Вирусный гепатит С: новые подходы к изучению патогенеза и разработка средств диагностики и профилактики тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.02, доктор биологических наук Масалова, Ольга Владимировна

• Масалова, Ольга Владимировна
• доктор биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации доктор биологических наук Масалова, Ольга Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ВИРУС ГЕПАТИТА С: ПАТОГЕНЕЗ, ДИАГНОСТИКА И

ПРОФИЛАКТИКА.

1.1. Эпидемиология и клиническое течение гепатита С.

1.2. Молекулярная организация вируса гепатита С.

1.2.1. Структура вириона.

1.2.2. Организация вирусного генома.

1.2.3. Структура и функции вирусных белков.

1.2.4. Жизненный цикл ВГС.

1.2.5. Антигенная структура белков ВГС и методы картирования В-клеточных эпитопов.

1.3. Иммунопатогенез вирусного гепатита С.

1.3.1. Врожденный иммунный ответ.

1.3.2. Адаптивный иммунный ответ.

1.3.3. Иммунный статус больных гепатитом С.

1.3.4. Лечение гепатита С.

1.3.5. Вирусные и хозяйские факторы, связанные с исходом ОГС и эффективностью IFN-терапин.

1.4. Разработка вакцин против гепатита С.

1.5. Молекулярные основы диагностики гепатита С.

1.5.1. Определение маркеров ВГС в сыворотке крови.

1.5.2. Выявление ВГС в инфицированных клетках больных гепатитом С.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Характеристика клинического материала.

2.2. Лабораторные животные и клеточные линии.

2.3. Основные материалы (рекомбинантные белки, синтетические пептиды, ДНК-конструкции, адъюванты).

2.4. Получение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела (МКА) к рекомбинантным белкам вируса гепатита С.

2.5. Биохимические и иммунохимические методы исследования.

2.5.1. Определение концентрации белка.

2.5.2 Изотипирование MICA.

2.5.3. Очистка МКА из асцитных жидкостей.

2.5.4. Приготовление конъюгатов.

2.5.5. Подготовка биологического материала.

2.5.6. Иммуноферментный анализ (ИФА).

2.5.7. Реакция иммунофлюоресценции.

2.5.8. Иммуногистохимическое и иммуноцитохимическое окрашивание in situ.

2.5.9. Выявление белков ВГС в МКПК методом проточной цитофлюориметрии.

2.5.10. Иммуноблоттинг и иммунодот.

2.5.11. Истощение МКА и сывороток.

2.6. Картирование антигенных детерминант белков ВГС с помощью технологии фагового дисплея.

2.7. Иммунологические методы исследования.

2.7.1. Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ).

2.7.2. Определение содержания популяций лимфоцитов.

2.7.3 ELISpot.

2.7.4. Определение содержания цитокинов.

2.7.5. Определение содержания растворимых форм дифференцировочных антигенов.1X

2.8. Детекция РНК вируса гепатита С и генотипирование ВГС.

2.9. Статистическая обработка результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ, ХАРАКТЕРИСТИКА И ГШИТОП ПАЯ

СПЕЦИФИЧНОСТЬ МКА.

3.1. Получение МКА к рекомбинанатным белкам core, NS3, NS4 и NS5 ВГС.

3.2. Иммунохимические свойства МКА.

3.3. Эпитопная специфичность МКА.

3.4. Взаимодействие MICA с денатурированными антигенами.

3.5. Реципрокный конкурентный анализ МКА.

3.6. Конкуренция МКА с антителами в сыворотках больных гепатитом С.

3.7. Картирование антигенных детерминант с помощью технологии фагового дисплея.

ГЛАВА 4. ВЫЯВЛЕНИЕ ВГС В МАТЕРИАЛАХ ОТ БОЛЬНЫХ ГЕПАТИТОМ С.

4.1. Детекция РНК ВГС в материалах от больных гепатитом С.

4.2. Экспрессия вирусных белков в клетках печени у пациентов с острым и хроническим гепатитом С.

4.3. Детекция белков ВГС в мононуклеарных клетках периферической крови.

4.3.1. Выявление белков ВГС в клетках крови in situ.

4.3.2. Анализ белков ВГС в клетках крови методом проточной цитометрии.

4.4. Обнаружение белков ВГС в лизатах инфицированных клеток.

4.5. Количественное определение содержания белка core ВГС в сыворотке и плазме крови.

4.5.1. Разработка метода выявления соге-белка ВГС.

4.5.2. Анализ содержания соге-белка в сыворотках больных гепатитом С

ГЛАВА 5. ИССЛЕДОВАНИЕ ИММУННОГО ОТВЕТА НА ВГС-ИНФЕКЦИЮ И АНАЛИЗ ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО СТАТУСА БОЛЬНЫХ ГЕПАТИТОМ С.

5.1. Активность антител к белкам ВГС в сыворотке и плазме крови.

5.2. Анализ относительного содержания различных популяций клеток крови.

5.3. Изменение содержания растворимых форм дифференцировочных антигенов в сыворотках крови больных гепатитом С.

5.4. Цитокиновый профиль больных гепатитом С.

ГЛАВА 6. ИНДУКЦИЯ И АНАЛИЗ ИММУННОГО ОТВЕТА НА ИММУНИЗАЦИЮ МЫШЕЙ РЕКОМБИНАНТНЫМИ БЕЛКАМИ

ВГС, ОТДЕЛЬНЫМИ ДЕТЕРМИНАНТАМИ И ДНК- ^

КОНСТРУКЦИЯМИ.

6.1. Иммунный ответ на введение рекомбинантных белков.

6.2. Иммунный ответ при иммунизации мышей ВГС-специфическими фагами и синтетическими пептидами.

6.3. Анализ иммунного ответа на ДНК-иммунизацию.

6.4. Сочетанная иммунизация животных рекомбинантными белками и ДНК-конструкциями.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Вирусный гепатит С: новые подходы к изучению патогенеза и разработка средств диагностики и профилактики»

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Гепатит С по оценкам экспертов ВОЗ и Европейского Союза относится к трем наиболее важным социально значимым инфекционным заболеваниям человека и является одной из главных причин хронических заболеваний печени. Около 3% человеческой популяции на Земле (примерно 170 млн. человек) инфицировано вирусом гепатита С (ВГС), и ежегодно около 3-4 млн. человек вновь инфицируется [Albeldawi et al., 2010]. Современные проявления эпидемического процесса при гепатите С характеризуются снижением частоты острых форм этой инфекции, но ростом числа лиц с наличием антител к ВГС в крови, а также увеличением числа микст-инфекций (в том числе сочетание ВГС- и ВИЧ-инфекции); отмечается также изменение возрастного состава больных, структуры путей передачи ВГС, увеличение показателей смертности от хронических гепатитов и цирроза печени [Михайлов М.И., Шахгильдян И.В., 2007, Шахгильдян И.В. и др., 2008]. Гепатит С характеризуется высокой частотой формирования хронической инфекции (до 70% - 80% острых форм переходят в хронический гепатит) и широким спектром клинических проявлений. Тяжесть заболевания варьирует от бессимптомного носительства до тяжелых форм с повреждением печени, прогрессирующим в цирроз и гепатоцеллюлярную карциному. Кроме того, с хроническим гепатитом С (ХГС) связывают многочисленные внепеченочные проявления, что позволяет рассматривать гепатит С как системное заболевание [Bowen, Walker, 2005, Heller, Rehermann, 2005]. Эффективность комбинированного лечения больных ХГС с помощью пегилированного интерферона-альфа (IFN-a) с рибавирином не превышает 50%, к тому же данная терапия сопряжена с серьезными побочными эффектами [Ghany et al., 2009].

За 20 лет интенсивных исследований со времени открытия ВГС определены структура вирусного РНК-генома и функции значительной части кодируемых им белков. Несмотря на успехи в изучении молекулярно-биологических свойств вируса, до сих пор не существует единой концепции патогенеза ВГСинфекции и ясного понимания механизма повреждающего действия ВГС на клетки печени. По-прежнему, не совсем ясно, какие факторы вируса и хозяина определяют исходы острого гепатита С (ОГС) - реконвалесценцию или формирование хронической инфекции, а также обусловливают прогрессирующее в цирроз течение ХГС [Sumida et al., 2010, Wadhawan et al., 2010]. Возможности изучения структуры ВГС и патогенеза заболевания ограничены сложностями культивирования вируса in vitro и узким кругом восприимчивых к вирусу животных. Большинство исследователей полагает, что ВГС не обладает прямым цитопатогенным действием, и главным фактором хронизации и прогрессирования заболевания является нарушение Т-клеточного ответа, а именно дисбаланс в соотношении ТЫ и Th2 лимфоцитов и секретируемых ими цитокинов [Albeldawi et al., 2010, Sharma, 2010].

Белки вируса изучены недостаточно в связи с их малой доступностью, так как ВГС циркулирует и накапливается в организме больных в низких концентрациях. Сведения о воздействии белков ВГС на клетки и организм противоречивы: вирусные белки могут супрессировать или усиливать иммунный ответ, ингибировать или индуцировать апоптоз [Irshad, Dhar, 2006, Pindel, Sadler, 2010, Siavoshian et al., 2005, Tang, Grisé, 2009]. До сих пор не выяснена функциональная роль белков ВГС в формировании хронического гепатита, а также не выявлены маркеры инфекции, ассоциированные с активностью и стадией ХГС. Выяснение структуры и свойств вирусных белков необходимо как для решения теоретических проблем (локализация антигенных и иммуногенных детерминант, определение протективных эпитопов), так и для решения задач практической медицины - создания профилактических средств, терапевтических препаратов и диагностических тест-систем.

Актуальной проблемой здравоохранения является усовершенствование диагностики гепатита С. Для ограничения распространения ВГС-инфекции особое значение имеет обнаружение ВГС в крови и продуктах крови. Серодиагностика, основанная на определении специфических антител к вирусным белкам, сегодня является одним из основных методов диагностики

ВГС-инфекции. Однако, одного этого теста недостаточно, поскольку антитела не выявляются на ранних стадиях инфицирования вирусом (фаза серонегативного «окна» продолжительностью до нескольких месяцев), а также при иммунодефицитных состояниях [Daniel et al., 2008]. Высокий уровень антигенной вариабельности ВГС может обусловливать ложноотрицательные результаты. Возможно также получение ложноположительных результатов за счет перекрестно-реагирующих детерминант [Pawlotsky, 2003]. Часто отмечаются несовпадения в результатах тестирования контрольных панелей сывороток с помощью различных тест-систем [Chen, Morgan et al., 2006, Chou et al., 2004]. В основе перечисленных недостатков - использование в тест-системах рекомбинантных белков и пептидов, недостаточно точно моделирующих антигенную структуру возбудителя, а также неполное знание особенностей взаимодействия ВГС с иммунной системой хозяина.

Индикация анти-ВГС антител, в основном, решает задачу этиологического диагноза, но не характеризует течение инфекции и не решает задачу прогноза исхода заболевания. По этим причинам важным является развитие методов прямого определения вирусспецифических маркеров - РНК и белков, как в сыворотке крови, так и непосредственно в клетках организма. Обнаружение указанных маркеров ВГС может решить проблему серонегативного «окна», а также дать ответ на вопрос о репликации ВГС и вирусной нагрузке. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для выявления РНК ВГС в плазме или сыворотке крови обладает высокой чувствительностью. Главным ограничением методов генодиагностики является недостаточная стандартизация [Творогова М.Г. и др., 2009, Schnuriger et al., 2006]. В последние годы активно разрабатываются иммуноферментные методы выявления белка нуклеокапсида (соге-белка) ВГС в сыворотках крови, способные служить определенной альтернативой ПЦР. [Ansaldi et al., 2006, Schnuriger et al., 2006, Seme et al., 2005]. За рубежом предложено несколько коммерческих тест-систем для детекции соге-белка ВГС, однако в нашей стране они дороги и малодоступны. В связи с этим разработка и внедрение в практику новых чувствительных, простых и относительно недорогих методов для количественного выявления ВГС в крови является чрезвычайно актуальной задачей.

Вакцина против гепатита С до настоящего времени не создана. Одна из основных причин - недостаточная изученность защитных механизмов врожденного и адаптивного иммунитета в ходе взаимодействия ВГС и иммунной системы хозяина. Сложность разработки вакцины заключается в высокой гетерогенности ВГС и способности вируса ускользать от иммунного ответа хозяина (escape effect). Имеющиеся данные позволяют заключить, что решающим фактором при элиминации ВГС является ранний, сильный, мультиспецифичный и функционально активный иммунный ответ клеточного звена иммунитета [Albeldawi et al., 2010, Sharma, 2010]. Основным подходом к созданию вакцин против гепатита С в настоящее время является использование индивидуальных рекомбинантных белков, отдельных пептидов или участков генома ВГС в составе ДНК-конструкций [Abdulhaqq et al., 2008, Houghton, Abrignani, 2005, Encke et al., 2007]. Анализ результатов опубликованных работ показал, что ни одна из кандидатных вакцин пока не способна обеспечить полноценный профилактический и терапевтический эффекты против ВГС. Можно констатировать, что, несмотря на определенные успехи, разработка вакцин против гепатита С требует дальнейших усилий и новых решений.

Вышеизложенное свидетельствует об актуальности работ, направленных на комплексный анализ роли вирусных факторов (PIIK и белков ВГС) и иммунного ответа хозяина (спектра антител к ВГС, иммунокомпетентных клеток, цитокинов и других иммунорегуляторных молекул) в патогенезе гепатита С. Эти знания необходимы для разработки эффективных средств диагностики, профилактики и создания специфических препаратов для лечения гепатита С, что позволит контролировать это широко распространенное заболевание.

Перечисленные нерешенные проблемы в изучении гепатита С определили актуальность настоящей работы, цель и задачи, которые в ней были поставлены.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цель работы - разработать критерии оценки активности гепатита путем комплексного определения РНК и белков ВГС в печени и периферической крови, маркеров функциональной активности иммунной системы у больных острым и хроническим гепатитом С для прогнозирования исходов заболевания и на основании полученных данных разработать вакцинную композицию, обеспечивающую эффективный иммунный ответ против ВГС.

Для достижения цели был поставлен ряд как фундаментальных, так и прикладных задач:

1. Получить панель моноклональных антител к белкам ВГС для изучения антигенной структуры белков и разработки иммунохимических методов выявления белков ВГС;

2. Оценить степень накопления белков ВГС в инфицированных клетках печени и в мононуклеарных клетках периферической крови больных гепатитом С;

3. Исследовать количественное содержание белка нуклеокапсида (core) ВГС в сыворотках крови больных гепатитом С и ВГС-инфицированных лиц;

4. Оценить частоту встречаемости геномных и репликативных форм РНК ВГС в печени и периферической крови больных гепатитом С;

5. Выявить особенности спектра и активности антител к белкам ВГС у пациентов с острым и хроническим гепатитом С;

6. Определить популяционный состав лимфоцитов периферической крови и исследовать содержание растворимых форм дифференцировочных антигенов в сыворотке крови больных с разными формами и стадиями гепатита С;

7. Исследовать концентрацию про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови, а также продукцию цитокинов in vitro клетками периферической крови пациентов с гепатитом С;

8. С помощью комплексного корреляционного анализа сопоставить результаты выявления вирусных ¿маркеров и параметров иммунного ответа с клиникоморфологическими и биохимическими данными больных гепатитом С.

