Структурная организация и особенности функционирования генов рибосомных РНК у диплоидного эгилопса Aegilops umbellulata в связи с явлениями ядрышкового доминирования тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.12, кандидат биологических наук Куликов, Александр Маратович

• Куликов, Александр Маратович
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Куликов, Александр Маратович

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. рДНК растений: локализация, повторяемость, структурная организация, дифференциальная экспрессия (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Рибосомные РНК и кодирующие их гены

1.2. Локализация генов рРНК. Ядрышковые организаторы хромосом

1.3. Копийность генов рРНК у растений

1.4. Рестриктазные карты рДНК растений

1.5. Пре-рРНК и зрелые 18S, 5,8S и 26S рРНК растений

1.6. Межгенный спейсер рДНК растений

1.7. Ядрышковое доминирование

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Краткая характеристика объектов исследований

2.2. Выделение и очистка ДНК растений

2.3. Выделение и очистка плазмидной ДНК

2.4. Выделение и очистка одноцепочечной фагмидной ДНК

2.5. Ультрацентрифугирование ДНК в градиенте плотности хлористого цезия

2.6. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами

2.7. Аналитический гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих условиях

2.8. Препаративный гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих условиях

2.9. Элюция ДНК из агарозных и полиакриламидных гелей

2.10. Перенос ДНК из агарозных гелей на мембранные фильтры (блоттинг)

2.11. Радиоактивное мечение препаратов ДНК

2.12. Блот-гибридизация ДНК

2.13. Клонирование фрагмента повторяющейся единицы рДНК Ае.итЪеИиШа, содержащего МГС

2.14. Подготовка компетентных клеток

2.15. Трансформация компетентных клеток Е.соИ плазмидной ДНК

2.16. Построение рестриктазной карты клонированного фрагмента ДНК

2.17. Субклонирование рестриктазных фрагментов межгенного спейсера рДНК Ае.итЪеИиШа

2.18. Секвенирование ДНК методом химической деградации

2.19. Секвенирование ДНК ферментативным методом

2.20. Электрофоретическое фракционирование ДНК в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (секвенирующий гель-электрофорез)

2.21. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей

2.22. Получение экстрактов ядерных белков

2.23. Замедление движения в геле фрагментов межгенного спейсера рДНК Ае.итЪеИиШа, связанных с ядерными белками

2.24. Бактериальные штаммы, плазмидные и фагмидные вектора, рекомбинантные плазмиды

2.25. Векторы и использованные конструкции

2.26. Реактивы и материалы

2.27. Составы использованных стандартных растворов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Геномная организация рДНК диплоидного эгилопса Ае. итЪеПиШа

3.2. Клонирование фрагмента рДНК, содержащего межгенный

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурная организация и особенности функционирования генов рибосомных РНК у диплоидного эгилопса Aegilops umbellulata в связи с явлениями ядрышкового доминирования»

Актуальность темы. Пристальное внимание к рибосомным РНК (рРНК) несоответственно, к кодирующим их генам (рДНК) не снижается уже на протяжении многих лет, что объясняется той важной ролью, которую они выполняют в клетке. Известно, что физиологический статус растений в ходе онтогенеза в значительной мере определяется эффективностью синтеза белка. Поскольку рРНК формируют "скелет" рибосом, являющихся главной составной частью белок-синтезирующего аппарата, то для успешной сборки должного количества этих органелл, в клетке, наряду со специфическими рибосомными белками, необходимо присутствие определенного пула молекул рРНК. По этой причине рДНК является весьма интенсивно функционирующей генетической системой, и выяснение механизмов регуляции ее активности представляет значительный интерес.

Особую актуальность эта проблема приобретает в связи с явлением ядрышкового доминирования, присущего амфидиплоидным и аллополиплоидным видам растений, состоящих из двух или большего числа разнокачественных геномов, и заключающегося в функционировании только определенных локусов рДНК и подавлении ими остальных. Эффект доминирования ядрышка одной хромосомы над ядрышками других, получивший название "дифференциальная амфипластия" (ЫауаБЫп, 1928), известен давно, однако, его физиологическая и молекулярно-генетическая природа до сих пор до конца не ясна. Спустя несколько десятилетий изучения этого явления оказалось, что в его основе лежит дифференциальная экспрессия генов рРНК, которая, в свою очередь, обуславливается особенностями организации межгенных спейсеров рДНК, содержащих промоторную область и прочие регуляторные элементы. К тому времени данное явление стали называть феноменом ядрышкового доминирования, а молекулярные причины, его вызывающие, стали предметом повышенного внимания. В настоящее время существует несколько гипотез, в той или иной мере объясняющих неодинаковую транскрипционную активность различных локусов рДНК в гибридных организмах (Pikaard, Chen, 1998), которые, однако, требуют получения дополнительной информации и экспериментальных доказательств.

