Фукоиданазы и альгинат-лиазы морской бактерии Formosa algae KMM 3553T и морского моллюска Lambis sp. тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат наук Сильченко, Артем Сергеевич

• Сильченко, Артем Сергеевич
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Сильченко, Артем Сергеевич

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1 ВВЕДЕНИЕ

2 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

2.1 Фукоиданы бурых водорослей и фукансульфаты иглокожих. Общие сведения

2.2 Классификация фукоиданов

2.2.1 Фукоиданы, построенные из а-1—>3-связанных остатков сульфатированной L-фукозы

2.2.2 Фукоиданы, построенные из а-1—>3- и а-1 —>4-связанных остатков сульфатированной L-фукозы

2.2.3 Фукоиданы сложного состава. Галактофуканы

2.2.4 Фукансульфаты иглокожих

2.3 Фукоиданазы. Общая информация

2.3.1 Номенклатура и классификация фукоиданаз

2.3.2 Методы определения фукоиданазной активности

2.3.2.1 Колориметрические методы

2.3.2.2 Физико-химические методы

2.3.3 Распространение фукоиданаз

2.3.4 Выделение и очистка фукоиданаз

2.3.5 Физико-химические свойства фукоиданаз

2.3.6. Тип действия и специфичность фукоиданаз

2.3.7 Структура фукоиданаз

2.3.8 Индукция биосинтеза фукоиданаз в микроорганизмах

2.4 Альгиновые кислоты

2.4.1 Структура альгиновых кислот

2.6 Альгинат-лиазы

2.6.1 Номенклатура и классификация альгинат-лиаз

2.6.2 Методы регистрации альгинолитической активности

2.6.3 Распространение альгинат-лиаз

2.6.4 Альгинат-лиазы бактерий

2.6.5 Альгинат-лиазы грибов, бактериофагов и вирусов

2.6.6 Альгинат-лиазы беспозвоночных и морских водорослей

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Методы поиска продуцентов фукоиданаз среди бактерий

3.2 Фукоиданазы морской бактерии Formosa algae КММ 3553Т

2

3.2.1 Влияние различных углеводных компанентов питательной среды на биосинтез фукоиданаз в морской бактерии F. algae КММ 3553Т

3.2.2 Выделение и характеристика свойств фукоиданазы из морской бактерии

F. algae КММ 3553Т

3.2.3 Анализ аминокислотных последовательностей фукоиданаз F. algae КММ 3553Т (Биоинформационный анализ фукоиданаз)

3.2.4 Получение рекомбинантных фукоиданаз F. algae КММ 3553Т

3.3 Фукоиданаза из морского моллюска Lambis sp

3.4 Альгинат-лиазы морской бактерии F. algae и морского моллюска Lambis sp

4 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

4.1 Материалы и реагенты

4.3 Методы исследования

5 ВЫВОДЫ

6 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Приложение Б

Приложение В

Приложение Г

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

А.о. - аминокислотный остаток

БСА (В SA) - бычий сывороточный альбумин

ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография

ДМСО (DMSO) - диметилсульфоксид

ДСН (SDS) - додецилсульфат натрия

ДТТ (DTT) - дитиотреитол

ДЭАЭ-целлюлоза (DEAE-cellulose) - диэтиламиноэтил-целлюлоза ИПТГ (IPTG) - изопропил-/?-0-1-тиогалактопиранозид

МАЛДИ (MALDI) - матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация

ПААГ-электрофорез (PAGE) - электрофорез в полиакриламидном геле

ПСА (APS) - персульфат аммония

Р.И. - рефрактометрический индекс

ТФУ (TFA) - трифторуксусная кислота

УФ (UV) - ультрафиолетовое излучение, Х=280-320нм

ЯМР (NMR) - ядерный магнитный резонанс

Fue - фукоза

Gal - галактоза

Glc - глюкоза

Man - манноза

Rha - рамноза

U - уроновая кислота

Ху1 - ксилоза

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Фукоиданазы и альгинат-лиазы морской бактерии Formosa algae KMM 3553T и морского моллюска Lambis sp.»

1 ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Изучение уникальных ферментов морских организмов, расщепляющих полисахариды бурых водорослей, характеристика их каталитических свойств и структуры - актуальная задача современной энзимологии. Объектами нашего исследования являются фукоиданазы и альгинат-лиазы морских беспозвоночных и бактерий, принимающие участие в катаболизме полианионных полисахаридов морских водорослей. Эти ферменты исследованы недостаточно, поэтому их изучение расширит наши теоретические знания о структурно-функциональных свойствах этих ферментов и позволит направленно использовать их для установления структуры природных полисахаридов.

Субстратами для исследуемых ферментов являются альгиновые кислоты (гомо- и гетерополисахариды, состоящие из остатков маннуроновых и/или гулуроновых кислот) и фукоиданы (высокосульфатированные гомо- и гетерополисахариды). Эти полисахариды бурых водорослей относят к так называемым «поливалентным биомодуляторам», так как они обладают широким спектром биологической активности: иммуномодулирующей, радиопротекторной, антиопухолевой, антивирусной, антимикробной, антикоагулянтной, гепатозащитной и другими. Все эти свойства делают возможным использование полисахаридов бурых водорослей в медицине. Однако лекарства на их основе еще не созданы. Это связано с недостатком информации о взаимосвязи структуры и биологической активности полисахаридов водорослей и отсутствием простых и воспроизводимых методов стандартизации препаратов. Существуют трудности в установлении структуры этих биополимеров, характеризующихся большим структурным разнообразием, гетерогенностью получаемых фракций, сложным построением молекул. Для стандартизации природных полисахаридов, установления их структуры, увеличения биологической активности и снижения побочных эффектов, наиболее перспективным является использование ферментов.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы является установление первичной структуры и характеристика каталитических свойств фукоиданаз и альгинат-лиаз морских организмов.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1) Разработать методы поиска продуцентов фукоиданаз и альгинат-лиаз среди морских организмов; 2) Выбрать продуценты фукоиданаз и альгинат-лиаз среди морских бактерий и беспозвоночных; 3) Разработать схемы выделения индивидуальных фукоиданаз и альгинат-лиаз из выбранных объектов; 4) Изучить каталитические свойства, специфичность и тип действия выделенных ферментов; 5) Установить структуры продуктов ферментативной трансформации фукоиданов и альгиновых кислот; 6) Определить аминокислотные последовательности выделенных ферментов; 7) Получить рекомбинантные аналоги исследуемых ферментов и провести их сравнительное изучение.

Научная новизна и практическая значимость работы: Разработан простой метод поиска продуцентов фукоиданаз среди микроорганизмов. Впервые выделены: внутриклеточная фукоиданаза из штамма морской бактерии Formosa algae КММ 3553Т, фукоиданаза и альгинат-лиаза из печени морского моллюска Lambis sp. Определены их основные биохимические свойства, специфичность и тип действия. Установлены структуры основных низкомолекулярных продуктов трансформации фукоидана и полигулуроновой кислоты, полученных под действием выделенных ферментов. Установлены первичные структуры двух фукоиданаз из штамма морской бактерии F. algae КММ 3553Т. Получены две рекомбинантные фукоиданазы F. algae КММ 3553Т и проведено сравнительное исследование их каталитических свойств.

Показаны особенности действия новых ферментов и возможности их дальнейшего применения для исследования структур фукоиданов и альгиновых кислот. Рекомбинантные фукоиданазы могут найти свое применение в биотехнологии для получения сульфатированных фукоолигосахаридов, которые имеют перспективы использования их в качестве биологически активных добавок и лекарственных препаратов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанный метод обнаружения фукоиданаз в бактериях, применим для масштабного поиска продуцентов этих ферментов.

2. Внутриклеточная фукоиданаза (FFA), выделенная из морской бактерии F. algae КММ 3553Т, является ферментом эндо-типа действия и катализирует расщепление а-1 —>4-0-гликозидных связей между остатками L-фукозы в молекуле фукоидана из Fucus evanescens.

3. Геном морской бактерии F. algae КММ 3553Т содержит два гена, кодирующих внеклеточную (FFA1) и внутриклеточную (FFA2) фукоиданазы.

4. Фукоиданазы FFA1 и FFA2 относятся к 107 структурному семейству О-гликозидгидро лаз.

5. Рекомбинантные фукоиданазы FFA1 и FFA2 являются ферментами эндо-типа действия и катализируют расщепление а-1—»4-О-гликозидных связей между остатками L-фукозы в молекуле фукоидана из F. evanescens.

6. Фукоиданаза из морского моллюска Lambis sp. является ферментом эндо-типа действия и катализирует расщепление а-1—+4-0-гликозидных связей между остатками L-фукозы в молекуле фукоидана из F. evanescens.

7. Альгинат-лиаза из морского моллюска Lambis sp., является ферментом эндо-типа действия, и имеет редкую для альгинат-лиаз морских беспозвоночных специфичность: катализирует расщепление а-1—>4-гликозидных связей между остатками L-гулуроновой кислоты. Фермент классифицирован как поли-1—»4-а-Ь-гулуронат-лиаза (КФ 4.2.2.11). Апробация работы. Материалы данной работы были представлены на:

Первом международном симпозиуме «Marine Enzymes and Polysaccharides», Вьетнам, 2012; конференции молодых ученых «ВЗГЛЯД В БУДУЩЕЕ», Россия, 2013 и пятом Российско-Корейском форуме «The 5th Korea-Russia Bio Joint Forum on the Natural Products Industrialization and Application», Корея 2013.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в журналах из списка ВАК РФ и 8 тезисов докладов в материалах научных конференций.

Личный вклад соискателя в проведении исследования. Соискателем был выполнен анализ литературных данных по теме исследования, планирование экспериментов, получена основная часть результатов, написаны статьи и подготовлены доклады на конференциях. На защиту вынесены только те положения и результаты, в получении которых роль автора была определяющей.

Структура диссертации. Диссертационная работа содержит следующие разделы: Введение, Литературный обзор, Результаты и их обсуждение, Экспериментальную часть, Выводы и Список литературы. Список литературы включает 213 источников. Диссертация изложена на 141 страницах и содержит 41 рисунок, 24 таблицы и 4 приложения.

ч

2 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

2.1 Фукоиданы бурых водорослей и фукансульфаты иглокожих. Общие сведения

Полианионные полисахариды являются обширной группой биополимеров, которые обнаружены во всех классах морских водорослей. Интерес к изучению этих полисахаридов вызван широким спектром их биологического действия. Они обладают противовирусным, противоопухолевым, иммуномодулирующим,

противовоспалительным, антикоагулянтным, антиадгезивным, антиангиогенным действием [1-11].

Среди полианионных полисахаридов наибольшее внимание привлекают фукоиданы - сульфатированнные полисахариды бурых водорослей и фукансульфаты иглокожих. Фукоиданы принадлежат к семейству сульфатированных гомо- или гетерополисахаридов, основным, а иногда единственным мономером которых являются сульфатированные и, в некоторых случаях, ацетилированные по различным положениям остатки a-L-фукозы. Кроме остатков фукозы, в состав фукоиданов бурых водорослей часто входят и другие моносахариды, такие как галактоза (Gal), манноза (Man), ксилоза (Xyl), рамноза (Rha), уроновые кислоты (U). Остатки галактозы также могут содержать сульфаты подобно остаткам фукозы.

Содержание фукоиданов в бурых водорослях колеблется в довольно широких пределах: от 0,4 до 20,4 % от сухого веса и зависит от вида водоросли и сезона ее сбора. Самое высокое содержание фукоидана (20,4 %) было обнаружено Усовым А.И. с соавторами в бурой водоросли Saundersella simplex, принадлежащей к порядку Dicyosiphonales [12]. Достаточно высокое содержание фукоиданов наблюдается в водорослях порядка Fucales: от 13,4 % до 16,5 % у F. vesiculosus и от 10,0 % до 11,5 % у Ascophyllum nodosum [13]. В дальневосточных представителях порядка Laminarinales содержание фукоиданов меньше - от 0,6 % до 6,5 %, а в дальневосточных водорослях порядка Fucales - от 1,5 % и до 7,9 % [14; 15].

Известно, что содержание и структура сульфатированных полисахаридов бурых

водорослей варьируют в зависимости от эндо- и экзогенных факторов [14-16].