11

Оценить роль вирусных и хозяйских факторов в повреждении печени, в течение и прогнозе гепатита С;

9. Провести иммунизацию мышей рекомбииантными белками ВГС и ДНК-конструкциями, сравнить эффективность иммунного ответа;

10.Дать сравнительную оценку иммуномодулирующего действия адъювантов, усиливающих гуморальный и клеточный иммунные ответы;

11. Выбрать оптимальные антигенные сочетания и адъюванты, создать вакцинную композицию, обеспечивающую эффективный иммунный ответ против ВГС.

Научная новизна

С использованием полученных моноклональных антител (МКА) к белкам ВГС установлена структурная организация 10 антигенных детерминант, не описанных ранее. Впервые установлено, что антигенные детерминанты белков ВГС выявляются в инфицированных клетках печени и мононуклеарных клетках периферической крови (МКПК) больных гепатитом С с различной частотой. Наиболее часто выявляются пять эпитопов на белках Ы84А, №4В и И85А, что может быть связано с пространственной доступностью этих детерминант.

С помощью иммунохимических методов, разработанных на основе МКА, получены новые данные о патогенетической роли белков ВГС. Впервые установлено, что у больных ХГС накопление соге-белка в печени и в МКПК прямо коррелирует с выявлением репликативной формы РНК ВГС. Таким образом, соге-белок может служить маркером активной репликации вируса. Частота обнаружения репликативной формы РНК ВГС, а также экспрессия белка 1Ч84А в печени и в МКПК больных ХГС сокращается при тяжелых некрозо-воспалительных процессах в печени, что может свидетельствовать о снижении репликативной активности ВГС при прогрессировании заболевания. Впервые показано, что гистологическая активность ХГС и повышение уровня ферментов печени прямо связана с наличием как геномной РНК ВГС, так и белков ВГС в ткани печени, РНК и соге-белка ВГС в сыворотках крови и белков ВГС в МКПК. При ХГС впервые установлена прямая зависимость между экспрессией белка NS5A в печени, выработкой антител к этому белку, увеличением гистологической активности и развитием фиброза, что позволяет рассматривать NS5A как один из маркеров степени повреждения ткани печени.

Анализ белков ВГС в печени больных гепатитом С впервые позволил получить прямые доказательства более высокой транскрипционной активности ВГС при ОГС по сравнению с ХГС. При ОГС выявлена прямая зависимость между накоплением белков core, NS3 и NS5A в гепатоцитах и некрозо-воспалительными изменениями ткани печени. Интенсивная экспрессия белков NS4A и NS3 в печени в период около 1 месяца после манифестации ОГС является предпосылкой спонтанной реконвалесценции.

Впервые установлено, что накопление белков ВГС в МКПК ассоциируется с иммунными расстройствами - сокращением доли мононуклеарных клеток и лимфоцитов в популяции лейкоцитов. При ОГС уменьшение количества CD 16+-лимфоцитов связано с более активной экспрессией белков NS3 и NS5A ВГС в печени (г= -0,7, р<0,05), a CD4+-лимфоцитов — с повышенным содержанием sFas (г= -0,52; р<0,05) и sHLA-DR (г= -0,56; р<0,05) в сыворотке крови.

Впервые установлена преимущественная циркуляция ВГС у пациентов с ОГС в виде безоболочечных нуклеокапсидов, а у больных с циррозом печени -в виде иммунных комплексов. Средняя концентрация соге-белка в сыворотках крови больных ХГС достоверно выше, чем у пациентов с ОГС (р<0,05).

Впервые показано, что достоверный (р<0,05) прогноз реконвалесценции может быть сделан на основе комплекса следующих иммунологических и вирусологических признаков: в течение 1 месяца от начала клинических симптомов ОГС - отсутствие антител к NS5A, низкая концентрация (<20 УЕ/мл) растворимой формы дифференцировочного антигена sCD38 и низкая концентрация (<40 пг/мл) соге-белка в сыворотке крови; в течение 3-4 месяцев - сочетание отсутствия РНК ВГС в сыворотке крови и нормализация уровня аланинаминотрансферазы (AJ1T).

При помощи технологии фагового дисплея получены фаговые клоны с пептидными вставками, имитирующими 11 антигенных детерминант белков core, NS3, NS4B и NS5A ВГС. Впервые показано, что антигенные детерминанты белков ВГС, экспонированные на поверхности фаговых частиц, являются более эффективными стимуляторами клеточного иммунного ответа по сравнению с олигопептидами со сходной аминокислотной последовательностью.

Впервые установлено, что ковалентные конъюгаты рекомбинантных белков ВГС с петидогликаном растительного происхождения иммуномодулятором иммуномаксом наиболее эффективно стимулируют гуморальный и клеточный иммунные ответы при введении низких доз антигена (около 1 мкг/мышь). Иммуномакс оказался таюке эффективным адыовантом при иммунизации мышей ДНК-плазмидой, кодирующей белки ВГС. Впервые показано, что вакцинная композиция, включающая специфические компоненты ВГС (ДНК-плазмиду и рекомбинантные белки) и иммуномакс в качестве адъюванта стимулирует интенсивный клеточный и гуморальный иммунный ответ к широкому спектру эпитопов ВГС.

Практическая значимость

Полученные МКА могут быть использованы в разных областях вирусологии и биотехнологии: для контроля качества и стандартизации рекомбинантных белков при производстве диагностических тест-систем, предназначенных для выявления антител к белкам ВГС в сыворотках крови; как аффинные сорбенты при очистке рекомбинантных белков; для разработки более чувствительных вариантов ИФА-диагностикумов ("capture''-ИФА и варианты, основанные на конкуренции); для анализа экспрессии белков ВГС в эукариотических клетках при создании новых векторных систем и ДНК-вакцин. Информация о детальном строении детерминант ВГС, полученная с помощью МКА, может применяться для усовершенствования диагностики гепатита С, для изучения влияния аминокислотных замен в белках на их антигенные свойства, а также для изучения иммунного ответа у пациентов, инфицированных разными генотипами ВГС.

Разработан чувствительный иммуноферментный метод выявления соге-белка в сыворотках как бессимптомных ВГС-инфицированных доноров, так и больных ОГС и ХГС. Получен патент на изобретение № 2329303 от 20.07.2008 г. Показано, что для обнаружения ВГС в крови пациентов с ОГС достаточно выявлять свободно циркулирующие вирионы, тогда как при ХГС следует включать анализ ВГС в составе иммунных комплексов. Преимущества количественного определения белка могут быть полезны для определения вирусной нагрузки, в том числе при оценке эффективности терапии. Низкая концентрация (<40 пг/мл) соге-белка в сыворотке в ранние сроки (около 1 месяца) после манифестации ОГС является предиктором реконвалесценции. Полученные результаты являются основой для разработки ИФА тест-системы для диагностики гепатита С, в том числе и его ранних стадий. Внедрение метода в практику позволит увеличить надежность диагностики гепатита С и вирусную безопасность гемотрансфузий.

Разработан метод выявления белков ВГС в инфицированных клетках (печень, клетки крови, трансфицированные ДНК-плазмидами клетки) in situ. Выбраны иммунные реагенты (смесь МКА к неструктурным белкам NS4 и NS5A), позволяющие выявлять натуральные белки ВГС с наибольшей чувствительностью. Показано, что обнаружение белков ВГС в зараженных клетках увеличивает эффективность диагностики. Метод полезен также для исследования фундаментальных вопросов, связанных с механизмами взаимодействия хозяин-вирус на клеточном уровне. Иммунные реагенты на основе МКА к ВГС, меченных ФИТЦ, пригодны для определения внутриклеточной экспрессии белков ВГС и анализа клеток методами проточной цитофлюориметрии и прямой иммунофлюоресценции. Конъюгаты МКА с пероксидазой хрена являются компонентами для разработки сэндвич-ИФА на антигены ВГС. На основе МКА к белкам core и NS4 разработаны варианты сэндвич-ИФА для выявления белков ВГС в лизатах клеток и тканей.

С помощью данного метода обнаружены белки ВГС в лизатах биоптатов печени пациентов с гепатитом неуточненной этиологии. Методы могут быть полезны при исследовании замороженных клеток крови, биопсийных и аутопсийных материалов, а также для анализа экспрессии белков ВГС в трансфицированных клетках.

Выявлены закономерности, которые являются предикторами рекопвалесценции: отсутствие антител к белку NS5A; низкая концентрация sCD38 и соге-белка в ранние сроки после манифестации заболевания (около 1 месяца), сочетание отсутствия РНК ВГС в сыворотке крови и нормального уровня траисиаминаз в период 3-4 мес. от начала заболевания. Включение этих параметров в обследование пациентов позволит повысить точность прогноза исхода ОГС и своевременно начать противовирусную терапию.

Выбраны адъюванты для вакцинной композиции против гепатита С: иммуномакс в виде ковалентного конъюгата с рекомбинантными белками ВГС, иммуномакс или ген GM-CSF - для ДНК-плазмиды. Эти вещества наиболее эффективно стимулируют гуморальный и клеточный иммунные ответы к широкому спектру эпитопов ВГС. Определен дизайн экспериментальной кандидаткой вакцины против гепатита С. Принцип, положенный в основу создания описанного мультиэпитопного вакцинного препарата, открывает перспективы для разработки на его основе вакцин нового поколения с использованием биотехнологических конструкций (белков и ДНК), содержащих аминокислотные и нуклеотидные последовательности структурных и неструктурных белков ВГС, в сочетании с иммуномаксом.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Получена панель из 26 МКА к 5 белкам ВГС, с помощью которых проведено антигенное картирование белков core, NS3, NS4A, NS4B и NS5A.

2. На основе МКА разработано три группы иммунохимических методов для выявления белков ВГС в материалах (сыворотка/плазма крови, клетки периферической крови и печени) от больных гепатитом С и ВГС-инфицированных лиц.

3. Антигенные детерминанты белков ВГС выявляются в инфицированных клетках с различной частотой, что может быть связано с пространственной доступностью этих детерминант.

4. Частота обнаружения белков ВГС в печени больных ОГС статистически значимо выше, чем больных ХГС, что свидетельствуют о более высокой активности репликации ВГС при ОГС по сравнению с ХГС.

5. Выявление соге-белка в сыворотке крови прямо коррелирует с гистологической и биохимической активностью, а также стадией ХГС.

6. Белки ВГС экспрессируются в мононуклеарах периферической крови большинства больных ХГС и чаще обнаруживаются в моноцитах.

7. Наличие и высокая активность антител к неструктурному белку N85А ассоциированы с более тяжелым поражением печени при ХГС, а также с неблагоприятным прогнозом исхода ОГС.

8. У больных гепатитом С выявлены изменения функциональной активности иммунной системы: повышение концентрации растворимых форм дифференцировочных антигенов, усиление экспрессии рецептора Раз-зависимого апоптоза на клетках крови, уменьшение доли Т-хелперов и №С-клеток, снижение иммунорегуляторного индекса, дисбаланс продукции цитокинов с преобладанием ТЬ2-цитокинов.

9. Мультикомпонентный препарат, созданный на основе биотехнологических продуктов - рекомбинантных белков ВГС, ДНК-конструкций, содержащих гены ВГС, в составе эукариотических векторов и иммуномодулятора иммуномакса, индуцирует наиболее эффективный клеточный и гуморальный ответ, направленный к широкому спектру эпитопов ВГС.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Масалова, Ольга Владимировна

выводы

1. Впервые на белках core, NS3, NS4A, NS4B и NS5A вируса гепатита С (ВГС) определена локализация 22 антигенных детерминант, взаимодействующих с моноклональными антителами (МКА). Установлено, что большинство эпитопов (16) являются конформационно-зависимыми, 6 эпитопов выявляют линейные участки вирусных белков. При помощи технологии фагового дисплея получены фаговые клоны с пептидными вставками, имитирующими 11 антигенных детерминант белков core, NS3, NS4B и NS5A ВГС.

2. Впервые установлены особенности экспрессии белков ВГС в печени при различных формах гепатита С. При ХГС показана прямая зависимость между накоплением белка NS5A в печени, выработкой антител к этому белку, увеличением гистологической активности и развитием фиброза, что позволяет рассматривать NS5A как один из маркеров повреждения ткани печени. Экспрессия белков core и NS4A, напротив, уменьшается по мере увеличения активности ХГС. Степень накопления белков ВГС и выявление геномной РНК ВГС в печени коррелируют с более высокой активностью аланинаминотрансферазы (AJIT) и с большей длительностью инфицирования.

3. Сравнительный анализ структурных и неструктурных белков ВГС в клетках печени показал, что у пациентов с ОГС частота обнаружения белков статистически значимо выше, чем у больных ХГС (100% против 74%, р=0,009). Вирусные белки в печени обнаруживались при ОГС с частотой 89-95%, при ХГС - 28-65%. Среднее количество ВГС-содержащих клеток печени при ОГС превышает таковое при ХГС: 51+7% против 33+3% (р=Ю,006). Полученные данные прямо свидетельствуют о более высокой активности репликации ВГС при ОГС по сравнению с ХГС.

4. В мононуклеарных клетках периферической крови (МКПК) больных ХГС геномная РНК ВГС выявляется достоверно чаще по сравнению с частотой ее выявления в сыворотке (94,6% против 76%, р=0,029). Белки ВГС найдены у 86% больных ХГС преимущественно в моноцитах (до 32% популяции), в меньшей степени - в лимфоцитах (до 5% популяции). Накопление белков ВГС в МКПК ассоциируется с уменьшением количества мононуклеаров (г= -0,66, р=0,001), повышением активности

AJ1T (р<0,05) и присутствием репликативной» формы РНК ВГС в МКПК (р<0,05).

5. Частота выявления белка core ВГС в ткани печени и МКПК значительно ниже, чем в сыворотке крови (28 и 44%, соответственно, против 71%, р<0,05). Наличие соге-белка в периферической' крови прямо коррелирует с гистологической и биохимической активностью, а также стадией'ХГС (р<0,05). Результаты определения соге-белка в сыворотках статистически значимо связаны с обнаружением геномной РНК ВГС, а в клетках крови и печени - репликативной формы РНК ВГС (р<0,05).

6. У больных гепатитом С на МКПК статистически значимо по сравнению с ВГС-негативными донорами повышена экспрессия рецептора Fas-зависимого апоптоза, CD95+ (р<0,05). Выявлена негативная корреляция между количеством СБ95+-лимфоцитов и степенью накопления в клетках печени белков ВГС: core и NS4A - при ХГС (р<0,05), NS3, NS4A и NS5A - при ОГС (р<0,05). При ХГС относительное содержание CD95+-лимфоцитов у больных с виремией в, 2 раза больше, чем у больных без виремии (р<0,05).

