Исследование молекулярных механизмов и регуляции биосинтеза белка у растений тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, доктор биологических наук в форме науч. докл. Искаков, Булат Кудайбергенович

• Искаков, Булат Кудайбергенович
• доктор биологических наук в форме науч. докл.
• 1997

Оглавление диссертации доктор биологических наук в форме науч. докл. Искаков, Булат Кудайбергенович

Актуальность проблемы. Изучение механизмов и регуляции биоситеза белка - одна из главных задач молекулярной биологии. Контроль экспрессии генов на уровне трансляции матричных (м)РНК у прокариот известен уже на протяжении многих лет и лишь относительно недавно был надежно продемонстрирован на молекулярном уровне для эукариотических организмов. В настоящее время уже хорошо описано несколько примеров трансляционного контроля экспрессии генов в эукариотических клетках: мРНК гена С€N4 у дрожжей; мРНК белков теплового шока 22 кДа и 70 кДа у ОюяорИНа; мРНК ферритина и трансферринового рецептора, а также многие мРНК вирусов животных и растений. Изучение этих примеров показало, что первичная структура мРНК заключает в себе не только информацию о кодируемом белке, но и полный набор сведений о самой мРНК как о функционирующей молекуле. Информация второго рода расшифровывается труднее и далеко не все элементы структуры, существенные для функционирования мРНК, выявлены в настоящее время. Даже в тех случаях, когда они известны, чаще всего не ясно, каким компонентам транслирующего аппарата адресована эта информация и как она распознается и реализуется.

Многочисленные работы последних лет показывают, что важную роль в модуляции эффективности трансляции мРНК играют их 5'-нетранслируемые последовательности (5'-НТП). Основными структурными чертами 5'-НТП, влияющими на эффективность трансляции эукариотических мРНК, являются: наличие и стабильность вторичной структуры; присутствие и взаимное погттЛт,ожение "ложных" инициирующих кодонов и соответствующих им .ыТых рамок трансляции; определенное нуклеотидное окружение вблизи ложных" и "истинных" инициирующих кодонов; доступность 5'-концевой ¡(-структуры мРНК.

Однако, несмотря на очевидную значимость, ни одна из этих черт, ни даже 11 озокупность не могут охватить всего многообразия факторов, регулирующих ; | " ансляцию мРНК в эукариотических клетках. Большая роль в этом отводится мому аппарату трансляции. Из 12 белковых факторов инициации трансляции ¡ул^рцот (еГР) некоторые (е1Р4Е, -4Г, -4А) могут связываться с 5'-концевой ; -структурой и участвовать в АТФ-зависимом расплетании вторичной эуктуры 5'-НТО мРНК. Активность факторов трансляции (е!Р2, -4В, -4Е,

4F, eEFl, eEF2) может регулироваться посредством ковалентных модификаций. Кроме того, в последнее время появляются работы по изучению низкомолекулярных РНК и вторичных продуктов метаболизма, которые, по-видимому, могут участвовать в регуляции процесса трансляции. Следует помнить также, что мРНК в эукариотических клетках находятся в комплексе со специфическими белками, образуя рибонуклеопротеидные комплексы -информосомы, и что белки информосом также могут регулировать эффективность трансляции мРНК.

Таким образом, эукариотические мРНК транслируются с различными эффективностями как in vivo, так и in vitro. Молекулярные механизмы такой неравной трансляции еше не выяснены, однако экспериментальные данные свидетельствуют, что в их основе лежит взаимодействие мРНК с компонентами белок-синтезирующего аппарата. Влияние eis- и írans-действующих регуляторных факторов на эффективность трансляции мРНК у растений изучено гораздо слабее, чем у животных.

Хотя основные пути биогенеза мРНК и этапы их трансляции в клетках животных и растений сходны, исследования последних лет свидетельствуют, что между ними имеется существенная разница в механизмах регуляции биосинтеза белка. Как показано в работах нескольких групп исследователей, многие белковые факторы трансляции растений отличаются от своих аналогов из клеток животных по структуре и не являются взаимозаменяемыми в гетерологичных бесклеточных системах синтеза белка. Нами впервые показано, что в растительных системах, по-видимому, отсутствует регуляция синтеза белка посредством фосфорилирования факторов инициации eíF2 и элонгации eEF2, надежно установленная и хорошо изученная для клеток животных.

Все эти факты свидетельствуют, что молекулярные механизмы и регуляция биосинтеза белка у растений требуют самостоятельного детального изучения. Знание этих механизмов позволит направленно создавать растения с качественно новыми хозяйственно-ценными признаками, открывает возможность для борьбы с вирусными заболеваниями.

Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена изучению молекулярных механизмов и регуляции биосинтеза белка в клетках высших растений с целью поиска механизмов трансляционного контроля, характерных для клеток растений, а также с целью сравнения их с таковыми у клеток животных и выявления возможных различий между ними.

В задачи исследования входило:

1. Выделение, характеристика белковых факторов инициации (eIF2) и элонгации (eEF2) трансляции из зародышей пшеницы и изучение регуляции их активностей посредством фосфорилирования.

2. Поиск продуктов вторичного метаболизма растений, обладающих способностью специфически влиять на процесс трансляции, и изучение механизма их действия.

3. Идентификация и характеристика преинициаторных трансляционных комплексов в экстрактах зародышей пшеницы и выяснение причин их накопления.

4. Поиск и характеристика малых шггошшматических РНК клеток зародышей пшеницы. Изучение их биогенеза, свойств и возможных функций в регуляции трансляции.

Научная новизна и практическая ценность работы. Основным достижением данной работы представляется проведенное впервые широкое и систематическое исследование молекулярных механизмов регуляции биосинтеза белка у растений в сравнении с таковыми у животных. Установлено, что между ними имеются существенные различия. Кроме того, данные, полученные в настоящей работе, свидетельствуют, что в клетках растений могут функционировать специфические, отличные от животных, механизмы трансляционного контроля.

Впервые изучены параметры взаимодействия фактора инициации трансляции e!F2 зародышей пшеницы с GDP и GTP. Измеренные константы диссоциации этих комплексов свидетельствуют, что сродство фактора eIF2 растений к GDP лишь в 10 раз выше, чем к GTP, в то время как в клетках животных это превышение оценивается в 100-300 раз. Эти результаты свидетельствуют, что механизм регуляции активности растительного фактора eIF2 может существенно отличаться от механизма регуляции аналогичного фактора клеток животных, а также во многом объясняют отсутствие ингибирующего действия низких концентраций двуспиральных (дс)РНК на синтез белка в клетках растений.

Также впервые показано, что фактор элонгации 2 (eEF2) из зародышей пшеницы способен фосфорилироватьея в условиях in vitro посредством eEF2-специфичной Са2+/калмодулин-зависимой киназы, полученной из ретикулоцитов кролика. При этом фосфорилированный фактор eEF2 зародышей пшеницы теряет свою активность в бесклеточной системе трансляции так же как и его фосфорилированный животный аналог. Однако в экстрактах из различных растительных объектов не удалось обнаружить эндогенной eEF2-фосфоршшрующей активности. Эти данные свидетельствуют что, хотя активность фактора eEF2 растений потенциально может регулироваться фосфорилированием, данный механизм регуляции, по-видимому, не реализуется в клетках растений.

Впервые обнаружено, что полипроантоцианидин (И ПА) - полифенольное соединение из верблюжьей колючки Alhagi kiigisorum S. в концентрации 1-5 мкМ практически полностью ингибирует синтез белка в бесклеточных системах трансляции, специфически связываясь с фактором eIF2 и блокируя его способность формировать тройной комплекс [GTP*eIF2*Met-tRNAj |. Эти данные свидетельствуют, что вещества вторичного метаболизма могут играть важную роль в регуляции белкового синтеза в клетках растений.

Впервые в клетках высших растений обнаружены 45S рибонуклео-протеидные (РНП) частицы, содержащие значительное количество быстрометящейся н о во с и н тез и ро r а н н о й РНК, обладающей матричной активностью. Изучение компонентного состава и физико-химических свойств 45S частиц свидетельствует, что они представляют собой 48S преинициаторные трансляционные комплексы, содержащие 40S рибосомные субчастицы, факторы инициации, GTP, Met-tRNA¡ и мРНП. Накопление таких комплексов в цитоплазме клеток растений указывает на существование факторов, контролирующих последовательность этапов инициации после связывания мРНП с 40S, но до присоединения 60S субчастиц.

Впервые в составе 45S РНП частиц зародышей пшеницы обнаружена малая РНК длиной около 135 нуклеотидов (обозначенная как 5,3S РНК). Показано, что 5,3S РНК локализуется также в полисомах и 80S рибосомах, но не обнаруживается в безрибосомных субклеточных фракциях. После диссоциации 80S рибосом в буфере с высокой ионной силой 5,3S РНК остается в комплексе с 40S субчастицей.

Установлено, что при нормальной температуре (25°С) 5,3S РНК присутствует в составе лишь 5-10% рибосом, тогда как после теплового шока (1ч при 37°С) ее количество увеличивается в 5 раз и от 25 до 50% рибосом становятся 5,3S РНК-содержащими. Кроме того установлено, что выделенная 5,3S РНК прочно и специфически связывается с фактором инициации eIF2, но не взаимодействует с элонгационным фактором eEF2. Эти данные свидетельствуют, что 5,3S РНК может участвовать в регуляции синтеза белка у зародышей пшеницы при тепловом шоке на уровне инициации трансляции.

Работа имеет теоретическое и методическое значение для последующих исследований по выяснению регуляторных механизмов биосинтеза белка и представляет интерес для специалистов в области молекулярной биологии, вирусологии и физиологии растений. Обнаруженное ингибирующее действие ППА на функцию фактора eIF2 предполагает возможность использования его в качестве тонкого инструмента при изучении механизмов и регуляции трансляции в эукариотических бесклеточных системах, поскольку он весьма специфично ингибирует функцию фактора eIF2 как зародышей пшеницы, так и ретикулоцитов кролика. Очищенный препарат ППА передан для проведения научно-исследовательских работ в лаборатории Техасского Университета (г. Остин, США) и Кентского Университета (г. Кантербери, Англия). Очищенные препараты факторов eIF2, eIF4E, eEF2 зародышей пшеницы передавались в различные научно-исследовательские лаборатории в России: Институт белка PAII, МГУ им, М. В. Ломоносова, Новосибирский Институт биоорганической химии, а также в других странах: Кентский Университет (Англия), Институт Фридриха Миш ера (Швейцария). В эти же, а также во многие другие организации передавался высококачественный экстракт из зародышей пшеницы, который использовался для in vitro трансляции.

Структура работы. Диссертация изложена в форме научного доклада. Материалы, использованные в диссертации, получены самостоятельно и в соавторстве с сотрудниками лаборатории белка и нуклеиновых кислот Института молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина - С.К.Смаиловым, С.М.Шайхиным, А.В.Ли, Е.В.Кожановым, Н.С.Полимбетовой, К.И.Мадиным, С.Ш.Жаныбековой. Всем коллегам автор выражает благодарность. Особую благодарность автор приносит академику А. С. Спирину за поддержку и постоянный интерес к данной работе.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены на многих конференциях и симпозиумах, в том числе: 14-м Международном конгрессе по биохимии (Прага, 1988); Международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1989); 19-й конференции ФЕБО (Рим, 1989); Международном симпозиуме "Регуляция трансляции" (Рига, 1989); Республиканской конференции "Современные проблемы физико-химической биологии и биотехнологии" (Алма-Ата, 1989); 10-м Советско-Французском симпозиуме "Организация и экспрессия геномов эукариот и прокариот" (Киев, 1990); 2-м съезде

Всесоюзного общества физиологов растений (Минск, 1990); 3-м Всесоюзном симпозиуме "Клеточные механизмы адаптации" (Чернигов, 1991); 14th International tRNA Workshop (Ридзина, Польша, 1991); Всесоюзной конференции "Генетические механизмы устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды" (Иркутск, 1991); Международной конференции "Protein biosynthesis" (Пущино, 1991); 2-м Всесоюзном симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии" (Самарканд, 1991); 1-м Всесоюзном симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пущино,

1991); 3-й конференции "Translational Control" (Колд Спринг Харбор, США,

1992); 2-м Российском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пущино, 1993); 4-м Международном конгрессе по молекулярной биологии растений (Амстердам, Нидерланды, 1994); Международной конференции "Baev memorial conference" (Москва, 1996); "Translational control" (Колд Спринг Харбор, США, 1996); Международном симпозиуме по стрессу и ассимиляции неорганического азота (Москва, 1996); 10-м вирусологическом конгрессе (Иерусалим, Израиль, 1996).

Диссертация обобщает результаты 28 экспериментальных работ, опубликованных в отечественных и зарубежных журналах, а также в монографии "Информосомы растений" (М.А. Айтхожин, Б.К. Искаков). Работа выполнена при финансовой поддержке Академии наук Казахстана, Международного научного фонда (грант MYH000), фонда INTAS (грант 93-2549).

Использованные сокращения. 40S СЧ. 60S СЧ - 40S и 60S субчастицы рибосом; 5'-НТП - 5'-нетранслируемая последовательность мРНК; БТШ - белки теплового шока; ДС-Na - додецилсульфат натрия; дсРНК - двуспиральная РНК; НАД - никотинамидадениндинуклеотид; ПААГ - полиакриламидный гель; ППА - полипроантоцианидин; РНП - рибонуклеопротеид; ФМСФ -фенилметилсульфонилфторид; ЭДТА - этиле идиаминтетрауксусная кислота; eEF - эукариотический фактор элонгации трансляции; meEF - eEF млекопитающих; peEF - eEF растений; elF - эукариотический фактор инициации трансляции; eIF2(aP) - фактор eIF2, фосфорилированный по а-субъединице; melF - elF млекопитающих; ре IF - elF растений; HRI - гемин-регулируемый ингибитор (протеинкиназа, активируемая при дефиците гемина); Met-tRNA, - инициаторная тРНКМет, ацидированная метионином; р! - изоэлектрическая точка: PKR -протеинкиназа, активируемая дсРНК; mPKR - PKR млекопитающих; pPKR -PKR растений.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. РЕГУЛЯЦИЯ СИНТЕЗА БЕЛКА В КЛЕТКАХ РАСТЕНИЙ НА

УРОВНЕ БЕЛКОВЫХ ФАКТОРОВ ТРАНСЛЯЦИИ

Синтез белка в клетках про- и эукариот представляет собой комплексный процесс, состоящий из многих стадий и включающий в себя большое число компонентов. Собственно синтез полипептидов обеспечивается рибосомными субчастицами, с которыми взаимодействуют трансляционные ферменты (факторы инициации, элонгации и терминации), мРНК и аминоацил-тРНК.

