗ, определяющих внутриклеточную локализацию белков, была сконструирована серия мутантов (Рис. 19). В последовательности ТБГ2 ПЛВМ был проведен сайт-направленный мутагенез N-концевого района, консервативного в белках гордеи-, помо- и пеклувирусов (mut23, Рис. 19А), и центрального района, высококонсервативного у всех известных вирусов с ТБГ (mut30, Рис. 19А). Кроме того, были получены делеционные мутанты N-концевого района (mut91), центрального сегмента последовательности между двумя гидрофобными участками (mut132 and mut151) и С-концевого района белка (mutM7 and mut22). В клоне mut31 была делетирована большая часть последовательности белка за исключением короткого N-концевого района и первого трансмембранного сегмента (Рис. 19А), а в мутанте mut15-l специфическая последовательность первого гидрофобного сегмента белка ТБГ2 была изменена на псевдослучайный набор остатков лейцина и изолейцина (Рис. 19А). В последовательности белка ТБГЗ ПЛВМ было получено три мутанта, несущие делеции в N-концевой области белка (mut263, mut196 и mut611; Рис. 19В), два мутанта, затрагивающие центральную область белка, консервативную у всех белков ТБГЗ группы I (mut71 и mut73; Рис. 19В), и два мутанта, имеющих делеции С-концевой последовательности белка разной длины (mut51 и mut62; Рис. 19В).

Анализ внутриклеточной локализации мутантов белка ТБГ2 ПЛВМ слитых с GFP показал, что ни одна из мутаций в гидрофильных районах белка не повлияла на локализацию белка в структурах эндомембранной системы клетки (Рис. 19). Это могло служить указанием на то, что локализация белка полностью определяется его способностью взаимодействовать с мембранами с помощью гидрофобных районов тиИЗЗ тиМ5а сое локализация локализация белка в присутствии слитого с вРР 18К

ЭМ ПТ

ЭМ ПТ

ЭМ ПТ

ЭМ ПТ

ЭМ ПТ

ЭМ ПТ

ЭМ ПТ

ЭМ ПТ

ЭМ ЭМ + ПТ

ЭМ ПТ локализация локализация белка вРР-15К спитого с вРР в присутствии мутанта

ПТ ПТ

ПТ ПТ

ПТ ПТ

ПТ ПТ

ЭМ ЭМ

ГС ГС

ГС ГС

ГС ГС

Рис. 19. Мутационный анализ белков ТБГ2 и ТБГЗ ПЛВМ. Схематично показаны мутации, внесенные в последовательности белков ТБГ2 (15К) (А) и белка ТБГЗ (18К) (В). ЭМ, элементы эндомембранной системы клетки. ПТ, периферические тельца. ГС, гранулярная сеть. Делеции показаны в виде серых прямоугольников, точечные мутации - в виде кружков. Мутация, внесенная в шШ71, представляла собой инсерцию четырех аминокислотных остатков. В белках дикого типа показаны: 1ч«и гидрофобные сегменты последовательности, ииннии центральная консервативная область белка ТБГ2 П'Н'ШШИ центральная консервативная область белка ТБГЗ. белка. С другой стороны, второй трансмембранный сегмент белка ТБГ2 не является необходимым для локализации белка, как в случае мутанта mut31 (Рис. 19А). При этом замена последовательности первого трансмембранного сегмента неспецифическим набором гидрофобных остатков также не оказывает влияния на локализацию белка (mut15-l; Рис. 19А). Таким образом, локализация ТБГ2 определяется, очевидно, именно гидрофобными свойствами, но не последовательностью его трансмембранных сегментов. Этот вывод согласуется с данными о роли трансмембранных сегментов в локализации интегральных мембранных белков, показывающими, что в некоторых случаях локализация белка зависит от длины этих доменов, но не их специфической последовательности (Gomord et al., 1999). Можно предположить, что белок ТБГ2 ПЛВМ не содержит описанных для многочисленных клеточных белков сигналов внутриклеточной сортировки, обеспечивающих транспорт из ЭР в специфические компартменты (Rothman arid Wieland, 1996; Nishimura and Balch, 1997; Vitale and Raikhel, 1999). Накопление белка и в ЭР, и в структурах аппарата Гольджи может служить указанием на отсутствие в этом белке сигналов, узнаваемых клеточной системой сортировки молекул (Rothman and Wieland, 1996; Ikonen and Simons, 1998),

Мутагенез белка ТБГЗ показал, что N-концевой район белка, предшествующий первому гидрофобному сегменту, не влияет на его локализацию (mut263, mut196 и mut611; Рис. 19В). Напротив, мутации в консервативной последовательности центрального района белка (mut71 и mut73; Рис. 19В) и делеция С-концевого трансмембранного сегмента (mut62; Рис. 19В) приводили к неспособности белка локализоваться в типичных для белка ТБГЗ периферических тельцах. Белки, несущие эти мутации, имели сходную локализацию и обнаруживались в мелких цитоплазматических включениях, образующих гранулярную сеть (Рис. ХВ и данные не показаны). Можно предположить, что оба элемента структуры белка, затронутые этими мутациями,- консервативная гидрофильная последовательность и С-концевой гидрофобный сегмент,- являются двумя частями сигнала, обеспечивающего локализацию белка ТБГЗ в периферических тельцах. Действительно, делеция, затрагивающая оба эти элемента (mut51), приводила к локализации, сходной с локализацией белка ТБГ2 в эндомембранной системе клетки (Рис. 19В).

Анализ специфичности ТБГЗ-зависимого внутриклеточного транспорта

Одним из возможных механизмов ТБГЗ-зависимого транспорта ТБГ2 могло быть прямое взаимодействие молекул этих двух белков. Для выявления участков последовательности, участвующих в такого рода белок-белковых взаимодействиях, был использован набор мутантов, полученный для картирования сигналов внутриклеточной локализации белков ТБГ2 и ТБГЗ ПЛВМ. В первой серии экспериментов мутанты белка ТБГ2, слитые с GFP, ко-экспрессировали с белком ТБГЗ. Было обнаружено, что все мутанты, за исключением mut31, в присутствии белка ТБГЗ локализовались, подобно белку ТБГ2 дикого типа, в периферических тельцах (Рис. 19А). Мутант ти1:31 также локализовался в такого рода структурах, но при этом не полностью перемещался в них из элементов эндомембранной системы клетки, и часть белка оставалась в ЭР и ядерной оболочке (Рис. 19А и данные не показаны). Такой «промежуточный» фенотип мог объясняться тем, что в мутанте ти$1 большая часть последовательности ТБГ2, кроме 36 Ы-концевых аминокислотных остатков, была дебетирована, в результате чего была существенно нарушена структура молекулы белка. Таким образом, ни одна из мутаций в белке ТБГ2 не приводила к тому, что белок полностью терял способность локализоваться в периферических тельцах в присутствии белка ТБГЗ.