Структуры фукоиданов, синтезируемых одним видом водоросли, могут иметь

значительные различия. В качестве примера можно привести фукоидан из F. vesiculosus,

который удалось разделить на 16 фракций, имеющих различный моносахаридный

состав [17]. Из бурой водоросли Kjellmaniella crassifolia были выделены две фракции

8

фукоиданов, первая фракция представляла собой фукансульфат, построенный из а-1—>3-связанных остатков сульфатированной Ь-фукозы, а вторая являлась фукоглюкурономаннаном [18; 19].

Вероятно, эти отличия в структурах связаны с ферментными системами, участвующими в биосинтезе полисахаридов. Состав этих ферментов может быть различен у каждого вида водоросли, а уровень экспрессии генов, кодирующих эти ферменты, может изменяться, так как зависит от факторов внешней среды.

В настоящее время сульфатированные фукозосодержащие полисахариды, несмотря на сложности установления их химической структуры, вызывают интерес в качестве основы для создания биологически активных добавок и лекарственных препаратов нового поколения.

2.2 Классификация фукоиданов

На сегодняшний день можно выделить несколько структурных групп фукоиданов, различающихся типом О-гликозидной связи между остатками а-Ь-фукозы в полисахариде:

1. Сульфатированные а-Ь-фуканы, построенные из остатков фукозы, связанных а-1 —>3-0-гликозидными связями. Данный тип фукоиданов встречается в бурых водорослях порядков Ьаттапа1ез и ЕсЮсагра1е5.

2. Фукоиданы, построенные из остатков а-Ь-фукозы, связанных 1—>3- и 1—>4-0-гликозидными связями. Синтезируются бурыми водорослями порядка Бисакв.

3. Сульфатированные галактофуканы, основными компонентами которых являются остатки а-Ь-фукозы и /?-0-галактозы, связанные 1—»3- и/или 1—»4-О-гликозидными связями. Синтезируются бурыми водорослями порядка Ьаттапа1ез.

4. Фукоиданы более сложного состава, молекулы которых содержат в значительных количествах помимо остатков фукозы и другие моносахариды.

Классификация фукоиданов является сложной задачей из-за способности водорослей одного вида синтезировать помимо а-Ь-фуканов другие фукозосодержащие полисахариды: сульфатированные галактофуканы, фукогалактаны,

фукоглюкурономаннаны и ксилофукоглюкуронаны. Подобные наборы

сульфатированных фукозосодержащих полисахаридов описаны практически для каждого порядка бурых водорослей.

2.2.1 Фукоиданы, построенные из а-1—+3-связанных остатков сульфатированной L-фукозы

Бурые водоросли порядка Laminariales и Ectocarpales синтезируют фукоиданы, основным структурным мотивом которых являются а-1—»3-связанные остатки сульфатированной фукозы (рис. 2.1).

Фукоиданы, выделенные из водорослей порядка Laminariales, построены из а-1—>3-связанных остатков фукозы, сульфатированных по С2 и/или С4 положениям. Фукоиданы такого строения были выделены из бурых водорослей Saccharina cichorioides (Laminaria cichorioides) [20; 21], S. latissima (L. saccharina) [22; 23] и Lessonia vadosa [24].

Из бурой водоросли Chorda filum [25] был выделен фукоидан, главная цепь которого состояла из гексасахаридного повторяющегося звена, в котором на пять а-1—»3'-связанных остатков L-фукозы приходился один остаток фукозы в качестве бокового ответвления при С2. Гидроксильные группы в положениях С4 и реже С2 были этерифицированы серной кислотой.

Помимо остатков фукозы в состав молекул фукоиданов могут входить и другие моносахариды. Так, некоторые фракции фукоиданов, выделенные из бурых водорослей S. gurjanovae, S. japónica и S. longicruris, кроме фукозы содержали значительное количество галактозы [26-28].

Из бурой водоросли Undaria pinnatifida была выделена фракция галактофукана, главная цепь которого построена из 1—»3-связанных остатков a-L-фукопиранозы и /?-0-галактопиранозы в соотношении 1:0,9. Минорные количества ксилозы и маннозы также были обнаружены в составе этого полисахарида [29]. Из этого же вида водоросли был выделен сульфатированный галактофукан, с таким же соотношением остатков a-L-фукопиранозы и /í-D-галактопиранозы (1:0,9). Было установлено, что этот полисахарид состоял из блоков, включающих остатки фукозы и галактозы (л=2-5). Остатки flf-L-фукопиранозы были сульфатированы при С2 и реже при С4, положение сульфатных групп также отмечалось при СЗ и/или С6 остатков /í-D-галактопиранозы [15].

Из бурой водоросли S. latís sima были выделены четыре фракции фукоиданов. Первая - имела типичное для порядка Laminariales строение: основная цепь, построенная из а-1—>3-связанных остатков фукозы, сульфатированных в основном по С4, реже по С2 положениям [22]. После разделения общей фракции фукоиданов из этой же водоросли на колонке с анионообменным носителем, были получены: фукогалактан, построенный из 1—»б-связанных остатков /í-D-галактопиранозы с ответвлениями от основной цепи в виде единичных 1—>4-связанных остатков a-L-фукозы и /í-D-галактозы; фукоглюкурономаннан, состоящий из 1—>4-связанных остатков ^-D-глюкуроновой кислоты и а-1 —»^-связанных остатков D-маннопиранозы с боковыми ответвлениями в виде остатков L-фукопиранозы по СЗ a-D-маннозы и фукоглюкуронан, построенный из 1—»3-связанных остатков //-D-глюкуроновой кислоты и содержащий разветвления в виде остатков a-L-фукопиранозы в положении С4 [23]. Аналогичная фракция фукоглюкурономаннана была выделена из водоросли К. crassifolia семейства Laminariaceae [19]. Исследование продуктов деградации фукоидана из S. gurjanovae, полученных в результате сольволитического десульфатирования, методом MALDI-TOF масс-спектрометрии позволило обнаружить смешанные фукогалактоолигосахариды. Было высказано предположение, что данный фукоидан представлял либо сульфатированный и частично ацетилированный галактофукан блочного строения, либо смесь частично ацетилированных и высокосульфатированных фукана, галактофукана и, возможно, галактана [26].

Бурые водоросли, принадлежащие к порядку Ectocarpales, в отличие от водорослей порядка Laminariales синтезируют фукоиданы с большим количеством боковых ответвлений. Так, из бурой водоросли Cladosiphon okamuranus [30] был получен фукоидан, главная цепь которого была построена из остатков L-фукозы, соединенных а-1 —>3-0-гликозидными связями и имеющих боковые ответвления, в основном, в виде a-D-глюкуроновой кислоты в положении при С2. Сульфатные группы расположены в основном при С4 остатка фукопиранозы. Более сложную структуру имел фукоидан из Chordaria flagelliformis. Его основная цепь частично гликозилирована по положениям С2 ar-D-глюкуроновой кислотой. Часть молекул гликозилирована по С4 единичными остатками сульфатированной фукофуранозы и/или дисахаридными звеньями #-L-Fuc/-(l—>-2)-í*-L-Fuc/-(l-> [31].

Фукоидан, основная цепь которого построена из 1—^3-связанных остатков а-Ь-фукопиранозы, содержался в бурой водоросли АпаПрш ]аротст, которая является представителем порядка Казаке. Этот фукоидан имел преимущественно а-1—>4- и реже сс-1 —^-связанные остатки Ь-фукопиранозы в виде боковых ответвлений. Сульфатные группы расположены в основном, в положении С2, а ацетильные группы в положении С4 остатка фукопиранозы [32].

Я= СОСН3; БОз"

СОСН3; БОз"

5. \atissima

С./1!ит

Я1= Н; СОСН3; 503"

Я2= Н; БОз"

Я3= Н; БОз"; Ь-Бис/

С. flagelliformis

С окатигапш

11= СОСН3; БОз" 503"; Н

А.]аротси.ч

5. Ыс1югю1с1ез

Рисунок 2.1 - Фукоиданы из различных видов бурых водорослей, построенные из а-1—»3-связанных остатков сульфатированной Ь-фукозы

2.2.2 Фукоиданы, построенные из а-1—»3- и а-1—»4-связанных остатков сульфатированной Ь-фукозы

Фукоиданы такой структуры синтезируют в основном бурые водоросли семейства Рисасеае порядка Рисакэ (рис. 2.2.). Впервые фукоидан такого типа был выделен из бурой водоросли \esiculosus. Однако из-за большого количества заместителей в молекуле, структура его была установлена неверно. Авторы утверждали, что остатки фукозы в молекуле фукоидана соединены а-1—»-2-О-гликозидными связями и сульфатированы в положении С4 [33]. Такая модель молекул фукоидана существовала около 40 лет. В 1993 году структура фукоидана из Р. уе^/си/о^щ1 была пересмотрена [34]. Вновь предложенная структура предполагала соединение остатков фукозы в молекуле фукоидана а-1—»З-О-гликозидными связями, присоединение разветвлений по С2, а сульфатных групп - по С4. Впоследствие в структуру этого фукоидана были внесены уточнения. Было показано, что углеводная цепь его содержит повторяющийся мотив, состоящий из остатков сульфатированной фукозы, связанной чередующимися а-1—>3- и

13

a-l—»4 гликозидными связями, а сульфатные группы находятся при С2 и в меньшей степени при СЗ остатков L-фукозы [35]. Аналогичную структуру имели фукоиданы из A. nodosum [35] и Pelvetia canaliculata [36] (рис. 2.2).

Из бурой водоросли F. evanescens разными авторами были выделены две фракции фукоиданов. Первая имела линейное строение с характерными для этой группы фукоиданов чередующимися гликозидными связями, сульфатные группы были присоединены при С2 и иногда при С4, ацетильные группы располагались случайным образом [37]. Вторая фракция содержала в 3,5 раза больше а-\—>3-связанных остатков фукозы [38].

Из F. distichus удалось выделить фракцию фукоидана с необычно высокой степенью регулярности [39]. Этот фукоидан был построен из повторяющихся дисахаридных звеньев L-фукозы, связанных а-1—>3; а-1—>4 гликозидными связями. В фукоидане также присутствовали следовые количества ацетильных групп и остатков фукофуранозы. Сульфатные группы занимали практически все свободные гидроксильные группы в молекуле полисахарида. Эта регулярность построения позволила расшифровать ЯМР спектры нативного фукоидана, не подвергая его химическим модификациям.

Фракция фукоидана, содержащая большое количество разветвлений, была получена из бурой водоросли F. serratus [40]. Основная цепь этого фукоидана представляла собой повторяющийся фрагмент следующей структуры: [—>3)-ar-L-Fucp-(1—»4)-ar-L-Fucp-(l—►]„. Боковые разветвления представлены остатками фукотриозы a-L-Fucp-(l—>4)-a-L-Fucp-(l—»3)-a-L-Fucp-(l—>, и присоединены к а-1—>3'-связанной L-фукозе основной цепи по положению С4. В среднем на семь единиц остатков фукозы основной цепи приходилось одно боковое ответвление. Кроме того, обнаружены незначительные количества коротких цепей а-1—>4-связанных остатков ксилозы в боковых ответвлениях. Установлено, что сульфатные группы находились в основном при С2, иногда при С4 остатков L-фукозы.

Были получены структурные характеристики фукоидана из водоросли Stoechospermum marginatum, относящейся к порядку Dictyotales. Установлено, что фукоидан построен из остатков фукозы, связанных а-\—>-3- и а-\—»4-О-гликозидными связями и сульфатированных по С2 и/или С4 положениям [41].

A. nodosum, F. vesiculosus, Р. cavaliculata

F. evanescens, R=H;COCH3 F. distichus R= SO3"; COCH3

Рисунок 2.2 - Фукоиданы, построенные из а-1—>3- и а-1—»4-связанных остатков

сульфатированной L-фукозы

2.2.3 Фукоиданы сложного состава. Галактофуканы

Как уже упоминалось, фукоиданы являются сложными гетерополисахаридами и часто кроме фукозы содержат значительные количества других моносахаридов.

Известны полисахариды, состоящие примерно из равных количеств сульфатированных остатков фукозы и галактозы. Фукоиданы, содержащие фукозу и галактозу в эквивалентных количествах, принято называть галактофуканами.

Галактофуканы были выделены из спорофиллов A. fistulosa [42], U. pinnatifida [3] и из целых талломов S. japónica [43], S. gurjanovae [44], S. patens [45].

