Создание исходного материала посредством межвидовой гибридизации для селекции капусты белокочанной на устойчивость к сосудистому бактериозу тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 06.01.05, кандидат наук Зубко Ольга Николаевна

• Зубко Ольга Николаевна
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Зубко Ольга Николаевна

Введение

Актуальность темы исследования

Цель и задачи

Научная новизна

Практическая значимость

Положения, выносимые на защиту

Апробация результатов

Связь работы с научными проектами и программами

Публикация результатов исследований

Структура и объем диссертации

Глава 1 Обзор литературы

1.1 Сосудистый бактериоз

1.1.1 Вредоносность и распространение

1.1.2 Возбудитель сосудистого бактериоза

1.1.3 Расовый состав патогена

1.1.4 Пути распространения Xcc и проникновения в растение

1.1.5 Симптомы сосудистого бактериоза, меры борьбы

1.2 Доноры и источники генов устойчивости к сосудистому бактериозу

1.2.1 Источники и доноры генов устойчивости к сосудистому бактериозу в пределах вида B.oleracea

1.2.2 Источники и доноры генов устойчивости к сосудистому бактериозу в

пределах рода Brassica

1.3. Филогенетические связи наиболее хозяйственно-ценных видов рода Brassica

1.3.1 Скрещиваемость видов

1.4 Автополиплоидия и аллоплоидия в создании исходного материала

1.5 Перспективные доноры и источники генов устойчивости к сосудистому бактериозу для селекции капусты белокочанной

1.5.1 Передача генов устойчивости к сосудистому бактериозу в B.oleracea из

других видов, характер наследования

1.5.1.1 Передача генов устойчивости к сосудистому бактериозу из B.carinata

1.5.1.2 Передача генов устойчивости к сосудистому бактериозу из B. juncea

1.5.1.3 Передача генов устойчивости к сосудистому бактериозу из B. rapa

1.6 Биотехнологии в межвидовой гибридизации

1.6.1. Преодоление постгамной несовместимости

1.6.1.1 Используемые технологии спасения зародышей при межвидовой гибридизации диплоидных B.oleracea и доноров/источников генов устойчивости к сосудистому бактреиозу аллотетраплоидных видов B.carinata и B.juncea

1.6.1.2 Сроки введения в культуру эксплантов для спасения зародышей

1.6.1.3 Среды, используемые для спасения зародышей, условия культивирования

1.6.2. Маркер-опосредованный отбор гибридных растений

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Растительный материал

2.2 Гибридизация

2.3 Завязываемость семян

2.4 Посев и уход за растениями

2.5 Оценка морфологических признаков

2.6 Фертильность пыльцы

2.7 Оценка устойчивости к сосудистому бактериозу на искусственном

инфекционном фоне

2.7.1 Изоляты бактерий Xcc

2.7.3 Культивирование бактерий и приготовление инокулюма

2.7.4 Инокуляция растений

2.8 Определение числа хромосом

2.8.1 Подсчет числа хромосом микроскопированием. Приготовление постоянных цитологических препаратов

2.8.2 Определение плоидности растений методом проточной цитометрии

2.9 Спасение зародышей, культура изолированных семязачатков/зародышей

2.10 Производство растений в культуре изолированных микроспор

2.11 Молекулярное генотипирование

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1 Интрогрессия генов устойчивости к сосудистому бактериозу из B.carinata в B.oleracea

3.1.1 Получение F1

3.1.2 Поколение беккросса BC1

3.1.2 Поколение беккросса ВС2

3.1.3 Поколение беккросса ВС3

3.1.4 Получение растений в культуре изолированных микроспор

3.1.5 Возникновение ogura-подобной ЦМС в ВС1-потомстве

3.2 Передача генов устойчивости к сосудистому бактериозу из B. juncea в B.oleracea

3.3 Передача генов устойчивости к сосудистому бактериозу из B.rapa в B.oleracea

3.3.1 Капуста пекинская

3.3.1.1 Получение F1

3.3.1.2 Поколение беккросса BC1

3.3.1.3 Поколение беккросса BC2

3.3.2 Турнепс

3.3.2.1 Получение F1

3.3.2.1 Поколение беккросса ВС1

Заключение

Список сокращений

Библиографический список

Приложения

Введение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Создание исходного материала посредством межвидовой гибридизации для селекции капусты белокочанной на устойчивость к сосудистому бактериозу»

Актуальность темы исследования

Капуста белокочанная (Brassica oleracea var. capitata) - одна из самых распространенных овощных культур, выращиваемых в Российской Федерации. По площадям, занятым под овощами открытого грунта в РФ капуста всех видов занимает второе место, а по валовому сбору продукции - первое (Бюллетени о состоянии сельского хозяйства, 2019).

Развитие и распространение болезней приводит к существенным потерям урожая капусты. В последние годы самым распространенным заболеванием капустных на территории РФ является сосудистый бактериоз (Обзор фитосанитарного состояния посевов сельскохозяйственных культур в российской Федерации в 2017 году и прогноз развития вредных объектов в 2018 году, 2018). У пораженных Xanthomonas campestris pv. campestris (Pammel) Dowson (Xcc) -возбудителем сосудистого бактериоза растений капусты белокочанной значительно снижается урожайность, качество продукции и семенная продуктивность (Джалилов с соавт., 1989). Методами борьбы с этим заболеванием являются превентивные мероприятия и возделывание гибридов с генетической устойчивостью. Наличие 11 рас Xcc и отсутствие доноров доминантных генов устойчивости ко всем расам сильно осложняет селекционный процесс. Самыми распространенными в РФ и мире являются 1 и 4 расы Xcc, а доноры доминантных генов устойчивости к этим расам известны в видах B.carinata, B.juncea и B.rapa.

Цель и задачи

Цель - создание исходного материала посредством межвидовой гибридизации для селекции капусты белокочанной (B.oleracea) на устойчивость к сосудистому бактериозу.

Задачи:

- Проведение реципрокной половой межвидовой гибридизации капусты белокочанной (B.oleracea) с известными донорами и источниками генов устойчивости к сосудистому бактериозу - B.carinata, B.juncea и B.rapa и с

помощью in vitro технологии спасения зародышей (embryo rescue) получение межвидовых гибридов и их потомства от насыщающих скрещиваний;

- Анализ морфологических, цитологических и биологических признаков межвидовых гибридов и их беккроссных потомств;

- Оценка устойчивости/восприимчивости межвидовых гибридов и беккроссных потомств к наиболее распространенным на территории РФ расам Xcc на искусственном инфекционном фоне;

- Изучение возможности использования технологии производства гаплоидов в культуре изолированных микроспор применительно к потомствам от межвидовой гибридизации B.oleracea и B.carinata для ускорения редукции числа хромосом и достижения видового числа хромосом.

Научная новизна

Впервые показано, что использование тетраплоидной формы B.oleracea в межвидовом скрещивании с аллотетраплоидной B.carinata для получения F1 требует технологии спасения зародышей, но позволяет получать семенное ВС-потомство без embryo rescue;

Доказано, что наследование доминантной устойчивости инбредной линии PI199947 B.carinata к 1, 3 и 4 расам Xcc при отдаленной гибридизации с капустой белокочанной не соответствует моногенной модели и контролируется несколькими генами, определяющими устойчивость к отдельным расам Xcc;

Установлено, что в ВС2-потомстве от межвидовой гибридизации (B.oleracea х B.carinata) возможно получить растения со спонтанно возникшей мужской стерильностью, имеющей цитоплазматический характер наследования и стабильно проявляющейся в потомстве;

Показано, что применение культуры изолированных микроспор у генотипов с несбалансированными наборами хромосом потомства BC2 от межвидовой гибридизации (B.oleracea х B.carinata) х B.oleracea позволяет произвести редукцию числа хромосом до видового с наследованием устойчивости к СБ у растений-регенерантов имеющих морфологию капусты белокочанной.

Практическая значимость. Разработан способ создания диплоидных линий капусты белокочанной Brassica oleracea устойчивых к сосудистому бактериозу (заявка на патент № 2018140881).

Создан исходный материал для селекции Fl-гибридов капусты белокочанной на устойчивость к сосудистому бактериозу (расам 1, 3 и 4 Хсс): растения ВС3-поколения и линии - удвоенные гаплоиды в потомствах от отдаленной гибридизации B.oleracea и B.carinata; впервые межвидовой гибридизацией B.oleracea с новым донором доминантной моногенной устойчивости к 3 и 4 расам Хсс B.rapa subsp. pekinensis получены ВС1-растения устойчивые к 1, 3 и 4 расам Хсс; межвидовой гибрид (B.oleracea х B.juncea) с устойчивостью к 1, 3 и 4 расам Хсс; межвидовой гибрид (B.oleracea х B.rapa subsp. rapa) устойчивый к 4 расе Хсс.

Создан исходный материал - линии БКБю3Цв, БКБю3Пр, БКБю3Бр со спонтанной Ogura-подобной цитоплазматической мужской стерильностью.

Положения, выносимые на защиту:

- Наследование доминантной устойчивости инбредной линии PI199947 B.carinata к 1, 3 и 4 расам Xcc при отдаленной гибридизации с капустой белокочанной не соответствует моногенной модели и контролируется несколькими генами, определяющими устойчивость к отдельным расам Xcc.

- Ускоренная технология - способ создания диплоидных линий капусты белокочанной Brassica oleracea устойчивых к сосудистому бактериозу с использованием при отдаленной гибридизации донора генов устойчивости B.carinata, тетраплоидной капусты белокочанной, серии беккроссов и КИМ;

- Исходный материал для селекции капусты белокочанной на устойчивость к сосудистому бактериозу, созданный отдаленной гибридизацией с комбинированием биотехнологических методов селекции.

- Новый источник цитоплазматической мужской стерильности.

