Исследование спонтанного и индуцированного апоптоза методом проточной цитофлуориметрии при раке молочной железы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.14, кандидат медицинских наук Кудинова, Елена Александровна

• Кудинова, Елена Александровна
• кандидат медицинских наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Кудинова, Елена Александровна

Введение.

Глава 1. Современное состояние проблемы.

1.1 Молекулярные механизмы апоптоза

1.2 Показатели клеточного цикла и их прогностическое значение при раке молочной железы.

1.3 Методы исследования апоптоза.

1.4 Исследование прогностической значимости показателей апоптоза.

Глава 2. Собственный клинический материал и методы исследования

2.1 Характеристика клинического материала.

2.2 Метод проточной цитофлуорометрии.

2.3 Методики приготовление клеточной суспензии.

2.4 Анализ гистограмм.

2.5 Иммуногистохимический метод.

2.6 Статистическая обработка.

Глава 3. Результаты собственных исследований.

3.1 Сравнение уровня спонтанного апоптоза в ткани нормальной и патологически измененной молочной железы.

3.2 Сравнение уровня апоптоза и пролиферативной активности при различных патологиях молочной железы.

3.3 Зависимость уровня апоптоза и пролиферативной активности от гистологического типа рака молочной железы.

3.4. Сравнение уровня апоптоза в зависимости от экспрессии эстроген и прогестероновых рецепторов.

3.5 Изменение уровня апоптоза в ткани рака молочной железы после предоперационной химиотерапии.

3.6 Сравнение уровня апоптоза и плоидности опухоли при раке молочной железы.

3.7 Влияние гистологического типа, плоидности и предопреационной химиотерпии на уровень апоптоза и пролиферативую активность в ткани рака молочной железы.

3.8 Использование показателей пролиферации и апоптоза для оценки местной распространенности.

Глава 4. Обсуждение результатов исследования.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование спонтанного и индуцированного апоптоза методом проточной цитофлуориметрии при раке молочной железы»

Формирование концепции апоптоза и осознание роли апоптоза в многочисленных физиологических процессах привело к активному исследованию нарушений и роли этого процесса при различных патологических состояниях. Особый интерес представляет изучение патологии апоптоза как стадии онкогенеза. Общепринятой точкой зрения в настоящее время считается концепция, согласно которой, нарушение равновесия (гармонии) между процессами пролиферации и апоптоза является главной причиной формирования опухоли. Эта парадигма является основной отправной точкой для разработки новых методов диагностики и лечения в онкологии. Исследование молекулярных факторов, отвечающих за контроль процессов пролиферации и апоптоза позволило выявить ряд диагностически значимых маркеров для различных нозологических форм рака (таких как рак желудка, толстой кишки, легкого, мочевого пузыря и др.). В тоже время, исследование этих маркеров в случае рака молочной железы, не выявило их диагностической эффективности по сравнению с клиническими факторами и такими показателями как уровень экспрессии рецепторов эстрогенов и прогестерона (Volpi A., De Paola F.,Nanni О., 2000, Chappuis P.O., Kapusta L. 2000). В практическом плане кажется перспективным, наравне с исследованием молекулярных маркеров процесса апоптоза исследование непосредственно количественных его показателей в ткани. Наличие, как минимум, двух пусковых механизмов апоптоза и сложной сети его регуляции позволяет говорить о возможной неоднозначности полученных результатов при исследовании только уровня экспрессии или наличия мутации ряда молекулярных компонентов.

Разработано несколько способов регистрации процессов апоптоза в тканях и клеточных культурах (Mundle S.D. и др., 1995, Ornberg R.L., 2001, Barret K.L., и соавт. 2001, Darzynkiewicz Z. и др. 2000,). С клинической точки зрения практический интерес представляет индекс апоптоза (АИ) - индекс, учитывающий процентное количество клеток, имеющих морфологические признаки апоптоза при микроскопическом исследовании ткани. Другим, наиболее употребимым способом регистрации уровня апоптоза является метод проточной цитофлуорометрии (Богатырев В. Н, 1991, Darzynkiewicz Z., 2000). Использование метода проточной цитофлуорометрии может быть основано на различных принципах окраски, так использование только красителей, специфичных к ДНК основано на феномене образования апоптозных частиц, содержащих уменьшенное количество ДНК,по сравнению с исходным количеством и регистрируется как субдиплоидный пик на ДНК гистограмме. Метод регистрирует в основном поздние стадии апотпоза. Однако последний метод практически не используется для анализа клинического материала, хотя является основным в экспериментальных исследованиях. Оба метода имеют свои преимущества и недостатки. Первый представляется предпочтительным благодаря своей относительной простоте и доступности, второй более информативен, однако требует анализа только свежего операционного материале и невыполним на фиксированном материале (таком как парафиновые блоки). В тоже время, возможность одновременной оценки показателей пролиферации и количественных и качественных аспектов апоптоза позволяет говорить о большей информативности метода, основанного на использовании проточной цитометрии. Следует упомянуть также работы, использующие TUNEL метод. Метод основан на использовании антител к бромдиоксиуридину, специфически связывающемуся с двунитевыми разрывами ДНК. Следует сказать, что этот метод регистрирует в основном ранние стадии апоптоза. Этот подход может быть реализован как в варианте с регистрацией сигнала методом проточной цитофлуорометрии, так и цитофотометрии, т.е. на гистологических или цитологических срезах. Однако, в настоящее время, основное количество экспериментального материала получено с использованием морфологического подхода, регистрирующего цитологические особенности апоптозных изменений. При этом показано, что в случае рака молочной железы, имеют место противоречивые данные о прогностической значимости уровня апоптоза. По данным разных авторов он может иметь как положительное, так и отрицательное прогностическое значение.