В бурых водорослях семейства Sargassaceae обнаружены разветвленные сульфатированные галактофуканы и фукозосодержащие полисахариды сложного состава. Практически все фукоиданы, выделенные из бурых водорослей семейства Sargassaceae таких как Sargassum trichophyllum, S. plagiophyllum, S. vulgare, имели в своем составе достаточно большое количество ксилозы и галактозы [46-48].

Из S. stenophyllum получены 2 типа галактофуканов, основная цепь которых была построена из галактозы и/или маннозы, а остатки фукозы находились в разветвлениях [49]. Подобные фракции, содержащие фукозу в боковых ответвлениях, были выделены из S. fusiforme (ранее Hizikia fusiforme) [50], и Spatoglossum schroederi [51; 52].

Из S. polycystum [53] была выделена еще одна фракция полисахарида с другой структурой. Его основная цепь была построена из а-1—»3-связанных остатков фукозы, а также имела в своей структуре короткие участки, содержащие остатки фукозы, связанные а-1—>2-0-гликозидными связями с остатками галактозы, остатки галактозы в свою очередь присоединены к остаткам фукозы 1—>3-0-гликозидными связями. Отмечалось небольшое количество а-1—»4-связанных остатков фукозы в виде боковых ответвлений. Также присутствовали ответвления в виде коротких фрагментов цепей галактозы, связанных между собой а-1—»4-О-гликозидными связями. Сульфатные группы были присоединены по С4 остатков фукозы и галактозы основной цепи молекулы галактофукана. Галактофукан подобной структуры был выделен из Turbinaria conoides [54].

Галактофукан из S. mcclurei также имел основную цепь, построенную из остатков фукозы: [—♦3)-a-L-Fucp(2,40S03_)-(1^3)-a-L-Fucp(2,40S03_)-(l—>] с участками, содержащими а-1 —>4-связанные остатки фукопиранозы и 6-связанные остатки галактозы на восстанавливающем конце основной цепи макромолекулы. Боковые ответвления представляли собой остатки галактозы и/или короткие чередующиеся цепи, состоящие из а-1—>3-связанных остатков фукозы и /?-1—»4-связанных остатков галактозы [55]. Сульфаты в данном полисахариде занимали главным образом положения С2 и/или С4 остатков фукозы и галактозы, а также положение СЗ при 1—>4-связанных остатках a-L-фукозы и ^-D-галактозы в боковых ответвлениях. Аналогичный по структуре основной цепи галактофукан был найден в S. myriocystum [56].

2.2.4 Фукансульфаты иглокожих

В представителях иглокожих обнаружены родственные фукоиданам полисахариды. В отличие от фукоиданов фукансульфаты иглокожих имеют линейную регулярную структуру и не содержат в своем составе других моносахаридов, а также ацетильных групп (рис. 2.3). Фукансульфаты выделены из клеточной стенки тела голотурий и икры морских ежей [57-61]. Функция фукансульфатов, содержащихся в клеточной стенке голотурий, по-видимому, сходна с функцией, выполняемой сульфатированными глюкозаминоглюканами соединительной ткани позвоночных. Фукансульфаты клеточной стенки яйцеклеток морских ежей играют важную роль в

процессе оплодотворения, обеспечивая узнавание ими спермотозоидов и индуцирование акросомной реакции [62-63].

Фукансульфаты, построенные из а-1 —>3-связанных остатков фукозы, выделены из голотурий Isostichopus badionotus [64], Ludwigothurea grisea [65], Acaudina molpadioides [66]. Полисахариды подобного строения были обнаружены в клеточной стенке яйцеклеток морских ежей Strongylocentrotus franciscanus [67], S. pallidas [68], S. purpuratus [69], Lytechinus variegates [70]. Структуры полисахаридов, выделенных из этих источников, различались только количеством и положением сульфатных групп в их молекулах. В основном это были линейные полимеры, состоящие из сульфатированных остатков L-фукозы, связанных а-1 —»3 -О-гликозидными связями, в которых сульфатные группы расположены регулярно и образуют систему из повторяющихся звеньев три- или тетрасахарида. В некоторых случаях - это гомополимеры, в которых остатки фукозы сульфатированы только по одному положению. Исключение составляют фракции фукансульфатов, выделенные из Apostichopus japonicus (Stichopus japonicus) [58]. Структура этих фукансульфатов имела невысокую степень регулярности, подобно фукоиданам бурых водорослей. Фукансульфаты имели разветвленную структуру: их основная цепь была построена из а-1—>3-связанных остатков сульфатированной фукопиранозы, а боковые ответвления присутствовали в виде сульфатированных по С2 и/или С4 остатков фукозы.

Из клеточной стенки икры морского ежа S. droebachiensis были выделены два фукансульфата, которые имели различия в расположении сульфатных групп [68]. Первый фукан был построен в основном из повторяющихся тетрасахаридных единиц [—>4)-a-L-Fucp-(20S03")-( 1 ^4)-a-L-Fucp-(20S03>( 1 ^4)-a-L-Fuc/>-( 1 -»4)-a-L-Fucp-(1—►]„, в то время как второй состоял из [—>4)-a-L-Fucp-(20S03~)-(l—>]п. Подобный фукансульфат, состоящий из повторяющихся тетрасахаридных единиц [4-a-L-Fucp-(20S03")-1^4-a-L-Fucp-(20S03")-1^4-i7-L-Fucp-l-^4-a-L-Fucp]n, выделен из яйцеклеток морского ежа Arbacia lixula [71].

Особенности строения фукансульфатов, в первую очередь регулярность построения молекул, делают их удобными модельными соединениями для исследования биологической активности фукозосодержащих полисахаридов, а также субстратами для исследования специфичности фукоиданаз.

o

)3S0 ,MAM>

/. badionotus

L. grísea

A. molpadioides

R= H; SO3" or

vwyw

M^tr/

OR,

I HO OR]

Rt= H; SO3"

A.japonicus

Ьу^есЫпт \ariegatus

5. ригригаШз

Рисунок 2.3 - Фрагменты структур фукансульфатов иглокожих

Mi

oso3"

он

о

wUw

S. fr an eis can us

S. droebachiensis

A. lixula

S. pallidus

2.3 Фукоиданазы. Общая информация

Информация о бактериях, способных гидролизовать молекулы фукоиданов, впервые была опубликована еще в 1959 году [72]. Термин «фукоиданазы» появился в 1967 году и был применен к препарату фермента, выделенному из гепатопанкреаса морского моллюска На1Шт ер. [73].

Исходя из данных о структуре фукоиданов, в их утилизации могут принимать участие разные ферменты, специфичные к определенным участкам молекулы фукоидана: сульфатазы, фуканазы, галактаназы, маннаназы и различные гликозидазы [73]. Интерес к изучению ферментов, катализирующих те или иные превращения фукоиданов, постоянно возрастает. Это связано с возможностью их использования в качестве инструментов для установления более детальной структуры фукоиданов. Кроме того, эти ферменты также могут найти применение в биотехнологии для получения биологически активных фрагментов нативного фукоидана сульфатированных фукоолигосахаридов, которые более предпочтительны, чем фукоидан, для создания БАДов или лекарственных препаратов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Сильченко, Артем Сергеевич, 2014 год

6 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Zonga A.,Cao Н., Wang F. Anticancer polysaccharides from natural resources: A review of recent research // Carbohydr. Polym. 2012. — Vol. 90, N 4. — P. 1395-1410.

2. Hayashi K., Nakano Т., Hashimoto M., Kanekiyo K., Hayashi T. Defensive effects of a fucoidan from brown alga Undaria pinnatifida against herpes simplex virus infection // Int. J. Immunopharmacol. 2008. — Vol. 8 N1. — P. 109-116.

3. Lee J.B., Hayashi K., Hashimoto M., Nakano Т., Hayashi T. Novel antiviral fucoidan from sporophyll of Undaria pinnatifida (Mekabu) // Chem. Pharm. Bull. (Tokyo). 2004. — Vol. 52, N9. —P. 1091-1094.

4. Макаренкова И.Д., Дерябин П.Г, Львов Д.К, Звягинцева Т.Н, Беседнова Н.Н. Противовирусная активность сульфатированного полисахарида из бурой водоросли Laminaria japónica в в отношении инфекции культур клеток, вызванной вирусом гриппа А птиц (H5N1) // Вопр. вирусологии. 2010. — Т. 1, — С. 41-45.

5. Yamasaki-Miyamoto Y., Yamasaki М., Tachibana Н., Yamada К. Fucoidan Induces apoptosis through activation of caspase-8 on human breast cancer MCF-7 cells // J. Agrie. Food Chem. 2009. — Vol. 57, N 18. — P. 8677-8682.

6. Usui Т., Asari K., Mizuno T. Isolation of Highly Purified Fucoidan from Eisenia-Bicyclis and Its Anti-Coagulant and Anti-Tumor Activities //' Agrie. Biol. Chem. 1980. — Vol. 44, N 8. — P. 1965-1966.

7. Беседнова H.H., Запорожец T.C. Фундаментальные и прикладные аспекты изучения биополимеров из гидробионтов Тихого океана // Бюлл. СО РАМН. 2008. — Т. 132 № 4. — С. 16-21.

8. Nishino Т., Yokoyama G., Dobashi К., Fujihara М., Nagumo Т. Isolation, purification, and characterization of fucose-containing sulfated polysaccharides from the brown seaweed Ecklonia kurome and their blood-anticoagulant activities // Carbohydr. Res. 1989. — Vol. 186, N 1. —P. 119-129.

9. Chevolot L., Foucault A., Chaubet F., Kervarec N., Sinquin C., Fisher A.M., Boisson-Vidal С. Further data on the structure of brown seaweed fucans: relationships with anticoagulant activity // Carbohydr. Res. 1999. — Vol. 319, N 1-4. — P. 154-165.

10. Jin W., Zhanga Q., Wanga J., Zhanga W. A comparative study of the anticoagulant activities of eleven fucoidans // Carbohydr. Polym. 2013. — Vol. 91, N 1. — P. 1-6.

11. Кузнецова Т.А., Шевченко H.M., Звягинцева Т.Н., Беседнова Н.Н. Биологическая активность фукоиданов из бурых водорослей и перспективы их применения // Антибиот. химиотер. 2004. — Т. 49 № 5. — С. 24-27.

12. Усов А.И., Смирнова, Г.П., Клочкова, H.F. Полисахариды водорослей. Полисахаридный состав некоторых бурых водорослей Камчатки // Биоорг. Химия. 2001. — Т. 27, № 6. — С. 444-448.

13. Репина О.И., Муравьева Е.А., А.В. П. Химический состав промысловых бурых водорослей Белого моря // Тр. ВНИРО: Прикл. биохим. технол. гидробионтов. 2004. — Т. 143, — С. 93-99.

14. Imbs T.I., Shevchenko "N.M., Sukhoverkhov S.V., Semenova T.L., Skriptsova A.V., Zvyagintseva T.N. Seasonal variations of the composition and structural characterisitcs of polysaccharides from the brown alga Costaría costata II Chem. Nat. Compd. 2009. — Vol. 45, N6, —P. 786-791.

15. Skriptsova A.V., Shevchenko N.M., Zvyagintseva T.N., Imbs T.I. Monthly changes in the content composition of fucoidan from (Laminariales, Phaeophyta) // J. Appl. Phycol. 2010. — Vol. 22, N 1. — P. 79-86.

16. Mak W., Hamid N., Liu Т., Lu J., White W.L. Fucoidan from New Zealand Undaria pinnatifida: Monthly variations and determination of antioxidant activities // Carbohydr. Polym. 2013. — Vol. 95, N 1. — P. 606-614.

17

18

19

20

21

22

23,

24,

25,

26,

27.

28.

29,

30.

31.

32.

33.

Nishino T., Nishioka C., Ura H., Nagumo T. Isolation and partial characterization of a novel amino sugar-containing .fucan sulfate from commercial Fucus vesiculosus fucoidan // Carbohydr. Res. 1994. — Vol. 255, — P. 213-224.

Sakai T., Kawai T., Kato I. Isolation and characterization of a fucoidan-degrading marine bacterial strain and its fucoidanase // Mar. Biotechnol. 2004. — Vol. 6, N 4. — P. 335-346. Sakai T., Kimura H., Kojima K., Shimanaka K., Ikai K., Kato I. Marine bacterial sulfated fucoglucuronomannan (SFGM) lyase digest brown algal SFGM into trisaccharides // Mar. Biotechnol. 2003. — Vol. 5, N 1. — P. 70-78.