Апробация результатов. Результаты исследований апробированы на 8

конференциях: Международная научная конференция молодых учёных и специалистов «Наука молодых - агропромышленному комплексу» (г. Москва, 2-3

июня 2016 г.); Международная научно-практическая конференция «Состояние и перспективы селекции и семеноводства капустных культур (г. Москва, 12-15 сентября 2016 г.); Международная научно-практическая конференция: «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем» с молодежной стратегической сессией «Кадры, ресурсы, возможности, инновации» (г. Краснодар, 20-22 сентября 2016 г.); XXIV Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (г. Москва, 10-14 апреля 2017 г.); VII International Symposium on Brassica (Pontevedra (Spain), 22-25 may 2017); Международная научная конференция молодых ученых и специалистов посвященная 100-летию И.С. Шатилова (г. Москва, 6 июня 2017 г.); Научная конференция «Современное состояние, проблемы и перспективы развития аграрной науки» (г. Ялта, 11-15 сентября 2017); Международная научная конференция молодых учёных и специалистов, посвящённая 150-летию со дня рождения В.П. Горячкина (г. Москва, 5-6 июня 2018).

Связь работы с научными проектами и программами

Грант «Разработка перспективной технологии создания F1 - гибридов Brassica устойчивых к основным фитопатогенным заболеваниям» Фонд содействия инновациям, №11535ГУ/2017 от 22.05.2017, «Новый подход к получению форм белокочанной капусты, устойчивых к сосудистому бактериозу», РФФИ, 18-316-00134\18 .

Публикация результатов исследований

По теме исследования опубликовано 12 научных работ, в том числе 2 в журналах, рекомендованных ВАК; 8 статей в сборниках других научных изданий; 1 в журнале, рецензируемом WOS. Передана заявка в патентное ведомство «Способ создания диплоидных линий капусты белокочанной Brassica oleracea устойчивых к сосудистому бактериозу», заявка №2018140881.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 146 страницах, из них основная часть на 124 страницах, содержит 20 таблиц, 36 рисунков и 10 приложений, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, выводов,

рекомендаций производству и приложений. Библиографический список состоит из 103 источников, в том числе 87 на иностранном языке.

Глава 1 Обзор литературы

1.1 Сосудистый бактериоз

1.1.1 Вредоносность и распространение

Впервые болезнь, сосудистый бактериоз (СБ) капустных, была описана в США (Garman, 1894). В Российской Федерации в последние годы, по данным Россельхозцентра, при обследовании посадок капустных культур пораженные болезнями растения (кила, СБ, слизистый бактериоз и пероноспороз) были обнаружены на 3,44 тыс. га из 14,89 тыс. га в 2016 г. и на 2,94 тыс. га из 25,48 тыс. га в 2017 г. Было установлено, что сосудистый бактериоз - наиболее распространенное из 4-х исследованных заболеваний капусты. СБ встречается на 1,88 тыс. га (12,6 %) и 2,32 тыс. га (9,1 %) обследованных площадей посадок капусты в 2016 и 2017 гг. соответственно (Обзор фитосанитарного состояния посевов сельскохозяйственных культур в российской Федерации в 2017 году и прогноз развития вредных объектов в 2018 году, 2018). Заражение растений СБ в фазу рассады приводит к снижению урожайности капусты белокочанной в 1,3-1,6 раза и к ухудшению качества продукции. Содержание сухих растворимых веществ в кочанах сокращается на 8,2-30,0 %, аскорбиновой кислоты - на 11,044,1 % (Джалилов с соавт., 1989). Во время хранения пораженной продукции за счет усиления интенсивности дыхания в ней и развития слизистого бактериоза убыль массы и абсолютный отход может составлять 31,4 и 66,1 % соответственно. Развитие СБ в растении приводит к угнетению семенных растений. Их высота снижается на 21,1 %, число стручков - в 1,6 раза, масса 1000 семян на 37,2 %, и как следствие потери урожая семян могут достигать 58,7 % (Джалилов с соавт., 1989).

1.1.2 Возбудитель сосудистого бактериоза

Возбудитель СБ впервые был установлен Pammel (1895 a, b), который показал, что заболевание вызывает бактерия, названная им Bacillus campestris. В настоящее время общепризнанным названием которой является Xanthomonas campestris pv. campestris (Pammel) Dowson (Xcc). Описание вида Xanthomonas cumpestris (Pammell 1895) Dowson 1939 полностью соответствует описанию рода

Xanthomonas Dowson 1939 (Vauterin et al., 1995). Бактерии грамотрицательные, по форме палочки размером 0,4-0,6 х 1,0-2,9 мкм, с полярным жгутиком. Встречаются они в основном в виде одиночных клеток или парами (диплобактерии), а также соединенными в цепочки (стрептобактерии). Колонии, на питательной среде, как правило, гладкие желтые слизистые. Характерные для рода желтые пигменты представляют собой моно- или дибром арилполиены, слизистость или вязкость культуры обусловлена экзополисахаридом ксантан. Штаммы этого вида вызывают заболевание у различных представителей Brassicaceae. Вид разделяют на патовары на основе реакций определенных растений-хозяев, а также с помощью биохимических, серологических и молекулярных исследований.

1.1.3 Расовый состав патогена Предложение распределения различных изолятов Xcc на расы на осное реакции линий и гибридов капусты белокочанной было сделано Игнатовым (1992). Kamoun et al. (1992) на основе реакции коллекции дифференциаторов Brassica - турнепс (TJR, TTH, TST), горчица (MFB) и капуста (ранняя цветная Super Snowball и репа Purple Top White Globe) на инокуляцию различными изолятами выделил 5 рас Xcc - 0, 1, 2, 3 и 4. Ignatov et al. (1998b) впоследствии показали, что расу 1 можно разделить на две или три расы на основе реакции дополнительных образцов B.oleracea и B.carinata. Пересмотренная дифференциация рас Xcc была предложена Vicente et al. (2001) на основе 144 шт. изолятов. Три расы (1, 2 и 4) были сохранены по системе Kamoun et al. (1992). Однако авторами не было найдено ни одного изолята, который соответствовал бы расе 3, и поэтому раса была исключена из новой классификации (Vicente et al., 2001). Изоляты, относящиеся к расе 1, по реакции B.oleracea и B.carinata разделили на 3 расы: новая раса 1, штаммы которой относятся к наиболее часто встречающимся, новая раса 3 и раса 5. Было предложено переименовать расу 0 в расу 6, т.к. штаммы, относящиеся к этой расе, поражают все растения-дифференциаторы. Раса 2 представлена только одним изолятом (Vicente et al., 2001). Позже была добавлена раса 7 (Fargier and Manceau, 2007; Jensen et al.,

2010). Кроме того, Fargier and Manceau (2007) включили расы 8 и 9 для классификации изолятов, которые имеют узкий диапазон растений-хозяев в коллекции дифференциаторов. Cruz et al. (2017) выделили две новые расы 10 и 11. Новая раса 10 отличается от расы 4 только тем, что поражает Just Right Hybrid Turnip (B. rapa), а раса 11 отличается от расы 6 отсутствием патогенности относительно Seven Top Turnip (B. rapa).

Vicente and Holub (2013) обобщив результаты своих ранних работ и работ других исследователей, объясняя взаимодействие 5-ти пар генов устойчивости и авирулентности, представили модель ген-на-ген для 9-ти рас Xcc (таблица 1.1).

Таблица 1.1 - Постулированная модель ген-на-ген для объяснения взаимодействия между растениями Brassica и расами Xanthomonas campestris pv. campestris (Vicente and Holub, 2013)

Гены авирулентности (А)

1 2 3 4 5 6 7 8 9

А1 A1 A1? A1 A1

А2 A2

A3 A3 A3 A3 A3

A4 A4

Дифференциаторы Гены устойчивости (R) A5

Wirosa Fl (Brassica oleracea) + (+)/+ + + + + + + +

Just Right Hybrid Turnip (Brassica rapa) R4 + + + - + + + + -

COB6O (Brassica napus) R2 + (+) + - + + + nt nt

Seven Top Turnip (B. rapa) R2 R4 + - +,v -,v +,v + + - -

PIC1 (Brassica carinata) R1 R4 - (+) - - + + + - -

FBLM2 (Brassica juncea) R1 R4? - + - - (+) + - - -

Miracle Fl (B.oleracea) R2? R3 R4? R5 + -/(+) -/(+) + - + + - -

SxDl (B.oleracea) R3 + -/(+) - + - (+)+ + nt nt

Примечание: +, совместимая реакция (восприимчивость); - несовместимая

реакция (устойчивость); (+), слабая патогенность; п1:, не тестировали; V, переменная реакция; ?, возможное, но необязательное наличие гена.

Модель допускает возможность включения дополнительных пар генов, если будут выявлены новые расы и дифференциаторы. Модель была построена таким образом, что отражает происхождение аллотетраплоидных видов капусты: происхождение R1 из генома ВВ, R3 из генома СС и R4 из АА генома. Авторы отмечают, что предложенная модель должна быть подтверждена генетическими и

молекулярными исследованиями как растения-хозяина, так и патогена. В результате скрещиваний, проведенных для установления наследования устойчивости к некоторым расам Xcc, показан доминантный моногенный контроль устойчивости к разным расам генами обозначенными R1, R3 и R4 (Vicente and Holub, 2013).

Из одиннадцати идентифицированных на сегодняшний день рас самыми распространенными во всем мире являются 1 и 4 {Fargier and Manceau, 2007; Vicente and Holub, 2013). Исследованиями расового состава патогена на территории РФ выявлено, что преобладают те же расы, 1 (31,S %) и 4 (34,1 %), в меньшей степени распространены расы 3 (20,З %) и 0 (13,б %) {Игнатов, 2001). Информации о встречаемости и распространенности других рас на территории РФ нами не обнаружено.