В последующих экспериментах была протестирована способность мутантов белка ТБГЗ влиять на локализацию белка ТБГ2 слитого с ЭРР. Мутант ти151, полностью потерявший локализацию природного белка ТБГЗ, не оказывал никакого влияния на 6РР-15К (Рис. 19В). Мутации в С-концевой части белка ТБГЗ, приводящие к локализации белка в мелких цитоплазматических включениях, образующих гранулярную сеть (ти173, т\ЛТ\ и ти!51), приводили к тому, что в присутствии таких мутантов ТБГ2 слитый с вРР также локализовался в гранулярной сети. И, наконец, мутации в Ы-концевой области не влияли на способность белка направлять ТБГ2 в периферические тельца (Рис. X). Таким образом, в последовательности белка ТБГЗ нам не удалось обнаружить район, отвечающий за гипотетическое взаимодействие с белком ТБГ2. Можно было предположить, что сигналы в белке ТБГЗ, отвечающие за его локализацию, также обеспечивают взаимодействие с белком ТБГ2. Другая гипотеза заключалась в том, что ТБГЗ-зависимый внутриклеточный транспорт белка ТБГ2 не требует специфических взаимодействий молекул белков ТБГ2 и ТБГЗ, что подтверждалось тем, что в белке ТБГ2 также не удалось обнаружить какую-либо последовательность, отвечающую за возможное взаимодействие с белком ТБГЗ. Последняя гипотеза была проверена экспериментально.

Сравнительный анализ последовательностей показывает, что белки ТБГ2 всех известных групп обладают высокой степенью сходства, тогда белки ТБГЗ групп I и II не имеют статистически значимого сходства последовательностей и различаются количеством трансмембранных сегментов (Рис. 5). Поэтому ко-экспрессия гетерологичных белков ТБГ2 и ТБГЗ, принадлежащих к группам I и II соответственно, могла быть полезной для анализа специфичности ТБГЗ-зависимого внутриклеточного транспорта белка ТБГ2. Для такого рода экспериментов были получены векторы экспрессии, несущие под контролем 358 промотера гены ХВК, рР*Т-ЗРР-12К, в котором был клонирован ген белка ТБГ2 ХВК слитый с геном ЭРР, и рЯТ-8К с геном белка ТБГЗ ХВК. В предварительных экспериментах было установлено, что локализация белка ТБГ2 ХВК слитого с йРР была сходной с таковой белка ТБГ2 ПЛВМ, и что в присутствии ТБГЗ ХВК белок ТБГ2 ХВК также локализовался в периферических тельцах, типичных для белка ТБГЗ ПЛВМ (Табл. 4). Эти наблюдения свидетельствуют о том, что обнаруженный для ПЛВМ (вируса с ТБГ типа I) феномен ТБГЗ-зависимого транспорта ТБГ2 имеет место также в случае ХВК, вируса с ТБГ типа II.

Ко-зкспрессия белков ТБГ2 и ТБГЗ ХВК и ПЛВМ (либо ТБГ2 ХВК и ТБГЗ ПЛВМ, либо ТБГ2 ПЛВМ и ТБГЗ ХВК) показала, что в обоих случаях в присутствии гетерологичного белка ТБГЗ белок ТБГ2 переходил из элементов эндомембранной системы клетки в периферические тельца (Табл. 4). Эти результаты можно считать подтверждением гипотезы о том, что ТБГЗ-зависимый транспорт независим от специфической последовательности и, вероятнее всего, не является результатом прямого взаимодействия молекул белков ТБГ2 и ТБГЗ.

Чтобы подтвердить способность белка ТБГЗ направлять внутриклеточный транспорт мембранных белков, не родственных ТБГ2, мы использовали два вирусных белка, имеющих гидрофобные сегменты последовательности, а именно продукт геномного компонента 4 (белок С4) ДНК-содержащего вируса некротической желтухи бобов (FBNYV, род Nanovirus) и продукт ОРТ2 вируса желтухи свеклы (BYV, род Closterovirus). Следует подчеркнуть, что оба этих белка не имеют сходства последовательностей с белками ТБГ.

Белок С4 FBNYV гомологичен белку С4 BBTV, другого вируса рода Nanovirus, для которого показана дисперсная локализация в периферических районах клетки (Burns et at., 1995; Katul et al., 1997; Wanitchakorn et a)., 2000). Сходным образом локализовался белок С4 слитый с GFP в эпидермальных клетках N. bertthamiana (Табл. 4 и данные не показаны). Однако при ко-экспрессии C4-GFP с белком ТБГЗ ПЛВМ слитым с DsRed наблюдалась ко-локализация зеленой и красной флуоресценции в периферических тельцах, типичных для белка ТБГЗ.

Белок 6.4К, кодируемый ОРТ2 BYV, в составе слитного белка с GFP был локализован в элементах эндомембранной системы клетки, преимущественно в ЭР (Табл. 4), что соответствовало предсказаниям, сделанным на основании анализа его

Таблица

Ко-экспресхия белков ТБГЗ и гетерологичных мембранных белков

Мембранный белок Ко-экспрессированный Локализация слитый с GFP ТБГЗ GFP

ТБГ2ПЛВМ - ЭМ

ТБГ2ПЛВМ ТБГЗ ПЛВМ ПТ

ТБГ2 ХВК - ЭМ

ТБГ2ХВК ТБГЗ ХВК ПТ

ТБГ2 ХВК ТБГЗ ПЛВМ ПТ

ТБГ2 ПЛВМ ТБГЗ ХВК ПТ

6KBYV - ЭМ

6KBYV ТБГЗ ПЛВМ ПТ

ОРТ4 FBNYV - МКП

ОРТ4FBNYV ТБГЗ ПЛВМ ПТ

ПЭМ, элементы эндомембранной системы; ПТ, периферические тельца; МКП, мембраны клеточной периферии. последовательности, обнаружившего предполагаемый трансмембранный сегмент (Agranovsky et al., 1991). При этом в присутствии белка ТБГЗ слитого с DsRed белок 6.4К BYV наблюдался в периферических тельцах, содержащих DsRéd (Табл. 4).

Таким образом, несмотря на то, что белки С4 FBNYV и 6.4К BYV не имеют сходства между собой и локализуются в клетке различным образом, оба этих белка транспортировались в присутствий белка ТБГЗ ПЛВМ в периферические тельца, что подтверждает гипотезу о том, что ТБГЗ-зависимый транспорт мембранных белков может происходить независимо от их специфической последовательности. Кроме того, это указывает на то, что ТБГЗ-зависимый транспорт может происходить не из мест локализации этих белков в клетке, а из участков их синтеза в шероховатом ЭР.