Zvyagintseva T.N., Shevchenko N.M., Nazarenko E.L., Gorbach V.I., Urvantseva A.M., Kiseleva M.I., Isakov V.V. Water-soluble polysaccharides of some far-eastern brown seaweeds. Distribution, structure, and their dependence on the developmental conditions // J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 2003. — Vol. 294, N 1. — P. 1-13.

Anastyuk S.D., Shevchenko N.M., Nazarenko E.L., Imbs T.I., Gorbach V.I., Dmitrenok P.S., Zvyagintseva T.N. Structural analysis of a highly sulfated fucan from the brown alga Laminaria cichorioides by tandem MALDI and ESI mass spectrometry // Carbohydr. Res. 2010. — Vol. 345, N 15. — P. 2206-2212.

Usov A.I., Smirnova G.P., Bilan M.I., Shashkov A.S. Polysaccharide of seaweeds. Brown alga Laminaria saccharina (L.) Lam. as a source of fucoidan // Bioorg. Khim. 1998. — Vol. 24, — P. 437-445.

Bilan M.I., Grachev A.A., Shashkov A.S., Kelly M., Sanderson C.J., Nifantiev N.E., Usov A.I. Further studies on the composition and structure of a fucoidan preparation from the brown alga Saccharina latissima II Carbohydr. Res. 2010. — Vol. 345, N 14. — P. 2038-2047. Chand'ia N.P., Matsuhiro B. Characterization of a fucoidan from Lessonia vadosa (Phaeophyta) and its anticoagulant and elicitor properties // Int. J. Biol. Macromol. 2008. — Vol. 42, N3. —P. 235-240.

Chizhov A.O., Dell A., Morris H.R, Haslam S.M., McDowell R.A., Shashkov A.S., Nifant'ev N.E., Khatuntseva E.A., Usov A.I. A study of fucoidan from the brown seaweed Chorda filum II Carbohydr. Res. 1999. — Vol. 320, N 1-2. — P. 108-119.

Shevchenko N.M., Anastyuk S.D., Gerasimenko N.I., Dmitrenok P.S., Isakov V.V., Zvyagintseva T.N. Polysaccharide and lipid composition of the brown seaweed Laminaria gurjanovae II Bioorg. Khim. 2007. — Vol. 33, N 1. — P. 96-107.

Wang J., Zhang Q., Zhang Z., Zhang H., Niu X. Structural studies on a novel fucogalactan sulfate extracted from the brown seaweed Laminaria japonica II Biol. Macromol. 2010. — Vol. 47, N2, —P. 126-131.

Rioux L.E., Turgeon S.L., Beaulieu .M. Structural characterization of laminaran and galactofucan extracted from the brown seaweed Saccharina longicruris II Phytochemistry. 2010. —Vol. 71, N 13. —P. 1586-1595.

Synytsya A., Kim W., Kim S., Pohl R., Synytsya A., Kvasnicka F., Copikova J., Park Y. . Structure and antitumour activity of fucoidan isolated from sporophyll of Korean brown seaweed Undariapinnatifida II Carbohydr. Polym. 2010. — Vol. 81, N 1. — P. 41-48. Sakai T., Ishizuka K., Shimanaka K., Ikai K., Kato I. Structure of oligosaccharides derived from Cladosiphon okamuranus fucoidan by digestion with marine bacterial enzymes // Mar. Biotechnol. 2003. — Vol. 5, N 6. — P. 536-544.

Bilan M.I., Vinogradova E.V., Tsvetkova E.A., Grachev A.A., Shashkov A.S., Nifantiev N.E., Usov A.I. A sulfated glucuronofucan containing both fucofuranose and fucopyranose residues from the brown alga Chordaria jlagelliformis II Carbohydr. Res. 2008. — Vol. 343, N 15. — P. 2605-2612.

Bilan M.I., Zakharova A.N., Grachev A.A., Shashkov A.S., Nifantiev N.E., Usov A.I. Fucoidan from the pacific brown alga Analipus japonicus (Harv.) winne (Ectocarpales, Scytosiphonaceae) // Bioorg. Khim. 2007. — Vol. 33, N 1. — P. 44-53.

Conchie J., Percival E. G. V. Fucoidin. Part II. The hydrolysis of a methylated fucoidin prepared from Fucus vesiculosus II J. Chem. Soc. 1950. — P. 827-832.

34.

35.

36,

37.

38.

39.

40,

41,

42,

43,

44.

45.

46.

47,

48,

49.

Patankar M.S., Oehninger S., Barnett Т., Williams R.L., Clark G.F. A revised structure for fucoidan may explain some of its biological activities // J. Biol. Chem. 1993. — Vol. 268, N 29. —P. 21770-21776.

Chevolot L., Mulloy В., Ratiskol J., Foucault A., Colliec-Jouault S.. A disaccharide repeat unit is the major structure in fucoidans from two species of brown algae // Carbohydr. Res. 2001. — Vol. 330, N 4. — P. 529-535.

Descamps V., Colin S., Lahaye M., Jam M., Richard C., Potin P., Barbeyron Т., Yvin J., Kloareg B. Isolation and culture of a marine bacterium degrading the sulfated fucans from marine brown algae // Maf. Biotechnol. 2006. — Vol. 8, N 1. — P. 27-39 Bilan M.I., Grachev A.A., Ustuzhanina N.E., Shashkov A.S., Nifantiev N.E., Usov A.I. . Structure of a fucoidan from the brown seaweed Fucus evanescens C.Ag. // Carbohydr. Res. . 2002. — Vol. 337, N 8. — P. 719-730.

Kusaykin M.I., Chizhov A.O., Grachev A.A., Alekseeva S.A., Bakunina I.Y., Nedashkovskaya O.I., Sova V.V., Zvyagintseva T.N. A comparative study of specificity of fucoidanases from marine microorganisms and invertebrates // J. Appl. Phycol. 2006. — Vol. 18, N 3-5. — P. 369-373.

Bilan M.I., Grachev A.A., Ustuzhanina N.E., Shashkov A.S., Nifantiev N.E., Usov A.I. A highly regular fraction of a fucoidan from the brown seaweed Fucus distichus L. // Carbohydr. Res. 2004. — Vol. 339, N 3. — P. 511-517.

Bilan M.I., Grachev A.A., Shashkov A.S., Nifantiev N.E., Usov A.I. Structure of a fucoidan from the brown seaweed Fucus serratus L. // Carbohydr. Res. 2006. — Vol. 341, N 2. — P. 238-245.

Adhikari U., Mateii C.G., Chattopadhyay K., Pujol C.A., Damonte E.B., Ray B. Structure and antiviral activity of sulfated fucans from Stoechospermum marginatum II Phytochem. 2006. — Vol. 67 N22. — P. 2474-2482.

Usov A.I., Smirnova G.P., Klochkova N.G. Polysaccharides of Algae 58. The polysaccharide composition of the Pacific brown alga Alaria jistulosa (Alariaceae, Laminariales) // Russ. Chem. Bull. 2005. — Vol. 54, N 5. — P. 1282-1286.

Xue C.-H., Fang Y., Lin H., Chen L., Li Z.-J., Deng D., Lu С.-Х. Chemical characters and antioxidative properties of sulfated polysaccharides from Laminaria japonica II J. Appl. Phycol. 2001. — Vol. 13, N 1. — P. 67-70.

Шевченко H.M., Анастюк. С.Д., Герасименко Н.И., Дмитренок П.С, Исаков В.В., Звягинцева Т.Н. . Полисахаридный и липидный состав бурой водоросли Laminaria gurjanovae II Биоорг. Химия. 2007. — Т. 33, — С. 96-107.

Zhu W., Ooi V.E., Chan Р.К., Ang P.O. Jr. Isolation and characterization of a sulfated polysaccharide from the brown alga Sargassum patens and determination of its anti-herpes activity // Biochem. Cell Biol. 2003. — Vol. 81, N 1. — P. 25-33.

Lee J.-B., Takeshita A., Hayashi K., Hayashi T. Structures and antiviral activities of polysaccharides from Sargassum trichophyllum I I Carbohydr. Polym. 2011. — Vol. 86, N 1. — P. 995- 999.

Suresha V., Anbazhagana C., Thangamb R., Senthilkumarc D., Senthilkumard N., Kannane S., Rengasamyd R., Palanid P. Stabilization of mitochondrial and microsomal function of fucoidan from Sargassum plagiophyllum in diethylnitrosamine induced hepatocarcinogenesis // Carbohydr. Polym. 2013. Vol. 92, N 2. — P. 1377- 1385.

Dorea C.M.P.G., Alvesa M.G.C.F., Willa L.S.E.P., Costaa T.G., Sabryb D.A., de Souza Regoa L.A.R., Accardob C.M., Rochaa H.A.O., Filgueira L.G.A., Leite E.L. A sulfated polysaccharide, fucans, isolated from brown algae Sargassum vulgare with anticoagulant, antithrombotic, antioxidant and anti-inflammatory effects // Carbohydr. Polym. 2013. — Vol. 91, N 1, — P. 467-475.

Duarte M.E., Cardoso M.A., Noseda M.D., Cerezo A.S. Structural studies on fucoidans from the brown seaweed Sargassum stenophyllum II Carbohydr. Res. 2001. — Vol. 333, N 4. — P. 281-293.

50. Li В., Wei X.J., Sun J.L.j Xu S.Y. Structural investigation of a fiicoidan containing a fucose-free core from the brown seaweed, Hizikia fusiforme II Carbohydr. Res. 2006. — Vol. 341, N 9. —P. 1135-1146.

51. Leite E.L., Medeiros M.G.L., Rocha H.A.O., Farias G.G.M., da Silva L.F., Chavante S.F., de Abreu L.D., Dietrich C.P., Nader H.B. Structure and pharmacological activities of a sulfated xylofucoglucuronan from the alga Spatoglossum schroederi II Plant Sei. 1998. — Vol. 132, N 2. —P. 215-228.

52. Rocha H.A., Moraes F.A., Trindade E.S., Franco C.R., Torquato R.J., Veiga S.S., Valente A.P., Mourao P.A., Leite E.L., Nader H.B., Dietrich C.P. Structural and hemostatic activities of a sulfated galactofucan from the brown alga Spatoglossum schroederi. An ideal antithrombotic agent? // J. Biol. Chem. 2005. — Vol. 280, N 50. — P. 41278-41288.

53. Bilan M.I., Grachev A.A., Shashkov A.S., Thu Thuy T.T., Thanh Van T.T., Minh Ly B.,Nifantiev N.E., Usov A.I. Preliminary investigation of a highly sulfated galactofucan fraction isolated from the brown alga Sargassum polycystum II Carbohydr. Res. 2013. — Vol. 377, —P. 48-57.

54. Chattopadhyay N., Ghosh Т., Sinha S., Chattopadhyay K., Karmakar P., Ray B. Polysaccharides from Turbinaria conoides: Structural features and antioxidant capacity // Food Chem. 2010. — Vol. 118, N 3. — P. 823-829.

55. Thinh P.D., Menshova R.V., Ermakova S.P., Anastyuk S.D., Ly B.M., Zvyagintseva T.N. Structural characteristics and anticancer activity of fucoidan from the brown alga Sargassum mcclurei II Mar. Drugs. 2013. — Vol. 11, N 5. — P. 1456-1476.

56. Badrinathan S., Shiju T.M., Christa A.S.S., Arya R., Pragasam V. Purification and structural characterization of sulfated polysaccharide from Sargassum myriocystum and its efficacy in scavenging free radicals // Indian J. Pharm. Sei. 2012. — Vol. 74, N 6. — P. 549-555.

57. Mulloy В., Ribeiro A.C., Alves A.P., Vieira R.P., Mourao P.A. Sulfated fucans from echinoderms have a regular tetrasaccharide repeating unit defined by specific patterns of sulfation at the 0-2 and 0-4 positions // J. Biol. Chem. . 1994. — Vol. 269, N 35. — P. 2211322123.

58. Kariya Y., Mulloy В., Imai K., Tominaga A., Kaneko Т., Asari A., Suzuki K., Masuda H., Kyogashimaa M., Ishiic T. Isolation and partial characterization of fucan sulfates from the body wall of sea cucumber Stichopus japonicus and their ability to inhibit osteoclastogenesis // Carbohydr. Res. 2004. —:Vol. 339, N 7. — P. 1339-1346.

59. Vilela-Silva A.C., Castro M.O., Valente A.P., Biermann C.H., Mourao P.A. Sulfated fucans from the egg jellies of the closely related sea urchins Strongylocentrotus droebachiensis and Strongylocentrotus pallidus ensure species-specific fertilization // J. Biol. Chem. 2002. — Vol. 277, N 1. — P. 379-387.