1.1.4 Пути распространения Xcc и проникновения в растение Cook et al. {1952) описал сосудистый бактериоз как болезнь, распространяющуюся в первую очередь с семенами. Тем не менее, бактерии также могут распространяться с зараженной рассадой, заселенной почвой, растительными остатками и с родственными сорными растениями (Schaad and Alvarez, 1993; Vicente and Holub, 2013). Патоген может сохраняться в семенах до трех лет {Bazzi, 1991), в почве, независимо от наличия хозяина, в течение приблизительно 40 дней зимой и 20 дней летом (Schaad and White 1974; Dane and Shaw, 199б). Внутри растительных остатков патоген может выживать в почве дольше - до двух лет в кочерыгах {Джалилов, 199б), потенциал почвенного матрикса может снижать выживаемость возбудителя {Arias et al., 2000).

Хотя Xcc - это патоген сосудистой системы, он отличается от многих вызывающих сосудистые заболевания организмов тем, что обычно проникает в растение через гидатоды на краях листьев, а не через корни или корневую шейку {Sutton and Williams, 1970). При высокой влажности формируются гуттационные капли, в них попадают бактерии, после снижения влажности капли втягиваются в лист и бактерии распространяются по сосудистой системе {Джалилов с соавт., 1995). Устьица, как правило, не являются основным путем проникновения Xcc,

однако, иногда, в условиях повышенной влажности это возможно, но даже при таком способе инфицирования, бактерии не распространяются в окружающие ткани {Cook et al., 19З2). Кроме того, бактерии могут проникнуть в растение через механические повреждения всех органов, нанесенные техникой, насекомыми, животными {Vicente and Holub, 2013).

1.1.5 Симптомы сосудистого бактериоза, меры борьбы

Попав в сосудистую систему, бактерии размножаются и распространяются, происходит накопление внеклеточной полисахаридной слизи, которая закупоривает ксилему. Такие полисахаридные пробки препятствуют току воды по ксилеме, тем самым вызывая водный стресс в клетках паренхимы, окруженных крупными жилками, что способствует образованию типичных симптомов - V-образных хлорозов и темных жилок {Sutton and Williams, 1970). Далее по сосудистой системе бактерии проникают в черешок и кочерыгу, вызывая в ней некротизацию сосудистого кольца {Джалилов с соавт., 19S9). Системное инфицирование может вызвать задержку роста и гибель молодых растений. Пораженные СБ, ослабленные растения могут поражаться другими болезнями. При низких температурах инфекция часто скрыта, бактерии сохраняются в сосудистой системе, а когда температура повышается - типичные симптомы проявляются, {Cook et al., 1952; Walker, 1953; Schaad, 19S2).

Борьба с СБ затруднена и обычно осуществляется с помощью превентивных мероприятий - использования свободных от болезни семян и рассады и устранения других потенциальных источников инокулята, таких как инфицированные растительные остатки и сорные растения, относящиеся к семейству Brassicaceae, соблюдение севооборота {Taylor et al., 2002). Семена обрабатывают гипохлоритом натрия {Babadoost et al., 199б), надуксусной кислотой {Орынбаев и Джалилов, 2016), перекисью водорода и ацетатом меди или сульфатом цинка, а также гидротермическими методами {Krauthausen et al., 2011). Защита в период вегетации сводится к предотвращению распространения бактерий с пораженных растений путем обработки антагонистами и биопрепаратами {Джалилов с соавт., 1995), медьсодержащими и

микробиологическими препаратами (Bora and Bhattacharyya, 2000). Такие методы, как использование капельного орошения вместо верхнего полива и добавления диоксида хлора в поливную воду могут применяться, чтобы уменьшить распространение заболевания при рассадном способе выращивания (Krauthausen et al., 2011).

Ни один из методов предотвращения инфицирования и борьбы с СБ не обеспечивает 100 % защиту растений. Наиболее перспективным, экологичным и долгосрочным методом борьбы с заболеванием является возделывание устойчивых к СБ сортов и гибридов.

1.2 Доноры и источники генов устойчивости к сосудистому бактериозу

Селекция капустных культур на устойчивость к СБ началась сразу после того, как был установлен и описан возбудитель заболевания. Многие ученые (Williams et al., 1971; Sharma et al., 1972; Jamwal and Sharma, 1986; Монахос с соавт., 1990), используя различный растительный материал, изоляты бактерий или их смеси, методы инокуляции (опрыскивание растений от стадии проростков до 5 и более настоящих листьев, замачивание семян, надрезание листа в суспензии бактерий), изучали генетику устойчивости к СБ, но представление о ней изменилось вместе с идентификацией рас патогена и типов устойчивости растений в зависимости от метода инокуляции.

1.2.1 Источники и доноры генов устойчивости к сосудистому бактериозу в пределах вида B.oleracea

Источники

После идентификации рас Xcc многими исследователями было установлено, что в основном представители вида B.oleracea являются восприимчивыми ко всем расам Xcc, а у устойчивых представителей B.oleracea устойчивость к СБ расово-специфичная к одной или двум расам. Так, в работе Taylor et al. (2002), из 70 изученных образцов B.oleracea при инокуляции 1, 2, 3, 4, 5 и 6 расами Xcc, 35 генотипов были восприимчивы ко всем расам, 1 7 были устойчивы к одной расе (12 к расе 2 Xcc, 5 к расе 6 Xcc), 15 к двум и только 3 генотипа обладали

устойчивостью к трем расам Xcc. При инокуляции расами 1, 3, 4 и 6 (авторы называют ее раса 0) Xcc коллекции линий B.oleracea «Селекционная станция им. Н.Н. Тимофеева» также было показано, что большинство устойчивых линий обладало устойчивостью только к одной расе Xcc (Монахос с соавт., 2015), аналогичную устойчивость проявили растения из коллекции B.oleracea в исследовании Afrin et al. (2018) при инокуляции 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7 расами Xcc.

Несмотря на преобладание в коллекциях независимых исследователей растений, обладающих расово-специфичной устойчивостью к одной-двум расам, в них встречаются единичные образцы, обладающие устойчивостью к трем и более расам. Как источник устойчивости к 1, 3, 5 и 6 расам Xcc отмечают инбредную линию Badger Inbred-16 (BI-16 полученную из сорта Early Fuji) (Taylor et al., 2002), инбредную линию ЦР (Монахос с соавт., 2015; Орынбаев с соавт., 2019) - источник устойчивости 1, 3 и 6 (авторы называют ее раса 0) Xcc и линию SCNU-C-4118, устойчивую к 3, 5 и 6 расам Xcc (Afrin et al., 2018).

Доноры

Гибридологическим анализом потомства устойчивой к 1, 3, 5 и 6 расам Xcc линии Badger Inbred-16 (Taylor et al., 2002) было показано, что она является донором количественной рецессивной устойчивости к 1 и 3 расам (Vicente et al., 2002), возможно, подобный характер наследования у этой линии и к 5 и 6 расам, однако, авторы проводили инокуляцию только расой 1, 3 и 4.

Поиском новых источников генов устойчивости и установления характера их наследования занимались и другие ученые. Ignatov et al. (1998b) генетическим анализом линии PI436606 (из сорта Heh Yeh da Ping Tou) показали, что устойчивость у этого генотипа к 1 расе Xcc контролируется одним доминантным геном R1, к 5 расе Xcc - одним рецессивным геном r5, аналогичную устойчивость авторы установили и у линий ISA454 и SR1. Однако, в работе Vicente et al. (2002) было показано, что устойчивость у линии PI436606 контролируется одним доминантным локусом Xca3, обуславливающим устойчивость к 3 расе Xcc, аналогичную устойчивость автор установил у линии удвоенного гаплоида BOH 85c (DH-линия, полученная из сорта Böhmerwaldkohl) (Vicente et al., 2002). Такое

расхождение в результатах по реакции на инокуляцию растений линии PI436606 можно объяснять тем, что после того, как в 2001 г. расу 1 Xcc по Kamoun et al. (1992) разделили на новые - 1, 3 и 5 (Vicente et al., 2001), Vicente et al. (2002) проводили инокуляцию изолятом бактерий, относящимся к расе 3, а во время проведения исследования Ignatov et al. (1998) этот изолят относили к расе 1. Так как (Vicente et al., 2002) в своей работе инокулировали растения только расой 1, 3 и 4, характер наследования генов устойчивости к расе 5 в их исследовании остается неизвестным.

Кроме того, что у B.oleracea устойчивость к СБ в основном количественная, число задействованных генов варьирует (при инокуляции растений методом прокола листа), у некоторых генотипов существуют гены, проявляющие свое действие при инокуляции методом, обеспечивающим проникновение бактерий в растения через гидатоды. Так, анализом потомств линии ЦР было установлено, что при инокуляции методом удаления семядольного листа, устойчивость к расе 3 контролируется одним рецессивным геном, а при инокуляции методом, обеспечивающим проникновение бактерий через гидатоды, другим рецессивным геном (Монахос с соавт., 2016, Орынбаев с соавт., 2019). С результатами полевой оценки теснее всего коррелируют данные, полученные при инокуляции растений методом, обеспечивающим проникновение бактерий через гидатоды (опрыскивание) (Джалилов с соавт., 1995).

Были упоминания о моногенном доминантном контроле устойчивости у представителей B.oleracea к нескольким расам Xcc. Ignatov et al. (1999) у линии SR1 при инокуляции методом удаления семядольного листа установили, что устойчивость к расам 1, 2, 4 и 5 Xcc у этого генотипа контролируется одним доминантным геном Rs, однако, упоминаний о практическом применении этого донора в селекционном процессе нами не обнаружено.

Таким образом, у большинства доноров генов устойчивости к СБ в пределах вида B.oleracea устойчивость количественная, рецессивная, которая кроме того, зависит от метода инокуляции/пути проникновения бактерий в растение. Отсутствие доноров моногенной доминантной устойчивости к нескольким расам,

в том числе к самым распространенным в РФ и мире - 1 и 4, требует вовлечения в селекционный процесс других видов семейства Brassicaceae обладающих такой устойчивостью.

1.2.2 Источники и доноры генов устойчивости к сосудистому бактериозу в пределах рода Brassica

В пределах всех экономически значимых видов рода Brassica, образующих треугольник U (U N, 1935), встречаются генотипы источники/доноры устойчивости к СБ, минимум к одной расе. В работе Taylor et al. (2002) были изучены некоторые линии всех этих видов, наиболее интересные образцы, с устойчивостью к трем и более расам представлены в таблице 1.2.

