Структурно-функциональные отношения трифенилэтиленов и эстрогенового рецептора в клетках рака молочной железы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат медицинских наук Максимов, Филипп Евгеньевич

• Максимов, Филипп Евгеньевич
• кандидат медицинских наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Максимов, Филипп Евгеньевич

Глава 1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность.

Цель настоящего исследования.

Задачи настоящего исследования.

Положения выносимые на защиту.

Глава 2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

2.1 История специфической гормональной терапии.

2.2. Эстрогеновые рецепторы и механизм действия эстрогенов.

2.2.1. Эстрогеновые Рецепторы (ЭР): структура и свойства.

2.2.2. Корегуляторы ЭР и механизм действия ЭР.

2.2.3. Негеномный механизм действия эстрогенов.

2.3. Антигормональная терапия рака молочной железы

2.3.1 Нестероидные антиэстрогены: переход к специфической терапии.

2.3.2 Селективные Модуляторы Эстрогенового Рецептора (вЕКМ).

2.3.3 Механизм действия БЕКМ.

2.3.4 Клиническое применение БЕКМ.

2.4 История изучения структурно-функциональных отношений производных трифенилэтилена, в том числе тамоксифена и его метаболитов и ЭР.

2.5. Резистентность к антнгормональпым препаратам

2.5.1. Нарушение метаболизма тамоксифена.

2.5.2. Врожденная резистентность.

2.5.3. Приобретенная резистентность.

2.6. Эстрогеновая терапия рака молочной железы

2.6.1 Механизмы эстроген-индуцнрованного апоптоза.

2.6.2 Перспективы применения эстрогеновой терапии в клинике.

Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Синтезированные трифенилэтилены и другие вещества.

3.2. Культуры клеток и методы культуральной работы.

3.3. Тесты для определения клеточной пролиферации.

3.4. Количественное определение апоптоза в культуре клеток.

3.5. ДНК-вектора.

3.6. Транзиторные трансфекции и люциферазные репортерные тесты.

3.7. Иммуноблоттинг.

3.8. Выделение мРНК из клеток и сиптез кДНК.

3.9. ПЦР в реальном времени.

3.10. Хроматиновая иммунопреципитация (СЫР).

3.11. Молекулярный докинг.

Глава 4. РЕЗУЛЬТАТЫ НАСТОЯЩЕГО ИССЛЕДОВАНИЯ

4.1. Определние биологической активности в линиях клеток рака молочной железы человека МСЕ-7 и МСЕ-7:5С.

4.2. Определение эстроен-индуцированного апоптоза в эстроген-независимых клонах клеток рака молочной железы человека МСЕ-7:5С и его количественный анализ.

4.3. Определение опосредованности эффектов исследуемых эстрогенов через ЭР во всех клеточных линиях МСЕ-7.

АЛ. Значение аспартата в 351 позиции ЭР для его активации непланарными трифенилэтиленами.

4.5. Определение механизмов регуляции транскрипционной активности ЭРа в клетках рака молочной железы.

4.6. Результаты молекулярного докинга.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Максимов, Филипп Евгеньевич

выводы

1. Все эстрогены вне зависимости от их химической структуры (планарности) способны инициировать клеточную пролиферацию клеток рака молочной железы.

2. Непланарные эстрогены не способны индуцировать апоптоз эстроген-независимых клеток МСР-7:5С. Только планарные эстрогены (17р-эстрадиол и диэтилстилбестрол) могут вызывать полную гибель таких клеток.

3. Уровень апоптоза в эстроген-независимых клетках при обработке непланарными эстрогенами ниже по сравнению с уровнями, индуцированными планарными эстрогенами. Планарные эстрогены способны увеличивать уровень митохондриальных проапоптотических маркеров в клетках эффективнее чем трифенилэтилены, тем самым предрасполагая клетки к апоптозу.

4. Все эстрогены вне зависимости от их химической структуры могут активировать ЭРа в ЭР-положительных клетках рака молочной железы как с диким фенотипом, так и с эстроген-независимым фенотипом.

5. Механизм активации ЭРа трифенилэтиленами отличается от механизма активации эстрадиолом за счет разницы в принимаемых рецептором конформациях. Эстрогены класса II нуждаются во взаимодействии с аспартатом в 351 позиции ЭР для его эффективной активации.

6. Регуляция транскрипционной активности ЭР при активации различными классами эстрогенов разная. Трифенилэтилены не позволяют конформационно измененному белку ЭР эффективно связывать коактиваторные белки с лиганд-рецепторным комплексом, что нарушает механизм деградации белка ЭР и снижает транскрипционную активность в клетках рака молочной железы.

7. Непланарные трифенилэтилены вероятнее всего изменяют конформацию ЭРа по типу антагонистической, подобно антиэстрогену 4-гидрокситамоксифену. В отличие от планарных эстрогенов, трифенилэтилены за счет своей химической структуры не позволяют 12-ой а-спирали закрыть полость лиганд-связывающего домена ЭРа. 8. Полученные результаты подчеркивают важность конформационных изменений ЭР при активации эстрогенами различных клессов для модуляции эстрогенового ответа в клетках.

Глава 5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

5.1. Определение биологической активности непланарных эстрогенов

Целью настоящего исследования структурно-функциональных отношений является изучение роли конформационных изменений ЭР при связывании непланарных эстрогенов в биологических процессах клеток рака молочной железы. Для этого использовались клеточные модели линии MCF-7 рака молочной железы и пролиферативные тесты для оценки биологических активностей серии синтезированных трифенилэтиленов, а так же репортерные тесты для определения способности данных эстрогенов активировать ЭР в данных клетках. Наши результаты показали, что все синтезированные трифенилэтилены обладают эстрогеноподобными свойствами в клетках рака молочной железы с диким фенотипом. Данные эстрогены существенно увеличивали пролиферативную активность клеток и увеличивали транскрипцию репортерного гена, которая регулировалась промотором, содержащим Эстроген-Респонсивный Элемент (ЭРЭ). Это указывает на то, что данные вещества несмотря на их непланарную структуру спосбны активировать ЭР и вызывать активацию транскрипции генов, ответственных за инициацию эстроген-стимулированной пролиферации. Несмотря на то, что по результатам данных экспериментов, тестируемые трифенилэтилены вызывают пролиферативные эффекты в клетках с диким фенотипом при более высоких концентрациях чем планарные эстрогены, как 17Р-эстрадиол и синтетический нестероидный эстроген диэтилстилбестрол (DES), трифенилэтилены способны связываться с ЭР, хотя, вероятнее всего с более низкой аффинностью. В отличии от тестируемых трифенилэтиленов, которые не обладают боковой аминоэтокси группой, метаболиты тамоксифена 4-гидрокситамоксифен и эндоксифен не способны активировать ЭР (по результатам репортерных тестов) и, следовательно, вызывать пролиферативный эффект (по результатам пролиферативных тестов).

Рентгеноструктурный анализ кристаллов комплексов ЭР-4-гидрокситамоксифена и ЭР-ралоксифена показал, что наличие боковой цепи у 4-гидрокситамоксифена критично для принятия ЭР антагонистической конформации путем репозиционирования а-спирали 12 рецептора этой боковой цепью. Это и предотвращает связывание коактиваторов с ЭР [12]. Основываясь на результатах наших пролиферативных и репортерных тестов мы предполагаем, что репозиционирование гидроксильных групп на синтезированных трифенилэтиленах изменяет их биологическую активность относительно друг друга, а так же понизило их сродство к рецептору по сравнению с эстрадиолом. Результаты все же показали, что данные непланарные эстрогены являются полными агонистами ЭР в клетках линии МСР-7:\У88, отсутствие боковой цепи как у метаболитов тамоксифена не позволяет трифенилэтиленам выступать в роли антагонистов в данной линии клеток, что показали опыты с ингибированием эстрадиол-стимулированной пролиферации клеток антиэстрогенами, у которых присутствует боковая цепь [12]. Несмотря на репозицонирование гидроксильных групп и добавление этокси группы, что снижает их биологическую активность в культуре клеток, все вещества сохранили способность индуцировать транскрипцию репортерного эстроген-зависимого гена в полной мере.

