Спектральное (ЯМР) и конформационное исследование олигосахаридов, отвечающих фрагментам фукоиданов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.03, кандидат химических наук Грачев, Алексей Александрович

• Грачев, Алексей Александрович
• кандидат химических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат химических наук Грачев, Алексей Александрович

Список условных обозначений

Часть 1. Введение.

Часть 2. Литературный обзор "Конформационный анализ углеводов в 7 растворе".

2.1. Экспериментальный конформационный анализ углеводов.

2.1.1. Теория и методы регистрации ядерного эффекта 9 Оверхаузера.

2.1.2. Теория и методы регистрации вицинальных констант 27 спин-спинового взаимодействия.

2.2. Теоретический конформационный анализ углеводов. 44 Часть 3. Обсуждение результатов.

3.1. Целевые соединения и стратегия их исследования.

3.2. Олигосахариды, относящиеся к фрагментам (1->3)- 58 связанной фукоидановой цепи.

3.2.1. Несульфатированные олигофукозиды 1а-5а.

3.2.2.2-0-сульфатированные олигофукозиды 16-46.

3.2.3.4-0-сульфатированные олигофукозиды 1в-4в.

3.2.4. Применение данных спектрального и конформационного 91 анализа синтетических олигофукозидов в структурном исследовании природных фукоиданов.

3.3. Олигосахариды, относящиеся к фрагментам фукоидановой 99 цепи с чередующимися (1-»3) и (1->4)-связями.

3.3.1. Несульфатированные олигофукозиды 1а-5а.

3.3.2.2-О-сульфатированные олигофукозиды 16-46.

3.3.3. Применение данных спектрального и конформационного 116 анализа синтетических олигофукозидов в структурном исследовании природных фукоиданов.

Часть 4 Выводы.

Часть 5 Экспериментальная часть.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Спектральное (ЯМР) и конформационное исследование олигосахаридов, отвечающих фрагментам фукоиданов»

Исследование взаимосвязи между структурой и свойствами углеводов является важнейшей задачей современной химии природных соединений. К широко изучаемым в последнее время биологически активным углеводам относятся полисахариды фукоиданы, про которые известно, что они проявляют противоопухолевую [1, 2], антикоагулянтную [3, 4], противовоспалительную [5-7] и антивирусную [8-10] активности.

Фукоиданы построены преимущественно из a-L-фукопиранозных остатков, связанных в полимерные цепи. При этом для их цепей характерно наличие разветвлений, а также высокая степень сульфатирования, одна-две сульфатные группы на одно фукопиранозное звено. Фукоиданы содержатся в бурых водорослях и морских беспозвоночных, относящихся к типу иглокожих. Несмотря на то, что эти биополимеры известны уже несколько десятков лет, имеются лишь фрагментарные сведения об их строении. Это обусловлено сложностью структурной характеристики фукоиданов из-за их нерегулярности, гетерогенности, а также отсутствия методов их направленного и контролируемого расщепления.

Изученные на данный момент фукоиданы можно разделить на два класса по типу соединения a-L-фукопиранозных остатков в полимерные цепи (Рисунок 1). К первому классу относятся фукоиданы с основной цепыо из a-L-фукопиранозных остатков, соединенных (1->3)-гликозидными связями. Фукоиданы с таким типом цепи были выделены из водорослей Laminaria saccharina [11], Chorda filum [12], Cladosiphon okamurantis [13], морского огурца Ludwigoíhurea grísea [14] и морского ежа Sírongylocentroíus franciscanus [15]. Другой класс фукоиданов содержит основную цепь из a-L-фукопиранозных остатков с чередующимися (1-»3)- и (1->4)-связями. К этому классу относятся фукоиданы из водорослей Fucus evanescense [16], Fucus distihus [17], Fucus serratus [18], Ascophyllum nodosum [19]. Для обоих типов цепей характерно наличие разветвленных фрагментов, при этом имеются сведения о 2,3- и 3,4-замещенных a-L-фукопиранозных остатках [12, 13, 18].