Среди белков, входящих в состав аппарата трансляции эукариотических клеток, идентифицировано более, чем 20 фосфопротеинов, (J. W. В. Hershey, 1989, J.Biol.Chem., Vol. 264, рр.20823-20826). Это указывает, что их фосфорилирование/дефосфорилирование может служить механизмом регуляции трансляции. Действительно, в ретикулоцитах кролика впервые были обнаружены и охарактеризованы механизмы регуляции активности двух ключевых факторов трансляции - фактора инициации 2 (eIF2) и фактора элонгации 2 (eEF2). Оба механизма основываются на фосфорилировании факторов специфическими протеинкиназами, что сопровождается ингибированием синтеза белка. Эти механизмы были позднее обнаружены и в других клетках животных, а также у дрожжей, что позволило считать фосфорилирование eIF2 и eEF2 универсальными механизмами регуляции трансляции для всех эукариотических клеток.

Процесс трансляции для растительных объектов изучен значительно слабее, и предполагается, что он регулируется так же, как и в клетках животных. Однако, в последнее время стали накапливаться данные, свидетельствующие о различиях в трансляционных аппаратах животных и растительных клеток. Например, было показано, что некоторые, функционально аналогичные, факторы трансляции из зародышей пшеницы и из ретикулоцитов кролика существенно различаются по структуре и не могут полностью заменять друг друга в гетерологичных бесклеточных системах трансляции (R.D. Abramson, et al., 1988, J.Biol.Chem., Vol. 263, pp. 5462-5467).

До начала нашей работы молекулярные механизмы регуляции процесса трансляции в клетках высших растений были мало изучены. Эти обстоятельства побудили нас исследовать регулируются ли активности факторов eIF2 и eEF2 растений подобно тому, как это имеет место в клетках животных.

1.1. Изучение регуляции активности фактора инициации 2 растений (peIF2). 1.1.1. Выделение и характеристика фактора pelF2 зародышей пшеницы.

Одной из ранних стадий инициации трансляции всех мРНК является связывание инициаторной метионил-тРНК (Met-tRNAj) с 40S рибосомной субчастицей. Фактор eIF2 является ключевым белком этого процесса, а тройственный комплекс [GTP*eIF2*Met-tRNAi| - обязательным интермедиатом, в составе которого Met-tRNAj переносится на 40S субчастицу.

С использованием модифицированного метода очистки (S. M. Shaikhin et al., 1992, Biochimie, Vol. 74, pp. 447-454) нами были выделены препараты eIF2 из ретикулоцитов кролика (meIF2) и из зародышей пшеницы (peIF2). Относительная молекулярная масса (Мг) нативного фактора peIF2 была определена методом гель-фильтрации и составила приблизительно 150000. По данным электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) с додецил-сульфатом натрия (ДС-Na) препарат peIF2 содержит четыре полипептида с Мг 37000 (р37), 40000 (р40), 42000 (р42), 52000 (р52) (рис. 1). Денситометрическое сканирование геля показало, что эти полипептиды находятся в соотношении .1 : 0,6 : 0,2 : 0,9, соответственно.

- рГ.У

-

-

- 30 к I •

Рис. 1. Электрофорез очищенных препаратов eIF2:

1 - melF2 ретикулоцитов кролика;

2 - peIF2 зародышей пшеницы;

3 - маркерные полипептиды (указаны их молекулярные массы в кДа).

Весьма вероятно, что полипептвд р40 фактора peIF2 является продуктом частичного протеолиза полипептида р42 (J. О. Langland et al., 1996, J.Biol.Chem., Vol. 271, pp. 4539-4544, К. S. Browning and A. M. Metz, неопубликованные данные).

Принимая во внимание это обстоятельство, можно считать, что фактор peIF2 состоит из трех субъединиц: р37, р42 и р52, в соотношении близком к 1:1:1. Аналогичный фактор ретикулоцитов кролика (raeIF2) также состоит из трех субъединиц с Мг 36000 (а), 38000 (Р) и 52000 (у). Недавно, при сравнении нуклеотидных последовательностей кДНК субъединиц факторов peIF2 и melF2, было выявлено, что субъединица р42 фактора peIF2, по-видимому, функционально соответствует а-субъединице фактора meIF2, р37 - (3-субъединице, а р52 - у-субъединице (К. S, Browning, 1996,Plant Mol.Biol., Vol.32, pp.107-144). Вместе с тем, следует отметить, что монокяональные антитела к каждой из субъединиц фактора meIF2 не взаимодействуют ни с одной из субъединиц фактора peIF2 (А. В. Ли, Б. К. Искаков и К. Г. Прауд, неопубликованные данные), что указывает на существенные различия в структуре eIF2 животных и растений.

1.1.2. Фосфорширование peIF2 и регуляция его активности.

Хорошо известно, что аминокислотный остаток Сер-51 а-субъединицы фактора eIF2 клеток млекопитающих (meIF2) является мишенью для фосфорилирования посредством по крайней мере двух специфических протеинкиназ: 1) HR1 - протеинкиназа, активируемая автофосфорилированием при дефиците гема (в ретикулоцитах), а также при многих стрессовых воздействиях, таких как тепловой шок, голодание по аминокислотам, глюкозе, и др. (R. Е. Rhoads, 1993, J.Biol.Chem., Vol. 268, рр.3017-3020; J.-J. Chen and L M. London, 1995, TIBS, Vol. 20, pp.105-108). 2) PKR - протеинкиназа, индуцируемая интерфероном и активируемая автофосфорилированием в присутствии низких концентраций (10 - 50 нг/мл) двуспиральных (дс)РНК (R. Е. Rhoads, 1993; R.C. Wek, 1994, TIBS, Vol. 19, pp.491-496). Недавно у дрожжей была обнаружена еще одна протеинкиназа (GCN2) с аналогичной субстратной специфичностью, которая активируется в условиях аминокислотного голодания (A. G. Hinnebusch, 1994, TIBS, Vol. 19, рр.409-414).

Фосфорилирование а-субъединицы фактора eIF2 ингибирует обмен GDP на GTP, катализируемый фактором eIF2B. Фактор eIF2B не может стимулировать GDP/GTP-обмен на фосфорилированном elF2; кроме того бинарный комплекс [eIF2(aP)*GDP|, содержащий фосфорилированный eIF2, имеет значительно большее сродство к фактору eIF2B, чем нефосфоршшрованый ¡elF2*GDP|. Поскольку фактора eIF2 содержится в клетке в 3-6 раз больше чем фактора eIF2B, то фосфорилирование лишь 1530% молекул eIF2 приводит к связыванию всех молекул eIF2B и прекращению образования новых тройственных комплексов |GTP*eIF2*Met-tRNAj], что в свою очередь приводит к полному блокированию инициации трансляции и остановке синтеза белка(М.1.Clemens, 1994, Mol.Biol. Rep., Vol.19, pp20l-210).

В настоящее время не ясно, функционирует ли подобный механизм регуляции трансляции посредством фосфорилирования фактора el F2 в клетках высших растений.

Нами была исследована способность фактора peIF2 служить в качестве субстрата для фосфорилирования посредством выделенной из ретикулоцитов кролика протеинкиназы - mPKR, активируемой дсРНК (рис. 2). Инкубация очищенного препарата mPKR в присутствии |-у-32Р|АТР и 10 нг поли(1):поли(С) приводила к ее активации и автофосфорилированию (рис. 2, дорожка 1). При добавлении в инкубационную смесь очищенного препарата фактора melF2 (ретикулоцитов кролика), как и следовало ожидать, происходит фосфорилирование его а-субъединицы (дорожка 2). У фактора peIF2 (зародышей пшеницы) mPKR-киназа фосфорилирует полипептиды р40 и р42 (рис. 2, дорожка 3).

Рис.2. Фосфорилирование факторов meIF2 и peIF2 протеинкиназой mPKR из ретикулоцитов кролика. Препараты инкубировали в присутствии |у-32Р| АТР и 10 нг поли(1):поли(С), затем проводили электрофорез и радиоавтографию. 1 - mPKR-киназа; 2 - mPKR-киназа + meIF2; 3 - mPKR-киназа + peíF2. Указаны положения mPKR-киназы и субъединиц факторов.

- т -vKM-m -у — 1>; мт — р1;'

Ш— р-н) — а — р:г/

Полученные нами результаты согласуются с данными нескольких групп исследователей о фосфорилировании полипептидов р40/42 фактора peIF2 посредством как экзогенной HRI-киназы ретикулоцитов кролика (R. Benne et al, 1980 a, Eur.J.Biochem., Vol.104, pp.109-117; R. D. Clarke and R. S. Ranu, 1987, Mol.Cell.Biochem., Vol.74, pp. 129-135; N. Janaki et al., 1995, Arch.Biochem.Biophys., Vol.342, pp.1-8), так и эндогенными протеинкиназами растений (К. S, Browning et al., 1985, Plant Physiol, Vol.77, pp.370-373).

Принимая во внимание недавнее сообщение о том, что субъединица р42 фактора peIF2, по-видимому, функционально соответствует а-субъединице фактора melF2 (К. S. Browning, 1996,Plant Mol.Biol., Vol.32, pp. 107-144), можно предположить, что в клетках растений возможно существование механизма контроля синтеза белка, в основе которого лежит фосфорилирование фактора peIF2. Однако это предположение не согласуется с тем обстоятельством, что ни в одной из упомянутых работ фосфорилирование субъединиц фактора peIF2 не сопровождалось заметным ингибированием трансляции в бесклеточной системе из зародышей пшеницы. Некоторые авторы сделали заключение, что в зародышах пшеницы, по-видимому, не функционирует гемин-контролируемая система регуляции трансляции (R. Benne et al, 1980, Eur J. Biochem., Vol. 104, pp.501-509; R. D. Clarke and R. S. Ranu, 1987).

Известно, что в бесклеточной системе трансляции, выделенной из ретикулоцитов кролика, в присутствии небольших количеств дсРНК происходит активация PKR-киназы, которая фосфорилирует а-субъединицу meIF-2, что в свою очередь приводит к ингибированию белкового синтеза. Нам представлялось интересным выяснить, как влияет присутствие дсРНК на бесклеточную систему трансляции из зародышей пшеницы.

На рисункеЗ показана зависимость эффективности трансляции РНК вируса табачной мозаики (ВТМ) от количества поли(1) : поли(С), вносимого в бесклеточные системы трансляции из зародышей пшеницы (кривая 1) и из ретикулоцитов кролика (кривая 2). Трансляция в бесклеточной системе из ретикулоцитов кролика значительно ингибировалась при концентрации дсРНК около 10 нг/мл, тогда как на систему из зародышей пшеницы присутствие дсРНК во всем испытанном диапазоне концентраций (1 нг/мл - 1 мкг/мл) не оказывало существенного влияния.

Рис. 3. Влияние дсРНК на трансляцию РНК ВТМ в бесклеточных системах из зародышей пшеницы (1) и ретику-лоцитов кролика (2).

Отсутствие заметного влияния низких концентраций дсРНК на трансляцию в бесклеточной системе из зародышей пшеницы, показанное в настоящей работе, согласуется с аналогичными результатами других авторов (L. Raijnders et al., 1975, Biochim.Biophys.Acta, Vol.390, pp.69-77; L. K. Grill et al., 1976, Biochem.Biophys.Res.Corrumm., Vol.73, pp. 149-i56) и указывает на то, что в клетках зародышей пшеницы, по-видимому, не функционирует система рефляции трансляции посредством фосфорилирования фактора peIF2.

Единственным свидетельством в пользу существования подобной системы в клетках растений являются работы Д. Рота с соавторами, в которых наблюдалось фосфорилирование белка с Мг 68000 (р68) в тканях табака, зараженных ВТМ (С. J. Crum et al., 1988, J.Biol. Chem,, Vol.263, pp. 1344013443). Поскольку фосфорилирование p68 усиливалось в присутствии дсРНК и, кроме того, этот белок взаимодействовал с антителами на PKR-киназу клеток млекопитающих (mPKR), авторы сделали вывод о функциональной идентичности белка р68 (pPKR) с mPKR. Действительно, позднее было показано, что pPKR, также как и mPKR, способна специфически фосфорилировать р42-субъединицу фактора pelF2 зародышей пшеницы и, что in vifro-фосфорилированный (только посредством mPKR) фактор peIF2 ингибировал трансляцию в бесклеточной системе зародышей пшеницы (J. О. Langland et al., 1996, j.Biol.Chem., Vol. 271, pp. 4539-4544). Следует отметить, однако, что для активации pPKR требовались в 1000 раз более высокие концентрации дсРНК (10-100 мкг/мл), чем для активации mPKR (10-50 нг/мл) и, что ингибирующий эффект дсРНК на in vitro-трансляцию в системе из зародышей пшеницы не всегда воспроизводился. Хотя растительный аналог фактора eIF2B до сих пор не обнаружен, тем не менее авторы считают, что в л н о о х л

100 80604020

Hi&O-O-O-О

О 0.2 0.4 0.6 0.8 1 [дсРНК], мкг/мл клетках растений имеются все компоненты, необходимые для функционирования механизма регуляции синтеза белка посредством фосфорилирования фактора peIF2.

Таким образом, данные по влиянию дсРНК на синтез белка в растительных системах противоречивы, а вопрос о наличии в клетках растений регуляторного механизма, основанного на фосфорилировании фактора peIF2, остается пока открытым.

1.1.3.Изучение кинетических параметров взаимодействия peIF2 с GDP и GTP

После каждого цикла инициации фактор eIF2 остается в составе неактивного и прочного комплекса с GDP [eIF2*GDP|. Для того, чтобы e!F2 мог участвовать в следующем цикле, связанная молекула GDP должна быть заменена на GTP. Этот обмен не может протекать самопроизвольно, так как сродство фактора к GDP в клетках животных на 2 порядка выше, чем к GTP, и осуществляется при помощи вспомогательного фактора eIF2B. Фактор eIF2B образует комплекс с [e!F2*GDP], который легко диссоциирует на |eIF2*eIF2B] и GDP. Константы диссоциации комплексов [eIF2*clF2B| с GTP либо GDP составляют 1.7 х НИ М и 1.8 х Ю-7 М, соответственно (В. Safer, 1983, Cell, Vol.33, pp.7-8). Поскольку физиологические концентрации GTP и GDP в клетке соотносятся как 10:1 (R. A. de Abreu, et al, J.Chromatogr., Vol.227, pp.45-52) то, при равном сродстве к гуаниловым нуклеотидам, реакция будет сдвигаться в сторону образования активного комплекса с GTP [eIF2*GTP] и, следовательно, процесс инициации будет протекать нормально.