Для определения способности синтезированных трифенилэтиленов индуцировать апоптоз в тамоксифен-резистентных и эстроген-независимых клетках, мы проводили аналогичные тесты на пролиферативную активность. Все планарные эстрогены способны индуцировать апоптоз во всей культуре клеток МСР-7:5С, которые были выведены для создания модели клеток рака молочной железы с развитой резистентностью ко всем формам адьювантной терапии. Пародоксально такие клетки развили механизм выживания в бесстероидной среде и ингибировали апоптотический путь, активирующийся при эстрогеновом голодании у клеток с диким фенотипом. Эстроген при концентрации близкой к концентрации эстрогена у женщин в постклимактерическом возрасте (1 нМ) убивает почти все клетки линии МСР-7:5С в течении недели, как это было показано в наших пролиферативных тестах. DES, который является планарным эстрогеном со структурой, похожей на структруру эстрогена, так же способен полностью убивать такие клетки в культуре. Поскольку наши тестируемые трифенилэтилены так же являются эстрогенами в клетках дикого типа и способны активировать ЭР, было решено сравнить их способность индуцировать апоптоз в клетках MCF-7:5C. Пародоксально, но не пленарные трифенилэтилены неспособны вызывать полной гибели клеток в течении 7 суток дяже при высокой концентрации в среде (1 мкМ). Только, два вещества были способны вызывать биологически существенный уровень апоптоза в культуре. Тригидрокситрифенилэтилен был способен зызывать в среднем 40-50% гибели клеток, в то время как цис-изомер дигидрокситрифенилэтилен был способен вызывать полную гибель клеток. Объяснить такую проапоптотическую активность цис-изомера дигидрокситрифенилэтилена можно только тем, что это вещество не имея 4-гидроксигруппы, как остальные трифенилэтилены, может связываться с ЛСД ЭР таким образом, что бы гидроксигруппа на противоположном фенильном кольце воспроизводила позицию гидрокси группы на эстрадиоле, таким образом, позиционируясь в полости ЛСД так, что второе фенильное кольцо не создает стерического препятствия для 12-ой а-спирали, позволяя ей закрыть полость ЛСД и связаться коактиваторам с ЭР и активировать его. Таким образом, данный трифенилэтилен может связываться с рецептором с достаточно высоким сродством, активировать его по пути сходным с этрадиол-опосредованным и вызывать апоптоз клеток. Так же возможна трансизомеризация, которая известна для тамоксифена, котда цис-изомер тамоксифена частично в растворе переходит в транс-изомер тамоксифена и перестает проявлять антиэстрогеновые свойства [190]. Остальные вещества не способны были вызывать гибель клеток, что было показно в пролиферативных тестах и в опытах по определеншо уровня апоптоза в культуре клеток. Более того, данные трифенилэтилены способны выступать в роли антагонистов ЭР, ингибируя эстрадиол-индуцированный апоптоз клеток. При этом все трифенилэтилены, так же как и планарные эстрадиол и DES, способны активировать транскрипционную активность репортерного гена, а следовательно и активировать ЭР. Это может указывать, что исследуемые непланарные трифенилэтилены способны связываться в ЭР в данных клетках, ативировать его, как и в клетках дикого типа, но неспособны индуцировать гибель клеток, как это делают планарные эстрогены, которые являются агонистами ЭР в обеих линиях клеток.

Поскольку в вышеописанных результатах му показали зависимость индукции эстроген-опосредованного апоптоза в эстроген-независимых клетках от химической стуктуры лигандов, а именно то, что трифенилэтилены не способны активировать апоптоз в таких клетках и выступают в качестве антагонистов, но в тоже время являются полными агонистами в клеках с диким фенотипом, то мы решили показать разницу в механизме активации ЭР планарными и непланарными эстрогенами. Так было показано ранее при помощи ренгено структурного анализа ЛСД ЭР связанного с эстрадиолом и 4-гидрокситамоксифеном и изучении эстрогеноподобных свойств последнего, что для активации ЭР необходима 351 аминокислота для активации рецептора трифенилэтипленами, на примере 4-гидрокситамоксифена. Для подтверждения гипозы о том, что данный амикислотный остаток необходим для активации рецепора, иы провели репортерные тесты для определения активности ЭР дикого типа и с заменой Асп351 на глицин испытуемыми везществами. Наши результаты показали, что только планарные эстрогены, такие как эстрадиол и DES способны активировать мутантную форму ЭР так же как и дикий тип ЭР, что чвязянно с тем что по результатам молекулярного моделирования и ренгеноструктурного анализа данные эстрогены не образуют водородной связи с 351 аминокислотой. В то время, как трифенилэтилены взаимодействуютс 351 аминокислотой, то это объяснет их неспособность активировать мутантную форму ЭР при связывании. Эти данные подтверждают данные ранее полученные группой Джордана [188Д89] о важности. 351 амикислоты для активации ЭР непланарными эстрогенами, такими как трифенилэтилены. Имеено химическая структура трифенилэтиленов обуславливает конформацию ЭР, а в свою очередь определяет механизм активации рецептора, после образования лиганд-рецепторного комплекса. Такой механизм активации может вполне определять и регуляцию биологических процессов, таких как апоптоз и активность ЭР как транскрипционного фактора.

5.2. Определение способности ненланарных эстрогенов активировать аноптотнческие маркеры

Подтверждением того, что исследуемые трифенилэтилены, которые не вызывают полной гибели клеток (тригидрокситрифенилэтилен, бисфенолтрифенилэтилен и этокситрифенилэтилен) действительно не способны в достаточной мере индуцировать апоптоз клеток, мы провели Вестерн блоттинг лизатов клеток MCF-7:5C и обрабатывали мембраны антителами против про- и анти-апоптотических маркеров. Результаты данных экспериментов только подтверждают разницу в характере изменений в уровнях вышеказанных маркеров различными классами эстрогенов. Так оказалось, что вне зависимости от структуры эстрогенов, все вещества способны вызывать снижение уровня анти-апоптотического маркера Вс1-Х1 в клетках MCF-7:5C, но только планарный эстрадиол способен вызывать достаточное увеличение про-апоптотических маркеров в течение первых 24 часов, в отличие от не планарных трифенилэтиленов. Трифенилэтилены не вызывая достаточного увеличения внутриклеточных уровней проапототических фаторов как Ьах и bim и не способны таким образом инициировать достаточную активацию каспаз в клетках и последующего апоптоза. Подтверждением того, что эти процессы, опосредованные трифенилэтиленами, специфичные для данной линии клеток мы провели аналогичные опыты на линии клеток MCF-7:WS8 с диким фенотипом. Результаты показали, что в отличие от эстроген-независимых клеток, в клетках с диким фенотипом, всеми эстрогенами, в независимости от класса, происходит увеличение внутриклеточных уровней обоих антиапоптотических маркеров Вс1-Х1 и Bcl

2, отсутствие увеличения уровней проапоптотических маркеров bim и bad, а так же отсутствие детектируемого уровня Ьах. Это указывает на то, что в данных клетках, в независимости от структуры лигандов ЭР происходит активация сигнальных путей для выживания клеток. Все эти результаты еще раз подтверждают результаты вышеописанных экспериментов, из которых можно сделать вывод о том, что конформация ЭР, которую ЭР принимает после связывания не планарных трифенилэтиленов, играет важную роль в активации апоптотических процессов в эстроген-независимых клетках, в то время, как агонистическая конформация, которая принимается при связывании планарных эстрогенов, не играет такой роли.

5.3. Определение конформации ЭР при связывании трифенилэтиленов и механизма активации ЭР не планарными эстрогенами

Определение мехнизма активации ЭР в клетках нам было необходимо для объяснения роли измененной корформации ЭР в неспособности индуцировать апоптоз в эстроген-независимых клетках и некритичности данного конформационного изменения для индукции роста клеток дикого типа. Для этого мы использовали результаты молекулярного докинга и репортерных тестов с мутантной формой ЭР.

Результаты молекулярного докинга показали, что все наши исследуемые трифенилэтилены лучше входят в модель антагонистической конформации ЭР и связываются лучше с рецептором орентируясь в ЛСД ЭР сходным образом с 4-гидрокситамоксифеном. В случае с агонистической конформацией ЭР, связывание трифенилэтиленов и образование водородных связей с аминокислотными остатками ЛСД, необходимых для подходящей ориентации лигандов в полости ЛСД, невозможно из-за стерических помех 12-ой а-спирали рецептора. Из этих результатов можно сделать вывод, что поскольку трифенилэтилены не могут войти в агонистическую конформацию ЭР из-за стерических помех, но входят в аналогичную антагонистической конформации рецептора с 4-гидрокситамоксифеном, то с наибольшей вероятностью все трифенилэтилены при связывании с ЭР придают последнему конформацию схожую с антагонистической конформацией ЭР, но тем не менее, способны активировать его, в отличии от 4-гидрокситамоксифена.

Дополнительным подтверждением гипотезы о том, что конформация ЭР при связывании планарных и непланарных (трифенилэтиленов) эстрогенов разная и соответственно, позволяющая классифицировать эстрогены на два класса, мы использовали результаты репортерных тестов с мутантной формой ЭР. Данная гипотеза была независимо развита как группой Джордана [15,191], так и группой Густа из Германии [16]. Как стало известно в результате рентгеноструктурного анализа кристаллов ЭР ассоциированного с 4-гидрокситамоксифеном, последний образует водородную связь с аспартатом в 351 позиции рецептора, которая является частью транскрипционно-функционального мотива AF-2 на 12-ой а-спирали, которая не может закрыть полость ЛСД ЭР из-за наличия у тамоксифена боковой цепи. Предотвращение конформационных изменений рецептора, которые бы позволили коактиваторам присоединиться и активировать рецептор, делают 4-гидрокситамоксифен антиэстрогеном в клетках рака молочной железы, но по каким-то причинам агонистом ЭР в клетках эндометрия, а так же даже в клетках с врожденной резистетностью к тамоксифену. При изучении эстроген-подобных свойств 4-гидрокситамоксифена, выяснилось, что для модуляции агонистических свойств тамоксифена, последнему абсолютно критично образование водородной свзяи с 351 а.о. В последующих исследованиях было показано, что замена 351 аспартата на глицин в ЭР полностью подавляет какие либо эстрогено-подобные свойства 4-гидрокситамоксифена, а именно транскрипционную активность ЭР на промоторе эндогенного гена TGFa [188]. Именно эти данные позволили классифицировать все эстрогены; на два клсса, где непланарные эстрогены (класса II) нуждаются во взаимодействии с 351 аспартатом для активации ЭР. Результаты репортерных тестов на ЭР-отрицательных клетках T47D:C42 [192], транзиторно трансфицированных векторами для экспрессии ЭР дикого типа и ЭР с заменой Асп351 на глицин, показали, что все планарные эстрогены способны активировать обе формы ЭР, т.к. не нуждаются во взаимодействии с 351 а.о., в то время как трифенилэтилены неспособны активировать мутантную форму ЭР, что указывает на то, что для модуляции эстрогено-подобных свойств трифенилэтиленов через ЭР, необходимо взаимодействие с 351 а.о. По сравнению с тамоксифеном, у другого адъювантного препарата ралоксифена нет эстрогеноподобных свойств, немотря на схожесть структуры с тамоксифеном. Ралоксифен отличается более длинной бокой цепью, чем у тамоксифена и по результатам рентгеноструктурного анализа комплекса ЭР ".ралоксифен стало известно, что боковая цепь ралоксифена нейтрализует заряд на аспартате 351 и не позволяет последнему взаимодействовать с функциональным мотивом АР-1, в отличие от тамоксифена, цепь которого короче и позволяет взаимодейтсвовать 351 а.о. с АБ-1 мотивом и активировать рецептор. Соответственно, как стало ясно из молекулярного моделирования, синтезированные трифенилэтилены взаимодействуют с теми же а.о. в ЛСД ЭР, что и 4-гидрокситамоксифен, и они вероятнее всего вызывают изменение конформации подобное тамоксифену, но поскольку у них отстутствуют боковые цепи, то они вероятнее всего способны более эффективно обеспечивать взаимодейтвие 351 а.о. с АР-1 мотивом, чем 4-гидрокситамоксифен, а соответственно и активность ЭР, что репортерные тесты и показали. Таким образом, мы определили механизм активации ЭР непланарными эстрогенами трифенилэтиленами в клетках рака молочной железы.

