Интеграция современных биотехнологических и классических методов в селекции овощных культур тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 06.01.05, доктор наук Монахос Сократ Григорьевич

• Монахос Сократ Григорьевич
• доктор наук
• 2016

Оглавление диссертации доктор наук Монахос Сократ Григорьевич

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Цель и задачи исследования

Научная новизна

Теоретическая и практическая значимость

Методология и методы исследования

Положения, выносимые на защиту

Апробация результатов

Связь работы с научными проектами и программами

Публикация результатов исследований

Личный вклад соискателя

Структура и объем диссертации

Благодарность

ГЛАВА 1. КЛАССИЧЕСКОЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ НАСЛЕДОВАНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ КАПУСТЫ К КИЛЕ (ВОЗБУДИТЕЛЬ - PLASMODIOPHORA BRASSICAE WOR.)

ПОДГЛАВА 1.1. ОБЩЕЕ ВВЕДЕНИЕ

1.1.1. Вредоносность и распространение килы

1.1.2. Симптомы болезни

1.1.3. Биологическая характеристика P.brassicae

1.1.4. Жизненный цикл патогена

1.1.5. Защитная реакция растений

1.1.6. Взаимодействие растение-патоген, расовая дифференциация P.brassicae Wor

1.1.7. Генетика и селекция на устойчивость к киле капустных культур

1.1.7.1. Генетика и селекция на устойчивость к киле B.rapa

1.1.7.2. Генетика и селекция на устойчивость к киле B.oleracea

1.1.7.3. Генетика и селекция на устойчивость к киле B.napus

1.1.7.4. Генетика и селекция на устойчивость к киле Raphanus

ПОДГЛАВА 1.2. СЕЛЕКЦИОННАЯ ЦЕННОСТЬ ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ К КИЛЕ ЛИНИЙ BRASSICA RAPA L. И ЭФФЕКТИВНОСТЬ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ КАРТИРОВАННЫХ ЛОКУСОВ

1.2.1. Введение

1.2.2. Материалы и методы

1.2.2.1. Генетический анализ устойчивости

1.2.2.2. Оценка устойчивости к киле на инфекционном фоне

1.2.2.3. Молекулярный анализ

1.2.3. Результаты и обсуждение

1.2.3.1. Гибридологический анализ устойчивости к киле турнепса

1.2.3.2. Гибридологический анализ устойчивости к киле капусты пекинской

1.2.3.3. Эффективность маркеров картированных локусов устойчивости к киле на селекционных популяциях

1.2.4. Заключение

ПОДГЛАВА 1.3. МОЛЕКУЛЯРНОЕ МАРКИРОВАНИЕ И ГЕНЕТИЧЕСКОЕ КАРТИРОВАНИЕ НОВОГО ЛОКУСА УСТОЙЧИВОСТИ К КИЛЕ КАПУСТЫ ПЕКИНСКОЙ BRASSICA RAPA L

1.3.1. Введение

1.3.2. Материалы и методы

1.3.2.1. Растительный материал для генетических исследований

1.3.2.2. Выделение ДНК из растений

1.3.2.3. Условия полимеразной цепной реакции (ПЦР)

1.3.2.4. Клонирование, секвенирование и анализ продуктов амплификации ДНК

1.3.2.5. Создание молекулярного маркера гена устойчивости к киле

1.3.2.6. Генетическое картирование гена устойчивости к киле

1.3.2.7. Статистический анализ

1.3.3. Результаты и обсуждение

1.3.3.1. Поиск RAPD-маркера гена CrrA5 у капусты пекинской

1.3.3.2. Конвертация RAPD-маркера 394RAPD430 в SCAR-маркер

1.3.3.3. Картирование гена устойчивости

1.3.3.4. Скрининг коллекции образцов капусты пекинской

1.3.4. Заключение

1.4. Библиографический список

1.5. Приложения

ГЛАВА 2. СЕЛЕКЦИЯ КАПУСТЫ {BRASSICA OLERACEA L.) НА УСТОЙЧИВОСТЬ К КИЛЕ С ПРИМЕНЕНИЕМ ОТДАЛЕННОЙ

ГИБРИДИЗАЦИИ И IN VITRO ТЕХНОЛОГИИ СПАСЕНИЯ

ЗАРОДЫШЕЙ (EMBRYO RESCUE)

ПОДГЛАВА 2.1. ОБЩЕЕ ВВЕДЕНИЕ

2.1.1. Скрещиваемость видов Brassicaceae

2.1.2. Технологии спасения зародышей («embryo rescue»)

2.1.3. Соматическая гибридизация

2.1.4. Отдаленная гибридизация в исследованиях и селекции

2.1.4.1. Производство стабильных искусственно синтезированных амфидиплоидов

2.1.4.2. Моносомно-дополненные линии

2.1.4.3. Интродукция генов хозяйственно ценных признаков

ПОДГЛАВА 2.2. ПЕРЕДАЧА ГЕНА УСТОЙЧИВОСТИ К КИЛЕ ИЗ ЕВРОПЕЙСКОЙ КОРМОВОЙ РЕПЫ ЕСД04-1 (B.RAPA) В КАПУСТУ БЕЛОКОЧАННУЮ (B.OLERACEA)

2.2.1. Введение

2.2.2. Материалы и методы

2.2.2.1. Растительный материал

2.2.2.2. Посев и выращивание растений

2.2.2.3. Гибридизация

2.2.2.4. Оценка межвидового происхождения гибридов

2.2.2.5. Определение числа хромосом

2.2.2.6. Определение жизнеспособности пыльцы

2.2.2.7. Оценка устойчивости к киле

2.2.2.8. Получение гаплоидов и удвоенных гаплоидов

2.2.2.9. Молекулярное генотипирование

2.2.2.10. Статистический анализ

2.2.3. Результаты и обсуждение

2.2.3.1. Репо-брюквенный гибрид (B.rapa х B.napus, 2n = 29, AAC)

2.2.3.2. Рапс-репо-брюквенный гибрид ((B.napus) х (B.rapa х B.napus)) -РРБ

2.2.3.3. F1-гибридное потомство (РРБ х B.oleracea)

2.2.3.4. Беккроссные поколения BC1 - BC2

2.2.3.5. Беккроссное поколение BC3

2.2.3.6. Беккроссное поколение BC4

2.2.3.7. Беккроссное поколение BC5

2.2.4. Заключение

ПОДГЛАВА 2.3. ИНТРОДУКЦИЯ ДОМИНАНТНОЙ МОНОГЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ К КИЛЕ ИЗ R.SATIVUS L. В B.OLERACEA L

2.3.1. Введение

2.3.2. Материалы и методы

2.3.2.1. Растительный материал

2.3.2.2. Культура семяпочек и зародышей

2.3.2.3. Удвоение числа хромосом

2.3.3. Результаты и обсуждение

2.3.3.1. Схема передачи гена устойчивости к киле из дайкона в капусту белокочанную

2.3.3.2. Морфологические признаки и жизнеспособность пыльцы отдаленных гибридов

2.3.3.3. Удвоение числа хромосом

2.3.3.4. Первое беккроссное поколение, BC1

2.3.3.5. Второе беккроссное поколение, BC2

2.3.4. Заключение

2.4. Библиографический список

2.5. Приложения

ГЛАВА 3. ПРОВЕДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ И УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ СОЗДАНИЯ ЛИНИЙ -УДВОЕННЫХ ГАПЛОИДОВ BRASSICA В КУЛЬТУРЕ ИЗОЛИРОВАННЫХ МИКРОСПОР

ПОДГЛАВА 3.1. ОБЩЕЕ ВВЕДЕНИЕ

3.1.1. Технологии производства удвоенных гаплоидов Brassica

3.1.2. Генотипическая зависимость эмбриогенной способности микроспор

3.1.3. Генетика эмбриогенной отзывчивости растений Brassica

3.1.4. Гибридизация как способ управления отзывчивостью генотипов к культуре микроспор

3.1.5. Влияние условий роста донорного растения на эмбриогенную способность микроспор

3.1.6. Повышение эмбриогенной способности микроспор

3.1.7. Частота регенерации растений - удвоенных гаплоидов

3.1.8. Методы повышения частоты регенерации эмбриоидов

3.1.8.1. Оптимальная стадия развития эмбриоида

3.1.8.2. Модификация питательных сред

3.1.8.3. Снижение доступности влаги и питательных элементов

3.1.8.4. Стимулирующее воздействие на эмбриоиды

3.1.9. Частота диплоидизации

3.1.10. Укоренение и адаптация

ПОДГЛАВА 3.2. ОПТИМИЗАЦИЯ ЭЛЕМЕНТОВ ТЕХНОЛОГИИ КУЛЬТУРЫ ИЗОЛИРОВАННЫХ МИКРОСПОР BRASSICA: ПОВЫШЕНИЕ ЭМБРИОГЕННОЙ СПОСОБНОСТИ МИКРОСПОР ОВОЩНЫХ И МАСЛИЧНЫХ КУЛЬТУР B.RAPA

3.2.1. Введение

3.2.2. Материалы и методы

3.2.2.1. Растительный материал, условия роста и ухода

3.2.2.2. Изоляция и культивирование микроспор

3.2.2.3. Регенерация растений

3.2.2.4. Цитологический анализ

3.2.3. Результаты и обсуждение

3.2.3.1. Влияние генотипа донорного растения на формирование и выход эмбриоидов в культуре изолированных микроспор B.rapa ssp

3.2.3.2. Стадия развития микроспор и их эмбриогенная способность в зависимости от длины бутона

3.2.3.3. Влияние активированного угля на выход эмбриоидов в культуре изолированных микроспор

3.2.3.4. Влияние условий подготовки донорных растений на число микроспор и их эмбриогенную способность

3.2.4. Заключение

ПОДГЛАВА 3.3. ОПТИМИЗАЦИЯ ЭЛЕМЕНТОВ ТЕХНОЛОГИИ КУЛЬТУРЫ ИЗОЛИРОВАННЫХ МИКРОСПОР BRASSICA: ИЗУЧЕНИЕ И ПОВЫШЕНИЕ ЧАСТОТЫ ПРОРАЩИВАНИЯ/РЕГЕНЕРАЦИИ ЭМБРИОИДОВ B.RAPA

3.3.1. Введение

3.3.2. Материалы и методы

3.3.2.1. Растительный материал

3.3.2.2. Условия роста и ухода за растениями

3.3.2.3. Изоляция и культивирование микроспор

3.3.2.4. Регенерация растений

3.3.2.5. Статистический анализ

3.3.3. Результаты и обсуждение

3.3.3.1. Влияние температуры культивирования эмбриоидов in vitro на частоту регенерации

3.3.3.2. Влияние размера бутона на частоту регенерации при культивировании эмбриоидов in vitro

3.3.3.3. Влияние продолжительности культивирования эмбриоидов in vitro на частоту регенерации сеянцев

3.3.3.4. Влияние питательной среды на регенерационную способность эмбриоидов

3.3.3.5. Влияние плотности размещения эмбриоидов in vitro на регенерационную способность

3.3.3.6. Влияние генотипа донорного растения на регенерационную способность эмбриоидов

3.3.4. Заключение

ПОДГЛАВА 3.4. СВЯЗЬ УРОВНЯ ПЛОИДНОСТИ С ЧИСЛОМ ХЛОРОПЛАСТОВ ЗАМЫКАЮЩИХ КЛЕТОК УСТЬИЦ ДИПЛОИДНЫХ И АМФИДИПЛОИДНЫХ ВИДОВ BRASSICA

3.4.1. Введение

3.4.2. Материалы и методы

3.4.2.1. Растительный материал и условия его выращивания

3.4.2.2. Оценка влияния температуры на ЧХЗКУ

3.4.2.3. Оценка влияния возраста растения на ЧХЗКУ

3.4.2.4. Цитологический анализ - подсчет числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц

3.4.2.5. Цитологический анализ - подсчет числа хромосом

3.4.2.6. Статистический анализ данных

3.4.3. Результаты

3.4.3.1. Связь уровня плоидности с ЧХЗКУ у растений B.rapa и B.napus

3.4.3.2. Связь уровня плоидности с ЧХЗКУ у растений B.oleracea

3.4.3.3. Влияние температуры и возраста растения на ЧХЗКУ

3.4.4. Заключение

3.5. Библиографический список

ГЛАВА 4. ПРОВЕДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ И РАЗРАБОТКА СХЕМЫ СЕЛЕКЦИИ F1-ГИБРИДОВ КАПУСТНЫХ КУЛЬТУР (BRASSICA) НА ОСНОВЕ ТЕХНОЛОГИИ СОЗДАНИЯ ЛИНИЙ - УДВОЕННЫХ ГАПЛОИДОВ

4.1. Введение

4.2. Продолжительность и сроки подготовки донорных растений капусты пекинской и белокочанной для культуры изолированных микроспор в условиях открытого грунта и теплицы

4.2.1. Капуста пекинская (B.rapa ssp.pekinensis)

4.2.2. Капуста белокочанная (B.oleracea var. capitata)

4.3. Продолжительность технологии культуры изолированных микроспор капусты пекинской

4.4. Особенности роста и развития растений-регенерантов капусты пекинской при осенней высадке маточников донорных растений

4.5. Особенности роста и развития растений-регенерантов капусты пекинской при весеннем посеве донорных растений

4.6. Продолжительность технологии культуры изолированных микроспор капусты белокочанной

4.7. Особенности роста и развития растений-регенерантов капусты белокочанной при осенней высадке маточников

4.8. Схема селекции и семеноводства F1-гибридов капустных культур на основе технологии создания линий - удвоенных гаплоидов

4.8.1. I этап - изучение исходного материала, отбор донорных растений

4.8.2. II этап - производство линий - удвоенных гаплоидов в культуре изолированных микроспор

4.8.3. III этап - размножение ЛУГ, оценка проявления самонесовместимости, гибридизация в системе топ-кросс и/или диаллельных скрещиваний, испытание

4.8.4. IV этап - поддержание и размножение родительских линий, производство семян коммерческого F1-гибрида

4.9. Продолжительность селекционного процесса и последовательность технологических операций

4.9.1. Продолжительность селекционного процесса от посева исходного материала до реализации семян F1-гибрида для двулетней культуры капусты белокочанной на основе самонесовместимости

4.9.2. Продолжительность селекционного процесса от посева исходного материала до реализации семян F1-гибрида на двулетней культуре капусты белокочанной на основе цитоплазматической мужской стерильности

4.10. Результаты практической реализации схемы селекции F1-гибридов капустных культур на основе технологии создания линий - удвоенных гаплоидов

4.11. Описание F1-гибридов капусты пекинской и белокочанной

4.11.1. Капуста пекинская F1 Мохито

4.11.2. Капуста пекинская F1 Бирюза

4.11.3. Капуста пекинская F1 Маркет

4.11.4. Капуста белокочанная F1 Краут

4.12. Заключение

4.13. Библиографический список

ГЛАВА 5. ПРОВЕДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ И РАЗРАБОТКА СХЕМЫ СЕЛЕКЦИИ F1 -ГИБРИДОВ ЛУКА РЕПЧАТОГО (ALLIUM CEPA L.) НА ОСНОВЕ ТЕХНОЛОГИИ СОЗДАНИЯ ЛИНИЙ - УДВОЕННЫХ ГАПЛОИДОВ

5.1. Введение

5.1.1. Мужская стерильность

5.1.2. Гибридное семеноводство на основе мужской стерильности

5.1.3. Технология производства удвоенных гаплоидов лука (A.cepa L.) гиногинезом

5.2. Материалы и методы

5.2.1. Растительный материал

5.2.2. Подготовка донорных растений

5.2.3. Сбор и стерилизация цветковых бутонов

5.2.4. