Структурно-функциональная организация межгенных спейсеров рДНК у представителей трибы пшеницевых семейства злаковых тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, доктор биологических наук Чемерис, Алексей Викторович

• Чемерис, Алексей Викторович
• доктор биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации доктор биологических наук Чемерис, Алексей Викторович

ВВЕДЕНИЕ

ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. рДНК растений: локализация, повторяемость, структурная 15 организация, дифференциальная экспрессия

1.1. Рибосомные РНК и кодирующие их гены

1.2. Локализация генов рРНК. Ядрышковые организаторы хромосом

1.3. Копийность генов рРНК у растений

1.4. Рестриктазные карты рДНК растений

1.5. Пре-рРНК и зрелые 18S, 5.8S и 26S рРНК растений

1.6. Межгенный спейсер рДНК растений

1.7. Метилирование цитозиновых остатков и транскрипция генов 46 рРНК растений

1.8. Ядрышковое доминирование

1.9. Стратегии секвенирования ДНК и векторные системы

Глава 2. Происхождение и эволюция полиплоидных пшениц 83 2.1. Ботанический состав подтрибы пшеницевых Triticinae 83 2.2 Филогенетические взаимоотношения некоторых видов подтрибы 87 пшеницевых Triticinae

ЧАСТЬ 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 3. Объекты исследований

3.1. Краткая характеристика объектов исследований

Глава 4. Методы исследований

4.1. Выделение и очистка ДНК растений

4.2. Выделение ДНК растений для проведения ПЦР

4.3. Выделение и очистка плазмидной ДНК

4.4. Выделение и очистка одноцепочечной фагмидной ДНК

4.5. Выделение и очистка рРНК растений

4.6. Ультрацентрифугирование ДНК в градиенте плотности 107 хлористого цезия

4.7. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами

4.8. Аналитический гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих 111 условиях

4.9. Препаративный гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих 113 условиях

4.10. Препаративный гель-электрофорез высокомолекулярных рРНК 113 в полиакриламидном геле в неденатурирующих условиях

4.11. Элюция ДНК из агарозных и полиакриламидных гелей

4.12. Элюция 18S и 26S рРНК из полиакриламидного геля

4.13. Высушивание агарозных и полиакриламидных гелей

4.14. Перенос ДНК из агарозных гелей на мембранные фильтры

4.15. Радиоактивное мечение препаратов ДНК

4.16. Радиоактивное мечение препаратов рРНК

4.17. Блот-гибридизация ДНК

4.18. Подготовка компетентных клеток E.coli

4.19. Трансформация компетентных клеток E.coli плазмидной ДНК

4.20. Клонирование фрагментов рДНК T. urartu и Ае. umbellulata

4.21. Построение рестриктазных карт клонированных фрагментов рДНК T. urartu и Ае. umbellulata

4.22. Разработка стратегии секвенирования ДНК и субклонирование 129 рестриктазных фрагментов межгенного спейсерарДНК T.urartu и

Ае.итЪеПиШа

4.23. Сайт-направленный мутагенез

4.24. Секвенирование ДНК методом химической деградации

4.25. Секвенирование ДНК ферментативным методом

4.26. Электрофоретическое фракционирование ДНК в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (секвенирующий гель-электрофорез)

4.27. Радиоавтография

4.28. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей

4.29. Амплификация участков межгенного спейсера рДНК 137 диплоидных пшениц и эгилопсов методом полимеразной цепной реакции

4.30. Клонирование амплифицированных участков межгенного 139 спейсера рДНК диплоидных пшениц и эгилопсов

4.31. Определение сайта инициации транскрипции генов рРНК 141 методом удлинения праймера.

4.32. Приготовление протопластов из проростков диплоидной 142 пшеницы T.boeoticum

4.33. Трансформация протопластов T.boeoticum методом химически 143 индуцированного эндоцитоза

4.34. Получение экстрактов ядерных белков

4.35. Замедление движения в геле фрагментов межгенного спейсера 145 рДНК Ае. umbellulata и T. urartu, связанных с ядерными белками

4.36. Окрашивание ядрышек азотнокислым серебром

4.37. Олигонуклеотидные праймеры, использованные при 146 проведении ПЦР, сайт-направленном мутагенезе, для конструирования полилинкерного участка и при анализе сдвига электрофоретической подвижности

Глава 5. Реактивы и материалы

5.1. Бактериальные штаммы, плазмидные и фагмидные вектора

5.2. Реактивы и материалы

5.3. Составы использованных стандартных растворов 155 'ЧАСТЬ 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 6. Структурная организация и особенности функционирования рДНК диплоидной пшеницы ТгШсит игаНи и диплоидного эгилопса Aegilops итЬеНиШа

6.1. Геномная организация рДНК диплоидной пшеницы ТгШсит 157 игагШ и диплоидного эгилопса Aegilops итЬеПиШа и клонирование повторов рДНК этих видов

6.2. Картирование фрагментов рДНК Т. игаПи иЛе. итЬеПиШа в 161 составе рекомбинантных плазмид рТиЗ и рАи58 соответственно

6.3. Секвенирование области МГС рДНК диплоидной пшеницы 165 ТгШсит игагШ и диплоидного эгилопса Aegilops итЬеПиШа

6.4. Взаимодействие элементов межгенных спейсеров рДНК 195 диплоидного эгилопса Ае.итЪеИиШа и диплоидной пшеницы

Т. игаПи с факторами транскрипции

6.5. Особенности метилирования цитозиновых остатков в рДНК 202 диплоидной пшеницы ТгШсит игагШ и диплоидного эгилопса

Ае%Иор8 итЬеПиШа

Особенности структурной организации МГС рДНК у отдельных 218 видов трибы пшеницевых и возможные причины дифференциальной экспрессии генов рРНК и ядрышкового доминирования (Заключение)

Глава 7. Промоторные области МГС рДНК отдельных представителей трибы пшеницевых

7.1. Секвенирование промоторных областей и повторяющихся 223 элементов МГС рДНК диплоидных пшениц ТгШсит игагШ, Т.Ъоеойсит, Т.топососсит и диплоидного эгилопса Aegilops

8ре1Шйе$

7.2. Определение сайтов инициации транскрипции генов рРНК у 233 диплоидных пшениц и изучение эффективности транскрипции с промотора генов рРНК в системе транзиентной экспрессии в трансформированных протопластах

Особенности организации промоторных областей МГС рДНК, прилегающих к сайту инициации транскрипции диплоидных видов пшеницы и эгилопсов (Заключение)

Глава 8. Тетра/окта стратегия секвенирования протяженных фрагментов ДНК

8.1. Конструирование фагмидного вектора pSequoiaT

8.2. Тетра/окта стратегия секвенирования 251 Перспективы использования тетра/окта стратегии секвенирования и 261 самостоятельного применения вектора pSequoiaT12 (Заключение)

Глава 9. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей 265 отдельных фрагментов рДНК и других повторяющихся последовательностей в связи с вопросами филогенетических взаимоотношений некоторых видов пшенично-эгилопсного альянса

9.1. Определение нуклеотидных последовательностей ВТС-1, ВТС-2, 265 включая ген 5.8S рРНК диплоидной пшеницы Triticum urartu, и сравнительный анализ этих участков рДНК с аналогичными областями других видов трибы пшеницевых

9.2. Сравнение нуклеотидных последовательностей отдельных 272 элементов МГС рДНК у представителей трибы пшеницевых в связи с их филогенетическими взаимоотношениями

9.3. Повторяющиеся последовательности генома и 287 филогенетические взаимоотношения отдельных видов трибы пшеницевых

Филогенетические взаимоотношения некоторых диплоидных и полиплоидных видов пшенично-эгилопсного альянса (Заключение) ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурно-функциональная организация межгенных спейсеров рДНК у представителей трибы пшеницевых семейства злаковых»

Актуальность темы. Исследованию рибосомных РНК (рРНК) и кодирующих их генов (рДНК) на протяжении многих лет уделяется пристальное внимание, что объясняется той важной ролью, которую они выполняют в клетке. Известно, что гены 18S, 5.8S и 26S рРНК организованы как единый блок, составляющий повторяющуюся единицу рДНК, которые, в свою очередь, в виде тандемно расположенных по типу "голова к хвосту" копий формируют кластер генов рРНК. Внутри повторяющейся единицы рДНК кодирующие области разделены между собой транскрибируемыми спейсерными последовательностями, а межгенный спейсер (часть которого также транскрибируется) отделяет один повтор от другого и содержит в своем составе все элементы, необходимые для инициации, терминации и регуляции транскрипции генов рРНК. Именно межгенный спейсер является наиболее вариабельной частью рДНК, отличаясь даже у близкородственных видов по числу и организации субповторов, а также ряда других элементов за счет инсерций, делеций и замен нуклеотидов в них, что, вероятно, обуславливает различную транскрипционную активность повторов рДНК. Таким образом, изучение структурной организации межгенного спейсера рДНК и его элементов необходимо для лучшего понимания механизмов функционирования этой важной генетической системы.