На основании результатов мутагенеза и данных ко-экспрессии гетерологичных белков можно сделать вывод о том, что специфические белок-белковые взаимодействия последовательностей ТБГ2 и ТБГЗ не участвуют в ТБГЗ-зависимом транспорте белка ТБГ2. Можно; предположить, что белок ТБГЗ способен активировать особый путь внутриклеточной транслокации мембранных белков к периферии клетки. В общем случае, сортировка белков происходит с помощью транспортных везикул и включает узнавание сигналов сортировки, обеспечивающее специфичность транспорта из ЭР в аппарат Гольджи , затем в транс-Гольджи и в компартменты нвзначения (Robinson et al., 1998; Vitale and Raikhel, 1999; Vitale and Denecke, 1999). Белок ТБГЗ может «включать» такого рода транслокацию определенного класса мембранных белков, обеспечивая, например, сигнал их дифференциальной сегрегации в почкующиеся транспортные везикулы (Robinson et al., 1998). С другой стороны, ТБГЗ-зависимая транслокация ТБГ2 может происходить и без везикулярного транспорта через аппарат Гольджи (Cocquerel et ai., 1999, Gomord et al., 1999), a путем транспортировки белков в плоскости мембран ЭР к специфическим суб-доменам ЭР, расположенным у клеточной стенки, таким как домен обмена липидами между ЭР и плазматической мембраной, десмотрубочки плазмодесм (Staehelin, 1997) или другой суб-домен ЭР, образование которого индуцировано белком ТБГЗ. Кроме того, возможное объяснение неспецифического механизма ТБГЗ-зависимого транспорта могло заключаться в следующем. Поскольку неродственные белки переходят в присутствий ТБГЗ из свойственных им эндомембранных структур в периферические тельца, где локализован ТБГЗ, существовала возможность того, что экспрессия ТБГЗ приводит к деструкции всей эндомембранной системы клетки и ее распаду на периферические тельца, где в таком случае будут оказываться любые белки, ассоциированные с эндомембранами.

Природа периферических телец, в которых локализован белок ТБГЗ

С целью выявления природы периферических мембранных телец, в которых локализован белок ТБГЗ, и получения ответа на вопрос о пути ТБГЗ-зависимого транспорта ТБГ2, белок ТБГЗ ко-экспрессировали с m-GFP5-ER, производным GFP,

Рис. 20. Визуализация структур эндоплазматического ретикулума в клетках, экспрессирующих белок ТБГЗ ПЛВМ. А. Локализация т-вРР5-ЕК. В. Локализация т-(ЗРР5-Е1Ч в клетке, экспрессирующей белок ТБГЗ ПЛВМ. С - Н. Ко-экспрессия т-ОРРв-ЕИ белка ТБГЗ слитого с РвЯес). Си Р, локализация флуоресценции вРР (зеленый канал). О и С, локализация флуоресценции ОзЯес! (фасный канал). Е и Н, наложение изображений в С и О или Р и б, соответственно. локализованном в люмене ЭР и представляющем собой, таким образом, флуоресцентный маркер структур ЭР.

В клетках, экспрессирующих ТБГЗ и т-ЭРРб-ЕЯ, сохранялись типичные структуры, в которых локализован т^Рб-ЕЯ, и, кроме того, наблюдались периферические тепа, сходные с таковыми в клетках, экспрессирующих белок ТБГЗ слитый с йРР (Рис. 20В). При ко-экспрессии т^Рб-ЕЯ и белка ОэРей-ТБГЗ периферические тельца, в которых находился белок ТБГЗ, содержали также ЭРР, и размер этих телец коррелировал с общим уровнем экспрессии белка ТБГЗ слитого с GFP (Рис. 20С-Н). Эти данные показывают, что белок ТБГЗ не разрушает эндомембранную систему клетки, но индуцирует образование (или пролиферацию) мембранных структур, связанных, по всей видимости, с цистернами периферического ЭР (Рис. 20С-Е) и являющихся его производными. Эта гипотеза предполагает, что внутриклеточный транспорт ТБГЗ в периферические тельца либо происходит без выхода белка из ЭР, либо подразумевает участие транспортных везикул, которые следуют к месту назначения без слияния с компартментами цис-Гольджи, откуда происходил бы быстрый ретроградный транспорт m-GFP5-ER (Hawes et al., 1999; Hadlington and Denecke, 2000). В обоих случаях внутриклеточный транспорт ТБГЗ может происходить минуя аппарат Гольджи. Существование такого механизма транспорта уже известно для клеток растений (Hawes et al., 1999; Vitale and Raikhel, 1999).

Дополнительное указание на локализацию периферических телец, содержащих ТБГЗ, относительно других клеточных структур было получено в экспериментах по экспрессии белка ТБГЗ ПЛВМ слитого с GFP с помощью вирусного вектора. Ген слитного белка GFP-ТБГЗ был клонирован в вирусный вектор экспрессии TMV30B, сконструированный на основе генома ВТМ (Shivprasad et al., 1999; предоставлен Dr. W. О. Dawson). Через 48 часов после инокуляции листьев N. benthamiana полученным вектором свечение GFP обнаруживалось во включениях различного размера, расположенными вдоль клеточных стенок клеток эпидермиса (Рис. 21). Таким образом, локализация слитного белка GFP-ТБГЗ ПЛВМ была схожей при экспрессии путем бомбардировки микрочастицами и с помощью вирусного вектора. При этом важно отметить, что в случае экспрессии с использованием вектора, когда, в отличие от экспериментов по бомбардировке, можно было наблюдать локализацию белка не в единичных клетках, а в группах

Рис. 21. Локализация белка ТБГЗ слитого с вРР при его экспрессии в листе N. Ьепйтатйпа с помощью вирусного вектора. Слева, локализацция белка в периферических структурах вдоль клеточных стенок клеток эпидермиса. Справа, увеличенное изображение, показывающее парные структуры, содержащие ТБГЗ.

Рис. 22. Окрашивание каллозы в клетках, экспрессирующих белок ТБГЗ слитый с DsRed. А, локализация ТБГЗ слитого с DsRed в периферических тельцах вдоль клеточной стенки (красный канал). В, окрашивание отложений каллозы с помощью sirofluor (зеленый канал). С, наложение изображений в А и В. клеток, содержащие ТБГЗ периферические тельца в соседних клетках часто располагались напротив друг друга по разные стороны клеточной стенки, образуя «пары» (Рис. 21). Структурной основой для такого расположения периферических телец в соседних клетках могли быть соединяющие их плазмодесмы.