60. Alves A.P, Mulloy В., Moy G.W., Vacquier V.D., Mourao P.A. Females of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus differ in the structures of their egg jelly sulfated fucans // Glycobiology. 1998. — Vol. 8, N 9. — P. 939-946.

61. Alves A.P., Mulloy В., Diniz J.A., Mourao P.A. Sulfated polysaccharides from the egg jelly layer are species-specific inducers of acrosomal reaction in sperms of sea urchins // J. Biol. Chem. 1997. — Vol. 272, N 11. — P. 6965-71.

62. Vilela-Silva A.C., Hirohashi N., Mourao P.A. The structure of sulfated polysaccharides ensures a carbohydrate-based mechanism for species recognition during sea urchin fertilization // Int. J. Dev. Biol. 2008. — Vol. 52, N 5-6. — P. 551-559.

63. Усов А.И., Билан М.И. Фукоиданы-сульфатированные полисахариды бурых водорослей // Усп. химии. 2009. — Vol. 78, N 8. — Р. 848-862.

64. Chen S., Hu Y., Ye X,, Li G., Yu G., Xue C., Chai W. Sequence determination and anticoagulant and antithrombotic activities of a novel sulfated fucan isolated from the sea cucumber Isostichopus badionotus И Biochim. Biophys. Acta. 2012. — Vol. 1820, N 7. — P. 989-1000.

65. Ribeiro A.-C., Vieira R.P., Mourao P.A.S., Mulloy B. A sulfated a-L-fucan from sea cucumber // Carbohydr. Res. 1994. — Vol. 255, — P. 225-240.

66. Yu L., Xu X., Xue C., Chang Y., Ge L., Wanga Y., Zhang C., Liu G., He C. Enzymatic preparation and structural determination of oligosaccharides derived from sea cucumber {Acaudina molpadioides) fucoidan // Food Chem. 2013. — Vol. 139, N 1. — P. 702-709.

67. Vilela-Silva A.-C.ES., Alves A.-P., Valente A.-P., Vacquier V.D., Mourao P.A.S. Structure of the sulfated a-L-fucan from the egg jelly coat of the sea urchin Strongylocentrotus franciscanus: patterns of preferential 2-O-and 4-O-sulfation determine sperm cell recognition // Glycobiology. 1999. — Vol. 9, N 9. — P. 927-933.

68. Vilela-Silva A.-C.E.S., Castro M.O., Valente A.-P., Biermann C.H., Mourao P.A.S. Sulfated fucans from the egg jellies of the closely related sea urchins Strongylocentrotus droebachiensis and Strongylocentrotus pallidus ensure species-specific fertilization // J. Biol. Chem. 2002. — Vol. 277, N 1. — P. 379-387.

69. Alves A.-P., Mulloy B., Moy G.W., Vacquier V.D., Mourao P.A.S. Females of the sea urchin Strongylocentrotus purpnratus differ in the structures of their egg jelly sulfated fucans // Glycobiology. 1998. — Vol. 8, N 9. — P. 939-946.

70. Pomin V.H.. Pereira M.S.. Valente A.-P„Tollefsen D.M., Pavao M.S.G., Mourao P.A.S. Selective cleavage and anticoagulant activity of a sulfated fucan: stereospecific removal of a 2-sulfate ester from the polysaccharide by mild acid hydrolysis, preparation of oligosaccharides, and heparin cofactor II-dependent anticoagulant activity // Glycobiology. 2005. — Vol. 15, N 4. —P. 369-381.

71. Alves A.-P., Mulloy B., Diniz J.A., Mourao P.A.S. Sulfated polysaccharides from the egg jelly layer are species-specific Inducers of acrosomal reaction in sperms of sea urchins // J. Biol. Chem. 1997. — Vol. 272, N 11. — P. 6965-6971.

72. Yaphe W., Morgan K. Enzymic hydrolysis of fucoidan by Pseudomonas atlantica and Pseudomonas carrageenovora II Nature. 1959. — Vol. 183, —P. 761-762.

73. Thanassi N.M., Nakada H. I. Enzymic degradation of fucoidan by enzymes from the hepatopancreas of abalone, Haliotus species // Arch. Biochem. Biophys. 1967. — Vol. 118, — P. 172-177. .

74. Gebler J., Gilkes N.R., Claeyssens M., Wilson D.B., Beguin P., Wakarchuk W.W., Kilburn D.G., Miller R.C., Jr., Warren R.A.>, Withers S.G. Stereoselective hydrolysis catalyzed by related beta-l,4-glucanases and beta-l,4-xylanases // J. Biol. Chem. 1992. — Vol. 267, N 18. — P. 12559-12561.

75. Henrissat B., Callebaut I., Fabrega S., I-.ehn P., jVtoraon J.P., Davies G. Conserved catalytic machinery and the prediction of a common fold for several families of glycosyl hydrolases // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. — Vol. 92, N 15. — P. 7090-7094.

76. Colin S., Deniaud E., JanrM., Descamps V., Chevolot Y., Kervarec N., Yvin J., Barbeyron T., Michel G., Kloareg B. Cloning and biochemical characterization of the fucanase FcnA: definition of a novel glycoside hydrolase family specific for sulfated fucans // Glycobiology. 2006. —Vol. 16 N11, —P. 1021-1032. . -

77. Pat. USA 6489155 (Bl). Enzymes capable of degrading a sulfated-fucose-containing polysaccharide and their encoding genes / Takayama M., Koyama N., Sakai T., Kato I.; assignee: Takaro Shuzo CO., LTD <JP).—publl. 03.12.2002.

78. Miller G.L., Use of dinitrosalicyhc acid reagent for determination of reducing sugar // Anal. Chem. 1959.—Vol. 31,N3. —P.426-428. .

79. Waffenschmidt S. Jaenicke L. Assay of reducing sugars in nanomole range with 2,2-bicinchoninate // Anal. Biochem. 1987. — Vol. 165, N 2. — P. 337-340.

80. Park J.T., Johnson M.J. A submicrodetermination of glucose U J. Bil. Chem. 1949. — Vol. 181, N 1. —P. 149-151.

81. Nelson T.E., Scarletti J. V., Smith F., Kirkwood S. // Can. J. Chem. 1962. — Vol. 245, — P. 1671-1678.

82. Almin K.E., Eriksson K.E. Enzymic degradation of polymers. I. viscometric method for the determination of enzymic activity // Biochim. Biophys. Acta. 1967. — Vol. 139, N 2. — P. 238-247.

83. Volpi N., Maccari F. Electrophoretic approaches to the analysis of complex polysaccharides // J. Chromatogr. B. 2006. — Vol. 834, N 1-2. — P. 1-13.

84. Min H., Cowman M.K. Combined alcian blue and silver staining of glycosaminoglucans in polyacrylamide gels: app;ication to electrophoretic analysis of molecular weight distribution // Anal. Biochem. 1986. — Vol. 155, N 1. — P. 275-285.

85. Goubet F., Jakson P., Deery M., Dupree P. Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: a method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases // Anal. Biochem. 2002. — Vol. 300, N 1. — P. 53-68.

86. Dietrich C.P., Farias G.G.M., de Abreu L.R.D., Leite E.L., da Silva L.F., Nader H.B. A new approach for the characterization of polysaccharides from algae: presence of four main acidic polysaccharides in thee species of the class Phaeophyceae // Plant Sci. 1995. — Vol. 108, N 2.

— P. 143-153.

87. Билан М.И., Кусайкин М.И., Грачев A.A., Цветкова Е.А., Звягинцева Т.Н., Усов А.И. Действие ферментного препарата морского моллюска Littorina kurila на фукоидан из бурой водоросли Fucus distichus // Биохимия. 2005. — Т. 70, № 12. — С. 1606-1612.

88. Kitamikado М., Yamaguchi К., Tseng С.Н., Okabe В. Method designed to detect alginate-degrading bacteria // Appl. Environ. Microbiol. 1990. — Vol. 56, N 9. — P. 2939-2940.

89. Бакунина И.Ю., Шевченко JI.C., Недашковская О. И., Шевченко Н. М., Алексеева С. А., Михайлов В.В., Звягинцева Т. Н. Поиск фукоидан-гидролаз среди морских микроорганизмов // Микробиология. 2000. — Т. 69, № 3. — С. 370-376.

90. Бакунина И.Ю. Недашковская О. И., Алексеева С. А., Иванова Е. П., Романенко Л. А., Горшкова Н. М., Исаков В. В., Звягинцева Т. Н., Михайлов В. В. // Микробиология. 2002. — Т. 71, № 1. — С. 49-55.

91. Бурцева Ю. В., Кусайкин М. И., Сова В. В., Шевченко Н. М., Скобун С. А., Звягинцева Т. Н. Распространение фукоиданаз и некоторых гликозидаз среди морских безпозвоночных // Биология моря. 2000. — Т. 26, № 6. — С. 429-432.

92. Kusaykin M.I., Burtseva, Y.V., Svetasheva T.G., Sova V.V., Zvyagintseva T.N. Distribution of O-glycosylhydrolases in marine invertebrates. Enzymes of the marine mollusk Littorina kurila that catalyze fucoidan transformation // Biochemistry (Mosc). 2003. — Vol. 68, N 3. — P. 317-324.

93. Rodriguez-Jasso R.M., Mussatto S.I., Pastrana L., Aguilar C.N., Teixeira J. A. Fucoidan-degrading fungal strains: screening, morphometric evaluation, and Influence of medium composition // Appl. Biochem. Biotechnol. 2010. — Vol. 162, N 8. — P. 2177-2188.

94. Sakai Т., Ishizuka K., Kato I. Isolation and characterization of a fucoidan-degrading marine bacterium // Mar. Biotechnol. 2003. — Vol. 5, N 5. — P. 409-416.

95. Ohshiro Т., Ohmoto Y., Ono Y., Ohkita R., Miki Y., Kawamoto H., Izumi Y. Isolation and characterization of a novel fucoidan-degrading microorganism // Biosci. Biotechnol. Biochem. . 2010. — Vol. 74, N 8. — P. 1729-1732.

96. Chang Y., Xue C., Tang Q., Li D., Wu X., Wang J. Isolation and characterization of a sea cucumber fucoidan utilizing marine bacterium // Lett. Appl. Microbiol. 2010. — Vol. 50, N 3.

— P. 301-307.

97. Woo-Jung K., Kim S., Lee Y., Kim H., Kim H„ Moon S., Suh H., Jang K., Park Y. Isolation and characterization of marine bacterial strain degrading fucoidan from korean Undaria pinnatiflda sporophylls // L Microbiol. Biotechnol. 2008. — Vol. 18, N 4. — P. 616-623.

98. Sakai Т., Kimura H., Kato I. Purification of sulfated fucoglucuronomannan lyase from bacterial strain of Fucobacter marina and study of appropriate conditions for Its enzyme digestion // Mar. Biotechnol. 2003. — Vol. 5, N 4. — P. 380-387.

99.

100

101

102

103

104

105

106

107.

108.

109.

110.

111.

112.

113.

114.

115.

Furukawa S., Fujikawa Т., Koga D., Ide A. Purification and some properties of exo-type fucoidanases from Vibrio'sp. N-5 // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1992. —Vol. 56, N 11. — P. 1829-1834.

Kitamura K., Matsuo M.,- Yasui T. Enzymic degradation of fiicoidan by fucoidanase from hepatopancreas of Patinopecten yessoensis II Biosci. Biotechnol. Biochem. 1992. — Vol. 56, N 3. — P. 490-494.

Билан М.И., Кусайкин М.И., Грачев A.A., Цветкова Е.А., Звягинцева Т.Н., Усов А.И. Действие ферментного препарата морского моллюска Littorina kurila на фукоидан из бурой водоросли Fucus distichus // Биохимия. 2005. — Т. 70, № 12. — С. 1606-1612. Sasaki К., Sakai Т., Kojima К., Nakayama S., Nakanishi Y., Kato I. Partial purification and characterization of an enzyme releasing 2-sulfo-a-L-fucopyranose from 2-sulfo-a-L-fucopyranosyl-(l—>2) pyridylaminated fucose from a sea urchin, Srtrongylocentrotus nudus // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1996. — Vol. 60, N 4. — P. 666-668.