Особую актуальность эта проблема приобретает в связи с наблюдающейся у аллополиплоидных видов растений дифференциальной экспрессией генов рРНК, заключающейся в функционировании только определенных, локусов рДНК и подавлении ими остальных. Доминирование ядрышка одной хромосомы над ядрышками других, получившее название "дифференциальная амфипластия" [Navashin, 1928], известно достаточно давно, однако, молекулярно-генетические причины этого явления до сих пор остаются до конца не выясненными. Спустя несколько десятилетий его изучения пришли к выводу, что в основе подобного эффекта лежит дифференциальная экспрессия генов рРНК, которая, в свою очередь, обуславливается особенностями промоторных областей и прочих регуляторных элементов, локализованных в межгенных спенсерах рДНК. К тому времени данное явление стали называть феноменом ядрышкового доминирования, а молекулярные причины, его вызывающие, стали предметом повышенного внимания. В настоящее время существует несколько гипотез, в какой-то степени объясняющих неодинаковую транскрипционную активность различных локусов рДНК в гибридных организмах [Pikaard, Chen, 1998; Pikaard, 1999], требующих, однако, получения дополнительной информации и экспериментальных доказательств.

Полиплоидные формы трибы пшеницевых вместе с сохранившимися диплоидными видами, выступившими в качестве доноров геномов, служат удобными объектами для изучения дифференциальной экспрессии генов рРНК. Как известно, для мягкой гексаплоидной пшеницы Triticum aestivum характерно доминирование локусов рДНК, расположенных на 1В и 6В хромосомах, тогда как ядрышковый организатор на хромосоме 5D заметно уступает им по своей активности [Flavell, O'Dell, 1979], а на хромосомах генома А его часто вообще не удается детектировать [Leitch et al., 1992]. Определение нуклеотидных последовательностей межгенных спейсеров рДНК, принадлежащих геному В [Barker et al., 1988], геному D [Lassner et al., 1987] и их сравнительный анализ позволили прийти к предварительному заключению о том, что одной из возможных причин доминирования локуса рДНК генома В над остальными служит увеличенное число А-субповторов. Однако для лучшего понимания особенностей функционирования генов рРНК и выяснения роли тех или иных элементов межгенного спейсера требовалось исследование еще каких-то других локусов рДНК. Причем, наиболее ценную информацию могло дать изучение локусов рДНК резко контрастных по своим свойствам. Так, выявление особенностей организации межгенных спейсеров рДНК диплоидной пшеницы T.urartu, обладающей крайне слабыми ядрышкообразующими регионами хромосом и рассматриваемой к тому же в качестве предполагаемого донора как раз супрессируемого генома А, а также диплоидного эгилопса Ae.umbellulata, характеризующегося наиболее сильными ядрышковыми организаторами среди прочих видов трибы пшеницевых может дать необходимую информацию, позволяющую понять причины дифференциальной экспрессии генов рРНК и пролить, таким образом, свет на феномен ядрышкового доминирования, имеющий место у мягкой гексаплоидной пшеницы. Отдельный интерес представляло изучение служащего в качестве одного из вероятных механизмов регуляции работы генов рРНК метилирования цитозиновых остатков в рДНК этих резко контрастных видов, поскольку в ряде работ показана взаимосвязь уровня транскрипционной активности рДНК аллополиплоидных и гибридных форм пшеницы и степени метилирования цитозиновых остатков в них [Савельев и др., 19906; Sardana et al., 1993; Houchins et al., 1997].

Ввиду того, что тетра- и гексаплоидные формы пшениц состоят соответственно из двух и трех разнокачественных геномов, то по целому ряду причин существует необходимость выявления диплоидных видов -доноров пшеничных геномов. Можно предполагать, что сравнение нуклеотидных последовательностей спейсерных областей рДНК, ввиду сочетания как высокой эволюционной консервативности этой генной системы, так и заметной вариабельности отдельных элементов межгенного спейсера, даст возможность прояснить происхождение исходных геномов и реконструировать эволюцию полиплоидных пшениц.

Цель и задачи исследования. Основная цель работы заключалась в выявлении молекулярных механизмов дифференциальной экспрессии генов рРНК у представителей трибы пшеницевых. Наряду с этим также представлялось важным провести исследование промоторных областей у отдельных представителей трибы пшеницевых и выяснение филогенетических взаимоотношений исследуемых видов.

В задачи исследования входило: 1) клонирование фрагментов повторяющихся единиц рДНК разных видов пшеницевых, включающих в свой состав межгенный спейсер или его отдельные элементы; 2) разработка стратегии секвенирования и конструирование специального фагмидного вектора; 3) определение нуклеотидных последовательностей межгенных спейсеров (или их элементов) рДНК разных видов трибы пшеницевых; 4) сравнительный анализ структурной организации межгенных спейсеров рДНК диплоидной пшеницы Т.игаПи и диплоидного эгилопса Ае. итЬе11иШа\ 5) идентификация участков межгенных спейсеров рДНК Ае.итЪеИиШа и Т.игаПи, взаимодействующих с факторами транскрипции; 6) сравнительный анализ степени метилирования цитозиновых остатков в рДНК Т. игаНи и Ае.итЬеИиШа; 7) исследование промоторных областей диплоидных видов пшениц и эгилопсов; 8) экспериментальное определение сайта инициации транскрипции генов рРНК у диплоидных пшениц Т. Ъоеойсит, Т.топососсит и Т.игаПи1, 9) идентификация в системе транзиентной экспрессии в трансформированных протопластах участка межгенного спейсера, выполняющего функцию промотора генов рРНК у диплоидной пшеницы Т.Ъоеойсит\ 10) выяснение филогенетических взаимоотношений отдельных ди- и полиплоидных видов пшенично-эгилопсного альянса.

Научная новизна. Клонированы фрагменты рДНК различных диплоидных видов пшеницы и эгилопсов, включающие межгенный спейсер или его отдельные элементы, и определены их нуклеотидные последовательности, составившие в общей сложности около 10 тпн. Разработана новая тетра/окта стратегия секвенирования, основанная на специально сконструированном фагмидном векторе с уникальными свойствами. Показано, что в состав межгенных спейсеров, кроме промоторной области, входит несколько типов повторяющихся элементов, среди которых превалируют А-, В- и Е-субповторы, причем последние выявлены впервые и являются уникальными для Ае.итЪеИиШа, в отличие от Т.игаПи и остальных видов подтрибы пшеницевых, имеющих только единичные копии этой последовательности. Выявлен высокий уровень гомологии Е-субповторов с областью корового промотора генов рРНК и показано их взаимодействие с экстрактами ядерных белков, содержащими факторы транскрипции. Показано, что у диплоидного эгилопса Ае.итЪеИиШа в более чем 95% повторов рДНК цитозиновые остатки в сайтах узнавания рестрикционной эндонуклеазы Нра11 метилированы, тогда как у диплоидной пшеницы Т.игаПи на долю таких повторов приходится менее 65% всей рДНК, причем, если у Ае.итЪеИиШа преимущественное метилирование происходит по СО-типу, то у Т.игагЫ СО-тип метилирования лишь незначительно превышает СКЮ-тип. Сопоставление степени метилирования цитозина в рДНК и интенсивности окрашивания ядрышек серебром у этих видов свидетельствует, что транскрипционная активность отдельной повторяющейся единицы рДНК у Ае.итЪеИиШа значительно выше, чем таковая у Т.игагЫ. У диплоидных видов пшениц Т.ЪоеоИсит, Т.топососсит и Т.игаПи в высококонсервативной промоторной области межгенного спейсера, прилегающей к сайту инициации транскрипции генов рРНК, обнаружены необычные мотивы нуклеотидных последовательностей, в которых отсутствуют канонические ТАТА-боксы. Эти мотивы у Т.игаПи и Т.Ъоеойсит представлены нуклеотидной последовательностью ТАСТАТООООО, а у Т.топососсит - последовательностью

ТАТТАТООООО, в то время как для большинства остальных злаковых, включая секвенированные нами Ае.итЪеИиШа и Ае.5реЬогс1е8, характерен мотив ТАТАСТАвСОА. У диплоидных пшениц был определен стартовый нуклеотид транскрипции генов рРНК, соответствующий остатку 1уанина, расположенному за последовательностью ТА(С/Т)ТАТ, что является первым экспериментальным подтверждением того, что у растений инициация транскрипции генов рРНК может происходить с гуанинового нуклеотида, на месте которого у большинства других растений находится остаток аденина. Впервые в системе транзиентной экспрессии в трансформированных протопластах исследована функциональная активность промотора рДНК Т. Ъоеойсит и его укороченных вариантов, показавших корректную инициацию транскрипции с ожидаемого нуклеотида. Впервые продемонстрирована возможность детекции присутствия в образцах ДНК с помощью ПНР со специфическими праймерами, гомологичными области внешнего транскрибируемого спейсера рДНК, третьего пшеничного генома Б. Полученные результаты существенно углубляют наши знания об организации и особенностях функционирования генов рРНК у высших растений.