Важно отметить, что все наши исследуемые трифенилэтилены были агонистами ЭР дикого типа во всех клеточных линиях (по результатам репортерных тестов), но тем не менее, результаты обширых исследований структурно-функциональных отношений трифенилэтиленов, проведенных группой Густа [193,194] показали, что некоторые из таких же трифенилэтиленов являются эффективными антагонистами в их клеточной линии МСР-7:2а, которые были стабильно трансфицированны векторами с репортерными генами. Авторы обнаружили, что трищцрокситрифенилэтилен и бисфенолтрифенилэтилен в та исследованиях почти полностью ингибировали эстрадиол-стимулированную транскрипцию репортерного гена при концентрации 100 нМ. Антагонистические свойства трифенилэтиленов, описываемые в их исследованиях, не коррелируют с их же результатми цитотоксических тестов на клетках дикого типа МСР-7 [193,194]. Оба рассматриваемых трифенилэтилена производили только слабый цитотоксический эффект, но при концентрациях выше 5 мкМ, что гораздо выше предела концентрационного диапазона, использованного в настоящем исследовании. Эту разницу в результатах полученных в настоящем исследовании и группой Густа можно объяснить разницой в наших клеточных линиях, а так же в схемах экспериментов.

5.4. Определение роли конформационного изменения ЭР непланарными эстроганами в транскрипционной активности ЭР и его протеосомальной деградации

Для определения роли конформационных изменений ЭР в регуляции транскрипционной активности ЭР мы опирались на известные факты, что транскрипционная активность ЭР поддерживается за счет постоянного время полужизниа белка ЭР. Время полужизни белка ЭР обеспечивается системой протеосомальной деградации белка. После активации ЭР лигандом и присоединения белков-коактиваторов, к этому комплексу присоединяются дополнительные коактиваторные молекулы, среди которых ДНК метилтрансфераза и ацетилтрансфераза, для изменения нуклеосомнальной структуры ДНК, что позволяет ЭР присоединиться к ДНК, а так же и убиквитин-лигазы иЬЬ и иЬС, которые осуществляют убиквитинилирование белка ЭР [48]. Убиквитинилирование белка ЭР «метит» последний для деградации 26Б протеосомой и это позволяет поддерживать постоянную ЭР-опосредованную транскрипцию эстроген-зависимых генов. Так было показано, что ингибирование деградации ЭР в клетках рака молочной железы существенно снижает транскрипционную активность на эстроген-респонсивных генах [48,195]. Эти факты заставили нас предположить, что транскрипционная активность ЭР с измененной конформацией белка и, соответственно, механизмом активации, может быть отличной от той, которая была описана при активации рецептора плпнарным эстрадиолом.

Для определения транскрипционной активности на эстроген-зависимом гене в клетках молочной железы мы провели количественную ПЦР в реальном времени на гене рБ2, который является классическим примером эстроген-зависимого гена. ПЦР проводились на основе кДНК полученных их обоих сублиний МСР-7^88 и МСР-7:5С, обработанных как эстрадиолом, так и исследуемыми трифенилэтиленами. Результаты данных опытов показали, что все эстрогены вне зависимости от структуры способны активировать ЭР в обоих линиях клеток. Это укзывает на то, что конформация ЭР не особо влияет на активацию транскрипционной активности эстроген-зависимых генов, таких как р82. Это так же подтверждается нашими репортерными тестами, проведенными на обеих линиях клеток. Но следует отметить, что транскрипционная активность генов в данных типах опытов у ЭР активированных трифенилэтиленами в среднем ниже, чем у инициированных планарным эстрадиолом. По этой причине мы решили проверить механизм регуляции этой транскрипционной активности через деградацию белка ЭР. Для этого мы провели Вестерн блоттинг лизатов клеток обеих линий клеток и обработали мембраны антителами против ЭРа и сравнили уровни белка ЭР в каждом образце. Результаты после 24 часов обработки клеток показали, что только эстрадиол в обеих линиях клеток способен деградировать белок ЭР стабильно, а трифенилэтилены никак не изменяли уровень белка. При проведении экспериментов с изучением динамики деградации ЭР мы обнаружили, что и трифенилэтилены способны стимулировать деградацию ЭР, но это происходит только между 2-8 часами обработки клеток, после чего уровень белка ЭР стабилизируется на контрольном уровне. Это может указывать на то, что механизм регуляции деградации белка ЭР активированного непланарными эстрогенами, отличный от механизма деградации ЭР, или может быть связанно с более низким сродством трифенилэтиленов с рецептором. Для проверки гипотезы о том, что низкий уровень деградации ЭР и его нестабильность связана с низким привлечением коактиваторных белков мы провели эксперименты с хроматиновой иммунопреципитацией промоторного участка гена pS2 и белков ЭР и коактиваторного белка SRC-3, после обрабоки клеток дикого типа MCF-7 некоторыми трифенилэтиленами и эстрадиолом в течении 45 минут. Нашей задачей являлось определить уровень привлечения белка SRC-3 на промотор гена pS2, так как именно привлечение коактиваторов обуславливает присоединение белков, необходимых для убиквитинирования ЭР [48]. Результаты данных экспериментов показали, что трифенилэтилены, которые обладают эстрогеноподобными свойствами, привлекают активированный ЭР на промотор так же эффективно, как и эстрадиол, но уровень белка SRC-3, ассоциированного с ЭР активированным трифенилэтиленами, занчительно меньше. Известно, что такие антиэстрогены как метаболиты тамоксифена 4-гидрокситамоксифен и эндоксифен так же способны привлекать ЭР на промоторы эстроген-зависимых генов, скорее всего из-за своих слабых эстрогеноподобных свойств, но с ними ассоциированны корепрессоры, поэтому они и не вызывают активацию транскрипции на промоторах [195]. В случае с трифенилэтиленами, ЭР, активированный такими непланарными эстрогенами, способен быть активным как транскрипционный фактор, но привлечение коактиваторов низкое, что может объяснить пониженную транскрипционную активность за счет сниженного уровня деградации белка ЭР протеосомальным комплексом. Подтвердением наших результатов, полученных при помощи иммунопреципитации хроматина могут служить результаты полученные, группой Леклерка из Бельгии [196]. Их группа обнаружила на другой in vitro модели, что ЭР ассоциированный с непланарными эстрогенами класса II не может образовывать комплекс с коактиватоными молекулами по причине конформационных изменений молекулы рецептора. В своих исследованиях они использовали вещество бисфенотрифенилэтилен и другие непланарные эстрогены, при связывании с которыми наблюдалось увеличение транскрипционной активности ЭР, а так же могли проявлять некоторые антагонистические свойства, подобные тем, которые обнаружили и мы. Бисфенолтрифенилэтилен в их исследованиях активирвал ЭР, но рецептор не способен в этом случае присоединать коактиваторы [196].

Для доказательства, того что снижение уровня белка ЭР, которое наблюдается в первые часы обработки клеток трифенилэтиленами, это именно протеосомальная деградация, мы провели опыты с ингибированием 26Б протеосомального комплекса. Результаты показали, что при ингибировании протеосомы специфическим ингибитором 1уЮ132, деградация ЭР, индуцируемая эстрадиолом, предотвращается, что подтверждает факт эстрадиол-индуцированной деградации ЭР [48]. Ингибирование протеосомы так же предотвращает деградацию ЭР; это доказывает, что снижение уровня белка ЭР в первые часы обрабоки клеток связано именно с протеосомальной деградацией белка ЭР. Для выявления возможных механизмов, регулирующих стабильность ЭР при активации трифенилэтиленами, мы провели обработку ЭР-отрицательных клеток рака молочной железы МБА-231, стабильно трансфицированных векторами для экспрессии белков ЭР дикого типа и с мутантной формы ЭР с заменой глицина 538 на аспартат. Было ранее замечено в рамках исследования по изучению эстрогеноподобных свойств тамоксифена, что при замене 538 а.о. на аспартат снижается стабильность ЭР, ассоциированного с 4-гидрокситамоксифеном и происходит эго деградация, чего не наболюдается с ЭР дикого типа. Результаты показали, что эстрадиол может стимулировать деградацию обеих форм ЭР, а тамоксифен только мутантную. Тригидрокситрифенилэтилен был неспособен стимулировать деградацию ЭР дикого типа в течении 24 часов, но способен стимулировать деградацию ЭР с заменой глицина в 538 позиции на аспартат, это указывает на схожесть механизмов регуляции стабильности ЭР ассоциированного с 4-гидрокситамоксифеном и на различия, в регуляции стабильности ЭР активированного эстрадиолом или трифенилэтиленами: Это подтверждает ранее предложенную группой

Джордана гипотезу о том, что непланарные эстрогены нуждаются в наличии 538 а.о. в поддержании стабильности ЭР, что и отличает этот механизм от механизма регуляции стабильности рецептора, активированного планарными эстрогенами [195].

