Применение масс-спектрометрии для исследования водорастворимых полисахаридов бурых водорослей и продуктов их ферментативной трансформации тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Анастюк, Станислав Дмитриевич

• Анастюк, Станислав Дмитриевич
• кандидат химических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат химических наук Анастюк, Станислав Дмитриевич

1 ВВЕДЕНИЕ.

2 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

2.1 Современные методы масс-спектрометрии, применяемые для изучения олиго- и полисахаридов.

2.1.1 Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением (ИЭР МС).

2.1.1.1 Электрораспыление как метод перевода. ионов в газовую фазу из раствора.

2.1.1.2 История применения метода ионизации. электрораспылением в масс-спектрометрии.

2.1.1.4 Электрофоретический механизм формирования заряженных капель

2.1.1.5 Модели формирования ионов газовой фазы. из малых заряженных капель.

2.1.2 Масс-спектрометрия с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (МАЛДИ МС).

2.1.2.1 Процесс образования газофазных ионов с помощью МАЛДИ.

2.1.2.2 Матрицы, используемые в МАЛДИ МС.

2.1.2.3 Подготовка пробы.

2.1.2.4 Способы улучшения качества МАЛДИ МС анализа.

2.1.3 Применение МАЛДИ и ИЭР МС для анализа углеводов.

2.1.4 Тандемная масс-спектрометрия (МС/МС).

2.1.5 Масс-спектрометрическая фрагментация молекулярных ионов олигосахаридов.

2.1.5.1' Номенклатура, используемая для описания продуктов. масс-спектрометрической,фрагментации1.

2.1.5.2 Фрагментация протонированных молекул.

2.1.5.3 Фрагментация комплексов олигосахаридов катионами щелочных металлов.

2.1.5.4 Фрагментация депротонированных молекул.,.

2.2 Масс-спектрометрический анализ продуктов трансформации гликанов 29 2.2.1 МС-анализ продуктов ферментативной трансормации полисахаридов

2.2.2 МС-анализ продуктов химической деградации полисахаридов.

2.3 Водорастворимые полисахариды бурых водорослей.

2.3.1 Ламинараны.

2.3.2 Фукоиданы.

2.3.2.1 Фукоиданы, построенные в основном. из сульфатированной фукозы.

2.3.2.2 Фукоиданы с гетерогенным моносахаридным составом.

2.3.2.3 Гетерогенность структуры фукоиданов.

2.3.2.4 Методы исследования фукоиданов.

2.3.2.5 Фукоиданы и гепарин.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Применение масс-спектрометрии для исследования водорастворимых полисахаридов бурых водорослей и продуктов их ферментативной трансформации»

Полисахариды — одни из наиболее распространенных на Земле биополимеров. Они разнообразны по составу и физико-химическим свойствам, что проявляется в многообразии их свойств и функций. Полисахариды могут выполнять структурные функции (целлюлоза, глюканы клеточных стенок), функции резервных веществ (амилоза, парам ил он, ламинараны), водосохраняющие функции, присущие гелеобразующим полисахаридам (гликозаминогликаны и полисахариды водорослей), функции химического узнавания гликопротеинов, связанных с разными клетками.

Водорастворимые полисахариды бурых водорослей (фукоиданы, ламинараны) разнообразны по своей структуре и биологической активности. Фукоиданы -сульфатированные гетерополисахариды - проявляют иммуномодулирующее, антивирусное, противоопухолевое и антикоагулянтное действие, и в настоящее время на их основе разрабатываются биологически активные добавки и лекарственные средства. Интерес к (1—>3);(1—>6)-Р-Б-глюканам, к которым относятся ламинараны, связан с их влиянием на системы иммунитета растений и животных.

Несмотря иа широкую известность всех этих полисахаридов, имеются трудности с установлением их структуры, которые связаны, с тем, что состав и структурные характеристики полисахаридов зависят не только от вида водоросли, но и от сезона сбора, возраста и т.д. Кроме того, строение этих полисахаридов, особенно фукоиданов, отличается отсутствием регулярности и большим разнообразием.

Успешно применяемый в настоящее время подход к установлению структуры фукоиданов с помощью ЯМР-спектроскопии предполагает использование химической* модификации исходного полисахарида с целью упрощения его структуры. Из-за высокой лабильности молекул фукоидана выходы модифицированных препаратов часто невелики, откуда следует, что значительная> часть информации- о структуре полисахарида, включая информацию о. минорных элементах, .теряется:

Современные методы, масс-спектрометрии позволяют получать надежные и точные результаты, благодаря аналитической гибкости, высокой, чувствительности и селективности. Использование тандемной масс-спектрометрии и ферментов (О-гликозилгидролаз, лиаз, сульфатаз) с установленной специфичностью и механизмом действия позволяет устанавливать строение полисахаридов с уточнением положений минорных элементов. Ферментативная трансформация полисахаридов представляет большой интерес, так как позволяет с высоким выходом получать новые препараты с более разнообразной биологической активностью.

Целью работы является использование методов масс-спектрометрии для установления структурных особенностей водорастворимых полисахаридов бурых водорослей (фукоидана и ламинарана) и продуктов их ферментативной трансформации, а также изучение механизма действия и специфичности ферментов, участвующих в трансформации.

В диссертационной работе представлены данные о структурных характеристиках ламинаранов и продуктов их ферментативной трансформаци. Изучены каталитические свойства ферментов. Основное внимание уделено изучению структурных особенностей фукоиданов как наиболее перспективных веществ для создания БАД к пище и новых лекарственных препаратов на их основе. Разработан подход к исследованию структурных особенностей фукоиданов с помощью методов ИЭР и МАЛДИ масс-спектрометрии. В литературном обзоре освещены особенности современных методов масс-спектрометрии, применяемых для анализа гетерогенных смесей углеводов, приведена информация о механизмах масс-спектрометрической фрагментации, структурах и степени изученности полисахаридов бурых водорослей.

Список используемыхсокращений

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография;

ББА МС - масс-спектрометрия с бомбардировкой быстрыми атомами;

ИЭР МС — масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением;

МАЛДИ МС - масс-спектрометрия с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией;

ДИС - диссоциация, индуцированная столкновением;

МС/МС (МС2) - тандемная масс-спектрометрия;

DHB - 2,5-дигидроксибензойная кислота;

НССА - 4-гидрокси-а-цианокоричная кислота;

ТФУ - трифторуксусная кислота;

ЯМР - ядерный магнитный резонанс;

УФ — ультрафиолетовый дипазон

ИК - инфракрасный диапазон

AnGal - 3,6-Ь-ангидрогалактоза

ХС - хондроитинсульфат

ГХ - газовая хроматография

ГХ/МС - газовая хроматография/масс-спектрометрия

Благодарности

Автор искренне благодарит научного руководителя д.х.н., проф. Звягинцеву Татьяну Николаевну, сотрудников лаборатории химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН за помощь в работе и особенно Шевченко Н.М. за предоставленные образцы фукоиданов. Автор выражает признательность зав. лаборатории инструментальных и радиоизотопных методов к.х.н. Дмитренку П.С. за напутствия в работе и поддержку.

2 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Масс-спектрометрия представляет собой современную фундаментальную и прикладную физико-химическую область науки. В её задачу входит получение и накопление знаний о составе веществ, их структуре, физико-химических свойствах, а также происходящих с ними процессах. Именно эти знания позволили обеспечить и осуществить многие открытия и достижения 20-го века, наиболее яркими из которых являются обеспечение освоения ядерной энергии, развитие микроэлектроники; к ним можно добавить достижения в химии, биологии, фармакологии, открытие стабильных изотопов, фуллеренов и многое другое.

Метод масс-спектрометрии с помощью образования ионов из нейтрального вещества, разделения их по массам и детектирования дает богатейшую информацию об окружающем мире. Масс-спектрометрия — естественный, многосторонний и эффективный комплекс методов определения состава вещества, исследования различных ядерных, атомных, плазменных, физико-химических, биологических, геологических и технологических процессов. Она успешно дополняет, конкурирует и часто превосходит другие методы физико-химического анализа по широте и комплексности подхода, чувствительности, скорости и точности измерений.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Анастюк, Станислав Дмитриевич

5 ВЫВОДЫ

1) Впервые сочетанием масс-спектрометрических методов были исследованы особенности структур новых фукоиданов из бурых водорослей L. gurjanovae и С. costata, определен структурный статус минорных моносахаридов в фукоидане из F. evanescens.