Механизм регуляции функции фактора eIF2 в клетках животных посредством его фосфорилирования заключается в том, что фосфорилированный eIF2 в комплексе [e[F2(aP)*GDP] прочно связывает elF2B, вследствие чего последний становится недоступным даже для нефосфорилированных молекул eIF2: нуклеотидный обмен блокируется и инициация ингибируется. Таким образом, одним из главных условий функционирования данного механизма является намного большее сродство фактора eIF2 к GDP чем к GTP.

В связи с этим нами впервые были измерены константы диссоциации комплексов фактора peIF2 зародышей пшеницы с GDP и GTP. Полученные величины констант диссоциации составили соответственно Kd(GDP) = 1.5 х Ю-7 М и Kd(GTP) = 1.5 х Ю-6 М, т.е. сродство фактора peIF2 к GDP всего в

10 раз выше, чем к GTP, тогда как для фактора из клеток животных (meIF2) эта разница в сродстве составляет 80 - 300 раз (табл.1).

Таблица 1.

Кинетические параметры взаимодействия GTP и GDP с eiF-2 из различных объектов

Константы Источники препарата е1Рдиссоциации Асцитные клетки Ретикулоциты Зародыши комплексов опухоли Эрлихаа) кролика6) пшеницы

KdGTP, нМ

KdGDP, нМ

KdGTP/KdGDP а) R. Panniers et al., 1988, J.Biol.Chem., Vol.263, pp.5519-5525. б) G.M. Walton and G.N. Gill, 1975, Biochim.Biophys.Acta, Vol.390, pp.231-245.

Близкие величины Kd для комплексов pel F2 с гуаниловыми нуклеотидами свидетельствуют о том, что при достаточно высоком соотношении концентраций GTP к GDP обмен нуклеотидов может происходить самопроизвольно без участия дополнительного elF2B- подобного белкового фактора. Действительно, как показано на рисунке 4, уже в концентрации цМ молекулы GTP практически полностью вытесняют GDP из комплекса с фактором pel F2 зародышей пшеницы. В отличие от этого, даже в концентрации 400 дМ GTP не вытесняет GDP из прочного комплекса с фактором merF2 ретикулоцитов кролика.

Рис. 4. Замещение GDP из комплексов eIF2*[3HJGDP на GTP.

1 - peIF2 зародышей пшеницы,

2 - meIF2 ретикулоцитов кролика.

ГГгТР! IiМ

На рисунке 5 приведены данные по влиянию фактора те1Р2В ретикудоцитов на обмен гуаниловых нуклетидов в комплексах с ше1Р2 или ре1Р2. Как видно из рисунка те!Р2В значительно стимулирует ОЭР/СТР обмен на факторе те1Р2, но не оказывает влияния на аналогичный обмен в случае фактора ре!Р2. о 0.01 0.02 о.оз 0.04 0.05 0.06 2 - те!Р2 ретикулоцитов кролика. ше!Р2В, разведения

Полученные нами результаты согласуются с данными К. Рамайа и соавторов (К. ^пак1 ег а1., 1995, Агс11.ВюсЬет.Вюр11у5., Уо!.342, рр.1-8), изучавших обмен гуаниловых нуклеотидов на факторах ше!Р2 и ре!Р2 в лизатах ретикулоцитов кролика, в которых синтез белка был заингибирован в условиях дефицита тема, либо добавлением низких концентраций дсРНК. В таких лизатах функция фактора ше1Р2В нарушается вследствии активации соответственно НШ- либо тРКИ- киназ и фосфорилирования остатка Сер-51 сх-субъединицы фактора е!Р2. На ретикулоцитном факторе ше1Р2 обмен гуаниловых нуклеотидов блокировался, тогда как на пшеничном факторе ре1Р2 - происходил нормально. Эти данные также свидетельствуют, что вОР/ОТР-обмен на факторе из клеток растений может происходить независимо от того, фосфорилирован ре1Р2 или нет. Такому предположению не противоречат результаты работ, в которых не удалось обнаружить функциональных аналогов е1Р2В в растительных объектах (Б. II. Ьах ег а1., 1982, 1.В1о1.СЬет., Уо1.257, рр.8233-8237; у, (МейюШ ел а1., 1983, .Шо1.СЬет., Уо1.258, рр.8285-8289). Следовательно, можно говорить о существенном отличии механизмов регуляции активности фактора е]Р2 в зародышах пшеницы по сравнению с клетками животных.

Рис. 5. Влияние фактора mcl F2B ретикулоцитов кролика на замещение GDP из комплексов eIF2*|3H|GDP на GTP. Фактор meIF2B добавляли в указанных разведениях исходного раствора. Концентрация GTP составляла для peiF2 - 3,5 цМ, а для meIF2 -350 цМ.

1 - peIF2 зародышей пшеницы,

1,2. Изучение регуляции активности фактора элонгации 2 растений (реЕР2), 1.2.1. Выделение и характеристика фактора рсЕР2 зародышей пшеницы.

В настоящей работе, с целью получения полноразмерного и активного препарата реЕР2, в качестве ингибитора протеаз применялся фенилметидсудьфонилфторид (ФМСФ) в концентрации 1 мМ и преследовалась цель максимально сократить продолжительность процедуры выделения. Полученный препарат являлся необходимым компонентом бесклеточной поли(и)-зависимой системы синтеза полифенилаланина (см. табл. 3), что свидетельствовало о его функциональной полноценности.

По данным двумерного электрофореза (рис. 6А) реЕР2 зародышей пшеницы имеет Мг около 100000 и представлен тремя зарядовыми изомерами с ер -2 изоэлектрическими точками (р1) в интервале от 6,1 до 6,4: два главных компонента с р1 6,1 и 6,2, соответственно, и минорный - с р! 6,4. мг Ш¥ хНГ3 й

43 •30

94 -67

43 -30

Рис. 6. Двумерный электрофорез препаратов фактора реЕР2 зародышей пшеницы. А - очищенный реЕР2; са Б - реЕР2, фосфорилирован-ный теЕР2-киназой из рети-кулоцитов кролика; В - радиоавтограмма геля Б. Слева показаны положения маркерных белков, справа -положения фактора (ЕР-2) и карбоангидразы (СА).

Величины pi были определены с помощью карбамилированной карбоангидразы (Carbamylyte™, Pharmacia), которая при двумерном электрофорезе образует серию пятен с Мг 30000. Положение крайнего левого пятна соответствует pi 6,7, а у каждого следующего вправо пятна величина р! уменьшается на 0,1. Наличие нескольких зарядовых изомеров (до четырех компонентов) было также описано для фактора meEF2 из клеток животных. Причиной существования зарядовых изомеров eEF2 могут являться ковалентные модификации, такие как образование дифтамида (J. С, Chen and J. W. Bodley, 1988, J.Biol.Chem., Vol.263, pp.11692 11696), ADP-рибозилирование (Zamboni et al., 1991, Eur.J.Biochera., Vol.200, pp. 13-18) и (или) фосфорилирование (J. E. Celisetal., 1990, Proc. Nat 1.Acad.Sei.USA., Vol.87. pp.4231-4235).

1.2.2. Фосфорилирование фактора peEF2 и регуляция его активности.

С целью выяснения способности фактора peEF2 зародышей пшеницы к фосфорилированию, очищенный препарат этого фактора инкубировали с теЕГ2-кинаюй ретикулоцитов кролика в присутствии [у-3-Р]АТР и затем анализировали двумерным электрофорезом (рис. 6Б и 6В). Из электрофореграммы (рис. 6Б) видно, что в результате реакции in vitro-фосфорилирования изоэлектрическая точка одного из главных зарядовых изомеров peEF2 (pi 6,1) сдвигается в кислую область до величины pi 5,8. Как следует из радиоавтограммы того же геля (рис. 6В), именно эта фракция молекул peEF2 наиболее интенсивно фосфорилируегся. Следовательно, по крайней мере часть молекул peEF2 зародышей пшеницы (более 50%) является аутентичным субстратом для теЕРЗ-киназы животного происхождения. Небольшое количество радиоактивных фосфатных групп содержится также в двух других зарядовых изомерах (с р! 6,2 и 6,4), тем не менее они почти не изменяют своих электрофоретических подвижностей. Следует отметить, что при стандартных условиях реакции in viiro-фосфорилирования посредством meEF2-KHHa3bi ретикулоцитов кролика, фактор peEF2 зародышей пшеницы фосфорилируется до такой же степени, что и meEF2 ретикулоцитов кролика.

Недавно была определена аминокислотная последовательность фактора pcEF2 из водоросли Chlorella kessleri (G. Schnelbogl and Т. Tanner, 1991, Plant Physiol., Vol.97, pp.469-471). Сравнение этой последовательности с последовательностью фактора meEF2 из ретикулоцитов кролика (N. Т. Price eí ai, 1991, FEBS Lett., V6L282, pp.253-258) показывает их большое сходство в домене фосфорилировавия (рис. 7), peEF2 52Гли-Асп-Тлн-Арг-Лей-Тре-Асп-Тре-Арг meEF2 51Гли-Глу-Тре-Арг-Фен- Гре-Асп-Тр^АргЗЗ

Рис. 7. Сравнение аминокислотных последовательностей домена фосфоршшрования в молекулах фактора eEF2 из клеток растений и животных. Выделены сайты фосфорилирования.

Поскольку известно, что фосформлироваиие фактора meEF2 клеток животных сопровождается ингибированием синтеза белка in vitro (A. G. Ryazanov and A. S. Spirin, 1990, New Biologist, V.2, pp.843-859) и, по-видимому, in vivo (J. E. Celis et al, 1990, Proc.Natl.Acad.Sci.USA., VoL87, pp.4231-4235), нами было исследовано влияние фосфорнлирования на активность peEF2 зародышей пшеницы (табл. 2). Фосфорилированный фактор зародышей пшеницы, так же как и его аналог из клеток животных, теряет свою активность в поли(11)~зависимой бесклеточной трансляционной системе, что сопровождается ингибированием синтеза полифенилаланина. Такого ингибирования не наблюдается в присутствии антагониста кальмодулина -трифторперазина или в отсутствии кальмодулина и ионов Са2+ (табл. 2). Последнее обстоятельство еще раз подтверждает Са2+/кальмодулин-зависимую регуляцию активности теЕР2-киназы клеток животных, описанную ранее (A. G. Ryazanov et al., 1988, Nature, Vol.334, pp. 170-173).

Влияние фосфорнлирования на активность peEF2 зародышей пшеницы в поли( I;)• зависямой бесклеточной системе трансляции

Таблица 2,

Добавки

3Н]палифенилаланин, пмоль

Без добавок EF-2-киназа

EF-2-киназа трифторперазин EF-2-киназа без Са2+ и кальмодулина

23,0 8,5 25,3 22,

Очищенный препарат реЕР2 прединкубировался с указанными добавками и затем вносился в бесклеточную систему трансляции.

Таким образом, фактор peEF2 зародышей пшеницы является аутентичным субстратом для теЕР2-киназы клеток животных, и его активность потенциально может регулироваться фосфорилированием. Естественно возникает вопрос: реализуется ли эта возможность в клетках растений, или, иначе говоря, имеется ли в клетках растений реЕР2-киназа, аналогичная таковой клеток животных?

Для того, чтобы ответить на эти вопросы, цитоплазматические экстракты (S23) из покоящихся и прорастающих (6-48ч при 25°С) зародышей пшеницы инкубировали с [у-32Р]АТР в присутствии кальмодулина и ионов Са2+ и подвергали электрофорезу (рис, 8, дорожки 4-7). В некоторых вариантах для усиления чувствительности детекции реЕР2.-киназы в инкубационную смесь вносили очищенный фактор peEF2 (рис. 8, дор. 5 и 7). В указанных экстрактах наблюдается большое количество полипептидов, являющихся субстратами для эндогенных протеик-фосфокиназ зародышей пшеницы. Однако, ни в одном из вариантов опыта не наблюдалось фосфорилирования фактора реЕР2 за счет эндогенной реЕР2-киназной активности (рис. 8). Аналогичный результат был получен и с экстрактами зародышей из созревающих (стадии молочно-восковой и восковой спелости) семян пшеницы.

Рис. 8. Фосфорили-рование peEF2 in vitro. А - эдектро-фореграмма, Б - радиоавтограмма геля А.

Образцы инкубировали с [у-32Р]АТР, затем проводили электрофорез и радиоавтографию. Дорожки: 1 - meEF2-киназа из ретикулоцитов кролика; 2 - peEF2; 3 - peEF2 + шеЕР2-киназа из ретикулоцитов кролика; 4 - экстракт из покоящихся зародышей пшеницы; 5 - экстракт из покоящихся зародышей пшеницы + реЕР2; 6 - экстракт из прорастающих зародышей пшеницы; 7 - экстракт из прорастающих зародышей пшеницы + peEF2.

Таким образом, при in w'fro-фосфорилировании в цитоплазматических экстрактах из покоящихся, либо активно метаболизирующих зародышей пшеницы peEF2-KHHa3Hofl активности обнаружить не удалось. Нельзя, однако, исключить возможность того, что активность реЕР2-киназы может быть по каким-либо причинам подавлена и проявляться лишь на определенных стадиях развития. Кроме того, одной из причин невозможности зарегистрировать фосфорилирование peEF2 может являться наличие в экстрактах зародышей пшеницы неспецифической фосфатазной активности. Действительно, по нашим данным уровень удельной фосфатазной активности в экстрактах из покоящихся зародышей составляет 0,086 ед/мг белка, и он увеличивается при прорастании в 3 раза (до 0,231 ед/мг белка), что видно даже по снижению уровня суммарного фосфорилирования белков in vitro (ср. дорожки 4,5 и 6,7 на рис. 7Б).

Для проверки этой возможности зародыши проращивали в присутствии [32Р]ортофосфата, а затем с помощью ускоренной методики получали из них обогащенный препарат peEF2 и анализировали методом электрофореза (рис. 9). В качестве ингибитора эндогенных фосфагаз в состав буферов вводили молибдат натрия.