Рисунок 1. Два типа основной цепи фукоиданов. Цепь I состоит из а-Ь-фукопиранозных остатков, соединенных только (1->3)-гликозидными связями. Цепь II построена из а-\.-фукопиранозных остатков, сочлененных чередующимися (1->3)- и (1-И)-связями. = Н, а-Ь-Риср, ЭОз", Ас

Наличие биологической активности фукоиданов связывают с их способностью имитировать углеводные лиганды природных рецепторов, например, белков лектинов. При этом способность фукоиданов к имитации определяется наличием в их структуре сульфатных групп, которые имеют определенную пространственную ориентацию. Таким образом, для понимания механизма имитации необходимо знать пространственную структуру фукоиданов. Это позволит разрабатывать эффективные фармацевтические препараты.

В данной работе проведено систематическое изучение вторичной (пространственной) структуры синтетических олигофукозидов (Рисунок 2 и 3), отвечающих фрагментам фукоидановых цепей обоих типов (I и II). При этом были рассмотрены олигофукозиды, различающиеся межфукозными связями (1-»3, 1—>4), числом звеньев в цепи (от 2 до 6), положением сульфатных групп (несульфатированные, 2-0-сульфатированные и 4-0-сульфатированные), а также олигофукозиды, содержащие в своей структуре разветвленные фрагменты (2,3 и 3,4).

ОРг

1*20? Дон

1а IV = Я» = Н

16 IV - вО^а , IV = Н

1вР1 = Н,Р2 = 303№

Ме

ОРг

1*20?

ОРг оК1

А0Н

2а IV = Я» = Н

26 IV = ЭО^а , IV = Н

2в IV = Н, IV = Э03№

Ме

ЕЮ?

0? он зб = Э03№ , IV = Н

Зв IV = Н, IV = Э03№

ОРг

Рисунок 2. Исследованные олигофукозиды, родственные гомо-(1-»3)-связанным фукоидановым цепям.

Изучение проводилось методами спектроскопии ЯМР и теоретического молекулярного моделирования. На основании полученных данных выявлены ключевые моменты, определяющие пространственное строение фукоидановых цепей. Другой целью работы являлась систематизация спектральных 13С ЯМР эффектов сульфатирования и гликозилирования для фукозидов и их объяснение в свете результатов теоретического конформационного анализа. В дальнейшем эти эффекты могут быть использованы при установлении структуры природных фукоиданов по данным 13С ЯМР [20].

ОРг ОРг ОРГ

Ме'

Ме НО но? 00н тЫ

I он но ¿он

6а IV = Н 7а IV = Н \Ы\ 8а = Н

66 IV = 80}№ 76 IV = ЭОзМа НО 86 IV = в03№

ОРг

10а ^ = Н

Рисунок 3. Исследованные олигофукозиды, родственные фукоидановым цепям с чередующимися (1-»3)- и (1-»4)-связями.

Часть 2.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Конформационный анализ углеводов в растворе"

Биологически важные полисахариды участвуют в самых различных комплиментарных взаимодействиях, например с антителами, ферментами, различными рецепторами. Активность полисахаридов в этих процессах напрямую связана с конформациями их полимерных цепей. Это определяет интерес к изучению строения и в частности пространственной организации полисахаридов и их фрагментов.

В настоящем литературном обзоре рассмотрены существующие способы определения конформаций углеводов в растворе с применением методов ЯМР-спектроскопии (раздел 2.1) и теоретического конформационного анализа (раздел 2.2).

Заключение диссертации по теме «Органическая химия», Грачев, Алексей Александрович

ВЫВОДЫ

1. На основании экспериментальных величин трансгликозидных констант зт спин-спинового взаимодеиствия 1СН и данных молекулярно-механических расчетов исследованы конформационные свойства олигофукозидов, построенных только из а-(1-»3)- или чередующихся а-(1->3)- и а-(1-»4)-связанных дисахаридных звеньев и отвечающих основным структурным фрагментам природных полисахаридов фукоиданов.

2. Показано, что конформации а-(1->3)-связанных дисахаридных фрагментов в изучаемых олигофукозидах зависят от их положения в олигосахаридной цепи, наличия сульфатных групп и разветвлений, в то время как конформации а-(1->4)-связанных фрагментов заметно изменяются только при введении в молекулы сульфатных групп.

3. Показано, что конформации внутренних дисахаридных фрагментов в исследованных олигосахаридах с числом фукозных звеньев от четырех и выше совпадают с конформациями соответствующих дисахаридных фрагментов фукоиданов.

4. Построены вторичные структуры фукоидановых цепей с гомо а-(1-»3)- или чередующимися а-(1-»3)- и а-(1-»4)-связями; выявлены особенности пространственной организации этих двух типов цепей.