Все эти данные указывают, что изменение конформации ЭР при связывании с трифенилэтиленами не только не только лишает его способности индуцировать эстроген-индуцированный апоптоз в эстроген-независимых клетках, но и играет роль в регуляции стабильности белка ЭР, что, в свою очередь, изменяет механизм регуляции транскрипционной активности опосредованной ЭР.

Таким образом в настоящей работе исследовалась роль конформационных изменений ЭР при связывании с непланарными эстрогенами. Непланарные эстрогены были представлены серией синтезированных нестероидных гидроксилированных производных трифенилэтилена. Биологические свойства данных непланарных эстрогенов класса II сравнивались с планарными эстрогенами класса I, такими как эстрадиол и DES. Для определения разницы в вероятных конформационных изменениях ЭР при связывании с эстрогенами различных классов мы применили метод виртуального докинга и показали, что конформационные изменения ЭР при связывании трифенилэтиленов вероятнее всего больше напоминают антагонистическую конформацию рецептора, придаваемую рецептору антиэстрогеном 4-гидрокситамоксифеном. Для определения биологической активности трифенилэтиленов по сравнению с эстрогенами класса I применялись пролиферативные тесты, с помошью которых мы показали, что все эстрогены, вне зависимости от класса, способны инициировать пролиферацию клеток рака молочной железы с диким фенотипом, но не все способны индуцировать эстроген-идуцированный апоптоз в эстроген-независимых клетках. При помощи Вестерн блоттингов мы показали, что из-за измененной конформации ЭР рифенилэтилена, невозможно существенное увеличение уровней проапоптотических факторов, что возможно и является причиной низкой степени клеточной гибели. При помощи репортерных тестов, проведенных на тех же линиях клеток, мы показали, что вне зависимости от класса эстрогенов, все вещества были способны активировать транскрипционную активность ЭР. Таким образом можно сделать вывод о том, что конформационное изменение ЭР не критично для активации рецептора и индукции клеточной пролиферации, но критично для индукции апоптоза в эстроген-независимых клетках. Так же при помощи репортерных тестов с мутантной формой ЭР мы показали разницу в механизме активации ЭР. Мы подтвердили гипотезу о том, что для активации ЭР трифенилэтиленами, последним необходимо взаимодействие с аспартатом в 351 позиции на рецепторе, что позволит этому а.о. взаимодейтсвовать с активным доменом рецептора АБ-1, что, по всей видимости и обеспечивает активность рецептора. Так же мы определили разницу в регуляции транскрипционной активности ЭР посредством изменения стабильности белка ЭР, связанного с непланарными эстрогенами, в сравнении с планарным эстрадиолом. При помощи Вестерн блотгингов мы показали, что ЭР активируемый трифенилэтиленами деградируется в меньшей степени, чем посредством планарного эстрадиола. Мы объяснили при помощи иммунопреципитации хроматина, что ЭР с измененной трифенилэтиленами конформацией не может эффективно связывать коактиваторы, что и обуславливает нарушение в протеосомальной деградации белка ЭР и объясняет пониженный уровень транскрипционной активности ЭР на промоторе эндогенных эстроген-респонсивных генов в клетках.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Максимов, Филипп Евгеньевич, 2010 год

1. Russo IH, Russo J: Role of hormones in mammary cancer initiation and progression. J

2. Mammary Gland Biol Neoplasia 1998, 3:49-61.

3. EBCTCG: Tamoxifen for early breast cancer: an overview of the randomised trials.

4. Early Breast Cancer Trialists' Collaborative Group. Lancet 1998, 351:1451-1467.

5. EBCTCG: Effects of chemotherapy and hormonal therapy for early breast cancer onrecurrence and 15-year survival: an overview of the randomised trials. Lancet 2005, 365:1687-1717.

6. Jordan VC: Tamoxifen: catalyst for the change to targeted therapy. Eur J Cancer 2008,44:30-38.

7. Fisher B, Costantino JP, Wickerham DL, Redmond CK, Kavanah M, Cronin WM, Yogel V,

8. Robidoux A, Dimitrov N, Atkins J, et al.: Tamoxifen for prevention of breast cancer: report of the National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project P-l Study. J Natl Cancer Inst 1998, 90:1371-1388.

9. Robson JM, Schonberg, A.: Estrous reactions, including mating, produced by triphenylethylene. Nature 1937,140:196.

10. Harper MJ, Walpole AL: Contrasting endocrine activities of cis and trans isomers in aseries of substituted triphenylethylenes. Nature 1966,212:87.

11. Harper MJ, Walpole AL: A new derivative of triphenylethylene: effect on implantationand mode of action in rats. JReprod Fertil 1967,13:101-119.

12. Jordan YC, Collins MM, Rowsby L, Prestwich G: A monohydroxylated metabolite oftamoxifen with potent antioestrogenic activity. J Endocrinol 1977, 75:305-316.

13. Johnson MD, Zuo H, Lee KH, Trebley JP, Rae JM, Weatherman RV, Desta Z, Flockhart DA,

14. Skaar TC: Pharmacological characterization of 4-hydroxy-N-desmethyl tamoxifen, a novel active metabolite of tamoxifen. Breast Cancer Res Treat 2004, 85:151-159.

15. Brzozowski AM, Pike AC, Dauter Z, Hubbard RE, Bonn T, Engstrom O, Ohman L, Greene

16. GL, Gustafsson JA, Carlquist M: Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor. Nature 1997,389:753-758.

17. Shiau AK, Barstad D, Loria PM, Cheng L, Kushner PJ, Agard DA, Greene GL: Thestructural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen. Cell 1998,95:927-937.

18. Levenson AS, Jordan VC: The key to the antiestrogenic mechanism of raloxifene isamino acid 351 (aspartate) in the estrogen receptor. Cancer Res 1998, 58:1872-1875.

19. Levenson AS, Tonetti DA, Jordan VC: The oestrogen-like effect of 4-hydroxytamoxifenon induction of transforming growth factor alpha mRNA in MDA-MB-231 breast cancer cells stably expressing the oestrogen receptor. Br J Cancer 1998, 77:18121819.

20. Jordan VC, Schafer JM, Levenson AS, Liu H, Pease KM, Simons LA, Zapf JW: Molecularclassification of estrogens. Cancer Res 2001, 61:6619-6623.

21. Gust R, Keilitz R, Schmidt K: Investigations of new lead structures for the design ofselective estrogen receptor modulators. J Med Chem 2001, 44:1963-1970.

22. Beatson GT: On the treatment of inoperable cases of carcinoma of the mamma:suggestions for a new method of treatment, with illustrative cases. Lancet 1896, 2:101-107.

23. Allen E, Doisy, E.A.: An ovarian, hormone: Preliminary reports on its localizationextraction and partial purification and action in test animals. JAMA 1923, 81:810821.

24. Dodds EC, Goldberg, L., Lawson, W., Robinson, R.: Estrogenic activity of certainsynthetic compounds. Nature 1938,141:247-248.

25. Haddow A, Watkinson, J.M., Paterson, E.: Influence of synthetic oestrogens uponadvanced malignant disease. British Medical Journal 1944:393-398.

26. Boyd S: On Oophorectomy in cancer of the breast. British Medical Journal 1900, 2:134141.

27. Kennedy BJ: Systemic effects of androgenic and estrogenic hormones in advancedbreast cancer. J Am Geriatr Soc 1965,13:230-235.

28. Kennedy BJ: Hormone therapy for advanced breast cancer. Cancer 1965,18:1551-1557.

29. Haddovv A: David A. Karnofsky memorial lecture. Thoughts on chemical therapy.1. Cancer 1970,26:737-754.

30. Haddow A: The chemotherapy of cancer. Br Med J1950,2:1271-1272.

31. Cooper RG: Combination chemotherapy in hormone resistant breast cancer. Proc Am

32. Assoc Cancer Res 1969,10:15.

33. Jensen KA, Luu TC, Chan WK: A truncated Ah receptor blocks the hypoxia andestrogen receptor signaling pathways: a viable approach for breast cancer treatment. Mol Pharm 2006, 3:695-703.

34. Toft D, Gorski J: A receptor molecule for estrogens: isolation from the rat uterus andpreliminary characterization. Proc Natl Acad Sci U SA 1966, 55:1574-1581.

35. Greene GL, Gilna P, Waterfield M, Baker A, Hort Y, Shine J: Sequence and expression ofhuman estrogen receptor complementary DNA. Science 1986, 231:1150-1154.

36. Kuiper GG, Enmark E, Pelto-Huikko M, Nilsson S, Gustafsson JA: Cloning of a novelreceptor expressed in rat prostate and ovary. Proc Natl Acad Sci USA 1996, 93:5925-5930.

37. Evans MJ, Eckert A, Lai K, Adelman SJ, Harnish DC: Reciprocal antagonism betweenestrogen receptor and NF-kappaB activity in vivo. Circ Res 2001, 89:823-830.

