Структурные и функциональные особенности рекомбинантных белков вируса гепатита C тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Гудим, Елена Александровна

• Гудим, Елена Александровна
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Гудим, Елена Александровна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературных данных.

1.1. Строение вируса гепатита С (ВГС).

1.2. Молекулярная биология ВГС.

1.2.1. Клеточная культура и модели животных.

1.2.2. Организация генома и генетическая вариабельност

1.2.3. Структура белков ВГС и их функции.

1.2.4. Цикл репликации ВГС.

1.2.5. Патогенез, диагностика и лечение гепатита С.

1.3. Взаимодействие белка Е2 ВГС с клеточной поверхностью.

1.3.1. Функциональная организация белка Е2.

1.3.2. Структура рецептора CD81.

1.3.3. Взаимодействие белка Е2 с рецептором CD81.

1.3.4. Взаимодействие белка Е2 с другими рецепторами для ВГС.

1.4. Структурные и функциональные особенности белка NS3 ВГС.

1.4.1. Сериновая npOTea3aNS3 и механизмы ее ингибирования.

1.4.2. Структура и функции хеликазы NS3.

1.5. Роль белков ВГС в гуморальном и клеточном иммунитете.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Клетки, плазмиды, культивирование.

2.2. Клонирование рекомбинантного белка Е2(384-661) ВГС для экспрессии в E.coli.

2.3. Клонирование рекомбинантного полноразмерного белка NS3 ВГС для экспрессии в E.coli.

2.4. Экспрессия рекомбинантных белков Е2, NS3 и CD81 в клетках E.coli.

2.5. Очистка телец включения.

2.6. Очистка рекомбинантного Е2 на Ni-NTA смоле.

2.7. Очистка рекомбинантного рецептора CD81 на глютатион-сефарозе 4В.

2.8. Взаимодействие рекомбинантного белка Е2 с рецептором CD81.

2.9. Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA).

2.10. Иммуноблоттинг.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Получение рекомбинантного функционально активного белка Е2 (384-661) ВГС.

3.1.1. Клонирование рекомбинантного белка Е2 (384-661) ВГС.

3.1.2. Экспрессия Е2(384-661) в клетках E.coli BL21[DE3].

3.1.3. Выделение и очистка белка Е2 на Ni-NTA смоле.

3.1.4. Взаимодействие полученного рекомбинантного белка Е2(384-661) с моноклональными антителами.

3.1.5. Экспрессия, выделение и очистка рецептора CD81.

3.1.6. Взаимодействие рекомбинантного белка Е2(384-661) с рецептором CD81.

3.2. Получение рекомбинантного полноразмерного белка NS3 ВГС. Изучение его взаимодействия с анти-ВГС антителами в сыворотках инфицированных ВГС.

3.2.1. Клонирование рекомбинантного полноразмерного белка NS3 ВГС.

3.2.2. Экспрессия и очистка полноразмерного белка NS3 в клетках Е. coli М-15 [REP4].

3.2.3. Взаимодействие рекобинантного белка NS3 с сыворотками больных гепатитом С.

3.3. Определение диагностического, прогностического, клинического значения детекции антител к полученному рекомбинантному белку NS3.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурные и функциональные особенности рекомбинантных белков вируса гепатита C»

Вирусом гепатита С (ВГС) инфицировано более 170 миллионов человек во всем мире. ВГС известен как один из наиболее распространенных факторов, вызывающих острые и хронические гепатиты у человека и шимпанзе. Хроническая инфекция развивается приблизительно в 50-80% случаев и в конце концов приводит 20-50% пациентов к циррозу и приблизительно 5% пациентов - к гепатоклеточной карциноме [Gardner et al., 2003; Pawlotsky, 2004; Panther, 2004].