Таблица 1.2 - Отдельные примеры результатов, полученных посредством скрининга образцов Brassicaceae на устойчивость к сосудистому бактериозу с

использованием пяти рас Xanthomonas campestris pv. campestris (Taylor et al., 2002)

Вид Название Тип Источник (регистра- Минимальный и максимальный индекс Гены устойчивости/ однородность

ционный болезни популяции

номер) Раса 1 Раса 3 Раса 4 Раса 5 Раса 6

B. rapa Капуста USDA 1.3- 0.0- 0.0- 0.7- 2.3- К4+Я3?/неоднородная

китайская;ОР (PI 18984) 2.7 2.5 2.8 1.7 3.0

B. rapa Broccoletto di Брокколини; HRIGRU 0.1- 0.1- 0.0 0.0- 0.0- Расово-неспецифичная/

rapa Natalino OP (5235) 1.0 2.0 0.7 1.9 неоднородная

B. Covo Индийская HRIGRU 0.0 0.0 0.0 1.4- 1.0- Ю/однородная

juncea горчица; OP (4301) 2.2 2.0

B. Chotma Индийская HRIGRU 0.0- 0.0 0.0 0.3- 0.1- Расово-неспецифичная/

juncea горчица; OP (3110) 0.1 0.9 0.6 неоднородная

B. nigra Горчица черная; OP HRIGRU (11076) 0.03.0 0.03.0 0.01.6 2.42.6 1.93.0 Ю/ неоднородная

B. nigra Горчица черная; OP HRIGRU (11069) 0.00.2 0.0 0.0 0.0 0.41.7 Расово-неспецифичная/ неоднородная

B. Эфиопская USDA 0.0 0.0 0.0 1.1- 1.0- Ю/ однородная

carinata горчица; SPS (PI 99947) 1.4 2.3

B. Patu Эфиопская HRIGRU 0.0- 0.2- 0.0- 0.0 0.1- Расово-неспецифичная/

carinata горчица; OP (6232) 0.1 0.5 0.3 0.4 однородная

Примечание: OP - свободное опыление (сорт), и SPS - потомство растения,

отобранное после свободного опыления. Индекс болезни: < 0,1 - устойчивые; 0,1 -0,75 - частично устойчивые; > 0,75 - восприимчивые.

Авторами были выделены источники устойчивости к трем из пяти изученных рас и определены гены, обуславливающие эту устойчивость. Генотипы, показавшие устойчивость ко всем расам, были определены авторами как источники потенциальной расово-неспецифичной устойчивости.

Источники устойчивости к СБ также представлены в системах дифференциаторов {Kamoun, 1992; Vicente et al., 2013), описаны выше {см. параграф 1.1.3). К наиболее перспективным источникам генов устойчивости можно отнести генотипы, обладающие устойчивостью к наибольшему числу рас, в т.ч. к самым распространенным в мире - 1 и 4-й. Таким критериям соответствуют практически все образцы из таблицы 1.2 (Taylor et al., 2002), а также линия горчицы листовой Florida Broad Leaf Mustard (FBLM2) (B.juncea) устойчивая к 6-ти из 9-ти протестированных рас Xcc (Vicente et al., 2013).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Зубко Ольга Николаевна, 2019 год

Библиографический список

1. Бюллетени о состоянии сельского хозяйства [Электронный ресурс] : федеральная служба государственной статистики - URL: http://www.gks.ru/wps/wcm/connect/rosstat_main/rosstat/ru/statistics/publications/catal og/doc_1265196018516. (05.04.2019).

2. Джалилов Ф. С. Бактериальные болезни капусты (диагностика, патогенез, иммунитет, защитные мероприятия): автореф. дисс. доктора биологических наук: 06.01.11 / Ф. С. Джалилов. - Москва, 1996. - С. 31.

3. Джалилов, Ф. С. Вредоносность сосудистого бактериоза капусты / Ф. С. Джалилов, Г. Ф. Монахос, Р. Д. Тивари // Известия ТСХА. -1989. - Вып.3. - С. 69-71.

4. Джалилов, Ф. С. Сравнение методов оценки устойчивости капусты к сосудистому бактериозу / Ф. С. Джалилов, И. В. Корсак, Г. Ф. Монахос // Известия ТСХА. - 1995. - Вып.2. - С. 147-151.

5. Зубко, О.Н. Отдаленная гибридизация для передачи устойчивости к сосудистому бактериозу / О.Н. Зубко, С.Г. Монахос // Картофель и овощи. -2016. - № 11. - С. 39 - 40.

6. Игнатов А. Н. Селекционное и генетическое изучение устойчивости белокачанной капусты к сосудистому бактериозу: автореф. дисс. канд. с-х. наук: 06.01.05 , 06.01.11 / А.Н. Игнатов. - Москва, 1992. - С. 25.

7. Игнатов, А.Н. Анализ расового состава популяции Xanthomonas campestris pv. campestris (Pamm.) Dow в России и селекция на устойчивость к сосудистому бактериозу / А.Н. Игнатов, Ф.С. Джалилов, Г.Ф Монахос // Генетические коллекции овощных растений. - СПб. : ВИР, 2001. - С. 179-190.

8. Монахос, Г.Ф. Капуста пекинская Brassica rapa L. Em. Metzg. ssp. Pekinensis (Lour.) Hanelt. Биологические особенности, генетика, селекция и семеноводство / Г.Ф. Монахос, С.Г. Монахос. - Москва: Изд-во РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, 2009. - 182 с.

9. Монахос, Г.Ф. Наследование устойчивости к сосудистому бактериозу у самонесовместимых линий позднеспелой белокочанной капусты / Г.Ф.

Монахос, Ф.С. Джалилов, Р.Д. Тивари // Известия ТСХА. - 1990. - Вып.4. - С. 8691.

10. Монахос, Г.Ф. Проявление симптомов сосудистого бактериоза у капустных растений с различными генами устойчивости в зависимости от концентрации инокулюма Xanthomonas campestris pv. Campestris / Г.Ф. Монахос, Ха Во Тхи Нгок, Ф.С. Джалилов // Известия ТСХА. - 2015. Вып. 1. С. 26-34.

11. Монахос, Г.Ф. Селекция капусты на устойчивость: состояние и перспективы / Г.Ф. Монахос, С.Г. Монахос, Г.А. Костенко // Картофель и овощи. - 2016. - № 12. - С. 31-35.

12. Обзор фитосанитарного состояния посевов сельскохозяйственных культур в российской Федерации в 2017 году и прогноз развития вредных объектов в 2018 году [Электронный ресурс] : министерство сельского хозяйства Российской Федерации, федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский сельскохозяйственный центр». - М., 2018. - URL: https://rosselhoscenter.com/files/users/42/Moskva/%D0%9E%D0%B1 %D0%B7%D0% BE%D1%80 2017 %D0%B3 %D0%BE%D0%B1%D1%8A%D0%B5%D0%B4%D0 %B8%D0%BD%D0%B5%D0%BD%D0%BD%D1%8B%D0%B9-ilovepdf-compressed 63ca9.pdf (09.02.2019).

13. Орынбаев, А.Т. Использование надуксусной кислоты для обеззараживания семян капусты от сосудистого бактериоза / А.Т. Орынбаев, Ф.С. Джалилов // Тезисы международной научно-практической конференции «Состояние и перспективы селекции и семеноводства капустных культур». - М. : РГАУ-МСХА. - 2016. - С. 43-44.

14. Орынбаев, А.Т. Методы оценки и характер наследования стеблевой устойчивости к сосудистому бактериозу у белокочанной капусты / А.Т. Орынбаев, Ф.С. Джалилов, Г.Ф. Монахос // Известия ТСХА. - 2019. - Вып. 1. - С. 45-53.

15. Приходько Н.И. Флора СССР / Н.И. Приходько, В.Д. Рудь // Поиплоидия. - Л. : Колос, 1984. - С .272 - 282

16. Пухальский, В.А. Практикум по цитологии и цитогенетике растений / В.А. Пухальский, А.А, Соловьев, Е.Д. Бадаева, В.Н. Юрцев. - М. : КолосС, 2007. -198 с.

17. Afrin, K.S. Development of Molecular Marker through Genome Realignment for Specific Detection of Xanthomonas campestris pv. campestris Race 5, a Pathogen of Black Rot Disease / K. S. Afrin , M.A. Rahim, H.J. Jung, J.I. Park, H.T. Kim, and I.S. Nou // J. Microbiol. Biotechnol. - 2019. - Vol. 29(5). - P. 785-793.

18. Akbar, A. Resynthesis of Brassica napus aiming for improved earliness and carried out by different approaches / A. Akbar // Hereditas. - 1989. - Vol. 111. - P. 239-246.

19. Arias, R.S. Effect of soil-matric potential and phylloplanes of rotation-crops on the survival of a bioluminescent Xanthomonas campestris pv. Campestris / R.S. Arias, S.C. Nelson, A.M. Alvarez // Eur. J. Plant Pathol. - 2000. - Vol. 106. - P. 109-116.

20. Attia,T. Digenomic triploids for an assessment of chromosome relationships in the cultivated diploid Brassica species / T. Attia, C. Busso, G. Röbbelen // Genome. - 1987. - Vol. 29. - P. 326-330.

21. Babadoost, M. Efficacy of sodium hypochlorite treatments for control of Xanthomonas campestris pv. campestris in Brassica seeds / M. Babadoost, M. L. Derie, R. L. Gabrielson // Seed Science and Technology. -1996. - Vol.24. - P. 7-15.

22. Bazzi, C. Seed-transmission of phytopathogenic bacteria / C. Bazzi // Petria. - 1991. - Vol. 1. - P. 19-30.

23. Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. J / G . Bertani // Bacteriol. - 1951. - Vol. 62. - P. 293-300.