Актуальность проблемы

Современные представления патогенеза развития рака молочной железы включают, как необходимый этап нарушение регуляции двух клеточный функций: пролиферации и программированной клеточной гибели - апоптоза. В многочисленных исследованиях показано, что генетические или эпигенетические изменения регуляции этих процессов закономерно наблюдаются в абсолютном большинстве опухолей молочной железы (Chappuis P.O., Kapusta L., 2000, Lipponen P. и др., 1994.). Изменения могут заключаться в мутациях онкогенов (Kumar S,1999, Mendendelsohn J. и др.,2001) или генов супрессоров (Hellquist Н.В, 1997) метилировании их промоторов, изменении уровня экспрессии их продуктов в результате изменения времени жизни мРНК или процессов ее процессинга и др. Использование этих изменений для диагностики рака молочной железы (Kerr J.F.R. и др., 1994,), мониторинга и прогноза опухолевого процесса (Kallioniemi О.Р. и др., 1987), а также попытки построения лечебных алгоритмов направленных на коррекцию этих изменений (Слонимская Е.М.,1999; Фильченков А.А.,1998; Camplejohn R.S.h др., 1995, Ewers S.B. и др., 1993) являются основным направлением исследовательского процесса в настоящее время. Однако, несмотря на достижения в исследовании процессов патогенеза, практические задачи диагностики, прогноза и мониторинга остаются нерешенными, что подтверждается ростом заболеваемости и смертности от рака молочной железы во всем мире и в России в том числе. Поэтому разработка новых методов прогноза является актуальной задачей современной онкологии.

В работах (Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В., 1996; Богатырев В.Н., 1996; Кушлинский Н.Е и др., 2003) показано, что такие показатели уровня экспрессии генов, контролирующих процессы апоптоза являются прогностически значимыми. Однако, апотоз -многостадийный процесс, регулируемый большим количеством молекул и исследование изменения отдельных молекул -регуляторов может не в полной мере отражать весь сложный процесс его реализации. В тоже время, имеется небольшое количество работ, в которых исследуется непосредственный уровень апоптоза в опухолевой ткани (R.Gonsales-Campora R. и др., 2000; Rouleau-Dubois С. и др., 2004) и полученные результаты дают противоречивые выводы. В основном эти работы исследую закономерности апотоза в культуре клеток (линии рака молочной железы MCF-7 и др.) или краткосрочных клеточных культур из биопсийного материала (Mundle S.D.h др., 1995) или основаны на оценке уровня апоптоза микроскопическими методами. Имеются только единичные работы, исследующие диагностическую значимость непосредственно уровня апоптоза в опухолевой ткани (Wu J . и др., 1997; Bedner Elzbieta и др, 1999; R.Gonsales-Campora R. и др.,2000).

Цель работы

Изучить прогностическую и диагностическую значимость показателей апоптоза в ткани опухоли молочной железы.

Задачи исследования

1. Исследовать соотношение процессов апоптоза и пролиферации в тканях патологически измененной молочной железы, включая различные нозологические формы рака методом проточной цитофлуориметрии.

2. Сравнить показатели апоптоза и пролиферации в ткани неизмененной и патологически измененной ткани молочной железы.

3. Изучить связь показателей спонтанного апоптоза в ткани рака молочной железы с распространенностью и размером опухоли.

4. Изучить связь показателей спонтанного апоптоза с уровнем экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона.

5. Изучить прогностическую ценность соотношения показателей пролиферации и апоптоза при различных патологических состояниях молочной железы.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Уровень спонтанного апоптоза достоверно выше в ткани опухоли молочной железы по сравнению с нормальной тканью и тканью фиброаденомы.

2. Уровень спонтанного апоптоза отличается в зависимости от гистологической формы, уровня экспрессии эстроген рецепторов и пролиферативной активности опухоли.

3. Уровень спонтанного апоптоза не зависит от размеров опухоли и состояния региональных лимфоузлов.

4. Относительная оценка процессов пролиферации и апоптоза может быть способом оценки скорости обновления ткани и отражать степень злокачественности.

Научная новизна.