А Б ■ ■'

Рис. 9. Фосфорилирование peEF2 in vivo. А - электрофореграмма, Б - радиоавтограмма геля А. Дорожки: 1 - обогащенный препарат peEF2 после in w'vo-фосфорилирования; 2 - такой же препарат + предварительно фосфорилированный фактор peEF2; 3 - очищенный препарат peEF2.

Обогащенный препарат содержит большое количество сопутствующих полипептидов, однако фактор peEF2 вполне отчетливо различим (рис. 9А, дорожка 1). Радиоавтограмма геля, представленная на рис. 9Б, показывает отсутствие какого-либо включения радиоактивных фосфатных групп в молекулы peEF2. В следующем варианте опыта в качестве контроля в экстракт (S23) вносили 20 мкг очищенного фактора peEF2 зародышей пшеницы, предварительно профосфорилированного теЕР2-киназой ретикулоцитов кролика в присутствии [у-32Р]АТР, инкубировали 10 мин при 25°С и затем проводили аналогичную процедуру ускоренного получения обогащенного препарата peEF2. Как видно из рисунка 9Б (дорожка 2), предварительно фосфорилированный фактор peEF2 не теряется в ходе процедуры очистки и сохраняет свое фосфорилированное состояние, несмотря на повышенный уровень фосфатазной активности в цитогоизматическом экстракте.

Таким образом, поскольку в настоящей работе не удалось зарегистрировать эндогенной peEF2-фосфорилирующей активности в зародышах пшеницы ни in vitro, ни in vivo, можно предположить, что хотя активность peEF2 зародышей пшеницы потенциально может регулироваться фосфорилированием, однако, из-за отсутствия эндогенной специфической Са2+/кальмодулин-зависимой реЕР2-кипазы, данный механизм регуляции в зародышах пшеницы не реализуется.

В пользу этого предположения свидетельствует также и то обстоятельство, что хотя во многих растительных объектах были обнаружены различные протеин киназы, в том числе и Са2+/кальмодулин-зависимые, ни одной из групп исследователей не удалось наблюдать фосфорилирования фактора peEF2 (К. S. Browning et al., 1985, Plant Physiol., Vol.77, pp.370-373). Вместе с тем, был опубликован ряд статей группы исследователей, которые наблюдали фосфорилирование белка с Мг 100000 в экстрактах из некоторых растений: Vicia sativa (F. J. Arias et al., 1991, Phytochemistiy, Vol.30, pp.3185-3187), Cucumis satuvus (M. A. Rojo et al., 1992, Cell.Mol.Biol., Vol.38, pp.171-174), Triticum aestivum (R. Muñoz et al., 1992, Phytochemistry, Vol.31, pp.55-57). Однако в этих работах авторами не приводятся прямые доказательства того, что фосфорилируемый белок является фактором peEF2, поэтому их вывод о наличии реЕР2-фософорилирующей активности в экстрактах растений представляется сомнительным. Следует отметить, что нами также наблюдалось эндогенное фосфорилирование белков с Мг около 100000, однако эти белки не имели отношения к фактору peEF2 (рис. 8).

Конечно, нельзя полностью исключить возможность того, что активность реЕР2-киназы в зародышах пшеницы каким-либо образом подавлена, с чем и связаны трудности ее обнаружения. В литературе описаны по крайней мере два примера подобного ингибирования: 1) в культуре клеток PC-12 (А.С. Nairn et al.,1987, J.Biol.Chem., Vol.262, pp. 14256-14272); 2) в ооцитах Xenopus laevis (К. V. Severinov et al., 1990, New Biol., Vol.2, pp.887-893), которое предположительно служит для регуляции дифференциации и развития клеток (A. G. Ryazanov and A. S. Spirin, 1990, New Biologist, V.2, pp.843-859). Поэтому вполне вероятно, что в. эмбриональных тканях пшеницы активность peEF2~ киназы может быть заингибирована, но появляется на других стадиях онтогенеза растения.

В связи с этим нами было исследовано фосфорилирование фактора peEF2 в цитоплазматических экстрактах из дифференцированных органов и тканей пшеницы: листьев, корней, нормальных и этиолированных проростков, пыльцы. Кроме того исследовались экстракты из других растений, в том числе из листьев и пыльцы табака, проростков и корешков кукурузы и гороха, но нигде не удалось обнаружить реЕР2-фосфорилируюшей активности (данные не представлены).

Известно, что в клетках животных уровень белкового синтеза значительно снижается на стадии митоза, и одной из. причин такого снижения может являться фосфорилирование фактора e£F2, вследствии активации соответствующей киназы (J, Е. Cells et al., 1990, Proc.Natl.Acad.Sci.USA., Vol.87, pp.4231-4235). Для зародышей пшеницы существование подобного механизма маловероятно, т.к., хотя деление клеток и происходит достаточно синхронно в течение по крайней мере 100 часов, оно не сопровождается снижением белкового синтеза (S. P. Yadav and Н. К. Das, 1977, Develop.BioL, Vol.36, pp.183-186).

Таким образом, на протяжении большей части жизненного цикла растений реЕР2-киназная активность не проявляется. Это позволяет считать, что белковый синтез в клетках высших растений не регулируется посредством фосфорилирования фактора peEF2. Не исключено, что этот механизм все же реализуется на определенных этапах развития растения (например в ходе гаметогенеза) или при воздействии стрессовых факторов (тепловой шок, гипоксия), и эти возможности требуют дополнительного изучения.

1.3. Изучение влияния полипроантоцианидина на трансляцию.

В связи с тем, что в настоящей работе в зародышах пшеницы не было обнаружено регуляции активности факторов трансляции посредством их фосфорилирования, характерной для клеток животных, возникает вопрос о существовании альтернативных, присущих лишь растениям, механизмов регуляции трансляции. Поскольку известно, что при вирусных инфекциях в растениях значительно возрастает содержание фенольных соединений, представлялось возможным, что эти вещества могут непосредственно влиять на процесс трансляции. Такая возможность была нами исследована на примере полипроантоцианидина (ППА) - полифенольного соединения (Мг около 10000) из верблюжьей колючки Alhagi kirgisorum S, которое синтезируется в данном растении на стадии цветения (О. Сапко, Р. Кунаева, неопубликованные данные). Проантоцианидины - фенольные полимеры, которые синтезируются многими растениями и могут связываться с белками, образуя растворимые и нерастворимые комплексы (А. Е. Hagerman and L. G. Butler, 1981, J.Biol.Chem., Vol.256, pp.4494-4497).

Для того, чтобы выяснить влияние ППА на биосинтез белка, была проведена трансляция эндогенной мРНК либо поли(Ч) в бесклеточной системе трансляции из ретикулоцитов кролика в присутствии возрастающих концентраций ППА. Результаты, представленные на рисунке 10 показывают, что ППА не оказывал ингибирующего действия на поли(и)-зависимую элонгацию в концентрациях до 10 мкМ и лишь незначительно ингибировап синтез полифенилаланина в концентрации 100 мкМ (кривая 2), в то время как трансляция эндогенной (глобиновой) мРНК почти полностью подавлялась при 10 мкМ ППА (кривая I). Эти данные свидетельствуют, что ингибирующему действию ППА подвержена ииициаторная стадия трансляции.

Представлялось интересным выяснить, на какую именно стадию инициации воздействует ППА. Для этого, в присутствии возрастающих количеств ППА, измеряли эффективность трансляции эндогенной мРНК в лизате из ретикулоцитов кролика (по включению [14С|лейцина), поли(и)-зависимой элонгации (по включению [ 14С]фенилаланина) и образование тройственного комплекса (по связыванию [355|метионина) (табл.3).

Полученные данные также показывают, что трансляция эндогенной мРНК и образование тройственного комплекса существенно подавляются в присутствии ППА, в то время как элонгация пептида практически не изменяется.

- 100 X

Рис.10. Влияние ППА на трансляцию эндогенных мРНК (кривая 1) и поли(и)-зависимую элонгацию (кривая 2) в бесклеточной системе из ретикулоцитов кролика.

МРРА1, М

Эти результаты свидетельствуют, что ППА специфически ингибирует е1Р2-зависимую стадию инициации - образование тройственного комплекса |С;ТР*е1Р2*МеыКМА;|.

Таблица 3.

Влияние ППА на синтез белка в бесклеточной системе из ретикулоцитов кролика, на образование тройственного комплекса и на поли(и)-зависимую элонгацию.

Концентрация ППА

14С]лейцин, [358)метионин, [!4С|фенилаланин, полимеризованный связанный полимеризованный имп/мин % имп/мин % имп/мин

Для проверки специфичности действия ППА было исследовано образование тройственного комплекса в присутствии различных концентраций нескольких фенольных соединений: кофейной кислоты (Мг 18016), кверцетина

Mг 33826) и ППА (рис.11). Из графика видно, что только ППА обладал строгим ингибирующим действием на образование тройственного комплекса.

Рис. 11. Влияние различных фенольных соединений на образование тройственного комплекса: 1 - кофейная кислота, 2 - кверцетин, 3 -ППА.

Таким образом, фенольное соединение ППА из верблюжьей колючки (Alhagi kirgisorum) эффективно ингибирует инициацию трансляции, специфически подавляя функцию фактора eIF2 - формирование тройственного комплекса [GTP*eIF2*Met-tRNAj]. Следует добавить, что ППА с равной эффективностью ингибирует активность фактора eIF2 из животных и растений. Пожалуй, это первое сообщение о специфическом взаимодействии фенольного соединения с одним из ключевых компонентов белок-синтезирующей системы.

В животных клетках активность фактора meIF2 регулируется обратимым фосфорилированием двумя специфическими протеи нки назами (HRI и PKR). PKR-киназа является одним из компонентов интерферон-индуцируемой системы противовирусной защиты клеток животных (R. J. Schneider and Th.Shenk, 1987, Ann.Rev.Biochem., Vol.56, рр.317-332). Активируясь в клетках животных в результате вирусной инфекции, PKR-киназа фосфорилирует а~ субъединицу фактора meIF2, что приводит к ингибированию трансляции вирусной мРНК.

Однако в растительных клетках существование подобной системы маловероятно, поскольку, как следует из результатов настоящей работы и опубликованных данных других исследователей, фосфорилирование фактора peIF2 не приводит к ингибированию синтеза белка в зародышах пшеницы. Более того, в трансгенных растениях турнепса {Brassica тара), синтезировавших in planta биологически активный cxD-интерферон человека, процесс инфекции вирусом желтой мозаики турнепса протекал нормально, и никакого подавления трансляции вирусной мРНК не было обнаружено (G. A. de Zoeten et al., 1989, Virology, Vol.172, pp.213-222). Поэтому в растениях может функционировать другая, присущая только им, система защиты, препятствующая размножению вирусов. Характерным примером активной защиты растений может служить образование локальных некрозов в инфецированных участках, без распространения инфекции на другие ткани. Эти некротические явления сопровождаются увеличением синтеза фенольных соединений (G. Loebenstein and A.Gera, 1988, Acta Horticult.,Vol. 234, pp.403411).

Следовательно, можно предположить, что фенольные соединения, подобные полипроантоцианидину, могут играть важную роль в механизме противовирусной защиты растений. Этот механизм может заключаться во взаимодействии ППА-подобных соединений с peIF2, вследствие чего подавляется общий белковый синтез, в том числе и трансляция вирусных мРНК. В пользу этого предположения свидетельствуют полученные нами данные о механизме ингибирования полипроантоцианидином активности melF2 из ретикулоцитов кролика (W. Kudlicki et al., 1991, Eur.J.Biochem., Vol.197, pp.623-629)- ППА образует с meIF2 нерастворимый комплекс, который можно осадить низкоскоростным центрифугированием, причем это взаимодействие высокоспецифично. Так, из нефракционированного лизата ретикулоцитов кролика ППА осаждает всего 3 белка, самый мажорный из которых - me!F2 (Kudlicki et al., 1991). Вместе с тем, инактивация eIF2 оказалась обратимой: до 80% активности eIF-2 можно восстановить мягкой обработкой детергентом NP-40 (С. Смаилов, А. Ли, Б. Искаков, неопубликованные данные). Следует отметить, что восстановление активности наблюдалось только в случае peIF2 из зародышей пшеницы, а в случае meIF2 ретикулоцитов кролика восстановить активность не удалось.

Эти результаты позволяют предположить, что вирусные инфекции, вызывающие в растениях увеличение содержания ППА-подобных фенольных соединений, приводят к подавлению общего белкового синтеза посредством обратимой инактивации фактора eIF2, что в свою очередь может препятствовать размножению вирусов. Такое ингибирование, индуцируемое вирусной инфекцией, может представлять собой неизвестный ранее механизм регуляции трансляции, присущий только растительным клеткам.

2. ИССЛЕДОВАНИЕ ИНИЦИАТОРНЫХ ТРАНСЛЯЦИОННЫХ

КОМПЛЕКСОВ РАСТЕНИЙ.

2.1. Обнаружение и характеристика 45S рибонуклеопротеидных частиц в цитоплазме зародышей пшеницы.

В цитоплазме эукариотических клеток мРНК находится в составе как полирибосомных, так и внеполирибосомных рибонуклеопротеидных (мРНП) частиц. Эти частицы были названы "информосомы" как носители генетической информации (А. S. Spirin, 1972, In: The mechanisms of protein synthesis and its regulation, Vol.27, pp.515-536). Цитоплазматические внеполирибосомные (свободные) информосомы имеют универсальное распространение в эукариотических клетках и представляют собой класс частиц, отличающихся от рибосом и их субъединиц по коэффициентам седиментации и плавучей плотности в CsCl (А. А. Preobrazhensky and А. S. Spirin, 1978, Progr.Nucl.Acids Res. and Mol.Biol., Vol.21, pp.l-37). Свободные информосомы обладают рядом .характерных общих свойств, главным из которых является то, что их коэффициент седиментации зависит от коэффициента седиментации образующей их мРНК и превышает его в 2 -2,5 раза. Плавучая плотность информосом в CsCl составляет от 1,36 до 1,48 г/см3, причем плотность главного компонента всегда равна 1,40 г/см3 независимо от коэффициента седиментации (А. S. Spirin and М. А. Ajtkhozhin, 1985, TIBS, Vol.10, pp.162-165).