Гликопротеиновую часть вирусной оболочки представляют собой гетеродимерные нековалентные комплексы оболочечных гликопротеинов Е1 и Е2. Основным рецептором для ВГС считается CD81, который взаимодействует с белком оболочки Е2. Одним из механизмов элиминации вируса является выработка анти-Е2 антител, нейтрализующих связывание ВГС с клетками. В белке оболочки Е2 ВГС найдены как линейные, так и конформационные эпитопы. [Clayton et al., 2002]. ВГС высоко изменчив, что определяет трудности в его изучении [Shaw, 2003]. Поэтому при анализе иммунного ответа необходимо учитывать все изоляты вируса. Поскольку из-за высокой скорости мутации ВГС постоянно появляются новые вирусные варианты, гуморальный иммунитет к этим вирусным инфекциям сохраняется лишь до появления нового сероварианта возбудителя, что не позволяет рассчитывать на долговременный эффект вакцинации только одним белком [Berzovsky et al., 2004].

В острой фазе антитела к неструктурным белкам определяются позже, чем антитела к структурным белкам. Белок NS3 относится к неструктурным белкам ВГС и обладает несколькими каталитическими функциями. Высокие титры антител к NS3 в острой фазе гепатита С рассматривают как маркер хронизации [Jovilet-Reynaud et al., 2004].

Таким образом, получение рекомбинантных функционально активных белков ВГС имеет огромное диагностическое и клиническое значение. Дальнейшие исследования с использованием данных белков важны не только для понимания различий в механизме иммунного ответа на вирусы к различным генотипам, но и получения терапевтической вакцины.

Цель и задачи работы. Целью данной работы является изучение структурных и функциональных особенностей рекомбинантных белков вируса гепатита С.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить рекомбинантный функционально активный белок Е2 вируса гепатита С, изучить его взаимодействие с рецептором CD81.

2. Получить рекомбинантный полноразмерный белок NS3 вируса гепатита С, изучить его взаимодействие с анти-ВГС антителами в сыворотках инфицированных ВГС.

3. Определить диагностическое, прогностическое, клиническое значение детекции антител к полученным рекомбинантным белкам.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Получены и охарактеризованы рекомбинантные белки Е2 и NS3 ВГС, экспрессированные в E.coli. Показано, что негликозилированная форма Е2 эффективно взаимодействует как с моноклональными антителами, полученными против эукариотического гликопротеина Е2, так и с человеческим клеточным рецептором CD81. Таким образом, метод получения рекомбинантного функционально активного негликозилированного Е2 в бактериальных клетках эффективен и наиболее экономичен, чем получение эукариотического гликопротеина Е2. Кроме того, нами получен полноразмерный рекомбинантный белок NS3 ВГС и показана возможность его использования для детекции анти-NS3 антител в тест-системах в сыворотках больных гепатитом С.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Гудим, Елена Александровна

выводы

1. С помощью панели анти-Е2 моноклональных антител и рецептора CD81 показано, что полученный рекомбинантный белок Е2 вируса гепатита С является функционально активным.

2. Получен рекомбинантный полноразмерный белок NS3 ВГС. Определено наличие антител к NS3 в сыворотках больных гепатитом С.

3. Полученные рекомбинантные белки Е2 и NS3 имеют важное диагностическое и прогностическое значение и могут быть использованы в тест-системах для детекции aHTH-NS3 антител в сыворотках больных гепатитом С.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Гудим, Елена Александровна, 2004 год

1. Мохонов В.В., Новиков Д.В., Самохвалов Е.И., Шаталов А.Г., Прилипов А.Г. // Структурные белки вируса гепатита С // Вопросы вирусологии, №1, 2002.

2. Ястребова О.Н. // Гепатит С // Кольцово, С. 30, 2000.

3. Artsaenko O., Tessmann K., Sack M., Haussinger D., Heintges T. // Abrogation of hepatitis С virus NS3 helicase enzymatic activity by recombinant human antibodies // J. Gen. Virol., v. 84(Pt 9), pp. 2323-2332, 2003.

4. Bartenschlager R., Kaul A., Sparasio S. // Replication of the hepatitis С virus in cell culture // Antiviral. Res., v. 60(2), pp. 91-102, 2003.