Впервые, на большом клиническом материале исследована прогностическая значимость показателей спонтанного и индуцированного апоптоза в ткани патологически неизмененной молочной железы, фиброаденомы, простой протоковой гиперплазии и ткани рака молочной железы. Показано, что уровень спонтанного апоптоза коррелирует со степенью местного распространения опухоли. Впервые изучена связь уровня спонтанного апоптоза и активности пролиферации опухоли, экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона.

Научно-практическая значимость.

Полученные результаты могут быть использованы для разработки новых критериев прогноза при раке молочной железы на основании соотношения показателей спонтанного апоптоза и показателей пролиферации клеток опухоли. Относительная оценка процессов пролиферации и апоптоза может быть способом оценки скорости обновления ткани и отражать степень злокачественности. Использование комплекса показателей апоптоза, пролиферации и уровня экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона при протоковом раке молочной железы позволяет с высокой вероятностью прогнозировать поражение регионарных лимфатических узлов.

Апробация материалов диссертации.

Материалы диссертации были доложены: на конференции «Национальные дни лабораторной медицины», Москва в 2001г., на VI Ежегодной Российской онкологической конференции, Москва, в 2002г., на конференции с международным участием «Научно-организационные аспекты и современные лечебно-диагностические технологии в маммологии, Москва,2003г., на конференции молодых ученых «Медицинские технологии на рубеже Ш тысячелетия, Москва, 2003. Апробация работы прошла на научно-практической конференции в ГУ РНЦРР МЗ и CP РФ в 2004 г.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 119 страницах и состоит из введения, обзора литературы, глав: Материалы и методы, Результаты собственных исследований, Обсуждение, Выводы, Список литературы. Указатель литературы содержит ссылки на 36 отечественных и 91 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 17 таблицами и 24 рисунками.

Заключение диссертации по теме «Онкология», Кудинова, Елена Александровна

Выводы

1. Уровень спонтанного апоптоза, определяемый как субдиплоидный пик, с двойной окраской по цитокератину в гистологически неизмененной ткани молочной железы, ткани фиброаденомы и простой протоковой гиперплазии не отличается и составляет в среднем 2,24%, 2,32% и 4,23% соответственно. Уровень спонтанного апоптоза в ткани рака молочной железы достоверно выше, чем при других патологических изменениях (7,14%).

2. Протоковая форма рака молочной железы имеет уровень спонтанного апоптоза достоверно выше, чем дольковая 7,9 и 3,9 % соответственно.

3. Уровень апоптоза в ткани рака молочной железы имеет достоверную положительную корреляцию с уровнем экспрессии рецепторов эстрогена в группе протокового рака молочной железы.

4. Уровень апоптоза цитокератин положительных клеток в ткани рака молочной железы достоверно не зависит от размеров опухоли, плоидности опухоли и не меняется на фоне предоперационной химиотерапии. Однако в группе долькового рака предоперационная химиотерапия снижает уровень апоптоза в клетках опухоли.

5. Спонтанный апоптоз имеет положительную достоверную корреляцию с уровнем пролиферативной активности в ткани рака молочной железы (коррелирует с величиной G2M).

6. В группе анеуплоидных опухолей спонтанный апоптоз имеет положительную достоверную корреляцию с индексом плоидности. Однако, уровень спонтанного апоптоза не отличается в группах диплоидных и анеуплоидных опухолей.

7. Отношение уровня пролиферации и апоптоза, отражающее скорость обновления клеточной популяции, выше в ткани рака молочной железы и в ткани фиброаденомы, это значение достоверно ниже при простой протоковой гиперплазии. Кроме того, дольковый рак имеет более высокую скорость обновления, чем протоковая форма рака молочной железы.

8. Показатели апоптоза (уровень «цитокератинового» апоптоза, отношение уровня пролиферации и апоптоза) являются достоверными предикторами регионарного метастазирования. Использование их в многомерных методах классификации (дискриминантный анализ, деревья классификации) позволяет получить эффективные модели оценки местной распространенности опухоли на основании исследования показателей проточной цитометрии основного опухолевого узла.

Практические рекомендации.

1. Полученные результаты могут быть использованы для разработки новых критериев прогноза при раке молочной железы на основании соотношения показателей спонтанного апоптоза и показателей пролиферации клеток опухоли.

2. Относительная оценка процессов пролиферации и апоптоза может быть способом оценки скорости обновления ткани и отражать степень злокачественности.

3. Использование комплекса показателей апоптоза, пролиферации и уровня экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона при протоковом раке молочной железы позволяет с высокой вероятностью прогнозировать поражение регионарных лимфатических узлов на основании проточно цитофлуорометрических характеристик основной опухоли.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Кудинова, Елена Александровна, 2005 год

1. Аббасов С.Г., Кушлинский Н.Е., Липкин В.М., Трапезников Н.Н. Факты и перспективы изучения Fas-FasL-системы в норме и при патологии// Успехи соврем. Биол.-2000.-т.120,№3.-с.303-318.