2) Методом МАЛДИ масс-спектрометрии было подтверждено, что ферменты LV из М. yessoensis и G-I из L. kurila являются эндо-( 1 —>3)-Р-0-глюканазами: в продуктах реакции помимо глюкозы обнаружены олигосахариды G1c2-G1c13. Показано, что исследуемые ферменты проявляли трансгликозилирующую активность: в присутствии метилглюко- и ксилозидов, а также метанола были получены метилолигозиды с п=2-7. Установлено, что метил гликоз иды наиболее предпочтительны в качестве акцепторов.

3) Методом МАЛДИ МС было установлено истинное молекулярно-массовое распределение ламинаранов из L. gurjanovae (G1c2i-G1c36) и L. cichorioides (Glc23-Glc33), метод гель-проникающей хроматографии давал завышение молекулярной массы в случае ламинарана из L. gurjanovae примерно в 5 раз.

4) Впервые с целью получения доступных для МС-анализа олигосахаридов, для деградации фукоиданов были применены сольволитическое десульфатирование и автогидролиз. С помощью МАЛДИ и тандемной ИЭР МС показано, что в условиях сольволиза фукоиданы деполимеризуются до моносульфатированных олигомеров с сохранением минорных включений, МС-методы позволили установить типы гликозидных связей в олигомерах и положение сульфатных групп. Применение автогидролиза привело к получению мультисульфатированных фукоолигомеров, но при этом терялась информация о структуре минорных включений. Эти методы деградации не приемлемы для низкосульфатированных фукоиданов.

5) Впервые применив метода МАЛДИ МС позволило установить, что фукоидан из L. gurjanovae представляет собой галактофукан блочного строения, поскольку в продуктах его деградации обнаружены фуко-, галакто- и смешанные фукогалактоолигосахариды. С помощью тандемной ИЭР МС установлено, что остатки фукозы соединены (1—»3)-гликозидпыми связями и сульфатировапы, равно как и остатки галактозы, при С-2 и С-4.

6) Анализ с помощью тандемной ИЭР МС продуктов кислотного гидролиза нового фукоидана из С. costata, основная цепь молекулы которого представлена манноглюкуронофуканом, позволил получить информацию о структуре фрагментов разветвлений: Fuc4S03"-(l—»4)-Fuc, Fuc2S03"-(l—>4)-Fuc, Fuc-( 1 ->4)-Fuc2S03\ Fuc-(l->4)-GlcA, Gal-(l->4)-GlcA, Gal-(l->3)-GlcA, Gal-(l-»4)-Fuc2S03\ Fuc-(l-»4)-Gal2S03", Gal2S03"-(l->2)-Gal, Gal4S03'-(l->4)-Gal.

7) Анализ с помощью тандемной ИЭР МС продуктов деградации фукоидана из L. cichorioides подтвердил, что этот фукоидан является высокосульфатированным (1 —»3)-а-Ь-фуканом.

8) С помощью тандемной ИЭР МС в продуктах деградации фукоидана из F. evanescens были впервые обнаружены фрагменты, содержащие минорные моносахариды Xyl, Gal, GlcA, входящие в его состав, и установлена структура содержащих их олигомеров: Xyl-(l-»4)-Fuc, Gal-(l-»4)-Fuc, Gal-(l-»4)-GaI-(l-»4)-Fuc, Gal-(l->4)-Gal, GIcA-(l^-2)-Fuc, Fuc-(l->3)-GIcA, Fuc-(l->4)-Fuc-(1—>3)-GlcA, Fuc-(l-»3)-Fuc(l-»4)-Fuc-(l-»3)-GlcA. Показано, что остатки Fuc, Xyl и Gal 2-О-сульфатированы со следами 4-О-сульфатирования. Олигосахариды, содержащие GlcA, несульфатированы.

9) Показано, что в МС/МС-спектрах сульфатированных олигомеров со свободной гидроксильной группой при С-4 соотношение интенсивностей фрагментных ионов °'2Х и 0,3Х зависит от позиции сульфатной группы (С-2 или С-3). При 2

П 9

О-сульфатировании интенсивность иона фрагмента ' X снижается. При отсутствии сульфата в указанных положениях ионы ^Х не образуются. Это позволило точно локализовать положение сульфатных групп.

3.2.5 Заключение

В процессе выполнения работы с помощью масс-спектрометрического анализа нами были исследованы структурные особенности фукоиданов из четырех видов бурых водорослей: L. gurjanovae, F. evanescens, L. cichorioides и С. costata.

Для получения олигосахаридов, пригодных к масс-спектрометрическому анализу, исходные фукоиданы были деполимеризованы различными методами: сольволитическим десульфатированием, частичным кислотным гидролизом и автогидролизом.

Впервые, с помощью химических и физико-химических методов было показано, что фукоидан из L. gurjanovae представляет собой сульфатированный и частично ацетилированный галактофукан блочного строения [142]. Фукоидан из L. gurjanovae был деполимеризован в условиях сольволитического десульфатирования и частичного кислотного гидролиза. С помощью МАЛДИ масс-спектрометрии среди, низкомолекулярных продуктов деполимеризации кроме моносахаридов a-L-фукозы [Fuc+Na]+ и [FucS03]" были обнаружены нейтральные фукоолигосахариды: [Fucn+Na]+, n=2-l 1, сульфатированные фукоолигосахариды [FucnS03]~,n=2-l 1, а также смешанные олигосахариды: [Fucn.mGalra+Na]+, п=4-6, m=l-3; [FucnmGalmS03]",n=3-6, т=1-2. Обнаружение смешанных олигосахаридов свидетельствует о блочном строении фукоидана. В среднем на 5 остатков фукозы приходится 2-3 остатка D-галактозы. Протяженность блоков, построенных из a-L-фукозы, составляет не менее 11 остатков. Анализ продуктов частичного кислотного гидролиза фукоидана с помощью МАЛДИ МС показал, что среди полученных олигосахаридов преобладали галактозосодержащие [Galn+Na]+, n=2-5, [GalnS03]", п=2-3, причем a-L-фукоза в смеси была найдена только в виде ионов мономеров [Fuc+Na]+ и [FuC[S03]" а также в составе иона [FuciGaliS03]. Отсюда следует, что, как уже известно, в условиях кислотного гидролиза более лабильными являются гликозидные связи между моносахаридными остатками дезоксигексозы (a-L-фукозы). При этом размер максимального блока, построенного из D-галактозы равен пяти, что близко к результатам исследования продуктов сольволитического десульфатирования где п=3.

Дальнейшее исследование с применением тандемной масс-спектрометрии с электрораспылительной ионизацией позволило установить структурные особенности фрагментов [FucnSC>3]", п=1-3. Было показано, что остатки a-L-фукозы связаны в основном (1—>-3)-связыо и 2-О-сульфатированы со следами 4-О-сульфатирования. Остатки D-галактозы также могут быть как 2-0-, так и 4-О-сульфатированы. К сожалению, информацию о типе связи между a-L-фукозой и D-галактозой извлечь не удалось из-за деградации исследуемой смеси олигосахаридов в процессе хранения. Можно предположить, что блоки, построенные из галактозы, связаны (1—»4)-связью с фукозной цепью, поскольку известно, что (1—»4)-связь менее устойчива, чем (1—>3)-связь, которая по данным ИЭР МС/МС преобладает в фукозной цепи. Исследуемый фукоидан отличается от аналогичных полисахаридов, выделенных из других видов семейства ламинарневых, которые представляют собой сульфатированные (1—>3)-а-L-фуканы [123, 147], хотя повышенное содержание D-галактозы отмечалось для фукоиданов из L. japonica [145] и L. cichorioides [146].

Фукоидан из F. evanescens, бурой водоросли рода Fucales, по одним данным представлял линейную цепь с чередующимися 3- и 4-связанными остатками a-L-Fucp, сульфатированными в> пололоженни 2. Дополнительная сульфатная группа могла находиться в положении С-4 некоторых (1 —>-3)-связанных остатков фукозы [108], сульфатированных в пололожении 2. По другим данным из F. evanescens была выделена фракция фукоидана с преобладанием (1—>-3)-связанных остатков фукозы над (1—>-4)-связанными примерно в 3.5 раза [107].

Для деполимеризации выделенного из F. evanescens по методу [107] фукоидана были применены условия сольволитического десульфатирования. В результате был получен набор олигосахаридов со степенью полимеризации? до 6. Согласно данным масс-спектрометрического анализа [144], этот фукоидан, содержал протяженные участки, построенные из (1—»3)-связанных остатков. a-L-Fucp (до трех, и, возможно, более), сульфатированных в основном в положении С-2. Впервые в фукоидане нами были найдены олигосахариды, содержащие D-глюкуроновую кислоту. Для этих фрагментов было отмечено чередование 3- и 4-связанных остатков a-L-Fucp. Таким образом, полученные данные [144] находятся в соответствии с результатами предыдущих исследований [107]. Кроме того, нами впервые было показано, что остатки D-ксилозы и D-галактозы, обнаруженных ранее в моносахаридном составе фукоидана из F. evanescens в минорных количествах, включены в цепь. Остаток D-ксилозы в основном 2-0-сульфатирован и может быть связан (1-»4)-связью с остатками a-L-Fucp. Остатки 2-0-сульфатированной D-галактозы (до двух) между собой могут быть связаны (1-»4)- или (1-»3)-связями, а с остатками a-L-Fucp - (1-»4)-связью. Наличие (3-(1-»4)-связанных остатков D-ксилозы (до шести), входящих в основную цепь фукоидана, было показано ранее только для бурой водоросли Fucus serratus [110].

Фукоидан из L. cichorioides ранее был исследован авторами работ [145, 146]. Полученные нами данные согласуются с результатами, опубликованными в работе [145], согласно которым исследуемый фукоидан представляет собой высокосульфатированный (1->3)-а-Ь-фукан, но находятся в противоречии с данными, полученными в работе [146], согласно которым фукоидан из L. cichorioides представляет собой галактофукан (L-Fuc:Gal~2:l), остатки a-L-фукозы в котором (1->4)-связаны и 2,3-О-дисульфатированы. В условиях автогидролиза, впервые примененного нами для деградации фукоиданов, были получены сульфатированные и нейтральные фукоолигосахариды с максимальной степенью» полимеризации п до 7. Результаты анализа сульфатированной a-L-фукозы и фукоолигосахаридов с п=2-3 с помощью ИЭР МС/МС показали следующее: остатки 2-0- и 4-О-сульфатированной a-L-фукозы были соединены в основном (1—>3)-связями. Содержание (1—Несвязанных остатков a-L-фукозы было незначительным. Остатки гексозы были найдены среди смешанных олигосахаридов [FucnHexi+Na]+, п=2-5 при ИЭР МС анализе состава нейтральных олигосахаридов. Данные о сульфатировании остатков гексозы и типе связи их с фукозной цепью не были получены, так как в продуктах отсутствовали необходимые сульфатированные фрагменты. Предположительно, по аналогии с фукоиданом из L. gurjanovae, остатки гексозы связаны (1—>4)-связью, которая'наиболее легко расщепляется в условиях автогидролиза, как было показано для каррагинанов [81].

Фукоидан из бурой, водоросли С. costata, исследованный нами впервые, содержал, помимо фукозы, большое количество глюкуроновой кислоты, гексоз, и был слабосульфатирован. Как известно из литературы [118], фукоидан с таким моносахаридным составом может иметь основную цепь, состоящую из блоков, построенных из D-глюкуроновая кислоты и D-маннозы, с разветвлениями в виде коротких цепей, состоящих из остатков сульфатированной a-L-фукозы и D-галактозы. Все три метода деполимеризации - автогидролиз, сольволитическое десульфатирование и частичный гидролиз - были использованы для получения олигосахаридов, пригодных к масс-спектрометрическому анализу. Только один из примененных методов деградации (кислотный гидродиз 1 Н ТФУ, 60 минут) оказался достаточно эффективным. Стоит отметить, что условия кислотного гидролиза, примененные для фукоидана из С. costata были более жесткие, чем для фукоидана из L. gurjanovae. При кислотном гидролизе фукоидана из С. costata кроме олигосахаридной была получена полисахаридная фракция, анализ моносахаридного состава которой (см. раздел 4.3.1) показал, что ее основными компонентами являются d-глюкуроновая кислота, D-мапноза и a-L-фукоза. Низкую эффективность деградации фукоидана автогидролизом и сольволитическим десульфатированием можно объяснить относительно небольшим количеством сульфатных групп, а также высокой стабильностью гликозидной связи в блоке уроновая кислота-гексоза [118]. Масс-спектрометрическин анализ низкомолекулярных продуктов кислотного гидролиза показал, что степень полимеризации наблюдаемых олигосахаридов непревышала двух, что связано с жесткими условиями кислотного гидролиза. Остатки a-L-фукозы в найденных фукоолигосахаридах были 2-0- или 4-О-сульфатированы и связаны (1—»4)-связью. Остатки D-галактозы в основном 4-О-сульфатированы и связаны с фукозой (1—»4)-связью и (1—>2)- или (1—»4)-связью между собой. Необходимо уточнить, что 4-О-сульфатирование отмечено в основном для остатков Сахаров на невосстанавливающем конце. Остатки D-ксилозы, содержащиеся в фукоидане в минорном количестве, не сульфатированы и найдены во фрагментах, содержащих a-L-фукозу. Фрагменты, содержащие a-L-фукозу и D-глюкуроновую кислоту на восстанавливающем конце, связаны (1—»4)-связью и не сульфатированы. Фрагменты Gal-(l-»4)-GlcA, Gal-(l-»3)-GlcA были также найдены в. исследуемом фукоидане. Возможно, бурая водоросль С. costata синтезирует два разных типа фукоиданов, как описано для Sargassum stenofilum [121] в разделе 2.3.2.3.

При интерпретации тандемных масс-спектров сульфатированных олигосахаридов в основном были использованы результаты работ [66] и [80]. Тем не менее, в процессе выполнения диссертационной работы были сделаны следующие

О 3 уточнения: механизм формирования фрагментов ' X, наблюдаемых во всех сульфатированных фукоолигосахаридах, по-видимому, требует наличия сульфатной группы в положениях С-3 [66] или С-2 [80], поскольку подобные сигналы не наблюдались в МС/МС спектрах олигосахаридов, содержащих уроновую кислоту на ft О восстанавливающем конце [144]. На интенсивность сигналов ' X в случае замещения гликозидного гидроксила влияет также наличие сульфатной группы в положении С-2, 02 так как сигналы ' X в случае с вышеуказанными фукоуронидными фрагментами имели более высокую интенсивность, чем в случае с сульфатированными фукоолигосахаридами. Таким образом, при наличии замещенного атома водорода гликозидного гидроксила, механизм образования вышеуказанного иона °'2Х для олигосахаридов отличается от предложенного ранее [65, 66] для сульфатированных моносахаридов. Это наблюдение позволяет точнее локализовать положение сульфатной группы по соотношению пнтенсивностей фрагментов °'2Х и °'3Х.

Фукоиданы различного строения представляют несомненный интерес для сравнительного исследования проявляемой ими разнообразной биологической активности. Установление строения полисахарида с уточнением положений минорных компонентов является важной задачей, так как имеется ряд примеров, где показано, что за биологическую активность отвечает определенный структурный элемент его молекулы. Так, антикоагулянтную активность гепарина связывают с уникальным пентасахаридным фрагментом, который составляет менее 30% от всей молекулы [129]. Изучение структуры гетерополисахаридов будет продолжено с использованием более эффективных методов хроматографии и с привлечением химических, физико-химических и энзиматических методов структурного анализа.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 4.1 Материалы и оборудование

Реагенты и материалы. Этанол, метанол, неорганические соли и кислоты — коммерческие препараты производства «Реахим» (Россия). ДЕАЕ-целлюлоза, декстраны (Молекулярные массы 10, 20, 40, 80 кДа), метил-Р-О-глюко- и ксилопиранозиды - препараты фирмы «Sigma» (США).

Ламинаран LeL из бурой водоросли Laminaria cichorioides был получен по методике, описанной ранее [148].

Фракция ламинарапа LgLl из бурой водоросли L. gurjanovae, нерастворимая в холодной воде была получена в процессе концентрирования водного раствора ламинарана (LgL) и охлаждения концентрата до 4°С [142]. Растворимая при комнатной температуре фракция ламинарана LgL2 была также получена по методике, описанной в работе [142].

Фракции фукоиданов LeF2 и FeF2'из бурых водорослей L. cichorioides и F. evanescens были получены по методикам, описанным ранее. Моносахаридный состав-фракции LeF2 (мольнып%): Fuc—81%, Xyl—2%, Rha— 8%, Glc—3%, Man—2%, Gal—4% по данным ВЭЖХ [145]. Моносахаридный состав фракции FeF2 (мольный%): Fuc—93%, Xyl—2.8%, Man—0.2%, Gal—4% по данным ВЭЖХ [107].

Фракция фукоидана LgF2 была получена из бурой водоросли L. gurjanovae по методу, описанному в работе [142]. Моносахаридный состав (мольный%): Fuc— 48.2%, Xyl—3.1%, Man—1.5%, Gal—45.5% по данным ВЭЖХ.

Фракция фукоидана CcF2 из бурой водоросли Costaria costata была получена с помощью анионнообенной хроматографии' (см. методы). Моносахаридный состав (мольный %): Fuc—39.7%, Xyl—11.6%, Gal—21.4%, Man—12.0%, GlcA—7.5% поданным ГЖХ ацетатов полиолов.

МАЛДИ масс-спектры регистрировали на времяпролетном масс-спектрометре «BIFLEX III» (Brukcr, Германия), оснащенном азотным, лазером (337 нм) с частотой импульса в 4 Гц и шириной импульса 3 не. Масс-спектрометр использовали в режиме рефлектора и с экстракцией ионов с задержкой.

ИЭР масс-спектры регистрировали на тандемном квадрупольно-времяпролетном масс-спектрометре «6510 LC-QTOF» (Agilent, США) с двойным ИЭР источником.

Моносахаридный состав определяли на углеводном анализаторе IC-5000 Biotronik (Германия) па колонке Shim-pack ISA-07/S2504 (0.4x25см), калий-боратный буфер, скорость элюции 0.6 мл/мин, обнаружение проводили бицинхонинатным методом; интегрирующая система Shimadzu С - R2 АХ. Моносахариды (Rha, Rib, Man, Fuc, Gal, Xyl, Glc) использовали как стандарты.

ГЖХ анализ ацетатов полиолов. Газо-жидкостная хроматография была выполнена с помощью хроматографа Hewlett-Packard 6850 (США) на HP-5MS капиллярной колонке (30 м х 0.4 мм) с использованием температурного градиента от 150 до 230 °С со скоростью 3 °С/мин. Образцы моносахаридов использовали в качестве стандартов.

ИК-спектры полисахаридов регистрировали в таблетках КВг на спектрометре Carl Zeiss IR-75 (Германия).

Молекулярную, массу полисахаридов, определяли методом гель-фильтрации на колонке (1.5x30 см) с Superdex 75 HR 10/30 или Superose 6 HR 10/30 (American Pharmacia Biotech AB). Элюцию проводили 0.05 M фосфатным буфером рН 7.2, содержащим 0.15 М NaCl. Скорость элюции 0.2 мл/мин. Фракции (0.5 мл) анализировали на присутствие углеводов по реакции с фенолом и серной кислотой [149]. В качестве стандартов использовали декстраны (М 10, 20, 40 и 80 кДа для Superdex 75 HR 10/30 и М40, 80 и 200-300 кДа для Superose 6 HR 10/30).

ВЭЖХ выполняли с помощью жидкостного хроматографа Agilent 1100 (США) с рефрактометрическим детектором на колонке Silasorb CJ8 (24x250 мм);

Сверхчистую воду получали с помощью оборудования Direct-Q (Millipore,

США)

4.2 Мётоды

Получение водорастворимых полисахаридов из бурой водоросли Costaria costata. Обезжиренную водоросль (50 г) измельчали до размера частиц не более 1мм, дважды в течение 3 ч экстрагировали 0.05 М раствором соляной кислоты при рН 2.0

2.3 и температуре 20°С (гидромодуль 1:20). Экстракты объединяли, концентрировали до 1/5 объема, нейтрализовали 3 % водным раствором NaHC03 (до рН 5.7), диализовали против 10 объемов дистиллированной воды 48 ч, лиофильно сушили. Сухой препарат растворяли в дистиллированной воде, не растворившийся осадок отделяли центрифугированием (Eppendorf Centrifuge (США) 5804 R, Т=15°С, t=10MHH, У=6500об/мин). Супернатант лиофильно сушили. Получали фракцию полисахаридов СсЭ-1 - 270мг (выход 0.4% от веса сухой водоросли).

Анионообменная хроматография. Раствор полисахарида СсЭ-1 в 0.1 М NaCl (1.9 г в 50 мл) наносили на колонку (3 х 21 см) с DEAE-целлюлозой в СГ-форме, уравновешенную с 0.1 М NaCl. Колонку промывали 0.01Н НС1, сорбированные полисахариды элюировали ступенчатым градиентом NaCl (0.5 М, 1.5 М, 2.0 М). Скорость элюции 1 мл/мин. Собирали фракции по 9 мл, присутствие полисахаридов анализировали фенол-сернокислотным методом [149]. Фракции упаривали, диализовали ультрафильтрацией на мембране NMWL 1000 (Millipore, США) путем последовательного разбавления, затем лиофилизовали. Получали 350 мг препарата CcF0.5, 320 мг препарата CcFl и 250мг препарата CcF2.

Кислотный гидролиз полисахаридов из L. gurjanovae (для определения моносахаридного состава с помощью ВЭЖХ). Раствор 5 мг вещества в 500 мкл 2 N трифторуксусной кислоты нагревали 8 ч при 100°С. После гидролиза смесь нейтрализовали, кислоту отгоняли на роторном испарителе три раза с метанолом.

Автогидролиз полисахаридов. Водный раствор фукоидана (10 мг/мл, в Н-форме, рН 2.0) оставляли при комнатной температуре на 3 сут. После гидролиза смесь нейтрализовали раствором NH.|OH до рН 6.0.

Для. удаления сульфатных групп использовалось сольволитическое десульфатирование (нагревание пиридиниевой соли полисахарида. в диметилсульфоксиде с добавкой метанола) [126]. По окончании реакции* смесь разбавляли водой, дважды лиофилизовали для удаления диметилсульфоксида.

Определение содержания* углеводов в выделенных образцах и фракциях проводили колориметрически по реакции с фенолом и серной кислотой [149]. Молекулярно-массовое распределение ламинарана из L. cichorioides (1-7 кДа), I растворимого» ламинарана из L. gurjanovae (1.3 - 11 кДа), низкомолекулярных продуктов десульфатирования фукоидана из L .gurjanovae (187 Да - 1.7 кДа) и F. evanescens (187 - 917 Да) определяли e помощью МАЛДИ масс-спектрометрии. Молекулярно массовое распределение продуктов автогидролиза фукоидана из L. cichorioides (187 - 1063Да), фракции FE-AF1 F. evanescens (229 - 681 Да), продуктов кислотного гидролиза фукоидана из С. costata (187 - 1063 Да) определяли с помощью масс-спектрометрии с электрораспылительной ионизацией.

Моносахаридный состав фракции FE-AF1 был определен после гидролиза 2М ТФУ 4ч при 105 °С с последующим восстановлением в воде с NaBD4 (ночь) при комнатной температуре и ацетилированием [150]. Для определения уроновых кислот гидролизаты упарены с IN НС1 5 раз для конверсии уроиовой кислоты в уроно-1,4-лактон, который был восстановлен NaBD4 с последующим ацетилированием [151].

Содержание сульфатных групп в полисахаридах определяли титриметрическим методом [152].

Дезацетилированне проводили обработкой полисахаридов водным раствором аммиака [112].

4:3.1 Получение олигосахаридов для масс-спектрометрического анализа

Получение олигосахаридов из фукоидана L. cichorioides автогидпдролизом.

Исходный фукоидан (LcF2, 9г) был деполимеризован в условиях автогидролиза. После нейтрализации и ультрафильтрации па мембране Millipore (1 кДа) были получены низкомолекулярная и высокомолекулярная фракции. Выход последней составил 0.33 г. Низкомолекулярная фракция была экстрагирована 95% ЕЮН (15 мин, 60°С). Осадок составил 3.8 г (Lc-AHH), супернатант лиофильно высушили и получили фракцию Lc-AHL с выходом 2;39 г. Подфракцию Lc-AHL использовали для анализа МАЛДИ и ИЭР МС/МС.

Получение олигосахаридов из фукоидана L. gurjanovae в процессе сольволитического i десульфатирования. Дезацетилированный фукоидан (LgF2) был деполимеризован, в условиях сольволитического десульфатирования-(см. выше). Этанольный экстракт продуктов десульфатирования (LgF2-DS) использовали для анализа методом МАЛДИ МС и ИЭР МС/МС.

Получение олигосахаридов из фукоидана L. gurjanovae частичным кислотным гидролизом. Дезацетилированный препарат LgF2 подвергали частичному кислотному гидролизу (0.2 Н ТФУ, Зч, 60°С). После нейтрализации полученный гидролизат (LgF2-H180) анализировали методом МАЛДИ МС.

Получение олигосахаридов из фукоидана F. evanescens в процессе сольволнтического десульфатирования. Дезацетилированный фукоидан FeF2 (100 мг) был деполимеризован условиях сольволнтического десульфатирования (см выше). Выход эганольного экстракта (Fe-DSlmf) составил 60 мг. Этот экстракт был проанализирован методом МАЛДИ МС. Далее, с помощью ВЭЖХ (хроматограф Agilent 1100, скорость потока - 4.8 мл/мин, 60°С, изократический режим, в воде) из него была выделена сульфатированная фракция Fe-AF1 с выходом 4 мг, которую анализировали методом ИЭР МС/МС. Моносахаридный состав данной фракции (мольный %): Fuc—72.8%, Xyl—5.2%, Gal—4.6%, GlcA—17.4% по данным ГЖХ ацетатов полиолов.

Получение олигосахаридов из фукоидана С. costata частичным кислотным гидролизом. Дезацетилированный фукоидан CcF2 подвергали гидролизу в течение 10, 20, 40 и 60 мин 1FI ТФУ при 100°С. После нейтрализации* продукты гидролиза экстрагировали метанолом и супернатант анализировали методом МАЛДИ МС (данные не приведены). Гидролизат CcF2-H60, содержащий, наибольшее количество олигосахаридов (60 минут гидролиза), анализировали методом ИЭР МС/МС. Моносахаридный состав фракции CcF2-H60 (мольный %): Fuc—76.5%, Xyl—1.3%, Rha—1.4%, Gal—20.2, Man—0.6% по данным ГЖХ ацетатов полиолов. Моносахаридный состав осадка гидролизата (60 минут), не растворившегося в метаноле (мольный %): Fuc—56.6%,Man—17.3%, GlcA—13.6%, Glc—12.5.

4.3.2 Получение ламинариолигосахаридов

Гидролиз ламинарана из L. cichorioides под действием эндо-(1—>3)-P-D-глюканазы из Mizuhopecten yessoensis. Ламинаран (2 мг) растворяли в 1 мл ацетатного буфера (буфер А, рН 4.5), содержащего 1 х 10"2 U фермента. Смесь инкубировали 60 мин. при 37°С. Реакцию останавливали кипячением. Продукты ферментативного гидролиза анализировали методом МАЛДИ МС.

Гидролиз ламинарана из L. cichorioides под действием эндо-(1—>3)-P-D-глюканазы из брюхоногого моллюска Littorina kurila. Ламинаран (2 мг) растворяли в 1 мл буфера А, содержащего 1 х 10"2U фермента. Смесь инкубировали 60 мин. при 37°С. Реакцию останавливали кипячением. Продукты ферментативного гидролиза анализировали методом МАЛДИ МС.

4.3.3 Получение ламинариолигозидов реакцией трансгликозилирования

Трансформация ламинарана из L. cichorioides под действием эндо-(1—>3)-(3-D-глюканазы из Mizuhopecten yessoensis в присутствии акцептора. Ламинаран (2 мг) и метил-P-D-глюкопиранозид (2 мг) растворяли в 1 мл 0.05М ацетатного буфера (рН 4.5) , содержащего 10"2 U фермента. Смесь инкубировали 5 мин при 37°С. Реакцию останавливали кипячением. Продукты трансгликозилирования1 анализировали методом МАЛДИ МС.

Трансформация ламинарана из L. cichorioides под действием эндо-(1—>3)-(3-D-глюканазы из Littorina kurila в присутствии различных акцепторов. Ламинаран (2 мг) и метил-Р-О-глюкопиранозид (или метил-p-D-ксилопиранозид (2 мг) или 20% метанол) растворяли в 1 мл 0.05М ацетатного буфера (рН 5.4) , содержащего 10"2 U фермента. Смесь инкубировали 10, 20, 30 мин. при 37°С. Реакцию останавливали кипячением в течение трех минут. Продукты трансгликозилирования анализировали методом МАЛДИ МС.

4.3.4 Анализ поли- и олигосахаридов с помощью МАЛДИ МС

МАЛДИ масс-спектры были записаны при ускоряющем напряжении в 19*кВ. В режиме регистрации положительных ионов использовали 50% раствор одномолярной 2,5-дигндроксибензойной кислоты (DHB) в смеси ацетонитрил/вода (1:1). В режиме регистрации отрицательных ионов в качестве матрицы использовали раствор фенилозазона Б-эрширо-пентозы (арабиноозазона), 10 мг/мл в метаноле [92]. Растворы матриц наносили на мишень в первую очередь в количестве 1 мкл и высушивали в потоке воздуха. Водные растворы исследуемых веществ (~1 мг/мл. для олигосахаридов и ~3 мг/мл для ламинаранов) наносили на мишень в количестве 1 мкл, после чего мишень высушивали в потоке воздуха. Для улучшения качества спектров применяли перекристаллизацию смеси вещество/матрица непосредственно на мишени с помощью метанола. Масс-спектры получены с использованием внешней калибровки по пику ангиотензина-П (Sigma) и пикам матрицы.

4.3.5 Анализ олигосахаридов с помощью ИЭР МС

ИЭР масс-спектры были получены при напряжении иглы в 4 кВ в отрицательном и 3.5 кВ в положительном режимах регистрации при температуре осушающего газа 325 °С и напряжении фрагментора 243 В. Пробоподготовка: сухой образец разбавляли в смеси ацетонитрил/вода (1:1) до получения концентрации -0.01 мг/мл и вводили полученный раствор с помощью шприцевого насоса (KD Scientific, США) со скоростью потока 5 мкл/мин. Калибровку проводили с помощью стандартной калибровочной смеси «HP MIX».

4.3.6 Анализ олигосахаридов с помощью ИЭР МС/МС

В тандсмпом режиме энергия столкновитсльной диссоциации выбиралась из промежутка 10-30 В по интенсивности фрагментных ионов. В качестве столкновительного газа применялся аргон.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Анастюк, Станислав Дмитриевич, 2009 год

1. Yamashita М., Fenn J. В. Negative-Ion Production with the Electrospray Ion-Source. // J. Phys. Chem. 1984. V. 88. N. 20. P. 4671-4675.

2. Aleksandrov M. L., Gall L. N., Krasnov N. V., Nikolaev V. I., Pavlenko V. A., Shkurov V. A. Mechanism of Ion Formation during the Electrohydrodynamic Sputtering of a Liquid into a Vacuum. // J. Anal. Chem-Ussr. 1984. V. 39. N. 9. P. 1268-1274.

3. Rollgen F. W., Bramer-Weigner E., Buttering L. J. // J. Phys Colloq. 1984. V. 45, Supplement 12. P. C9-297.

4. Schmelzeisen-Redeker G., Buttering L. J., Rollgen F. W. Desolvation of ions and molecules in thermospray mass spectrometry // Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes. 1989. V. 90. N. 2. P. 139-150.

5. Hillenkamp F., Karas M. Mass-Spectrometry of Peptides and Proteins by Matrix-Assisted Ultraviolet-Laser Desorption Ionization. // Methods in Enzymol. 1990. V. 193. P. 280-295.

6. Karas M., Hillenkamp F. Laser Desorption Ionization of Proteins with Molecular Masses Exceeding 10000 Daltons. // Anal. Chem. 1988. V. 60. N. 20. P. 2299-2301.

7. Stump M. J., Fleming R. C., Gong W. H., Jaber A. J., Jones J. J., Surber C. W., Wilkins C. L. Matrix-assisted laser desorption mass spectrometry. // Applied Spectroscopy Reviews. 2002. V. 37. N. 3. P. 275-303.

8. Chen X. J., Carroll J. A., Beavis R. C. Near-ultraviolet-induced matrix-assisted laser desorption/ionization as a function of wavelength. // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1998. V. 9. N. 9. P. 885-891.

9. Knochenmuss R. A quantitative model of ultraviolet matrix-assisted laser desorption/ionization. // J. Mass Spectrom. 2002. V. 37. N. 8. P. 867-877.

10. Dreisewerd K. The desorption process in MALDI. // Chem. Reviews. 2003. V. 103. N. 2. P. 395-425.

11. Karas M., Kruger R. Ion formation in MALDI: The cluster ionization mechanism. // Chem. Reviews. 2003. V. 103. N. 2. P. 427-439.

12. Zenobi R., Knochenmuss R. Ion formation in MALDI mass spectrometry. // Mass Spectrom. Reviews. 1998'. V. 17. N. 5. P. 337-366.

13. Knochenmuss R., Zenobi R. MALDI ionization: The role of in-plume processes. // Chem. Reviews. 2003. V. 103. N. 2. P. 441-452.

14. Spengler В., Cotter R. J. Ultraviolet-Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry of Proteins above 100000 Daltons by Pulsed Ion Extraction Time-of-Flight Analysis. // Anal. Chem. 1990. V. 62. N. 8. P. 793-796.

15. Vorm O., Roepstorff P.Mann M. Improved resolution and'very high sensitivity in MALDI TOF of matrix surfaces made by fast evaporation. // Anal. Chem. 1994. V. 66. N. 19. P. 3281-3287.

16. Xiang F., Beavis R*. C. A method'to increase contaminant tolerance in protein matrix-assisted laser desorption/ionization^ by the fabrication of thin protein-doped poly crystal line films. // Rapid Commun: Mass Spectrom. 1994. V. 8. P. 199-204.

17. Mechref Y., Novotny, M. V. Matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry of acidic glycoconjugates facilitated by the use of spermine as a co-matrix. // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1998. V. 9. N. 12. P. 1293-1302.

18. Gusev A. I., Wilkinson W. R., Proctor A., Hcrcules D. M. Improvement of Signal Reproducibility and Matrix/Comatrix Effects in Maldi Analysis. // Anal. Chem. 1995. V. 67. N. 6. P. 1034-1041.

19. Laine R. A. Glycobiology 4 // (1994).

20. Barber M., Bordoli R. S., Sedgwick R. D., Tyler A. N. Fast Atom Bombardment of Solids (Fab) a New Ion-Source for Mass-Spectrometry. // J. Chem. Soc. - Chem. Commun. 1981. V. N. 7. P. 325-327.

21. Karas M., Bachmann D., Bahr U., Hillenkamp F. Matrix-Assisted Ultraviolet-Laser Desorption of Nonvolatile Compounds. // Int. J.Mass Spectrom Ion Proc. 1987. V. 78. P. 53-68.

22. Mock К. K., Davey M., Cottrell, J. S. The Analysis of Underivatised Oligosaccharides by Matrix-Assisted Laser Desorption Mass-Spectrometry. // Biochem. andBiophys. Res. Commun. 1991. V. 177. N. 2. P. 644-651.

23. Garozzo D., Spina E., Sturiale L., Montaudo G., Rizzo, R. Quantitative-Determination of Beta(l-2) Cyclic Glucans by Matrix-Assisted Laser-Desorption Mass-Spectrometry. // Rapid Commun. Mass Spectrom. 1994. V. 8. N. 5. P. 358-360.

24. Huberty M. C., Vath J. E., Yu W.Martin S. A. Site-Specific Carbohydrate Identification in Recombinant Proteins Using Mald-Tof Ms. // Anal. Chem. 1993. V. 65. N. 20. P. 2791-2800.

25. Shen X. D., Perreault H. Characterization of carbohydrates using a combination of derivatization, high-performance liquid chromatography and mass spectrometry. // J. Chromatography A. 1998. V. 811. N. 1-2. P. 47-59.

26. Harvey D. J. Quantitative Aspects of the Matrix-Assisted Laser-Desorption Mass-Spectrometry of Complex Oligosaccharides. // Rapid Coinmun. Mass Spectrom.1993. V. 7. N. 7. P. 614-619.

27. Fenn J. В., Mann M., Meng С. K., Wong S. F., Whitehouse, С. M. Electrospray Ionization-Principles and Practice. // Mass Spectrom. Reviews. 1990. V. 9. N. 1. P. 37-70.

28. Meng С. K., Mann M., Fenn J. B. Of Protons or Proteins a Beams a Beam for a That (Burns,O.S.). // Zeitschrift Fur Physik D-Atoms Molecules and Clusters. 1988. V. 10. N. 2-3. P. 361-368.

29. Burlingame, A. L., Boyd, R. K.Gaskell, S. J. Mass-Spectrometry. // Anal. Chem.1994. V. 66. N. 12. P. R634-R683.

30. Reinhold, V. N., Reinhold, В. В., Costello, С. E. Carbohydrate Molecular-Weight Profiling, Sequence, Linkage, and Branching Data Es-Ms and Cid. // Anal. Chem.1995. V. 67. N. 11. P. 1772-1784.

31. Wilm, M. S., Mann, M. Electrospray and Taylor-Cone Theory, Doles Beam of Macromolecules at Last. // Int. J. Mass Spectrom. 1994. V. 136. N. 2-3. P. 167-180.

32. Bahr, U., Pfenninger, A., Karas, M., Stahl, B. High, sensitivity analysis of neutral underivatized oligosaccharides by nanoelectrospray mass spectrometry. // Anal. Chem. 1997. V. 69. N. 22'. P. 4530-4535.

33. Безукладников, П. В., Елякова, Л. А., Звягинцева, Т. Н.Миргородская, О. А. Изучение реакции, катализируемых карбогидразами, с помощью масс-спектрометрии ЭРИАД. //Химия природ, соедпн. 1989. № 1. С. 54-59.

34. Busch, К. L., Glish, G. L., McLuckey, S. A. Mass Spectrometry/Mass Spectrometry: Techniques and- Applications of Tandem Mass Spectrometry // (VCH, New York, 1988).

35. Cooks, R. G., Beynon, J. H., Caprioli, R. M., Lester, G. R: Metastable Ions // (Elsevier, Amsterdam, 1973).

36. McLafferty, F. W. Tandem Mass Spectrometry // (JohnWiley & Sons, Inc., New York, 1983).

37. Bosso, С., Heyraud, A., Patron, L. Oligosaccharide Characterizations by Fast-Atom-Bombardment Mass-Spectrometry Fragmentation Study in Relation to the Substituent at the Reducing End. // Organ. Mass Spectrom. 1991. V. 26. N. 4. P. 321334.

38. Carr S. A., Reinhold V. N., Green B. N., Flass J. R. Enhancement of Structural Information in Fab Ionized Carbohydrate Samples by Neutral Gas Collision. // Biomed Mass Spectrom. 1985. V. 12. N. 6. P. 288-295.

39. Domon В., Muller D. R., Richter W. J. Identification of Interglycosidic Linkages and Sugar Constituents in Disaccharide Subunits of Larger Glycosides by Tandem Mass-Spectrometry. // Organ. Mass Spectrom. 1989. V. 24. N. 5. P. 357-359.

40. Gillece-Castro B. L., Burlingame A. L. Biological Mass Spectrometry // (ed. McCloskey, A. L. B. a. J. A.) (Elsevier, Amsterdam, 1990).

41. Orlando R., Bush C. A1., Fenselau C. Structural-Analysis of Oligosaccharides by Tandem Mass-Spectrometry Collisional Activation of Sodium Adduct Ions. // Biomed. Environ. Mass Spectrom. 1990. V. 19. N. 12. P. 747-754.

42. Duffin K. L., Welply J. K., Huang E., Henion J. D. Characterization of N-Linked Oligosaccharides by Electrospray and Tandem Mass-Spectrometry. // Anal. Chem.1992. V. 64. N. 13. P. 1440-1448.

43. Linsley К. В., Chan S. Y., Chan S., Reinhold В. B„ Lisi P. J., Reinhold V. N. Applications of Electrospray Mass-Spectrometry to Erythropoietin N-Linked and O-Linked Glycans. // Anal. Biochem. 1994. V. 219. N. 2. P. 207-217.

44. Phillips N. J., Apicella M. A., Griffiss J. M., Gibson B. W. Structural Studies of the Lipooligosaccharides from Haemophilus-Influenzae Type-B Strain-A2. // Biochem.1993. V. 32. N. 8. P. 2003-2012.

45. Perreault, PI., Costello С. E. Liquid secondary ionization, tandem and matrix-assisted laser-desorption ionization time-of-flight mass-spectrometric characterization of glycosphingolipid derivatives// Org. Mass Spectrom. 1994. V. 29. P. 720-735.

46. Spengler В., Kirch D., Kaufmann R., Lemoine J. // Org. Mass Spectrom. 1994. V. 29. P. 782.

47. Domon В., Costello С. E. A Systematic Nomenclature for Carbohydrate Fragmentations in Fab-Ms Ms Spectra of Glycoconjugates. // Glycoconj. J. 1988. V. 5. N. 4. P. 397-409.

48. Zaia J., Miller M. J. C., Seymour J. L., Costello С. E. The role of mobile protons in negative ion CID of oligosaccharides. // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2007. V. 18. N. 5. P. 952-960.

49. Karlsson N. G., Karlsson H., Hansson G. C. Sulphated mucin oligosaccharides from porcine small intestine analysed by four-sector tandem mass spectrometry. // J. Mass Spectrom. 1996. V. 31. N. 5. P. 560-572.

50. Minamisawa Т., Hirabayashi J. Fragmentations of isomeric sulfated monosaccharides using electrospray ion trap mass spectrometry. // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005. V. 19. N. 13. P. 1788-1796.

51. Tissot В., Salpin J. Y., Martinez M., Gaigeot M. P., Daniel, R. Differentiation of the fucoidan sulfated L-fucose isomers constituents by CE-ESIMS and molecular modeling. // Carbohydr. Res. 2006. V. 341. N. 5. P. 598-609.

52. Carroll J. A., Willard D., Lebrilla С. B. Energetics of Cross-Ring Cleavages and Their Relevance to the Linkage Determination of Oligosaccharides. // Analytica Chimica Acta. 1995. V. 307. N. 2-3. P. 431-447.

53. Saad О. M., Leary J. A. Delineating mechanisms of dissociation for isomeric heparin disaccharides using isotope labeling and ion trap tandem mass spectrometry. // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2004. V. 15. N. 9. P. 1274-1286.

54. Desaire H., Leary J. A. Utilization of MS3 spectra for the multicomponent quantification of diastereomeric N-acetylhexosamines. // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2000. V. 11. N. 12. P. 1086-1094.

55. Angel A. S., Nilsson Bl Analysis of Glycoprotein Oligosaccharides by Fast-Atom-Bombardment Mass-Spectrometry. //Biomed. Environ. Mass Spectrom. 1990. V. 19. N. 11. P. 721-730.

56. Звягинцева Т. H., Елякова Jl. А., Исаков, В. В. // Биоорган, химия. 1995. № 21. С. 208-216.

57. Т. H. Звягинцева, Т. H. Макарьева, С. П. Ермакова, Л. А. Елякова. Получение п-нитрофенил-ламинариолигозидов реакцией трансгликозилироваиия, катализируемой эндо-1,3-(3-0-глюканазой из морского моллюска // Биоорган, химия. 1998, Т. 24. № 3. С. 219-223.

58. Sinnott М. L. Catalytic Mechanisms of Enzymatic Glycosyl Transfer. // Chem. Reviews. 1990. V. 90. N. 7. P. 1171-1202.

59. Harvey D. J. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of carbohydrates. // Mass Spectrom: Rev. 1999. V. 18. N. 6.- P. 349-450:

60. Bjorndal Н., Ilellerquist С. G., Lindberg В., Svensson S. // Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 1970. V. 9. P. 610-619.

61. Daniel R., Chevolot L., Carrascal M., Tissot В., Mourao P. A. S., Abian J. Electrospray ionization mass spectrometry of oligosaccharides derived from fucoidan of Ascophyllum nodosum. 11 Carbohydr. Res. 2007. V. 342. N. 6. P. 826-834:

62. Noseda M. D., Cerezo A. S. Room-Temperature, Low-Field С-13-Nmr Spectra of Degraded Carrageenans .3. Autohydrolysis of a Lambda Carrageenan and of Its Alkali-Treated Derivative. // Int. J. Biol. Macromol. 1993. V. 15. N. 3. P. 177-181.

63. Stortz C. A., Cerezo A. S. Specific Fragmentation of Carrageenans. // Carbohydr. Res. 1987. V. 166. N. 2. P. 317-323.

64. Stortz C. A., Cerezo A. S. Room-Temperature, Low-Field С-13-Nmr Spectra of Degraded Kappa-Iota-Carrageenans. // Int. J. Biol. Macromol. 1991. V. 13. N. 2. P. 101-104.

65. Беседнова H. H., Иванушко Л. А., Звягинцева Т. H., Елякова Л. А. Иммунотропные свойства 1—>3; 1 —>6-Р-В-глгоканов. // Антибиотики и химиотерапия. 2000. т. 45. № 2. С. 37-44.

66. Kobayashi A., Tai A., Kawazu К. Structural Elucidation of an Elicitor-Active Oligosaccharide, Ln-3, Prepared from Algal Laminaran. // J. Carbohydr. Chem. 1995. V. 14. N. 6. P. 819-832.

67. Manners D. J., Seiler A., Sturgeon R. J. Studies on Beta-Glucanases .6. Observations on the Endo-(l-.4)-Beta-D-Glucanase Activity of Extracts of Barley. // Carbohydr. Res. 1982. V. 100. N. Mar. P. 435-440.

68. Percival E., McDowell, R. H. Chemistry and Enzymology of Marine Algal Polysaccharides // (Academic Press, New York and London, 1967).

69. Stone B. A., Clarke A. E. Chemistry and Biology of (l-3)-Glucans, La Trobe University Press // (La Trobe University Press, Melbourne, Australia, 1992).

70. Read S. M., Currie G., Bacic A. Analysis of the structural heterogeneity of laminarin by electrospray-ionisation-mass spectrometry. // Carbohydr. Res. 1996. V. 281. N. 2. P. 187-201.

71. Chen P., Baker A. G., Novotny M. V. The use of osazones as matrices for the matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of carbohydrates. // Anal. Biochem. 1997. V. 244. N. 1. P. 144-151.

72. Dell A. F.A.B.-mass spectrometry of carbohydrates. // Adv Carbohydr. Chem. Biochem. 1987. V. 45. P. 19-72.

73. Chizhov A. O., Dell A., Morris H. R., Reason A. J., Haslam S. M., McDowell R: A., Chizhov O. S., Usov A. I. Structural analysis of laminarans by MALDI and FAB mass spectrometry. // Carbohydr. Res. 1998. V. 310. N. 3. P. 203-210.

74. Nishino Т., Nagumo Т., Kiyohara H., Hamada H. Structural characterization of a new anticoagulant fiican sulfate from the brown seaweed Ecklonia kurome. II Carbohydr. Res. 1991. V. 211. N. 1. P. 77-90.

75. Glabe С. G., Grabel L. В., Vacquier V. D., Rosen S. D. Carbohydrate Specificity of Sea-Urchin Sperm Binding a Cell-Surface Lectin Mediating Sperm-Egg Adhesion. // J. Cell Biol. 1982. V. 94. N. 1. P. 123-128.

76. Mourao P. A. S., Bastos I. G. Highly Acidic Glycans from Sea-Cucumbers -Isolation and Fractionation of Fucose-Rich Sulfated Polysaccharides from the Body Wall of Ludwigothurea-Grisea. II European J. Biochem. 1987. V. 166. N. 3. P. 639645.

77. SeGall G. K., Lennarz W. J. Chemical characterization of the component of the jelly coat from sea urchin eggs responsible for induction of the acrosome reaction. // Dev Biol. 1979. V. 71. N. 1. P. 33-48.

78. Li В., Lu F., Wei X. J., Zhao R. X. Fucoidan: Structure and bioactivity. // Molecules. 2008. V. 13. N. 8. P. 1671-1695.

79. Black W. A. P., Dewar E. Т., Woodward F. N. Manufacture of algal chemicals. IV.-Laboratory-scale isolation of fucoidin from brown marine algae. // J. Sci. Food Agric. 1952. V.3.P. 122-129.

80. Nishino Т., Nishioka C., Ura H., Nagumo, T. Isolation and Partial Characterization of a Novel Amino Sugar-Containing Fucan Sulfate from Commercial Fucks Vesiculosa Fucoidan. // Carbohydr. Res. 1994. V. 255. P. 213-224.

81. Conchie J., Percival' E. G. V. Fucoidin part II. The hydrolysis of a methylated fucoidin prepared from Fucus vesiculosus. II J. Chem. Soc. 1950. V. P. 827-833.

82. O'Neill A. N. Degradative studies on-fucoidan. // J. Amer. Chem. Soc. 1954. V. 76. P. 5074-5076.

83. Anno K., Seno N., Ota M. Isolation of L-fucose 4-sulfate from fucoidan. // Carbohydr. Res. 1970. V. 13. P. 167-169.

84. Patankar M. S., Oehninger S., Barnett Т., Williams R. L., Clark G. F. A Revised Structure for Fucoidan May Explain Some of Its Biological-Activities. // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. N. 29. P. 21770-21776.

85. Bilan, M. I., Grachev, A. A., Ustuzhanina, N. E., Shashkov, A. S., Nifantiev, N. E., Usov, A. I. Structure of a fucoidan from the brown seaweed Fucus evanescens C.Ag. // Carbohydr. Res. 2002. V. 337. N. 8. P. 719-730.

86. Bilan M. I., Grachev A. A., Ustuzhanina N. E., Shashkov A. S., Nifantiev N. E., Usov A. I. A highly regular fraction of a fucoidan from the brown seaweed Fucus distichus L. // Carbohydr. Res. 2004. V. 339. N. 3. P. 511-517.

87. Bilan M. I., Grachev A. A., Shashkov A. S., Nifantiev N. E., Usov A. I. Structure of a fucoidan from the brown seaweed Fucus serratus L. // Carbohydr. Res. 2006. V. 341. N. 2. P. 238-245.

88. Schweiger R. G. Methanolysis of fucoidan. I. Preparation of methyl a-L-fucoside and L-fucose. // J. Org. Chem. 1962. V. 27. P. 4267-4272.

89. Chizhov A. O., Dell A., Morris H. R., Haslam S. M., McDowell R. A., Shashkov A. S. Nifant'ev N. E., Khatuntseva E. A., Usov A. I. A study of fucoidan from the brown seaweed Chorda filum. И Carbohydr. Res. 1999. V. 320. N. 1-2. P. 108-119.

90. Mian J., Percival E. Carbohydrates of the brown seaweeds Himanthalia lorea and Bifurcaria bifurcata Part II. structural studies of the "fucans". // Carbohydr. Res. 1973. V. 26. P. 147-161.

91. Hussein M. M., Abdel A., Salem H. M. Sulfated heteropolysaccharides from Padina pavoia. II Phytochem. 1980. V. 19. P. 2131-2132.

92. Hussein M. M., Abdel A., Salem H. M. Some structural features of a new sulfated heteropolyssaride from Padina pavoia. II Phytochem. 1980. V. 19. P. 2133-2135.

93. Chevolot L., Mulloy В., Ratiskol J., Foucault A., Colliec-Jouault S. A disaccharide repeat unit is the major structure in fucoidans from two species of brown algae. // Carbohydr. Res. 2001. V. 330. N. 4. P. 529-535.

94. Marais M. F., Joseleau J. P. A fucoidan fraction from Ascophyllum nodosum. И Carbohydr. Res. 2001. V. 336: N. 2. P. 155-159.

95. Li В., Wei X. J., Sun J. L., Xu S. Y. Structural investigation of a fucoidan containing a fucose-free core from the brown seaweed, Hizikia fusiforme. II Carbohydr. Res. 2006. V. 341. N. 9. P. 1135-1146.

96. Duarte M. E. R., Cardoso M. A., Noseda M. D., Cerezo A. S. Structural studies on fucoidans from the brown seaweed Sargassum stenophyllum. II Carbohydr. Res. 2001. V. 333. N. 4. P. 281-293.

97. Ponce N. M. A., Pujol C. A., Damonte E. В., Flores M. L., Stortz, C. A. Fucoidans from the brown seaweed Adenocystis utricularis: extraction methods, antiviral activity and structural studies. // Carbohydr. Res. 2003. V. 338. N. 2. P. 153-165.

98. Bilan M. I., Usov A. I. Structural analysis of fucoidans. // Nat. Prod. Comms. 2008. V. 3.N. 10. P. 1639-1648.

99. Ciucanu I., Kerek F. A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrates // Carbohydr. Res. 1984. N. 131. P. 209-217.

100. Усов А. И., Смирнова Г. П., Билан М. И., Шашков А. С. Бурая водоросль Laminaria saccharina как источник фукоидана// Биоорган, химия. 1998. Т. 24 № 6. С. 437-445.

101. Taylor R. L., Shively J. Е., Conrad Н. Е. Stoichiometric Reduction of Uronic Acid Carboxyl Groups in Polysaccharides. In Methods in Carbohydrate Chemistry // (ed. Whistler, R. L., BeMiller, J. N.) (Academic Press, New York, San Francisco, 1976).

102. Zhang Z. Q., Yu G. L., Zhao X., Liu H. Y., Guan H. S., Lawson A. M., Chai W. G. Sequence analysis of alginate-derived oligosaccharides by negative-ion electrospray tandem mass spectrometry. // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2006. V. 17. N. 4. P. 621630.

103. Rabenstein D. L. Heparin and heparan sulfate: structure and function. // Nat. Prod. Reports. 2002. V. 19. N. 3. P. 312-331.

104. Fukuta K., Nakamura T. Induction of hepatocyte growth factor by fiicoidan and fucoidan-derived oligosaccharides. // J. Pharmacy and Pharmacol. 2008. V. 60. N. 4. P. 499-503.

105. Shanmugam M., Mody К. H. Heparinoid-active sulphated polysaccharides from marine algae as potential blood anticoagulant agents. // Curr. Sci. 2000. V. 79. N. 12. P. 1672-1683.

106. Lindahl U., Backstrom G., Thunberg L. The Antithrombin-Binding Sequence in Heparin Identification of an Essential 6-O-Sulfate Group. // J. Biol. Chem. 1983. V. 258. N. 16. P. 9826-9830.

107. Zaia J., Costello С. E. Tandem mass Spectrometry of sulfated heparin-like glycosaminoglycan oligosaccharides. // Anal. Chem. 2003. V. 75. N. 10. P. 24452455.

108. Zaia J. Mass spectrometry of oligosaccharides. // Mass Spectrom. Reviews. 2004. V. 23. N. 3.P. 161-227

109. Saad, O. M.Leary, J. A. Heparin sequencing using enzymatic digestion and ESI-MSn with HOST: A heparin/HS oligosaccharide sequencing tool. // Anal. Chem. 2005. V. 77. N. 18. P. 5902-5911.

110. Berteau O., Mulloy B. Sulfated fucans, fresh perspectives: structures, functions, and biological properties of sulfated fucans and an overview of enzymes active toward this class of polysaccharide. // Glycobiol. 2003. V. 13. N. 6. P. 29-40.

111. Huggett A. G., Nixon D. A. Enzymatic determination of blood glucose. // Biochem. J. 1957. V. 66. P. 12.

112. Pesentseva M. S., Kusaykin M. I., Anastyuk S. D., Sova V. V., Zvyagintseva T. N. Catalytic properties and mode of action of endo-(l—>3)-beta-D-glucanase and beta

113. D-glucosidase from the marine mollusk Littorina kurila. // Carbohydr. Res. 2008. V. 343. N. 14. P. 2393-2400.

114. Шевченко, H. M., Анастюк, С. Д., Герасименко, Н. И., Дмитренок, П. С., Исаков, В. В.Звягинцева, Т. Н. Полисахаридный и липидный состав бурой водоросли Lominaria gurjanovae. II Биоорган, химия. 2007. т. 33. № 1. С. 96-107.

115. Звягинцева Т. Н., Широкова Н. И., Елякова, Л. А. // Биоорган, химия. 1994. т. 20. № 12. С. 1349-1358.

116. Yoon S. J:, Pyun Y. R., Iiwang J. K., Mourao P. A. A sulfated fiican from the brown alga Laminaria cichorioides has mainly heparin cofactor II-dependent anticoagulant activity. // Carbohydr. Res. 2007. V. 342. N. 15. P. 2326-2330.

117. Dubois M., Gilles K. A., Hamilton J. K., Rebers P. A., Smith, F. // Anal. Chem. 1956. V. 28. P. 350-356.

118. Sawardeker J. S., Sloneker J. H., Jeanes, A. // Anal. Chem. 1965. V. 37. P. 16021604.

119. Jones Т. M., Albersheim P. A Gas Chromatographic Method for the Determination of Aldose and Uronic Acid Constitulents of Plant Cell Wall Polysaccharides. // Plant Physiol. 1972. V. 49. P. 926-936.

120. Кошелева, Л. П.Глебко, Л. И. // Химия природ, соедип. 1977. № 4. С. 500-502.