7. У больных гепатитом С по сравнению с ВГС-негативными донорами установлено статистически значимое (р<0,05) повышение концентраций растворимых дифференцировочных антигенов в сыворотке крови: sFas, sCD38, sHLA-I и sHLA-DR - при ОГС, sFas и sCD38 - при ХГС. Выявлена прямая корреляция между концентрациями sFas и sHLA-I и накоплением белков ВГС в клетках печени больных гепатитом С (г=0,3-0,4, р<0,05). Уровень sFas достоверно выше у больных ОГС с генотипами 1а и lb ВГС по сравнению с генотипами 2а и За (462±120 и 148±29 УЕ/мл, соответственно, р<0,05).

8. У больных ХГС наблюдается нарушение иммунного статуса, которое проявляется в статистически значимом снижении относительного количества субпопуляций лимфоцитов с маркерами CD4+ (Th) и CD16+ (NK), а также иммунорегуляторного индекса CD4+/CD8+ (р<0,05) по сравнению с ВГС-негативными донорами. У больных ОГС, кроме этого, статистически значимо увеличена субпопуляция CD8+ (CTL); сокращение количества CD16+-лимфоцитов ассоциировано с более активной экспрессией белков NS3 и NS5A ВГС в печени (г=-0,7, р<0,05).

9. У больных гепатитом С по сравнению с ВГС-негативными донорами выявлен дисбаланс цит'окинов, продуцируемых ТЫ и Th2 Т-клетками. Он заключается в гиперпродукции IL-4, IL-6, IL-10 и TNF-a в сыворотках крови, (р<0,001). Кроме этого, при ОГС повышена продукция IL-8 (р<0,002) и понижена1 - IL-2 (р<0,05). Спонтанная продукция цитокинов 1Ь-8и IL-10 клетками крови больных гепатитом С достоверно снижена по сравнению с донорами (р<0,05). Рекомбинантные белки BFC значительно слабее стимулировали секрецию клетками крови in vitro цитокинов IL-2, IFN-y и TNF-a, чем конканавалин А (р<0;01).

10.При исследовании гуморального ответа установлено, что частота встречаемости и активность антител к белку NS5A статистически значимо выше у пациентов с большей гистологической и биохимической активностью и стадией ХГС, а также у больных ОГС с последующей хронизацией заболевания (р<0,05). Эти данные позволяют рассматривать наличие антител к NS5A как неблагоприятный признак при гепатите С.

11.Анализ полученных вирусологических и иммунологических данных выявил новые прогностические критерии для- оценки исхода ОГС. Показано, что предвестниками реконвалесценции в течение первого месяца после начала заболевания служат: более интенсивное накопление белков NS4A и NS3 в печени в ранние сроки после манифестации ОГС; низкая концентрация sCD38 в сыворотке; отсутствие антител к NS5A; низкая концентрация (<40 пг/мл) соге-белка в сыворотке.

12.На основе полученных МКА разработан комплекс иммунохимических методов, которые позволили: а)- выявлять белки ВГС в. инфицированных клетках печени и крови in situ; б) - обнаруживать белки ВГС в лизатах клеток и тканей; в) - определять белок нуклеокапсида в сыворотках крови и дифференцировать безоболочечные нуклеокапсиды, вирионы ВГС и иммунные комплексы. Выбраны иммунные реагенты - смеси МКА, позволяющие выявлять натуральные белки ВГС, по крайней мере, трех генотипов (1, 2 и 3) с наибольшей чувствительностью.

13.Разработан дизайн экспериментальной кандидатной мультиэпитопной вакцины против гепатита С. Вакцинная композиция включает: специфические компоненты ВГС (ДНК-плазмиду и рекомбинантные белки) и новый оригинальный отечественный иммуномодулятор иммуномакс в качестве адъюванта. Установлено, что трехкратное введение комплексной вакцины лабораторным животным стимулирует интенсивный клеточный и гуморальный иммунный ответ к широкому спектру эпитопов ВГС.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в результате проведенных исследований получена панель из 26 МКА, направленных к пяти белкам ВГС: core, NS3, NS4A, NS4B и NS5A ВГС. Показано, что все МКА направлены к иммунодоминантным эпитопам ВГС и опознают 16 конформационно-зависимых и 6 линейных эпитопов.

На основе полученных МКА разработан комплекс иммунохимических методов, которые позволили: а) выявлять белки ВГС в инфицированных клетках печени и крови in situ; б) обнаруживать белки ВГС в лизатах клеток и тканей; в) определять белок нуклеокапсида в сыворотках крови и дифференцировать безоболочечные нуклеокапсиды, вирионы ВГС и иммунные комплексы. Установлено, что частота выявления прямых маркеров ВГС (РНК и белков) в клетках значительно больше (р<0,05) по сравнению с сывороткой или плазмой крови.

Впервые выявлены закономерности, характеризующие связи между обнаружением РНК и экспрессией белков ВГС в печени и периферической крови больных ХГС в зависимости от активности и стадии заболевания. Показано, что повышение уровня ферментов печени прямо связано с общей вирусной нагрузкой: наличием как геномной РНК ВГС, так и белков ВГС в ткани печени, РНК и соге-белка в сыворотках крови и белков ВГС в МКПК. С повышением гистологической активности ассоциированы активная экспрессия белка NS5A в печени и обнаружение белка core в периферической крови. В то же время, при тяжелых некрозо-воспалительных процессах в печени (ИГА 9-12, А=3) частота обнаружения минус-цепей РНК ВГС, а также экспрессия белка NS4A в печени и в МКПК больных ХГС сокращается, что может свидетельствовать о снижении репликативной активности ВГС при прогрессировании заболевания. Прямые корреляционные связи установлены между развитием тяжелого фиброза и цирроза ткани печени (ИФ>3) pi накоплением белка NS5A в печени, а также белка core в МКПК и сыворотке крови, при этом у пациентов с циррозом преобладающей формой циркуляции ВГС являются иммунные комплексы.

Анализ белков ВГС в печени больных гепатитом С впервые позволил получить прямые доказательства более высокой * транскрипционной активности ВГС при ОГС по сравнению с ХГС. При ОГС выявлена прямая зависимость между накоплением белков core, NS3 и NS5A в гепатоцитах и некрозо-воспалительными изменениями ткани печени. Впервые установлено, что вирусологическими предпосылками спонтанной реконвалесценции в период около 1 месяца после манифестации ОГС являются: интенсивная экспрессия белков NS4A и NS3 в печени, а также низкая концентрация (<40 пг/мл) • соге-белка в сыворотке крови; в период 3-4 месяцев - сочетание отсутствия РНК ВГС в сыворотке крови и1 нормализация уровня АЛТ.

Проведен анализ ряда параметров иммунного ответа и иммунного статуса у больных гепатитом С. Показано, что частота встречаемости и активность антител к белку NS5A статистически значимо выше у пациентов с большей гистологической и биохимической активностью и стадией ХГС, а также у больных ОГС с последующей хронизацией заболевания (р<0,05). Эти данные позволяют рассматривать наличие антител к NS5A как неблагоприятный признак при гепатите С. Показано, что иммунологическими предвестниками реконвалесценции в течение первого месяца от начала заболевания служат: низкая концентрация (<20 УЕ/мл) растворимой формы дифференцировочного антигена sCD38 в сыворотке; отсутствие антител к NS5A (р<0,05).

На основании полученных данных были выбраны иммунодоминантные области неструктурных белков NS3, NS4 и NS5A ВГС, экспрессия которых и иммунный ответ на которые связан с прогрессированием ХГС и исходом ОГС. Разработан дизайн экспериментальной кандидатной мультиэпитопной вакцины для профилактики гепатита С. Вакцинная композиция включает: специфические компоненты ВГС (ДНК-конструкции и рекомбинантные белки) и новый оригинальный отечественный адъювант иммуномакс. Установлено, что трехкратное введение комплексной вакцины лабораторным животным стимулирует интенсивный клеточный и гуморальный иммунный ответ к широкому спектру эпитопов ВГС.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Масалова, Ольга Владимировна, 2011 год

1. Антитела. Методы./Под. ред. Д. Кэтти М.: Мир. - 1991. - Т.2. - 227 с.

2. Атауллаханов Р.П., Пичугин A.B., Мельникова Т.М., Хаитов P.M. Повышение иммуногенности белковых антигенов путем конъюгации с иммуномаксом.//Иммунология. 2008. - Т.29. - №6. - С.334-337.

3. Атауллаханов Р.И., Пичугин A.B., Шишкова Н.М. и др. Клеточные механизмы иммуномодулирующего действия препарата Иммуномакса.// Иммунология. 2005. - Т.26. - С.111-120.

4. Балаян М.С., Михайлов М.И. Энциклопедический словарь вирусные гепатиты./Изд. 2-е. М.: Амипресс. - 1999. - 304 стр.

5. Баранов A.B., Малеев В.В. Иммунологические показатели при хроническом течении гепатита С.//Инфекц. болезни. 2008 а. - №1. -С.13-15.

6. Баранов A.B., Малеев В.В. Эпидемиологические и клинические особенности хронического гепатита С.//Эпидемиология и инфекционные болезни. 2008 б. - №2. - С.32-35.

7. Буеверов А.О. Некоторые аспекты изучения апоптоза при хронических вирусных гепатитах.//Клинич. перспективы гастроэнтерологии, гепатологии. 2009. - № 2. - С.11-17.

8. Вирусные гепатиты в Российской Федерации.//Аналитический обзор, 6 выпуск / Под ред. Жебруна А.Б. НИИЭМ им. Пастера, СПб. - 2006.

9. Давыдов Я. И., Тоневицкий А.Г. Предсказание линейных В-клеточных эпитопов.//Молекулярная биология. 2009. - Т.43. - №1. - С.166-174.

10. Дерябин П.Г., Вязов С.О., Исаева Е.И. и др. Персистенция вируса гепатита С в культурах клеток головного мозга мышей-сосунков.//Вопр. вирусол. 1997а. - Т.6. - С.254-258.

11. Дерябин П.Г., Исаева Е.И., Вязов С.О. и др. Хроническая инфекция культур клеток почки эмбриона свиньи, вызванная вирусом гепатита С.//Вопр. вирусол. 1997 б. - Т.6. - С.259-263.

12. Дерябин П.Г., Львов Д.К. Высокопродуктивный вариант вируса гепатита С. Выделение, характеристика, идентификация.//Доклады Академии наук РФ. 1998. - Т.358. - №5. - С.688-691.

13. Дунаева Н.В., Неустроева Ю.А., Тихомирова Т.А. Распространённость патологии почек у больных хроническим гепатитом С и клиническое значение криоглобулинемии в её развитии.//Мир вирусных гепатитов. -2008. №5. - С.17-22.

14. Ершов Ф.И., Мезенцева М.В. Интерфероны и другие цитокины при остром вирусном гепатите С.//Цитокины и воспаление. 2007. - Т.6. -С.32-35.

15. Ершов Ф.И., Наровлянский А.Н., Мезенцева М.В. Ранние цитокиновые реакции при вирусных инфекциях.//Цитокины и воспаление. 2004. -Т.З. - С.3-6.

16. Жукова О.Б., Рязанцева Н.В., Новицкий В.В. и др. Модуляция апоптоза лимфоцитов крови как способ выживания вируса гепатита С.//Иммунология. 2005. - Т.26. - №2. - С.79-83.

17. Иванисенко В.А., Ерошкин A.M. Поиск сайтов, содержащих функционально значимые замены в наборах родственных или мутантных белков./УМолекул. биология. 1997. — Т.31. - С.880-887.

18. Киселева JIM., Шаршова С.М., Ильмухина JI.B. и др. Оптимизация этиопатогенетической терапии хронического гепатита С .//Мир вирусных гепатитов. 2008. - №2. - С. 12-15.

19. Крель П.Е., Цинзерлинг О.Д. Внепеченочная локализация вируса гепатита С: особенности клинических проявлений и прогностическая значимость.//Терапевтический архив. 2009. - №11. - С.63-68.

20. Круглов И.В., Знойко О.О., Огиенко O.JI. и др. Спектр антител к различным антигенам PICV при разных вариантах течения хронической НСУ-инфекции.//Вопросы вирусологии. 2002. -№2. - С.11-15.

21. Круглов И.В., Огиенко O.JL, Знойко О.О. и др. Исследование сероконверсии к различным антигенам ВГС у больных гепатитом С с различными исходами.//Вопросы вирусологии. 2003. - №2. - С.36-40.

22. Литвинов A.C., Цыркунов В.М., Кравчук Р.И., Лукашик С.П. Механизмы липидной инфильтрации гепатоцитов при хронической НСУ-инфекции.//Инфекционные болезни. 2008. -Т.6. - №1. - С.8-12.

23. Лопаткина Т.Н. Хронический гепатит С: внепеченочные проявления, особенности клинического течения, диагностика.//Вирусные гепатиты -достижения и перспективы. 2000. - №2. - С.5-6.

24. Макашова В.В., Яковенко М.А., Флоряну А.И. и др. Особенности иммунитета у больных хроническим гепатитом С.//Эпидемиология и инфекционные болезни. 2009. - №2. — С.58-62.

25. Мезенцева М.В., Панкова Е.П., Ершов Ф.И. Цитокиновый профиль и интерфероновый статус при хроническом вирусном гепатите С.//Мир вирусных гепатитов. 2007. - №6. - С.10-16.

26. Мироджов Г.К., Одинаев Р.И., Сатарова М.И. Цитокины при хроническом гепатите С.//Клинич. медицина. 2009. - № 2. - С. 13-17.

27. Михайлов М.И., Шахгильдян И.В. Актуальные проблемы эпидемиологии вирусных гепатитов.//Мат. VII Российской научно-практической конференции «Вирусные гепатиты эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика». — 29-31 мая 2007 г. - С. 122-123.

28. Москалёв A.B., Астапенко П.В. Латентные формы вирусных гепатитов В и С. Оптимизация диагностики.//Информационный бюллетень "Новости "Вектор-Бест". 2009. - Т.51. - №1.

29. Наследникова И.О., Рязанцева Н.В., Белобородова Е.В. и др. Дизрегуляция клеточного звена иммунитета при хроническом вирусном гепатите. //Бюллетень СО РАМН. 2005. - Т. И 8. - №4. - С.59-63.

30. Николаева Л.И., Михайлов М.И., Блохина H.A. и др. Титры специфических антител в разные фазы гепатита С.//Эпидемиология и инфекционные болезни. 2004.- № 5. - С.37-42. .

31. Николаева Л.И., Петрова Е.В., Макашова В.В. и др. Изменения специфического гуморального иммунитета у пациентов с хроническим гепатитом С при противовирусной терапии.//Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2005. - № 5. - С.44-49.

32. Николаева Л.И., Финогенова М.П., Шибнев В.А. Выявление антител к консенсусной последовательности первого гипервариабельного региона белка Е2 вируса гепатита С в зависимости от фазы инфекции.//Вопр. вирусол. 2006. - №4. - С. 16-19.