5. Beard M.R., Abell G., Honda M., Carroll A., Gartland M., Clarke В., Suzuki K., Lanford R., Sangar D.V., Lemon S.M. // An infectious molecular clone of a Japanese genotype lb hepatitis С virus // Hepatology, v. 30(1), pp. 316324, 1999.

6. Berzovsky J.A., Ahlers J.D., Janik J., Morris J., Oh S., Terabe M., and Belyakov I.M. // Progress on new vaccine strategies against chronic viral infections // J. Clin. Invest., v. 114, pp. 450-462, 2004.

7. Beeck A., Dubuisson J. // Topology of hepatitis С virus envelope glycoproteins // Rev. Med. Virol., v. 13(4), pp. 233-241, 2003.

8. Blight K.J., Kolykhalov A.A., Rice C.M. // Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture // Science., v. 290(5498), pp. 1972-1974, 2000.

9. Blight K.J., McKeating J.A., Marcotrigiano J., Rice C.M. // Efficient replication of hepatitis С virus genotype la RNAs in cell culture // J. Virol., v. 77(5), pp. 3181-3190, 2003.

10. Carloni G., Iacovacci S., Sargiacomo M., Ravagnan G., Ponzetto A., Peschle C., Battaglia M. // Susceptibility of human liver cell cultures to hepatitis С virus infection // Arch. Virol. Suppl., v. 8, pp. 31-39, 1993.

11. Carlos M.P., Yamamura Y., Vu Q., Conzen K., Anderson D.E., Torres J.V. // Humoral immunity to immunodominant epitopes of Hepatitis С vims inindividuals infected with genotypes la or lb // Clin. Immunol., v. 111(1), pp. 22-27, 2004.

12. Carrere-Kremer S., Montpellier-Pala C., Cocquerel L., Wychowski C., Penin F., Dubuisson J. // Subcellular localization and topology of the p7 polypeptide of hepatitis С virus // J. Virol., v. 76(8), pp. 3720-3730, 2002.

13. Chen L., Chen P., Fan G., Li L., Liu C. // Localization of hepatitis С virus core protein in the nucleus of peripheral blood mononuclear cells of hepatitis С patients // Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi., v. 16(1), pp. 37-39, 2002.

14. Clayton R.F., Owsianka A., Aitken J., Graham S., Bhella D., Patel A.H. // Analysis of antigenicity and topology of E2 glycoprotein present on recombinant hepatitis С virus-like particles // J.Virol., v. 76(15), pp. 76727682, 2002.

15. Cocquerel L., Kuo C.C., Dubuisson J., Levy S. // CD81-dependent binding of hepatitis С virus E1E2 heterodimers // J. Virol., v. 77(19), pp. 1067710683,2003.

16. Diepolder HM. // Prevention and therapy of viral hepatitis // Internist.(Berl). v. 45(2), pp. 197-209,2004.

17. Dou X.G., Talekar G., Chang J., Dai X., Li L., Bonafonte M.T., Holloway В., Fields H.A., Khudyakov Y.E. // Antigenic heterogeneity of the hepatitis С virus NS5A protein // J. Clin. Microbiol., v. 40(1), pp. 61-67, 2002.

18. Drummer H.E., Poumbourios P. // Hepatitis С virus glycoprotein E2 contains a membrane-protein heptad repeat sequence that is essential for E1E2 glycoprotein heterodimerization and viral entry // J. Biol. Chem., v. 279(29), pp. 30066-30072, 2004.

19. Drummer H.E., Wilson K.A., and Poumbourios P. // Identification of the Hepatitis С virus E2 glycoprotein binding site on the large extracellular loop of CD81 // J. Virol., v. 76(21), pp. 11143-11147, 2002.

20. Duenas-Carrera S. // DNA vaccination against hepatitis С // Curr. Opin. Mol. Ther., v. 6(2), pp. 146-150, 2004.

21. Errington W., Wardell A.D., McDonald S., Goldin R.D., McGarvey M.J. // Subcellular localization of NS3 in HCV-infected hepatocytes // J. Med. Virol., v. 59(4), pp. 456-462, 1999.