Вместе с тем, в цитоплазме клеток животных были обнаружены относительнно гомогенные РНП-частицы с коэффициентом седиментации 40-50S, содержащие РНК, быстро включающую радиоактивные предшественники (L.P. Ovchinnikov and A.S. Spirin, 1970, Naturwissenschaften, Vol.57, pp.514-521). Их обозначают как 45S РНП-частицы или, иногда, как нативные 40S рибосомные субчастицы. Как правило, в составе этих частиц обнаруживается существенное количество новосинтезированной быстрометящейся РНК, которую часто отождествляют с мРНК. Последнее обстоятельство послужило причиной многочисленных экспериментальных работ и дискуссий, посвященных установлению природы 45S РНП-частиц. Однако, обобщая результаты этих работ нельзя сделать однозначного вывода о природе 45S РНП-частиц клеток животных.

При изучении локализации новосинтезированной быстрометящейся РНК в клетках зародышей пшеницы нами были впервые обнаружены РНП-частицы, которые по своим физико-химическим характеристикам и по составу аналогичны 45S частицам клеток животных.

Изолированные зародыши пшеницы проращивали в стерильных условиях в течение 12 часов при 26°С, а затем импульсно метили [3Н]уридином. Время инкубации с радиоактивным предшественником составляло 30 мин. Выделение субклеточных фракций (безмитохондриальный цитоплазм атический экстракт - S23; полирибосомная фракция - Ps; рибосомная фракция - Rs; безрибосомная фракция - S100) проводили при 4°С с помощью дифференциального центрифугирования (В. К. Iskakov and К. I. Madin, 1994, Plant Sei., Vol.96, pp.99-108).

На рисунке 12 приведены результаты седиментанионного анализа новосинтезированной быстрометящейся РНК, содержащейся в полирибосомной и рибосомной фракциях клеток зародышей пшеницы. В полирибосомной фракции (рис. 12А) содержится значительное количество 80S монорибосом, однако практически вся радиоактивная РНК седиментирует быстрее 80S в составе полирибосом.

ФРАКЦИИ ФРАКЦИИ

Рис. 12. Седиментационный анализ распределения новосинтезированной быстрометящейся [3Н]уридином РНК, содержащейся в полирибосомной (А) и рибосомной (Б) фракциях зародышей пшеницы. 1 - Агбо; 2 -радиоактивность. Условия центрифугирования: для А -ротор 8\¥-41,

§, 3°С, 2 ч, Ю-50%-ный сахарозный градиент; для Б - ротор 8\У-41, 105000 g, 3°С, 3 ч, 5-20%-ный градиент.

При анализе рибосомной фракции в 5-20% градиенте концентрации сахарозы (рис. 12Б) по УФ-поглощению наблюдается два компонента -главный (80S), соответствующий монорибосомам, и минорный (45S), соответствующий, нативным 40S СЧ. Небольшое плечо на правом склоне пика монорибосом соответствует 60S СЧ. Основная часть новосинтези-рованной РНК распределяется в 45S-30He, а минорная часть - в зоне 60S СЧ. Собственно 80S рибосомы, а следовательно, и рибосомная РНК практически не содержат радиоактивной метки, в то время как структуры с коэффициентом седиментации около 45S имеют наибольшую удельную радиоактивность. Следует отметить, что идентичные результаты были получены и при исследовании зародышей из созревающих семян пшеницы.

Таким образом, в цитоплазме клеток активно метаболизирующих зародышей пшеницы присутствуют относительно гомогенные 45 S РНП-частицы, содержащие значительное количество быстрометящейся новосинтезированной РНК. Естественно возникает вопрос о природе этих частиц.

Поскольку плотности ый анализ РНП-частиц дает дополнительную информацию для суждения об их природе, материал полирибосомной и рибосомной фракций анализировали в градиенте плотности CsCi (рис. 13). Прежде всего следует напомнить, что у высших растений плавучая плотность в CsCl для 80S монорибосом составляет 1,54-1,55 г/см3; 60SC4 - 1,56-1,57 г/ см3; 40SC4 - 1,52-1,53 г/см3; полирибосом - 1,51-1,53 г/см3; информосом -1,40-1,44 г/см3 (М. A. Ajtkhozhin et al., 1972, FEBS Lett., Vol.21, pp. 42-44; M. A. Ajtkhozhin et al., 1973, FEBS Lett., Vol.31, pp. 104-106).

Из рисунка 13A видно, что практически вся новосинтезированная РНК полирибосомной фракции распределяется в зоне с плавучей плотностью 1,51 - 1,53 г/см3, характерной для полирибосом, хотя присутствует и минорный компонент с плотностью 1,40 г/см3, характерной для информосом зародышей пшеницы. Распределение белка по градиенту полностью совпадает с распределением УФ-поглощающего материала, что свидетельствует о его локализации в составе РНП-частиц. Свободный белок (плавучая плотность 1,30 - 1,35 г/см3) отсутствует.

В рибосомной фракции (рис. 13Б) УФ-поглощающий материал представлен главным образом рибосомами (плавучая плотность 1,54-1,55 г/ см3). Радиоактивный материал распределяется в градиенте CsCl достаточно гомогенно с максимумом в зоне с плавучей плотностью 1,50 г/см3.

Плавучая плотность, г/мл 1,6 1,5 1,4 1,

Белок, мкг

10 20 ФРАКЦИИ Плавучая плотность, т/мл

1,5 1,4 1,

Рис. 13. Плотностный анализ в градиенте СзС1 материала полирибосомной (А), рибосом-ной (Б) фракций и 455-зоны сахарозного градиента (В), собранной как указано на рис. 12Б. 1 - А2бо; 2 - радиоактивность; 3 - распределение белка. Условия центрифугирования: ротор 8\\'-65; 105000 & 3°С; 20 ч.

Л260 I Б , а имп/мин

1,2 V п 1600 "

0,8 - кг 1200

04 Г й \l.4G А ч 1,40 800

1 Ш 400 i . 1.

Белок,

ФРАКЦИИ Плавучая плотность, г/мл

А260 0,

Белок,

Выявляются также два минорных компонента с плотностями 1,46 и 1,40 г/см3, Компонент с плотностью 1,40 г/см3 представлен, по-видимому, свободными цитоплазматическими информосомами. Два других компонента с плотностями 1,50 и 1,46 г/см3 ранее уже наблюдались в цитоплазме прорастающих зародышей пшеницы (М. A. Ajtkhozhin and A. U. Akhanov, 1974, FEBS Lett., Vol.41, pp.275-279) и было предположено, что они соответствуют комплексам информосом с 40S СЧ или монорибосомой, однако природа этих компонентов далее не выяснялась. Распределение белка по градиенту в основном совпадает с распределением УФ-поглощающего материала. Однако наличие белка в зоне с плотностью 1,3-1,32 г/см3 свидетельствует о том, что в препарате рибосомной фракции содержится определенное (около 10% от суммарного белка) количество свободных белков. В 1. 1 ! имп/мин

1,52 1 \ 1,40 1 ' 400

Р 200

Т ., "7 7^1 . 1. I.

10 20 ФРАКЦИИ

Сопоставляя результаты седиментационного (рис. 12) и плотности ого (рис. 13) анализов рибосомной фракции, можно сделать заключение, что главный радиоактивный компонент с плотностью 1,50 г/см3 на рисунке 13Б соответствует 45S частицам на рисунке 12Б, или, иначе говоря, 45S частицы имеют плавучую плотность 1,50 г/см3. Для того, чтобы лучше убедиться в этом был проведен плотностный анализ 45S фракции, вычлененной из сахарозного градиента как указано на рисунке 12Б. Результат этого анализа приведен на рисунке 13В . По УФ-поглощению обнаруживается главный компонент с максимумом в зоне с плотностью 1,52 г/см3, характерной для 40S СЧ, В этой зоне содержится около 20% радиоактивного материала, который может представлять собой новосинтезированную 17S рРНК, находящуюся в составе новообразованных 40S СЧ. На правом склоне УФ-пика выявляется небольшое плечо с плотностью 1,50 г/см3, на которое приходится около 70% радиоактивного материала, взятого в анализ. По-видимому, в 45S фракции сахарозного градиента находятся по-крайней мере два типа РНП-частиц: 1 - 40S СЧ (включая новообразованные), которые присутствуют в большем количестве, но содержат меньше радиоактивной РНК; 2 - 45S частицы, присутствующие в небольшом количестве, но содержащие РНК с наибольшей удельной радиоактивностью. Свободные информосомы (1,40 - 1,44 г/см3) в препарате не обнаруживаются.

Очевидно, что если бы все меченые 45S частицы являлись новообразованными 40S СЧ, то их плавучая плотность в CsCl должна была составлять 1,52 г/см3. Если бы частицы являлись комплексами свободной (не связанной с белком) мРНК и 40S СЧ, то плавучая плотность таких комплексов должна была быть больше плавучей плотности 40S СЧ (т.е. больше чем 1,52г/см3). Наконец, если эти частицы являются свободными информосомами, то величина их плавучей плотности должна быть 1,40 г/ см3. Величина плавучей плотности 45S частиц, равная 1,50 г/см3, занимает промежуточное положение между плотностью 40S СЧ (1,52 г/см3) и свободных информосом (1,40 г/см3). Можно предположить, что 45S РНП-частицы зародышей пшеницы представляют собой комплексы 40SC4 со свободными информосомами.

Для выяснения природы 45S РНП-частиц важно знать природу новосинтезированной РНК. С этой целью анализу подвергали РНК, входящие в состав полирибосом и 45S частиц, поскольку именно в этих структурах находится практически вся новосинтезированная РНК (см. рис. 12).

На рисунке 14А приведено седиментационное распределение РНК, выделенной из полирибосом, из которого видно, что рибосомные РНК не содержат радиоактивной метки, а вся новосинтезированная быстрометящаяся РНК распределена гетерогенно в интервале 6-16Б с максимумом около 128. Такое распределение характерно для мРНК. имп/мин X 10 имп/мин х 10имп/мин х 10

10 20 ФРАКЦИИ

II III

Р^] имп/мин х 10

10 20 ФРАКЦИИ

175 рРНК

- 5,88 рРНК

- 5,38 РНК

- 58 рРНК

Рис. 14. Анализ РНК, выделенных из полирибосом (А) и из 458-фракции сахарозного градиента (Б, В), собранной как указано на рис. 12Б. 1 - Агбо; 2 - радиоактивность. Трансляционную активность РНК, содержащихся в различных зонах сахарозных градиентов: I - 15-188; II - 10158; III - 6-108, определяли в бесклеточной системе из зародышей пшеницы. Условия центрифугирования (для А и Б): ротор 8\¥-50.1; 105000 16°С; 6 ч; 10-30%-ный сахарозный градиент. В - электрофорез РНК 458-фракции в градиентном (2-15%) ПАА-геле с 7 М мочевиной.

Анализ РНК 45S частиц в градиенте сахарозы (рис. 14Б) показал, что в препарате не содержится 25S рРНК, а присутствуют 17S рРНК, гетерогенная по размеру РНК (6-16S) и небольшое количество низкомолекулярных РНК (4-6S). Следует отметить, что 4-6S РНК 45S частиц обладает способностью ацилироваться [358]метионином в присутствии препарата аминоацил-тРНК синтетаз из Е. coli, что свидетельствует о наличии в 45S РНП-частицах инициаторной тРНКМет. Около 20% радиоактивности приходится на новосинтезированную 17S рРНК, однако большая часть быстрометящейся РНК распределяется гетерогенно в интервале 6-16S, что характерно для мРНК. Анализ РНК 45S частиц электрофорезом в 2-15% градиентном ПАА геле (рис. 14В) подтвердил результаты седиментационного анализа и выявил в низкомолекулярной зоне характерный набор РНК. Помимо высокомолекулярных РНК в препарате содержится небольшое количество тРНК, а также ряд дискретных малых РНК, из которых наиболее представлена РНК (5,3S) длиной около 135 нуклеотидов (подробнее об изучении свойств 5,3S РНК будет изложено в следующем разделе работы).

Другим важным критерием матричной природы РНК является ее способность направлять синтез белка in vitro. Для измерения матричной активности из сахарозных градиентов (рис. 14) вычленяли по три зоны: I - 15-18S; II - 10-15S; III - 6-10S, и содержащиеся в них РНК транслировали in vitro в бесклеточной системе из зародышей пшеницы. Результаты, представленные на рисунках 14А и 14Б в виде гистограмм, свидетельствуют, что быстрометящиеся новосинтезированные РНК полирибосом и 45S частиц содержат большую пропорцию мРНК.

Очевидно, что идентификация новосинтезированных РНК как мРНК справедлива лишь при использовании очень коротких периодов инкубации зародышей пшеницы с радиоактивным предшественником (не более 30 мин). Увеличение продолжительности инкубации сопровождается активным включением радиоактивной метки в рибосомные, транспортные и другие виды РНК.

Сохранялась возможность того, что наличие мРНК в 45S-30ne сахарозного градиента является результатом наложения гетерогенно седиментирующих информосом. Чтобы проверить эту возможность, препарат рибосомной фракции разделяли в сахарозном градиенте, вычленяли четыре зоны: I - 80-90S; И - 60-70S; Ш - 40-50S; IV - 10-25S, и экстрагированные из них РНК транслировали in vitro. Результаты, представленные на рисунке 15, показывают, что матричная активность распределяется не гетерогенно, а сосредоточена в 45S-30He, несмотря на гетерогенные размеры содержащихся в ней молекул мРНК (рис. 14Б). Этот результат можно объяснить существованием комплексов 40S СЧ с мРНК, в которых последние находятся в РНГТ-форме.

Рис. 15. Седиментационное A260'lj5Si распределение эндогенной ими/мин

0,6х ю-" матричной активности препарата рибосомной фракции. 0 44 Сахарозный градиент (5-20%) центрифугировали как описано для рис. 12Б, вычленяли четыре °'22 зоны: I - 80-90S; Н - 60-70S;

III - 40-50S; IV - 10-25S, и выделенные из них РНК

10 „ 30 транслировали в бесклеточной фракции f f системе из зародышей пшеницы. 1 - Агбо.