Представители трибы пшеницевых, многие из которых являются полиплоидными формами, служат довольно удобными объектами для изучения дифференциальной экспрессии генов рРНК и, следовательно, причин возникновения ядрышкового доминирования. Для мягкой гексаплоидной пшеницы Triticum aestivum — основной хлебной культуры в нашей стране — характерно доминирование локусов рДНК, расположенных на 1В и 6В хромосомах, тогда как ядрышковый организатор на хромосоме 5D значительно мельче (Flavell, О'Dell, 1979), а на 1А хромосоме его часто вообще не удается детектировать (Leitch et al., 1992). Выяснение структурно-функциональной организации межгенных спейсеров рДНК, принадлежащих геному D (Lassner et al., 1987), геному В (Barker et al., 1988), a также являющейся предполагаемым донором генома А диплоидной пшенице T.urartu (Вахитов и др., 1989), и их сравнительный анализ позволили прийти к предварительному заключению о том, что возможными причинами доминирования локуса рДНК генома В над остальными служат определенные особенности его структурной организации. Для подтверждения подобного предположения требовалось исследование какого-либо еще локуса рДНК, проявляющего доминирующий характер, и обнаружение того факта, что при включении в геном мягкой пшеницы хромосомы 1U от диплоидного вида эгилопса Aegilops umbellulata ядрышкообразующие регионы пшеницы (включая локусы рДНК на хромосомах 1В и 6В, также являющихся достаточно сильными) полностью супрессируются (Martini et al., 1982), вызывает к этой проблеме дополнительный интерес. Таким образом, становится ясно, что для лучшего понимания механизмов как супрессии, так и доминирования тех или иных, расположенных на разных хромосомах локусов рДНК гексаплоидной пшеницы, необходимо также знание структурной организации и особенностей функционирования рДНК диплоидного вида эгилопса Ae.umbellulata, обладающего очень мощными ядрышковыми организаторами, чем и был обусловлен выбор этого объекта для данного исследования.

Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в изучении структурной организации межгенного спейсера рДНК диплоидного эгилопса Ae.umbellulata и роли его отдельных элементов в дифференциальной экспрессии генов рРНК в связи с явлением ядрышкового доминирования.

В задачи исследования входило: 1) изучение геномной организации генов рРНК; 2) клонирование фрагмента повторяющейся единицы рДНК, включающего в свой состав межгенный спейсер; 3) определение структурной организации межгенного спейсера рДНК; 4) секвенирование части межгенного спейсера рДНК, включая промоторную область, субповторы и межгенный транскрибируемый спейсер; 5) сравнительный анализ структурной организации межгенных спейсеров рДНК диплоидного эгилопса Ae.umbellulata с другими представителями трибы пшеницевых; 6) идентификация участков межгенных спейсеров рДНК диплоидного эгилопса Ae.umbellulata и диплоидной пшеницы T.urartu, взаимодействующих с факторами транскрипции .

Научная новизна и практическая ценность. Клонирован фрагмент рДНК диплоидного эгилопса Ae.umbellulata, включающий межгенный спейсер, для большей части которого определена нуклеотидная последовательность. Обнаружено, что в состав межгенного спейсера, кроме промоторной области, входит несколько типов повторяющихся элементов, среди которых превалируют А-, В- и Е-субповторы. Е-тип субповторов выявлен впервые и является уникальным для Ae.umbellula.ta, в отличие от остальных видов трибы пшеницевых, имеющих только единичные копии этой последовательности. Выявлен высокий уровень гомологии Е-субповторов с областью корового промотора генов рРНК. Показано взаимодействие Е-субповторов с экстрактами ядерных белков, содержащими факторы транскрипции. Выдвинуто предположение об участии А-, В- и Е-субповторов в возникновении эффекта ядрышкового доминирования у полиплоидных форм трибы пшеницевых. Результаты исследований на примере диплоидного эгилопса Ае.итЬеПиШа углубляют представление об организации и особенностях функционирования генов рРНК у высших растений.

Практическая значимость работы заключается в выявлении элементов межгенного спейсера, взаимодействующих с присутствующими в экстрактах ядерных белков факторами транскрипции и ответственных, таким образом, за дифференциальную экспрессию генов рРНК у пшениц и их диких сородичей, что может способствовать прогнозированию особенностей интеграции геномов и определению функционального состояния генов рРНК при формировании новых искусственных видов полиплоидных пшениц с ценными хозяйственно-полезными признаками.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на III Всесоюзном совещании по хемосистематике и эволюционной биохимии высших растений (Москва, 1986), V съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров (Москва, 1987), V конференции молодых ученых социалистических стран по биоорганической химии (Пущино, 1988), III Всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки (Петрозаводск, 1988), 8-ом двустороннем симпозиуме СССР—ФРГ "Организация генома и регуляция активности генов" (Иркутск, 1989), конференции "Актуальные проблемы физико-химической биологии и биотехнологии" (Алма-Ата, 1989), VII Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1990), 10-ом двустороннем симпозиуме СССР— Франция "Организация и экспрессия геномов прокариотических и эукариотических организмов" (Киев, 1991), 4-ом Международном конгрессе по молекулярной биологии растений (Амстердам, 1994), международной конференции, посвященной памяти академика А.Н.Белозерского (Москва, 1995), Всероссийском симпозиуме "Изучение генома и генетическая трансформация растений" (Иркутск, 1999), IV съезде Общества физиологов растений России (Москва, 1999). Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 168 работ отечественных и зарубежных авторов. Работа изложена на 145 страницах и содержит 31 рисунок.