22. Failla C.M., Pizzi E., De Francesco R., Tramontano A. // Redesigning the substrate specificity of the hepatitis С virus NS3 protease // Fold. Des., v. 1(1), pp. 35-42, 1996.

23. Fan Z., Yang Q.R., Twi J.S., Sherker A.H. // Specific in vitro association between the hepatitis С viral genome and core protein // J. Med. Virol., v. 59(2), pp. 131-134, 1999.

24. Farci P., Purcell R.H. // Clinical significance of hepatitis С virus genotypes and quasispecies // Semin. Liver. Dis., v. 20(1), pp. 103-126, 2000.

25. Flint M., Dubuisson J., Maidens C., Harrop R., Guile G. R., Borrow P., and McKeating J. A. // Functional characterization of intracellular and secreted forms of a truncated hepatitis С virus E2 glycoprotein // J.Virol., v. 74, pp. 702-709, 2000.

26. Foy E., Li K., Wang C., Sumpter R. Jr., Ikeda M., Lemon S.M., Gale M. Jr. // Regulation of interferon regulatory factor-3 by the hepatitis С vims serine protease // Science., v. 300(5622), pp. 1145-1148, 2003.

27. Francesco R., Pessi A., Steinkuhler C. // Mechanisms of hepatitis С virus NS3 proteinase inhibitors // J. Viral. Hepat., v. 6(Suppl 1), pp. 23-30, 1999.

28. Frelin L. // Development of vaccines and experimental models for chroniv infections caused by the hepatitis С virus // Karolinska University Press, Stockholm, Sweden, p. 84, 2004.

29. Fried M.W. // Viral factors affecting the outcome of therapy for chronic hepatitis С // Rev. Gastroenterol. Disord., v. 4(Suppll), pp. 8-13, 2004.

30. Gardner J.P., Durso R.J., Arrigale R.R., Donovan G.P., Maddon P.J., Dragic Т., and Olson W.S. // L-SIGN (CD 209L) is a liver-specific capture receptor for hepatitis С virus // PNAS, v. 100(8), pp. 4498-4503, 2003.

31. Germi R., Crance J.M., Garin D., Zarski J.P., Drouet E. // Hepatitic С virus culture systems // Pathol. Biol (Paris)., v. 49(3), pp. 255-261, 2001.

32. Goutagny N., Fatmi A., De Ledinghen V., Penin F., Couzigou P., Inchauspe G., Bain C. // Evidence of viral replication in circulating dendritic cells during hepatitis С virus infection // J. Infect. Dis., v. 187(12), pp. 19511958,2003.

33. Grakoui A., Shoukry N.H., Woollard D.J., Han J.H., Hanson H.L., Ghrayeb J., Murthy K.K., Rice C.M., Walker C.M. // HCV persistence and immune evasion in the absence of memory T cell help // Science., v. 302(5645), pp. 659-662, 2003.

34. Howard C.R. // Hepatitis С vims: clades and properties // J. Gastroenterol. Hepatol., 17 Suppl, pp. 468-470, 2002.

35. Howe A.Y., Chase R., Taremi S.S., Risano C., Beyer В., Malcolm В., Lau J.Y. // A novel recombinant single-chain hepatitis С vims NS3-NS4A protein with improved helicase activity // Protein. Sci., v. 8(6), pp. 13321341, 1999.

36. Hsu M., Zhang J., Flint M., Logvinoff C., Cheng-Mayer C., Rice C.M., and McKeating J.A. // Hepatitis С vims glycoptoteins mediate pH-dependent cell entry of pseudotyped retroviral particles // PNAS, v. 100(12), pp. 72717276, 2003.

37. Imbert I., Dimitrova M., Kien F., Kieny M.P., Schuster C. // Hepatitis С vims IRES efficiency is unaffected by the genomic RNA 3'NTR even in thepresence of viral structural or non-structural proteins // J. Gen. Virol., v. 84(Pt6), pp. 1549-1557, 2003.

38. Jones I.M., Chan-Fook C. // Receptors for hepatitis С virus // J. Virol., pp. 10860-10861,2000.

39. Kato N. // Genome of human hepatitis С virus (HCV): gene organization, sequence diversity, and variation // Microb. Сотр. Genomics., v. 5(3), pp. 129-151,2000.

40. Keck Z.Y., Sung V.M., Perkins S., Rowe J., Paul S„ Liang T.J., Lai M.M., Foung S.K. // Human monoclonal antibody to hepatitis С virus El glycoprotein that blocks virus attachment and viral infectivity // J. Virol., v. 78(13), pp. 7257-7263, 2004.

41. Kien F., Abraham J.D., Schuster C., Kieny M.P. // Analysis of the subcellular localization of hepatitis С virus E2 glycoprotein in live cells using EGFP fusion proteins // J. Gen. Virol., v. 84(Pt3), pp. 561-566, 2003.

42. Kim D.W., Kim J., Gwack Y., Han J.H., and Choe J. // Mutational analysis of the hepatitis С virus RNA helicase // J. of Virology., v. 71(12), pp. 94009409, 1997.

43. Kitadokoro K., Bordo D., Galli G., Petracca R., Falugi F., Abrignani S., Grandi G., and Bolognesi M. // CD81 extracellular domain 3D structure: insight into the tetraspanin superfamily structural motifs // EMBO J., v.20(l), pp. 12-18,2001.

44. Kunkel M., Watowich S.J. // Biophysical characterization of hepatitis С virus core protein: implications for interactions within the virus and host // FEBS Lett., v. 557(1-3), pp. 174-180, 2004.

45. Kups J., Wozniakowska-Gesicka T. // Evaluation of specific humoral response to hepatitis С core antigen in children // Przegl. Lek., v. 60(12), pp. 802-805,2003.

46. Kwong A.D., Kim J.L., Rao G., Lipovsek D., Raybuck S.A. // Hepatitis С vims NS3/NS4A protease // Antiviral. Res., v. 41(1), pp. 67-84, 1999.

47. Kwong A.D., Kim J.L., Lin C. // Structure and function of hepatitis С virus NS3 helicase // Curr. Top. Microbiol. Immunol., v. 242, pp. 171-196, 2000.

48. Lam A.M.I., Keeney D., and Frick D.N. // Two novel conserved motifs in the hepatitis С virus NS3 protein critical for helicase action // J. of Biol. Chem., v. 278(45), pp. 44514-44524, 2003.

49. Lanford R.E., Bigger C., Basset S., Klimpel G. // The chimpanzee model of hepatitis С vims infections // ILAR J., v. 42(2), pp. 117-126, 2001.

50. Levy S., Nguyen V.Q., Andria M.L., Takahashi S. // Structure and membrane topology of TAPA-1 // J. of Biol.Chem., v. 266, pp.14597-14602, 1991.

51. Liang T.J., Hoofnagle J.H., Gallin J.I., Fauci A.S. // Hepatitis С (A volume in the biomedical research reports) // Academic Press, P. 512, 2000.

52. Lin C., and Kim J.L. // Structure-based mutagenesis study of hepatitis С virus NS3 helicase // J. of Virology., v. 73(10), pp. 8798-8807, 1999.

53. Marco S.D., Rizzi M., Volpari C., Walsh M.A., Narjes F., Colarusso S., Francesco R.D., Matassa V.G., and Sollazzo M. // Inhibition of the hepatitis С virus NS3/4A protease // J. of Biological Chemistry., v. 275(10), pp. 7152-7157, 2000.

54. Martin F., Dimasi N., Volpari C., Perrera C., Di Marco S., Brunetti M., Steinkuhler C., De Francesco R., Sollazzo M. // Design of selective eglin inhibitors of HCV NS3 proteinase // Biochemistry., v. 37(33), pp. 1145911468, 1998.

55. Mihm S., Frese M., Meier V., Wietzke-Braun P., Scharf J.G., Bartenschlager R., Ramadori G. // Interferon type I gene expression in chronic hepatitis С // Lab. Invest., v. 84(9), pp. 1148-1159, 2004.

56. Mondelli M.U., Cerino A., Meola A., Nicosia A. // Variability or conservation of hepatitis С virus hypervariable region 1? Implications for immune responses // J. Biosci., v. 28(3), pp. 287-304, 2003.

57. Moriishi K., Matsuura Y. // Mechanisms of hepatitis С virus infection // Antivir. Chem. Chemother., v. 14(6), pp. 285-297, 2003.

58. Nakano I., Fukuoa Y., Katano Y., and Hayakawa I. // Conformational epitopes detected by cross-reactive antibodies to envelope 2 glycoprotein of the hepatitis С virus // J.Infection diseases., v. 180, pp. 1328-1333, 1999.

59. Nozaki A., Ikeda M., Naganuma A., Nakamura Т., Inudoh M., Tanaka K., Kato N. // Identification of a lactoferrin-derived peptide possessing binding activity to hepatitis С virus E2 envelope protein // J. Biol. Chem., v. 278(12), pp. 10162-10173,2003.

60. Panther E., Spangenberg H.C., Neumann-Haefelin C., Rosier K., Blum H.E., von Weizsacker F., Thimme R. // The role of the virus specific T-cell response in acute and chronic HBV and HCV infection // Z. Gastroenterol., v. 42(1), pp. 39-46, 2004.

61. Petit М-A., Jolivet-Reynaud С., Peronnet E., Michal Y., and Trepo C. // Mapping of conformational epitope shared between El and E2 jn the serum-derived human hepatitis С virus envelope // JBC., p. 33., 2003.

62. Pawlotsky J.M. // Pathophysiology of hepatitis С virus infection and related liver disease // Trends. Microbiol., v. 12(2), pp. 96-102, 2004.

63. Penin F., Dubuisson J., Rey F.A., Moradpour D., Pawlotsky J.M. // Structural biology of hepatitis С virus // Hepatology, v. 39(1), pp. 5-19, 2004.

64. Pietschmann Т., Bartenschlager R. // Tissue culture and animal models for hepatitis С virus // Clin. Liver Dis., v. 7(1), pp. 23-43, 2003.

65. Pohlmann S., Zhang J., Baribaud F., Chen Z., Leslie G.J., Lin G., Granelli-Piperno A., Doms R.W., Rice C.M., McKeating J.A. // Hepatitis С virus glycoproteins interact with DC-SIGN and DC-SIGNR // J. Virol., v. 77(7), pp. 4070-4080, 2003.

66. Randall G., Grakoui A., and Rice C.M. // Clearance of replicating hepatitis С virus replicon RNAs in cell culture by small interfering RNAs // PNAS, v. 100(1), pp. 235-240, 2003.

67. Seder R.A., Hill A.V. // Vaccines against intracellular infections requiring cellular immunity // Nature., v. 406(6797), pp. 793-798, 2000.

68. Serebrov V., and Pyle A.M. // Periodic cycles of RNA unwinding and pausing by hepatitis С virus NS3 helicase // NATURE., v. 430, pp. 476-480, 2004.

69. Shaw M.L., McLauchlan J., Mills P.R., Patel A.H., McCruden E.A. // Characterisation of the differences between hepatitis С virus genotype 3 and 1 glycoproteins // J. Med. Virol., v. 70(3), pp. 361-372, 2003.

70. Shimizu Y.K., Igarashi H., Kiyohara Т., Shapiro M., Wong D.C., Purcell R.H., Yoshikura H. // Infection of a chimpanzee with hepatitis С virus grown in cell culture // J. Gen. Virol., v.79(Pt6), pp. 1383-1386, 1998.

71. Soldaini E., Wack A., D'Oro U., Nuti S., Ulivieri C., Baldari C.T., Abrignani S. // T cell costimulation by the hepatitis С virus envelope protein E2 binding to CD81 is mediated by Lck // Eur. J. Immunol., v. 33(2), pp. 455-464, 2003.

72. Steinkuhler C., Biasiol G., Brunetti M., Urbani A., Koch U., Cortese R., Pessi A., De Francesco R. // Product inhibition of the hepatitis С virus NS3 protease // Biochemistry.,v. 37(25), pp. 8899-8905, 1998.

73. Szabo E., Lotz G., Paska C., Kiss A., Schaff Z. // Viral hepatitis: new data on hepatitis С infection // Pathol. Oncol. Res., v. 9(4), pp. 215-221, 2003.

74. Tai C-L., Pan W-C., Liaw S-H., Yang U-C., Hwang L-H., and Chen D-H. // Structure-based mutational analysis of the hepatitis С virus NS3 helicase // J. of Virology., v. 75(17), pp. 8289-8297, 2001.

75. Tanikawa K. // Pathogenesis and treatment of hepatitis С virus-related liver diseases // Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int., v. 3(1), pp. 17-20, 2004.

76. Teoh N.C., Farrell G.C. // Management of chronic hepatitis С virus infection: a new era of disease control // Intern. Med. J., v. 34(6), pp. 32437, 2004.

77. Thimme R., Oldach D., Chang K-M., Steiger C., Ray S.C., and Chisari F.V. // Determinants of viral clearance and persistence during acute hepatitis С virus infection // J. Exp. Med., v. 184(10), 1395-1406, 2001.

78. Torresi J., Bharadwaj M., Jackson D.C., Gowans E.J. // Neutralising antibody, CTL and dendritic cell responses to hepatitis С virus: a preventative vaccine strategy // Curr. Drug. Targets., v. 5(1), pp. 41-56, 2004.

79. Urbani A., Bazzo R., Nardi M.C., Cicero D.O., Francesco R., Steinkuhler C., and Barbato G. // The metal binding site of the hepatitis С virus NS3 protease//J. of Biol. Chem., v. 273(30), pp. 18760-18769, 1998.

80. Wisdom G.V. // Peptide Antigens // Oxford University Press Inc., Oxford New York Tokyo., P. 252, 1994.

81. Woollard D.J., Grakoui A., Shoukry N.H., Murthy K.K., Campbell K.J., Walker C.M. // Characterization of HCV-specific Patr class II restricted CD4+ T cell responses in an acutely infected chimpanzee // Hepatology., v.38(5), pp. 1297-1306, 2003.

82. Wood J., Frederickson R.M., Fields S., and Patel A.H. // Hepatitis С vims 3'X region interacts with human ribosomal proteins // J. of Virology, v. 75(3), pp. 1348-1358, 2001.

83. Wright-Minogue J., Yao N., Zhang R., Butkiewicz N.J., Baroudy B.M., Lau J.Y., Hong Z. // Cross-genotypic interaction between hepatitis С vims NS3 protease domains and NS4A cofactors // J. Hepatol., v. 32(3), pp. 497504, 2000.

84. Xie Z.C., Riezu-Boj J.I., Lasarte J.J., Guillen J., Su J.H., Civeira M.P., Prieto J. // Transmission of hepatitis С vims infection to tree shrews // Virology., v. 244(2), pp. 513-520, 1998.

85. Xu J., Ye L., Gao J., Zhang В., Ruan H., Wu Z. // Detection of antibody against hepatitis С vims first envelope (HCV-E1) protein and its clinical application // Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi., v. 16(4), pp. 392-394, 2002.

86. Yao P., Ни X., Hu D. // Study of hepatitis С vims specific immune responses in anti-HCV positive patients without hepatitis С viremia // Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi., v. 14(3), pp. 22730, 2000.

87. Yi M., Kaneko S., Yu D.Y., Murakami S. // Hepatitis С virus envelope proteins bind lactoferrin// J. Virol., v. 71(8), pp. 5997-6002, 1997.

88. Zhang X.X., Zhang S.Y., Liu J., Lu Z.M., Wang Y. // Expression of hepatitis С virus hypervariable region 1 and its clinical significance // World J. Gastroenterol., v. 9(5), pp. 1003-1007, 2003.