Для анализа белков, входящих в состав 45S частиц, использовали материал 45S фракции, вычлененной из сахарозного градиента как показано на рисунке 12Б. В качестве контроля чистоты этого материала использовали данные его плотностного анализа в градиенте CsCl (рис. 13В). Как видно из рисунка 13В, препарат не содержит свободных белков (плавучая плотность 1,30-1,32 г/см3) и представлен, по-видимому, смесью малых рибосомных субчастиц и 45S частиц. Поскольку нам не удалось далее разделить материал на эти составляющие, то мы можем привести лишь суммарный полипептидный состав 45S фракции. Белки 45S фракции анализировали двумерным электрофорезом (рис. 16). Из приведенных данных видно, что большая часть полипептидов представлена типичными структурными белками рибосом с Мг от 10000 до 50000, распределенными в щелочной зоне градиента pH. Вместе с тем, в препарате присутствуют и полипептиды, составляющие характерную группу, отличную от рибосомных белков. В эту группу можно отнести высокомолекулярные полипептиды (Мг 40000 - 120000), распределяющиеся в слабокислой зоне градиента pH и присутствующие в небольших количествах. фракции

68000 «м»

Рис. 16. Двумерный электрофорез в ПАА геле белков, содержащихся в 45Б фракции сахарозного градиента, собранной как указано на рис. 12Б.

Из многочисленных полипептидов этой группы обращает на себя внимание полипептид с Мг 52000 и pi около 6,5, присутствующий в значительном количестве. Аналогичный полипептид был обнаружен нами ранее также в составе полирибосомных информосом зародышей пшеницы (Б. К. Искаков и М. А. Айтхожин, 1979, Мол.Биол., Т.13, С.1124-1129), следовательно, можно предположить, что в составе 45S частиц этот поли пептид также связан с мРНК. Кроме того, во фракции 45S частиц обнаруживается большая часть активности фактора pe!F2 (В. К. Iskakov and К. !. Madin, 1994, Plant Sci., Vol.96, pp.99-108). Вполне вероятно, что во вторую группу входят полипептиды информосомных белков и факторов инициации трансляции.

Известно, что в ходе инициации трансляции 40S СЧ, содержащая факторы elFIA и е 1F3, связывается сначала с тройственным комплексом [GTP*eIF2*Met-tRNA|], образуя промежуточный 43S комплекс (S. Ochoa, 1983, Arch.Biochem.Biophys., Vol.223, рр.325-349). Затем 43S комплекс, при участии многих факторов инициации (elFl, -4А, -4В, -4F), а также факторов elFIA, eIF2 и e!F3, уже находящихся на 40S СЧ, связывается с мРНК вблизи ее 5'-концевой кеп-структуры с образованием 48S преинициаторного комплекса (A. R. Hunter et al,, 1977, Eur.J.Biochem,, Vol.75, pp.159-170; R. Jagus et al., 1981, Prog.Nucl.Acids Res.Mol.Biol., Vol.25, pp.127-185). Ha заключительной стадии инициации к 48S преинициаторному комплексу присоединяется 60S СЧ с образованием 80S инициаторного комплекса и трансляция переходит в стадию элонгации полипептидной цепи.

Обобщая экспериментальные данные, представленные в этом разделе работы, можно предположить, что цитоплазм атические РНП-частицы зародышей пшеницы с плавучей плотностью 1,52 г/см3 (рис. 13В) могут соответствовать 43S преинициаторным комплексам, тогда как мРНК содержащие 45S частицы (1,50 г/см3) могут быть функционально тождест-вены 48S преинициаторным комплексам, содержащим 40S СЧ, мРНП, факторы инициации трансляции, GTP и инициаторную метионид-тРНК.

Накопление 48S интермедиата в цитоплазме зародышей пшеницы указывает на существование естественных факторов, нарушающих последовательность инициаторных событий на стадиях после связывания мРНК. с 40S СЧ, но перед присоединением 60S СЧ. :

Одним из факторов может являться дефицит АТР, поскольку в этих условиях 40S СЧ может связываться с 5' концом мРНК, но ее миграция в направлении 3' конца затруднена или полностью блокируется, что приводит к остановке 40S СЧ на пути к первому АУГ-кодону (М. Kozak, 1980, Cell, Vol.22, pp.459-467). В этом случае формирование 80S инициаторного комплекса невозможно, т.к. 40S СЧ не достигла АУГ-кодона, что является необходимым условием для присоединения 60S СЧ.

Другой причиной накопления 48S интермедиата может являться нарушение активности одного или нескольких факторов инициации трансляции. Так, было показано, что экстракт из неоплодотворенных яиц морского ежа ингибирует белковый синтез в бесклеточных системах из эмбрионов морского ежа и из ретикулоцитов кролика, приводя к накоплению большого количества 48S преинициаторных комплексов (L. J. Hansen et al., 1987, J.Biol.Chem., Vol.262, pp.6114-6120). Добавление фактора eíF4F компенсировало ингибирующий эффект экстракта яиц в обеих системах, что указывает на присутствие в нем ингибитора, инактивирующего данный фактор (W.-I. Huang et al., 1987, Proc.Natl.Acad.Sci. USA., Vol.84, pp.63596363).

Вопрос о причинах накопления 48S трансляционного интермедиата в цитоплазме зародышей пшеницы остается пока открытым, тем не менее результаты, представленные в данном разделе работы свидетельствуют, что стадия связывания мРНК с 43S преинициаторным комплексом и/или ближайшие последующие стадии могут являться лимитирующими скорость формирования 80S инициаторных комплексов в клетках растений.

2.2. Обнаружение в рибосомах зародышей пшеницы малой РНК, индуцируемой тепловым шоком.

В клетках всех исследованных эукариотических организмов помимо информационных и рибосомных содержится обширный класс низкомолекулярных РНК (нмРНК). К этому классу относятся разные виды нмРНК, обнаруживающихся как в ядре, так и в цитоплазме и обладающих характерными структурными особенностями и определенными функциями.

Из малых цитоплазматических (мц)РНК наиболее изучена 7S РНК, образующая специфический рибонуклеопротеидный комплекс (SRP), который служит в качестве адаптера между рибосомами, синтезирующими секреторные или мембранные белки, и участками транслокации в мембране шероховатого эндоплазматического ретикулума (Н. Lutcke and В. Dobberstein, 1993, Mol.Biol.Reports, Vol. 18, pp.143-147). Кроме 7S РНК в эукариотических клетках обнаружено много других видов мцРНК, которые могут участвовать в регуляции белкового синтеза, поскольку, как было показано, некоторые из них стимулируют, а большинство - ингибируют трансляцию мРНК in vitro (S. Sarkar, 1984, Progr.Nucl.Acids Res.Mol.Bioi., Vol.31, pp.267-293).

Хотя накопленный экспериментальный материал свидетельствует о том, что мцРНК потенциально могут участвовать в регуляции биосинтеза белка в клетках животных организмов, тем не менее их функциональное значение для жизнедеятельности клетки остается до конца не выясненным. Следует отметить также, что структура и функции мцРНК клеток растений исследуются значительно слабее чем у животных.

В этом разделе работы дается характеристика мпРНК (5,3S РНК), впервые обнаруженной нами в клетках зародышей пшеницы. Представлены данные по субклеточной локализации и частичной первичной структуре 5,3S РНК, обсуждаются вопросы о ее происхождении и функциях.

Хорошо известно, что при резком повышении температуры среды (тепловой шок), клетки практически всех живых организмов, в том числе и растений, начинают активно синтезировать группу специфических белков, получивших название белков теплового шока (БТШ). Изучение механизмов индукции синтеза БТШ в клетках растений имеет важное значение, поскольку с накоплением БТШ связывают усиление термотолерантности растений (R.T. Nagao, 1989, In: Environmental stress in plants, Ed. J.H. Cherry, Berlin: SpringerVerlag, NATO AS1 Series, Vol.G19, pp.331-342).

Нами впервые была предпринята попытка изучить влияние теплового шока на изменения в составе малых цитоплазматических (мц)РНК клеток зародышей пшеницы. Для этого зародыши проращивали при нормальной температуре (26°С) в течение 17 часов и дополнительно 1 час при стрессовых температурах (37°С или 42°С). Как было показано ранее, для зародышей пшеницы температура 37°С является оптимальной для синтеза БТШ, а 42°С - сублетальной (Н.Т. Nguyen et al., 1989, In: Environmental stress in plants, Ed. J.H. Cherry, Berlin: Springer-Verlag, NATO ASI Series, Vol.G19, pp.319-330). После инкубации при разных температурах из зародышей получали субклеточные фракции как описано ранее (В. К. Iskakov and К. I. Madin, 1994, Plant Science, Vol.96, pp.99-108) и выделяли из них РНК. Равные количества РНК каждого из вариантов анализировали электрофорезом в 10% ПАА-геле с 8 М мочевиной (рис. 17).

Как видно из рисунка 17, при оптимальном режиме теплового шока (1 час, 37°С), наиболее отчетливым изменением в спектре мцРНК является значительное накопление РНК длиной около 135 нуклеотидов, получившей название 5,3S РНК. Результаты денситометрии показали, что при тепловом шоке количество 5,3S РНК увеличивается в 5 раз по сравнению с нормой. Размер 5,3S РНК определяли по ее электрофоретической подвижности относительно 5S рРНК (120 н), 5,8S рРНК (162 н) и 4S тРНК (70-85 н) зародышей пшеницы, размеры которых известны (R. М. МасКау et al., 1980, Eur. J. Biochem., Vol.112, pp.561-576). Накопление 5,3S РНК заметно уже в безмитохондриальной фракции (ср. дорожки 1 и 2), но становится более очевидным в полирибосомной (ср. дорожки 4 и 5) и особенно в рибосомной (ср. дорожки 7 и 8) фракциях. В безрибосомной фракции 5,3S РНК совсем не обнаруживается (дорожки 11-13), что свидетельствует о ее рибосомной локализации. При сублетальном режиме теплового шока (1 час при 42 °С) накопления 5,3S РНК не происходит.

Для более точной идентификации структур, с которыми ассоциирована 5,3S РНК, препараты полирибосомной и рибосомной фракций зародышей пшеницы, подвергавшихся тепловому шоку при 37°С, анализировали в градиентах сахарозы и определяли содержание 5,3S РНК в различных зонах градиентов. В полирибосомной фракции 5,3S РНК преимущественно локализуется на 80S монорибосомах, а также в небольших количествах обнаруживается в составе полирибосом (данные не приведены). fe í. и Vf ri "Г

I IJ.IJ

135120

- 5,83 pPHK

- 5,35 РНК • 5 S pPHK

- tPHK

Рис. 17. Электрофорез в 10%-ном ПАА -геле с 8 M мочевиной РНК, выделенных из различных субклеточных фракций зародышей пшеницы, прораставших 17 часов при нормальной (26°С) температуре и дополнительно 1 час при температурах, указанных на рисунке. S23 - безмитохошриальная фракция; Ps - полирибосомная фракция; Rs -рибосомная фракция; S100 - безрибосомная фракция. Справа указаны положения 5,8S рРНК, 5,38 РНК, 5S рРНКи 4S тРНК, а слева - размеры этих РНК в нуклеопгидах. Дорожка 10 содержит маркерную РНК, выделенную из очищенных 80S рибосом зародышей пшеницы, прораставших при нормальной температуре.

На рисунке 18 представлен седиментационный анализ рибосом ной фракции. Из сахарозного градиента вычленяли 4 зоны: I) 803 монорибосомы; II) 60S СЧ; III) нативные 40S СЧ; IV) 5-20S безрибосомная фракция, и выделяли из них РНК. Злектрофоретический анализ равных количеств этих РНК показал (рис. 18Б), что 5,3S РНК содержится только в зонах 80S рибосом и нативыых 40S СЧ, причем в последней из них 5,3S РНК является главным видом мцРНК. При электрофорезе РНК, выделенных из равных объемов тех же зон градиента (рис. 18В), становится очевидным, что большая часть молекул 5,38 РНК локализована на монорибосомах.

Рис. 18. Седиментационный анализ (А) в 5-30% градиенте сахарозы материала рибосомной фракции зародышей пшеницы, подвергавшихся тепловому шоку 1 час при 37°С , и электрофорез (Б, В) РНК, выделенных из различных зон этого градиента: Б - электрофорез равных количеств РНК; В - элекрофорез РНК, выделенных из равных объемов указанных зон. Условия седиментации и электрофореза указаны в подписях к рис. 12Б и рис. 17 соответственно.

Поскольку существенное количество 5,3S РНК связано с 808 рибосомами, представлялось интересным выяснить с какой из субчастиц она ассоциирована. Для этого рибосомы, содержащиеся в зоне I на рисунке 18А, инкубировали в буфере с высокой ионной силой (500 мМ КС!) и пониженным содержанием ионов магния (0,1 мМ MgCb) и затем анализировали в градиенте сахарозы того же ионного состава (рис. 19А). По УФ-поглощению наблюдается полная диссоциация рибосом на субчастицы. Из сахарозного градиента вычленяли 3 зоны: I) 60S СЧ; II) 40S СЧ; 111) 5-20S безрибосомная фракция, выделяли из них РНК, равные количества которых анализировали электрофорезом в 10% ПАА-геле с 8 М мочевиной (рис. 19Б).

I II Ш

L—JI11I-111IIIIL

10 20 ФРАКЦИИ

Рис. 19. Седиментационный анализ (А) в 5-30% градиенте сахарозы диссоциированных 80S рибосом и электрофорез (Б) равных количеств РНК, выделенных из различных зон этого градиента. Условия диссоциации, седиментации и электрофореза указаны в тексте и в подписях к рис. 12Б и рис. 17 соответственно.

Как видно из рисунка 19Б, 5,3S РНК обнаруживается только в зоне 40S СЧ и остается в комплексе с ними в условиях высокой ионной силы, что свидетельствует о специфичности и прочности их взаимодействия.

Возникает вопрос о происхождении 5,3S РНК. Поскольку 5,3S РНК накапливается при тепловом шоке в количестве, сравнимом с таковым рибосомных РНК, то естественно предположить, что она является продуктом фрагментации более высокомолекулярных рРНК или предшественником 5S рРНК. Более того, ранее было установлено, что в клетках Drosophila melanogaster при тепловом шоке наблюдается накопление существенного количества мцРНК длиной в 135 нуклеотидов (G. М. Rubin and D. S. Hogness, 1975, Cell, Vol.6, pp.207-213). Анализ олитонуклеотидных карт показал, что эта мцРНК является предшественником 5S рРНК с 15 дополнительными нуклеотидами на З'-конце. Авторы связывают накопление этой мцРНК с нарушением процессинга 5S рРНК при воздействии теплового шока.

Для того чтобы выяснить не является ли 5,3S РНК предшественником 5S рРНК зародышей пшеницы мы провели сравнение их олигонуклеотидных карт и обнаружили их существенное различие, что указывало на отсутствие между ними взаимосвязи по типу "предшественник - продукт" (S. Zhanybe-kova et al., 1995, Reports Nat.Acad.Sci. R.K., Vol.5, pp.78-84).