38. Menasce LP, White GR, Harrison CJ, Boyle JM: Localization of the estrogen receptorlocus (ESR) to chromosome 6q25.1 by FISH and a simple post-FISH banding technique. Genomics 1993,17:263-265.

39. Kumar V, Green S, Stack G, Berry M, Jin JR, Chambón P: Functional domains of thehuman estrogen receptor. Cell 1987,51:941-951.

40. Lees JA, Fawell SE, Parker MG: Identification of two transactivation domains in themouse oestrogen receptor. Nucleic Acids Res 1989,17:5477-5488.

41. Sanchez R, Nguyen D, Rocha W, White JH, Mader S: Diversity in the mechanisms of generegulation by estrogen receptors. Bioessays 2002,24:244-254.

42. Klinge CM: Estrogen receptor interaction with co-activators and co-repressors. Steroids2000, 65:227-251.

43. Kushner PJ, Agard DA, Greene GL, Scanlan TS, Shiau AK, Uht RM, Webb P: Estrogenreceptor pathways to AP-1. J Steroid Biochem Mol Biol 2000, 74:311-317.

44. Saville B, Wormke M, Wang F, Nguyen T, Enmark E, Kuiper G, Gustafsson JA, Safe S:1.gand-, cell-, and estrogen receptor subtype (alpha/beta)-dependent activation at GC-rich (Spl) promoter elements. J Biol Chem 2000,275:5379-5387.

45. McKenna NJ, O'Malley BW: Minireview: nuclear receptor coactivators—an update.

46. Endocrinology 2002,143:2461-2465.

47. Lannigan DA: Estrogen receptor phosphorylation. Steroids 2003, 68:1-9.

48. Feng W, Webb P, Nguyen P, Liu X, Li J, Karin M, Kushner PJ: Potentiation of estrogenreceptor activation function 1 (AF-1) by Src/JNK through a serine 118-independent pathway. Mol Endocrinol 2001,15:32-45.

49. Denton RR, Koszewski NJ, Notides AC: Estrogen receptor phosphorylation. Hormonaldependence and consequence on specific DNA binding. J Biol Chem 1992, 267:72637268.

50. Tzeng DZ, Klinge CM: Phosphorylation of purified estradiol-liganded estrogen receptorby casein kinase U increases estrogen response element binding but does not alter ligand stability. Biochem Biophys Res Commun 1996, 223:554-560.

51. Picard N, Charbonneau C, Sanchez M, Licznar A, Busson M, Lazennec G, Tremblay A:

52. Phosphorylation of activation function-1 regulates proteasome-dependent nuclear mobility and E6-associated protein ubiquitin ligase recruitment to the estrogen receptor beta. Mol Endocrinol 2008, 22:317-330.

53. Saji S, Hirose M, Toi M: Clinical significance of estrogen receptor beta in breast cancer.

54. Cancer Chemother Pharmacol 2005, 56 SuppI 1:21-26.

55. Lonard DM, Nawaz Z, Smith CL, O'Malley BW: The 26S proteasome is required forestrogen receptor-alpha and coactivator turnover and for efficient estrogen receptor-alpha transactivation. Mol Cell 2000, 5:939-948.

56. Gee AC, Carlson KE, Martini PG, Katzenellenbogen BS, Katzenellenbogen JA: Coactivatorpeptides have a differential stabilizing effect on the binding of estrogens and antiestrogens with the estrogen receptor. Mol Endocrinol 1999,13:1912-1923.

57. Pedram A, Razandi M, Levin ER: Nature of functional estrogen receptors at the plasmamembrane. Mol Endocrinol 2006, 20:1996-2009.

58. Arpino G, Wiechmann L, Osborne CK, Schiff R: Crosstalk between the estrogen receptorand the HER tyrosine kinase receptor family: molecular mechanism and clinical implications for endocrine therapy resistance. Endocr Rev 2008, 29:217-233.

59. Migliaccio A, Di Domenico M, Castoria G, de Falco A, Bontempo P, Nola E, Auricchio F:

60. Tyrosine kinase/p21ras/MAP-kinase pathway activation by estradiol-receptor complex in MCF-7 cells. EMBO J1996,15:1292-1300.

61. Schiff R, Massarweh SA, Shou J, Bharwani L, Mohsin SK, Osborne CK: Cross-talkbetween estrogen receptor and growth factor pathways as a molecular target for overcoming endocrine resistance. Clin Cancer Res 2004,10:331 S-336S.

62. Shou J, Massarweh S, Osborne CK, Wakeling AE, Ali S, Weiss H, Schiff R: Mechanisms oftamoxifen resistance: increased estrogen receptor-HER2/neu cross-talk in ER/HER2-positive breast cancer. J Natl Cancer Inst 2004, 96:926-935.

63. Campbell RA, Bhat-Nakshatri P, Patel NM, Constantinidou D, Ali S, Nakshatri H:

64. Phosphatidylinositol 3-kinase/AKT-mediated activation of estrogen receptor alpha: a new model for anti-estrogen resistance. J Biol Chem 2001, 276:9817-9824.

65. Saeki T, Cristiano A, Lynch MJ, Brattain M, Kim N, Normanno N, Kenney N, Ciardiello F,

66. Salomon DS: Regulation by estrogen through the 5'-flanking region of the transforming growth factor alpha gene. Mol Endocrinol 1991, 5:1955-1963.

67. Kenney NJ, Saeki T, Gottardis M, Kim N, Garcia-Morales P, Martin MB, Normanno N,

68. Salomon DS, Brandt R, Ciardiello F, Normanno N: Epidermal growth factor-relatedpeptides and their receptors in human malignancies. Crit Rev Oncol Hematol 1995, 19:183-232.

69. Levin ER: Bidirectional signaling between the estrogen receptor and the epidermalgrowth factor receptor. Mol Endocrinol 2003,17:309-317.

70. Razandi M, Pedram A, Park ST, Levin ER: Proximal events in signaling by plasmamembrane estrogen receptors. J Biol Chem 2003,278:2701-2712.

71. Schiff R, Massarweh S, Shou J, Osborne CK: Breast cancer endocrinc resistance: howgrowth factor signaling and estrogen receptor coregulators modulate response. Clin Cancer Res 2003,9:447S-454S.

72. Lerner LJ, Holthaus FJ, Jr., Thompson CR: A non-steroidal estrogen antiagonist l-(p-2diethylaminoethoxyphenyl)-l-phenyl-2-p-methoxyphenylethanol. Endocrinology 1958,63:295-318.

73. Lerner LJ, Jordan VC: Development of antiestrogens and their use in breast cancer:eighth Cain memorial award lecture. Cancer Res 1990,50:4177-4189.

74. Jordan VC: Biochemical pharmacology of antiestrogen action. Pharmacol Rev 1984,36:245-276.

75. Jordan VC: Tamoxifen: a most unlikely pioneering medicine. Nat Rev Drug Discov 2003,2:205-213.

76. Jordan VC: The development of tamoxifen for breast cancer therapy: a tribute to thelate Arthur L. Walpole. Breast Cancer Res Treat 1988,11:197-209.

77. Walpole AL, Patterson, E.: Synthetic oestrogens in mammary cancer. Lancet 1948, 2:783786.

78. Jordan VC, Robinson SP: Species-specific pharmacology of antiestrogens: role ofmetabolism. Fed Proc 1987, 46:1870-1874.

79. Jordan VC, Phelps E, Lindgren JU: Effects of anti-estrogens on bone in castrated andintact female rats. Breast Cancer Res Treat 1987,10:31-35.

80. Gottardis MM, Jordan VC: Antitumor actions of keoxifene and tamoxifen in the Nnitrosomethylurea-induced rat mammary carcinoma model. Cancer Res 1987, 47:4020-4024.

81. Gottardis MM, Robinson SP, Satyaswaroop PG, Jordan VC: Contrasting actions oftamoxifen on endometrial and breast tumor growth in the athymic mouse. Cancer Res 1988, 48:812-815.

82. Gottardis MM, Ricchio ME, Satyaswaroop PG, Jordan VC: Effect of steroidal andnonsteroidal antiestrogens on the growth of a tamoxifen-stimulated human endometrial carcinoma (EnCalOl) in athymic mice. Cancer Res 1990, 50:3189-3192.

83. Ettinger B, Black DM, Mitlak BH, Knickerbocker RK, Nickelsen T, Genant HK,

84. Cummings SR, Eckert S, Krueger KA, Grady D, Powles TJ, Cauley JA, Norton L, Nickelsen

85. T, Bjarnason NH, Morrow M, et al.: The effect of raloxifene on risk of breast cancer in postmenopausal women: results from the MORE randomized trial. Multiple Outcomes of Raloxifene Evaluation. JAMA 1999, 281:2189-2197.

86. Vogel VG, Costantino JP, Wickerham DL, Cronin WM, Cecchini RS, Atkins JN, Bevers TB,

87. Fehrenbacher L, Pajon ER, Jr., Wade JL, 3rd, et al.: Effects of tamoxifen vs raloxifene on the risk of developing invasive breast cancer and other disease outcomes: the NSABP Study of Tamoxifen and Raloxifene (STAR) P-2 trial. JAMA 2006, 295:27272741.

88. Chisamore MJ, Ahmed Y, Bentrem DJ, Jordan VC, Tonetti DA: Novel antitumor effect ofestradiol in athymic mice injected with a T47D breast cancer cell line overexpressing protein kinase Calpha. Clin Cancer Res 2001, 7:3156-3165.

89. Jordan VC, O'Malley BW: Selective estrogen-receptor modulators and antihormonalresistance in breast cancer. J Clin Oncol 2007, 25:5815-5824.