2. Абелев Г.И. Механизмы дифференцировки и опухолевый рост// Биохимия. -2000.-Т.65.- № 1.-е. 127-138.

3. Абраменко И.В., Фильченков А.А. Прогностическое значение апоптопического и пролиферативного индексов при солидных новообразованиях// 0нкология.-2002.-т.4.-№3.-с. 165-170.

4. Абраменко И.В., Фильченков А.А. Оценка параметров апоптоза в диагностике онкологических заболеваний, их прогнозе и оптимизации схем терапии// Вопросы онкологии.-2003.-т.49.-№1.-с.21-30.

5. Акимов А.А., Иванов С.Д., Хансон К.П. Апоптоз и лучевая терапия злокачественных новообразований// Вопросы онкологии.-2003.-т.49.-№3.-с.261-269.

6. Акоев И.Г., Мотлох Н.Н. Биофизический анализ предпатологических и предлейкозных состояний.-М.: Наука, 1984.-с.78-124.

7. Артамонова Е.В., Овсянников С.В., Тупицын Н.Н., Кадагидзе З.Г., Летягин В.П., Ермилова В.Д., Огнерубов Н.А., Паниченко А.В. Иммунологическая диагностика метастазов рака молочной железы и рака желудка в лимфатические узлы// Врач.-2003.-№1.- с.34-35.

8. Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В .//Российский онкологический журнал.-1996.-№ 1.-С.58-61.

9. Богатырев В. Н.Значение количественных методов исследования (морфометрии, проточной цитометрии, сканирующей микрофотометрии) в клинической онкоцитологии//Автореф. дисс. доктора мед.наук.-Москва.-1991.- с. 78-111.

10. Богатырев В.Н., Портной С.М., Лактионов К.П., Летягин В.П. Проточная цитометрия при раке молочной железы T1-2N0M0: анализ 10-летних наблюдений//Материалы 1 съезда онкологов стран СНГ.-Москва.: 1996.- т.2.-с.482-483.

11. Владимирская Е.Б., Масчан А.А., Румянцев А.Г. Апоптоз и его роль в развитии опухолевого роста//Гематол. и трансфузиол.-1997.- т.42.-№ 5.-С.4-9.

12. Добрынин В.Я., Николаева Т.Г. Метод проточной ДНК-цитометрии в прогнозировании течения опухолевого процессов при опухолях человека. В кн.: Экспериментальная онкология на рубеже веков./Под. ред. М.И. Давыдова, А.Ю. Барышникова/, 2003.-c.483-510.

13. Дубров A.M., Мхитарян B.C., Трошин Л.И. Многомерные статистические методы. М.: Финансы и статистика, 1998.- 352с.

14. Епифанова О.И. Лекции о клеточном цикле.-М.:1997.

15. Епифанова О.И., Полуновский В.А., Терских В.В.Регуляторные механизмы пролиферации клеток//ВИНИТИ, Итоги науки и техники.-М.:1988.-т.Ю.

16. Епифанова О.И., Полуновский В. А., Терских В.В.Регуляция размножения клеток в процессе специализации, старения и неопластической трансформации//ВИНИТИ, Итоги науки и техники.- М.:1988.-т.11.

17. Заридзе Д.Г. Эпидемиология и этиология злокачественных новообразований. В кн. Канцерогенез./ Под. ред. Д.Г.Заридзе/М.,Медицина.-2004.- с.29-85.

18. Зубрихина Г.Н. Проточная цитометрия в диагностике и прогнозе злокачественных новообразований человека. Док. дисс. 1990.

19. Кайряк О.В., Лисовская Н.Ю., Семикоз Н.Г. Частота спонтанного апоптоза периферических лимфоцитов опухоленосителей как критерий прогноза эффективности специфического лечения// Цитол.генетика.-1999,- т.ЗЗ .-с.23-6.

20. Копнин Б.П. Основные свойства неопластической клетки и базовые механизмы их возникновения. В кн. Канцерогенез./ Под. ред. Д.Г.Заридзе/М.,Медицина.-2004.- с.86-102.

21. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза//Биохимия.-2000.-т.65.-№ 1.-е.5-33.

22. Коршунов А.Г., Сычева Р.В., Голанов А.В. Иммуногистохимическое изучение апоптоза в глиобластомах больших полушарий головного мозга// Арх. пат.1998.-т.60.-№ 3.-С.23-27.

23. Котов Ю. Б. Новые математические подходы к задачам медицинской диагностики. М: Едиториал УРСС, 2004.- 328с.

24. Кушлинский Н.Е., Зборовская И.Б. Молекулярно-биологические исследования при раке молочной железы.: В кн. Первичные опухоли молочной железы . Практическое руководство по лечению./Под. ред. ЛетягинаВ.П./, 2004.-С.23-55.

25. Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю. Гибель клетки (апоптоз).-М.: Медицина.-2001.- с.81-110.

26. Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю. Сравнительная морфология апоптоза и некроза клеток опухолей // Тезисы 1 Белорусского съезда патологоанатомов и судебных медиков.-Минск.-1990-1991.-Т.2-с.299-300.

27. Нейштадт Э.Л., Воробьева О.А. Патология молочной железы.-Санкт-Петербург.: Фолиант.-2003.-с.90-94.

28. Новиков B.C. (ред). Программированная клеточная гибель.-Санкт-Петербург. :Наука.-1996.-c.256.

29. Ориновский М.Б., Ожерельев А.С., Кушлинский Н.Е. Рак молочной железы. Тканевые маркеры в оценке метастазирования и прогноза (монография)//Издательская группа РОНЦ им. Блохина РАМН.-ББК 55.6.081.-М.-2003.- с.250.

30. Портной С.М. Рак молочной железы (факторы прогноза и лечение)//Автореф.дисс. доктора мед. наук.-Москва.-1997.

31. Робинсон М.В., Труфакин В.А. Апоптоз клеток иммунной системы. Успехи соврем биол.-1991.-т.111.-№ 2.-С.246-259.

32. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека//под ред. С.В.Петрова, Н.Т.Райхлина.:Казань.-2000.-с.250-265.

33. Слонимская Е.М. Прогнозирование исхода заболевания у больных раком молочной железы//Автореф. дисс. доктора медицинских наук.-Томск.-1999.-с.48.

34. Фильченков А.А. Современные представления о роли апоптоза в опухолевом росте и его значение при противоопухолевой терапии//Эксперим. онкол. -1998.-т.20.-с.259-270.

35. Фильченков А.А., Стойка Р.С. Апоптоз и рак.:Киев.- Морион.-1999.-С.-184.

36. Флетчер Р., Флетчер С., Вагнер Э. Клиническая эпидемиология. Основы доказательной медицины/Пер. с англ.- М.:Медиа Сфера, 1998. -352с.

37. Хансон К.П. Апоптозховременное состояние проблемы//Изв. РАН. Серия биол.-1998.-№2.-с. 134-141.

38. Ярилин А.А. Апоптоз и его место в иммунных процессах//Иммунология.-1996.-№ 1.-е. 10-23.

39. Ярилин А.А. Апоптоз. Природа феномена и его роль в целостном организме//Патол. физиол. экспер. тер. -1998.-т.2.-с.38-48.

40. Abdel-Moneim I., Melamed M.R., Darzynkiewicz Z., Gorczyca W. Proliferation and apoptosis in solid tumors. Analysis by laser scanning cytometry//Anal. Quant. Cytol.Histol.-2000.-v.22.-p.393-7.

41. Allred D.C., Harvey J.M., Berardo M., Clark G.M. Prognostic and predective factors in breast cancer by immunohistochemical analysis//Mod. Pathol.-1998.-vol. 11 .-p. 155-168.

42. Anderson T.J. Pathological studies of apoptosis in the normal breast// Endocr Relat Cancer. -1999.- V6.- № 1,- p. 9-12.

43. Barret K.L., Willingham J.M., Garvin A.J., Willingham M.C. Advences in cytovhemical methods for detection of apoptosis//J.Hist.Cytoch.-2001.-v.49.-p.821-832.

44. Bedner Elzbieta et al. Analysis of apoptosis by Laser Scanning Cytometry//Cytometry.-l 999 -vol.3 5.-p. 181-195.

45. Ben-Hur H., Mordechay E., Halperin R., Gurevich P., Zandbank J., Herper M., Zusman I. Apoptosis-related proteins (Fas, Fas ligand, bcl-2 and p53) in different types of human breast tumors// Oncol Rep. 2002.-V. 9.- № 5.- P. 977-80.

46. Bertho L., Santiago M.A., Coutinho S.G. Flow cytometry in the study of cell death// Mem Inst Oswaldo Cruz. 2000.- V. 95.- № 3.- p.429-33.

47. Bertram J.S. The molecular biology of cancer//Molecular aspect of medicine.-2001.- vol.21 .-p. 167-223.

48. Carter C.L., Allen C., Henson D.E. Relation of tumor size, lymph node status and survival in 24,740 breast cancer cases//Cancer.-1989.-vol.63.-p.181-187.

49. Chappuis P. O., Kapusta L., Begin L.R., et al. Germinal BRSA1/2 mutations and p27bpJ protein levels independently outcome after breast cancer// J. Clin. 0ncol.-2000.-v.l8.-p.4045-4052.

50. Chen T.L., Luo I., Mikhail N., Raskova J., Raska К Jr. Comparison of flow and image cytometry for DNA content analysis of fresh andformalin-fixed, paraffin-embedded tissue in breast carcinoma// Cytometry.-1995.-vol.22.- №3 .-p. 181-9.

51. Clark G.M., Mathieu M-C., Owens M.A., et al. Prognostic significance of S-phase fraction in good-risk, node-negative breast cancer patients//J Clin Oncol.-1992.-vol.lO.-p.428-432.