Заключение диссертации по теме «Физиология и биохимия растений», Куликов, Александр Маратович

выводы

1. В рекомбинантной плазмиде рАи58 клонирован фрагмент рДНК диплоидного эгилопса Ае.итЪеИиШа, включающий межгенный спейсер, в котором сосредоточены регуляторные элементы, отвечающие за дифференциальный характер экспрессии генов рРНК.

2. Определена нуклеотидная последовательность части межгенного спейсера, включающая промоторную область, отдельные субповторы и зону пре-рРНК, общей протяженностью около 2500 пн.

3. Показано, что в состав межгенного спейсера входит несколько типов повторяющихся элементов, среди которых превалируют А-, В- и Е-субповторы. Е-тип субповторов выявлен впервые и является уникальным для Ае.итЪеИиШа, в отличие от остальных видов трибы пшеницевых, имеющих только единичные копии этой последовательности.

4. Установлено, что Е-субповторы представляют собой инвертированные последовательности, способные формировать жесткие "шпилечные" структуры, которых у Ае.итЪеИиШа оказывается 6 тандемно расположенных копий против одиночных "шпилек" у остальных видов трибы пшеницевых.

5. Обнаружен высокий уровень гомологии Е-субповторов с областью корового промотора генов рРНК и показано их взаимодействие с ядерными белками, содержащими факторы транскрипции, свидетельствующее об участии данных элементов межгенного спейсера рДНК в регуляции процесса транскрипции.

6. Выдвинуто предположение об участии А-, В- и Е-субповторов в проявлении дифференциальной экспрессии генов рРНК, приводящей у полиплоидных форм трибы пшеницевых к эффекту ядрышкового доминирования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выяснение причин, лежащих в основе давно известного феномена ядрышкового доминирования, находится в центре внимания широкого круга исследователей, поскольку ядрышковые организаторы хромосом, будучи легко выявляемыми объектами (достигаемого путем их простого окрашивания азотнокислым серебром или специальными красителями), служили и служат удобным маркерным признаком физиологического состояния организмов. Так, немалое число работ посвящено определению количественных характеристик ядрышек у растений в связи с проблемой адаптации видов к изменяющимся условиям окружающей среды. Долгое время подобные исследования проводились лишь на "фенотипическом" уровне, однако для более уверенной интерпретации получаемых данных возникла необходимость в познании организации ядрышкового "аппарата" клетки. Начиная с середины 60-х годов, после того как стало известно, что в ядрышках локализованы гены рРНК, исследования этих структур перешли на качественно новый уровень. Появление и развитие новых мощных методических приемов дало в руки ученых такие инструменты, которые позволили заняться функциональной "анатомией" генов рРНК и, таким образом, вплотную приблизиться к решению проблемы ядрышкового доминирования.

Представители трибы пшеницевых, помимо того, что среди них имеются важнейшие сельскохозяйственные культуры (новые знания о которых всегда будут актуальными) служат очень удобными объектами для изучения дифференциальной экспрессии генов рРНК, поскольку у них ярко выражено явление ядрышкового доминирования. Сведения о том, что у мягкой гексаплоидной пшеницы ядрышковые организаторы хромосом 1В и 6В доминируют над таковыми хромосом 50 и 1А были получены в конце 50-х годов, однако, только к концу 80-х стало относительно ясно почему это происходит. В то же время, для воссоздания более полной картины проявления у полиплоидных форм пшениц феномена ядрышкового доминирования все же недоставало сведений о тонкой структурной организации генов рРНК и особенностей их функционирования у других видов растений и в том числе у диплоидного эгилопса Ае.итЬе11и1Ма, который, как оказалось, содержит в себе наиболее мощные ядрышковые организаторы хромосом, способные в синтетических гибридах с мягкой пшеницей супрессировать образование ядрышек даже на хромосомах 1В и 6В.