33. Николаева Л.И., Макашова В.В., Петрова Е.В. и др. Снижение содержания антител к вирусу гепатита С при антивирусной терапии.//Биомедицинская химия. 2009. - №2. - С.201-211.

34. Пименов В.К., Афанасьев А.Ю., Колобов A.A. и др. Диагностические возможности иммуноферментной тест-системы для определения спектра антител к структурным и неструктурным антигенам вируса гепатита С.//Вопр. вирусол. 2000. - Т.45. - №6. - С.44-47.

35. Птицына Ю.С. Сывороточный уровень растворимых форм мембранных антигенов клеток иммунной системы при вирусных гепатитах В, С и G.// Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук. 2003.

36. Редышн Ю.В., Дронь Е.В. Иммунный и цитокиновый статус у больных хроническим вирусным гепатитом С при использовании противовирусного средства Панавир и иммуномодулятора Галавит./ЛДитокипы и воспаление. 2007. - Т.6 - №1. - С .40-46.

37. Ройт А., Бростофф Д., Мейл Д. Иммунология.//М. Мир. -2003. -620 с.

38. Рязанцева A.A., Завалишина Л.Э., Маныкин A.A. Выявление РНК вируса гепатита С в образцах печени больных хроническим гепатитом С и гепатоцеллюлярной карциномой с помощью in situ RT-PCR.//Bonp. вирусол.-2005. Т.50. - №6. - С.9-14.

39. Санин A.B., Наровлянский А.Н., Ожерелков C.B. и др. Иммуномо дуляторы в ветеринарной практике: применение и противоречия.//Ветеринарная клиника. 2008. - №10 (77).

40. Семененко Т.А. Клеточный иммунный ответ при гепатите С.//Вирусные гепатиты: достижения и перспективы. — 2001. №1. - С.3-9.

41. Семененко Т.А. Иммунологические показатели эффективности лечения хронического гепатита С.//Вирусные гепатиты: достижения и перспективы. 2004. - №1. - С.3-9.

42. Скляр Л.Ф. Роль системы цитокинов в гепатоцеллюлярном повреждении при хроническом гепатите С.//Медиц. иммунол. 2006. -Т.8.-С. 81-87.

43. Творогова М.Г., Чуланов В.П., Волкова P.A. и др. Оценки качества выявления РНК вируса гепатита С методом ПЦР в Федеральной системе внешней оценки качества в 2005-2007 гг./УЖурн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2009 - №1. -С.59-62.

44. Хаитов P.M., Алексеев Л.П. Физиологическая роль главного комплекса гистосовместимости человека.//Иммунология. 2001. - №3. - С.4-12.

45. Шахгильдян И.В., Ясинский A.A., Михайлов М.И. Эпидемиологическая характеристика хронических гепатитов В и С в Российской Федерации.//Мир вирусных гепатитов. 2008. - №5 - С. 11-16.

46. Щелкунов С.Н. Нитевидные фаги Е. coli молекулярные векторы генетической мнженерии.//Соровский образовательный журнал. — 2001. - Т.7. - №8. - С.2-6.

47. Abdulhaqq S.A., Weiner D.B. DNA vaccines: developing new strategies to enhance immune responses.//Immunol. Res. 2008. - V.42. — P.219-232.

48. Aberle J.H, Formann E., Steindl-Munda P. et al. Prospective study of viral clearance and CD4(+) T-cell response in acute hepatitis C primary infection and reinfection.//J. Clin. Virol. -2006. -V.36. -P.24-31.

49. Ait-Goughoulte M., Hourioux C., Patient R. et al. Core protein cleavage by signal peptide peptidase is required for hepatitis C virus-like particle assembly.//.!. Gen. Virol. 2006. - V.87. -P.855-860.

50. Albeldawi M., Ruiz-Rodriguez E., Carey W.D. Hepatitis C virus: Prevention, screening, and interpretation of assays.//Cleve Clin. J. Med. 2010. -V. 77. - №9.-P.616-626.

51. Aloman C., Gehring S., Wintermeyer P. et al. Chronic ethanol consumption impairs cellular immune responses against HCV NS5 protein due to dendritic cell dysfunction.//Gastroenterology. 2007. - V.132. - №2. - P.698-708.

52. Al-Qahtani A., Al-Hazzani T., Al-hussain T. et al. Correlation between clinical characteristics, survival and genetic alterations in patients with hepatocellular carcinoma from Saudi Arabia.//Cancer Genet. Cytogenet. -2010. V.203. - №2. - P.269-277.

53. Alvarez-Lajonchere L., Dueñas-Carrera S. Advances in DNA immunization against hepatitis C virus infection.//Hum. Vaccin. 2009. - V.5(8). - P.568-571.

54. Alvarez-Lajönchere L., Shoukry N. H., Gra B. et al. Immunogenicity of CIGB-230, a therapeutic DNA vaccine preparation, in HCV-chronically infected individuals in a Phase I clinical trial.//J.Viral Hepatitis. 2009. -V. 16. №3. - P. 156-167.

55. Amador-Cañizares Y., Alvarez-Lajonchere L., Guerra I. et al. Induction of IgA and sustained deficiency of cell proliferative response in chronic hepatitis C.//World J. Gastroenterol. 2008. - V.14 - №44. - P.6844-6852.

56. Andre P., Komurian-Pradel F., Deforges S. et al. Characterization of low-and very-low-density hepatitis C virus RNA-containing particles .//J. Virol. -2002. V.76 - №14. - P.6919-6928.

57. Ansaldi F., Bruzzone B., Testino G. et al. Combination hepatitis C virus antigen and antibody immunoassay as a new tool for early diagnosis of infection.//! Viral. Plepat. 2006. - V.13. - P.5-10.

58. Antonaci S., Jirillo E., Schiraldi O. Soluble HLA class I antigens in chronic hepatitis C: a disease-associated manifestation or molecules modulating immunoresponsiveness?//Immunopharmacol. Immunotoxicol. 1999. — V.21. - №4. — P.727-738

59. Appel N., Schaller T., Penin F., Bartenschlager R. From structure to function: new insights into hepatitis C virus RNA replication.//.!. Biol. Chem. 2006. -V.281. - №15. — P.9833-9836.

60. Appel N., Zayas M., Miller S. et al. Essential role of domain III of nonstructural protein 5A for hepatitis C virus infectious particle assembly.//PLoS pathogens. -2008. V.4. - el000035.

61. Asselah T. NS5A inhibitors: a new breakthrough for the treatment of chronic hepatitis C.//J. Hepatol. 2011. - V.54. - №5. - P. 1069-1072.

62. Ballardini G., De Raffele E., Groff P. et al. Timing of reinfection and mechanisms of hepatocellular damage in transplanted hepatitis C virus-reinfected liver.//Liver Transpl. 2002. - V.8. - P.10-20.

63. Bare P., Massud I., Parodi C. et al. Continuous release of of hepatitis C virus (HCV) by peripheral blood mononuclear cells and B-lymphoblastoid cell-line cultures derived from FICV-infected patients.//J. Gen. Virol. 2005. - V. 86. -P.1717-1727.

64. Baril M., Brakier-Gingras L. Translation of the F protein of hepatitis C virus is initiated at a non-AUG codon in a +1 reading frame relative to the polyprotein.//Nucleic Acids Res. 2005. - V.33. - №5. - P. 1474-1486.

65. Barril G., Castillo I., Arenas M.D. et al. Occult hepatitis C virus infection among hemodialysis patients.//J. Am. Soc. Nephrol. 2008. - V.19. -P.2288-2292.

66. Bartenschlager R., Lohmann V. Replication of hepatitis C virus.//J. Gen. Virol. -2000. -V.81. -P.1631-1648.

67. Bartolomé J., López-Alcorocho J.M., Castillo I. et al. Ultracentrifugation of serum samples allows detection of hepatitis C virus RNA in patients with occult hepatitis C.//J. Virol. 2007. - V.81. - №14. -P.7710-7715.

68. Bartolomé J., Rodríguez-Iñigo E., Quadros P. et al. Detection of hepatitis C virus in thyroid tissue from patients with chronic PICV infection.//. J. Med. Virol. 2008. - V.80. - №9. - P. 1588-1594.

69. Bedossa P., Poynard T. An algorithm for the grading of activity in chronic hepatitis C.//Hepatology. 1996. - V.24. - P.289-293.

70. Belon C.A., Frick D.N. Helicase inhibitors as specifically targeted antiviral therapy for hepatitis C.//Future Virol. 2009. - V.4. - №3. - P.277-293.

71. Bhattacherjee Y., Prescott L.F., Pike I. et al. Use of NS4 peptides to identify type-specific antibody to hepatitis C virus genotypes 1, 2, 3, 4, 5 and 6.//J. Gen. Virol. 1995. - V.76. - P. 1737-1748.

72. Bigger C.B., Brasky K.M., Lanford R.E. DNA microarray analysis of chimpanzee liver during acute resolving hepatitis C virus infection.//.!. Virol. -2001. V.75. - P.7059-7066.

73. Blackard J.T., Smeaton L., Hiasa Y. et al. Detection of hepatitis C virus (HCV) in serum and peripheral blood mononuclear cells from HCV-monoinfected and HIV/HCV-coinfected persons.//.!. Infect. Dis. 2005. -V.192. -P.258-265.

74. Bocharov G., Ludewig B., Bertoletti A. et al. Underwhelming the immune response: effect of slow virus growth on CD8+ -T-lymphocyte responses.//J. Virol. -2004. V.78. - P.2247-2254.

75. Boettler T., Spangenberg H.C., Neumann-Haefelin C. et al. T cells with a CD4+CD25+ regulatory phenotype suppress in vitro proliferation of virus-specific CD8+ T cells during chronic hepatitis C virus infection.//.!. Virol. -2005. V.79. - P.7860-7867.

76. Bouvier-Alias M., Patel K., Dahari H. et al. Clinical utility of total PICV core antigen quantification: a new indirect marker of HCV replication.//Hepatology. 2002. - V.36. - P.211-218.

77. Bowen D., Walker C. Adaptive immune responses in acute and chronic hepatitis C virus infection.//Nature. 2005. - V.436. - P.946-952.

78. Boyer N., Marcellin P. Pathogenesis, diagnosis and management of hepatitis C.//J. Hepatol. -2000. -V.32. -P.98-112.

79. Brass V., Gosert R., Moradpour D. Investigation of the hepatitis C virus replication complex.//Methods Mol. Biol. -2009. -V.510. P. 195-209.

80. Bratkovic T. Progress in phage display: evolution of the technique and its application.//Cell Mol. Life Sci. 2010. - V.67. - №5. - P.749-767.

81. Brody R.I., Eng S., Melamed J. et al. Immunohistochemical detection of hepatitis C antigen by monoclonal antibody TORDJI-22 compared with PCR viral detection. // Am. J. Clin. Pathol. 1998. - V.l 10. - № 1. - P.32-37.

82. Cabrera R. An immunomodulatory role for CD4+CD25+ regulatory T lymphocytes in hepatitis C virus infection.//PIepatology. 2004. - V.40. - № 5. — P! 062-1071.•i

83. Calvaruso V., Burroughs A.K., Standish R. et al. Computer-assisted image analysis of liver collagen: relationship to Ishak scoring and hepatic venous pressure gradient.//Hepatology. 2009.,- V.49. - №4. - P.1236-1244. •

84. Castillo I., Rodrigues-Inigo E., Bartolomé J. et al. Hepatitis C virus replicates in peripheral blood mononuclear cells of patients with occult hepatitis C virus infection.//Gut. 2005. - V.54. - P.682-685.

85. Castillo I., Rodríguez-Iñigo E., López-Alcorocho J.M. et al. Hepatitis C virus replicates in the liver of patients who have a sustained response to antiviral treatment.//Clin. Infect. Dis. 2006. - V.43. -№10. - P.1277-1283.

86. Chamlian A., Benkoel L., Sahel J. et al. Immunohistochemical detection of hepatitis C virus related CI00-3 and core antigens in formalin-fixed liver tissue. //Cell .Molec. Biology. 1996. - V. 42. - P.557-566.

87. Chan S.C., Lo S.Y., Liou J.W. et al. Visualization of the structures of the hepatitis C virus replication complex.//Biochem. Biophys. Res. Commun. -2011.-V.404. -№l.-P.574-578.

88. Chang K.M. Immunopathogenesis of hepatitis C virus infection.//Clin. Liver Dis. 2003. - V.7. - P.89-105.

89. Chang M., Marquardt A.P., Wood B.L. et al. In situ distribution of hepatitis C virus replieative-intermediate RNA in hepatic tissue and its correlation with liver disease.//! Virol. 2000. - V.74. - №2. - P.944-955.

90. Chang J.C., Seidel C., Ofenloch B. Et al. Antigenic heterogeneity of the hepatitis C virus NS4 protein as modeled with synthetic peptides.//Virology. 1999. - V.257. - P.177-190.

91. Chang T.-T., Young K.-C., Yang Y.-J. et al. Hepatitis C virus RNA in peripheral blood mononuclear cells: comparing acute and chronic hepatitis C virus infection.//Hepatology. 1996. - V.23. - P.977-981.

92. Chen J.Y., Li F. Development of hepatitis C virus vaccine using hepatitis B core antigen as immuno-carrier.//World J. Gastroenterol. 2006. - V.12. -№48. - P.7774-7778.

93. Chen S.L., Morgan T.R. The Natural history of hepatitis C virus (HCV) infection.//Intern. J. Med. Sci. -2006. V.3 -P.47-52.

94. Chen M., Sallberg M., Sonnerborg A. et al. Human and murine antibody recognition is focused on the ATP/helicase, but not the protease domain of hepatitis C virus nonstructural 3 protein.//ITepatology. 1998. - V.28. -P.219-224.

95. Chen M., Sallberg M., Sonnerborg A. et al. Limited humoral immunity in hepatitis C virus infection.//Gastroenterology. 1999. - V.116. -P.135-143.

96. Choo Q., Kuo G., Weiner A.J. et.al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome.//Science. 1989. - V. 244. -P.359-362.

97. Chou R., Clark E.C., Helfand M. Screening for hepatitis C virus infection: a review of the evidence for the U.S. Preventive Services Task Force.//Ann. Intern. Med. 2004. - V.140. - №6. - P.465-479.

98. Ciccaglione A.R., Marcantonio C.5 Tritarelli E. et al. The transmembrane domain of hepatitis C virus El glycoprotein induces cell death.//Virus Res. -2004.-V. 104. -№l.-P.l-9.

99. Claassen M.A., de Knegt R.J., Tilanus H.W. et al. Abundant numbers of regulatory T cells localize to the liver of chronic hepatitis C infected patients and limit the extent of fibrosis.//! Hepatol. 2010. - V.52. - №3. - P.315-321.

100. Contini P., Ghio M., Poggi A. et al. Soluble HLA- A, -B, -C and -G molecules induce apoptosis in T and NK CD8+ cells and inhibit cytotoxic T cell activity through CD8 ligation.//Eur. J. Immunol. 2003. - V.33. - №1. -P.125-134.