Для проверки гипотезы о том, что периферические тельца, содержащие ТБГЗ, расположены вблизи плазмодесм, была проведена окраска каллозы, полисахарида, который откладывается около устьев плазмодесм (Ding, 1998), с помощью красителя анилиновый синий, содержащего sirofluor, дающий специфическое флуоресцентное окрашивание каллозы (Smith and McCully, 1978; Stone et al., 1984). Флуоресцентная микроскопия показала, что периферические тельца, содержащие слитый с DsRed белок ТБГЗ ПЛВМ располагались вблизи окрашенных отложений каллозы (Рис. 22). При этом размер ТБГЗ-содержащих телец мог варьировать, тогда как структуры, содержащие каллозу всегда были сходного размера; кроме того, не все структуры, окрашенные sirofluor, находились вблизи периферических телец, содержащих ТБГЗ (Рис.22).

Таким образом, можно заключить; что мембранные структуры, в которых локализован белок ТБГЗ, являются производными ЭР и расположены вблизи плазмодесм.

ТБГЗ-зависимый транспорт белка ТБГ2 в клетках животных

Система внутриклеточйой сортировки белков высококонсервативна у дрожжей, растений и животных (Hawes et al., 1999; Sato et al., 1999; Andreeva et al., 2000; Batoko et al., 2000; Nebenführ and Staehelin, 2001), и было показано, что сигналы сортировки некоторых белков растений функциональны также в других системах (Altschuler et al., 1993; Sato et al., 1999; Kikkert et al., 2001). Чтобы проверить универсальность механизма ТБГЗ-зависимого транспорта белка ТБГ2 для клеток эукариот, слитные гены GFP-ТБГг и DsRed-ТБГЗ ПЛВМ были перенесены под контроль IE промотера цитомегаловируса, и полученные конструкции использовали для трансфекции клеток почек хомяка (линия ВНК-21) и человека (линия 293Т). Как и в клетках растений, слитый с GFP белок ТБГ2 локализовался в клетках млекопитающих в эндомембранной системе, преимущественно в ЭР, тогда как белок ТБГЗ слитый с DsRed обнаруживался в многочисленных включениях, природа которых неизвестна (данные не приведены). Тем не менее, в экспериментах по ко-трансфекции слитные белки GFP-TBI~2 и DsRed-ТБГЗ ко-локапизовались в сходных включениях (данные не показаны), что указывает на то, что механизм ТБГЗ-зависимого транспорта универсален для клеток растений и млекопитающих и, следовательно, использует фундаментальные механизмы транспорта белков эукариотических клеток.

РОЛЬ БЕЛКА ОБОЛОЧКИ В ТБГ-ЗАВИСИМОМ МЕЖКЛЕТОЧНОМ ТРАНСПОРТЕ

Ранее было показано, что белок оболочки (БО) необходим для межклеточного транспорта потексвирусов (Chapman et al., 1992; Forster et al., 1992). Тем не менее, роль БО оставалась неясной. Были высказаны предположения, что транспорт потексвирусного генома может происходить в форме вириона, и этим определяется роль БО (Santa Cruz et al., 1998), или БО вместе с белком ТБГ1 формируют РНП, специализированные для межклеточного транспорта (Lough et al., 1998). Для анализа функций БО в транспорте потексвирусов мы использовали метод комплементации.

В клоне pPVX-GUS, представляющем собой полную инфекционную кДНК-копию генома ХВК, несущую маркерный ген GUS (Рис. 10), был получен мутант по гену БО pPVX-GUS.Xho, в котором была введена мутация сдвига рамки после кодона 219 гена БО, в результате чего происходила делеция 18 С-концевых остатков белка. После бомбардировки листьев N. benthamina микрочастицами, несущими pPVX-GUS.Xho, и последующей гистохимической детекции GUS было показано, что мутант неспособен выходить из первично зараженных клеток. С другой стороны, ко-бомбардировка с pRT-PVX.CP, вектором, несущего БО ХВК, восстанавливала межклеточный транспорт мутанта (Табл. 5). В этой системе проводилось тестирование способности различных белков комплементировать транспортную функцию БО ХВК.

Было показано, что при ко-бомбардировке pPVX-GUS.Xho и вектором pPVA, несущим под контролем 35S промотера полную инфекционную копию генома А-вируса картофеля (АВК, род Potyvirus) (Puurand et al., 1996), происходит межклеточный транспорт мутанта ХВК (Табл. 5). Можно было предположить, что либо транспортная система потивируса полностью замещает функции транспортной системы ХВК и обеспечивает перенос РНК ХВК в соседние клетки без участия транспортных белков ХВК, либо один их белковых продуктов потивируса

Таблица

Комплементация межклеточного транспорта PVX.GUS-Xho при ко-бомбардировке с

Вектор экспрессии Диаметр фокуса инфекции, мкм

- 59 ±13. pRT-PVX.CP 261 ± 20. pPVA 292 ±18.

J3RT-PVA.CP 264 ±22. pRT-PVA.HC-Pro 54 ±11. pRT-PVA.6K1 -CI-6K2 63 ± 13. pRT-PVA.P1 63 ± 10. pRT-PVA.6K2-Nla 60 ± 12. pRT-PVY.CP 272 ±24.

Диаметр фокусов инфекции определен по гистохимическому окрашиванию GUS, проведенному через 72 часа'после бомбардировки. специфически комплементирует транспортную функцию БО ХВК. Чтобы проверить, какое из предположений верно, мы клонировали гены отдельных белков АВК под контролем 35S промотера, и проводили ко-бомбардировку полученных конструкций с pPVX-GUS.Xho. Было обнаружено, что только БО АВК способен комллементировать функцию БО ХВК в межклеточном транспорте, и дальнейшие эксперименты подтвердили эти данные, показав, что БО другого потивируса, Y-вируса картофеля, также комплементировал транспорт pPVX-GUS.Xho (Табл. 5). Таким образом, функция БО ХВК, утраченная в мутанте PVX-GUS.Xho, могла быть предоставлена БО потивирусов, и необходимо было выяснить, способен ли потивирусный БО полностью замещать БО ХВК, или только комплементировать функцию короткого С-концевого района БО ХВК. Для этого был сконструирован мутант pPVX-GFP.ACP с полной делецией гена БО и маркерным геном GFP. Флуоресцентная микроскопия лисьев N. benthamiana, подвергнутых бомбардировке этим мутантом, показала, что, как ожидалось, полная делеция гена БО приводила к тому, что инфекция была ограничена первично зараженными клетками. При этом ко-бомбардировка pPVX-GFP.äCP с векторными плазмидами, несущими гены БО АВК и YBK, не приводила к восстановлению способности мутантного ХВК к системному транспорту. Более того, гибридный геном PVX.GFP.PVA-CP, в котором ген БО ХВК был замещен геном БО АВК, также был дефектен по межклеточному транспорту (данные не показаны). Кроме того, электронная микроскопия препаратов из листьев трансгенных растений N. benthamiana, экспрессирующих БО YBK и зараженных PVX-GUS.Xho, показала, что в таких условиях, несмотря на способность БО потивирусов взаимодействовать с РНК ХВК in vitro (Merits et al., 1998), не происходило гетерологичной инкапсидации генома ХВК потивирусным БО (данные не показаны). При этом PVX-GUS.Xho в зараженных протопластах мог формировать вирион-подобные частицы, имевшие меньшую длину по сравнению с вирионами ХВК, что соответствовало ранее полученным данным для аналогичного мутанта по БО другого потексвируса, вируса мозаики белого клевера (WCIMV, Forster et al., 1992). Таким образом, полученные данные показывают, что С-концевой район БО ХВК несет специфическую функцию в вирусном межклеточном транспорте, которая не связана, вероятнее всего, с формированием вирусных частиц и может быть специфически комплементирована потивирусным БО. Этот вывод подтверждается данными, показывающими, что функции инкапсидации и межклеточного транспорта в БО WCIMV могут быть разделены: мутант с делецией С-концевого района БО, сохраняющий способность образовывать вирионы, был дефектен по межклеточному транспорту (Lough et а)., 2000).