Восполнить этот пробел и была призвана данная работа, в ходе выполнения которой получены приоритетные данные, касающиеся тонкой структурной организации межгенного спейсера рДНК Ае.итЪеИиШа, где сосредоточены промоторная область, субповторы и прочие регуляторные элементы. Так, было обнаружено, что в состав межгенного спейсера входит несколько типов повторяющихся элементов, среди которых превалируют А-, В- и Е-субповторы. При этом Е-тип субповторов, представляющих собой инвертированные последовательности, высоко гомологичные промоторной области, выявлен впервые и является уникальным для Ае.итЪеИиШа, тогда как у остальных видов трибы пшеницевых имеются только единичные копии этой последовательности. Проведенный нами сравнительный анализ межгенных спейсеров рДНК представителей трибы пшеницевых показывает, что виды со слабыми ядрышковыми организаторами (рожь и диплоидная пшеница Т.игагШ) характеризуются отсутствием В-субповторов и относительно небольшим числом субповторов типа А, которых у них всего от 6 до 8. Последний вид, впрочем, содержит в промоторной области довольно необычный мотив, в котором нет канонического ТАТА-бокса, что также может влиять на транскрипционный уровень таких повторов рДНК. Локус рДНК хромосомы 5Б мягкой пшеницы проявляет среднюю степень доминирующей активности и уже несет В-субповторы, а также несколько большее число (от 8 до 10) А-субповторов. Локус ЫогВ2 мягкой пшеницы способен супрессировать образование ядрышек всеми этими хромосомами и отличается от наиболее "сильного" среди них ядрышкового организатора ГЧогОЗ только увеличенным числом А-субповторов, которых у него уже 12. Что касается организации межгенного спейсера рДНК Ае.итЬеИиЫа, то в результате проведенной нами работы стали известны его характерные черты, которые, вероятно, и обеспечивают "превосходство" генов рРНК этого вида. Так, наряду с тем же количеством и "качеством" В-субповторов, что и в локусах рДНК ТЧогБЗ и ЫогВ2, межгенный спейсер Ае.итЬеПиШа содержит уже 18 А-субповторов и 6 субповторов типа Е. Последние высокогомологичны коровому промотору и, видимо отчасти поэтому взаимодействуют с факторами транскрипции. Другой интересной чертой Е-субповторов является то, что каждый из них способен формировать жесткие "шпилечные" структуры, которых у Ае.итЬеПиШа оказывается 6 против одиночных у остальных видов. Таким образом, все эти элементы межгенного спейсера (стандартный промотор с каноническим ТАТА-боксом, дистальные В-субповторы, сильно увеличенное число А-субповторов, дополнительный тип инвертированных Е-субповторов) и дают локусу рДНК Ае.итЪеИиШа, расположенному на хромосоме Ш, преимущества в конкурентной "борьбе" за факторы транскрипции, приводящие в итоге к ядрышковому доминированию.

По завершению данной работы можно сказать, что сделан еще один, важный шаг для понимания причин возникновения ядрышкового доминирования у высших растений. Познание тонких механизмов регуляции транскрипции генома полиплоидных пшениц и, в том числе, такой его важной части, как рДНК, несомненно может позволить в будущем, используя эти сведения, рационально подбирать доноры

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Куликов, Александр Маратович, 1999 год

1. Вахитов В.А., Куликов A.M., Чемерис A.B. Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов рДНК пшениц и эгилопсов // Генетика. -1988. Т.24. - С.1993-2005.

2. Вахитов В.А., Чемерис A.B., Ахметзянов A.A. Нуклеотидная последовательность межгенного и внешнего транскрибируемого спейсеров рДНК диплоидной пшеницы Triticum urartu Thum, ex Gandil. // Молекуляр. биология. 1989. - Т.23. - С. 336-342.

3. Данилюк Н.К., Ястребов С.И., Артамонова Т.П., Попов С.Г. Упрощенный вариант метода Максама-Гильберта для определения первичной структуры олигонуклеотидов и фрагментов ДНК // Биоорг. химия. 1986.- Т.12. С.1185-1188.

4. Дуброва А.Н. Ядрышковые организаторы хромосом как адаптивныйэлемент вида//Ж. общ. биол. 1989. -Т.1. - С.213-217.

5. Колоша В.О., Фодор И.И. Высокая гомология нуклеотидныхпоследовательностей цистрона 26S рРНК Citrus limon и Saccharomycescerevisiae II Докл. АН СССР. 1986. - Т.290. - С. 1006-1011.

6. Навашин С. О диморфизме ядер в соматических клетках у Galtoniacandicans II Изв. Имп. Акад. Наук. Сер. VI. 1912. - №4. - С.373-385.

7. Навашин С. Гетеро- и идиохромозомы растительного ядра, как причинаядерного диморфизма некоторых видов растений, и значение ядерногодиморфизма в процессе видообразования // Изв. Имп. Акад. Наук. Сер. VI.- 1915. №17. - С.1821-1834.

8. Савельев С.В. Ашапкин В.В., Вильчинскас Р., Ванюшин Б.Ф. Рибосомная ДНК гексаплоидной пшеницы: молекулярное клонирование, рестриктазное картирование, гетерогенность // Молекуляр. биол. 1990. -Т.24. - С.51-57.