101. Coppola N., Pisapia R., Tonziello G. et al. Virological pattern in plasma, peripheral blood mononuclear cells and liver tissue and clinical outcome in chronic hepatitis B and C virus coinfection.//Antivir. Ther. 2008. - V.13. -№2. — P.307-318.

102. Coquillard G., Patterson B.K. Determination of hepatitis C virus-infected, monocyte lineage reservoirs in individuals with or without HIV coinfection.//J. Infect. Dis. 2009. - V.200. - №6. - P.947-954.

103. Courouse A., Noel L., Barin F. et al. A comparative evaluation of the sensitivity of 5 anti-hepatitis C virus immunoblot assays.//Vox sanguinis. -1998. V.74. - №4 - P.217-224.

104. Cox A. L., Mosbruger T., Lauer G. M. et al. Comprehensive analyses of CD8+ T cell responses during longitudinal study of acute human hepatitis C.//Hepatology. 2005. - V.42. - P. 104-112.

105. Cramp M., Catucci P., Rossol S. et al. Hepatitis C virus (HCV) specific immune response in anti-FICV positive patients without hepatitis C viraemia.//Gut. 1999. - V.44. - P.424-429.

106. Creedon G., Mabruk M.J., Grace A. et al. Lack of association between hepatitis C viral RNA in serum and liver and histologic gradings: a study on Irish anti-D-treated patients.// Diagn. Mol. Pathol. 2002. - V.ll. - №1. -P.27-32.

107. Crespo J., Rivero M., Mayorga M. et al. Involvement of the Fas system in hepatitis C virus recurrence after liver transplantation./ZLiver Transpl. -2000. V.6. - №5. - P.562-569.

108. Crovatto M., Pozzato G., Zorat F. et al. Peripheral blood neutrophils from hepatitis C virus-infected patients are replication sites of the virus.//Haematologica. 2000. - V.85. - P.356-361.

109. Daniel H.D., Grant P.R., Garson J.A. et al. Quantitation of hepatitis C virus using an in-house real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction in plasma samples.//Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2008. - V.61. - №4. -P.415-420.

110. Delia Bella S., Crosignani A., Riva A. et al. Decrease and dysfunction of dendritic cells correlate with impaired hepatitis C virus specific CD4+ T-cell proliferation in patients with hepatitis C virus infection.//Immunology. -2007. V.121. -P.283-292.

111. Desmet V.J., Gerber M., Hoofhagle J.H. et al. Classification of chronic hepatitis: diagnosis, grading and staging.//Hepatology. 1994. - V.19. -P.1513-1520.

112. Dimitrova M, Imbert I, Kieny MP, Schuster C. Protein-protein interactions between hepatitis C virus nonstructural proteins.//J. Virol. 2003. - V.77. -P.5401-5414.

113. Dou X.-G., Talekar G., Chang J. et al. Antigenic heterogeneity of the hepatitis C virus NS5A protein.// J. Clin. Microbiol. 2002. - V.40. - P.61-67.

114. Drane D., Maraskovsky E., Gibson R. et al. Priming of CD4+ and CD8+ T cell responses using a HCV core ISCOMATRIX vaccine: a phase I study in healthy volunteers.//Human Vaccines. 2009. - V.5. - №3. - P. 151-157.

115. Egger D., Wolk B., Gosert R. et al. Expression of hepatitis C virus proteins induces distinct membrane alteration including a candidate viral replication complex.//J. Virol. 2002. - V.76. - P.5974-6984.

116. El-Awady M.K., Tabll A.A., El Abd Y.S., et al. Conserved peptides within the E2 region of Hepatitis C virus induce humoral and cellular responses in goats.// Virol. J. 2009. - V.6. - P.66.

117. El-Awady M.K., Tabll A.A., Redwan E.R.M. et al. Flow cytometric detection of hepatitis C virus antigens in infected peripheral blood leukocytes: Binding and entry .//World J. Gastroenterol. 2005. - V.ll. -№33. - P.5203-5208.

118. Elmowalid>G.A., Qiao M*., Jeong S.H. et al. Immunization with* hepatitis C virus-like- particles results in' control of hepatitis C virus infection' in chimpanzees.//Proc. Natl. Acad. Sci'. USA. 2007. -V. 104. -P.8427-8432:

119. Encke J., Findeklee .J, Geib J. et all Prophylactic and therapeutic vaccination with dendritic cells against hepatitis C virus infection.//Clin. Exp. Immunol. 2005. - V.142. - №2. - P.362-369.

120. Encke J., Geissler M., Stremme W., Wands J:R. DNA-based immunization* breaks tolerance in a hepatitis C virus transgenic mouse model.//Human, vaccines. 2006 b. - V.2. - P.78-83.

121. Encke J., Radunz W., Eisenbach C. ct al. Development of a heterologous, multigenotype vaccine against hepatitis C virus infection.//Europ. J. Clin. Investigat. 2007. - V.37. - P.396-406.

122. Enshell-Seijffers D., Denisov D., Groisman B. et al. The mapping and reconstitution of a conformational discontinuous B-cell epitope of FIIV-1.//J. Mol. Biol. 2003. - V.334. - P.87-101.

123. Enshell-Seijffers D., Smelyanski L., Gershoni J.M. The rational design of a "type 88" genetically stable peptide display vector in the filamentous bacteriophage fd.//Nucleic Acids Res. 2001. - V.29. - P.50-63.

124. Errington W., Wardell A.D., McDonald S. et al. Subcellular localisation of NS3 in HCV-infected hepatocytes.//J. Med. Virol. 1999. - V. 59. - P.456-462.

125. Farci P., Shimoda A., Wong D. et al. Prevention of hepatitis C virus infection in chimpanzees by hyperimmune serum against the hypervariable region 1 ofthe envelope 2 protein.//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - V.93. -P.15394-15399.

126. Ferns R.B., Tuke P., Sweenie C. H. Characterisation of a panel of monoclonal antibodies raised against recombinant HCV core protein.//J. Med. Virology. 1996. - V.50. - P.221-229.

127. Fields Virology//Edit. by Knipe D.M., Howley P.M. 2001. - V.l. - P.991-1127.

128. Fletcher N.F., Yang J.P., Farquhar M.J. et al. Hepatitis C virus infection of neuroepithelioma cell lines.//Gastroenterology. 2010. - V.139. - P.1365-1374.

129. Flint M., Tscherne D.M. Cellular receptors and HCV entry.//Methods Mol. Biol. 2009. - V.510 - P.265-277.

130. Fournillier A., Dupeyrot P., Martin P. et al. Primary and memory T cell responses induced by hepatitis C virus multiepitope long peptides .//Vaccine.- 2006. V.24. - P.3153-3164.

131. Francavilla V., Accapezzato D., De Salvo M., et al. Subversion of effector CD8+ T cell differentiation in acute hepatitis C virus infection: exploring the immunological mechanisms.//Europ. J. Immunology. -2004. V.34. - №2. -P.427-437.

132. Frank A.C., Zhang X., Katsounas A. et al. Interleukin-27, an anti-HIV-1 cytokine, inhibits replication of hepatitis C virus.//J. Interferon Cytokine Res.- 2010. V.30. - №6. - P.427-431.

133. Frese M., Schwarzle V., Barth K. et al. Interferon-gamma inhibits replication of subgenomic and genomic hepatitis C virus RNAs.//Hepatology. 2002. -V.35. - Pt.694-703.

134. Frey S.E., Houghton M., Coates S. et al. Safety and immunogenicity of HCV E1E2 vaccine adjuvanted with MF59 administered to healthy adults.//Vaccine. 2010. - V.28. - №38. - P.6367-6373.

135. Friebe P., Lohmann V., Krieger N., Bartenschlager R. Sequences in the 5' nontranslated region ofhepatitis C virus required for RNA replication.//J. Virol. 2001. - V.75. — P. 12047—12057.

136. Fujita N., Kaito M., Takeo M. et al. Different hepatitis C virus dynamics of free-virions and immune-complexes after initiation of interferon-a in patients with chronic hepatitis C.//J. Hepatology. 2003. - V.39. - P. 1013-1019.

137. Fujita N., Kaito MC,: Tanaka PI. et: all Hepatitis 'C virus free-viriorw and*; immune-complex dynamics during? interferon therapy with and», without; ribavirihiimgenotypeT.l b chronicrhepatitis C patients.//J; Viral: Hepat: 2006: -V.13. -P.190-198: ,

138. Gaudy C., Thevenas G. Tichet J. et ah. Usefulness of the hepatitis C virus core antigen assay for screening of a population undergoing routine medical checkup.//J'. Clin. Microbiol. 2005. - V.43. - №4. - P: 1722-1726.

139. Gehring S:, Gregory S; H., Kuzushita N., Wands J: R: Type 1 interferon augments DNA-based vaccination against hepatitis C virus core protein./'/!. MedicalVirology. 2005. - V.75: - №2. - P.249-257. .

140. Geysen II.M., Mason T.J., Rodda S.J. Cognitive features of continuous antigenic determinants.//J. Moh Recognit. 1988. - V.l. - P.32-35.

141. Geysen H.M., Rodda S.J., Mason T.J. et al. Strategies for epitope analysis using peptide synthesis./^: Immunol:. Methods. 1987. - V.l02. - P.259-274.

142. Ghabril M., Dickson R.C., Krishna M. et al. Persistence of hepatitis C RNA in liver allografts is associated with histologic progression independent of serologic viral clearance.//.!. Transplant. 2009. - V.2009. - P.297528.

143. Ghany M.G., Strader D.B., Thomas D.L., Seeff L.B. Diagnosis, management, and treatment of hepatitis C: an update. American Association for the Study of Liver Diseases.//Hepatology. 2009. - V.49. - №4. -P.1335-1374.

144. Giannini C., Brechot C. Hepatitis C virus biology.//Cell Death and Differentiation. -2003. V.10. -P.27-38.

145. Gong G.-Z., Lai L.-Y., Jiang Y.-F. et al. HCV replication in PBMC and its influence on interferon therapy.//World J. Gastroenterol. 2003. - V.9. - №2.- P.291-294.

146. Goeser T., Muller H.M., Pfaff E., Theilmann L. Characterization of antigenic determinants of the hepatitis C virus.//Virology. 1994. - V. 205. - P. 462469.

147. Gonzalez V., Padilla E., Diago M. et al. Clinical usefulness of total hepatitis C virus core antigen quantification to monitor the response to treatment with peginterferon alpha-2a plus ribavirin.//J. Viral. Hepat. 2005. - V.12. -P.481-487.

148. Gonzalez-Peralta R. P., Fang J. W., Davis G. L. et al. Optimization for the detection of hepatitis C virus antigens in the liver .//J. Hepatol. 1994. -V.20. — P.143-147.

149. Gonzalez-Peralta R.P., Fang J., Gary L. et al. Significance of hepatic expression of hepatitis C viral antigens in chronic hepatitis C.//Dig. Dis. Sci.- 1995. V.40. - P.2595-2601.

150. Gouda I., Nada O., Ezzat S. et al. Immunohistochemical detection of hepatitis C virus (genotype 4) in B-cell NHL in an Egyptian population: correlation with serum HCV-RNA.//Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. -2010.-V.18. -№l.-P.29-34.

151. Gouttenoire J., Penin P., Moradpour D. Hepatitis C virus nonstructural protein 4B: a journey into unexplored territory.//Rev Med Virol. 2010. -V.20.-P.l 17-129.

152. Gowans E.J. Distribution of markers of hepatitis C virus infection throughout the body.//Semin. Liver Dis. 2000. - V.20. - P.85-102.

153. Guglietta S., Garbuglia A.R., Salichos L., et al. Impact of viral selected mutations on T cell mediated immunity in chronically evolving and self limiting acute HCV infection.//Virology. 2009. - V.386. - P.398-406.

154. Guobuzaite A., Chokshi S., Balciüniene L. et al. Viral clearance or persistence after acute hepatitis C infection: interim results from a prospective study.//Medicina. 2008. - V.44. - №7. -P.510-520.

155. Habersetzer F., Baumert T.F., Stoll-Keller F. GI-5005, a yeast vector vaccine expressing an NS3-core fusion protein for chronic HCV infection.//Curr. Opin. Mol. Ther. 2009 b. - V.l 1. - №4. - P.456-462.

156. Hahn C., Cho Y., Kang B. et al. The HCV Core protein acts as a positive regulator of Fas-mediated apoptosis in a human limphoblastoid T-cells line.//Virology. 2000. - V.276 - P. 127-137.

157. Haller A.A., Lauer G.M., King T.H. et al. Whole recombinant yeast-based immunotherapy induces potent T cell responses targeting HCV NS3 and Core proteins.-2007. №8. -V.25. - P. 1452-1463.

158. Harris R.A., Sugimoto K., Kaplan D.E. et al. Human leukocyte antigen class II associations with hepatitis C virus clearance and virus-specific CD4 T cell response among Caucasians and African Americans.//Hepatology. 2008. -V.48. - №1. — P.70-79.

159. Heller T., Rehermann B., Acute hepatitis C: a multifaceted disease.//Semin. Liver. Dis. -2005. V.25. -P.7-17.

160. Heller T., Saito S., Auerbach J. et al. An in vitro model of hepatitis C virion production.//Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2005. - V.l02. - №7. - P.2579-2583.

161. Fliroishi K., Eguchi J., Ishii S. et al. Immune response of cytotoxic T lymphocytes and possibility of vaccine development for hepatitis C virus infection.//! Biomed. Biotechnol. 2010. - V.2010. - P.263810.

162. Hoofnagle J.H. Course and outcome of hepatitis C.//Hepatology. 2002. -V.36. -P.S21-S29.

163. Hopp T.P., Woods K.R. Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences.//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. - V.78. — P.3824-3828.

164. Horner S.M., Gale M. Jr. Intracellular innate immune cascades and interferon defenses that control hepatitis C virus.//J. Interferon Cytokine Res. 2009. - V.29. - №9. - P.489-498.

165. Hosoi K., Hagihara M., Kagawa T. et al. The serum soluble PILA-DR antigens as a predictive marker the response to interferon-alpha treatment in patients with chronic hepatitis C.//Tokai J. Exp. Clin. Med. 2000. - Y.25. — P.l 17-124.

166. Houghton M., Abrignani S. Prospects for a vaccine against the hepatitis C virus .//Nature. 2005. - V.436. - P.961-966.

167. Iio S., Hayashi N., Mita E. et al. Serum levels of soluble Fas antigen in chronic hepatitis C patients.//J. Hepatology. 1998. - V.29. - P.517-523.

168. Irshad M., Dhar I. Hepatitis C virus core protein: an update on its molecular biology, cellular functions and clinical implications .//Med. Princ. Pract. — 2006. V. 15. - №6. - P.405-416.

169. Isaguliants M.G., Petrakova N.V., Mokhonov V.V. DNA immunization efficiently targets conserved functional domains of protease and ATPase/helicase of nonstructural 3 protein (NS3) of human hepatitis C virus.//Immunol. Lett. -2003. V.88. - P. 1-13.

170. Jain N., Nguyen H., Chambers C., Kang J. Dual function of CTLA-4 in regulatory T cells and conventional T cells to prevent multiorgan autoimmunity.//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2010. -V.107. -P.1524-1528.