90. Paruthiyil S, Parmar H, Kerekatte V, Cunha GR, Firestone GL, Leitman DC: Estrogenreceptor beta inhibits human breast cancer cell proliferation and tumor formation by causing a G2 cell cycle arrest: Cancer Res 2004, 64:423-428.

91. Lieberman ME, Gorski J, Jordan VC: An estrogen receptor model to describe theregulation of prolactin synthesis by antiestrogens in vitro. J Biol Chem 1983, 258:4741-4745.

92. Jordan VC, Lieberman ME, Cormier E, Koch R, Bagley JR, Ruenitz PC: Structuralrequirements for the pharmacological activity of nonsteroidal antiestrogens in vitro. Mol Pharmacol 1984,26:272-278.

93. Jordan VC, Koch R, Mittal S, Schneider MR: Oestrogenic and antioestrogenic actions in aseries of triphenylbut-l-enes: modulation of prolactin synthesis in vitro. Br J Pharmacol 1986,87:217-223.

94. Jensen EV, Jordan VC: The estrogen receptor: a model for molecular medicine. Clin

95. Cancer Res 2003,9:1980-1989.

96. Jordan VC, Brodie AM: Development and evolution of therapies targeted to the estrogenreceptor for the treatment and prevention of breast cancer. Steroids 2007, 72:7-25.

97. Howell A, Cuzick J, Baum M, Buzdar A, Dowsett M, Forbes JF, Hoctin-Boes G, Houghton

98. J, Locker GY, Tobias JS: Results of the AT AC (Arimidex, Tamoxifen, Alone or in Combination) trial after completion of 5 years' adjuvant treatment for breast cancer. Lancet 2005,365:60-62.

99. Fisher B, Dignam J, Wolmark N, Wickerham DL, Fisher ER, Mamounas E, Smith R,

100. Begovic M, DimitrovNV, Margolese RG, et al.: Tamoxifen in treatment of intraductal breast cancer: National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project B-24 randomised controlled trial. Lancet 1999,353:1993-2000.

101. Gail MH, Costantino JP, Bryant J, Croyle R, Freedman L, Helzlsouer K, Vogel V: Weighingthe risks and benefits of tamoxifen treatment for preventing breast cancer. J Natl Cancer Inst 1999, 91:1829-1846.

102. Jordan VC: SERMs: meeting the promise of multifunctional medicines. J Natl Cancer1.st 2007,99:350-356.

103. Martino S, Cauley JA, Barrett-Connor E, Powles TJ, Mershon J, Disch D, Secrest RJ,

104. Cummings SR: Continuing outcomes relevant to Evista: breast cancer incidence in postmenopausal osteoporotic women in a randomized trial of raloxifene. J Natl Cancer Inst 2004, 96:1751-1761.

105. Goss PE, Ingle JN, Martino S, Robert NJ, Muss HB, Piccart MJ, Castiglione M, Tu D,

106. Shepherd LE, Pritchard KI, et al.: Randomized trial of Ietrozole following tamoxifen as extended adjuvant therapy in receptor-positive breast cancer: updated findings from NCIC CTG MA.17. J Natl Cancer Inst 2005, 97:1262-1271.

107. Gottardis MM, Jordan VC: Development of tamoxifen-stimulated growth of MCF-7tumors in athymic mice after long-term antiestrogen administration. Cancer Res 1988, 48:5183-5187.

108. Jordan VC, Mittal S, Gosden B, Koch R, Lieberman ME: Structure-activity relationshipsof estrogens. Environ Health Perspect 1985, 61:97-110.

109. Stearns V, Johnson MD, Rae JM, Morocho A, Novielli A, Bhargava P, Hayes DF, Desta Z,

110. Flockhart DA: Active tamoxifen metabolite plasma concentrations after coadministration of tamoxifen and the selective serotonin reuptake inhibitor paroxetine. J Natl Cancer Inst 2003, 95:1758-1764.

111. Desta Z, WardBA, SoukhovaNV, Flockhart DA: Comprehensive evaluation of tamoxifensequential biotransformation' by the human cytochrome P450 system in vitro: prominent roles for CYP3A and CYP2D6. J Pharmacol Exp Ther 2004, 310:10621075.

112. Borges S, Desta Z, Li L, Skaar TC, Ward BA, Nguyen A, Jin Y, Storniolo AM, Nikoloff

113. DM, Wu L, et al.: Quantitative effect of CYP2D6 genotype and inhibitors on tamoxifen metabolism: implication for optimization of breast cancer treatment. Clin Pharmacol Ther 2006, 80:61-74.

114. Weigel RJ, deConinck EC: Transcriptional control of estrogen receptor in estrogenreceptor-negative breast carcinoma. Cancer Res 1993, 53:3472-3474.

115. Robertson KD, Ait-Si-Ali S, Yokochi T, Wade PA, Jones PL, Wolffe AP: DNMT1 forms acomplex with Rb, E2F1 and HDAC1 and represses transcription from E2F-responsive promoters. Nat Genet 2000,25:338-342.

116. Davis T, Kennedy C, Chiew YE, Clarke CL, deFazio A: Histone deacetylase inhibitorsdecrease proliferation and modulate cell cycle gene expression in normal mammary epithelial cells. Clin Cancer Res 2000, 6:4334-4342.

117. Normanno N, Ciardiello F, Brandt R, Salomon DS: Epidermal growth factor-relatedpeptides in the pathogenesis of human breast cancer. Breast Cancer Res Treat 1994, 29:11-27.

118. Stoica A, Saceda M, Doraiswamy YL, Coleman C, Martin MB: Regulation of estrogenreceptor-alpha gene expression by epidermal growth factor. J Endocrinol 2000, 165:371-378.

119. Tang CK, Perez C, Grunt T, Waibel C, Cho C, LupuR: Involvement of heregulin-beta2 inthe acquisition of the hormone-independent phenotype of breast cancer cells. Cancer Res 1996,56:3350-3358.

120. Oh AS, Lorant LA, Holloway JN, Miller DL, Kern FG, El-Ashry D: Hyperactivation of

121. MAPK induces loss of ERalpha expression in breast cancer cells. Mol Endocrinol 2001,15:1344-1359.

122. Osborne CK, Bardou V, Hopp TA, Chamness GC, Hilsenbeck SG, Fuqua SA, Wong J,

123. Allred DC, Clark GM, Schiff R: Role of the estrogen receptor coactivator AIB1 (SRC-3) and HER-2/neu in tamoxifen resistance in breast cancer. J Natl Cancer Inst 2003, 95:353-361.

124. Dowsett M, Harper-Wynne C, Boeddinghaus I, Salter J, Hills M, Dixon M, Ebbs S, Gui G,

125. JW, Weiss GR: NF-kappa B inhibition markedly enhances sensitivity of resistant breast cancer tumor cells to tamoxifen. Ann Oncol 2004,15:885-890.

126. Sovak MA, Bellas RE, Kim DW, Zanieski GJ, Rogers AE, Traish AM, Sonenshein GE:

127. Aberrant nuclear factor-kappaB/Rel expression and the pathogenesis of breast cancer. J Clin Invest 1997,100:2952-2960.

128. Cogswell PC, Guttridge DC, Funkhouser WK, Baldwin AS, Jr.: Selective activation of NFkappa B subunits in human breast cancer: potential roles for NF-kappa B2/p52 and for Bcl-3. Oncogene 2000,19:1123-1131.

129. Zhou Y, Eppenberger-Castori S, Marx C, Yau C, Scott GK, Eppenberger U, Benz CC:

130. Activation of nuclear factor-kappaB (NFkappaB) identifies a high-risk subset of hormone-dependent breast cancers. Int JBiochem Cell Biol 2005,37:1130-1144.

131. Biswas DK, Shi Q, Baily S, Strickland I, Ghosh S, Pardee AB, Iglehart JD: NF-kappa Bactivation in human breast cancer, specimens and its role in cell proliferation and apoptosis. Proc Natl Acad Sci USA 2004,101:10137-10142.

132. Sliva D, English D, Lyons D, Lloyd FP, Jr.: Protein kinase C induces motility of breastcancers by uprcgulating secretion of urokinase-type plasminogen activator through activation of AP-1 and NF-kappaB. Biochem Biophys Res Comman 2002,290:552-557.

133. Bloom ND, Tobin EH, Schreibman B, Degenshein GA: The role of progesteronereceptors in the management ofadvanced breast cancer. Cancer 1980, 45:2992-2997.

134. Dowsett M, Cuzick J, Wale C, Howell T, Houghton J, Baum M: Retrospective analysis oftime to recurrence in the ATAC trial according to hormone receptor status: an hypothesis-generating study. J Clin Oncol 2005, 23:7512-7517.

135. Jordan VC, Gelber RD: Problems with the progesterone receptor in practice? J Clin1. Oncol 2007,25:1957-1959.

136. Osborne CK, Shou J, Massarweh S, Schiff R: Crosstalk between estrogen receptor andgrowth factor receptor pathways as a cause for endocrine therapy resistance in breast cancer. Clin Cancer Res 2005, ll:865s-870s.

137. Howell A, Dodwell DJ, Anderson H, Redford J: Response after withdrawal of tamoxifenand progestogens in advanced breast cancer. Ann Oncol 1992,3:611-617.

138. O'Regan RM, Gajdos C, Dardes RC, De Los Reyes A, Park W, Rademaker AW, Jordan

139. VC: Effects of raloxifene after tamoxifen on breast and endometrial tumor growth in athymic mice. J Natl Cancer Inst 2002,94:274-283.

140. Nicholson RI, Staka C, Boyns F, Hutcheson IR, Gee JM: Growth factor-drivenmechanisms associated with resistance to estrogen deprivation in breast cancer: new opportunities for therapy. Endocr Relat Cancer 2004,11:623-641.