9. Хвырлева Ц.Д., Чернышев А.И., Бочканов С.С., Яковлева Е.Ю., Ананьев Е.В. Межсортовой полиморфизм и организация генов 18S-26S рРНК у ячменя. // Генетика. 1987. - Т.23. - С.717-724.

10. Чемерис А.В., Вахитов В.А. Молекулярное клонирование генов рибосомных РНК диплоидной пшеницы Triticum urartu Thum ex Gandil. // Молекуляр. биология. 1987. - T.21. - С. 1092-1098.

11. Чемерис А.В., Вахитов В.А. Первичная структура гена 5,8S рРНК и внутренних транскрибируемых спейсеров рДНК у диплоидной пшеницы Triticum urartu Thum. ex Gandil. // Молекуляр. биология. 1989. - Т.23. -С.320-326.

12. Agarwal M.L., Aldrich J., Agarwal A., Cullis C.A. The flax ribosomal RNA-encoding genes are arranged in tandem at a single locus interspersed by 'non-rDNA' sequences // Gene. 1992. - V.120. - P. 151-156.

13. Appels R., Dvorak J. Relative rates of divergence of spacer and gene sequence within the rDNA region of species in the Triticeae: implications for themaintenance of homogeneity of a repeated gene family // Theor. Appl. Genet. -1982b. -V.63. -P.361-365.

14. Appels R., Gerlach W.L., Dennis E.S., Swift., Peacock W.J. Molecular and chromosomal organization of DNA sequences coding for the ribosomal RNAs in cereals // Chromosoma. 1980. - V. 78. - P. 293-311.

15. Appels R., Moran L.B., Gustafson J.P. The structure of DNA from the rye Secale cereale) nor rl locus and its behaviour in wheat backgrounds // Can. J. Genet. Cytol. 1986. - V.28. - P.673-685.

16. Borisjuk N.V., Davidjuk Y.M., Kostishin S.S., Miroshnichenco G.P., Velasco R., Hemleben V. Structural analysis of rDNA in the genus Nicotiana II Plant Mol. Biol. 1997. - V.35. - P.655-660.

17. Borisjuk N., Hemleben V. Nucleotide sequence of the potato rDNA intergenic spacer//Plant Mol. Biol. 1993. - V.21. - P.381-384.

18. Buescher P.J., Phillips R.L., Brambl R. Ribosomal RNA contents of maize genotypes with different ribosomal RNA gene number // Biochem. Genet. -1984. V.22. -P.923-930.

19. Capesius I. Nucleotide sequence of a 25S rRNA gene from mustard (Sinapis alba) II Plant Mol. Biol. 1991. - V. 16.-P. 1093-1094.

20. Carroza M.L., Giorgi L., Cremonini R. Nuclear DNA content and number of ribosomal RNA genes in cultivars and selected lines of Durum wheat // Z. Pflanzenzuchtg. 1980. - V.84. - P.284-293.

21. Cassidy, D.M., Blackler, A.W. Repression of nucleolar organizer activity in an interspecific hybrid of the genus Xenopus II Dev. Biol. 1974. - V.41. - P.84-96.

22. Castilho A., Heslop-Harrison J.S. Physical mapping of 5S and 18S-25S rDNA and repetitive DNA sequences in Aegilops umbellulata // Genome. 1995. -V.38. - P.91-96.

23. Chatterton N.J., Hsiao C., Asay K.H., Wang R.R-C., Jensen K.B. Nucleotide sequence of internal transcribed spacer region of rDNA in wheat, Triricum speltoides L. (Tausch.) Gren. ex Richter (Gramineae) // Plant Mol. Biol. -1992a. -V.20. -P.157-158.

24. Chatterton N.J., Hsiao C., Asay K.H., Wang R.R-C., Jensen K.B. Nucleotide sequence of the internal transcribed spacer region of the rDNA in wheat, Triticum aestivum L. (Gramineae) II Plant Mol. Biol. 1992b. - V.20. - P. 159160.

25. Chatterton N.J., Hsiao C., Asay K.H., Jensen K.B., Wang R.R-C. Nucleotide sequence of internal transcribed spacer region of rDNA in the primitive oatspecies, Avena longiglumis Durieu (Gramineae) // Plant Mol. Biol. 1992c. -V.20. - P.163-164.

26. Chipchase M.I.H., Birnstiel M. On the nature of nucleolar RNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1963. - V.50. - P.l 101-1107.

27. Cohen S.N., Chang A.C.Y., Hsu L. Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria: genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1972. - V.69. - P.2110-2114.

28. Crosby A.R. Nucleolar activity of lagging chromosome in wheat. // Amer. J. Bot.- 1957.-V. 44.-P. 813-822.

29. Cullis C.A. Environmental induction of heritable changes in flax: defined environments inducing changes in rDNA and peroxidase isozyme band pattern // Heredity. 1981. - V.47. - P.87-94.