171. Jennings T.A., Chen Y., Sikora D. et al. RNA unwinding activity of the hepatitis C virus NS3 helicase is modulated by the ns5b polymerase.//Biochemistry. 2008. - V.47. - P.l 126-1135.

172. Jiao X., Wang R.Y., Feng Z. et al. Modulation of cellular immune response against hepatitis C virus nonstructural protein 3 by cationic liposomeencapsulated DNA immunization.//Hepatology. 2003. - V.37. - P.452-460.

173. Jiao J., Wang J., Sallberg M. Effects of HCV proteins in current HCV transgenic models .//Hepatol. Res. 2010. - Y.40. - №2. - P.l 15-124.

174. Jirasko V., Montserret R., Lee J. et al. Structural and functional studies of nonstructural protein 2 of the hepatitis C virus reveal its key role as organizer of virion assembly.//PLoS Pathog. -2010. V.6. - №12. - el001233.

175. Jolivet-Reynaud C., Adida A., Michel S. et al. Characterization of mimotopes mimicking an immunodominant conformational epitope on the hepatitis C virus NS3 helicase.//J. Med. Virol. 2004. - V.72. - P.385-395.

176. Jolivet-Reynaud C., Dalbon P., Viola F. et al. HCV Core Immunodominant region analysis using mouse monoclonal antibodies and human sera: characterization of major epitopes useful for antigen detection.//J. Med. Virol. 1998. - V.56. — P.300-309.

177. Jones C., Murray C., Eastman D. et al. Flepatitis C virus p7 and NS2 proteins are essential for production of infectious virus.//J. Virol. 2007. - V.81. -P.8374-8383.

178. Kanda T., Steele R., Ray R., Ray R. Inhibition of intrahepatic IFN-(gamma) production by hepatitis C virus non-structural protein 5a in transgenic mice.//J. Virol. -2009. -V.83. -P.8463-8469.

179. Kaplan D.E., Sugimoto K., Newton K. et al. Discordant role of CD4 T cell response relative to neutralizing antibody and CDS T-cell responses in acute hepatitis C.//Gastroenterology. -2007. V. 132. -P.654-666.

180. Kato T., Matsumura T., Heller T. et al. Production of infectious hepatitis C virus of various genotypes in cell cultures.//J. Virol. 2007. - V.81. -P.4405-4411.

181. Khoo K.M., Han M.-K., Park J.B. et al. Localization of the cyclic ADP-ribose-dependent calcium signaling pathway in hepatocyte nucleus.//J. Biol. Chem. 2000. - V.275. - №32. - P.24807-24817.

182. Khudyakov Y.E., Khudyakova N.S., Jue D.L. et al. Linear B-cell epitopes of the NS3-NS4-NS5 proteins of the hepatitis C virus as modeled with synthetic peptides.//Virology. 1995. - V.206 - P.666-672.

183. Kim J.L., Morgenstern K.A., Griffith J.P. et al. Hepatitis C virus RNA helicase domain with a bound oligonucleotide: the crystal structure provides insights into the mode of unwinding.//Structure. 1998. - V.6. - P:89-100.

184. Klade C., Wedemeyer H., Berg T. et al. Therapeutic vaccination of chronic hepatitis C nonresponder patients with the peptide vaccine IC41.//Gastroenterology. —2008. — V.134. №5. -P.1385-1395.

185. Klimashevskaya S., Obriadina. A., Ulanova T. et al. Distinguishing'acute from chronic and resolved hepatitis C virus (HCV) infections by measurement of anti-HCV immunoglobulin G avidity index.//J. Clin. Microbiol. 2007. - V.45. - №10. - P.3400-3403.

186. Knodell R.G., Ishak K.G., Black W.C. Formulation and application of a numerical scoring system of assessing hystological activity in asymptomatic chronic active hepatitis.//Hepatology. 1981. - №1. - P.431-435.

187. Kohler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity .//Nature. 1975. - V.256. -P.495-497.

188. Koike K. Steatosis, liver injury, and hepatocarcinogenesis in hepatitis C viral infection.//.!. Gastroenterol. 2009: - V.44. - Suppl. 19. - P.82-88.

189. Kolykhalov A., Mihalik K., Feinstone S., Rice C. Flepatitis C virus-encoded enzymatic activities and conserved RNA elements in the 3' nontranslated region are essential for virus replication in vivo.//J. Virol. 2000. - V.74. -P.2046-2051.

190. Konan K., Giddings T., Ikeda M. et al. Nonstructural protein precursor NS4A/B from hepatitis. C virus alters function and ultrastmcture of host secretory apparatus.//.!. Virol. 2003. - V.77. - №14. - P.7843-7855.

191. Kountouras J., Zavos C., Chatzopoulos D. Apoptosis in hepatitis C.//J. Viral. Hepat. 2003. - V.10. - P.335-342.

192. Koutsoudakis G., Kaul A., SteinmannE. et al. Characterization of the early steps of hepatitis C virus infection by using luciferase reporter viruses.//! Virol. 2006. - V.80. - P.5308-5320.

193. Kriegs M., Burckstummer T., Himmelsbach K. et al. The hepatitis C virus non-structural NS5A protein impairs both the innate and adaptive hepatic immune response in vivo.//J. Biol. Chem. 2009. - V.284. -P.28343-28351.

194. Krishnadas D., Ahn J., Han J. et al. Immunomodulation by hepatitis C virus-derived proteins: targeting human dendritic cells by multiple mechanisms .//Int. Immunol. -2010. V.22. - №6. - P.491-502.

195. Lande R., Urbani F., Carlo B. et al. CD38 ligation plays a direct role in* the induction of IL-ip, IL-6 and IL-101 secretion in resting human monocytes.//J. Cell. Immunol. 2002. - V.220. - P. 30-38*

196. Lang K.5 YanJ., Draghia-Akli R.et al. Strong HCV NS3- and NS4A-specific cellular immune responses induced in mice and Rhesus macaques by a novel HCV genotype la/lb*consensus DNA vaccine.//Vaccine. 2008. - V.26. -P.6225-6231.

197. Laperche S., Marrec N.L., Simon N. et al. A new HCV core antigen assay based on disassociation of immune complexes: an alternative to molecular biology in the diagnosis of early HCV infectiom//Transfusion. 2003. -V.43. — P.958-962.

198. Lau G., Fang J., Wu P. et al. Detection of hepatitis C virus genome in formalin-fixed.parafin-embedded liver tissue by in situ reverse transcription polymerase chane reaction.//.!. Med. Virol. 1994. - V.44. - №5. - P.406-409.

199. Lee K., Choi J., Ou J., Lai M. The C-terminal transmembrane domain of hepatitis C virus (HCV) RNA polymerase is essential for HCV replication in vivo .//J. Virol. 2004. - V.78. - №7. - P.3797-3802.

200. Lee A., Manning W., Arian C. et al. Priming of hepatitis C virus-specific cytotoxic T lymphocytes in mice following portal vein injection of a liver-specific plasmid DNA.//Hepatology. 2000. - V.31. - P.1327-1333.

201. Liefhebber J., Brandt B., Broer R. et al. Hepatitis G virus ns4b carboxy terminal domain is a membrane binding

202. Lindenbach B., Evans M. J>., Syder A. J. et al. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture.//Science. 2005. - V.309: - P.623-626.

203. Lin L., Libbrecht L., Verbeeck J. et al. Quantitation of replication of the HCV genome in human livers with end-stage cirrhosis by strand-specific real-time RT-PCR assays: methods and clinical relevance.//! Med. Virol. -2009.-V.81. -№9.-P.1569-1575.

204. Liu Y.J. Dendritic cell subsets and lineages, and their functions in innate and adaptive immunity .//Cell. 2001. - V.l 06. - P.259-262.

205. Liu Z., Yang F., Robotham J., Tang H. Critical role of cyclophilin A and its prolyl-peptidyl isomerase activity in the structure and function of the hepatitis C virus replication complex.//J. Virol. 2009. — V.83. - №13. -P.6554-6565.

206. Logvinoff C., Major M., Oldach D. et al. Neutralizing antibody response during acute and chronic hepatitis C virus infection.//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. - V. 101. - P. 10149-10154.

207. Lorenzo J., Castro A., Aguilera A. et al. Total HCV core antigen assay A new marker of HCV viremia and its application during treatment of chronic hepatitis C.//J. Virol. Methods. 2004. - V.120. - P. 173-177.

208. Lundin M., Lindstrom H., Gronwall C., Persson M. Dual topology of the processed hepatitis C virus protein ns4b is influenced by the NS5A protein.//J. Gen. Virol. -2006. -V.87. P. 3263-3272.

209. MacDonald J., Duffy M., Brady M. et al. CD4 T helper type 1 and regulatory T cells induced against the same epitopes on the core protein in hepatitis G virus-infected persons.//J. Infect. Diseases. 2002. — V.l85. - №6. - P.720-727.

210. Machida K., Tsukiyama-Kohara K., Seike E. et al. Inhibition of cytochrome -release in Fas-mediated signaling pathway in transgenic mice induced to express hepatitis C viral proteins.//! Biol. Chemistry. 2001. - V.276. -P.12140-12146.

211. Maekawa S, Enomoto N. Viral factors influencing the response to the combination therapy of peginterferon plus ribavirin in chronic hepatitis C.//J. Gastroenterol. -2009. V.44. - №10. -P.1009-1015.

212. Mangia A., Thompson A., Santoro R. et al. An IL28B polymorphism determines treatment response of hepatitis C virus genotype 2 or 3 patients who do not achieve a rapid virologic response.//Gastroenterology. 2010. -V.139.-P.821-827.

213. Maillard P., Krawczynski K., Nitkiewicz J. et al. Nonenveloped nucleocapsids of hepatitis C virus in the serum of infected patients.//J. Virol.- 2001. V.75. - P.8240-8250.

214. Major M., Dahari H., Mihalik K. et al. Hepatitis C virus kinetics and host responses associated with disease and outcome of infection in chimpanzees.//Hepatology. 2004. - V.39. - P.1709-1720.

215. Majumder M., Ghosh A., Steele R. et al. Hepatitis C virus NS5A protein impairs TNF-mediated hepatic apoptosis, but not by an anti-FAS antibody, in transgenic mice.//Virology. 2002. - V.294. - №1. - P.94-105.

216. Malavasi F., Deaglio S., Ferrero E. et al. CD38 and CD157 as receptors of the immune system: a bridge between innate and adaptive immunity .//Mol. Med. 2006.-V. 12. - №11-12. -P.334-341.

217. Martin J., Navas S., Quiroga J. A. et al. Quantification of hepatitis C virus in liver and peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic hepatitis C virus infection.//! Med. Virol. 1998. - V.54. - №4. - P.265-270.

218. Martínez-Donato G., Capdesuñer Y., Acosta-Rivero N. et al. Multimeric HCV E2 protein obtained from Pichia pastoris cells induces a strong immune response in mice.//Mol. Biotechnol. -2007. V.35. - №3. - P.225-235.

219. Martínez-Donato G., Musacchio A., Alvarez-Lajonchere L. et al. Ratio of HCV structural antigens in protein-based vaccine formulations is critical for functional immune response induction.//Biotechnol .Appl. Biochem. -2010.- V.56. -№3. -P.lll-118.

220. Marusawa H., Hijikata M., Chiba T., Shimotohno K. Hepatitis C virus core protein inhibits Fas-mediated and TNF-alpha-mediated apoptosis via NF-Kappa-B activation.//! Virol. 1999. - V.73. -P.4713-4720.

221. Masaki T., Suzuki R., Murakami K. et al. Interaction of hepatitis C virus nonstructural protein 5a with core protein is critical for the production of infectious virus particles.//! Virology. 2008. - V.82. - P.7964-7976.

222. Meier V., MihmiS;, BraumPi et al. HCV-RNA positivity in' peripheral blood? mononuclear cells of patients with chronic HGV infection: does it really mean viral: replication?//World Jl Gastroenterol. 2001. - V.7. - №21 -P.228-234.

223. Menez R. Bossus M:. Muller B.H. et al. Crystal structure of a hydrophobic immunodominant antigenic; site on< hepatitis C virus core protein complexed to monoclonal : antibody 19D9D6.//J. Immunol. 2003. - V.170. - P.1917-1924.

224. Minenkova O., Gargano N., Tomassi A.D.' et.al. ADAM-HCV, a new-concept diagnostic assay for antibodies to hepatitis C virus in serum.//Eur. J. Biochem. 2001. - V.268. - P.4758-4768. '

225. Mondelli M., Cerino A., Boender P. et al. Significance of the immune response to a major, conformational B-cell epitope on the hepatitis C virus NS3 region* defined by a human monoclonal antibody .//J: Virol. 1994. -V.68 - P.4829-4836.

226. Moradpour D., Gosert R., Egger D. et al. Membrane association of hepatitis» C virus nonstructural proteins and identification of the membrane alteration^ that harbors the viral replication complex./ Antiviral'research. 2003. - V. 60.-P. 103-109.

227. Morishima C., Paschal D.M., Wang C.C. et al. Decreased NK cell frequency in chronic hepatitisC does not affect ex vivo cytolytic killing.//Hepatology. -2006. V.43. - P.573-580.

228. Muerhoff A., Jiang L., Shah D. et al. Detection of HCV core antigen in human serum and plasma with an automated chemiluminescent immunoassay.//Transfusion. 2002. - V.42. - PL349-356.

229. Nakamoto N., Cho H., Shaked A. et al. Synergistic reversal of intrahepatic HCV-specific CD8 T cell exhaustion by combined PD-l/CTLA-4 blockade.//PLoS Pathog. 2009; - V.5. - №2. - el000313.

230. Nakamuta M., Shimohashi N., Tada S. et al. Serum levels of HCV RNA and core protein before and after incubation at 37°C for 24 h.//HepatoI. Res. -2001. V.19. - P.254-262.

231. Nakane P., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugation.//! Histochem. Cytochem. -1974. -V.22. P. 1084-1091.

232. Navas M., Fuchs A., Schvoerer E. et al. Dendritic cell susceptibility to hepatitis C virus genotype 1 infection.//J. Med. Virol. 2002. - V.67. -P.152-161.

233. Nayak N., Sathar S. Immunohistochemical detection of hepatitis C virus antigen in paraffin embedded liver biopsies from patients with chronic liver disease.//ActaHistochem. 1999. - V.101. -№4. -P.409 -419.

234. Neumann A., Lam-N., Dahari H. et al. Hepatitis C viral dynamics in vivo and the antiviral efficacy of interferon-alpha therapy.//Science. 1998. - V.282. -P.103-107.

235. Neumann-Haefelin C., Spangenberg H., Blum H., Thimme R. Host and viral factors contributing to CD8+ T cell failure in hepatitis C virus infection.//World J. Gastroenterol. -2007. -V. 13. №36. -P.4839-4847.

236. Neumann-Haefelin C., Thimme R. Impact of the genetic restriction of virus-specific T-cell responses in hepatitis C virus infection.//Genes Immun. -2007. V.8. - №3. - P.181-192.