Cell-to-cell movement PVX.GUS-Xho PVX.GUS-) pRT-TMV.30K pR.T-TMV.27K. pRT-TMV.19K pRT-TMV.147 pRT-TMV.ctl 1 pRT-TMV.ct33 pRT-TMV.ct + + + + + pRT-TMV.388 С pRT-TMV.DEL4 С

Рис. 23. Комплементация межклеточного транспорта мутантов ХВК транспортным белком ВТМ и его делеционными вариантами. А. Функциональные домены в белке 30К ВТМ. SEL, район, отвечающий за увеличение эффективного диаметра плазмодесм. CW, сигнал локализации в клеточной стенке. RBD А и RBD В, РНК-связывающие домены. F, район, необходимый для сворачивания белковой молекулы. PME, район связывания с пектинметилэстеразой, Т, участки, необходимые для взаимодействия белка с микротрубочками и/или плазмодесмами. В. Способность делеционных мутантов ЗОК белка ВТМ комплементировать межклеточный транспорт мутантов ХВК.

Для выяснения транспортной функции, специфически выполняемой С-концевым районом БО ХВК, была сделана попытка комплементировать транспорт PVX.GUS-Xho делеционными мутантами транспортного белка ВТМ, функциональные домены которого идентифицированы и картированы (Citovsky et al., 1992, 1993; Gafny et al., 1992; Waigmann et al., 1994; Haley et al., 1995; Hughes et al., 1995; Kahn et al., 1998; Reichel and Beachy, 1998; Brill et al., 2000; Chen et al., 2000; Boyko et al., 2000).

Для этих экспериментов был получен вектор экспрессии pRT-TMV.30K, несущий ген транспортного белка ВТМ (белка 30К) под контролем 35S промотера. Как и в случае транспортного бепка другого тобамовируса ToMV (Morozov et al., 1997), белок 30K комплементировал транспорт и PVX.GUS-Bsp (мутанта по белку ТБГ1, Рис. 10), и PVX.GUS-Xho (Рис. 23), что может указывать на то, что транспортный белок ВТМ способен полностью замещать собой транспортную систему ХВК. Следовательно, в экспериментах по комплементации транспорта PVX.GUS-Xho мутантами белка ЗОК особый интерес представляли те его делеционные варианты, которые утратили способность функционировать как транспортный белок (и комплементировать транспорт PVX.GUS-Bsp), но при этом, сохраняя некоторые функциональные домены, комплементировали транспорт PVX.GUS-Xho, что могло бы показать, какие из доменов белка ЗОК функционально эквивалентны С-концевому району БО ХВК.

Результаты комплементационного анализа набора мутантов белка ЗОК, представленные на Рис. 23, показывают, что такими свойствами обладали три делеционных варианта белка, TMV.27K, TMV.19K и TMV.ct33. Удаление N- и С-концевых районов белка ЗОК, делающее его нефункциональным в качестве транспортного белка, не лишает его способности комплементировать функцию С-концевого района БО ХВК, что является указанием на то, что соответствующая специфическая функция белка ЗОК определяется его внутренним районом. В подтверждение этому, внутренняя делеция (TMV.DEL4, Рис. 23) приводит к неспособности белка ЗОК комплементировать транспорт PVX.GUS-Xho.

Район белка ЗОК ВТМ, участвующий в комплементации функции карбокситерминального района БО ХВК, включает ряд перекрывающихся функциональных доменов, отвечающих за связывание РНК, связывание с клеточным белком-рецептором пектинметилэстеразой, взаимодействие с мембранами ЭР и увеличение эффективного диаметра плазмодесм (Kahn et al., 1998; Citovsky et al., 1999; Leisner et al., 1999; Rhee et al., 2000; Brill et al., 2000). Можно предположить, что роль частично функциональных мутантов ЗОК ВТМ в комплементации транспорта PVX.GUS-Xho, заключается в формировании РНП, содержащих геномную РНК ХВК, и доставке их (или РНП, сформированными белками ХВК) к плазмодесмам, которые могут модифицироваться белками ТБГ. Поскольку несколько РНК-связывающих белков АВК не способны комплементировать дефект по транспорту мутанта

PVX.GUS-Xho (Табл. 5), можно предположить, что именно доставка к клеточной стенке является по крайней мере одной их функций С-концевого участка БО ХВК. Это предположение косвенно подтверждается данными о том, что центральный район белка ЗОК ВТМ содержит участок связывания с микротрубочками, которое необходимо, возможно, для внутриклеточного транспорта белка (Boyko et al., 2000а, 2000b). Следует также отметить, что приведенные эксперименты показывают, что, помимо транспортной функции, локализованной в короткой С-концевой области, БО ХВК содержит еще одну детерминанту межклеточного транспорта, которая расположена в остальной части белка, однако функция ее требует дальнейшего изучения.

ВОЗМОЖНЫЕ МОДЕЛИ ТРАНСПОРТА ВИРУСОВ С ТРОЙНЫМ БЛОКОМ ГЕНОВ

Экспериментальные данные, представленные в настоящей работе приближают нас к пониманию молекулярного механизма ТБГ-зависимого межклеточного транспорта вирусной инфекции.

У вирусов, кодирующих ТБГ группы I, способность белка ТБГ1 связывать РНК является ключевой для формирования комплексов с вирусной геномной РНК и образования специализированных РНП, предназначенных для переноса в соседние клетки. Такие РНП были выделены из тканей, зараженных ВШМЯ (Brakke et at., 1988). В случае вирусов, кодирующих ТБГ группы II, природа РНП остается неясной, но белок ТБГ1 может входить в их состав либо модифицируя вирионы и таким образом придавая им способность транслоцироваться через плазмодесмы (Santa Cruz et al., 1998; Atabekov et al., 2000), либо образуя смешанные невирионные РНП вместе с белком оболочки (Lough et al., 1998). Таким образом, важнейшей ролью белка ТБГ1 является образование РНК-белковых комплексов, предназначенных для межклеточного транспорта.