30. Danna K.J. Determination of fragment order through partial digest and multiple enzyme digest // In: Methods in Enzymology. Acad. Press. New York, 1980. -V.65. - P.449-467.

31. Doelling J.H., Gaudino R., Pikaard C.S. Functional analysis of Arabidopsis thaliana rRNA gene and spacer promoters by transient expression // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - V.90. - P.7528-7532.

32. Doelling, J.H., Pikaard, C.S. Transient expression in Arabidopsis thaliana protoplasts derived from rapidly established cell suspension culture // Plant Cell Rep. 1993. - V.12. - P.241-244.

33. Eckenrode V.K., Arnold J., Meagher R.B. Comparison of the nucleotide sequences of Glycine max and other small-subunit rRNAs // J. Mol. Evol. -1985. V.21. - P.259-269.

34. Ellis T.H.N., Delseny M., Lee D., Burcham K.W.G. Methylated and undermethylated rDNA repeats are interspersed at random in two higher plant species // Plant Mol. Biol. 1989. - V. 14. - P. 73-80.

35. Flavell R.B. Repeated sequences and genome change // In: Genetic Flux in Plants. Springer; Wien, New York. 1985. - P. 139-156.

36. Flavell R.B. The structure and control of expression of ribosomal RNA genes // Oxford Surv. Plant Mol. Cell Biol. 1986. - V.3. - P.252-274.

37. Flavell R.B., O'Dell M. Ribosomal RNA genes on homoeologous chromosomes of group 5 and 6 in hexaploid wheat // Heredity. 1976. - V.37. -P.377-385.

38. Flavell R.B., O'Dell M. The genetic control of nucleolus formation in wheat // Chromosoma. 1979. - V. 71. - P. 135-152.

39. Flavell R.B., O'Dell M., Thompson W.F. Regulation of cytosine methylation in ribosomal DNA and nucleolus organizer expression in wheat // J. Mol. Biol. -1988. V.204. - P.523-534.

40. Flavell R.B., Smith D.B. The role of homoeologous group 1 chromosomes in the control of rRNA genes in wheat // Biochem. Genet. 1974. - V.12. - P.271-279.

41. Fribe B., Kim N-S, Kuspira J., Gill B.S. Genetic and cytogenetic analyses of the A genome of Triticum monococcum. VI. Production and identification of primery trisomies using the C-banding technique \\ Genome. 1990. - V.33. -P.542-555.

42. Friedrich H., Hemleben V., Meagher R.B., Key J.L. Purification and restriction mapping of soybean 18S and 25S ribosomal RNA genes // Planta. 1979. -V.146. - P.467-473.

43. Garoff, H., Ansorge, W. Improvements of DNA sequencing gels // Anal. Biochem. 1981. - V. 115. - P.450-457.

44. Gerbi S.A. Evolution of ribosomal DNA In: Molecular evolutionary genetics (ed. R.J. Mclntyre). Plenum Press, New York, 1985. P.419-517. Gerbi S.A. The evolution of eukaryotic ribosomal DNA // BioSystems. - 1986. - V.19.-P.247-258.

45. Grierson D. RNA processing and other post-transcriptional modification // In: Nucleic Acids and proteins in plants.- Springer; Berlin. 1982. - V.2. - P. 192223.

46. Hanahan D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids // J. Mol. Biol. 1983. - V.166. - P.557-580.

47. Hemleben V., Grierson D. Evidence that in higher plants the 25S and 18S rRNA genes are not interspersed with genes for 5S rRNA // Chromosoma. -1978. V.65. - P.353-358.

48. Honjo T., Reeder R.H. Preferential transcription of Xenopus laevis ribosomal RNA in interspecies hybrids between X.laevis and X.mulleri II J. Mol. Biol. -1973. V.80. -P.217-228.

49. Houchins K., O'Dell M., Flavell R.B., Gustafson J.P. Cytosine methylation and nucleolar dominance in cereals hybrids // Mol. Gen. Genet. 1997. - V.255. -P.294-301.

50. Hsiao C., Chatterton N.J., Asay K.H., Jensen K.B. Phylogenetic relatioships of 10 grass species: an assessment of phylogenetic utility of the internal transcribed spacer region in nuclear ribosomal DNA in monocots // Genome. -1994. -V.37. -P.l 12-120.

51. Hsiao C., Chatterton N.J., Asay K.H., Jensen K.B. Molecular phylogeny of the Pooideae {Poaceae) based on nuclear rDNA (ITS) sequences // Theor. Appl. Genet. 1995a. - V.90. - P.389-398.

52. Hsiao, C., Chatterton, N.J., Asay, K.H., Jensen, K.B. Phylogenetic relationships of the monogenomic species of the wheat tribe, Triticeae (Poaceae), inferred from nuclear rDNA (internal transcribed spacer) sequences // Genome. 1995b. -V.38.-P.211-223.