237. Nevens F., Roskams T., Van Vlierberghe H. et al. A pilot study of therapeutic vaccination with envelope protein El in 35 patients with chronic hepatitis C.//Hepatology. 2003. - V.38. - №5. - P.1289-1296.

238. Neville J., Prescott L., Bhattacherjee V. et al Antigenic variation of core, NS3, and NS5 proteins among genotypes of hepatitis C virus.//J. Clin. Microbiol. 1997. - V.35. - P.3062 - 3070.

239. Nielsen S., Bassendine M., Martin C. et al. Characterization of hepatitis C RNA-containing particles from human liver by density and size.//J. Gen. Virol. -2008. -V.89. -Pt 10. -P.2507-2517.

240. Nikolaeva L.I., Blokhina N.P., Tsurikova N.N. et al. Virus-specific antibody titers in different phases of hepatitis C virus infection.//J. Viral Hepatitis. -2002. -V.9. -P.429-437.

241. Nikonov A., Juronen E., Ustav M. Functional characterization of fingers subdomain-specific monoclonal antibodies inhibiting the hepatitis C virus RNA-dependent RNA polymerase.//! Biol. Chem. 2008 - V.283. -P.24089-24102.

242. Nolandt O., Kern V., Muller H. et al. Analysis of hepatitis C virus core protein interaction domains.//! Gen. Virology 1997. - V.78. - P. 13311340.

243. Nuovo G., Holly A., Wakely P et al. Correlation of histology, viral load, and in situ viral detection in hepatic biopsies from patients with liver transplants secondary to hepatitis C infection.//Human Pathol. 2002. - V.33. - 277284.

244. Ohno O., Mizokami M., Wu R.R. et al. New hepatitis C virus (HCV) genotyping system that allows for identification of HCV genotypes la,lb,2a,2b,3a,3b,5,5a and 6a.//J. Clinical. Microbiol. 1997. - V.35. - №1. -P.201-207.

245. Okamoto H., Okada S., Sugiyama Y. Detection of hepatitis C virus RNA by a two-stage polymerase chain reaction with two pairs of praimers deduced from the 5'noncoding region.//Jap. J. Exp. Med. 1990. - V.60. - №3. -P.215-222.

246. Olesen O.F., Lonnroth A., Mulligan B. Human vaccine research in the European Union.//Vaccine. 2009. - V.27. - №5. - P.640-645.

247. Orland J.R., Wright T.L., Cooper S. Acute hepatitis C.//Hepatology. 2001. - V.33. -P.321—327.

248. Owsianka A., Timms J., Tarr A. et al. Identification of conserved residues in the E2 envelope glycoprotein of the hepatitis C virus that are critical for CD81 binding.//! Virol. 2006. - V.80. - №17. - P.8695-8704.

249. Ozaslan E., Kilicarslan A., Simsek H. et al. Elevated serum soluble Fas levels in the various stages of hepatitis C virus-induced liver disease.//! Int. Med. Res. 2003. - V.31. - №5. - P.3 84-391.

250. Pal S., Shuhart M.C., Thomassen L. et al. Intrahepatic hepatitis C virus replication correlates with chronic hepatitis C disease severity in vivo.//! Virol. 2006. - V.80. - №5. - P.2280-2290.

251. Paredes A., Blight K. A genetic interaction between hepatitis C virus NS4B and NS3 is important for RNA replication.//!. Virol.- 2008.- V.82. -P.10671-10683.

252. Pavio N., Lai M.M. The hepatitis C virus persistence: how to evade the immune system?//! Biosci. 2003. - V.28. - P.287-304.

253. Pawlotsky J.M. Use and interpretation of hepatitis C virus diagnostic assays.//Clin. Liver Dis. 2003. - V.7. - P.27-37.

254. Pawlotsky J.M., Gerraanidis G. The non-structural 5A protein* of hepatitis C virus.//J. Viral Hepatitis. 1999. - V.6. - P.343-356.

255. Penin F., Dubuisson J., Rey F.A. et. al. Structural biology of hepatitis C virus.//Hepatology. -2004. V. 39. - №1. - P. 5-19.

256. Pereboeva L.A., Pereboev A.V., Morris G.E. Identification of antigenic sites on three hepatitis C virus proteins using phage-displayed peptide libraries.//.!. Med. Virol. 1998. - V.56. - P. 105-111.

257. Pereboeva L.A., Pereboev A.V., Wang L.F., Morris G.E. Hepatitis C epitopes from phage-displayed cDNA libraries and improved diagnosis with a chimeric antigen.//J. Med. Virol. -2000. V.60. -P.144-151.

258. Perry S., Mostafa S., Wenstone R. et al. HLA-DR regulation "and the influence of GM-CSF on transcription, surface expression and shedding.//Int. J. Med. Sci. -2004. V.l. - №3. - P. 126-136.

259. Petit M., Jolivet-Reynaud C., Peronnet E. et al. Mapping of a conformational epitope shared between El and E2 on the serum-derived human hepatitis C virus envelope.//.!. Biol. Chem. -2003. V.278. - №45. -P.44385-44392.

260. Pham T., MacParland S., Mulrooney P.M. et al. Hepatitis C virus persistence after spontaneous or treatment-induced resolution of hepatitis C.//J. Virol. — 2004. V.78. - №11'. -P.5867-5874.

261. Pindel A., Sadler A. The Role of Protein Kinase R in the Interferon Response.// J. Interferon Cytokine Res. -2010. V.31. - №1. -P.59-70.

262. Polyak S., Khabar K., Paschal D. et al. Hepatitis C virus nonstructural 5A protein induces interleukin-8, leading to partial inhibition of the interferon-induced antiviral response.//! Virol. 2001 a. - V.75. - №13. - P.6095-6106.

263. Polyak S., Khabar K., Rezeiq M., Gretch D. Elevated levels of interleukin-8 in serum are associated with hepatitis C virus infection and resistance to interferon therapy.//! Virol. 2001 b. - V.75. - №13. - P.6209-6211.

264. Prezzi C., Nuzzo M., Meola A. et al. Selection of antigenic and immunogenic mimics of hepatitis C virus using sera from patients.//! Immunol. 1996. -V.156. -P.4504-4513.

265. Pugnale P., Latorre P., Rossi C. et al. Real-time multiplex PCR assay to quantify hepatitis C virus RNA in peripheral blood mononuclear cells.//! of Viral. Methods.-2006. -V.133. -P.195-204.

266. Puppo F., Contini P., Ghio M. et al. Soluble HLA class I molecules/CD8 ligation trigger apoptosis of CD8+ cells by Fas/Fas- ligand interaction.//The Sci. World J. 2002. - V.2. - P.421-423

267. Qiu Q., Wang R., Jiao X. et al. Induction of multispecific Th-1 type immune response against HCV in mice by protein immunization using CpG and Montanide ISA 720 as adjuvants.//Vaccine. 2008. - V.26. - P.5527-5534.

268. Quinkert D., Bartenschlager R., Lohmann V. Quantitative analysis of the hepatitis C virus replication complex.//J Virol. 2005. - V.79. - №21. -P.13594-13605.

269. Racanelli V., Manigold T. Presentation of HCV antigens to naive CD8+T cells: why the where, when, what and how are important for virus control and infection outcome.//Clin. Immunol. -2007. -V. 124. №1. -P.5-12.

270. Raghuraman S., Abraham P., Daniel H.D. et al. Characterization of soluble FAS, FAS ligand and tumour necrosis factor-alpha in patients with chronic HCV infection.//! Clin. Virol. 2005. - V.34. - P.63-70.

271. Rahman F., Heller T., Sobao Y. et al. Effects of antiviral therapy on the cellular immune response in acute hepatitis C.//Hepatology. 2004. - V.40. -P.87-97.

272. Realdon S., Gerotto M., Dal Pero F. et al. Proapoptotic effect of hepatitis C virus core protein in transiently transfected cells is enhanced by nuclear localization and is dependent on PKR activation.//! Hepatol. 2004. - V.40. -P.77-85.

273. Rebmann V., Ronin-Walknowska E., Sipak-Szmigiel O. et al. Soluble HLA-DR and soluble CD95 ligand levels in pregnant women with antiphospholipid syndromes.//Tissue Antigens. 2003. - V.62. - P.536-541.

274. Reigadas S., Pacheco A., Ramajo J. et al. Specific interference between two unrelated internal ribosome entry site elements impairs translation efficiency.//FEBS Lett. 2005. - V.579. - №30. - P.6803-6808.

275. Reimer U. Prediction of linear B-cell epitopes.//Methods Mol. Biol. 2009. -V.524. -P.335-344.

276. Resti M., Azzari C., Moriondo M. et al. Injection drug use facilitates hepatitis C virus infection of peripheral blood mononuclear cells.//Clin. Infect. Dis. -2002. V.35. -P.236-239.

277. Rodrigues-Inigo E., Casqueiro M., Navas S. et al. Fluorescent "in situ" hybridization of hepatitis C virus RNA in peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic hepatitis C.//J. Med. Virol. 2000. - V.60. -P.269-274.

278. Rollier C., Depla E., Drexhage J. et al. Control of heterologous hepatitis C virus infection in chimpanzees is associated with the quality of vaccine-induced >periferal T-helper immune response.//! Virol. 2004. - V.78. -P.187-196.

279. Rosa G., Osborne S., Garetto F. et al. Epitope mapping of the NS4 and NS5 gene products of hepatitis C virus and the use of a chimeric NS4-NS5 synthetic peptide for serodiagnosis.//J. Virol. Meth. 1995. - V.55. - P.219-232.

280. Rushbrook S.? Ward S., Unitt E. et al. Regulatory T cells suppress in vitro proliferation of virus-specific CD8+ T cells during persistent hepatitis C virus infection.//! Virol. -2005. -V.79. -P.7852-7859.

281. Sabato M., Shiffman M., Langley M. et al. Comparison of performance characteristics of three real-time reverse transcription-PCR test systems for detection and quantification of hepatitis C virus.//! Clin. Microbiol. 2007.- V.45. №8. - P.2529-2536.

282. Sabelko-Downes K., Russell J. The role of Fas ligand in vivo as a cause and regulator of pathogenesis.//Curr. Opin. in Immunology. 2000. - V.12. -№3. -P.330-335.

283. Sakaki M., Hiroishi K., Baba T. et al. Intrahepatic status of regulatory T cells in autoimmune liver diseases and chronic viral hepatitis.//flepatology Research. 2008. - V.38. - №4. - P.354-361.

284. Sallberg M, Frelin L, Weiland O. DNA vaccine therapy for chronic hepatitis C virus (HCV) infection: immune control of a moving target.//Expert Opin. Biol. Ther. 2009. - V.9. - №7. - P.805-815.

285. Sansonno D., Cornacchiulo V., Racanelli V., Damacco F. In situ simultaneous detection of hepatitis C virus RNA and hepatitis C virus-related antigens in hepatocellular carcinoma.//Cancer. — 1997. — V.80. P.22-33.

286. Sansonno D., Dammacco F. Hepatitis C virus clOO antigen in liver tissue from patients with acute and chronic infection.//Hepatology. — 1993. V.18. -P.240-245.

287. Sansonno D., Iacobelli A.R., Cornacchiulo V. et al. Immunohistochemical detection of hepatitis C virus-related proteins in liver tissues .//Clin. Exp. Rheumatol. 1995. - V.13. - S29-S32.

288. Sarobe P., Lasarte J., Zabaleta A. et al. Hepatitis C virus structural proteins impair dendritic cell maturation and inhibit in vivo induction of cellular immune responses.//J. Virology. -2003. V.77. - №20. -P.10862-10871.

289. Sarasin-Filipowicz M., Oakeley E.J., Duong F.H. et al. Interferon'signaling and treatment outcome in chronic hepatitis C.//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2008. V.105. -№19. -P.7034-7039.

290. Sarfraz S., Hamid S., Siddiqui A. et al. Altered expression of cell cycle and apoptotic proteins in chronic hepatitis C virus infection.//BMC Microbiology. -2008. V.8. -P.133.

291. Sarrazin C., Dragan A., Gartner B. et al. Evaluation of an automated, highly sensitive, real-time PCR-based assay (COBAS Ampliprep/COBAS TaqMan) for quantification of HCV RNA.//J. Clin. Virol. 2008. - V.43. - №2. -P.162-168.

292. Sasayama M., Deng L., Kim S. et al. Analysis of neutralizing antibodies against hepatitis C virus in patients who were treated with pegylated-interferon plus ribavirin.//Kobe J. Med. Sci. 2010. - V.56. - №2. — E60-E66.

293. Schnuriger A., Dominguez S., Valantin M.-A. et al. Early detection of hepatitis C virus infection by use of a new combined antigen-antibody detection assay: potential use for high-risk individuals.//!. Clin. Microbiol. — 2006.-V.44. №4.-P. 1561-1563.

294. Schregel V., Jacobi S., Penin F., Tautz N. Flepatitis C virus NS2 is a protease stimulated by cofactor domains in NS3.//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. - V. 106. - P.5342-5347.

295. Schulze zur Wiesch J., Lauer G., Day C. et al. Broad repertoire of the CD4+ Th cell response in spontaneously controlled hepatitis C virus infection includes dominant and highly promiscuous epitopes.//! Immunol. 2005. — V. 175. - №6. - P.3603-3613.

296. Schuttler C., Thomas C., Discher T. et al. Variable ratio of, hepatitis C virus RNA to viral core antigen in patient sera.//J. Clin. Microbiol. 2004. - V.42.- №5. -P.1977-1981.

297. Seme K., Poljak M., Babic D.Z. et al. The role of core antigen detection' in, management of hepatitis C: a critical review.//! Clin. Virol. 2005. - V.32. -P:92-101.

298. Sharma S.D. Hepatitis C virus: molecular biology & current therapeutic options.//Indian J. Med. Res. -2010. V. 131. - P. 17-34.

299. Shaw S., Luse G., Gilks W. et al. Leucocyte differentiation antigen database.//Leucocyte typing/Ed. Schlossman S.F.- Oxford university press. -1995. P.16-198.

300. Shi S., Polyak S., Tu H. et al. Hepatitis C virus NS5A colocalizes with the core protein on lipid droplets and interacts with« apolipoproteins.//Virology. — 2002. V.292. - P. 198-210.

301. Shimakami T., Hijikata M., Luo H. et al. Effect of interaction between hepatitis C virus NS5A and NS5B on hepatitis C virus RNA replication with the hepatitis C virus replicón.//! Virol. 2004. - V.78. - №6.« - P.2738-2748.

302. Siavoshian S., Abraham J., Kieny M., Schuster C. HCV core, NS3, NS5A and NS5B proteins modulate cell proliferation independently from p53 expression in hepatocarcinoma cell lines.//Arch. Virol. 2004. - V.149. -№2. -P.323-336.

303. Siavoshian S., Abraham J., Thumann C. et al. Hepatitis C virus core, NS3, NS5A, NS5B proteins induce apoptosis in mature dendritic cells.//! Med. Virol. -2005. V.75. - №3. - P.402-411.