Белки ТБГ2 и ТБГЗ могут обеспечивать доставку таких структур к плазмодесмам. Действительно, белок ТБГЗ направляет внутриклеточный транспорт белка ТБГ2 в мембранные структуры, расположенные в непосредственной близости от плазмодесм. С другой стороны, показано, что белок ТБГ1, который локализован диффузно в цитоплазме, в присутствии белков ТБГ2 и ТБГЗ частично или полностью переходит в точечные структуры в клеточной стенке, соседствующие с плазмодесмами (Erhardt et al., 1999, 2000; Lawrence and Jackson, 2001). Таким образом, роль белков ТБГ2 и ТБГЗ может сводиться к внутриклеточному транспорту ТБГ1-содержащих РНП. Наши данные показывают, что, при комплементации транспорта мутанта ХВК по белку ТБГ1 гомологичным белком размер фокуса инфекции достигал 50 клеток. Это указывает, что белок ТБГ1 может, транспортируясь через плазмодесмы, пересекать несколько клеточных границ. В то же время, в случае аналогичных экспериментов с белками ТБГ2 и ТБГЗ, комплементация транспорта мутантов выражалась только в переходе вируса в клетки, соседние с первично зараженной (см, также Lough et al., 2000). Таким образом, белки ТБГ2 и ТБГЗ выполняют свою функцию в клетке, где они синтезированы, и не способны транспортироваться через плазмодесмы.

Наши данные доказывают, что именно белок ТБГЗ направляет внутриклеточный транспорт белков ТБГ2 и ТБГ1 к плазмодесмам, но еще предстоит выяснить, какие белок-белковые взаимодействия между тремя этими белками необходимы для такого транспорта. Можно предположить, что белок ТБГЗ, действуя неспецифически по отношению к последовательности транспортируемого белка, направляет белок ТБГ2 в мембранные структуры около плазмодесм, тогда как некое специфическое взаимодействие между молекулами белков ТБГ2 и ТБГ1 обеспечивает транспорт ТБГ1-содержащих РНП. Другое предположений заключается в том, что белки ТБГ2 и ТБГЗ, находясь в составе периферических мембранных телец, вместе образуют «посадочную площадку» для ТБГ1-содержащих РНП, причем в таком случае можно предполагать специфическое взаимодействие ТБГ1 и с белком ТБГ2, и с белком ТБГЗ.

Таким образом, настоящая работа, позволив сформулировать в целом модель механизма ТБГ-зависимого межклеточного транспорта вирусной инфекции, оставляет выяснение некоторых его важных деталей для последующих исследований.

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Соловьев, Андрей Геннадьевич

ВЫВОДЫ

1. Определена полная первичная структура и организация геномов трех фитовирусов, кодирующих тройной блок транспортных генов и принадлежащих к группам потеке- и гордеивирусов. На основании анализа последовательностей белков выделены две группы ТБГ.

2. С помощью рекомбинантных гордеивирусных геномов продемонстрирована функциональная эквивалентность ТБГ и моноцистронных транспортных модулей.

3. Комплементационный анализ белков ТБГ показал существование функциональных взаимодействий белка ТБГ1 с белками ТБГ2 и ТБГЗ.

4. Выявлены и охарактеризованы две РНК-связывающие активности белка ТБГ1. Показано, что кооперативное связывание РНК белком ТБГ1 обусловлено его хеликазным доменом. Участки, отвечающие за другую РНК-связывающую активность картированы в аминотерминальном гордеивирусного белка ТБГ1. Эта активность необходима для системного транспорта вирусной инфекции.

5. Выявлено, что белок ТБГ2 в отсутствие других белков ТБГ локализуется в эндомембранной системе клетки. В то же время белок ТБГЗ найден в периферических тельцах вдоль клеточной стенки. Показано, что эти тельца представляют собой мембранные структуры, производные эндоплазматического ретикулума, расположенные вблизи плазмодесм.

6. С помощью мутагенеза показано, что локализация белка ТБГ2 определяется гидрофобной природой его трансмембранных сегментов, тогда как локализация ТБГЗ зависит от специфического сигнала в его последовательности, включающего центральную консервативную область белка и его карбокситерминальный трансмембранный сегмент.

7. Обнаружен ТБГЗ-зависимый внутриклеточный транспорт белка ТБГ2 из эндомембранной системы в периферические тельца. С помощью ко-экспрессии мутантов белков ТБГ2 и ТБГЗ и гетерологичных мембранных белков показано, что ТБГЗ-индуцируемый транспорт не зависит от специфической последовательности транспортируемого белка и не требует белок-белковых взаимодействий ТБГ2 и ТБГЗ. Продемонстрировано, что внутриклеточный транспорт белка ТБГ2, направляемый белком ТБГЗ, может происходить также в клетках млекопитающих.

8. Выявлено, что белок оболочки ХВК несет две детерминанты, определяющие его роль в межклеточном транспорте. Показано, что одна их этих детерминант локализована в карбокситерминальном участке белка, и ее функция может быть комплементирована белком оболочки потивирусов и частично функциональным транспортным белком ВТМ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Miroshnichenko N.A., Zelenina D.A., Simonova M.N., Fedorkin O.N., Solovyev A.G., Morozov S.Yu. (1990). In vitro membrane binding of the translation products of two potato virus X small genes. Vlllth International Congress of Virology, Berlin, Abstracts, p.367.

2. Novikov V.K., Tyulkina L.G., Solovyev A.G., Lukasheva L.I., Merits A., Morozov S.Yu.

1990). Complementary DNA cloning and sequencing of plantain mosaic potexvirus. Vlllth International Congress of Virology, Berlin, Abstracts, p.377.

3. Morozov S.Yu., Miroshnichenko N.A., Zelenina DA, Fedorkin O.N., Solovijev A.G., Lukasheva L.I. and Atabekov J.G. (1990). Expression of RNA transcripts of potato virus XfulWength and subgenomic cDNAs. Biochimie 72,677-684.

4. Смирнягина E.B. Морозов С.Ю., Мирошниченко H.A., Лукашева Л.И., Кулаева О.И., Соловьев А.Г., Федоркин О.Н., Родионова Н.П., Атабеков И.Г. (1990). 5'-концевая не транслируемая последовательность геномной РНК Х-вируса картофеля вызывает эффективное усиление трансляции чужеродного гена. Доклады АН СССР 314, 979-980.