24. Bhatia R. Efficient microspore embryogenesis in cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis L.) for development of plants with different ploidy level and their use in breeding programme / R. Bhatia, S. S. Dey, S. Sood et. al. // Scientia Horticulturae. - 2017. - Vol. 216. - P. 83-92.

25. Bora, L. C. Integrated management of black rot of cabbage caused by Xanthomonas campestris(Pammel) Dowson / L. C. Bora. A. K. Bhattacharyya // Agricultural Science Society of North-East India. - 2000. - Vol. 132. - P. 229-233.

26. Busso, C. Trigenomic combinations for the analysis of meiotic control in the cultivated Brassica species / C. Busso, T. Attia, G. Röbbelen // Genome. - 1987. -Vol. 29. - P. 331-333.

27. Chiang, M. S. Transfer of resistance to race 2 of Plasmodiophora brassicae from Brassica napus to cabbage (B.oleracea ssp. capitata). III. First backcross and F2 progenies from interspecific hybrids between B. napus and B.oleracea ssp. capitate / M.S. Chiang, B.Y. Chiang, W.F. Grant // Euphytica. - 1979. - Vol. 28(2). - P. 257266.

28. Chiang, M.S. Transfer of resistance to race 2 of Plasmodiophora brassicae from Brassica napus to cabbage (B.oleracea var. capitata). I. Interspecific hybridization between B. napus and B.oleracea var.capitata / M.S. Chiang, B.Y. Chiang, W.F. Grant // Euphytica. - 1977. - Vol. 26. - P. 319-336.

29. Cook, A.A. Studies on the disease cycle of black rot of crucifers / A.A. Cook, J.C. Walker, R.H. Larson // Phytopathology. - 1952. - Vol. 42. - P. 162-167.

30. Cruz, J. Assessment of Diversity Xanthomonas campestris Pathovars Affecting Cruciferous Plants in Portugal and Disclosure of two novel X. campestris pv. campestris races / J. Cruz, R. Tenreiro, , L. Cruz // Plant Pathology. - 2017. - Vol. 99(2). - P. 403-414.

31. Custers, J.B.M. Microspore culture in rapeseed (Brassica napus L.) / J.B.M. Custers // Doubled haploid production in crop plants / Eds. M. Maluszynski, K.J. Kasha, B.P. Forster, I. Szarejko. - Kluver Academic Publisher. - 2003. - P. 185 - 194.

32. Dane, F. Survival and persistence of bioluminescent Xanthomonas campestris pv. campestris on host and non-host plants in the field environment / F. Dane, J.J. Shaw // J. Appl. Bacteriol. - 1996. - Vol. 80. - P. 73-80.

33. Demeke, T. Potential taxonomic use of random amplified polymorphic DNA (RAPD): a case study in Brassica / T. Demeke, R.P. Adams, R. Chibbar // Theoretical and Applied Genetics. - 1992. - Vol. 84. - P. 990-994.

34. Dey, S. S. Inter specific hybridization (Brassica carinata x Brassica oleracea) for introgression of black rot resistance genes into Indian cauliflower (B.oleracea var. botrytis L.) / S. S. Dey, K. Sharma, R. Bhatia and etc. // Euphytica. -2015. - Vol. 204(1). - P. 149-162.

35. Dolezel, J. Estimation of nuclear DNA content in plants using flow cytometry / J. Dolezel, J. Greilhuber, J Suda // Nature Protocols. - 2007. - Vol. 2(9). -P. 2233-2244/

36. Fargier, E. Pathogenicity assays restrict the species Xanthomonas campestris into three pathovars and reveal nine races within X. campestris pv. Campestris / E. Fargier, C. Manceau // Plant Pathol. - 2007. - Vol. 56. P. 805-818.

37. Fredua-Agyeman, R. Molecular cytogenetic identification of B genome chromosomes linked to blackleg disease resistance in Brassica napus x B. carinata interspecific hybrids / R. Fredua-Agyeman, O. Coriton, V. Huteau et. al. // Theoretical and Applied Genetics. - 2014. - Vol. 127(6). P. 1305-1318.

38. Gamborg, O.L. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells / O.L. Gamborg, R.A. Miller, K. Ojima // Exp. Cell. Res. - 1968. - Vol. 50. -P. 151-158.

39. Garman, H. A bacterial disease of cabbage / H. Garman // Kentucky Agr. Exp. Stn. Rep. 3. - 1894. P. 43-46.

40. Goszczynska, T. Introduction to Practical Phytobacteriology / T. Goszczynska, J.J. Sefontein, S. Serfontein // ARC-Plant Protection Research Institute, Pretoria, South Africa. - 2000. - 83 p.

41. Guo, H. Brassica napus sources of resistance to black rot of crucifers and inheritance of resistance / H. Guo, M. H. Dickson, J. E. Hunter // HortScience. - 1991. -Vol. 26. - P. 1545-1547.

42. Gupta, S.K. Production of interspecific and intergeneric hybrids in Brassica and Raphanus. Cruciferae Newsl / S.K. Gupta // Eucarpia. - 1997. - Vol. 19. - P. 2122.

43. Hansen, L. N. Transfer of resistance to Xanthomonas campestris pv campestris into Brassica oleracea L. by protoplast fusion / L. N. Hansen, E. D. Earle // Theor Appl Genet. - 1995. - Vol. 91. - P. 1293-1300.

44. Harberd, D. J. A simple effective embryo culture technique for Brassica / D.J. Harberd // Euphytica. - 1969. - Vol. 18. - P.425-429.

45. Ignatov, A. Black rot of crucifers and sources of resistance in Brassica crops / A. Ignatov, K. Hida, Y. Kuginuki // JARQ Japan Agric. Res. Q. - 1998a. - Vol. 32. - P. 167-172.

46. Ignatov, A. Distribution and inheritance of race-specific resistance to Xanthomonas campestris pv. campestris in Brassica rapa and B. napus / A. Ignatov, Y. Kuginuki, K. Hidam // J. Russ. Phytopathol. - 2000. - Vol. 1. - P. 89-94.

47. Ignatov, A. Race-specific reaction of resistance to black rot in Brassica oleracea / A. Ignatov, Y. Kuginuki, K. Hida // Eur. J. Plant Pathol. - 1998b. - Vol. 104. - P. 821-827.

48. Ignatov, A. Vascular stem resistance to black rot in Brassica oleracea / A. Ignatov, Y. Kuginuki, K. Hida // Canadian Journal of Botany. - 1999. - Vol. 77(3). - P. 442-446.

49. Inomata, N. Production of interspecific hybrids between Brassica campestris and Brassica oleracea by culture in vitro of excised ovaries / N. Inomata // Jpn. J. Breed. - 1977. - Vol. 27. - P. 295-304.

50. Jamwal, R. S. Inheritance of resistance to black rot (Xanthomonas campestris pv. Campestris) in cauliflower (Brassica oleracea var. Botrytis) / R.S. Jamwal, P. P. Sharma // Euphytica. - 1986. - Vol. 35(3). - P. 941-943.

51. Jensen, B.D. Occurrence and diversity of Xanthomonas campestris pv. campestris in vegetable brassica fields in Nepal / B.D. Jensen, J.G., Vicente, H.K. Manandhar et. al. // Plant Dis. - 2010. - Vol. 94. - P. 298-305.

52. Jourdan, P. Brassica carinata resynthesized by protoplast fusion / P. Jourdan, E. Salazar // Theoretical and Applied Genetics. - 1993. - Vol. 86(5). - P. 567572.

53. Kamoun, S. Incompatible interaction between crucifers and Xanthomonas campestris involve a vascular hypersensitive response: role of the hrpX locus / S. Kamoun, H.V. Kadmar, E. Tola et. al. // Molecular Plant-microbe Interactions. - 1992. - Vol. 5. - P. 22-33.

54. Kaneko, K. Production of interspecific hybrids between Brassica campestris and B.oleracea and intergeneric hybrids between Raphanus sativus and B. campestris by ovule culture / K. Kaneko, Y. Okafuji, O. Matsumoto // Bull. Yamaguchi Agr. Exp. Sta. - 1996. - Vol. 47. - P. 6-13.

55. Kirov, I. An easy "SteamDrop" method for high quality plant chromosome preparation / I. Kirov, M. Divashuk, K. Van Laere, et. al. // Molecular Cytogenetics. -2014. - Vol. 7:21.

56. Krauthausen, H.J. Methods to reduce the spread of the black rot pathogen, Xanthomonas campestris pv. campestris, in brassica transplants / H.J. Krauthausen, N. Laun, W. J. Wohanka // Plant Dis. Prot. - 2011. - Vol. 118. - P. 7-16.

57. Kulak, S. Karyotyping of Brassica amphidiploids using 5S and 25S rDNA as chromosome markers / S. Kulak, R. Hasterok, J. Maluszynska // Hereditas. - 2002. -Vol. 136(2). - P. 144-150.

58. Lagercrantz, U. Comparative genome mapping in Brassica / U. Lagercrantz, D.J. Lydiate // Genetics. - 1996. - Vol. 144. - P. 1903-1910

59. Lichter, R. Induction of haploid plants from isolated pollen of Brassica napus / R. Lichter // E. Pflanzenphysiol. - 1982. - Vol. 105. - P. 427-434.

60. Lu, C. Fertilization fitness and relation to chromosome number in interspecific progeny between Brassica napus and B. rapa: a comparative study using natural and resynthesized B. napus / C. Lu, M. Kato // Breed. Sci. - 2001. - Vol. 51. -P. 73-82.

61. Maluszynska, J. (2005). Identification of individual chromosomes and parental genomes in Brassica juncea using GISH and FISH / J. Maluszynska, R. Hasterok // Cytogenetic and Genome Research. - 2005. - Vol. 109(1-3). - P. 310-314.

62. Momotaz, A. Production of intergeneric hybrids between Brassica and Sinapis species by means of embryo rescue techniques / A. Momotaz, M. Kato, F. Kakihara // Euphytica. - 1998. - Vol. 103. - P. 123-130.