304. Simmonds P. Genetic diversity and evolution of hepatitis C virus 15 years on.//! Gen. Virology. -2004. - V.85. -P.3173-3188.

305. Slavenburg S., Huntjens-Fleuren H., Dofferhoff T. et al. Ribavirin plasma concentration measurements in patients with hepatitis C: early ribavirin concentrations predict steady-state concentrations.//Ther. Drug Monit. -2011. V.33. - №1. - P.40-44.

306. Smith G. P., Scott J. K. Libraries of peptides and proteins displayed' on filamentous phage.//Methods Enzymol. 1993. - V.217. - P.228-257.

307. Smyk-Pearson S., Tester I., Lezotte D. et al. Differential antigenic hierarchy associated with spontaneous recovery from Hepatitis C Virus infection: Implications for vaccine design.//J. Inf. Dis. -2006. V.194. -P.454-463.

308. Smyk-Pearson S., Tester I.A., Klarquist J. et al. Spontaneous recovery in acute human hepatitis C virus infection: functional T-cell thresholds and relative importance of CD4 help.//J. Virol. 2008. - V.82. - №4. - P. 18271837.

309. Spaggiari G., Contini P., Negrini S. et al. IFN-gamma production in human NK cells through the engagement of CD8 by soluble or surface HLA class I molecules.//Eur. J. Immunol. 2003. - V.33. - P.3049-3059.

310. Stevens T., Bossie A., Sanders V. et al. Regulation of antibody isotype secretiomby subsets of antigen-specific helper T cells.//Nature. 1988. -V.334. — P.255-258.

311. Sumida K., Ubara Y., Hoshino J. et al. Hepatitis C virus-related kidney disease: various histological patterns.//Clin. Nephrol. 2010. - V.74. - №6. -P.446-456.

312. Sung V., Shimodaira S., Doughty A.L. et al. Establishment of B-cell lymphoma cell lines persistently infected with hepatitis C virus in vivo and in vitro: the apoptotic effects of virus infection.//! Virol. 2003. - V.77. -P.2134-2146.

313. Suslov A.P., Kuzin S.N., Golosova T.V. et al. Limits of diagnostic accuracy of anti-hepatitis C virus antibodies detection by ELISA and immunoblot assay.//Russ. J. Immunol. 2002. - V.7. - №2. - P. 175-184.

314. Suzuki T. A Hepatitis C virus-host interaction involved in viral replication: toward the identification of antiviral targets.//Jpn. J. Infect. Dis. 2010. -V.63. - №5. - P.307-311.

315. Syder A., Lee H., Zeisel M. et al. Small molecule scavenger receptor BI antagonists are potent HCV entry inhibitors.//! Hepatol. 2011. - V.54. -P.48-55.

316. Szabo G., Dolganiuc A. Subversion of plasmacytoid and myeloid dendritic cell functions in chronicHCV infection.//Immunobiology. 2005. - V.210. -P.237-247.

317. Tanaka Y., Takagi K., Fujihara T. High stability of enzyme immunoassay for hepatitis C virus core antigen evaluation before and after incubation at room temperature.//FIepatol. Res. - 2003. - V.26. - P.261-267.

318. Tang H., Grisé H. Cellular and molecular biology of HCV infection and hepatitis.//Clin. Sci. (Lond). 2009. - V.l 17. - №2. - P.49-65.

319. Taya N., Torimoto Y., Shindo M. et al. Fas-mediated apoptosis of periferal blood mononuclear cells in patients with hepatitis C.//Br. J. Haematol. -2000. V.l 10. - P.89-97.

320. Tellinghuisen T., Foss K.5 Treadaway J. Regulation of hepatitis C virion production via phosphorylation of the NS5A protein.//PLoS pathogens. -2008. V.4. - el000032.

321. Teo M., Hayes P. Management of hepatitis C.//British Medical Bulletin. -2004.-V.70.-P.51-69.

322. Thimme R. Oldach D., Chang K.M. et al. Determinants of viral clearance and persistence during acute hepatitis C virus infection.//! Exp. Med. 2001. - V.194. -P.1395-1406.

323. Tsutsumi M., Urashima S., Takada A. et al. Detection of antigens related to hepatitis C virus RNA encoding the NS5 region in the livers of patients with chronic type C hepatitis.//Hepatology. 1994. - V.l9. -P.773-778.

324. Thimme R., Bukli J., Spangenberg H.C. et al. Viral and immunological determinants of hepatitis C virus clearance, persistence, and disease.//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2002. V.99. - P.15661-15668.

325. Thimme R., Neumann-Haefelin C., Boettler T., Blum H.E. Adaptive immune responses to hepatitis C virus: from viral immunobiology to a vaccine.//Biol. Chem. 2008. - V.389. - №5. - P.457-467.

326. Thimme R., Oldach D., Chang K.-M. et al. Determinants of viral clearance and persistence during acute hepatitis C virus infection.//! Exp. Med. 2001. -V.194.-P.1395-1406.

327. Torres B., Martin J.L., Caballero A. et al. HCV in serum, peripheral blood mononuclear cells and lymphocyte subpopulations in C-hepatitis patients.//Hepat. Res. -2000. V.l8. - P. 141-15!

328. Toussaint N.C., Donnes P., Kohlbacher O. A mathematical framework for the selection of an optimal set of peptides for epitope-based vaccines.//PLoS Comput. Biol. -2008. V.4. - №12. - el000246.

329. Tsai S., Liaw Y., Chen M. et al. Detection of type 2-like T-helper cells in hepatitis C infection: implications for chronicity.//Hepatology. 1997. -V.25. - P.449—458.

330. Tseng C., Klimpel G. Binding of the hepatitis C virus envelope protein E2 to CD81 inhibits natural killer cell functions.//J. Exp. Med. 2002. - V.l95. -P.43—49.

331. Uebelhoer L., Han I.-H., Callendret B. et al. Stable cytotoxic T cell escape mutation in hepatitis C virus is linked to maintenance of viral fitness.//PLoS Pathogens. -2008. V.4. - №9. - el000143.

332. Urbani S., Amadei B., Fisicaro P. et al. Outcome of acute hepatitis C is related to virus-specific CD4 function and maturation of antiviral memory CDS responses.//Hepatology. 2006. - V.44. - P. 126-139.

333. Vajdy M.5 Selby M., Medina-Selby A. et al. Hepatitis C virus polyprotein vaccine formulations capable of inducing broad antibody and cellular immune responses.//J. Gen. Virol. 2006. - V.87. - Pt 8. - P.2253-2262.

334. Valkavi P., Mediei Mí, Casula F. et al. Evaluation of a total hepatitis C virus (HCV) core antigen assay for the detection of antigenaemia in anti-HCV positive individuals.//!. Med. Virol. -2004. -V.73. -P.397-403.

335. Vauloup-Fellous C., Pene V., Garaud-Aunis J. et al. Signal peptide peptidase-catalyzed cleavage of hepatitis C virus core protein is dispensable for virus budding but destabilizes the viral capsid.//J. Biol. Chem. 2006. -V.281. - №38. - P.27679-27692.

336. Vietheer P., Boo I., Drummer H.E., Netter H.J. Immunizations with chimeric hepatitis B virus-like particles to induce potential anti-hepatitis C virus neutralizing antibodies.//Antivir. Ther. -2007. V.12. -P.477-487.

337. Vieyres G., Thomas X., Descamps V. et al. Characterization of the envelope glycoproteins associated with infectious hepatitis C virus.//J. Virol. 2010. -V.84. - №19. -P.10159-10168.

338. Vieyres G., Dubuisson J., Patel A.H. Characterization of antibody-mediated neutralization directed against the hypervariable region 1 of hepatitis C virus E2 glycoprotein.//!. Gen. Virol. -2011. -V.92. -Pt.3. -P.494-506.

339. Viliano P., Vlanov D., Nelson K. et al. Persistence of viremia and the importance of long-term follow-up after acute hepatitis C infection.//Hepatology. 1999. - V.29. - P.908-914.

340. Wadhawan M., Rastogi M., Gupta S., Kumar A. Peritransplant management of chronic hepatitis C.//Trop. Gastroenterol. 2010. - V.31. - №2. - P.75-81.

341. Wakita T., Pietschmann T., Kato T. et al. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome.//Nat. Med. 2005. -V.11.-P.791-796.

342. Wang Q., lohnson R., Chen D. et al. Expression and purification of untagged full-length F1CV NS5B RNA-dependent RNA polymerase.//Protein Expr. Purif. 2004. - V.35. - №2. - P.304-312.

343. Wang L.-F., Yu M. Epitope identification and discovery using phage displaylibraries: application in vaccine development and diagnostics.//Current Drug Targets. 2004. - V.5. - P.l-15.

344. Waris G., Sarker S., Siddiqui A. Two-step affinity purification of the ' hepatitis C virus ribonucleoprotein complex.//RNA. 2004. - V.10. - №2.1. P.321-329.

345. Wedemeyer H., Schuller E., Schlaphoff V. et al. Therapeutic vaccine IC41 as late add-on to standard treatment in patients with chronic hepatitis C.//Vaccine. -2009. V.27. - №37. -P.5142-5151.

346. Weiler-Normann C., Rehermann B. The liver as an immunological organ.//J.Gastroenterology and Plepatology. 2004. - V.19. - S279-S283.

347. Welbourn S., Pause A. The hepatitis C vims NS2/3 protease.//Curr. Issu. Mol. Biol. 2007. - V.9. - P.63-69.

348. Wertheimer A., Miner C., Lewinsohn D.M. et alt Novel CD41 and CD81 T-cell determinants within the NS3 protein in subjects with spontaneously resolved HCV infection.//Hepatology. 2003. - V.37. - P.577-589.

349. White P. A, Pan Y., Freeman A.J. et al. Quantification of hepatitis C virus in human liver and serum samples by using LightCycler reverse transcriptase PCR.// J. Clin. Microbiol. 2002. - V.40. - №11. - P.4346-4348.

350. Willberg C., Ward S., Clayton R. et al. Protection of hepatocytes from cyototoxic T cell mediated killing by interferon-alpha.//PLoS One. 2007. -V.2. -e791.

351. Wintermeyer P., Gehring S., Eken A., Wands J.R. Generation of cellular immune responses to HCV NS5 protein through in vivo activation of dendritic cells.//J. Viral Hepat. -2010. V.17. - №10. -P.705-713.

352. Xagorari A., Chlichlia K. Toll-Like Receptors and Viruses: Induction of Innate Antiviral Immune Responses.//The Open Microbiology Journal. -2008. V.2. - P.49-59.

353. Yan F., Chen A., Flao F. et al. Hepatitis C virus may infect extrahepatic tissues in patients with hepatitis C.//World J. Gastroenterol. 2000. - V.6. -№6. - P.805-811.

354. Yang S., Lai M., Chen D. et al. Mutations in the NS5A and E2-PePHD regions of hepatitis C virus genotype lb and response to combination therapy of interferon plus ribavirin.//Liver Int. 2003. - V.23. - №6. - P.426-433.

355. Yao Z., Eisen-Vandervelde A., Ray S., Hahn Y. FICV core/gClqR interaction arrests T cell cycle progression through stabilization of the cell cycle inhibitor p27Kipl.//Virology. -2003. V.314. - №1. -P.271-282.

356. Yasui K., Wakita T., Tsukiyama-Kohara K. et al. The native form and maturation process of hepatitis C virus core protein.//J. Virol. 1998. - V.72. - P.6048-6055.

357. Yerly D., Heckerman D., Allen T.M. et al. Increased cytotoxic T-lymphocyte epitope variant cross-recognition and functional avidity are associated with hepatitis C virus clearance.//! Virol. 2008. - V.82. - №6. - P.3147-3153.

358. Yi M., Ma Y., Yates J., Lemon S.M. Trans-complementation of an NS2 defect in a late step in hepatitis C vims (PICV) particle assembly and maturation.//Pub. Libr. Sci. Pathog. -2009. V.5. - el000403.

359. Yip Y.L., Smith G., Ward R.L. Comparison of phage pill, pVIII and GST as carrier proteins for peptide immunisation in Balb/c mice.//Immunology Letters. -2001. V.79. - P.197-202.

360. Yu H.5 Babiuk L.A., van Dmnen Littel-van den Hurk S. Strategies for loading dendritic cells with hepatitis C NS5a antigen and inducing protective immunity.//! Viral Hepatitis. 2008. - V.15. - P.459-470.

361. Yu M., Bartosch B., Zhang P. et al. Neutralizing antibodies to hepatitis C vims (PICV) in immune globulins derived from anti-HCV-positive plasma.//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. - V. 101. - P.7705-7710.

362. Yu C., Chiang B.L. A new insight into hepatitis C vaccine development.//!. Biomed. Biotechnol. -2010. V.2010. - 548280.

363. Yuki N., Matsumoto S., Tadokoro K. et al. Significance of liver negativestrand HCV RNA quantitation in chronic hepatitis C.//J. Hepatol. 2006. -V.44. - №2. - P.302-309.

364. Yutani S., Komatsu N., Shichijo S. et al. Phase I clinical study of a peptide vaccination for hepatitis C vims-infected patients with different human leukocyte antigen-class I-A alleles.//Cancer Science. 2009. - V.100. - №10. -P. 193 5-1942.

365. Zarife M.A., Reis E.A., Meira G.C. et al. IL-8 is associated with non-viremic state and IFN-y with biochemical activity in HCV-seropositive blood donors.//Intervirology. 2010. - V.54. - №2. - P.87-96.

366. Zein N.N., Li PI., Persing D.PT Plumoral immunity in acute and chronic hepatitis C infection.//Gastroenterology. 1999. - V.l 17. - №2. - P.510.

367. Zeisel M.B., Fofana I., Fafi-Kremer S., Baumert T.F. Hepatitis C vims entry into hepatocytes: Molecular mechanisms and targets for antiviral therapies.//! Hepatol. 2010. -V.54. - №3. - P.566-576.

368. Zhang Z.X., Chen M., Hultgren C. et al. Immune responses to the hepatitis C vims NS4A protein are profoundly influenced by the combination of the viralgenotype and the host major histocompatibility complex.//! Gen. Virology. -1997. V.78. -P.2735-2746.

369. Zhong J., Gastaminza P., Cheng G. et al. Robust hepatitis C virus infection in vitro.//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. - V. 102. - P.9294-9299.

370. Zhu Z., Wilson A., Gopalakrishna K. et al. Hepatitis C virus core protein enhances telomerase activity in Huh7 cells.//! Med. Virol. 2010. - V.82. -№2. -P.239-248.

371. Zibert A., Kraas W., Meisel H. et al. Epitope mapping of antibodies directed against hypervariable region 1 in acute self-limiting and chronic infections due to hepatitis C virus.//! Virology. 1997. - V.71. - №5. -P.4123^1127.

372. Zignego A.L., Giannini C., Monti M., Gragnani L. Hepatitis C virus lymphotropism: lessons from a decade of studies.//Dig. Liver Dis. — 2007. — V.39. Suppl.l. — S38-45.