Wu Q. Zhang M., Wu K., Liu В., Cai J., Pan R. Purification and characteristics of fucoidanase obtained from Dendryphiella arertaria TM94 // J. Appl. Phycol. 2011. — Vol. 23, N 2. — P. 197-203.

Wu Q., Ma S., Xiao H.,. Zhang M, Cai J. Purification and the secondary structure of fucoidanase from Fusarium sp. LD8 // Evid. Based. Complement. Alternat. Med. 2011. — Vol. 2011, N 196190. —P. 1-8.

Daniel R., Berteau O., Chevolot L., Varenne A., Gareil P., Goasdoue N. Regioselective desulfation of sulfated L-fucopyranoside by a new sulfoesterase from the marine mollusk Pecten maximus. Application to the structural study of algal fiicoidan (Ascophyllum nodosum) // Eur. J. Biochem. 2001. — Vol. 268, N 21. — P. 5617-5626.

Berteau O., McCort I., Goasdoue N., Tissot В., Daniel R. Characterization of a new a-L-fiicosidase isolated from the marine mollusk Pecten maximus that catalyzes the hydrolysis of a-L-fucose from algal fucoidan {Ascophyllum nodosum) II Glycobiology. 2002. — Vol. 12, N 4. — P. 273-282.

Sakai Т., Kimura H., Kojima K., Ikai K., Akiyoshi S., Nakanishi Y., Kato I. Endo-fucoidan-lyase. — Japan, 2001.

Sakai Т., Kimura H., Kato I. A marine strain of Flavobacteriaceae utilizes brown seaweed fucoidan // Mar. Biotechnol. 2002. — Vol. 4, N 4. — P. 399-405.

Sova V.V., Elyakova L.A. Some aspects of the specificity and action pattern of (3-1,3-glucan glucanohydrolase from Spisula sachalinensis II Biochim. Biophys. Acta. 1971. — Vol. 258, N 1. —P. 219-227.

Daniel R., Berteau O., Jozefonvicz J., Goasdoue N. Degradation of algal (Ascophyllum nodosum) fucoidan by an enzymatic activity contained in digestive glands of the marine mollusc Pecten maximus // Carbohydr. Res. 1999. — Vol. 322, N 3-4. — P. 291-297. Кусайкин М.И., Чижов A.O., Алексеева C.A., Бакунина И.Ю., Недашковская О.И., Сова

B.В., Звягинцева Т.Н. Сравнительное исследование специфичности фукоиданаз морских микроорганизмов и беспозвоночных // Доклады Академии Наук. 2004. — Т. 396, № 5. —

C. 1-3.

Altschul S.F., Madden Т. L., Schaffer А.А., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs // Nucleic Acids Res. 1997 —Vol. 25, N 17. — P. 3389-3402.

Lemesle-Varloot L., Henrissat В., Gaboriaud C., Bissery V., Morgat A., Mornon J.P. Hydrophobic cluster analysis: procedures to derive structural and functional information from 2-D-representation of protein sequences // Biochimie. 1990. — Vol. 72, N 8. —P. 555-574. Heger A., Holm L. Rapid automatic detection and alignment of repeats in protein sequences // Proteins. 2000. — Vol. 41, N 2. — P. 224-237.

Bateman A., Coin L., Durbin R., Finn R.D., Hollich V., Griffiths-Jones S., Khanna A., Marshall M., Moxon S., Sonnhammer E.L., Studholme D.J., Yeats C., Eddy S.R. . The Pfam protein families database // Nucleic Acids Res. 2004. — Vol. 32, — P. 138-141.

116. Tepass U., Truong К., Godt D., Ikura M., Peifer M. Cadherins in embryonic and neural morphogenesis // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2000. — Vol. 1, N 2. — P. 91-100.

117. Cao L., Yan X., Borysenko C.W., Blair H.C., Wu C., Yu L. CHLD. A cadherin-like domain in Proteobacteria and Cyanobacteria // FEMS Microbiol. Lett. 2005. — Vol. 251, N 2. — P. 203209.

118. Fraiberg M., Borovok I., Wainer R.M., Lamed R., Bayer E.A. Bacterial cadherin domains as carbohydrate binding modules: determination of affinity constants to insoluble complex polysaccharides // Biomass Convers.: Methods and Protocols. 2012. — Vol. 908, N 11. — P. 109-118.

119. Fraiberg M., Borovok I., Wainer R.M., Lamed R. Discovery and characterization of cadherin domains in Saccharophagus degradans 2-40 // J. Bacterid. 2010. — Vol. 192, N 4. — P. 1066-1074.

120. Fraiberg M., Borovok I., Bayer E.A., Wainer R.M., Lamed R. Codherin domein in polysaccharide-degrading marine bacterium Saccharophagus degradans 2-40 are carbohydrate binding modules // J. Bacteriol. 2011. — Vol. 193, N 1. — P. 283-285.

121. Barbeyron Т., L'Harold S., Michel G., Czjzek M. Mariniflexile fucanivorans sp. nov., a marine member of the Flavobacteriaceae that degrades sulphated fucans from brown algae // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008. — Vol. 58, — P. 2107-2113.

122. Okazaki M., Furuya K., Tsukayama K., Nisizawa K. Isolation and identification of alginic acid from a calcareous red alga Serraticardia maxima II Bot. Mar. 1982. — Vol. 25, N 3. — P. 123131.

123. Skjak-Braek G., Larsen B, Grasdalen H. The role of O-acetyl groups in the biosynthesis of alginate by Azotobacter vinelandii II Carbohydr. Res. 1985. — Vol. 145, N 1. — P. 169-174.

124. Rossel K.G., Srivastava L.M. . Seasonal variation in the chemical constituents of the brown algae Macrocystis integrifolia and Noveocystic luetkeana II Can. J. Bot. . 1984. — Vol. 62, — P. 2229-2236.

125. Sowjanya J.A., Singh J., Mohita Т., Sarvanan S., Moorthi A., Srinivasan N., Selvamurugan N. Biocomposite scaffolds containing chitosan/alginate/nano-silica for bone tissue engineering // Colloids Surf., B. 2013. — Vol. 109, N 1. — P. 294-300.

126. De Santis S., Diociaiuti M., Cametti C., Masci G. Hyaluronic acid and alginate covalent nanogels by template cross-linking in polyion complex micelle nanoreactors // Carbohydr. Polym. 2014, —Vol. 101, —P. 96-103.

127. Alboofetileh M., Rezaei M., Hosseini H., Abdollahi M. Antimicrobial activity of alginate/clay nanocomposite films enriched with essential oils against three common foodborne pathogens // Food Control. 2014. — Vol. 36, N 1. — P. 1-7.

128. Kim J., Sachdev P., Sidhu K. Alginate microcapsule as a 3D platform for the efficient differentiation of human embryonic stem cells to dopamine neurons // Stem Cell Res. 2013. — Vol. 11, N 3. — P. 978-989.

129. Fujihara M., Nagumo T. An influence of the structure of alginate on the chemotactic activity of macrophages and the antitumor activity // Carbohydr. Res. 1993. — Vol. 243, N 1. — P. 211216.

130. Баранов В. Фруктово-ягодное покрытие тортов и пирожных с альгинатом натрия // Обществ, питание. 1980» — Т. 3, — С. 12-13.

131. Усов А.И., Альгиновые ^кислоты и альгинаты: методы анализа, определения состава и установления строения//Усп. химии. 1999. — Т. 68, —С. 1051-1061.

132. Rehm В.Н., Valla S. Bacterial alginates: biosynthesis and applications // Appl Microbiol Biotechnol. 1997. — Vol. 48, N 3. — P. 281-8.

133. Michel G., Tonon Т., Scornet D., Cock J.M., Kloareg B. The cell wall polysaccharide metabolism of the brown alga Ectocarpus siliculosus. Insights into the evolution of extracellular matrix polysaccharides in Eukaryotes // New Phytologist. 2010. — Vol. 188, N 1. — P. 82-97.

134. Wong T.Y., Preston L.A.; Schiller N.L. . ALGINATE LYASE: Review of major sources and enzyme characteristics, structure-function analysis, biological roles, and applications // Annu. Rev. Microbiol. 2000. — Vol. 54, — P. 289-340.

135. Donnan F.G., Rose R.C. Osmotic pressure, molecular weight and viscosity of sodium alginate // Can. J. Res. Sect. B. 1950. — Vol. 28, N 3. — P. 105-113.

136. Madgwick J., Haug A., Larsen B. Ionic requirements of alginate-modifying enzymes in the marine alga Pelvetia canaliculata (L.) Dene, et Thur. // Bot. Mar. 1978. — Vol. 21, N 1. — P. 1-3.

137. Preiss J., Ashwell G. Alginic acid metabolism in bacteria. I. Enzymatic formation of unsaturated oligosaccharides and 4-deoxy-L-erythro-5-hexoseulose uronic acid // J. Biol. Chem.. 1962. —Vol. 237, —P. 309-316.

138. Boyd J., Turvey J.R. Isolation of a poly-L-guluronate lyase from Klebsiella aerogenes II Carbohydr. Res. 1977. — Vol. 57, —P. 163-171.

139. Madgwick J., Haug A., Larsen B. Alginate lyase in the brown alga Laminaria digitata (Huds.) Lamour. // Acta Chem. Scand. 1973. — Vol. 27, N 2. — P. 711-712.

140. Watanabe T., Nisizawa K. Enzymatic studies on alginate lyase from Undaria pinnatifida in relation to texture softening prevention by ash-treatment (Haiboshi) // Bull. Jpn. Soc. Sci. Fish. 1982. —Vol.48, —P. 243-249.

141. Favorov V.V., Purification of alginases by affinity chromatography on a Bio-Gel alginate column // Int. J. Biochem. 1973. — Vol. 4, N 20. — P. 107-110.

142. Seiderer L.J., Newell R.C., Cook P.A. Quantitative significance of style enzymes from two marine mussels (Choromytilus meridionalis Krauss and Perna perna Linnaeus) in relation to diet // Mar. Biol. Lett. 1982. — Vol. 3, N 4-5. — P. 257-271.

143. Muramatsu T., Hirose S., Katayose M. Isolation and properties of alginate lyase from the midgut gland of wreath shell Turbo cornutus II Agric. Biol. Chem. 1977. — Vol. 41, — P. 19391946.

144. Bartell P.F., Orr T.E., Lam G.K.H. Polysaccharide depolymerase associated with bacteriophage infection II J. Bacterid. 1966. — Vol. 92, N 1. — P. 56-62.

145. Davidson I.W., Lawson C.J., Sutherland I.W. An alginate lyase from Azotobacter vinelandii phage // J. Gen. Microbiol. 1977. — Vol. 98, N 1. — P. 223-29.

146. Brown B.J., Preston J.F. III. L-Guluronan-specific alginate lyase from a marine bacterium associated with Sargassum II Carbohydr. Res. 1991. — Vol. 211, — P. 91-102.

147. Romeo T., Preston J.F. III. Purification and structural properties of an extracellular (l-4)-/?-D-mannuronanspecific alginate lyase from a marine bacterium // Biochemistry 1986. — Vol. 25, — P. 8385-8391.

148. Stevens R.A., Levin R.E. Purification and characteristics of an alginase from Alginovibrio aquatilis II Appl. Environ. Microbiol. 1977. — Vol. 33, N 5. — P. 1156-1161.

149. Boyen C., Bertheau Y., Barbeyron T., Kloareg B. Preparation of guluronate lyase from Pseudomonas alginovora for protoplast isolation in Laminaria II Enzyme Microb. Technol. 1990. —Vol. 12, — P. 885-890.

150. Kraiwattanapong J., Tsuruga H., Ooi T., Kinoshita S. Cloning and sequencing of a Delaya marina gene encoding for alginate lyase // Biotechnol. Lett.. 1999. — Vol. 21, N 2. — P. 169174.

151. Li L., Jiang X., Guan H., Wangb P. Preparation, purification and characterization of alginate oligosaccharides degraded by alginate lyase from Pseudomonas sp. HZJ 216 // Carbohydr. Res. 2011. — Vol. 346, N 6. — P. 794-800.

152. Sawabe T., Ezura Y., Kimura T. Purification and characterization of an alginate lyase from marineAlteromonas sp. //'Nippon. Suisan. Gakkaishi.. 1992. — Vol. 58, N 3. — P. 521-527.

153. Sawabe T., Ohtsuka M., Ezura Y. Novel alginate lyases from marine bacterium Alteromonas sp. strain H-4 // Carbohydr. Res. 1997. — Vol. 304, N 1. — P. 69-76.