5. Для исследуемых олигофукозидов определены экспериментальные эффекты

I 3 сульфатирования и гликозилирования в спектрах С ЯМР и изучена их взаимосвязь с конформационными характеристиками молекул.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ЯМР спектры олигофукозидов 1а-10б (10-15 мг) были зарегистрированы на приборе Bruker DRX-500, оснащенного програмным обеспечением XWINNMR 3,6 , также фирмы Bruker. Образцы для регистрации ЯМР-спектров были растворены в D20 (99.98% D, Merck, 0.5 мл) с использованием ацетона

1 1Ч

0.05%) в качестве внутреннего стандарта ( Н 2.225 м.д., С 31.45 м.д.). Температура экспериментов выбиралась так, чтобы сигнал остаточных протонов HOD в *Н ЯМР спектрах не перекрывался с сигналами протонов олигофукозидов. Спектры несульфатированных олигофукозидов (1а-10а) были зарегистрированы при ЗОЗК, спектры 2-0-сульфатированных олигофукозидов (16-96) - при температуре 298К, а спектры 4-0-сульфатированных олигофукозидов (1в-4в) - при температуре 307К. Для некоторых образцов были использованы специальные ампулы (Microtube Shigemi, Inc.), позволяющие уменьшить объем раствора образца и тем самым повысить чувствительность ЯМР экспериментов.

Отнесение сигналов в одномерных спектрах 'Н-ЯМР олигосахаридов проводили с использованием комбинации 2D gCOSY, gNOESY и TOCSY экспериментов, в то время как сигналы в спектрах 13С ЯМР были отнесены с применением 2D gHSQC и gJ-HMBC экспериментов.

Данные спектров !Н ЯМР целевых олигосахаридов 1а,в-10а приведены в Приложении 1. Данные спектров 13С ЯМР целевых олигосахаридов 1а,в-10а приведены в Приложении 2.

Экспериментальные величины неравновесных ЯЭО были измерены с применением градиентной методики 2D gNOESY. Для (1->3)-связанных олигофукозидов 1а-4в ширина спектрального окна составляла 1000 (±50) Гц на частоте резонанса ядер !Н (500 МГц) и не включала область резонанса ядер протонов метальных групп остатков фукозы. В случае олигофукозидов с чередующимися (1->3)- и (1->4)-связями 6а,б-10а ширина спектрального окна составляла 2500 (±50) Гц и включала область резонанса ядер протонов метальных групп. Время насыщения тт составляло 500 мс, релаксационная задержка tj - 3 с. В ходе экспериментов был использован градиент магнитного поля синусоидальной формы длительностью 1 мс и временем востановления 1 мс. Фурье-преобразование спектров проводилось с использованием в обоих измерениях 2D gNOESY спектра взвешивающей функции - квадратичного синуса, сдвинутого на л/2.

Экспериментальные величины Jc,h КССВ были измерены с помощью градиентной методики gJ-HMBC [48, 49] и методики J-resolved [45, 46]. 2D gJ-НМВС эксперимент регистрировался в режиме эхо/антиэхо. Эхо составляющая получалась за счет приложения двух синусоидальных градиентов поля с соотношением интенсивностей 5:-3, в то время как для антиэхо составляющей - соотношение было -3:5. Градиенты поля прикладывались в течение 1 мс, задержка для восстановления поля составляла 1 мс. Ширины спектральных окон составляли 1000 (±50) Гц для 'Н-региона и 4700 Гц для.13С региона и не включали область резонанса углеродов метальных групп остатков фукозы. Спектры были зарегистрированы с 60-80 tj инкрементами, при этом на каждый инкримент tj приходилось 500-700 прохождений. В течение времени регистрации собиралось 512 точек. Для получения достоверных величин КССВ предварительная задержка Ai в НМВС эксперименте должна составлять как минимум 60% инвертированной величины наименьшей КССВ, которую мы хотим измерить (Ai=0.6/Jc,hmiw) [49]. Коэффициент пропорциональности к, определяющий величину расщепления пиков, был равен 40-60. Релаксационная задержка составляла 1 с. Таким образом, полное время экспериментов составляло 10-15 ч. Для подавления расщеплений, обусловленных прямыми КССВ 'jc н, в J-HMBC эксперименте использовался трехступенчатый низкочастотный фильтр LPJF [49]. Диапазон подавляемых КССВ составлял 125-180 Гц. При этом в низкочастотный фильтр LPJF была встроена последовательность градиентов поля синусоидальной формы с соотношением интенсивностей +7:-4:-2:-1. Математическая обработка экспериментов включала линейное предсказание ССИ до 1024 точек в Fi измерении, что соответствует разрешению 5-6 Гц, и дополнение нулями до 1024 точек в F2 измерении, что соответствует разрешению 1 Гц. В качестве взвешивающих функций по обеим осям (Fj и F2) использовался квадратичный синус, сдвинутый на л/2.

J-resolved эксперименты проводились в режиме детектирования ядер С, для повышения чувствительности которых использовалась импульсная последовательность PENDANTE. Ширины спектральных окон составляли 4800 1 ^

Гц для С-измерения и 14 Гц для J-измерения. Спектры были оцифрованы с 44 ti-инкрементами, при этом на каждый инкремент приходилось 500-740 циклов накопления. 2048 точек регистрировалось в течение времени накопления Î2, что соответствовало разрешению 2.3 Гц в 13С-измерении. Релаксационная задержка между двумя циклами составляла 1 с. Таким образом, полное время экспериментов составляло 12-15 ч. Для селективной инверсии сигналов протонов использовался импульс гауссовой формы, его длительность составляла 20-50 мс, что соответствует диапазону облучения 50-20 Гц и отвечает требуемой селективности. Математическая обработка включала дополнение масива данных нулями до 128 точек в J-измерении, что соответствует разрешению 0,3 Гц. В качестве взвешивающих функций по обеим осям (Fj и F2) использовался квадратичный синус, сдвинутый на я/2.

Молекулярное моделирование было проведено с использованием программы TINKER со встроенным силовым полем ММЗ. Диэлектрическая константа 8 принималась равной 81. При этом влияние растворителя в расчетах в явном виде не учитывалось. Начальные структуры молекул, используемые для построения конформационных карт, получали геометрической оптимизацией с использованием силового поля ММЗ. Для построения каждой точки коиформационного пространства молекулы использовали одну и ту же начальную структуру, изменяя только значения торсионных углов ф и у при гликозидных связях. Подвижность торсионных связей задавалась силовой постоянной 10 ккал/градус . Конформационные карты были визуализованы с помощью программы SigmaPlot 4.0.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Грачев, Алексей Александрович, 2006 год

1. М. Ellouali, С. Boisson-Vidal, Р. Durand, J. Jozefonvicz, Anticancer Res., 1993,13, 2011.

2. H. Itoh, Н. Nöda, Н. Amano, С. Zhuang, Т. Mizuno, Н. Ito, Anticancer Res., 1993,13, 2045.

3. M.S. Pereira, В. Mulloy and P.A. Mourao, J. Biol. Chem., 1999,274, 7656.

4. T. Nagumo, T. Nishino, In: Polysaccharides in Medicinal Applications, S. Dumitriu Ed., Marcel Dekker: New York, 1996, 545.

5. M.E. Preobrazhenskaya, A.E. Berman, V.l. Mikhailov, N.A. Ushakova, A.V. Mazurov, A.V. Semenov, A.I. Usov, N.E. Nifant'ev, N.V. Bovin, Biochem. Molecul. Biol. Int., 1997, 43, 443.

6. C. Granert, J. Raud, A. Waage, L. Lindquist, Infect. Immun., 1999, 67, 2071.

7. L.A. Lasky, Science, 1992,258, 964.

8. M.O. McClure, J.P. Moore, D.F. Blanc, P. Scotting, G.M.W. Cook, R.J. Keynes, J.N. Weber, D. Davies, R.A. Weiss, AIDS Res. Hum. Retrovir., 1992, 8, 19.

9. M. D. Baba, D. Schols, R. Pauwels, H. Nakashima, E. De Clercq, J. AIDS, 1990,3,493.

10. G. F. Clark, S. Oehninger, L.K. Moen, FASEB J., 1992, 6,233.

11. A.I. Usov, G.P. Smirnova, M.I. Bilan, A.S. Shashkov, Bioorgan. Khim.,1998, 24,431.

12. A.O. Chizhov, A. Dell, H.R. Morris, S.M. Haslam, R.A. McDowell, A.S. Shashkov, N.E. Nifant'ev, E.A. Khatuntseva, A.I. Usov, Carbohydr. Res.,1999, 320, 108.

13. M. Nagaoka, H. Shibata, I. Kimura-Takagi, S. Hashimoto, K. Kimura, R. Aiyama, S. Ueyama, T. Yokokura, Glycoconjugate J., 1999,16, 19.

14. A.-C.Ribeiro, R.P.Vieira, P.A.S. Mourao, B. Mulloy, Carbohydr. Res., 1994, 255, 225.

15. A.-C. Vilela-Silva, A.-P. Alves, A.-P. Valente, V.D. Vacquier, P.A.S. Mourao ,Glycobiology, 1999, 9,927.

16. M.I. Bilan, A.A. Grachev, N.E. Ustuzhanina, A.S. Shashkov, N.E. Nifantiev, A.I. Usov, Carbohydr. Res., 2002, 337, 719.

17. M.I. Bilan, A.A. Grachev, N.E. Ustuzhanina, A.S. Shashkov, N.E. Nifantiev, A.I. Usov, Carbohydr. Res., 2004, 339, 511.

18. M.I. Bilan, A.A. Grachev, N.E. Ustuzhanina, A.S. Shashkov, N.E. Nifantiev, A.I. Usov, Carbohydr. Res., 2006, 341, 238.

19. L. Chevolot, A. Foucault, F. Chaubet, N. Kervarec, C. Sinquin, A.-M. Fisher, C. Boisson-Vidal, Carbohydr. Res. 1999, 319, 154.

20. A.C. Шашков, 13C ЯМР -спектроскопия углеводов, Диссертация. д-ра хим.наук, Москва, ИОХ АН СССР, 1983.

21. Г.М. Липкипд, Конформационный анализ углеводных цепей, Диссертация. д-ра хим.наук, Москва, ИОХ АН СССР, 1991.

22. R.U. Lemieux, К. Bock, L.T.J. Delbaere, S. Koto, V.S. Rao, Can. J. Chem., 1980, 58, 631.

23. H. Thogersen, R.U. Lemieux, К. Bock, B. Meyer, Can. J. Chem., 1982, 60, 44.

24. A.G. Gerbst, A.A. Grachev, N.E. Ustyuzhanina, E.A. Khatuntseva, D.E. Tsvetkov, A.I. Usov, A.S. Shashkov, M.E. Preobrazhenskaya, N.A. Ushakova, N.E. Nifantiev, Russ. J. Bioorg. Chem., 2004, 30(2), 137.

25. J.A. Schwarcs, A.S.Perlin, Can. J. Chem., 1972, 50, 3661.

26. F. Heatley, L. Akhter, R.T. Brown, J. Chem. Soc. Perkin II, 1980,919.

27. A.S. Shashkov, G.M. Lipkind, Y.A. Knirel, N.K. Kochetkov, Magn. Reson. Chem., 1988,26, 735.

28. D.M. Grant, B.V. Cheney, J. Am. Chem. Soc., 1967, 89(21), 5315.

29. J. Noggle, R.E. Schirmer, The nuclear Overhauser effect, New York, 1971.

30. Э. Дероум, Современные методы ЯМР для химических исследований, Москва, Мир, 1992.

31. Н.М. Сергеев, Спектроскопия ЯМР, Москва, Московский университет, 1981.

32. С. Bauer, R. Freeman, Т. Frenkiel, J. Keeler, A.J. Shaka, J. Magn. Res., 1984, 58, 442.

33. T.D.W. Claridge, High Resolution NMR Techniques in Organic Chemistry, Pergamon, 1999.

34. J.-R. Brisson, J.P. Carver, Biochemistry, 1984, 22, 1362.

35. S.R. Haseley, S.G. Wilkinson, Carbohydr. Res., 1998, 306, 257.

36. J. Jeener, B.H. Meier, P. Bachmann, R.R. Ernst, J. Chem. Phys., 1979, 71, 4546.

37. A.A. Bothner-By, R.L. Stephens, J. Lee, C.D. Warren, R.W. Jeanloz, J. Am. Chem. Soc., 1984,106, 811.

38. A. Bax, D.G. Davis, J. Magn. Res., 1985, 63, 207.

39. A. Bax, D.G. Davis, J. Magn. Reson., 1985, 65, 355.

40. M. Karplus, J. Chem. Phys., 1959, 30, 11.

41. M. Karplus, J. Am. Chem. Soc., 1963, 85, 2870.

42. J.A. Schwarcz, A.S. Perlin, Can. J. Chem., 1972, 50, 3667.43