Практическая значимость. Клонированные фрагменты рДНК диплоидной пшеницы Т.игагЫ, пригодные для их использования в качестве зондов при проведении блот-гибридизационных экспериментов, переданы различным научным учреждениям Российской Федерации и стран СНГ. Нуклеотидные последовательности клонированных и секвенированных фрагментов рДНК различных диплоидных видов пшеницы и эгилопсов, а также АТ-богатого повтора диплоидной пшеницы Т.топососсит внесены в международные банки данных ББВТ/ЕМВЬ/ОепВапк. Сконструирован фагмидный вектор р8еяшнаТ12, характеризующийся уникальными свойствами, и предназначенный для определения нуклеотидных последовательностей протяженных фрагментов ДНК с помощью разработанной тетра/окта стратегии секвенирования путем генерирования однонаправленных делеционных субклонов. Получены убедительные свидетельства участия ряда диплоидных видов пшениц и эгилопсов в образовании полиплоидных форм пшениц рядов 1иг%1йит-ае&и\ит и Нторкееуп. Показана принципиальная возможность детекции с помощью ПЦР с геном-специфическими олигонуклеотидными праймерами генома Б, свидетельствующего о присутствии ДНК мягкой пшеницы, что может иметь важное значение при оценке технологических свойств муки твердых пшениц, идущей на изготовление макаронных изделий. Положения, выносимые на защиту. Особенности структурной организации МГС рДНК различных представителей трибы пшеницевых определяют функциональное состояние генов рРНК и их транскрипционный статус. Во внешнем транскрибируемом спейсере рДНК диплоидного эгилопса Ае.итЬеПи1Ша имеются тандемно расположенные субповторы Е-типа, каждый из которых представляет собой инвертированную последовательность, высокогомологичную промоторной области. У диплоидных пшениц Т.игагШ, Т.Ъоеойсит и Т.топососсит в промоторной области имеются необычные мотивы ТА(С/Т)ТАТО, где последний нуклеотид при транскрипции является стартовым. Донором третьего генома Б гексаплоидной пшеницы ряда Шг§гс1ит-ае8Нуит Т.аеяйуит является диплоидный эгилопс АеЛажски, а донором третьего генома Ат для гексаплоидной пшеницы Т.гкикоуякуг из группы ИторкееуИ послужила диплоидная пшеница Т.топососсит. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на III Всесоюзном совещании по хемосистематике и эволюционной биохимии высших растений (Звенигород, 1986), V съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров (Москва, 1987), V конференции молодых ученых социалистических стран по биоорганической химии (Пущино,

1988), III Всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки (Петрозаводск, 1988), IV Всесоюзной конференции "Современные проблемы эволюционной биохимии и происхождение жизни" (Телави, 1988), 8-ом двустороннем симпозиуме СССР—ФРГ "Организация генома и регуляция активности генов" (Иркутск, 1989), VII Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1990), 10-ом двустороннем симпозиуме СССР— Франция "Организация и экспрессия геномов прокариотических и эукариотических организмов" (Киев, 1990), 4-ом Международном конгрессе по молекулярной биологии растений (Amsterdam, Голландия 1994), международной конференции, посвященной памяти академика А.Н.Белозерского (Москва, 1995), международной конференции, посвященной памяти академика А.А.Баева (Москва, 1996), втором съезде биохимического общества РАН (Москва, 1997), международной конференции "Механизмы транскрипции" (New Mexico, США, 1998), девятом международном симпозиуме по генетике пшеницы (Saskatoon, Канада, 1998), Всероссийском симпозиуме "Изучение генома и генетическая трансформация растений" (Иркутск, 1999), IV съезде Общества физиологов растений России (Москва, 1999), VIII конференции "Геномы растений и животных" (San Diego, США, 2000). Публикации. Основные материалы диссертации изложены в 33 печатных работах, а также депонированы в международных банках данных DDBJ/EMBL/GenBank.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (две главы), трех глав экспериментальной части (объекты исследований, материалы и методы), результатов и их обсуждения (четыре главы), выводов и списка цитированной литературы, включающего 333 работы отечественных и зарубежных авторов. Работа изложена на 333 страницах и содержит 82 рисунка и 4 таблицы.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Чемерис, Алексей Викторович

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Клонированы фрагменты рДНК разных видов пшениц и их сородичей эгилопсов, для которых определены нуклеотидные последовательности межгенных спейсеров или их отдельных элементов, включающих промоторную область, субповторы, внешний транскрибируемый спейсер, а также некоторые другие участки повторяющихся единиц рДНК. Клонирована и секвенирована единичная копия АТ-богатого семейства повторов ДНК диплоидной пшеницы ТгШсит топососсит. Общая протяженность всех секвенированных фрагментов ДНК составила около 10 тпн.

2. Разработана новая тетра/окта стратегия секвенирования протяженных фрагментов ДНК, основанная на использовании специально сконструированного фагмидного вектора с уникальными чертами, заключающимися в отсутствии в его последовательности сайтов узнавания для тетрануклеотидной рестрикционной эндонуклеазы и одновременно в наличии в полилинкере сайтов расщепления для октануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз и 8м?а\ с ОС- и АТ-богатыми участками узнавания соответственно.

3. Показано, что в состав межгенных спейсеров рДНК пшениц и эгилопсов входит несколько типов повторяющихся элементов, среди которых превалируют А-, В- и Е-субповторы. Е-тип субповторов выявлен впервые и является уникальным для Aegilops итЬеПиЫа, в отличие от остальных видов трибы пшеницевых, имеющих только единичные копии этой последовательности. Установлено, что Е-субповторы представляют собой инвертированные нуклеотидные последовательности, способные формировать "шпилечные" структуры, которых у Ае.итЪеИиШа оказывается 6 тандемно расположенных копий против одиночных "шпилек" у остальных видов трибы пшеницевых. Обнаружен высокий уровень гомологии Е-субповторов с областью корового промотора генов рРНК и показано их взаимодействие с ядерными белками, содержащими факторы транскрипции, свидетельствующее об участии данных элементов межгенного спейсера рДНК в регуляции транскрипционного процесса.

4. Показано, что у диплоидного эгилопса Ае.итЪеИиШа в более чем 95% повторов рДНК цитозиновые остатки в сайтах узнавания рестрикционной эндонуклеазы Нра11 метилированы, тогда как у диплоидной пшеницы Т.игагШ на долю таких повторов приходится менее 65% всей рДНК, при этом интенсивность окрашивания ядрышек серебром свидетельствует, что транскрипционная активность отдельной повторяющейся единицы рДНК у Ае.итЪеИиШа значительно выше, чем таковая у Т.игагШ.

5. У диплоидных видов эгилопсов Ае.итЪеИиШа и Ае.зреНо1с1е$ в области промотора, включающей сайт инициации транскрипции рДНК, обнаружены типичные почти для всех остальных однодольных растений мотивы ТАТАвТАОООА, тогда как в подобных мотивах у диплоидных видов пшениц отсутствует канонический ТАТА-бокс. У Т.игагШ и Т. ЪоеоНсит они представлены необычными нуклеотидными последовательностями ТАСТАТООООЦ а у Т.топососсит — последовательностью ТАТТАТООООО, присутствие которой с помощью ПЦР со специфическими праймерами также показано и в рДНК диплоидной пшеницы Тзтвкхуае, являющейся естественным голозерным мутантом последнего вида.

6. У диплоидных пшениц Т.игагШ, Т.ЪоеоИсит, Т.топососсит определен сайт инициации транскрипции генов рРНК, который приходится на пурин (в), входящий в состав необычных мотивов ТА(С/Т)ТАТО, что является первым экспериментальным подтверждением возможности инициации транскрипции генов рРНК у растений с гуанинового нуклеотида.

7. Исследована функциональная активность промотора рДНК Т.ЪоеоИсит в гомологичной системе транзиентной экспрессии из изолированных протопластов, трансформированных клонированными в плазмиде промоторными участками, содержащими необычный мотив ТАСТАТО, от положений -284 до +14 и от -112 до +14, показавшими способность корректно инициировать транскрипцию.

8. Выдвинуто предположение об участии А-, В- и Е-субповторов МГС рДНК в обеспечении ядрышкового доминирования у полиплоидных форм трибы пшеницевых, и о негативной роли в этом процессе необычного (не несущего ТАТА-бокс) мотива ТАСТАТО, локализованного в промоторной области рДНК супрессируемого генома А.