154.

155.

156,

157,

158.

159

160.

161.

162.

163.

164.

165.

166.

167.

168.

169.

170.

171.

172.

Sawabe T., Sawada C., Suzuki E., Ezura Y. Intracellular alginateoligosaccharide degrading enzyme activity that is incapable of degrading intact sodium alginate from a marine bacterium Alteromonas sp. // Fish. Sci. 1998. — Vol. 64, N 2. — P. 320-334.

Doubet R.S., Quatrano R.S. Isolation of marine bacteria capable of producing specific lyases for alginate degradation // Appl. Environ. Microbiol.. 1982. — Vol. 44, N 3. — P. 754-756. Doubet R.S., Quatrano R.S. Properties of alginate lyases from marine bacteria // Appl. Environ. Microbiol. 1984. — Vol. 47, N 4. — P. 699-703.

Haraguchi K., Kodama T. Purification and propertes of poly(P-d-mannuronate) lyase from Azotobacter chroococcum // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996. — Vol. 44, N 5. — P. 576581.

Linker A., Evans L.R. Isolation and characterization of an alginase from mucoid strains of Pseudomonas aeruginosa // J. Bacterid.. 1984. — Vol. 159, N 3. — P. 958-964. Yonemoto Y., Murata K., Kimura A., Yamaguchi H., Okayama K. Bacterial alginate lyase: characterization of alginate lyase-producing bacteria and purification of the enzyme // J. Ferment. Bioeng. 1991. — Vol. 72, N 3, —P. 152-157.

Pecina A., Pascual A., Paneque A. Cloning and expression of the algL gene, encoding the Azotobacter chroococcum alginate lyase: purification and characterization of the enzyme // J. Bacterid. 1999. —Vol. 181, N5. —P. 1409-1414.

Hashimoto W., Okamoto M., Hisano T., Momma K., Murata K. Sphingomonas sp. A1 lyase active on both poly-P-d-mannuronate and heteropolymeric regions in alginate // J. Ferment. Bioeng. 1998. — Vol. 86, N 2. — P. 236-238.

Muramatsu T., Sogi T. Characterization of alginate lyases from a marine bacterium // Comp. Biochem. Physiol. 1990. — Vol. 97B, — P. 103-108.

Sutherland I.W., Keen G.A. Alginases from Beneckea pelagia and Pseudomonas spp. // J. Appl. Biochem.. 1981. — Vol. 3, — P. 48-57.

Min K.H., Sasaki S.F., Kashiwabara Y., Nisizawa K. Substrate specificity of endo-polyguluronide lyases from Pseudomonas sp. on the basis of their kinetic properties // J. Biochem. 1977. — Vol. 81, N 3. — P. 547-553. • -

Nakagawa A., Ozaki T., Chubachi K., Hosoyama T., Okubo T., Iyobe S., Suzuki T. An effective method for isolating alginate lyase-producing Bacillus sp. ATB-1015 strain and purification and characterization of the lyase // J, Appl. Microbiol. 1998. — Vol. 84, N 3. — P. 328-335.

Lange B., Wingender J., Winkler U.K. Isolation and characterization of an alginate lyase from Klebsiella aerogenes II Arch. Microbiol.,. 1989. — Vol. 152, N 3. — P. 302-308. Schiller N.L., Monday S.R., Boyd C.M.,Keen N.T., Ohman D.E. Characterization of the Pseudomonas aeruginosa alginate, lyase gene (algL): cloning, sequencing, and expression in Escherichia coli // J. Bacteriol, 1993. — Vol. 175, N 15. — P. 4780-4789. Kaneko Y., Yonemoto Y., Okayama K., Kimura A., Murata K. Bacterial alginate lyase: properties of the enzyme formed in a mixed culture of bacteria isolated from soil // J. Ferment. Bioeng. 1990. — Vol. 70, N 3. —147-149.

Chavagnat F., Duez C., Guinand M., Potin P., Barbeyron T., Henrissat B., Wallach J., Ghuysen J.M. Cloning, sequencing and overexpression in Escherichia coli of the alginatelyase-encoding aly gene of Pseudomonas alginovora: identification of three classes of alginate lyases // Biochem. J. 1996. — Vol. 319, N Pt 2. — P. 575-583.

Schaumann K., Weide G. Enzymatic degradation of alginate by marine fungi // Hydrobiologia. 1990. — Vol. 204-205, N 1. — P. 589-596, .

Singh R.P., Gupta V., Kumari P., Kumar Mtj Reddy C.R.K,, Prasad K., Jha B. Purification and partial characterization of an extracellular alginate lyase from Aspergillus oryzae isolated from brown seaweed // J. Appl. Phycol. 2011. — Vol. 23, N 4. — P. 755-762. Wainwright M., Sherbrock-Cox V, Factors influencing alginate degradation by the marine fungi: Dendryphiella salina and D, arenaria II Bot. Mar. . 1981. — Vol. 24, N 9. — P. 489491.

173. Shimokawa T., Yoshida S., Takeuchi T., Murata K., Kobayashi H., Kusakabe I. Purification and characterization of extracellular poly(beta-D-l,4-mannuronide) lyase from Dendryphiella salina IFO 32139 // Biosci. Biotechnol. Biochem.. 1997. — Vol. 61, N 4. — P. 636-640.

174. Wainwright M. Alginate degradation by the marine fungus Dendryphiella salina II Mar. Biol. Lett. 1980, —Vol. 1, N 6. — P. 351-354.

175. Bradshaw R.E., Bhatnagar D., Ganley R.J., Gillman C.J., Monahan B.J., Seconi J.M. Dothistroma pini, a forest pathogen, contains homologs of aflatoxin biosynthetic pathway genes // Appl. Environ. Microbiol.. 2002. — Vol. 68, N 6. — P. 2885-2892.

176. Berka R.M., Grigoriev I.V., Otillar R. et al. Comparative genomic analysis of the thermophilic biomass-degrading fungi- Myceliophthora thermophila and Thielavia terrestris II Nat. Biotechnol.. 2011. — Vol. 29, N 10. — P. 922-927.

177. Machida M., Asai K., Sario M. et al. Genome sequencing and analysis of Aspergillus oryzae II Nature. 2005. — Vol. 438, N 7071. — P. 1157-1161.

178. Schirawski J., Mannhaupt G., Munch K. et al. Pathogenicity determinants in smut fungi revealed by genome comparison // Science. 2010. — Vol. 330, N 6010. — P. 1546-1548.

179. Sarrocco S., Fanti S., Vannacci G. Are terrestrial Ascomycetes lacking in alginolytic activity ? // J. Gen. Appl. Microbiol. 2004. — Vol. 50, N 4. — P. 229-234.

180. Barker T., Eklund C., Wyss O. Physical differences of virus-associated depolymerases // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1968. — Vol. 30, N 6. — P. 704-710.

181. Pike L., Wyss O. Isolation and characterization of phage-resistant strains of Azotobacter vinelandii II J. Gen. Microbiol. 1975, — Vol. 89, N1. —P. 182-86.

182. Eklund C., Wyss O. Enzyme associated with bacteriophage infection // J. Bacteriol. 1962. — Vol. 84, N 6. — P. 1209-1215.

183. Suda K., Tanji Y., Hori K., Unno H. Evidence for a novel Chlorella virusencoded alginate lyase // FEMS Microbiol. Lett. 1999. — Vol. 180, N 1. — P. 45-53.

184. Elyakova L.A., Favorov V.V. Isolation and certain properties of alginate lyase VI from the mollusk Littorina sp. // Biochim. Biophys. Acta. 1974. — Vol. 358, N 2. — P. 341-354.

185. Favorov V.V., Vozhova E.I., Denisenko V.A., Elyakova L.A. A study of the reaction catalysed by alginate lyase VI from the sea mollusc, Littorina sp. // Biochim. Biophys. Acta. 1979. — Vol. 569, N 2. — P. 259-266.

186. Muramatsu T., Yamada K., Date M., Yoshioka S. Action of poly(p-D-mannuronate)lyase from Turbo cornutus on oligomeric substrates // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1993. — Vol. 57, N 12. —P. 1990-1994.

187. Muramatsu T., Egawa K. Isozymes of alginate lyase in the mid-gut gland of Turbo cornutus II Agric. Biol. Chem. 1980. — Vol. 44, N 11. — P. 2587-2594.

188. Muramatsu T., Hashimoto H., Takahashi T. Physicochemical characteristics and conformational features of alginate lyase isozymes from Turbo cornutus II Agric. Biol. Chem. 1984. — Vol. 48, N 1. — P. 79-85.

189. Suzuki H., Suzuki K., Inoue A., Ojima T. A novel oligoalginate lyase from abalone, Haliotis discus hannai, that releases disaccharide from alginate polymer in an exolytic manner // Carbohydr. Res. 2006. — Vol. 341, N 1. — P. 1809-1819.

190. Nakada H.I., Sweeny P.C. Alginic acid degradation by eliminases from abalone hepatopancreas //J. Biol. Chem. 1967. —Vol. 242, N 5. —P. 845-851.

191. Rahman M.M., Inoue A. , Tanaka H., Ojima T. cDNA cloning of an alginate lyase from a marine gastropod Aplysia kurodai and assessment of catalytically important residues of this enzyme // Biochimie. 2011. — Vol. 93, N 10. — P. 1720-1730.

192. Shimizu E., Ojima T., Nishita K. cDNA cloning of an alginate lyase from abalone, Haliotis discus hannai II Carbohydr. Res. 2003. — Vol. 338, N 24. — P. 2841-2852.

193. Rahman M.M., Wanga L., Inoue A., Ojima T. cDNA cloning and bacterial expression of a PL-14 alginate lyase from a herbivorous marine snail Littorina brevicula II Carbohydr. Res. 2012. — Vol.360, —P. 69-77.

194

195

196

197

198

199

200,

201,

202,

203,

204.

205.

206.

207.

208.

209.

210.

211.

212.

Rahman M.M., Inoue A., Tanaka H., Ojima T. Isolation and characterization of two alginate

lyase isozymes, AkAly28 and AkAly33, from the common sea hare Aplysia kurodai II Сотр.

Biochem. Physiol. B: Biochem. Mol. Biol. 2010. — Vol. 157, N 4. — P. 317-325.

Boyen C., Kloareg В., Polne-Fuller M., Gibor A. Preparation of alginate lyases from marine

molluscs for protoplast isolation in brown algae // Phycologia. 1990. — Vol. 29, N 2. — P.

173-181.

Jacober L.F., Rice C., Rand A.G. Jr. Characterization of the carbohydrate degrading enzymes

in the Surf Clam crystalline style // J. Food Sci. 1980. — Vol. 45, — P. 381-385.

Shiraiwa Y., Abe K., Sasaki S.F., Ikawa Т., Nisizawa K. Alginate lyase activities in the

extracts from several brown algae // Bot. Mar. 1975. — Vol. 18, N 2. — P. 97-104.

Ermakova S.P., Ivanova E.P., Bakunina I.Y., Mikhailov V.V., Zvyagintseva T.N. Effect of

brown algae metabolites on the synthesis of O-glycosyl hydrolases by bacteria degrading the

thallus of Fucus evanescens // Microbiol. 2012. — Vol. 81, N 3. — P. 367-372.

Bilan M.I., Grachev A.A., Ustuzhanina N.E., Shashkov A.S., Nifantiev N.E., Usov A.I.

Structure of a fucoidan from the brown seaweed Fucus evanescens C.Ag. // Carbohydr. Res.

2002. — Vol. 337, N 8. — P. 719-730.

Hankin L., Anagnostakis S.L. Solid Media Containing Carboxymethylcellulose to Detect Cx Cellulase Activity of Micro-organisms // J. Gen. Microbiol. 1977. —- Vol. 98, N 1. — P. 109115.

Ivanova E.P., Alexeeva Y.V., Flavier S., Wright J.P., Zhukova N.V., Gorshkova N.M., Mikhailov V.V., Nicolau D.V., Christen R. Formosa algae gen. nov., sp. nov., a novel member of the family Flavobacteriaceae // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. — Vol. 54, — P. 705711.

Abdian P.L., Caramelo J. J., Ausmees N., Zorreguieta A. RapA2 is a calcium-binding lectin composed of two highly conserved cadherin-like domains that specifically recognize Rhizobium leguminosarum acidic exopolysaccharides // J. Biol. Chem. 2013. — Vol. 288, N 4.