141. Jordan NJ, Gee JM, Barrow D, Wakeling AE, Nicholson RI: Increased constitutiveactivity of PKB/Akt in tamoxifen resistant breast cancer MCF-7 cells. Breast Cancer Res Treat 2004, 87:167-180.

142. Gee JM, Harper ME, Hutcheson IR, Madden TA, Barrow D, Knowlden JM, McClelland

143. RA, Jordan N, Wakeling AE, Nicholson RI: The antiepidermal growth factor receptor agent gefltinib (ZD1839/Iressa) improves antihormone response and prevents development of resistance in breast cancer in vitro. Endocrinology 2003, 144:51055117.

144. Hutcheson IR, Knowlden JM, Madden TA, Barrow D, Gee JM, Wakeling AE, Nicholson

145. RI: Oestrogen receptor-mediated modulation of the EGFR/MAPK pathway in tamoxifen-resistant MCF-7 cells. Breast Cancer Res Treat 2003, 81:81-93.

146. Knowlden JM, Hutcheson IR, Barrow D, Gee JM, Nicholson RI: Insulin-like growthfactor-I receptor signaling in tamoxifen-resistant breast cancer: a supporting role to the epidermal growth factor receptor. Endocrinology 2005,146:4609-4618.

147. Normanno N, De Luca A, Bianco C, Maiello MR, Carriero MV, Rehman A, Wechselberger

148. C, Arra C, Strizzi L, Sanicola M, et al.: Cripto-1 overexpression leads to enhanced invasiveness and resistance to anoikis in human MCF-7 breast cancer cells. J Cell Physiol 2004,198:31-39.

149. Atlas E, Cardillo M, Mehmi I, Zahedkargaran H, Tang C, Lupu R: Heregulin is sufficientfor the promotion of tumorigenicity and metastasis of breast cancer cells in vivo. Mol Cancer Res 2003,1:165-175.

150. Brodie AH, Jelovac D, Long B: The intratumoral aromatase model: studies witharomatase inhibitors and antiestrogens. J Steroid Biochem Mol Biol 2003,86:283-288.

151. Wolf DM, Jordan VC: A laboratory model to explain the survival advantage observedin patients taking adjuvant tamoxifen therapy. Recent Results Cancer Res 1993, 127:23-33.

152. Lee ES, Schafer JM, Yao K, England G, O'Regan RM, De Los Reyes A, Jordan VC: Crossresistance of triphenylethylene-type antiestrogens but not ICI 182,780 in tamoxifen-stimulated breast tumors grown in athymic mice. Clin Cancer Res 2000, 6:4893-4899.

153. Herman ME, Katzenellenbogen BS: Response-specific antiestrogen resistance in a newlycharacterized MCF-7 human breast cancer cell line resulting from long-term exposure to trans-hydroxytamoxifen. J Steroid Biochem Mol Biol 1996, 59:121-134.

154. Liu H, Lee ES, Gajdos C, Pearce ST, Chen B, Osipo C, Loweth J, McKian K, De Los

155. Reyes A, Wing L, et al.: Apoptotic action of 17beta-estradiol in raloxifene-resistant MCF-7 cells in vitro and in vivo. J Natl Cancer Inst 2003, 95:1586-1597.

156. Park WC, Liu H, Macgregor Schafer J, Jordan VC: Deregulation of estrogen inducedtelomerase activity in tamoxifen-resistant breast cancer cells. Int J Oncol 2005, 27:1459-1466.

157. Song RX, Mor G, Naftolin F, McPherson RA, Song J, Zhang Z, Yue W, Wang J, Santen

158. RJ: Effect of long-term estrogen deprivation on apoptotic responses of breast cancer cells to 17beta-estradioI. J Natl Cancer Inst 2001, 93:1714-1723.

159. Lewis JS, Osipo C, Meeke K, Jordan VC: Estrogen-induced apoptosis in a breast cancermodel resistant to long-term estrogen withdrawal. J Steroid Biochem Mol Biol 2005, 94:131-141.

160. Robinson SP, Jordan VC: Antiestrogenic action of toremifene on hormone-dependent,independent, and heterogeneous breast tumor growth in the athymic mouse. Cancer Res 1989, 49:1758-1762.

161. Osborne CK, Coronado E, Allred DC, Wiebe V, DeGregorio M: Acquired tamoxifenresistance: correlation with reduced breast tumor levels of tamoxifen and isomerization of trans-4-hydroxytamoxifen. J Natl Cancer Inst 1991, 83:1477-1482.

162. Yao K, Lee ES, Bentrem DJ, England G, Schafer JI, O'Regan RM, Jordan VC: Antitumoraction of physiological estradiol on tamoxifen-stimulated breast tumors grown in athymic mice. Clin Cancer Res 2000, 6:2028-2036.

163. Osipo C, Gajdos C, Liu H, Chen B, Jordan VC: Paradoxical action of fulvestrant inestradiol-induced regression of tamoxifen-stimulated breast cancer. J Natl Cancer Inst 2003, 95:1597-1608.

164. Jordan VC: Selective estrogen receptor modulation: concept and consequences incancer. Cancer Cell 2004,5:207-213.

165. Scherbakov AM, Lobanova YS, Shatskaya VA, Onopchenko OV, Gershtein ES,

166. Krasil'mkov MA: Activation of mitogenic pathways and sensitization to estrogen-induced apoptosis: two independent characteristics of tamoxifen-resistant breast cancer cells? Breast Cancer Res Treat 2006,100:1-11.

167. Ingle JN, Ahmann DL, Green SJ, Edmonson JH, Bisel HF, Kvols LK, Nichols WC,

168. Creagan ET, Hahn RG, Rubin J, et al.: Randomized clinical trial of dietliylstilbestrol versus tamoxifen in postmenopausal women with advanced breast cancer. N Engl J Med 1981, 304:16-21.

169. Lonning PE, Taylor PD, Anker G, Iddon J, Wie L, Jorgensen LM, Mella O, Howell A:

170. High-dose estrogen treatment in postmenopausal breast cancer patients heavily exposed to endocrine therapy. Breast Cancer Res Treat 2001, 67:111-116.

171. Peter ME, Krammer PH: The CD95(APO-l/Fas) DISC and beyond. Cell Death Differ2003,10:26-35.

172. Tsujimoto Y: Bcl-2 family of proteins: life-or-death switch in mitochondria. Biosci Rep2002,22:47-58.

173. Lewis JS, Meeke K, Osipo C, Ross EA, Kidawi N, Li T, Bell E, Chandel NS, Jordan VC:1.trinsic mechanism of estradiol-induced apoptosis in breast cancer cells resistant to estrogen deprivation. J Natl Cancer Inst 2005, 97:1746-1759.

174. Lobanova YS, Scherbakov AM, Shatskaya VA, Krasil'nikov MA: Mechanism of estrogeninduced apoptosis in breast cancer cells: role of the NF-kappaB signaling pathway. Biochemistry (Mosc) 2007,72:320-327.

175. Song RX, Zhang Z, Mor G, Santen RJ: Down-regulation of Bcl-2 enhances estrogenapoptotic action in long-term, estradiol-depleted ER(+) breast cancer cells. Apoptosis 2005,10:667-678.

176. Zeitlin BD, Zeitlin IJ, Nor JE: Expanding circle of inhibition: small-molecule inhibitorsof Bcl-2 as anticancer cell and antiangiogenic agents. J Clin Oncol 2008, 26:41804188.

177. Voehringer DW: BCL-2 and glutathione: alterations in cellular redox state thatregulate apoptosis sensitivity. Free Radic Biol Med 1999,27:945-950.

178. Schroder CP, Godwin AK, O'Dwyer PJ, Tew KD, Hamilton TC, Ozols RF: Glutathioneand drug resistance. Cancer Invest 1996, 14:158-168.

179. Anderson ME: Glutathione: an overview of biosynthesis and modulation. Chem Biol1.teract 1998,111-112:1-14.

180. Townsend DM, Tew KID, Tapiero H: The importance of glutathione in human disease.

181. BiomedPharmacother 2003, 57:145-155.

182. Anderson CP, Tsai JM, Meek WE, Liu RM, Tang Y, Forman HJ, Reynolds CP: Depletionof glutathione by buthionine sulfoxine is cytotoxic for human neuroblastoma cell lines via apoptosis. Exp Cell Res 1999,246:183-192.

183. Lewis-Wambi JS, Kim, H., Wambi, C., Patel, R., Pyle, J.R., Klein-Szanto, A.J., Jordan,

184. V.C.: Buthionine Sulfoximide Sensitizes Antihormone-Resistant Human Breast Cancer Cells to Estrogen-Induced Apoptosis. Breast Cancer Research 2008, (In Press).

185. Bailey HH, Ripple G, Tutsch KD, Arzoomanian RZ, Alberti D, Feierabend C, Mahvi D,

186. Schink J, Pomplun M, Mulcahy RT, et al.: Phase I study of continuous-infusion L-S,R-buthionine sulfoximine with intravenous melphalan. J Natl Cancer Inst 1997, 89:1789-1796.

187. Bailey HH, Mulcahy RT, Tutsch KD, Arzoomanian RZ, Alberti D, Tombes MB, Wilding

188. G, Pomplun M, Spriggs DR: Phase I clinical trial of intravenous L-buthionine sulfoximine and melphalan: an attempt at modulation of glutathione. J Clin Oncol 1994,12:194-205.