9. С помощью ПЦР с геном-специфичными праймерами, гомологичными промоторной области рДНК, показано, что донорами третьих геномов для гексаплоидной пшеницы ряда 1и^гс1ит-аезИуит Т.аезйуит и гексаплоидной пшеницы Т.гкикоуякуг из группы йторкееми являются диплоидный эгилопс АеЛашски (геном Б) и диплоидная пшеница Т.топососсит (геном Ат) соответственно.

Заключение)

Основываясь на полученных в ходе этой работы результатах, а также на данных литературы, можно сделать определенные заключения об эволюционных взаимоотношениях различных видов пшениц и их диких сородичей. Считается, что при формировании двух линий полиплоидных пшениц оказалось задействовано от 4 до 6 диплоидных геномов, большинство из которых так или иначе оказалось исследовано или рассмотрено в этой работе.

Так, сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей субповторов, промоторных областей, результаты проведенных ПЦР с геном-специфичными праймерами, блот-гибридизационные эксперименты с использованием в качестве зонда АТ-богатого повтора лишний раз подтверждают, что при формировании полиплоидных пшениц ряда turgidum-aestivum донором генома D послужил диплоидный эгилопс из секции Vertebrata Ae.tauschii. Для гексаплоидной пшеницы T.zhukovskyi из группы timopheevii третий геном ведет свое происхождение от диплоидной пшеницы Т.топососсит, привнесший в ее гибрид с Т. timopheevii, сопровождавшийся удвоением числа хромосом, геном Ат, о чем свидетельствуют и наши результаты ПЦР со специфическими праймерами. При этом происхождение другого генома А гексаплоидной пшеницы T.zhukovskyi, находившегося еще в тетраплоидном виде Т. timopheevii, вызывает некоторые сомнения. Согласно полученным в этой работе данным, им может быть один из двух видов диплоидных пшениц, а именно: T.boeoticum или T.urartu.

Соответствие генома G T.timopheevii геному S Ae.speltoides хотя и получило в ходе данной работы косвенное подтверждение, еще не может, исходя из наших результатов, считаться окончательным. Весьма сложной осталась ситуация и со вторым геномом В у полиплоидных пшениц ряда turgidum-aestivum. Проведенное секвенирование промоторной области рДНК Ae.speltoides и сравнительный анализ с аналогичным участком МГС мягкой пшеницы локусом NorB2, а также сравнение нуклеотидных последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров показали их существенные различия, что убедительно свидетельствует, что не этот вид был донором генома В полиплолидных пшениц ряда turgidum-aestivum. к>

ЧО

3\

Ае§Иоря IаиБски Б

ТгШсит ТгШсит ТгШсит игаНи * топососсит Ьоеойсит

А" * * Ат Аь

2п=2х й * ''

А* Л*

ТгШсит Шг&йит АиВ'

2п=2х

ТгШсит йторкеегп АьО

2п=4х

ТгШсит аезйгит А^Б

ТгШсит гкикоуъкуг АьАтС

2п=6х ряд ит-ае$Цуит ряд Иторкееуи

Рис. 9.25. Предположительные филогенетические связи полиплоидных рядов 1иг%1(1ит-ае8йуит и Иторкееуи пшенично-эгилопсного альянса. Жирными линиями показаны связи, получившие подтверждение в наших исследованиях. Зачеркнутыми оказались неподтвержденные связи.

Несмотря на то, что его наиболее вероятным донором считается Ае.1о^1ззта, результаты, полученные нами в блот-гибридизационных экспериментах с использованием в качестве зонда АТ-богатого повтора диплоидной пшеницы Т.топососсит, входят в некоторое противоречие с подобным утверждением. Вероятно, стоит обратить особое внимание на других представителей секции в частности, Ае.яеагзи, который ряд авторов уже прочили в доноры генома В. Что касается А генома обеих групп пшениц, то, исходя из полученных результатов, можно уверенно говорить, что диплоидная пшеница Т.топососсит не имеет к нему никакого отношения. В то же время однозначно ответить на вопрос, какой из видов диплоидных пшениц Т.игагШ или Т.ЬоеоПсит (или оба — для разных групп полиплоидных пшениц) являются донором(ами) генома(ов) А, пока не представляется возможным.

Схема филогенетических взаимоотношений донорных видов и их полиплоидных производных в трибе пшеницевых, приведенная нами в главе 2 (рис. 2.1), являлась попыткой отобразить их родственные связи, причем сплошными линиями были показаны признаваемые большинством тритикологов, а связи требующие дополнительных исследований, были представлены в виде прерывистых линий. Полученные в ходе данной работы результаты позволили нам уточнить предложенную ранее схему и представить ее здесь (рис. 9.25) с некоторыми изменениями, заключающимися в перечеркивании некоторых пунктирных линий, говорящем, что эти виды не могли служить донорами геномов конкретных полиплоидных форм, и изображении жирными линиями связей, получивших подтверждение в наших исследованиях.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Чемерис, Алексей Викторович, 2000 год

1. Данилюк Н.К., Ястребов С.И., Артамонова Т.П., Попов С.Г. Упрощенный вариант метода Максама-Гильберта для определения первичной структуры олигонуклеотидов и фрагментов ДНК // Биоорг. химия. 1986. - Т.12. - С.1185-1188.

2. Дорофеев В.Ф., Мигушова Э.Ф. Новое в эволюции и систематике пшеницы // Докл. ВАСХНИЛ. 1981. - №2. - С.6-9.

3. Дорофеев В.Ф., Удачин P.A., Семенова JI.B. и др. Пшеницы мира // JL, Колос. 1987. 560 С.

4. Жуковский П.М., Хвостова В.В. Цитогенетика пшеницы и ее гибридов // М., Наука.- 1971. 287 С.

5. Ирвин Г.Н. Пшеница дурум и макаронные изделия // В кн.: Пшеница и оценка ее качества. М., Колос. - 1968. - С.459-475.

6. Колоша В.О., Фодор И.И. Высокая гомология нуклеотидныхпоследовательностей цистрона 26S рРНК Citrus limon и Saccharomycescerevisiae II Докл. АН СССР. 1986. - Т.290. - С.1006-1011.

7. Конарев В.Г. Белки пшеницы. М.: Колос, 1980. 351 С.

8. Конарев В.Г. Проблемы генома растенй // С.-х. биология. 1985. - Т.20.5. С.20-31.

9. Мазин A.JI. О роли энзиматического метилирования регуляторных элементов в контроле активности генов разных групп организмов // Молекуляр. биол. 1994 - Т.26. - С.244 - 263.

10. Одинцова Т.И., Егоров Ц.А. N-концевые последовательности со-глиадинов Aëgilops longissima. К вопросу о происхождении геномов полиплоидных пшениц//Биохимия. 1990. - Т.55. - С.509-516.

11. Пенева Т.И., Конарев В.Г. Идентификация генома Aegilops searsii Feldman et Kislev по белкам-маркерам // Труды прикл. бот. генет. селекции. 1982.- Т.73. С.138-139.

12. Савельев C.B., Ашапкин В.В., Ванюшин В.Ф. Рибосомная ДНК гексаплоидной пшеницы: характер метилирования и временная организация репликации в развивающихся проростках // Молекуляр. биолог. 1990а. - Т.24. С. 1042-1056.

13. Савельев C.B. Ашапкин В.В., Вильчинскас Р., Ванюшин Б.Ф. Рибосомная ДНК гексаплоидной пшеницы: молекулярное клонирование, рестриктазное картирование, гетерогенность // Молекуляр. биол. 19906. -Т.24.-С.51-57.

14. Agarwal M.L., Aldrich J., Agarwal A., Cullis C.A. The flax ribosomal RNA-encoding genes are arranged in tandem at a single locus interspersed by 'non-rDNA' sequences // Gene. 1992. - V. 120. - P. 151-156.

15. Ahmed A. Use of transposon-promoted deletions in DNA sequence analysis // J. Mol. Biol. 1984. - V.178. - P.941-948.

16. Ahmed A. A vector for sequencing long (40-kb) DNA fragments // Gene. -1989. V.75. - P.315-321.

17. Ahmed A. Double-origin vectors for isolating bidirectional deletions useful in DNA sequence analysis // Gene. 1994. - V.141. - P.71-73. Ahmed A., Podemski L. Use of ordered deletions in genome sequencing // Gene. - 1997. - V.197. - P.367-373.

18. Akiyama H., Kanai S., Ozawa H. Multi-priming sequencing: a DNA sequencing method involving restriction enzyme-digested DNA fragments as primers // J. Biochem. 1992. - V.l 11. - P.589-593.