52. Clayton F., Hopkins C.L. Pathologic correlates of prognosis in lymph node-positive breast carcinomas//Cance.-1993.-vol.71.- p. 1780-1790.

53. Cook D.L., Weaver D.L. Comparison of DNA content, S-phase fraction, and survival between medullary and ductal carcinoma of the breast//Am J Clin Pathol.-1995.-vol. 101№ 1 .-p. 17-22.

54. Crissman A. and T. Hirons G. Staining of DNA in live and fixed cells/ZMethods in Cell Biology. Academic Press, San Diego.- 1994.-p. 195-209.

55. Cuello-Carrion F.D., Ciocca D.R. Improved detection of apoptotic cells using a modified in situ TUNEL technique//J.Hist.Cytoch.-1999.-v.47.-p.837-839.

56. Cummings M.C., Winterford C.M., Walker N.I. Apoptosis//Am J Surg Path.- 1997.-vol.21.-p.88-101.

57. Darzynkiewicz Z. Apoptosis in antitumour strategies: modulation of cell cycle or differentiation//! Cell Biochem.-1995.-vol.58.-p.l51-59.

58. Darzynkiewicz Z., Bedner E. Analysis of apoptotic cells by flow and laser scanning cytometry/ZMethods Enzymol.- 2000.-.v322.-p. 18-39.

59. DNA Cytometry Consensus Conference. Consensus review of the clinical utility of DNA cytometry in carcinoma of the breast/ZBreast Cancer Res Treat.-1993.-vol.28.- №1.-p.55-9.

60. Dressier L.G. Controls, standards, and histogram interpretation in DNA flow cytometry//Biology.-1990.-vol.33 .-p. 157.

61. Ehemann V., Sykora J., Vera-Delgado J., Lange A., Otto H.F. Flow cytometric detection of spontaneous apoptosis in human breast cancer using the TUNEL-technique// Cancer Lett.-2003.-v.8.-p. 125-31.

62. Esteban J.M., Felder В., Ahn С., et al. Prognostic relevance of carcinoembryonic antigen and estrogen receptor status in breast cancer patients//Cancer.-l 994.-vol.74.-p. 1575-1583.

63. Farber E. Programmed cell death: necrosis versus apoptosis//Mol. Pathol-1994.- vol.7-p.605-609.

64. Ghali V.S., Liau S., Teplitz C., Prudente R. A comparative study of DNA ploidy in 115 fresh-frozen breast carcinomas by imege analysis versus flow cytometry//Cancer.-1992.-vol.70.-p.2668-2672.

65. Glogovac J.K., Porter P.L., Banker D.E., Rabinovitch P.S. Cytokeratin labeling of breast cancer cells extracted from paraffin-embedded tissue for bivariate flow cytometric analysis//Cytometry.-1996.-vol.24.- №3.-p.260-7.

66. Gonzalez-Campora R., Galera Ruiz M.R., Vazkez Ramirez F., Rios M.J.J., Fernandes S.J.M., Ramos M.M.M., Gomez P.A. Apoptosis in breast carcinoma// Pathol Res. Pract.-2000.-v.196.-p. 167-74.

67. Gorczyca W., Bedner E., Burfeind P., Darzynkiewicz Z., Melmed M.R., Analysis of apoptosis in solid tumors by laser-scanning cytometry//Mod. Pathol.- 1998,-v. 11 .-p. 1052-8.

68. Gorczyca W., Tuzyak Т., Kram A., Melamed M.R., Darzynkiewich Z. Detection of apoptosis-associated DNA strand breaks in fine-needle aspiration biopsies by in situ end labeling of fragmented DNA//Cytometry.- 1994,-v 15 .-N2.-p. 169-175.

69. Gross A., McDonnell J.M., Korsmeyer S.J. BCL-2 family members and mitochondria in apoptosis//Gen. Dev.-1999.-vol.13-p. 1899-1911.

70. Hasebe Т., Sasaki S., Imoto S., Ochiai A. Prognostic significance of the intra-vessel tumor characteristics of invasive ductal carcinoma of the breast: a prospective study//Virchows Arch.-2004.-v.444.-p.20-7.

71. Hedley D.W. DNA analysis from paraffin-embedded blocks//Methods Cell Biol.-1994.-vol.41.-p.231-40.

72. Heiden Т., Castanos-Velez E., Andersson L.C., Biderfeld P. Combined analysis of DNA ploidy, proliferation, and apoptosis in paraffin-embedded material by flow cytometry//Lab. Invest.-2000.-v.80.-p.1207-13.

73. Henson D.E., Ries L., Freedman L.S.,Carriaga M. Relationship among outcome, stage of disease, and histologic grade for 22,616 cases of breast cancer//Cancer.-l 991 .-vol. 68.-p.2142-2149.