189. Ellis MJ, Dehdahti, F., Kommareddy, A., Jamalabadi-Majidi, S., Crowder, R., Jeffe, D.B.,

190. Lewis-Wambi JS, Kim HR, Wambi C, Patel R, Pyle JR, Klein-Szanto AJ, Jordan VC:

191. Buthionine sulfoximine sensitizes antihormone-resistant human breast cancer cells to estrogen-induced apoptosis. Breast Cancer Res 2008,10:R104.

192. O'Dwyer PJ, Hamilton TC, LaCreta FP, Gallo JM, Kilpatrick D, Halbherr T, Brennan J,

193. Bookman MA, Hoffman J, Young RC, et al.: Phase I trial of buthionine sulfoximine in combination with melphalan in patients with cancer. J Clin Oncol 1996,14:249-256.

194. Khor LY, Moughan J, Al-Saleem T, Hammond EH, Venkatesan V, Rosenthal SA, Ritter

195. MA, Sandler HM, Hanks GE, Shipley WU, et al.: Bcl-2 and Bax expression predict prostate cancer outcome in men treated with androgen deprivation and radiotherapy on radiation therapy oncology group protocol 92-02. Clin Cancer Res 2007,13:3585-3590.

196. Stein CA, Benimetskaya L, Mani S: Antisense strategies for oncogene inactivation.

197. Semin Oncol 2005,32:563-572.

198. Walensky LD, Kung AL, Escher I, Malia TJ, Barbuto S, Wright RD, Wagner G, Verdine

199. GL, Korsmeyer SJ: Activation of apoptosis in vivo by a hydrocarbon-stapled BH3 helix. Science 2004,305:1466-1470.

200. Oh KJ, Barbuto S, Pitter K, Morash J, Walensky LD, Korsmeyer SJ: A membranetargeted BID BCL-2 homology 3 peptide is sufficient for high potency activation of BAX in vitro. J Biol Chem 2006,281:36999-37008.

201. Leone M, Zhai D, Sareth S, Kitada S, Reed JC, Pellecchia M: Cancer prevention by teapolyphenols is linked to their direct inhibition of antiapoptotic Bcl-2-family proteins. Cancer Res 2003, 63:8118-8121.

202. Zhai D, Jin C, Satterthwait AC, Reed JC: Comparison of chemical inhibitors ofantiapoptotic Bcl-2-family proteins. Cell Death Differ 2006,13:1419-1421.

203. Mohammad RM, Wang S, Aboukameel A, Chen B, Wu X, Chen J, Al-Katib A: Preclinicalstudies of a nonpeptidic small-molecule inhibitor of Bcl-2 and Bcl-X(L) (-)-gossypol. against diffuse large cell lymphoma. Mol Cancer Ther 2005, 4:13-21.

204. Wang JL, Liu D, Zhang ZJ, Shan S, Han X, Srinivasula SM, Croce CM, Alnemri ES,

205. Huang Z: Structure-based discovery of an organic compound that binds Bcl-2 protein and induces apoptosis of tumor cells. Proc Natl Acad Sci U SA 2000, 97:71247129.

206. Zeitlin BD, Joo E, Dong Z, Warner K, Wang G, Nikolovska-Coleska Z, Wang S, Nor JE:

207. Antiangiogenic effect of TW37, a small-molecule inhibitor of Bcl-2. Cancer Res 2006, 66:8698-8706.

208. Oltersdorf T, Elmore SW, Shoemaker AR, Armstrong RC, Augeri DJ, Belli BA, Bruncko

209. M, Deckwerth TL, Dinges J, Hajduk PJ, et al.: An inhibitor of Bcl-2 family proteins induces regression of solid tumours. Nature 2005,435:677-681.

210. Mohammad RM, Goustin AS, Aboukameel A, Chen B, Baneijee S, Wang G, Nikolovska

211. Coleska Z, Wang S, Al-Katib A: Preclinical studies of TW-37, a new nonpeptidic small-molecule inhibitor of Bcl-2, in diffuse large cell lymphoma xenograft model reveal drug action on both Bcl-2 and Mcl-1. Clin Cancer Res 2007,13:2226-2235.

212. Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S, Fuchs H, Paton V, Bajamonde A, Fleming T,

213. Eiermann W, Wolter J, Pegram M, et al.: Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. N Engl J Med 2001,344:783-792.

214. Marty M, Cognetti F, Maraninchi D, Snyder R, Mauriac L, Tubiana-Hulin M, Chan S,

215. Gasparini G, Gion M, Mariani L, Papaldo P, Crivellari D, Filippelli G, Morabito A,

216. Burstein HJ, Keshaviah A, Baron A, al. E: Trastuzumab and vinorelbine or taxanechemotherapy for HER2+ metastatic breast cancer: the TRAVIOTA study. Journal of Clinical Oncology 2006 ASCO Ann Meet Proc Part I, 24:abstract 650.

217. Robert N, Leyland-Jones B, Asmar L, Belt R, Ilegbodu D, Loesch D, Raju R, Valentine E,

218. Sayre R, Cobleigh M, et al.: Randomized phase III study of trastuzumab, paclitaxel, and carboplatin compared with trastuzumab and paclitaxel in women with HER-2-overexpressing metastatic breast cancer. J Clin Oncol 2006,24:2786-2792.

219. Bernard-Marty C, Lebrun F, Awada A, Piccart MJ: Monoclonal antibody-based targetedtherapy in breast cancer: current status and future directions. Drugs 2006, 66:15771591.

220. Johnston JB, Navaratnam S, Pitz MW, Maniate JM, Wiechec E, Baust H, Gingerich J,

221. Skliris GP, Murphy LC, Los M: Targeting the EGFR pathway for cancer therapy.

222. CurrMed Chem 2006,13:3483-3492.

223. Agus DB, Gordon MS, Taylor C, Natale RB, Karlan B, Mendelson DS, Press MF, Allison

224. DE, Sliwkowski MX, Lieberman G, et al.: Phase I clinical study of pertuzumab, a novel HER dimerization inhibitor, in patients with advanced cancer. J Clin Oncol 2005,23:2534-2543.

225. Jager M, Ruf P, Schoberth A, Hess J, Lindhofer H: Effect of low HER2(+1) expressingtumor cells of the trifunctional antibody ertumaxomab. Journal of Clinical Oncology 2008, 26:abstract 3071.

226. Konecny GE, Pegram MD, Venkatesan N, Finn R, Yang G, Rahmeh M, Untch M, Rusnak

227. DW, Spehar G, Mullin RJ, et al.: Activity of the dual kinase inhibitor lapatinib (GW572016) against HER-2-overexpressing and trastuzumab-treated breast cancer cells. Cancer Res 2006, 66:1630-1639.

228. Nelson MH, Dolder CR: Lapatinib: a novel dual tyrosine kinase inhibitor with activityin solid tumors. Ann Pharmacother 2006, 40:261-269.

229. Cameron D, Casey M, Press M, Lindquist D, Pienkowski T, Romieu CG, Chan S, Jagiello

230. Chu QS, Cianfrocca ME, Goldstein LJ, Gale M, Murray N, Loftiss J, Arya N, Koch KM,

231. Pandite L, Fleming RA, et al.: A phase I and pharmacokinetic study of lapatinib in combination with letrozole in patients with advanced cancer. Clin Cancer Res 2008, 14:4484-4490.

232. Konecny G, Pauletti G, Pegram M, Untch M, Dandekar S, Aguilar Z, Wilson C, Rong HM,

233. Bauerfeind I, Felber M, et al.: Quantitative association between HER-2/neu and steroid hormone receptors in hormone receptor-positive primary breast cancer. J Natl Cancer Inst 2003,95:142-153.

234. Ariazi EA, Kraus RJ, Farrell ML, Jordan VC, Mertz JE: Estrogen-related receptor alphaltranscriptional activities are regulated in part via the ErbB2/HER2 signaling pathway. Mol Cancer Res 2007, 5:71-85.

235. Levenson AS, MacGregor Schafer JI, Bentrem DJ, Pease KM, Jordan YC: Control of theestrogen-like actions of the tamoxifen-estrogen receptor complex by the surface amino acid at position 351. J Steroid Biochem MolBiol 2001, 76:61-70.

236. McCague R, Leclercq G, Jordan VC: Nonisomerizable analogues of (Z)- and (E)-4hydroxytamoxifen. Synthesis and endocrinological properties of substituted diphenylbenzocycloheptenes. J Med Chem 1988,31:1285-1290.

237. Bentrem D, Fox JE, Pearce ST, Liu H, Pappas S, Kupfer D, Zapf JW, Jordan VC: Distinctmolecular conformations of the estrogen receptor alpha complex exploited by environmental estrogens. Cancer Res 2003, 63:7490-7496.

238. Pink JJ, Bilimoria MM, Assikis J, Jordan VC: Irreversible loss of the oestrogen receptorin T47D breast cancer cells following prolonged oestrogen deprivation. Br J Cancer 1996,74:1227-1236.

239. Lubczyk V, Bachmann H, Gust R: Investigations on estrogen receptor binding. Theestrogenic, antiestrogenic, and cytotoxic properties of C2-alkyl-substituted l,l-bis(4-hydroxyphenyl)-2-phenylethenes. J Med Chem 2002, 45:5358-5364.

240. Lubczyk V, Bachmann H, Gust R: Antiestrogenically active l,l,2-tris(4-hydroxyphenyI)alkenes without basic side chain: synthesis and biological activity. J Med Chem 2003,46:1484-1491.

241. Pearce ST, Liu H, Jordan VC: Modulation of estrogen receptor alpha function andstability by tamoxifen and a critical amino acid (Asp-538) in helix 12. J Biol Chem 2003,278:7630-7638.