19. Alting-Mees M.A., Short J.M. pBluescript II: gene mapping vectors // Nucl. Acids Res. 1989. - V. 17. - P.9194.

20. Ansorge W., Voss H., Zimmermann J. (eds.) DNA Sequencing Strategies. Wiley. Spektrum. 1996. 202 P.

21. Appels R., Dvorak J. The wheat ribosomal spacer DNA region: Its structure and variation in population and among species // Theor. Appl. Genet. 1982a. -V.63. - P.337-348.

22. Appels R., Dvorak J. Relative rates of divergence of spacer and gene sequence within the rDNA region of species in the Triticeae: implications for the maintenance of homogeneity of a repeated gene family // Theor. Appl. Genet. -1982b. V.63.-P.361-365.

23. Badaeva E., Friebe B., Gill B.S. Genome differentiation in Aegilops. 2. Physical mapping of 5S and 18S-26S ribosomal RNA gene families in dipolid species // Genome. 1996. - V.39. - P.l 150-1158.

24. Bakker F.T., Olsen J.L., Stam W.T. Evolution of nuclear rDNA ITS sequences in the Cladophora albida/sericea clade (Chlorophyta) II J. Mol. Evol. 1995. -V.40. - P.640-651.

25. Balbas P., Soberon X., Merino E., Zurita M., Lomeli H.H., Valle F., Flores N., Bolivar F. Plasmid vector pBR322 and its special-purpose derivates — a review II Gene. 1986. - V.50. - P.3-40.

26. Birnstiel M.L., Chipchase M., Speirs J. The ribosomal RNA cistrons // Progress

27. Nucl. Acids Res. Mol. Biol. 1971. - V.l 1. - P.351-389.

28. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screeningrecombinant plasmid DNA /7 Nucl. Acids Res. 1979. - V.7. - P. 1513-1523.

29. Birnstiel M.L., Chipchase M.I.H., Hyde B.B. The nucleolus, a source ofribosomes // Biochim. Biophys. Acta. 1963. - V.l6. - P.454-462.

30. Bloom S.E. Goodpaster C. An improved technique for selective silver stainingof NOR's in human chromosomes // Human Genet. 1976. - V.34. - P. 199-206.

31. Blundy K.S, Cullis C.A., Hepburn A.G. Ribosomal DNA methylation in flaxgenotroph and a crown gall tumour // Plant Mol. Biol. 1987. - V.8. - P.217225.

32. Bolivar F., Rodriguez R., Greene P.J., Betlach M.C., Heineker H.L., Boyer H.W. Construction and characterization of new vehicles. II A multipurpose cloning system // Gene. 1977. - V.2. - P.95-113.

33. Borisjuk N.V., Davidjuk Y.M., Kostishin S.S., Miroshnichenco G.P., Velasco R., Hemleben V. Structural analysis of rDNA in the genus Nicotiana II Plant Mol. Biol. 1997. - V.35. - P.655-660.

34. Borisjuk N., Hemleben V. Nucleotide sequence of the potato rDNA intergenic spacer // Plant Mol. Biol. 1993. - V.21. - P.381-384.

35. Brenner D.G., Shaw W.V. The use of synthetic oligonucleotides with universal templates for rapid DNA sequencing: results with staphylococcal replicon pC221 // EMBO J. 1985. - V.4. - P.561-568.

36. Brosius J. Superpolylinkers in cloning and expression vectors // DNA. 1989. -V.8. - P.759-777.

37. Brown J.W.S., Shaw P.J. Small nucleolar RNAs and pre-rRNA processing in plants // Plant Cell. 1998. - V.l0. - P.649-657.

38. Bryan G.J., Dixon A., Gale M.D., Wiseman G. A PCR-based method for the detection of hexaploid bread wheat adulteration of durum wheat and pasta // J. Cereal Sci. 1998. V.28. - P.135-145.

39. Buescher P.J., Phillips R.L., Brambl R. Ribosomal RNA contents of maize genotypes with different ribosomal RNA gene number // Biochem. Genet. -1984. V.22. -P.923-930.

40. Capesius I. Nucleotide sequence of a 25S rRNA gene from mustard {Sinapis alba) II Plant Mol. Biol. 1991. -V. 16. - P. 1093-1094.

41. Carroza M.L., Giorgi L., Cremonini R. Nuclear DNA content and number of ribosomal RNA genes in cultivars and selected lines of Durum wheat // Z. Pflanzenzuchtg. 1980. - V.84. - P.284-293.

42. Cassidy, D.M., Blackler, A.W. Repression of nucleolar organizer activity in an interspecific hybrid of the genus Xenopus II Dev. Biol. 1974. - V.41. - P.84-96.

43. Castilho A., Heslop-Harrison J.S. Physical mapping of 5S and 18S-25S rDNA and repetitive DNA sequences in Aegilops umbellulata // Genome. 1995. -V.38. - P.91-96.

44. Cerbah M., Souza-Chies T., Jubier M.F., Lejeune B., Siljak-Yakovlev S. Molecular phylogeny of the genus Hypochaeris using internal transcribed spacers of nuclear rDNA: inference for chromosomal evolution // Mol. Biol. Evol. 1998. - V. 15.- P.345-354.

45. Chatterton N.J., Hsiao C., Asay K.H., Wang R.R-C., Jensen K.B. Nucleotide sequence of internal transcribed spacer region of rDNA in wheat, Triricum speltoides L. (Tausch.) Gren. ex Richter (Gramineae) // Plant Mol. Biol. -1992c.-V.20.-P. 157-158.

46. Chatterton N.J., Hsiao C., Asay K.H., Wang R.R-C., Jensen K.B. Nucleotide sequence of the internal transcribed spacer region of the rDNA in wheat, Triticum aestivum L. (<Gramineae) // Plant Mol. Biol. 1992d. - V.20. - P. 159160.

47. Chen K., Gray J.C., Wildman S.G. Fraction I and the origin of polyploid wheats // Science. 1975. - V.190. - P.1304-1306.

48. Chen Z.J., Pikaard C.S. Transcriptional analysis of nucleolar dominance in polyploid plants: Biased expression/silencing of progenitor rRNA genes is developmentally regulated in Brassica II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. -V.94. - P.3442-3447.

49. Cheng B.F., Heneen W.K., Pedersen C. Ribosomal RNA gene loci and their nucleolar activity in Brassica alboglabra II Heredity. 1995. - V.123. - P. 169173.

50. Chipchase M.I.H., Birnstiel M. On the nature of nucleolar RNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1963. - V.50. - P.l 101-1107.

51. Cohen S.N., Chang A.C.Y., Hsu L. Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria: genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1972. - V.69. - P.2110-2114.

52. Crosby A.R. Nucleolar activity of lagging chromosome in wheat. // Amer. J. Bot. 1957. - V. 44. - P. 813-822.

53. Cullis C.A. Environmental induction of heritable changes in flax: defined environments inducing changes in rDNA and peroxidase isozyme band pattern // Heredity. 1981. - V.47. - P.87-94.

54. Danna K.J. Determination of fragment order through partial digest and multiple enzyme digest // In: Methods in Enzymology. Acad. Press. New York, 1980. -V.65. - P.449-467.

55. Doelling, J.H., Pikaard, C.S. Transient expression in Arabidopsis thaliana protoplasts derived from rapidly established cell suspension culture // Plant Cell Rep. 1993. - V.12. - P.241-244.

56. Dvorak J., McGuire P.E., Cassidy B. Apparent sources of the A genomes of wheats inferred from polymorphism in abundance and restriction fragment length of repeated nucleotide sequences // Genome. 1988. - V.30. - P.680-689.

57. Dvorak J., di Terlizzi P., Zhang H-B., Resta P. The evolution of polyploid wheats: identification of the A genome donor species // Genome. 1993. -V.36.-P.21-31.

58. Dvorak J., Zhang H-B. Variation in repeated nucleotide sequences sheds light on the phylogeny of the B and G genomes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1990. V.87. P.9640-9644.

59. Eberle J.R. Generation of bidirectional deletions using DNase I // Biotechniques. 1993. - V.14. - P.408-411.

60. Echeverria, M., Delcasso-Tremousaygue, D., Delseny, M. A nuclear protein binding to dA/dT-rich sequences upstream from the radish DNA promoter // Plant J. 1992. - V.2. - P.211-219.

61. Eckenrode V.K., Arnold J., Meagher R.B. Comparison of the nucleotide sequences of Glycine max and other small-subunit rRNAs // J. Mol. Evol. -1985.-V.21. -P.259-269.

62. Ellis T.H.N., Delseny M., Lee D., Burcham K.W.G. Methylated and undermethylated rDNA repeats are interspersed at random in two higher plant species //PlantMol. Biol. 1989. - V.14. - P. 73-80.

63. Feldman M., Sears R. The wild gene resources of wheat // Scient. Amer. 1981. N1. - P.98-109.

64. Finnegan E.J., Genger R.K., Peacock W.J., Dennis E.S. DNA methylation in plants // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1998. - V.49. - P.223-247.