74. Kallioniemi O.P., Blanco G., Alavaikko M., Hietanen Т., Mattila J., Lauslahti K., Koivula T. Tumour DNA ploidy as an independent prognostic factor in breast cancer//Br J Cancer.-1987.- №5.-p.637-42.

75. Kerr J.F.R., Winterford C.M., Harmon B.V. Apoptosis: Its significance in cancer and cancer therapy//Cancer.-1994.-vol.73.-p.2013-26.

76. Kimmig R., Spelsberg H., Kapsner Т., Untch M., Hepp H. Flow cytometric DNA analysis of breast cancer by two colour method using cytokeratin labeling for identification of tumour cells//Anal Cell Pathol.-1994.-vol.7.- №3.-p.205-15.

77. Kroemer G., Reed J.C. Mitochondrial control of cell death//Nat. Med — 2000.-vol.6-p.513-519.

78. Maciorowski Z., Klijanienko J., Padoy E., Mosseri V., Fourquet A., Chevillard S., El-Naggar A.K., Vielh P. Comparative image and flow cytometric TUNEL analysis of fine needle samples of breast carcinoma// Cytometry.-2001 .-v.46.-p. 150-6.

79. Manon van Engeland et al. Annexin V-Affinity Assay: A Review on an Apoptosis Detection System Dased on Phosphatidylserine Exposure//Cytometry.-1998.-v.31- p. 1-9.

80. McCormick S.R., Peters A.A., Schrauth J.B. Flow cytometric DNA analysis with cytokeratin gating of formalin-fixed deparaffinized breast cancer nuclei//Am J Clin Pathol.-1998.-vol. 110.-№ 2.-p.227-37.

81. McCoy J.P. Medicaid and Medicare Reimbursement for Flow Cytometry//Am J Clin Pathol.- 2001.-vol.15.-№ 5.-p.3-12.

82. Medina D. Biological and molecular characteristics of the premalignant mouse mammary gland// Biochim. Biophys.Acta.-2002.-p.l-9.

83. Mendendelsohn J. et al. The molecular Basis of Cancer-2001.-2nd edition.- p. 19-40.

84. Michels J.J., Duigou F., Marnay J. Flow cytometry in primary breast carcinomas. Prognostic impact of proliferative activity//Breast cabcer Res Treat.-2000.- vol.62.-№ 2.-p.l 17-26.

85. Nagata S., Goldstein P. The Fas death factor// Science.-1995.-v.267 — p.1449-1456.

86. O'Donovan N., Crown J., Stunell H., Hill A.D., McDermott E., O'Higgins N., Duffy M.J. Caspase 3 in breast cancer// Clin Cancer Res. 2003.- V. 9.- № 2.- P. 738-42

87. Ormerod M. G., Payne A.W.R. and Watson J.V. Improved program for the analysis of DNA histograms//Cytometry.-1987.-v.8.-p.637-641.

88. Ormerod M.G.(ed). Flow cytometry; A practical approach//IRL Press, Ozford.-1990.-p.69-87.

89. Ormerod. M.G., Analysis of DNA -general methods, in Flow Cytometry: a Practical Approach, M. G. Ormerod, ed. 2nd edition//IRL at Oxford University Press, Oxford.-1994.-p.l 19-135.

90. Ornberg R.L. Proliferation and apoptosis measurements by color image analysis based on diferential absorption//J.Hist.Cytoch.-2001.-v.49.-p.1059-1060.

91. Overton W.R. Modefied histogram subtraction technique for analysis of flow cytometry data//Cytometry.- 1988.-vol.9.-p.319-326.

92. Peng L, Jiang H, Bradely C. Detection of В lymphoma cells undergoing apoptosis by Annexin-V assay// Chin Med Sci J. 2002.- V. 17.- № 1.-P. 17-21.

93. Pillai M.R., Kesari A.L., Chellam V.G., Madhavan J., Nair P., Nair M.K. Spontaneous programmed cell death in infiltrating duct carcinoma: association with p53, bcl-2, hormone receptors and tumor proliferation// Pathol. Res. Pract.-1998.-v.l94.-p.549-57.

94. R.Gonsales-Campora R.,Galera Ruiz M.R., Vazquez Ramirez F. et al. Apoptosis in breast carcinoma // Path. Res. Pract.-2000.-v.196.-p.167-174.

95. Raff M.C. Social controls on cell survival and cell death// Nature.-1992.-v.356.-p.397-400.

96. Redkar A.A., Balsara B.R., Bhisey A.N., Sampat M.B., Mittra I. DNA analysis of breast cancer by flow cytometry and correletion with other prognostic parameters//Indian J. Med. Res.-1992.-v.96.-p.223-9.

97. Redkar A.A., Krishan A. Flow cytometric analysis of estrogen, progesterone receptor expression and DNA content in formalin-fixed, paraffin-embedded human breast tumors//Cytometry.-1999.-v.38.-№2.-p.61-9.