5. Morozov S.Yu., Miroshnichenko N.A., Solovyev A.G., Fedorkin O.N., Zelenina D.A., Lukasheva L.I., Atabekov J.G. (1991). Expression of the 5'-distal genes in potato virus X genome. FEBS Advanced Course "The Plant Virus Genome: Structure and Expression", Riga. Abstracts, p.17.

6. Rodionova N.P., Morozov S.Yu., Miroshnichenko N.A., Solovyev A.G., Fedorkin O.N., Lukasheva L.I., Smirnyagina E., Karpova O.V., Tomashevskaya O.L., Atabekov J.G.

1991). Translation enhancing properties of the 5'-!eader sequence of potato virus X RNA. FEBS Advanced Course "The Plant Virus Genome: Structure and Expression", Riga. Abstracts, p.18,

7. Morozov S.Yu., Miroshnichenko N.A., Solovyev A.G., Zelenina D.A., Fedorkin O.N., Lukasheva L.I., Grachev-S.A. and Chernov B.K. (1991). In vitro membrane binding of the translation product of the carlavirus 7-kDa protein genes. Virology 183, 782-785.

8. Smirnyagina E.V., Morozov S.Yu., Rodionova N.P., Miroshnichenko N.A., Solovyev A.G., Fedorkin O.N. and Atabekov I.G. (1991). Translational efficiency and competitive ability of mRNAs with 5-untranslated aß-leader of PVX RNA. Biochimie 73, 587-598.

9. Morozov S.Yu., Miroshnichenko N.A., Solovyev A.G., Fedorkin O.N., Zelenina D.A., Lukasheva L.I., Karasev A.V., Dolja V.V., and Atabekov J.G. (1991). Expression strategy of the potato virus X triple gene block. Journal of General Virology 72, 20392043.

10.Zelenina D.A., Kulaeva O.I., Smirnyagina E.V., Solovyev A.G., Miroshnichenko N.A., Fedorkin O.N., Rodionova N.P., Morozov S.Yu. and Atabekov I.G. (1992). Translation enhancing properties of the 54eader of potato virus X genomic RNA. FEBS Letters 296, 267-270.

И.Томашевская О.Л., Соловьев А.Г., Карпова O.B., Федоркин О.Н., Морозов С.Ю., Родионова Н.П. и Атабеков И.Г. (1992). Роль структурных элементов 5'-нетранслируемой последовательности РНК Х-вируса картофеля (aß-лидер) в определении его активности как трансляционного знхансера. Доклады Академии Наук 324,697-700.

12.Соловьев А.Г., Новиков В.К., Морозов С.Ю., Каграманов В.Н. и Атабеков И.Г.

1993). Первичная структура тройного блока генов РНК вируса мозаики подорожника азиатского. Доклады Академии Наук 328,625-628.

13.Morozov S.Yu., Denisenko O.N., Zelenina D.A., Fedorkin O.N., Solovyev A.G., Maiss E., Casper R. and Atabekov J.G. (1993). A novel open reading frame in tobacco mosaic virus genome coding for a putative small, positively charged protein. Biochimie 75,659-665.

14.Tomashevskaya O.L., Solovyev A.G., Karpova O.V., Fedorkin O.N., Rodionova N.P., Morozov S.Yu. and Atabekov J.G. (1993). Effects of sequense elements in the potato virus X RNA 5'-untranslated ab-leader on its translation enhancing activity. Journal of General Virology 74,2717-2724.

15. Solovyev A.G., Novikov V.K., Merits A., Savenkov E.I., Zelenina D.A., Tyulkina L.G. and Morozov S.Yu. (1994). Genome characterization and taxonomy of Plantago asiatica mosaic potexvirus. Journal of General Virology 75,259-267.

16.Kruse M., Koenig R., Hoffmann A., Kaufmann A., Commandeur U., Soiovyev A.G., Savenkov E.I. and Burgermeister W. (1994). Restriction fragment length polymorphism analysis of reverse transcription-PCR products reveals the existence of two major strain groups of beet necrotic yellow vein virus. Journal of General Virology 75,18351842.

17.Denisenko O.N., Fedorkin O.N., Zelenina D.A, Solovyev A.G. and Morozov S.Yu.

1994). Analysis of the probable functioning of the small positively-charged protein encoded by the area overlapping transport protein and coat protein genes of tobacco mosaic virus. 4th International Congress of Plant Molecular Biology, Amsterdam. Abstracts, N1501.

18.Solovyev A.G., Savenkov E.V., Morozov S.Yu., Agranovsky A.A. and Atabekov J.G. (1994). Conserved and diverged elements in RNAß of three hordeiviruses. 4"1 International Congress of Plant Molecular Biology, Amsterdam. Abstracts, N1505.

19.Solovyev A.G., Savenkov E.V., Agranovsky A.A. and Morozov S.Yu. (1994). Nucleotide sequence and comparative analysis of RNAß in poa semilatent virus and lychnis ringspot virus: a putative role of the triple gene block as a determinant of hordeivirus host specificity. International conference "Fundamental and applied problems in phytopathology", Yalta. Abstracts, p.15.

20. Solovyev A.G. (1995). Movement proteins of plant viruses. Conference on virus diseases of Poaceae in Europe, Versalles. Abstracts, p.1.

21.Solovyev A.G., Savenkov E.I., and Grdzelishvili V.Z. (1995). Role of triple gene block proteins of barley stripe mosaic virus and poa semilatent virus in determination of hordeiviruses symptom expression. Conference on virus diseases of Poaceae in Europe, Versalles. Abstracts, p.43.

22.Solovyev A.G., Zelenina D.A., Savenkov E.I., Grdzelishvili V.2., Morozov S.Yu., Lesemann D.-E., Maiss E., Casper R., and Atabekov J.G (1996). Movement of a barley stripe mosaic virus chimera with a tobacco mosaic virus movement protein. Virology 217,436-441.

23.Morozov S.Yu., Solovyev A.G., Zelenina D.A., Savenkov E.I., Grdzelishvili V.Z., and Atabekov J.G (1996). Cell-to-cell transport of the barley stripe mosaic virus with replacement of the triple gene blockfor the foreign movement protein genes. Xth International Congress of Virology, Jerusalem, Israel. Abstracts, W05-2.

24.Solovyev A.G., Zelenina D.A., Savenkov E.I., Grdzelishvili V.Z., Morozov S.Yu., and Atabekov J.G (1996). Comparative studies of the gene srtucture and function between different hordeiviruses. X International Congress of Virology, Jerusalem, Israel. Abstracts, PW05-8.

25.Solovyev A.G., Savenkov E.I., Agranovsky A.A., and Morozov S.Yu. (1996). Comparisons of the genomic c/s-elements and coding regions in RNAp components of the hordeiviruses barley stripe mosaic virus, lychnis ringspot virus, and poa semilatent virus. Virology 219, 9-18.