65. Flavell R.B., O'Dell M. Ribosomal RNA genes on homoeologous chromosomes of group 5 and 6 in hexaploid wheat // Heredity. 1976. - V.37. -P.377-385.

66. Flavell R.B., O'Dell M. The genetic control of nucleolus formation in wheat // Chromosoma. 1979. - V. 71. - P. 135-152.

67. Flavell R.B., O'Dell M., Thompson W.F. Regulation of cytosine methylation in ribosomal DNA and nucleolus organizer expression in wheat // J. Mol. Biol. -1988. V.204. - P.523-534.

68. Flavell R.B., Smith D.B. The role of homoeologous group 1 chromosomes in the control of rRNA genes in wheat // Biochem. Genet. 1974. - V.12. - P.271-279.

69. Fribe B., Kim N-S, Kuspira J., Gill B.S. Genetic and cytogenetic analyses of the A genome of Triticum monococcum. VI. Production and identification of primery trisomies using the C-banding technique \\ Genome. 1990. - V.33. -P.542-555.

70. Friedrich H., Hemleben V., Meagher R.B., Key J.L. Purification and restriction mapping of soybean 18S and 25S ribosomal RNA genes // Planta. 1979. -V.146. - P.467-473.

71. Fukui K., Nakayama S., Ohmido N., Yoshiaki H., Yamabe M. Quantitative karyotyping of three diploid Brassica species by imaging methods and localization of 45s rDNA loci on the identified chromosomes // Theor. Appl. Genet. 1998. V.96. - P.325-330.

72. Garoff, H., Ansorge, W. Improvements of DNA sequencing gels // Anal. Biochem. 1981. - V. 115. - P.450-457.

73. Gaudino R.J., Pikaard C.S. Cytokinin induction of RNA polymerase I transcription in Arabidopsis thaliana \\ J. Biol. Chem. 1997.- V.272. P.6799-6804.

74. Gerbi S.A. Evolution of ribosomal DNA In: Molecular evolutionary genetics (ed. RJ. Mclntyre). Plenum Press, New York, 1985. P.419-517. Gerbi S.A. The evolution of eukaryotic ribosomal DNA // BioSystems. - 1986. - V.19.-P.247-258.

75. Gerlach W.L., Appels R., Dennis E.S., Peacock W.J. Evolution and analysis of wheat genomes using highly repeated DNA sequences // Proc. 5th Intern. Wheat Genet. Symp., New Delhi, 1978. P.81-91.

76. Goldsborough P.B., Cullis C.A. Characterization of the gens for ribosomal

77. RNA genes in flax //Nucl. Acids Res. 1981. - V.9. - P.1301-1309.

78. Goryshin I.Y., Jendrisak J., Hoffman L.M., Meis R., Reznikoff W.S. Insertionaltransposon mutagenesis by electroporation of released Tn5 transpositioncomplexes // Nat. Biotechnol. 2000. - V. 18. - P.97-100.

79. Goryshin I.Y., Reznikoff W.S. Tn5 in vitro transposition // J. Biol. Chem.1998. V.273. - P.7367-7374.

80. Graham D.E. The isolation of high molecular weight DNA from whole organisms or large tissue masses // Anal. Biochem. 1978. - V.85. - P.609-613.

81. Grebenstein B., Ruser M., Sauer W., Hemleben V. Molecular phylogenetic relationships in Aveneae (Poaceae) species and other grasses as inferred from ITS1 and ITS2 rDNA sequences // Plant Syst. Evol. 1998. - V.213. - P.233-250.

82. Grellet F., Delcasso-Tremousaygue D., Delseny M. Isolation and characterization of an unusual repeated sequence from the ribosomal intergenic spacer of the crucifer Sisymbrium irio II Plant Mol. Biol. 1989. - V.12. -P.695-706.

83. Grierson D. RNA processing and other post-transcriptional modification // In: Nucleic Acids and proteins in plants.- Springer; Berlin. 1982. - V.2. - P. 192223.

84. Guo L-H., Wu R. New rapid methods for DNA sequencing based on exonuclease III digestion followed by repair synthesis // Nucl. Acids Res. -1982.-V.10.-P.2065-2084.

85. Hanahan D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids // J. Mol. Biol. 1983. - V.166. - P.557-580.

86. Harding K. The methylation status of DNA derived from potato plants recovered from slow growth // Plant Cell Tiss. Organ Cult. 1994. - V.37. -P.31-38.

87. Honjo T., Reeder R.H. Preferential transcription of Xenopus laevis ribosomal RNA in interspecies hybrids between X.laevis and X.mulleri II J. Mol. Biol. -1973.-V.80.-P.217-228.

88. Houchins K., O'Dell M., Flavell R.B., Gustafson J.P. Cytosine methylation and nucleolar dominance in cereals hybrids // Mol. Gen. Genet. 1997. - V.255. -P.294-301.

89. Hozak P., Cook P.R., Schofer C., Mosgoller W., Wachtler F. Site of transcription of ribosomal RNA and intranucleolar structure in HeLa cells // J. Cell Sci. 1994. - V.107. - P.639-648.

90. Hsiao C., Chatterton N.J., Asay K.H., Jensen K.B. Phylogenetic relatioships of 10 grass species: an assessment of phylogenetic utility of the internal transcribed spacer region in nuclear ribosomal DNA in monocots // Genome. -1994.-V.37.-P.l 12-120.

91. Hsiao C., Chatterton N.J., Asay K.H., Jensen K.B. Molecular phylogeny of the Pooideae (.Poaceae) based on nuclear rDNA (ITS) sequences // Theor. Appl. Genet. 1995a. - V.90. - P.389-398.

92. Hsiao, C., Chatterton, N.J., Asay, K.H., Jensen, K.B. Phylogenetic relationships of the monogenomic species of the wheat tribe, Triticeae (Poaceae), inferredfrom nuclear rDNA (internal transcribed spacer) sequences // Genome. 1995b. -V.38.-P.211-223.

93. Humphreys G.O., Weston A., Brown M.G.M., Saunders J.R. Plasmid transformation of Escherichia coli II In: Transformation. Proc. 4th Eur. Meet. Bacter. Transform. Transfect. George Allen & Unwin; London, 1979. - P. 287-312.

94. Hutchinson J., Miller T.E. The nucleolar organisers of tetraploid and hexaploid wheats revealed by in situ hibridisation \\ Theor. Appl. Genet. -1982. V.61. -P.285-288.

95. Jellen E.N., Phillips R.L., Rines H.W. Chromosomal localization and polymorphisms of ribosomal DNA in oat (Avena spp.) II Genome. 1993. -V.37. - P.23-32.

96. Jiang J., Gill B.S. New 18S • 26S ribosomal RNA gene loci: chromosomal landmarks for the evolution of polyploid wheats // Chromosoma. 1994. -V.103. - P.179-185.

97. Johnson B.L., Dhaliwal H.S. Triticum urartu and genome evolution in thetetraploid wheats // Amer. J. Bot. 1978. - V.65. - P.907-918.

98. Johnson D.F., Nierlich D.P., Lusis A.J. Use of the lac repressor in constructingsequential deletions and a new sequencing vector // Gene. 1990. - V.94. - P.914.

99. Karagiannis C.S., Pappelis A.J. Effect of abscisic acid, gibberellic acid, indoleacetic acid, and kinetin on selective ribosomal cistron regulation in quiescent and senescent onion leaf base tissue // Mech. Ageing Dev. 1994. -V.76. - P.145-155.

100. Karagiannis C.S., Pappelis A.J., Yopp J.H. Brassinolide is a selective ribosomal cistron regulator in onion leaf base tissue // Mech. Ageing Dev. 1995. - V.80. -P.35-42.

101. Karvonen P., Karjalainen M., Savolainen O. Ribosomal RNA genes in Scots pine (.Pinus sylvestris L.): chromosomal organization and structure // Genetika. 1993.-V.88. -P.59-68.

102. Karvonen P., Szmidt A.E., Savolainen O. Length variation in the internal transcribed spacers of ribosomal DNA in Picea abies and related species // Theor. Appl. Genet. 1994. - V.89. - P.969-974.

103. Kato A., Yakura K., Tanifuji S. Organization of ribosomal DNA in the carrot // Plant Cell Physiol. 1982. - V.23. - P. 151-154.

104. Kelly R.J., Siegel A. The Cucurbita maxima ribosomal DNA intergenic spacerhas a complex structure I I Gene. 1989. - V.80. - P.239-248.

105. Kerby K., Kuspira J. Cytological evidence bearing on the origin of the Bgenome in polyploid wheats // Genome. 1988. - V.30. - P.36-43.

106. Kerby K., Kuspira J., Jones B.L. Biochemical data bearing on the relationshipbetween the genome of Triticum urartu and the A genome and B genome of thepolyploid wheats II Genome. 1988. - V.30. - P.576-581.