53. Humphreys G.O., Weston A., Brown M.G.M., Saunders J.R. Plasmid transformation of Escherichia coli II In: Transformation. Proc. 4th Eur. Meet. Bacter. Transform. Transfect. George Allen & Unwin; London, 1979. - P. 287-312.

54. Hutchinson J., Miller T.E.The nucleolar organisers of tetraploid and hexaploid wheats revealed by in situ hibridisation \\ Theor. Appl. Genet. -1982. V.61. -P.285-288.

55. Jackson, S.D., Flavell, R.B. Protein-binding to reiterated motifs within the wheat rRNA gene promoter and upstream repeats // Plant Mol. Biol. 1992. -V.20. -P.911-919.

56. Jiang J., Gill B.S. New 18S.26S ribosomal RNA gene loci: chromosomal landmarks for the evolution of polyploid wheats // Chromosoma. 1994. -V.103. -P.179-185.

57. Jorgensen R.A., Cuellar R.E., Thompson W.F. Modes and tempos in the evolution of nuclear-encoded ribosomal RNA genes in legumes // Carnegie Institute Year book' 81. 1982. - P.98-101.

58. Karvonen P., Karjalainen M., Savolainen O. Ribosomal RNA genes in Scots pine (Pinus sylvestris L.): chromosomal organization and structure // Genetika. 1993. - V.88. -P.59-68.

59. Katayama S., Hirano H.-Y., Tsukaya H., Naito S., Komeda Y. Analysis of intergenic spacer region in the nuclear rDNA of Pharbitis nil II Genome. -1992. V.35.-P. 92-97.

60. Kopp E., Mayr B., Schleger W. Species-specific non-expression of ribosomal RNA genes in a mammalian hybrid, the mule // Chromosoma. 1986. - V.94. -P.346-352.

61. Martienssen R.A., Richards E.J. DNA methylation in eukaryotes // Curr. Opin. Genet. Dev. 1995. - V.5. - P.234-242.

62. Martini G., Flavell R.B. The control of nucleolus volume in wheat: a genetic study at three developmental stages // Heredity. 1985. - V.54. - P.l 11-120.

63. Martini G., O'Dell M., Flavell R.B. Suppression of wheat nucleolus organizers by the nucleolus organizer chromosomes from Aegilops umbellulata II Chromosoma. 1982. - Y.84. - P.687-700.

64. May C.E. Selection for ribosomal-RNA gene numbers in commercial wheats // Proceedings of the 9th International Wheat Genetics Symposium. Saskatoon, Canada, 1998. - V.l. - P.95-98.

65. May C.E., Appels R. Variability and genetics of spacer DNA sequences between the ribosomal-RNA genes of hexaploid wheat (Triticum aestivum) II Theor. Appl. Genet. 1987. - V. 74. - P. 617-624.

66. Maxam A.M., Gilbert W. A new method for sequencing DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. - V.74. - P.560-564.

67. McMullen M.D., Hunter B., Phillips R.L., Rubenstein I. The stricture of the maize ribosomal DNA spacer region // Nucl. Acids Res. 1986. - V.14. -P.4953-4968.

68. Messing J., Carlson J., Hagen G., Rubinstein I., Oleson A. Cloning and sequencing of the ribosomal RNA genes in maize: The 17S region // DNA. -1984. V.3.-P.31-40.

69. Miller O.J., Miller D.A., Dev V.G., Tantravahi R., Croce C.M. Expression of human and supression of mouse nucleolus organizer activity in mouse-humansomatic cell hybrids // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976. - V.73. P.4531-4535.

70. Miller O.L., Jr. The nucleolus, chromosomes, and visualization of genetic activity // J. Cell Biol. 1981. - V.91. - P.15S-27S.

71. Miller Т.Е., Gerlach W.L., Flavell R.B. Nucleolus organizer variation in wheat and rye revealed by in situ hybridisation // Heredity. 1980. - V.45. - P. 377382.

72. Miesfeld R., Sollner-Webb В., Croce C., Arnheim N. The absence of a human-specific ribosomal DNA transcription factor leads to nucleolar dominance in mouse greater than human hybrid cells // Mol. Cell Biol. 1984. - V.4. -P.1306-1312.

73. Neves N., Silva M., Heslop-Harrison J.S., Viegas W. Nucleolar dominance in triticales: control by unlinked genes // Chromosome Res. 1997. - V.5. - P. 125131.

74. Olmedilla A., Delcasso D., Delseny M. Methylation pattern of nuclear ribosomal RNA genes from rice (Oryza sativa) II Plant Sci. Lett. 1984. - V.37. - P.123-127.

75. Oono K., Sugiura M. Heterogeneity of the ribosomal RNA gene clusters in rice // Chromosoma. 1980. - V76. - P.85-89.

76. Owen-Hughes T., Workman J.L. Experimental analysis of chromatin function in transcription control // Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 1994. - V.4. -P.403-441.