63. Motegi, T. Obtaining an Ogura-type CMS line from asymmetrical protoplast fusion between cabbage (fertile) and radish (fertile) / T. Motegi, I. Nou, J. Zhou, et. al. // Euphytica. - 2003. - Vol. 129. - P. 319-323.

64. Murashige, T. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures / T. Murashige, F. Skoog // Physiol. Plant. - 1962. - Vol. 15. -P. 473-497.

65. Murray, M.G. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA / M.G. Murray, W. F. Thompson // Nucleic Acids Research. - 1980. - Vol. 19. - P. 43214325.

66. Navabi, Z. K. Analysis of B-genome chromosome introgression in interspecific hybrids of Brassica napus x B.carinata / Z. K. Navabi, K. E. Stead, J. C. Pires et al. // Genetics. - 2010. - Vol. 187. - P. 659-673.

67. Olsson, G. Species crosses within the genus Brassica / G. Olsson // Hereditas. - 1960. - Vol. 46(3-4). - P. 351-386.

68. Pammel, L.H. Bacteriosis of rutabaga (Bacillus campestris n sp.) / L.H. Pammel // Am. Mon. Microsc. J. - 1895a. - Vol. 16. - P. 145-151.

69. Pammel, L.H. Bacteriosis of rutabaga (Bacillus campestris n. sp.) / L.H. Pammel // Iowa State Coll. Agric. Exp. Stn. Bull. - 1895b. - Vol. 27. - P. 130-134.

70. Panjabi, P. Comparative mapping of Brassica juncea and Arabidopsis thaliana using Intron Polymorphism (IP) markers: homoeologous relationships, diversification and evolution of the A, B and C Brassica genomes / P. Panjabi, A. Jagannath, N. C. Bisht et. al. // BMC Genomics. - 2008. - Vol. 9(1). . - P. 113.

71. Parkin, I.A.P. Identification of the A and C genomes of amphidiploid Brassica napus (oilseed rape) / I.A.P. Parkin, A.G. Sharpe, D.J. Keith, D.J. Lydiate // Genome. - 1995. - Vol. 38. - P. 1122-1131.

72. Pelletier, G. Intergeneric cytoplasmic hybridization in cruciferae by protoplast fusion / G. Pelletier, C. Primard, F. Vedel et. al. // MGG Molecular & General Genetics. - 1983. - Vol. 191(2). - P. 244-250.

73. Quazi, M.H. Interspecific hybrids between Brassica napus L. and Brassica oleracea L. developed by embryo culture / M.H. Quazi // Theor Appl Genet -1988. -Vol. 75. - P. 309-318.

74. Rahman, M.H. Optimum age of siliques for rescue of hybrid embryos from crosses between Brassica oleracea, B.rapa and B.carinata / Rahman, M.H. // Can. J. Plant Sci. - 2004. - Vol. 84. - P. 965-969.

75. Rahman, M.H. Production of yellow-seeded Brassica napus through interspecific crosses / M.H. Rahman // Plant Breed. - 2001. - Vol. 120. - P. 463-472.

76. Reed, S.M. Embryo Rescue / S.M Reed // Plant Development and Biotechnology. - CRC Press, 2005. - P. 235- 239.

77. Rubel, M. Whole-Genome Re-Alignment Facilitates Development of Specific Molecular Markers for Races 1 and 4 of Xanthomonas campestris pv. campestris, the Cause of Black rot Disease in Brassica oleracea / M. Rubel, A. Robin, S. Natarajan, J. Vicente, H-T. Kim, J.-I. Park, I-S. Nou // Int. J. Mol. Sci. - 2017. - Vol. 18. - P. 2523.

78. Rygulla, W. Combination of resistance to Verticillium longisporum from zero erucic acid Brassica oleracea and oilseed Brassica rapa genotypes in resynthesized rapeseed (Brassica napus) lines / W. Rygulla, W. Friedt, F. Seyis, W. Lühs, C. Eynck, A. Tiedemann, R.J. Snowdon // Plant Breed. - 2007a. - Vol. 126. - P. 596-602.

79. Rygulla, W., Snowdon, R.J., Eynck, C., Koopmann, B., von-Tiedemann, A., Lühs, W. and Friedt, W. 2007b. Broadening the genetic basis of Verticillium longisporum resistance in Brassica napus by interspecific hybridization. Phytopathology 97: 1391-1396.

80. Schaad, N.W. Detection of seed borne bacterial plant pathogens / N.W. Schaad // Plant Dis. - 1982. - Vol. 66. - P. 885-890.

81. Schaad, N.W. Survival of Xanthomonas campestris in soil / N.W. Schaad, W.C. White // Phytopathology. - 1974. - Vol. 64. - P. 1518-1520.

82. Schaad, N.W. Xanthomonas campestris pv. campestris: cause of black rot of crucifers. In: Xanthomonas / N.W. Schaad, A. Alvarez // London: Chapman & Hall.

- 1993. - P. 51-55.

83. Seyis, F. Molecular characterization of novel resynthesized rapeseed (Brassica napus) lines and analysis of their genetic diversity in comparison with spring rapeseed cultivars / F. Seyis, R.J. Snowdon, W. Lühs, W. Friedt // Plant Breed. - 2003.

- Vol. 122. - P. 473-478.

84. Sharma, B. B. Genetics and molecular mapping of black rot resistance locus Xcalbc on Chromosome B-7 in EthiopianMustard (Brassica carinata A. Braun) / B. B. Sharma, P. Kalia, D. K. Yadava et. al. // PLoS ONE. - 2016. - Vol. 11 (3). - P. 1-13.

85. Sharma, B. B. Introgression of Black Rot Resistance from Brassica carinata to Cauliflower (Brassica oleracea botrytis Group) through Embryo Rescue / B. B. Sharma, P. Kalia, D. Singh et. al. // Frontiers in Plant Science. - 2017. - Vol. 8. - P. 1255.

86. Sharma, B. R. Inheritance of resistance to blackrot in cauliflower / B. R. Sharma, V. Swarup, S. S. Chatterjee // Canadian Journal of Genetics and Cytology. -1972. - Vol. 14(2). - P. 363-370.

87. Snowdon, R.J. Genomic in situ hybridisation in Brassica amphidiploids and interspecific hybrids / R.J. Snowdon, W. Köhler, W. Friedt, A. Köhler // Theoretical and Applied Genetics. - 1997. - Vol. 95. - P. 1320-1324.

88. Song, K. Development of synthetic Brassica amphidiploids by reciprocal hybridization and comparison to natural amphidiploids / K. Song, K. Tang, T.C. Osborn // Theor. Appl. Genet. - 1993. - Vol. 86. - P. 811-821.

89. Sutton J.C. Relation of xylem plugging to black rot lesions development in cabbage / J.C. Sutton, P.H. Williams // Canadian Journal of Botany. - 1970. - Vol. 48(2). - P. 391-401.

90. Taylor, J.D. Sources and origin of resistance to Xanthomonas campestris pv. campestris in Brassica genomes / J.D. Taylor, J. Conway, S.J. Roberts et. al. // Phytopathology. - 2002. - Vol. 92. - P. 105-111.

91. Tonguc, M. Development of black rot resistant interspecific hybrids between Brassica oleracea L. cultivars and Brassica accession A 19182, using embryo rescue / M. Tonguc, P.D. Griffiths // Euphytica. - 2004b. - Vol. 136. - P. 313-318.

92. Tongu?, M. Segregation distortion of Brassica carinata derived black rot resistance in Brassica oleracea / M. Tonguc, E. D. Earle, P.D. Griffiths // Euphytica. -2003. - Vol. 134(3). - P. 269-276.

93. Tongu?, M. Transfer of powdery mildew resistance from Brassica carinata to Brassica oleracea through embryo rescue /, M. Tongu?, P.D. Griffiths // Plant Breed. - 2004a. - Vol. 123. - P. 587-589.

94. U, N Genome analysis in Brassica with special reference to the experimental formation of B. napus and peculiar mode of fertilization / N, U // Jpn J Genet. -1935. - Vol. 7. - P. 784-794.

95. Vauterin, L. Reclassification of Xanthomonas / L. Vauterin, B. Hoste, K. Kersters et. al. // Int. J. Syst. Bacteriol. - 1995. - Vol. 45. - P. 472-489.

96. Vicente, J. G. Inheritance of Race-Specific Resistance to Xanthomonas campestris pv. Campestris in Brassica Genomes / J. G. Vicente, J. D. Taylor, A. G. Sharpe et. al. // Phytopathology. - 2002. - Vol. 92(10). - P. 1134-1141.

97. Vicente, J.G. Identification and origin of Xanthomonas campestris pv. campestris races and related pathovars / J.G. Vicente, J. Conway, S.J. Roberts et. al. // Phytopathology. - 2001. - Vol. 91. - P. 492-499.

98. Vicente, J.G. Xanthomonas campestris pv. campestris (cause of black rot of crucifers) in the genomic era is still a worldwide threat to brassica crops / J.G. Vicente, E.B. Holub // Mol. Plant Pathol. - 2013. - Vol. 14, - P. 2-18.

99. Walker, J.C. Cauliflower, cabbage, and others. In: Plant Diseases. The Yearbook of Agriculture / J.C. Walker. - Washington: US Department of Agriculture, 1953. - P. 425-430.

100. Wan, Z. Genetic characterization of a new cytoplasmic male sterility system (hau) in Brassica juncea and its transfer to B. napus / Z. Wan, B. Jing, J. Tu, C. Ma, J. Shen, B. Yi, J. Wen, T. Huang, X. Wang, T Fu // Theor. Appl. Genet. - 2008. -Vol. 116. - P. 355-362.

101. Warwick S.I., Francis A. and Gugel R.K. Guide to Wild Germplasm of Brassica and Allied Crops (Tribe Brassiceae, Brassicaceae) [Электронный ресурс]: Part III - URL: http://www.brassica.info/info/publications/guidewild/Guide_ed3_PART%20III_16July 2009.pdf (03.05.2018).

102. William, S. Bacterial genomic DNA isolation using CTAB / S. William, H. Feil, A. Copeland // Doe joint genome institute, US Department of Energy, Office of Science. - 2012. - P. 1- 4.

103. Williams, P.H. Inheritance of Resistance in Cabbage to Black Rot / P.H. Williams, T. Staub, J. C. Sutton // Phytopathology. - 1971. - Vol. 62. - P. 247-252.

Приложения Приложение А

Образование уни- би- и тривалентов в поздней профазе I мейоза у межвидового

гибрида БК

Приложение Б

Завязываемость семян в реципрокных скрещиваниях межвидовых гибридов БК и КБ с диплоидными линиями B.oleracea

и межвидового гибрида БК с тетраплоидной ЗМ1-1

Комбинация Опылено Завязалось Завязалось Комбинация Опылено Завязалось Завязалось

скрещивания бутонов, шт. семян, шт. семян, шт./стручок скрещивания бутонов, шт. семян, шт. семян, шт./стручок

БюхБК 52 7 0,13 БКхЗМ1-1 107 33 0,31

БкхБю 69 42 0,61 БКхЭт 107 30 0,28

КБхБю 93 26 0,28 КБхЭт 118 11 0,09

БюхКБ 34 3 0,09 КБхАгр013 25 14 0,56

КБхМЛА 76 27 0,36 БКхАгр012 43 6 0,14

БКхМЛА 107 37 0,35 КБхАгр2ки1 89 14 0,16

КБхЕWЭ 62 10 0,16 БКхАгр2ки1 161 4 0,02

БКхЕWЭ 78 13 0,17 БкхБФ 71 12 0,17

БфхКБ 17 2 0,12 КБхБФ 44 14 0,32

БфхБК 21 1 0,05 ЕWЭхКБ 86 0 0,00

ЕWЭхБК 15 1 0,07 Агр012хБК 31 1 0,03

Агр013хКБ 32 0 0,00

Приложение В

Реакция растений ВС1-популяции на инокуляцию 1, 3 и 4 расами Xcc

Комбинация Номер Заса Xcc Комбинация Номер Раса Xcc

скрещивания растения 1 3 4 скрещивания растения 1 3 4

БюхБК 1 - - - БКхЗм1-1 1 - - -

2 + - - 2 - - -

3 - + + 3 - - -

4 - - - 4 - + +

5 - + - 5 - - -

6 - - - 6 - - -

БКхБю 1 + + - 7 + + -

2 - + - 8 + - н.д.

3 - + - 9 - + +

4 - + - 10 - + -

5 - + - 11 + - -

6 - + - 12 - - -

7 - + - 13 + - н.д.

8 + + - БКхЭт 1 - + -

9 - - - 2 - - -

10 + + - 3 - + -

11 - + - 4 - - -

12 - + - 5 + - -

13 + + - 6 - - н.д.

14 + + - 7 + - -

15 - - - 8 + - -

16 - + + 9 + - н.д.

17 + - - 10 - + -

18 - - - КБх Эт 1 + - -

19 + н.д. - 2 + + -

20 - - - 3 - н.д. н.д.

21 + н.д. н.д. 4 - - +

22 + н.д. - 5 н.д. + +

КБхБю 1 - + + 6 - - -

2 + н.д. н.д. КБхАгр012 1 - - -

3 - + н.д. 2 + + -

4 + - - 3 + + -

5 + - н.д. 4 - + -

БюхКБ 1 - + + 5 - + -

КБхМЛА 1 - + - 6 + -

2 - - - БКхАгр012 1 - - -

БКхМЛА 1 - + - 2 - + +

2 + + - 3 + + -

3 + - н.д. КБхАгр2ки1 1 + + +

КБхEWЭ 1 + + - 2 - - н.д.

2 + - + 3 + - -

БКхEWЭ 1 - + + БКхАгр2ки1 1 н.д. н.д. н.д.

2 + + - БКхБф 1 + + н.д.

3 - + - КБхБф 1 - + -

4 + + - 2 - + -

5 + - - 3 + + н.д.

Контроль линия 1 - - - Контроль линия 1 + + +

Р1199947 2 - - - ЦВ9 (B.oleracea) 2 + + +

(B.carinata) 3 - - - 3 + + +

Примечание: н.д. - нет данных, + восприимчивость, - устойчивость; цветом

выделены устойчивые к 3-м расам Xcc генотипы

128

Приложение Г

Завязываемость семян от скрещиваний ВС1-растений с ди- и тетраплоидными линиями B.oleracea

Комбинация скрещивания ц/б Опылено бутонов, шт. Завязалось семян Завязалось семян, шт./стручок Комбинация скрещивания ц/б Опылено бутонов, шт. Завязалось семян Завязалось семян, шт./стручок

БюБК1х БюБК1 ц 8 2 0,25 БККор1хБККор1 ц 10 0 0,00

б 35 434 12,40 б 22 2 0,09

БюБК 1 х Аут3ки(14) б 35 650 18,57 БККор1хАут б 37 6 0,16

БюБК1хМп б 68 1250 18,38 БККор1хЦв9 б 42 12 0,29

БюБК1хЦв9 б 50 1500 30,00 БККор2(3) хМП б 37 11 0,30

БюБК1хМп ц 4 124 31,00 БККор2(3) хЦв9 б 37 10 0,27

б 7 91 13,00 БККор2(3 ) х Аут3ки( 14) б 50 9 0,18

БюБК1хЦв9 б 14 290 20,71 КБЭтбх КБЭтб ц 6 0 0,00

ц 5 154 30,80 б 19 0 0,00

БюБК1 хТен ц 6 212 35,33 КБЭтбхТен б 35 1 0,03

б 17 462 27,18 КБЭтбхБр б 36 6 0,17

Мпх БюБК1 б 16 280 17,50 КБЭтбхМп б 30 2 0,07

Цр1дг1хБюБК1 ц 10 16 1,60 КБЭт6хЦв9 б 60 1 0,02

б 21 225 10,71 ТенхКБЭтб б 8 1 0,13

БПхБюБК1 ц 6 5 0,83

б 21 17 0,81 БКЗм2хЭт2 б 54 16 0,14

АутхБюБК1 ц 8 227 28,38 БКЗм2х БКЗм2 ц 14 0 0,00

б 8 254 31,75 б 40 0 0,00

ТенхБюБК1 ц 3 76 25,33 БКЗм2хЗм1-1 б 45 0 0,00

б 5 78 15,60 БКЗм2хАпт2 б 83 0 0,00

БюБК4х БюБК4 ц 15 0 0,00 БКЗм2хЦв9 б 31 0 0,00

б 16 127 7,94 БКЗм2хЭт3 б 66 0 0,00

БюБК4хТен ц 5 100 20,00 Эт3хБКЗм2 б 81 11 0,14

б 8 114 14,25 БКЗмбх БКЗмб б 29 9 0,31

БюБК4х Аут3ки(14) б 39 740 18,97 БКЗм6хЦв9 б 24 0 0,00

БюБК4хМп б 19 81 4,26 БКЗм6хЗм1-1 б 43 5 0,12

БюБК4х Аут ц 7 201 28,71 БКЗм6хАпт2 б 61 46 0,75

б 9 176 19,56 Апт2хБКЗм6 б 8 7 0,88

БюБК4хЦв9 ц 9 274 30,44 Эт3 хБКЗмб б 40 4 0,10

б 12 208 17,33 БКБю 15 х БКБю15 ц 6 0 0,00

Продолжение приложения Г

БюБК4хМп ц 8 213 26,63 б 14 0 0,00

б 12 284 23,67 БКБю 15 х Аут3ки(14) б 40 8 0,20

Црдг1х БюБК4 ц 5 1 0,20 БКБю15хМП б 42 5 0,12

б 14 11 0,79 БКБю15хАгр2ки1(13) б 69 2 0,03

ТенхБюБК4 б 8 134 16,75 БКБю15хЦв9 б 61 10 0,16

МпхБюБК4 ц 3 18 6,00 БКБю15х Црдг1 б 14 1 0,07

б 11 17 1,55 БКБю15хТен б 27 1 0,04

БюБКбх Аут3ки14 б 47 1107 23,55 БКБю15хБр б 26 5 0,19

БюБКбхМп б 62 1579 25,47 ТенхБКБю15 б 12 0 0,00

БюБК6хЦв9 ц 5 161 32,20 МпхБКБю15 б 5 2 0,40

б 13 282 21,69 БКБю18х БКБю 18 ц 3 0 0,00

БюБКбхТен ц 4 93 23,25 б 23 0 0,00

б 5 81 16,20 БКБю18хБр б 39 6 0,15

ТенхБюБКб ц 3 7 2,33 БКБю18х Мп б 47 2 0,04

б 6 69 11,50 БКБю18хЦв9 б 24 7 0,29

Мпх БюБК6 б 18 129 7,17 МпхБКБю18 б 8 2 0,25

АутхБюБКб ц 5 144 28,80 ТенхБКБю18 б 9 2 0,22

б 9 187 20,78 БКБю9хАут б 27 21 0,78

Цр1дг1хБюБК6 ц 7 2 0,29 БКБю9х Црдг1 б 40 11 0,28

б 19 190 10,00 БКБю9хМп2 б 23 6 0,26

БКБю9хЦв9 б 15 8 0,53

МпхБКБю9 б 18 42 2,33

БПхБКБю9 ц 8 3 0,38

б 19 0 0,00

Примечание: ц/б - опыление в цветках/опыление в бутонах

Приложение Д

Анализ устойчивости/восприимчивости ВС2-растений на инокуляцию 1, 3 и 4 расами Xcc

Комбинация № Раса Xcc Комбинация № Раса Хсс Комбинация № Раса Xcc Комбинация № Раса Xcc

скрещивания 1 3 4 скрещивания 1 3 4 скрещивания 1 3 4 скрещивания 1 3 4

БКБю 15 х Аут3ки(14) 1 + - + ТенхБКБю18 1 + + + БюБК6хЦв9 1 + + + БюБКбх Аут3ки14 1 + + +

2 - -/+ - 2 + + + 2 + + + 2 + + +

3 + + + Мпх БюБК6 1 + + + 3 + + + 3 + + +

4 + + + 2 + - + 4 + + + 4 + + +

5 + + + 3 + + + 5 + + + 5 + + +

БПхБКБю9 1 + + + 4 + + + 6 + + + 6 + + +

2 + + + 5 + - + 7 + + + 7 + + +

3 + + + 6 + - + 8 + + + 8 + + +

БКБю15хМп 1 + + - 7 + + + 9 + + + 9 + + +

2 + - + 8 + + + 10 + + + 10 + + +

БКЗмбх БКЗмб 1 - - - 9 + + + 11 + + + 11 + - +

БКБю9хЦв9 1 + + + 10 + + + 12 + + + 12 + + +

2 + + + 11 + + + 13 + + + 13 + + +

3 + + + 12 + - + 14 + + + 14 + + +

4 + - + 13 + + + 15 + + + 15 + + +

5 + + + 14 + + + 16 + + + 16 + + +

БКБю15хАгр2ки1(13) 1 + - + 15 + + + 17 + + + 17 + + +

БККор2(3) хМп 1 - + + 16 + - + 18 + + + 18 + + +

2 + + + 17 + - + 19 + + + 19 + + +

Эт3хБКЗм2 1 + + + 18 + + + 20 + + + 20 + + +

2 + - + 19 + + + 21 + + + 21 + + +

3 + - + 20 + + + 22 + + + 22 + + +

4 + + + 21 + + + 23 + + + 23 + + +

5 + - + 22 + + + 24 + + + 24 + + +

6 + - + 23 + + + 25 + + + 25 + + +

7 + + + 24 + + + 26 + + + 26 + + +

БККор1хЦв9 1 + + + 25 + + + 27 + + + 27 + + +

2 + - + 26 + + + 28 + + + 28 + + +

3 + - + 27 + + + 29 + + + 29 + + +

Продолжение приложения Д

4 + - + 28 + + + 30 + + + 30 + + +

5 + + - 29 + + + 31 + + + 31 - + +

6 + + + 30 + - + 32 + + + 32 + + +

7 + + + 31 + + + 33 + + + 33 + + +

8 + + + 32 + + + 34 + + + 34 + + +

Црдг1 х БюБК4 1 + + - Эт3 хБКЗмб 1 + - - 35 + + + 35 + + +

БККор1х БККор1 1 + - - 2 + + + 36 + + + 36 + + +

БККор2(3) хЦв9 1 + + + 3 + + + 37 + + + 37 + + +

2 + + + 4 - - -/+ 38 + + + 38 + + +

3 + + + 5 + + + 39 + + + 39 + + +

4 + + + БюБК4х БюБК4 1 + + + 40 + + + 40 + - +

5 + + + 2 - + + 41 + + + 41 + + +

6 + + + Мпх БюБК1 1 + + + МпхБюБК4 1 + + + 42 + + +

7 - - - 2 + + + 2 + + + 43 + + +

8 + - + 3 + + + 3 + + + 44 + + +

9 + + + 4 + - + 4 + + + 45 + + +

БюБК1х БюБК1 1 + + + 5 + + + 5 + + + 46 + + +

2 + + + 6 + + + 6 + + + 47 + + +

3 + + + 7 + + + 7 + + + 48 + + +

4 + + + 8 + + + 8 + + + 49 + + +

5 + + + 9 + + + 9 + + + 50 + + +

6 + - + 10 + + + 10 + + + 51 + + +

7 + + + 11 + + + 11 + + + 52 + + +

8 + + + 12 + + + 12 + + + 53 + + +

9 + + + 13 + + + 13 + + + 54 + + +

10 - - + 14 + + + 14 + + + ТенхБюБК4 1 + + +

11 + - + 15 + + + 15 + + + 2 + + +

12 + + + 16 + + + 16 + + + 3 + + +

13 + + + 17 + - + БюБКбхТен 1 + + - 4 + + +

14 + + + 18 + + + 2 + + - 5 + + +

15 + + + 19 + + + 3 + + + 6 + - +

16 + - + 20 + + + 4 + + + 7 + + -

17 + + + 21 + + + 5 + + + 8 + + +

Продолжение приложения Д

18 + + + 22 + + + 6 + + + 9 + + +

19 - + + 23 + - + 7 + + + 10 + + +

20 + - + 24 + + + 8 + + + 11 + + +

21 + + + 25 + - + 9 + + + 12 + + +

22 + + + 26 + - + 10 + + + 13 + + +

23 + + + 27 + - + 11 + + + 14 - - +

24 + - + 28 + + + 12 + + + 15 + + -

25 + + + 29 + + + 13 + + + 16 + + +

26 + - + 30 + + + 14 + + + 17 + + +

27 + + + 31 + - + 15 + + + 18 - + +

28 + + + 32 + + + 16 + + + 19 + + +

29 + - + БКБю9хМп 1 + + + 17 + + + 20 + + +

30 + + + 2 + + + 18 + + + 21 + - +

31 + - + 3 + + + 19 + - + 22 + + +

32 + + - 4 + + + 20 + + + 23 + + +

33 + + + 5 + + + 21 + + - 24 + + +

34 + - + 6 + + + 22 + + + 25 + + +

35 + + + БККор1хАут 1 + - + 23 + + + 26 + + +

36 + + + 2 + + + 24 + + + 27 + + -

37 + - + 3 + + + 25 + + + 28 + + +

38 + - + БККор2(3) хАут3ки14 1 + + + 26 + + + 29 + - -

39 + - + 2 + + + 27 + + + 30 + + +

40 + + - 3 + + + 28 + + + 31 + + +

41 + + + МпхБКБю15 1 + + + 29 + + + 32 + + +

42 + + + БКБю15хЦв9 1 - - - 30 + + + 33 + + +

43 + + + 2 + + + 31 + + + 34 + + +

44 + - + 3 + + - 32 + + + БюБК4хЦв9 1 + + +

45 + - + Апт2хБКЗм6 1 + + + 33 + + + 2 - + +

46 + + + 2 + + + 34 + + - 3 + + +

47 + + + 3 + - + 35 + + + 4 - - +

48 + + + МпхБКБю18 1 + + + 36 + + + 5 - - +

49 + + + БПхБюБК1 1 + + + 37 + + + 6 - - +

50 + + + 2 + + + 38 + + - 7 - - +

Продолжение приложения Д

51 + - + 3 + + + 39 + + + 8 - + +

52 + + + 4 + + - 40 + + + БюБК4хМп 1 + -

53 + + + 5 + + - 41 + + - 2 + + +

54 - - + БюБК1хЦв9 1 + + + 42 + + - 3 + - +

55 + + + 2 + + + 43 + + + 4 - - +

56 + + + 3 + + + 44 + + + 5 - + -

57 + - + 4 + + + 45 + + + 6 + + +

58 + + + 5 + + + 46 + + + 7 - + +

59 + + + 6 + + + 47 + + + 8 - + +

60 + - + 7 + + - 48 + + + КБЭт6хЦв9 1 + + +

61 + + + 8 + + + ТенхБюБКб 1 + - - БКБю9хАут 1 + + -

БюБКбхМп 1 + + + 9 + + + 2 + + - 2 - + +

2 + + + 10 + + + 3 + + + 3 + + +

3 + + + 11 + + + 4 + + + 4 - + -

4 + + + 12 + + + 5 + + + БюБК 1 х Аут3ки(14) 1 + + +

5 + + + 13 + + + 6 + + + 2 + + +

6 + + + 14 + + + 7 + + + 3 + - +

7 + + + 15 + + + 8 + + + 4 + + +

8 + + + 16 + + + 9 + + + 5 + + +

9 + + + 17 + - + 10 + + + 6 + + +

10 + + + 18 + + + 11 + + + 7 + + +

11 + + + 19 + + + 12 + + + 8 + + +

12 + + + 20 + + + 13 + + + 9 + + +

13 + + + 21 + + + 14 + - + 10 + + +

14 + + + 22 + + + 15 + + + 11 + + +

15 + + + 23 + + + 16 + + + 12 + + +

16 + + + 24 + + + 17 + + + 13 + + +

17 + + + 25 + + + 18 + + + 14 + + -

18 + + + 26 + + + 19 + + - 15 + + -

19 + + + 27 + + + 20 + + + 16 + + +

ТенхБюБК1 1 + + + 28 + - + 21 + + + 17 + + +

2 + - + 29 + + + 22 + + + 18 + + +

3 + + + 30 + + + 23 + + + 19 + + +

Продолжение приложения Д

4 + + + 31 + + + 24 + + + 20 + + +

5 + + + 32 + + + 25 + + + 21 + + +

6 + + - 33 + + + 26 + + + 22 + + +

7 + + + 34 + + + 27 + + + 23 + + +

8 + + + 35 + - + 28 + + + 24 + + +

9 + + + 36 + + + 29 + + + 25 + + +

10 + + + 37 + - + 30 + + + 26 + + +

11 + + + БюБК1хТен 1 + + + 31 + + + 27 + + +

12 + - + 2 + + + 32 + + + 28 + + +

13 + + + 3 + + + 33 + + + 29 + + +

14 + - + 4 + + + 34 + + + 30 + + +

15 + + + 5 + + + 35 + + + 31 + + +

16 + + + 6 + + + 36 + + + 32 + + +

17 + + + 7 + + + 37 + + + 33 + + +

18 + + - 8 + + + 38 + + + 34 + + +

19 + + + 9 + + + 39 + - + 35 + + +

20 + + + 10 + + + БюБК1хМп 1 нд + нд 36 + + +

21 + + + 11 + + + 2 + + нд 37 + + +

22 + + + 12 + + + 3 + + нд 38 + + +

23 + + + 13 + + + 4 + + нд 39 + + +

24 + + + 14 + + + 5 + + нд 40 + + +

25 + + + 15 + + + 6 + нд 41 + - +