107. King K., Torres R.A., Zentgraf U., Hemleben V. Molecular evolution of theintergenic spacer in the nuclear ribosomal RNA genes of Cucurbitaceae II J.

108. Mol. Evol. 1993. - V.36. - P.144-152.

109. Klarholz I., Hildebrandt A. Hordeum vulgare rRNA gene intergenic spacer // 1999. DDBJ/EMBL/GenBank Accession number AF147501.

110. Kollipara K.P., Singh R.J., Hymowitz T. Phylogenetic and genomicrelationships in the genus Glycine Willd. based on sequences from the ITSregion of nuclear rDNA // Genome. 1997. - V. 40. - P. 57-68.

111. Kolosha V.O., Fodor I. Nucleotide sequence of Citrus limon 26S rRNA geneand secondary structure model of its RNA // Plant Mol. Biol. 1990. - V.14. 1. P.147-161.

112. Konarev V.G., Gavrilyuk I.P., Gubareva N.K., Peneva T.I. Seed protein ingenome analysis, cultivar identification, and documentation of cereal geneticresources: a review // Cereal Chem. 1979. - V.56. - P.272-278.

113. Kopp E., Mayr B., Schleger W. Species-specific non-expression of ribosomal

114. RNA genes in a mammalian hybrid, the mule // Chromosoma. 1986. - V.94.1. P.346-352.

115. Kovarik A., Matyasek R.,Leitch A.,Gardova B., Fulnecek J., Bezdek M. Variability in CpNpG methylation in higher plant genomes // Gene. 1997. -V.204. - P.25-33.

116. Krens F.A., Molendijk L., Wullems G.J., Schilperoort R.A. In vitro transformation of plant protoplasts with Ti-plasmid DNA // Nature. 1982. -V.296. - P.72-74.

117. Kuhrova V., Bezdek M., Kaukalova B., Vyskot B. Methylation state of rDNA in some species of the family Brassicaceae studied with the method of RELP // Biol. Plant. 1992. - V.34. - Suppl. - P.566.

118. Kulaeva O.N., Karavaiko N.N., Selivankina S.Yu., Zemlyachenko Ya.V., Shipilova S.V. Receptor of trans-zeatin involved in transcription activation by cytokinin //FEBS Lett 1995. - V.366. - P.26-28.

119. Maizels N. Dictyostelium 17S, 25S, and 5S rDNAs lie within a 38,000 base pair repeated unit // Cell. 1976. - V.9. - P.431-438.

120. Mandecki W., Hayden M.A., Shallcross M.A., Stotland E. A totally synthetic plasmid for general cloning, gene expression and mutagenesis in Escherichia coli II Gene. 1990. - V.94. - P. 103-107.

121. Marchuk D., Drumm M., Saulino A., Collins F.S. Construction of T-vectors, a rapid and general system for direct cloning of unmodified PCR products // Nucl. Acids Res. 1991. - V. 19. - P. 1154.

122. Marrocco R., Gelati M.T., Maggini,F. Nucleotide sequence of the internal transcribed spacers and 5.8S region of ribosomal DNA in Pinus pinea L. // DNA Seq. 1996. - V.6. - P.175-177.

123. Martienssen R.A., Richards E.J. DNA methylation in eukaryotes // Curr. Opin. Genet. Dev. 1995. - V.5. - P.234-242.

124. May C.E. Selection for ribosomal-RNA gene numbers in commercial wheats // Proceedings of the 9th International Wheat Genetics Symposium. Saskatoon, Canada, 1998. - V.l. - P.95-98.

125. May C.E., Appels R. Variability and genetics of spacer DNA sequences between the ribosomal-RNA genes of hexaploid wheat (Triticum aestivum) II Theor. Appl. Genet. 1987. - V. 74. - P. 617-624.

126. Maxam A.M., Gilbert W. A new method for sequencing DNA // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1977. - V.74. - P.560-564.

127. Mclntyre C.L., Clarke B.C., Appels R. DNA sequence analyses of the ribosomal spacer regions in the Triticeae II Plant Syst. Evol. 1988. - V. 160. -P. 91-104.

128. McMullen M.D., Hunter B., Phillips R.L., Rubenstein I. The stricture of the maize ribosomal DNA spacer region // Nucl. Acids Res. 1986. - V.14. -P.4953-4968.

129. Messing J., Crea R., Seeburg P.H. A system for shotgun DNA sequencing // Nucl. Acids Res. 1981. - V.9. - P.309-321.

130. Miller O.L., Jr. The nucleolus, chromosomes, and visualization of genetic activity // J. Cell Biol. 1981. - V.91. - P.15S-27S.

131. Miller O.J., Miller D.A., Dev V.G., Tantravahi R., Croce C.M. Expression of human and supression of mouse nucleolus organizer activity in mouse-human somatic cell hybrids // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976. - V.73. P.4531-4535.

132. Miller T.E., Gerlach W.L., Flavell R.B. Nucleolus organizer variation in wheat and rye revealed by in situ hybridisation // Heredity. 1980. - V.45. - P. 377382.

133. Mohan J., Flavell R.B. Ribosomal RNA cistron multiplicity and nucleolar organisers in hexaploid wheat // Genetics. 1974. - V.76. - P.33-44.

134. Nath J., Hanzel J.J., Thompson J.P., McNay J.W. Additional evidence implicating Triticum searsii as the B-genome donor to wheat // Biochem. Genet. 1984. V.22. - P.37-50.

135. Nath J., Thompson J.P., Gulati S.C. Identification of the G-genome donor to Triticum timopheevii by DNA:DNA hybridizations // Biochem. Genet. 1985. -V.23. - P.125-137.

136. Nelson M., McClelland M. The effect of site-specific methylation on restriction-modification enzymes // Nucl. Acids Res. 1987. - V.15. - Suppl. r219-r230.

137. Neves N., Silva M., Heslop-Harrison J.S., Viegas W. Nucleolar dominance in triticales: control by unlinked genes // Chromosome Res. 1997. - V.5. - P. 125131.

138. Ngan F., Shaw P., But P. Wang J. Molecular authentication of Panax species // Phytochemistry. 1999. - V.50. - P.787-791.

139. Nickrent D.L., Schuette K.P., Starr E.M. A molecular phylogeny of Arcetobium (Viscaceae) based on nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacer sequences//Am. J. Bot. 1994. - V.81. - P. 1149-1160.

140. Norrander J., Kempe T., Messing J. Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis // Gene. 1983. - V.26. -P.101-106.

141. Obara, A. Valencia orange rRNA gene // DDBJ. 1993. Accession number E08821.

142. Olmedilla A., Delcasso D., Delseny M., Cauwet-Marc A-M. Variability in giant fennel {Ferula commnis, Umbelliferae): ribosomal RNA nuclear genes // Plant Syst. Evol. 1985. - V.150. - P.263-274.

143. Olmedilla A., Testillano P.S., Vicente O., Delseny M., Risueno M.C. Ultrastructural rRNA localization in plant cell nucleoli. RNA/RNA in situ hybridization, autoradiography and cytochemistry // J. Cell Sci. 1993. - V.106.- P.1333-1346.

144. Olszewska M.J., Sakowicz T., Kazmierczak J., Luchniak P. Enhanced nucleolar parameters in Vicia faba L. induced by 5-azacytidine may be only partly attributed to DNA demethylation // Folia Histochem. Cytobiol. 1997. - V.35. -P.185-192.

145. Oono K., Sugiura M. Heterogeneity of the ribosomal RNA gene clusters in rice // Chromosoma. 1980. - V76. - P.85-89.

146. Owen-Hughes T., Workman J.L. Experimental analysis of chromatin function in transcription control // Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 1994. - V.4. -P.403-441.

147. Paldi E., Devay M. Relationship between the cold-induced rRNA synthesis and the rRNA cistron number in wheat cultivars with varying degrees of frost hardiness // Plant Sci. Lett. 1983. - V. 30. - P. 61-67.

148. Phillips R.L., Wang S.S., Weber D.F., Kleese R.A. The nucleolar organizer in maize // Genetics. 1973. V.74. P.212.

149. Pikaard C.S. Nucleolar dominance and scilencing of transcription // Trends Plant Sci. 1999. - V.4. - P.478-483.

150. Pikaard, C.S., Chen, Z.J. Nucleolar dominance. In Transcription of ribosomal RNA genes by eukaryotic RNA polymerase I (ed. Paule M.R.). R.G. Landes, Austin, TX. 1998. - P.277-294.

151. Poulson R. Isolation, purification and fractionation of RNA // In: Ribonucleic Acids. Springer, Berlin e.a. - 1973. P.243-261.

152. Pruitt R.E., Meyerowitz E.M. Characterization of the genome of Arabidopsis thaliana II J. Mol. Biol. 1986. - V.187. - P. 169-183.