26.Dobrov E.N., Abu-Eid M.M., Solovyev A.G., Kust S.V. and Novikov V.K. (1997). Properties of the coat protein of a new tobacco mosaic virus coat protein ts-mutant. Journal of Protein Chemistry 16,27-36.

27. Solovyev A.G., Zelenina D.A., Savenkov E.I., Grdzelishvili V.Z., Morozov S.Yu., E. Maiss, R. Casper, and Atabekov J.G. (1997). Host-controlled cell-to-cell movement of a hybrid barley stripe mosaic virus expressing a dianthovirus movement protein. Iritervirology 40,1-6.

28. Savenkov E. I., Solovyev A. G., and Morozov S. Y. (1998). Genome sequences of poa semilatent and lychnis ringspot hordeiviruses. Archives of Virology143,1379-1393.

29.Morozov S.Yu., Solovyev A.G., Fedorkin, O.N., Savenkov E. I., Kalinina, N.O., Samuilova, O.V., J. Schiemann, and Atabekov, J.G. (1998). Studies on the functional properties of the movement proteins encoded by the triple gene block. International Symposium "Molecular mechanisms of stress responses in plants", Moscow, Russia. Abstracts, S5-p.90.

30.Samuilova, O. V., Kalinina, N. O., Solovyev, A. G., Savenkov, E. I., and Morozov, S. Yu. (1998). Mapping of NTPase domain in TGBpl protein of hordei- and potexviruses. P.167, Abstracts of 17th Annual Meeting of American Society of Virology, University of British Columbia, Vancouver, Canada, July 1998.

31.Solovyev, A.G., Savenkov, E.I., Grdzelishvili, V.Z., Kalinina, N.O., Morozov, S.Yu., Schiemann, J., and Atabekov J.G. (1999). Movement of hordeivirus hybrids with exchanges in the triple gene block. Virology 253,278-287.

32.Atabekov J.G., Malyshenko, S.I., Morozov, S.Yu., Taliansky, M.E., Solovyev, A.G., Agranovsky, A.A., and Shapka, N.A. (1999). Identification and study of tobacco mosaic virus movement function by complementation tests. Phil. Trans. R. Soc. Lond. 354, 629-635.

33.Morozov, S.Yu. and Solovyev, A.G. (1999). Genome organization in RNA viruses. In Molecular Biology of Plant Viruses (C. L. Mandahar, ed.), Kluwer Academic Publishers: Boston/Dordrecht/London, pp. 47-98.

34. Morozov, S. Yu., Solovyev, A. G., Kalinina, N. O., Fedorkin, O. N., Samuilova, O. V„ Schiemann, J., and Atabekov, J. G. (1999). Evidence for two nonoverlapping functional domains in the potato virus X 25K movement protein. Virology 260, 55-63.

35.Solovyev, A. G., Zamyatnin, A. A., Straganova, T. A., Fedorkin, 0. N., Morozov, S. Yu. Schiemann, J., and Atabekov, J. G. (1999). Functional interactions of triple gene block movement proteins: TGBp3-assisted subcellular targeting of TGBp2. Xilh International Congress of Virology, Sydney, Australia, August 9-13.

36.Solovyev, A. G., Stroganova, T. A., Zamyatnin, A. A., Schiemann, J., Morozov, S. Yu. (1999). Functional interaction of triple gene block movement proteins: Cooperative subcellular sorting of poa semilatent virus membrane proteins. 7th Symposium "New aspects of resistance research on cultivated plants", Aschersleben, Germany, November 17-18.

37.Morozov, S. Yu., Solovyev, A. G., Kalinina, N. O., Rakitina, D„ Yelina, N.E., Fedorkin, O. N., Schiemann, J., and Atabekov, J. G. (1999). Structural and functional analogies in plant virus movement proteins. 7th Symposium "New aspects of resistance research on cultivated plants", Aschersleben, Germany, November 17-18.

38.Solovyev, A. G., Stroganova, T. A., Zamyatnin Jr, A. A., Fedorkin, 0. N., J. Schiemann, and Morozov, S. Yu. (2000). Subcellular sorting of small membrane-associated triple gene block proteins: TGBp3-assisted targeting of TGBp2. Virology 269,113-127.

39. Fedorkin, O. N., Merits, A., Lucchesi, J., Solovyev, A. G., Saarma, M., Morozov, S. Yu., and MSkinen, K. (2000). Complementation of the movement-deficient mutations in potato virus X: potyvirus coat protein mediates cell-to-cell trafficking of C-terminal truncation but not deletion mutant of potexvirus coat protein. Virology 270, 31-42.

40.Lawrence, D. M„ Solovyev, A. G., Morozov, S. Yu., Atabekov, J. G., and Jackson, A. O. (2000). Hordeiviruses. In Virus Taxonomy. Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses, (van Regenmortei, M. H. V., Fauquet, C. M., Bishop, D. H. L„ Carstens, E. B., Estes, M. K., Lemon, S. M., Maniloff, J., Mayo, M. A., McGeoch, D. J., Pringle, C. R., and Wickner, R. B. eds), pp. 899-904. Academic Press, London.

41. Fedorkin, O. N., Solovyev, A. G., Yelina, N. E„ Zamyatnin Jr, A. A., Zinovkin, R. A., MSkinen, K., Schiemann, J., and Morozov, S. Yu. (2001). Cell-to-cell movement of potato virus X involves distinct functions of the coat proteins. Journal of General Virology 82,449-458.

42. Solovyev, A. G., Zamyatnin Jr., A. A., Gorshkova, E. N., Erokhina, T.N., Schiemann, J., Morozov, S. Yu., and Atabekov, J.G. (2001). Subcellular targeting of membrane proteins encoded by triple gene block of poa semilatent hordeivirus. 6th International Symposium on Positive Strand RNA Viruses, Paris, France, May 28 - June 2.

43.Kalinina, N. O., Rakitina, D. A., Yelina, N. E., Zamyatnin Jr., A. A., Stroganova, T. A., Klinov, D. V., Prokhorov, V. V., Ustinova, S. V., Chernov, B. K„ Schiemann, J., Solovyev, A. G., and. Morozov, S. Yu. (2001). RNA-binding properties of the 63-kDa protein encoded by the triple gene block of poa semilatent hordeivirus. Journal of General Virology 82,2569-2578.

44.Zamyatnin Jr., A. A., Solovyev, A. G., Sablina, A. A., Agranovsky, A. A., Katul, L„ Vetten, H. J., Schiemann, J., Hinkkanen, A. E., Lehto, K. and Morozov, S. Yu. (2002). Dual-colour imaging of membrane protein targeting directed by poa semilatent virus movement protein TGBp3 in plant and mammalian cells. Journal of General Virology 83,651-662.