— P. 2893-904.

Cho J.H., Muralidharan V., Vila-Perello M., Raleigh D.P., Muir T.W., Palmer III A.G. Tuning protein autoinhibition by domain destabilization // Nat. Struct. Mol. Biol. 2011. — Vol. 18, N 5 —P. 550-555.

Adebodun F., Jordan F. Multinuclear magnetic resonance studies on the calcium (II) binding site in trypsin, chymotrypsin, and subtilisin // Biochem. 1989. — Vol. 28, — P. 7524-7531. Tokheim A.M., Spannaus-Martin D.J., Martin B.L. Evidence for the Cd2+ activation of the aryl sulfatase from Helixpomatia II BioMetals. 2005. — Vol. 18, N 5. — P. 537-540. Zvyagintseva T.N., Shevchenko N.M., Popivnich I.B., Isakov V.V., Scobun A.S., Sundukova E.V., Elyakova L.A. A new procedure for the separation of water-soluble polysaccharides from brown seaweeds // Carbohydr. Res. 1999. — Vol. 322, N 1-2. — P. 32-39. Ivanova E.P., Alexeeva Y. V., Flavier S., Wright J. P., Zhukova N. V., Gorshkova N. M., Mikhailov V. V., Nicolau D. V., Christen R. Formosa algae gen. nov., sp. nov., a novel member of the family Flavobacteriaceae // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. — Vol. 54, N 3.

— P. 705-711.

Dubois M., Gilles K., Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F. A colorimetric method for the determination of sugars // Nature. 1951. — Vol. 168, N 4265. — P. 167.

Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. — Vol. 72, N 12. —P. 248-254.

Laemmli U.K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. — Vol. 227, N 5259. — P. 680-685.

Dodgson K.S., Price R.G. A note on the determination of the ester sulphate content of sulphated polysaccharides // Biochem. J. 1962. — Vol. 84, N 1. — P. 106-110. Слонекер Дж. Методы исследования углеводов. Пер. с англ. под ред. А .Я. Хорлина. : М.: Мир, 1967.-371-373.

Chen P., Baker A.G., Novotny M.V. The use of osazones as matrices for the matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of carbohydrates // Anal. Biochem. 1997. — Vol. 244, N 1, —P. 144-151.

Приложение А Полная аминокислотная и нуклеотидная последовательности FFA1.

Выделенные области соответствуют местам отжига праймеров для получения рекомбинантных конструкций, содержащих вставки FFA1 (сочетание праймеров 0 и I), FFA1-SD (сочетание праймеров О

и II), FFA1-KD (сочетание праймеров 0 и III).

1 MQTTTNYVYFFLLCLFTANI 1 ATGCAAACAACTACTAACTATGTTTACTTTTTTTTATTATGCTTATTTACGGCAAATATA

21 SLHAQQI PDPDQGLRAEWMR

61 TCGCTTCATGCTCAACAAATTCCAGATCCGGATCAAGGCTTAAGAGCCGAATGGATGCGT

О

41 GSYGMLWLPERNFNGNIEGI 121 GGCTCCTATGGAATGCTCTGGTTACCAGAACGTAATTTTAACGGGAATATTGAGGGAATA

61 RIDEFITQIKDIRTVDYVQL 181 CGAATAGATGAGTTTATAACTCAAATAAAAGATATTCGTACCGTCGATTATGTTCAATTA

81 PLTSPNIFSPIHVGPHSLIE 241 CCGCTAACAAGTCCAAATATTTTTTCTCCAATACATGTTGGTCCACACTCCTTAATTGAA

101 SFWEGDTDANGDPINLAVPR 301 AGTTTTTGGGAAGGTGACACCGATGGAAATGGTGATCCGATTAATCTTGCCGTTCCTAGA

121 ESVDDPLLSWLKALRAAGLK 361 GAATCTGTAGATGATCCACTTTTAAGTTGGTTAAAAGCCTTGAGAGCTGCGGGATTAAAG

141 АЕ IYVNSYNLLARI PEDTQE 421 GCAGAGATTTATGTGAATTCTTATAATTTACTGGCAAGAATTCCAGAGGATACGCAAGAA

161 DYPDVSERWMEWCDTNPEAQ 481 GATTATCCAGATGTATCAGAACGTTGGATGGAATGGTGTGATACTAATCCGGAGGCGCAG

181 AFIASQDFHEGDGRRKYMFC 541 GCTTTTATAGCCAGTCAAGACTTTCATGAAGGCGATGGCAGACGTAAGTATATGTTTTGT

201 YAEF I LKEYANRYGDL I DAW 601 TATGCAGAATTTATTCTTAAAGAATATGCTAATCGTTATGGCGATTTAATTGACGCTTGG

221 CFDSADNIMEGECGDDPASD 661 TGTTTCGACTCCGCAGATAATATTATGGAAGGCGAGTGTGGCGATGATCCAGCATCAGAC

241 DIDDQRIYQAFAEACHSGNP

721 GATATTGATGACCAAAGAATTTATCAGGCCTTTGCCGAAGCATGTCACTCAGGGAATCCT

261 KAAISFNNSVGDREGNPFTT

781 AAAGCAGCGATTTCATTCAATAATAGTGTGGGTGATCGTGAAGGAAATCCGTTTACAACA

281 ATYFDDYTFGHPFGGAGNMV

841 GCAACTTATTTTGATGATTATACTTTTGGACATCCGTTTGGAGGCGCCGGGAATATGGTC

301 ENETLYGYNFGVI EWMDDYN

901 GAGAATGAAACCTTGTATGGTTACAATTTTGGAGTTATAGAATGGATGGATGACTATAAT

321 GSAFLDDDRTWNDNVVSHYF

961 GGAAGTGCATTTCTTGACGATGACAGAACGTGGAATGATAATGTCGTATCGCATTATTTT

341 PKQSATSWNAGNTPCLTDDQ

1021 CCTAAACAAAGTGCAACCTCTTGGAATGCTGGAAATACGCCTTGTTTAACAGACGACCAA

361 FVEWTSKGIIDGGAITWGTP

1081 TTTGTAGAATGGACAAGTAAAGGAATAATTGATGGAGGAGCTATAACTTGGGGAACACCG

381 LIRTNLENSPVLTLRDYAVT

1141 TTAATACGTACGAATTTAGAAAATTCTCCAGTATTAACTTTACGTGATTATGCGGTTACG

401 QFELTDAYLKEFQS PGAPNW

1201 CAGTTCGAACTTACAGATGCTTATTTAAAAGAATTTCAATCCCCAGGCGCACCTAATTGG

III

421 SRQYTILPP/iYLGQTYAHTL

1261 TCCAGACAATATACTATTTTACCTCCAGCTTATTTAGGGCAAACTTATGCACATACTTTA

441 VEGVDFWDPEQVGITNLTIA

1321 GTGGAGGGTGTCGATTTTTGGGATCCAGAACAAGTTGGAATTACAAATCTTACAATAGCA

461 SGTLPEWLTITETEEGVWAL

13 81 TCTGGAACTTTACCAGAATGGTTAACAATTACAGAAACAGAAGAAGGTGTTTGGGCCTTA

481 SGTPTESEATDYTFEFSAQD 1441 AGTGGTACGCCAACAGAATCTGAGGCTACAGATTATACATTTGAATTTAGTGCACAAGAT

501 ADGTTNREVELQVMKLGEGF

1501 GCTGATGGTACAACCAATAGAGAGGTAGAATTACAAGTÀATGAAGTTAGGAGAAGGCTTT

521 IDLEDGTPVWFSNPLVLDNA

1561 ATTGATTTAGAAGATGGTACGCCAGTATGGTTTTCAAATCCATTAGTATTAGACAATGCA

541 IALSTYTGLLETTVDVFDFE

1621 ATCGCATTAAGTACCTATACAGGTCTTTTAGAAACAACTGTTGATGTTTTTGATTTTGAG

561 DDALTITKISGPEWLVVTDD

1681 GACGATGCGCTAACAATTACTAAAATATCAGGTCCAGAATGGCTAGTTGTTACTGATGAT

581 AQGLWRLSGI PTAADAGENS

1741 GCTCAAGGGTTATGGCGTTTAAGTGGCATACCAACAGCGGCAGATGCTGGCGAAAATTCA

601 FIFSVNDGVLSSETEIKIIV

1801 TTTATATTTAGTGTTAÁCGATGGTGTTTTGTCTTCAGAAACAGAAATAAAAATAATAGTA

621 DHVSGFTDLGDGTPVWSAST

1861 GATCATGTCTCAGGGTTTACTGATTTGGGAGATGGAACACCTGTTTGGTCTGCTTCAACA

641 YNLPDANATFAYNYTLELGK

1921 TATAAC CTT С CAGATG CTAATG CTACATTTGCATATAATTATACTTTGGAATTAGGAAAA

661 EYYDFEGDALTI TKVAGPDW

1981 GAATATTATGATTTTGAAGGTGATGCATTAACGATCACCAAAGTGGCAGGTCCAGATTGG

681 LTIQETSTRVLTLSGTPINT

2041 CTTACCATTCAGGAAACATCTACAAGAGTTTTAACCTTAAGCGGCACACCTATAAATACA

701 DEGENS ITLNLSDGVNSSNT

2101 GATGAAGGTGAAAATAGTATTACGCTTAATTTAAGTGATGGTGTAAACTCATCGAATACA

721 EL ILTVI PTE I S D SNVQVKA

2161 GAACTTATTTTAACTGTTATTCCTACCGAAATTAGCGACAGTAACGTTCAAGTAAAGGCG

-П-

741 AANTNYGINTVATMYSETLT 2221 GCTGCAAATACTAATTATGGTATTAATACGGTCGCAACTATGTATTCTGAAACGTTAACT

761 APDGMATFRI S IDVTPTEPF

2281 GCTCCAGATGGTATGGCGACGTTTAGGATTTCTATAGATGTTACACCTACGGAACCTTTT

781 AI TSGASGGDSTENSWGMGD

2341 GCTATTACTTCTGGTGCATCAGGAGGTGATTCTACAGAAAATTCTTGGGGAATGGGAGAT

801 GSTTNQETLFRGSDNQAVEN

2401 GGCTCAACAACCAATCAAGAAACTTTATTTAGAGGATCAGACAATCAAGCCGTAGAAAAC

821 INNIQIIDFDAHGGSISEED

2461 ATTAACAATATTCAAATTATCGATTTTGATGCGCATGGTGGCTCTATTTCAGAAGAAGAT

841 ITGVFKS I TLVNAQNANDL F

2521 ATTACAGGTGTATTTAAGTCAATTACTTTAGTGAATGCTCAAAATGCTAACGATTTATTT

861 SITVESVVSTPRAALEATET

2581 TCAATTACTGTAGAATCTGTGGTGTCAACGCCTAGAGCTGCATTAGAAGCCACAGAAACT

881 IDLATETGLSDDTEITEFI I

2641 ATCGATTTAGCAACTGAGACAGGACTTAGTGATGATACAGAAATTACAGAATTTATTATT

901 GTANDATANRWSVDGITVYV

2701 GGTACAGCTAATGATGGAACAGCAAACAGATGGTCAGTAGACGGAATTACGGTATATGTG

921 FVEGYTLSSPDLYLTEGFRL

2 761 TTTGTGGAAGGTTATACTTTATCATCACCAGATCTTTATTTAACCGAAGGGTTCAGACTA

941 YPNPATDDILLNMPIYSARI

2821 TATCCGAACCCAGCAACAGATGATATTTTATTGAATATGCCAATATATTCCGCTCGCATT

961 MD ITGKVVKVYTSATQNIDV

2881 ATGGATATCACAGGTAAGGTGGTTAAGGTCTATACTTCAGCAACTCAAAATATAGACGTT

981 SQLSEGVYFLKGLNNVGETV

2941 TCTCAATTATCAGAAGGTGTGTATTTTCTTAAAGGTCTTAATAATGTAGGAGAGACTGTA

1001 VKKFVKRN -3001 GTTAAAAAGTTTGTGAAGCGTAATTAA

I

Приложение Б Полная аминокислотная и нуклеотидная последовательности РБА2.

Выделенные области соответствуют местам отжига праймеров для получения рекомбинантных конструкций, содержащих вставки РРА2 (сочетание праймеров 0 и I), РРА2-80 (сочетание праймеров О

и II), РРЛ2-КГ) (сочетание праймеров 0 и III).