153. Rafalski J.A., Wiewiorowski M., Soll D. Organization of ribosomal DNA in yellow lupine (Lupinus luteus) and sequence of 5,8S ribosomal RNA genes // FEBS Lett. 1983. - V.152. - P.241-246.

154. Reddy P.S., Padayatty J.D. rDNA repeat unit in rice variety IR-20 // Ind. J. Biochem. Biophys. 1987. - V.24. - P.293-295.

155. Reeder R.H. Enhancers and ribosomal gene spacers // Cell. 1984. - V.38. -P.349-351.

156. Ren Z., Nie W., Black L.W. A powerful approach for generating and sequencing DNA deletions: sequencing from the outside in // Anal. Biochem. -1997.-V.245.-P.112-114.

157. Rigby P.W., Dieckmann M., Rhodes C., Berg P. Labeling deoxyribonucleic acid to high specific activity in vitro by nick translation with DNA polymerase I // J. Mol. Biol. 1977. - V.l 13. - P.237-251.

158. Riley R., Unrau J., Chapman V. Evidence on the origin of the B genome of wheat // J. Hered. 1958. - V.49. - P.91-98.

159. Ritossa F.M., Spiegelman S. Localization of DNA complementary to ribosomal RNA in the nucleolus organizer region of Drosophila melanogaster II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1965. - V.53. - P.737-745.

160. Saghai-Maroof M.A., Soliman K.M., Jorgensen R.A., Allard R.W. Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1984. -V.81.-P.8014-8018.

161. Sallares R., Brown T.A. PCR-based analysis of the intergenic spacers of the NOR loci on the A genomes of Triticum diploids and polyploids // Genome. -1999.-V.42.-P.116-128.

162. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A laboratory manual, 1989. Second Edn. Cold Spring Harbor. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1682 P.

163. Sanchez-Pescador R., Urdea M.S. Use of unpurified synthetic deoxynucleotide primers for rapid dideoxynucleotide chain termination sequencing // DNA. -1984. V.4. - P.339-343.

164. Schnapp A., Rosenbauer H., Grummt I. Trans-acting factors involved in species-specificity and control of mouse ribosomal gene transcription // Mol. Cell. Biochem. 1991. - V.104. - P.137-147.

165. Schultheis L.M., Baldwin B.G. Molecular phylogenetics of Fouquieriaceae: evidence from nuclear RDNA ITS studies // Am. J. Bot. 1999. - V.86. - P.578-589.

166. Scott N.S., Kavanagh T.A., Timmis J.N. Methylation of rRNA genes in some higher plants // Plant Sci. Lett. 1984. - V.35. - P.213-217.

167. Sealey P.G., Southern E.M. Gel electrophoresis of DNA // In: Gel Electrophoresis of Nucleic Acids. A practical approach. IRL Press. Oxford, 1982. P.39-76.

168. Sears E.R. The wheats and their relatives // Handbook of Genetics. V.2. King R.C. (ed.). Plenum Press, 1974. P.59-91.

169. Shaw P.J., Highett M.I., Beven A.F., Jordan E.G. The nucleolar architecture of polymerase I transcription and processing // EMBO J. 1995. - V.14. - P.2896-2906.

170. Siegel A., Kolacz K. Heterogeneity of pumpkin ribosomal DNA. // Plant Physiol. 1983. - V.72. - P. 166-171.

171. Smith H.O. Recovery DNA from gels // Meth. Enzymol. Academic Press, New York e.a. 1980. - V.65. P.371-380.

172. Sorge J.A., Blinderman L.A. ExoMeth sequencing of DNA: Eliminating the need for subcloning and oligonucleotide primers // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989.-V.86.-P.9208-9212.

173. Takaiwa F., Kikushi S., Oono K. The complete nucleotide sequence of the intergenic spacer between 25S and 17S rDNAs in rice // Plant Mol. Biol. -1990. V.15.-P.933-935.

174. Takaiwa F., Oono K., Iida Y., Sugiura M. The complete nucleotide sequence ofa rice 25S rRNA gene // Gene. 1985a. - V.37. - P.255-259.

175. Takaiwa F., Oono K., Sugiura M. The complete nucleotide sequence of a rice17S rRNA gene // Nucl. Acids Res. 1984. - V.12. - P.5441-5448.

176. Takaiwa F., Oono K., Sugiura M. Nucleotide sequence of the 17S 25S spacerregion from rice rDNA // Plant Mol. Biol. 1985b. - V.4. - P.355-362.

177. Taketa S., Harrison G.E., Heslop-Harrison J.S. Comparative physical mappingof the 5S and 18S-25S rDNA in nine wild Hordeum species and cytotypes //

178. Theor. Appl. Genet. 1999. - V.98. - P.l-9.

179. Teoh S.B., Hutchinson J., Miller T.E. A comparison of the chromosomal distrubution of cloned repetitive DNA sequences in different Aegilops species //Heredity. 1983. - V.51. - V.635-641.

180. Thiellement H., Seguin M., Bahrman N., Zivy M. Homoeology and phylogeny of the A, S, and D genomes of the Triticinae // J. Mol. Evol. 1989. - V.29. -P.89-94.

181. Thompson W.F., Flavell R.B. DNase I sensitivity of ribosomal RNA genes in chromatin and nucleolar dominance in wheat // J. Mol. Biol. 1988. - V.204. -P.535-548.

182. Toloczyki C., Feix G. Occurrence of 9 homologous repeat unit in the external spacer region of a nuclear maize rRNA gene unit-// Nucl. Acids Res. 1986. -V.14. - P.4969-4985.

183. Torres-Ruiz RA, Hemleben V Pattern and degree of methylation in ribosomal

184. RNA genes of Cucurbita pepo L. // Plant Mol. Biol. 1994. - V.26. - P. 11671179.

185. Tucci G.F., De Dominies R.I., Ficca A.G., Celi M., Gregori C. Nucleoli, rRNA genes and ITS region in Posidonia oceanica (L.) Delile // Hereditas. 1998. -V.129. - P.59-65.

186. Unfried I., Stocker U., Gruendler P. Nucleotide sequence of the 18S rRNA gene from Arabidopsis thaliana Co 10 // Nucl. Acids Res. 1989. - V.17. -P.7513.

187. Vanyushin B.F., Kirnos M.D. DNA methylation in plants // Gene. 1988. -V.74.-P.117-121.

188. Viera J., Messing J. The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers // Gene. 1982.-V.19.-P.259-268.

189. Vincentz M., Flavell R.B. Mapping of ribosomal RNA transcripts in wheat // Plant Cell. 1989. - V.l. - P.579-589.

190. Waalwijk C., Flavell R.A. Mspl, an isoschizomer of Hpall which cleaves both unmethylated and methylated Hpall sites // Nucl. Acids Res. 1978. - V.5. -P.3231-3236.

191. Waines J.G., Barnhart D. Biosystematic research in Aegilops and Triticum II Hereditas. 1992. - V.l 16. - P.207-212.

192. Walker T.A., Pace N.R. 5.8S ribosomal RNA 11 Cell. 1983. - V. 33. - P. 320322.

193. Wallace H., Birnstiel M.L. Ribosomal cistrons and nucleolar organizer // Biochim. Biophys. Acta. 1966. - V.l 14. - P.296-310.

194. Watson J.C. Kaufman L.S., Thompson W.F. Development regulation of cytozine methylation in the nuclear ribosomal RNA genes of Pisum sativum II J. Mol. Biol. 1987. - V.193. - P. 15-26.

195. Wendel J.F. Genome evolution in polyploids // Plant Mol. Biol. 2000. - V.42.- P.225-249.

196. Yakura K., Tanifuji S. Molecular cloning and restriction analysis of EcoRI-fragments of Vicia faba rDNA // Plant Cell Physiol. 1983. - V.24. - P. 13271330.

197. Yanisch-Perron C., Viera J., Messing J. Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the Ml3mp 18 and pUC19 vectors // Gene. 1985.-V.33.-P. 103-119.

198. Zentgraf U., Hemleben V. Complex formation of nuclear proteins with the RNA polymerase I promoter and repeated elements in the external transcribed spacer of Cucumis sativus ribosomal DNA // Nucl. Acids Res. 1992. - V.20. -P.3685-3691.

199. Zhang Q.F., Saghai-Maroof M.A., Allard R.W. Effects on adaptedness of variations in ribosomal DNA copy number in populations of wild barley (Hordeum vulgare ssp. spontaneum) // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1990. -V.87. - P.8741-8745.

200. Zhu K.Y., Clark J.M. Rapid construction of nested deletions of recombinant plasmid DNA for dideoxy sequencing // Biotechniques. 1995. - V.18. - P.222-224.

201. Zimmer E.A., Jupe E.R. Walbot V. Ribosomal gene structure, variation and inheritance in maize and its ancestors // Genetics. 1988. - V.120. - P. 11251136.