98. Rouleau-Dubois С., Cuny M., Ferreires G.,Simony-Lafontaine G.,Rouanet P., Greiner G.,Jeanteur P.,Baldet P., Escoat C. Spontaneous apoptosis in the intra-ductal component's stroma of breast invasive carcinoma//Anticancer Res.-2004.-24.-№l.- p.53-7.

99. Rzymowska J., Skierski J., Kurylcio L., Dyrda Z. DNA index as prognostic factor in breast cancer//Neoplasma.-1995.-v.42.-№5.-p.239-42.

100. Sabe I., Andritsch I., Mangoud A., Awad A.S., Khalifa A., Krishan A. Flow cytometric analysis of estrogen receptor expression in isolated nuclei and cells from mammary cancer tissues//Cytometry.-1999.-v.36.-№2.-p. 131-9.

101. Samoszuk M.K., Sallash G., Chen K., Carlton E., Oldaker T. Association between flow cytometric S-phase fraction and apoptotic rate in breast cancer// Cytometry.-1996.- v.26.-№ 4.-p. 281-5.

102. Schultz D.S., Zarbo R.J. Comparison of eight modifications of Hedley's method for flow cytometric DNA ploidy analysis of paraffin-embedded tissue//Am J Clin Pathol.-1992.-v.98.- №3.-p.291-5.

103. Schwandner O., Schiedeck Т.Н., Bruch H.P., et al . Apoptosis in rectal cancer: prognositic in comparison with clinical histopathologic, and immunohistochemical variables// Dis Colon Rectum.- 2000.-v. 43.-p. 1227-36.

104. Sun S., Li L., Sun D. In situ observation of apoptosis and proliferation in breast cancer and its precancerous lesions//Zhonghua Zhong Liu Za Zhi.-1999.-v.21.-№6.-p.447-9.

105. Talieri M, Diamandis EP, Katsaros N, Gourgiotis D, Scorilas A. Expression of BCL2L12, a new member of apoptosis-related genes, in breast tumors// Thromb Haemost. 2003.- V. 89.- № 6.- P. 1081-8.

106. Thompson C.B. Apoptosis in patogenesis and treatment of disease// Science.-1995.-v.267.-p. 1456-1462.

107. Thorud E., Fossa S.D., Vaage S., Kaalhus O., Knudsen O.S., Bormer O., Shoaib M.C. Primary breast cancer. Flow cytometric DNA pattern in relation to clinical and histopathologic characteristics//Cancer.-1986.-v.57.- №4.-p.808-11.

108. Uzarevic В., Petroveski M., Jakic-Razumovic J., Hutinec Z., Sabioncello A., Gamulin S. Prognostic significance of cell cycle parameters in infiltrative ductal breast carcinoma//J Clin Lab Anal.-1998.-v. 12.- №3.-p.131-6.

109. Vakkala M., Lahteenmaki K., Raunio H. et al. Apoptosis during carcinoma progression//Clin. Cancer Res.-1999.-v.5-p.319-324.

110. Van Diest P.J., Risse E. K. J., Schipper N. W., Baak J. P. A. Comparisson of light microscopic grading and morfometric features in cytological breast cancer specimens//Path. Res. Pract.-1989.-v.l85.-p.612-616.

111. Volpi A., De Paola F.,Nanni O. Prognostic sugnificance of biologic markers in node-negative breast cancer patients: a prospecctive study// Breast Cancer Res.-2000.-v.63.-p.l81-192.

112. Wijsman J.H. et al. A new method to detect apoptosis in paraffine sections: in situ endlabelling of fragmentet DNA//J.

113. Histochim.Cytochim. 1994. - v.41.- № 1-p.7-12.

114. Willingham M.C. Cytochemical methods for the detection of apoptosis// The Journal of Histochemistry and Cytochemistry.-1999.- V. 47.- № 9.-P. 1101-1109.

115. Wingren S., Stal O. Flow cytometric gating on cytokeratin-containing DNA aneuploid breast cancer cells improves the prediction of recurrence//Eur J Cancer.-1995.-v.31 A.- №11.-p. 1893-5.

116. Wingren S., Stal O., Nordenskjold B. Flow cytometric analysis of S-phase fraction in breast carcinomas using gating on cells containing cytokeratin//South East Sweden Breast Cancer Group. Br J Cancer.-1994.-v.69.- №3.-p.546-9.

117. Wu J., Shao Z., Jiang M. In situ DNA labeling apoptosis in breast cancer as related to prognosis//Chung Hua Chung Liu Tsa Chih.-1997.v.l9.-p. -100-102.

118. Yuan J., Hennesy C., Corbett IP, et al. Node negative breast cancer: The prognostic value of DNA ploidy for long-term survival//Br J Surg.-1991.-v.78.-p.844-848.

119. Zhang S.Q., Qiang S.Y., Yang W.B., Jiang J.T., Ji Z.Z. Expression of survivin in different stages of carcinogenesis and progression of breast cancer// Ai Zheng.-2004.-v.23.-№6.-p.697-700.