77. Paldi E., Devay M. Relationship between the cold-induced rRNA synthesis and the rRNA cistron number in wheat cultivars with varying degrees of frost hardiness // Plant Sci. Lett. 1983. - V. 30. - P. 61-67.

78. Phillips R.L., Wang S.S., Weber D.F., Kleese R.A. The nucleolar organizer in maize // Genetics. 1973. V.74. P.212.

79. Pikaard, C.S., Chen, Z.J. Nucleolar dominance. In Transcription of ribosomal RNA genes by eukaiyotic RNA polymerase I (ed. Paule M.R.). R.G. Landes, Austin, TX. 1998. - P.277-294.

80. Reddy P.S., Padayatty J.D. rDNA repeat unit in rice variety IR-20 // Ind. J. Biochem. Biophys. 1987. - V.24. - P.293-295.

81. Reeder R.H. Enhancers and ribosomal gene spacers // Cell. 1984. - V.38. -P.349-351.

82. Ritossa F.M., Spiegelman S. Localization of DNA complementary to ribosomal RNA in the nucleolus organizer region of Drosophila melanogaster II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1965. - V.53. - P.737-745.

83. Saghai-Maroof M.A., Soliman K.M., Jorgensen R.A., Allard R.W. Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. - V.81. - P.8014-8018.

84. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A laboratory manual, 1989. Second Edn. Cold Spring Harbor. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1682 P.

85. Schnapp A., Rosenbauer H., Grummt I. Trans-acting factors involved in species-specificity and control of mouse ribosomal gene transcription // Mol. Cell. Biochem. 1991. - V.104. - P.137-147.

86. Sealey P.G., Southern E.M. Gel electrophoresis of DNA // In: Gel Electrophoresis of Nucleic Acids. A practical approach. IRL Press. Oxford, 1982.-P.39-76.

87. Takaiwa F., Oono K., Iida Y., Sugiura M. The complete nucleotide sequence ofa rice 25S rRNA gene // Gene. 1985a. - V.37. - P.255-259.

88. Takaiwa F., Oono K., Sugiura M. The complete nucleotide sequence of a rice17S rRNA gene //Nucl. Acids Res. 1984. - V.12. - P.5441-5448.

89. Takaiwa F., Oono K., Sugiura M. Nucleotide sequence of the 17S 25S spacerregion from rice rDNA // Plant Mol. Biol. 1985b. - V.4. - P.355-362.

90. Thompson W.F., Flavell R.B. DNase I sensitivity of ribosomal RNA genes inchromatin and nucleolar dominance in wheat // J. Mol. Biol. 1988. - V.204. 1. P.535-548.

91. Toloczyki C., Feix G. Occurrence of 9 homologous repeat unit in the external spacer region of a nuclear maize rRNA gene unit // Nucl. Acids Res. 1986. -V. 14. - P.4969-4985.

92. Tucci G.F., De Dominies R.I., Ficca A.G., Celi M., Gregori C. Nucleoli, rRNA genes and ITS region in Posidonia oceanica (L.) Delile // Hereditas. 1998. -V.129. - P.59-65.

93. Unfried I., Stocker U., Gruendler P. Nucleotide sequence of the 18S rRNA gene from Arabidopsis thaliana Co 10 // Nucl. Acids Res. 1989. - V.17. -P.7513.

94. Van Loon L.C., Trewaras A., Chapman K.S.R. Phosphorylation of chromatin-associated proteins in Lemna and Hordeum // Plant Physiol. 1975.- V.55.-P.288-292.

95. Vincentz M., Flavell R.B. Mapping of ribosomal RNA transcripts in wheat // Plant Cell. 1989. - V.l. - P.579-589.

96. Walker T.A., Pace N.R. 5.8S ribosomal RNA // Cell. 1983. - V. 33. - P. 320322.

97. Wallace H., Birnstiel M.L. Ribosomal cistrons and nucleolar organizer // Biochim. Biophys. Acta. 1966. - V. 114. - P.296-310.

98. Yakura K., Tanifuji S. Molecular cloning and restriction analysis of EcoRI-fragments of Vicia faba rDNA // Plant Cell Physiol. 1983. - V.24. - P. 13271330.

99. Zentgraf U., Ganal M., Hemleben V. Length heterogeneity of the rRNA precursor in cucumber (Cucumis sativus) // Plant Mol. Biol. 1990. - V.15. -P.465-474.

100. Zhang Q.F., Saghai-Maroof M.A., Allard R.W. Effects on adaptedness of variations in ribosomal DNA copy number in populations of wild barley (Hordeum vulgare ssp. spontaneum) II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1990. -V.87. - P.8741-8745.

101. Zimmer E.A., Jupe E.R. Walbot V. Ribosomal gene structure, variation and inheritance in maize and its ancestors // Genetics. 1988. - V.120. - P.1125-1136.