Нами была также исследована возможность того, что 5,3S РНК может являться дискретным п родуктом фрагментации более высокомолекулярных рибосомных РНК. Сотой целью 5,3S РНК метили по З'-концу радиоактивным фосфатом в реакции с Т4 РНК-лигазой и [5'-32Р]рСр, а затем определяли ее нуклеотвдную последовательность, используя метод частичного гидролиза специфическими рибонуклеазами. Была установлена нуклеотидная последовательность З'-концевого района 5,3S РНК зародышей пшеницы длиной в 81 нуклеотид (рис. 20), которую анализировали с помощью компьютерной программы "M1CROGEN1E" (Beckman) на наличие подобия с нуклеотид ны ми последовательностями всех рибосомных РНК, содержащимися в базе данных этой программы. Компьютерный анализ показал отсутствие подобия З'-концевого фрагмента 5,3S РНК с нуклеотидными последовательностями 28S, 18S и 5.8S рибосомных РНК. Тем не менее было выявлено некоторое подобие 5,3S РНК с 5S рРНК, которое особенно отчетливо проявляется только в З'-концевом участке 5S рРНК в интервале с 80-го по 101-й нуклеотид (рис. 20). Для 5S рРНК этот участок известен как домен-С "внутреннего контролирующего района" (ICR), узнаваемого фактором инициации транскрипции TFHIA РНК-полимеразы 10 (G. A. Kassavetis et al., 1990, Cell, Vol.60, pp.235-245). Наличие домен-С-подобной последовательности в З'-концевой области 5,3S РНК позволяет предположить, что она, также как и 5S рРНК, является продуктом транскрипции РНК-полимеразы III,

Следует отметить, что в клетках Tetrahymena thermophila под влиянием теплового шока происходит накопление мцРНК длиной около 270 нуклеотидов (G8 РНК), которая также транскрибируется РНК-полимеразой III (К. W. Kraus et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.84, pp.383-387). Было показано, что G8 РНК ассоциирована с поли- (но не моно-) рибосомами и способна формировать стабильные дуплексы с 28S (но не с 18S) рибосомной РНК. По мнению авторов G8 РНК играет роль в регуляции трансляции при тепловом шоке на стадии элонгации полипептидных цепей. Недавно установлено, что G8 РНК необходима для обеспечения термотолерантности клеток [P. A. Fung et al., 1995, Science, Vol.286, pp. 1036-1039).

5S pPHK 5' GGAUGCGAUCAUACCAGCACUAAAGCACCGGAUCCCAUCAGAACÜCCGAA

5, 3SPHK 5' .CAUGAC

60 70 80С-домен 100.

5S pPHK

5,3SPHK

I ! I ! I

GUUAAGCGUGCUUGGGCGAGAGUAGUACUAGGAUGGGUGACCUCCUGGGAA ** *** * **** * ** ******* * *******

GUGCAGCUGUGGGCGAGAGCAGUAACAGCAGAUUGGGUGAAÜUUCUGGGAA

5S pPHK GUCCUCGUGUOGCAOUCCC 3' * * ** *

5,3SPHK AGGUUCUUCGUÜGGUUGGCAAUUG 3'

Рис. 20. Сравнение нуклеотидных последовательностей 58 рРНК и 5,35 РНК зародышей пшеницы. Точками обозначены неизвестные нуклеотиды, звездочками - совпадающие нуклеотиды, цифрами - нумерация нуклеотидов для 5Б рРНК. Показано положение С-домена в 5Б рРНК.

Учитывая строгую локализацию 5,3S РНК на 40S рибосомной субчастице и их прочную взаимную ассоциацию, можно считать, что 5,3S РНК не является дискретным продуктом деградации 28S и 5,8 S рРНК или недопроцессированным предшественником 5S рРНК. Для окончательного выяснения биогенеза 5,3S РНК необходимо установление ее полной нуклеотидной последовательности и дополнительные эксперименты с использованием специфических ингибиторов РНК-полимераз.

Таким образом, в клетках зародышей пшеницы нами впервые обнаружена мцРНК длиной около 135 нуклеотидов (5,3S РНК), количество которой при тепловом шоке увеличивается в 5 раз. Эта РНК локализуется в полирибосомах, 80S рибосомах и в нативных 40S субчастицах, но не в безрибосомных субклеточных фракциях. После диссоциации рибосом 5,3S РНК остается в комплексе с 40S СЧ и не отделяется от них в условиях высокой ионной силы. Согласно перечисленным свойствам 5,3S РНК существенно отличается от других видов мцРНК, описанных к настоящему времени.

Известно, что в составе 80S рибосомы содержится по одной молекуле 5S и 5,8S рРНК, причем обе они локализованы на 60S СЧ. Если допустить, что в составе рибосомы (на 40S СЧ) может содержаться только одна молекула 5,3S РНК, то по ее количественному содержанию относительно 5S или 5,8S рРНК можно приблизительно оценить долю 5,3S РНК-содержащих рибосом зародышей пшеницы. При нормальных температурных условиях эта доля составляет 5-10%, а при тепловом шоке - увеличивается до 25-50% (см. рис. 17,18). Таким образом, не все рибосомы зародышей пшеницы могут содержать 5,3S РНК, что позволяет предположить существование, по крайней мере, двух популяций рибосом, из которых популяция 5,35РНК-содержащих рибосом максимально возрастает при стрессовом температурном режиме, когда наблюдается максимальный синтез белков теплового шока.

Строгая локализация 5,3S РНК на 40S субчастицах как в рибосомах, так и в составе преинициаторных комплексов, а также корреляция ее накопления с максимальным синтезом БТШ, позволяют предположить, что 5,3S РНК может участвовать в регуляции синтеза белка в клетках зародышей пшеницы при тепловом шоке на уровне инициации трансляции.

Подтверждением этому предположению могут служить полученные нами данные по взаимодействию 5,3S РНК с ключевыми факторами трансляции -peIF2 и peEF2 зародышей пшеницы. Было показано, что, хотя оба фактора являются РНК-связывающими белками, peEF2 не взаимодействует, тогда как peIF2 специфически связывается с 5,3S РНК. Были измерены константы диссоциации комплексов peIF2 с 5,3S РНК, а также с Met-tRNA¡, которые при 25°С и 100 мМ ионов калия составили 1,7 х 10~7 М и 1,5 х К) 7 М соответственно (Н. О. Накисбеков и др., 1991, Цитология, Т.ЗЗ, С.120-122). Следовательно, 5,3S РНК способна специфически и достаточно прочно взаимодействовать с peIF2, а также конкурировать с инициаторной Мет-тРНК за РНК-связывающий участок этого фактора, когда тройственный комплекс [GTP*peIF2*Met-tRNAi] присоединяется к 40S СЧ.

Обсуждая вопрос о возможных функциях 5,3S РНК, следует, на наш взгляд, рассмотреть следующую серию работ. Известно, что 5'-нетранслируемые последовательности (5'-НТП) мРНК некоторых вирусов растений, обладают способностью значительно увеличивать эффективность трансляции многих репортерных мРНК (D. R. Gallie, 1996, Plant Mol.Biol., Vol.32, pp.145-158). В частности, 68-нуклеотидная 5'-НТП геномной РНК вируса табачной мозаики (ВТМ), обозначаемая как Q-фрагмент, находясь на

5'-конце репортерной мРНК, стимулирует ее трансляцию как in vitro (в 5-10 раз), так и in vivo (в 20-50 раз) (D. R. Gallie, 1993, Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol., Vol.44, pp.77-105).

Механизм стимулирующего эффекта fí-фрагмента неизвестен, однако экспериментальные данные свидетельствуют, что ответственные за него факторы содержатся не только в нуклеотидной последовательности fí-фрагмента (D.R.Gallie and V. Walbot, 1992, Nucl. Acids Res., Vol.20, pp.46314638), но также и в трансляционном аппарате растительной клетки (D. R. Gallie et al., 1988, Nucl. Acids Res., Vol.16, pp.8675-8694). В частности, с использованием бесклеточной системы трансляции из зародышей пшеницы было показано, что клеточным компонентом, опосредующим стимулирующий эффект Q-фрагмента, могут являться либо собственно рибосомы, либо ранее неизвестный рибосомо-ассоциированный фактор, который не отмывается от рибосом в условиях высокой (0,5 М KCl) ионной силы. При этом гипотетический фактор не был обнаружен ни в цитозольной (S100) фракции, ни во фракции уже известных белковых факторов трансляции, которые, как известно, почти полностью отмываются от рибосом в условиях высокой ионной силы (D. R. Gallie et al., 1988, Nucl. Acids Res., Vol.16, pp.8675-8694).

Описанные в настоящей работе свойства 5,3S РНК зародышей пшеницы делают ее весьма подходящим кандидатом на роль упомянутого фактора, опосредующего высокую трансляционную эффективность РНК ВТМ, а также некоторых клеточных мРНК, например кодирующих БТШ. Интересно отметить, что РНК ВТМ ведет себя подобно мРНК БТШ, т.е. она эффективно транслируется в клетках растений при тепловом шоке (W. О. Dawson and С. Boyd, 1987, Plant Mol.Biol., Vol.8, pp. 145-149). Более того, Q-фрагмент РНК ВТМ может функционально заменять 5'-НТП мРНК БТШ и придавать репортерной мРНК, на 5'-конце которой он находится, способность транслироваться в условиях теплового шока даже более эффективно, чем при нормальной температуре (L. Pitto et al., 1992, Plant Physiol,, Vol.lOO, pp. 1827-1833).

Все эти данные свидетельствуют, что определенные группы клеточных мРНК, а также некоторые вирусные мРНК вероятно используют одинаковый механизм инициации трансляции, одним из участников которого может являться 5,3S РНК. Конечно, вопрос о функции 5,3S РНК требует дальнейших исследований.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Искаков, Булат Кудайбергенович

ВЫВОДЫ

В настоящей диссертационной работе получены следующие основные результаты.

1. Выделен очищенный препарат фактора инициации трансляции 2 (peIF2) из зародышей пшеницы. Измерены константы диссоциации (Ка) комплексов этого фактора с GDP и GTP, которые составили 1.5 х 10~7 М и 1,5 х Ю-6 М соответственно. Близкие величины Kd этих комплексов свидетельствуют, что при достаточно высоком соотношении концентраций GTP к GDP в клетках растений обмен нуклеотидов на факторе peIF2 может происходить без участия фактора elF2B, который катализирует обмен гуаниловых нуклеотидов в клетках животных.

2. Выделен очищенный препарат фактора элонгации трансляции 2 (peEF2) из зародышей пшеницы. Показано, что этот белок с Мг 100000, имеющий три зарядовых изомера (два главных - pi 6,1 и 6,2 и минорный - р! 6,4), является аутентичным субстратом для фосфорилирования посредством экзогенной Са2+/кальмодулин-зависимой еЕР2-киназы из ретикулоцитов кролика. Установлено, что фосфорилирование приводит к ингибированию функции peEF2 в бесклеточной системе трансляции, следовательно активность eEF2 растений потенциально может регулироваться фосфорилированием. Однако обнаружить эндогенную реЕР2-фосфорилирующую активность не удалось ни в одном из исследованных растительных объектов ни in vitro ни in vivo.

3. Впервые установлено, что полипроантоцианидин (ППА) - фенольный полимер из верблюжьей колючки (Alhagi kirgisorum S) эффективно ингибирует синтез белка в бесклеточных системах из зародышей пшеницы и ретикулоцитов кролика. Показано, что ингибиторньзй эффект ППА обусловлен его специфическим связыванием с фактором eIF2 и блокированием образования тройственного комплекса [GTP*eíF2*Met-tRNA;].

4. Установлено, что существенное количество новосинтезированной пульс-меченой РНК зародышей пшеницы (отождествляемой с мРНК) локализуется в 45S РНП-частицах. Данные плотностного анализа в градиенте CsCl, распределение матричной активности и активности фактора eIF2, полипептидный состав свидетельствуют, что 45S РНП-частицы представлены 43S и 48S трансляционными преинициаторными комплексами. Накопление подобных интермедиатов указывает, что стадия связывания мРНК с 43S комплексом и/или ближайшие последующие стадии могут являться лимитирующими скорость формирования 80S инициаторных комплексов в клетках растений.

5. В составе 45S РНП-частиц зародышей пшеницы впервые обнаружена малая РНК длиной 135 нуклеотидов, обозначенная как 5,3S РНК. Установлено, что она всегда связана с рибосомным материалом -полисомами, 80S моносомами, нативными 40S субчастицами, но не обнаруживается в безрибосомных цитоплазматических фракциях. Показано,,что 5,3S РНК прочно связана с рибосомами и не отмывается в условиях высокой ионной силы (0,5 М KCl); при диссоциации 80S рибосом 5,3S РНК остается в комплексе с 40S субчастицей.

6. Установлено, что при нормальной температуре (26°С) 5,3S РНК присутствует лишь в 5-10% рибосом зародышей пшеницы, тогда как при тепловом шоке (60 мин, 37°С) ее количество увеличивается в 5 раз и около 25-50% рибосом становятся 5,3S РНК-содержащими.

7. Показано, что 5,3S РНК способна специфически и достаточно прочно связываться с фактором peIF2, но не взаимодействует с фактором peEF2. Измерены константы диссоциации (K¿) комплексов peIF2 зародышей пшеницы с 5,3S РНК и инициаторной Мет-тРНК, которые составили 1,7 х К)'7 М и 1,5 х Ю-7 М соответственно. Следовательно, 5,38 РНК может удерживать фактор peIF2 на 40S субчастице и/или конкурировать с инициаторной Мет-тРНК за РНК-связываюший участок этого фактора, когда тройственный комплекс присоединяется к 408 субчастице.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Iskhakov В.К., Filimonov N.G., Ajtkhozhin М.А. Proteins bound to poly(A) sequences of polyribosomes from germinating wheat embryos // Biochimica et Biophysica Acta. - 1978. - Vol. 521, № 2. - P. 470-475.

2. Искаков Б.К., Филимонов Н.Г., Полимбетова H.C., Айтхожин М.А. Поли(А)-последовательности, связанные с белком в полирибосомах прорастающих зародышей пшеницы // Вестник АН Каз ССР. - 1978. -№ 2. - С. 61-65.

3. Искаков Б.К., Айтхожин М.А. Белки информосом, связанных с полирибосомами, из прорастающих зародышей пшеницы // Молекулярная биология. - 1979. - Т. 13, № 5, - С. 1124-1129.

4. Полимбетова Н.С., Искаков Б.К., Айтхожин М.А. Ядерные информосомы зародышей пшеницы: изучение свойств в зависимости от условий выделения // Биохимия,- 1979.- Т.44, Вып. 12,- С. 2179-2185.

5. Аханов А.У., Бельгибаев С.А., Искаков Б.К., Айтхожин М.А. Выделение и характеристика РНК-связывающих белков из цитоплазмы зародышей пшеницы // Вестник АН Каз ССР. - 1979. - № 9. - С. 50-55.

6. Айтхожин MA., Искаков Б.К. Информосомы растений (Монография) / / Издат. "Наука" АН КазССР. - Алма-Ата, 1982. 184 С.

7. Искаков Б.К., Полимбетова Н.С., Айтхожин М.А. Ядерные информосомы зародышей пшеницы: белки, связанные с гетерогенной ядерной РНК / / Биохимия. - 1984. - Т. 49, Вып. 5. - С. 861-869.

8. Искаков Б.К., Полимбетова Н.С., Агашкин А.О., Айтхожин М.А. Храктеристика лоли(А)-содержаших ядерных информосом и белков, входящих в их состав // Биохимия.- 1985.- Т.50, Вып.8.- С. 1323-1329.

9. Искаков Б.К., Айтхожин М.А. Выделение белков информосом и анализ их с помощью двумерного электрофореза //В сб.: "Методы молекулярной биологии, биохимии и биотехнологии растений". - Изд. "Наука" АН КазССР. - Алма-Ата, 1988. - С. 5-17.

10. Полимбетова И.С., Искаков Б.К. Выделение и анализ низкомолекулярных ядерных РНК с помощью электрофореза // В сб.:"Методы молекулярной биологии, биохимии и биотехнологии растений". - Изд. "Наука" АН КазССР. - Алма-Ата, 1988. - С. 33-40.

11. Мадин К.И,, Каримов Н.Ж., Искаков Б.К., Накисбеков Н.О. Электроэлюция нуклеиновых кислот из полиакриламидных гелей и определение нуклеотидной последовательности РНК // В сб.:"Методы молекулярной биологии, биохимии и биотехнологии растений". - Изд. "Наука" АН КазССР. - Алма-Ата, 1988. - С. 40-49.

12. Smailov S.K., Shaikhin S.M., Lee A.V., Iskakov B.K. Study of initiation factor 2(eIF-2) from wheat germ // Abstracts of International Symposium "Molecular organization of biological structures". - Moscow, 1989. - Abstr. Book II. - P. 257.

13. Madin K.I., Iskakov B.K. Characterization of 45S particles from wheat germ cytoplasm // Abstracts of International Symposium "Molecular organization of biological structures". - Moscow, 1989. - Abstr. Book П. - P. 258.

14. Nakisbekov N.O., Zhanibekova S.Sh., Polimbetova N.S., Azimuratova R.Zh., Iskakov B.K. Heat shock inducible small cytoplasmic RNA from wheat embryos // Abstracts of International Symposium "Molecular organization of biological structures".-Moscow, 1989.- Abstr.Book II.-P.265.

15. Shaikhin S.M., Smailov S.K., Lee A-V., Iskakov B.K. Interaction of initiation factor 2 (eIF-2) from wheat germ with GTP and GDP // Abstracts of the Conference "Modern Problems of Physico-Chemical Biology and Biotechnology". - Alma-Ata, 1989. - P. 12.

16. Iskakov В.К., Madin K.I. Characterization of 45S RNP-particles from wheat germ cytoplasm I I Abstracts of the Conference "Modern Problems of Physico-Chemical Biology and Biotechnology". - Alma-Ata, 1989. - P. 16.

17. Nakisbekov N.O., Zhanybekova S.Sh., Polimbetova N.S., Azimuratova R.Zh., Iskakov B.K. Low molecular weight RNAs of 45S RNP particles from wheat germ // Abstracts of the Conference "Modern Problems of Physico-Chemical Biology and Biotechnology". - Alma-Ata, 1989. - P. 17.

18. Iskakov B.K. Protein biosynthesis regulation in plants // Abstract of Xth Bilateral Symposium USSR-France "Organization and expression of eukaryote and prokaryote genom". - Kiev, 1990. - P. 4.

19. Madin K., IskakovB. The nature of 45SRNP particles from wheat germ cytoplasm // Abstract of Xth Bilateral Symposium USSR-France "Organization and expression of eukaryote and prokaryote genom". - Kiev, 1990. - P. 14.

20. Искаков Б.К. Регуляция биосинтеза белка у растений // Тезисы докл. 2-го Съезда ВОФР. - Минск, 1990. - С. 37.

21. Smailov S.K., Lee A.V., Mukhamedzhanov B.G., Iskakov В.К., Denisenko O.N. An inhibitor of protein synthesis initiation from Alhagi kirgisorum S. // FEBS Letters. - 1990. - Vol.275, № 1,2. - P. 99-101.

22. Ли A.B., Смаилов C.K., Шайхин C.M., Мухамеджанов Б.Г., Сапко О.А., Кунаева P.M., Искаков Б.К. Регуляция биосинтеза белка полифенольным соединением полипроантоцианидином при внешних воздействиях на растительную клетку // Цитология. - 1991. - Т. 33, № 5. - С. 112-113.

23. Накисбеков Н.О., Жаныбекова С.Ш., Полимбетова Н.С., Смаилов С.К., Ли А.В., Шайхин С.М., Искаков Б.К. Взаимодействие малой цитоплазматической РНК теплового шока с факторами трансляции // Цитология. - 1991. - Т. 33, № 5. - С. 120-122,

24. Madin K.I., Iskakov B.K, Translation preinitiation complexes accumulation in cytoplasm of germinating wheat embryos // Abstract of 14th International tRNA Workshop. - Rydzyna, Poland, 1991. - P. 159.

25. Madin K.I., Nakisbekov N.O., Zhanybekova S.Sh., Polimbetova N.S., Iskakov B.K. Translation preinitiation complexes in cytoplasm of germinating wheat embryos contain small cytoplasmic RNA // Abstract of 14th International tRNA Workshop. - Rydzyna,Poland, 1991. - P. 192.

26. Smailov S.K., Lee A.V.,Shaikhin S.M. Iskakov B.K, Mukhamedzhanov B.G., Sapko O.V., Kunaeva R.M. The role of phenolic compounds at the level of gene expression in plant cells // Abstracts of 8th International Protoplast Symposium. -Uppsala, Sweden, 1991. - P. A36.

27. Мадин К.И., Жаныбекова С.Ш., Накисбеков H.O., Полимбетова Н.С., Искаков Б.К. ГТреинициаторные трансляционные комплексы зародышей пшеницы содержат малую РНК, индуцируемую при тепловом шоке // Тезисы докл. Всесоюзной конференции "Генетические механизмы утойчивости растений к неблагоприятным факторам среды". - Иркутск, 1991. - С. 104.

28. Шайхин С.М., Смаилов С.К., Ли А.В., Кожанов Е.В., Искаков Б.К. Взаимодействие фактора инициации трансляции 2 зародышей пшеницы с гуаниловыми нуклеотидами // Биохимия. - 1991. - Т. 56, Вып.12. - С. 2148-2158.

29. Kudlicki W., Picking W.D., Kramer G., Hardesty В., Smailov S., Mukhamedzhanov В., Lee A., lskakov В. Eucaryotic protein synthesis initiation factor 2. A target for inactivation by proanthocyanidin // European Journal of Biochemistry. - 1991. Vol.197, №3. - P. 623-629.

30. lskakov B.K. Mechanisms of protein biosynthesis regulation in plant cells // Abstracts of International Conference "Protein biosynthesis".- Pushcliino, 1991.-P. 47.

31. Smailov S.K., Lee A.V., Shaikhin S.M., lskakov B.K., Sapko O.V., Mukhamedzhanov B. G.,Kunaeva R.M., Denisenko O.N. PPA - a novel specific inhibitor of protein biosynthesis initiation // Abstracts of International Conference "Protein biosynthesis".- Pushchino, 1991.- P. 30.

32. Крыкбаев P.A., Карпова O.B., Искаков Б.К. Инициация трансляций РНК сателлитного вируса. некроза табака // Тезисы 1-го Всесоюзного симпозиума "Новые методы биотехнологии растений". - Пущино, 1991. - С. 102.

33. Мадин К.И., Крыкбаев Р.А., Шманов М.А., Карпова О.В., Искаков Б.К. Роль 5'-нетранслируемой последовательности мРНК в регуляции биосинтеза белка у растений // Тезисы 1-го Всесоюзного симпозиума "Новые методы биотехнологии растений". - Пущино, 1991. - С. 103.

34. Shaikhin S.M., Smailov S.K., Lee A.V., Kozhanov E.V., lskakov B.K. Interaction of wheat germ translation initiation factor 2 with GDP and GTP // Biochimie. - 1992. - Vol.74, №5. - P. 447-454.

35. Искаков Б.К., Мадин К.И. Обнаружение и характеристика 45S рибонуклеопротеидных частиц зародышей пшеницы // Биополимеры и клетка. - 1992. - Т.8, № 3. - С. 9-18.

36. Iskakov В., Nakisbekov N., Madin K, Zhanybekova S., Polimbetova N. The novel small RNA from translation preinitiation complexes of wheat embryos / / Abstracts of 3-rd "Translational Control" Conference. - Cold Spring Harbor, USA, 1992. - P. 139.

37. Smailov S., Shaikhin S., Lee A., Iskakov B. Absence of translational control by phosphorylation of eIF-2 and EF-2 in plant cell // Abstracts of 3-rd "Translational Control" Conference. - Cold Spring Harbor, USA, 1992. - P. 226.

38. Kudlicki W., Picking W.D., Kramer G., Hardesty В., Smailov S.K., Mukhamedzhanov B.G., Lee A.V., Shigaeva A.M., Iskakov B.K. A novel specific inhibitor of eIF-2 from Alhagi kirgizorum S. // Известия AH PK, Серия биол. - 1992. - Вып. 4(172). - С. 3-10.

39. Мундус Д.А., Малыгин А.А., Зенкова М.А., Репкова М.Н., Веньяминова А.Г., Смаилов С.К., Ли А.В., Искаков Б.К., Врацких Л.В., Ямковой В.И., Карпова Г.Г. Аффинная модификация 40S субчастиц из плаценты человека производными pAUG и pAUGU3 // Молекулярная биология. -1992. - Т.26, Вып.4. - С. 949-956.

40. Искаков Б.К. Механизмы регуляции биосинтеза белка в клетках растений // Тезисы докл. 2-го Российского симпозиума "Новые методы биотехнологии растений". - Пущино, 1993. - С. 80.

41. Смаилов С.К., Ли А.В., Искаков Б.К. Изучение фосфорилирования фактора элонгации трансляции 2 (EF-2) зародышей пшеницы // Молекулярная биология. - 1993. - Т. 27, Вып.З. - С. 708-715.

42. Smailov S.К., Lee A.V., Iskakov B.K. Study of phosphorylation of translation elongation factor 2 (EF-2) from wheat germ // FEBS Letters. - 1993. - Vol.321, No.2. - P. 219-223.

43. Iskakov B.K., Madin K.I. Characterization of 45S ribonucleoprotein particles detected in wheat embryo cytoplasm // Plant Science. - 1994. - Vol.96, №12. - P. 99-108.

44. Iskakov В., Zhanybekova S., Madin K, Smailov S., Lee A., Polimbetova N. Properties of the novel small RNA from wheat embryo ribosomes // Abstracts of 4th International Congress of Plant Molecular Biology. - Amsterdam, 1994. - Poster №300.

45. Zhanybekova S.Sh., Polimbetova N.S., Nakisbekov N.O., Iskakov B.K. Detection of the novel small cytoplasmic RNA in wheat embryo cells // Reports Nat.Acad.Sci. R.K. - 1995. - Vol.5. - P. 78-84.

46. Жанабекова С.Ш., Полимбетова Н.С., Накисбеков Н.О., Искаков Б.К. Низкомолекулярные ядерные рибонуклеопротеидные частицы зародышей пшеницы // Известия HAH Р.К. - 1995. - № 2. - С. 15-23.

47. Iskakov В.К., Shmanov М.А., Polimbetova N.S., Zhanybekova S.Sh., Lee A. V., Galiakparov N.N. Properties and function of the novel small RNA detected in wheat embryo ribosomes // Abstracts of A.Bayev Memorial Conference. - Moscow, 1996. - P. 216.

48. Lee A.V., Smailov S.K., Shaikhin S.M., Galiakparov N.N., Akbergenov R.Zh., Iskakov B.K. The wheat cap-binding protein is not phosphorylated in vitro and in vivo // Abstracts of A.Bayev Memorial Conference. - Moscow, 1996. -P. 219.

49. Жаныбекова С.Ш., Полимбетова H.C., Накисбеков H.O., Искаков Б.К. Обнаружение в рибосомах зародышей пшеницы новой малой РНК, индуцируемой тепловым шоком // Биохимия. - 1996. - Т. 61, вып. 5. - С. 862-870.

50. Iskakov В.К., Shmanov М.А., Polimbetova N.S., Zhanybekova S.Sh., Lee A.V., Galiakparov N.N. Effect of the novel small RNA detected in wheat embryo ribosomes on translation of mRNA with viral 5'-leader sequence // Abstracts of Xth International Congress of Virology. - Jerusalem, 1996. - P. 235, Poster No.PW50-7.

51. Zhanybekova S.Sh., Polimbetiva N.S., Shmanov M.A., Lee A.V., Akbergenov R.Zh., Iskakov B.K. Properties and possible function of the novel small RNA detected in wheat embryo ribosomes // Abstracts of "Translational Control" Conference. - Cold Spring Harbor, USA, 1996. - P. 301.

52. Полимбетова H.C., Жаныбекова С.Ш., Ли A.B., Искаков Б.К. Действие теплового шока на синтез малых цитоплазматических РНК высших растений // Физиология растений. - 1996. - Т.43, № 6. - С. 887-893.

Подписано в печать 28. 08. 97. Формат 60x84'/16. Бум. тип. N9 1, Печать офсетная. Усл.-п. л. 3,3. Уч.-изд. л. 3,4. Тираж 100. Заказ 137.

Издательство „Гылым" АН — МН РК 480100, Алматы, ул. Пушкина, 111/113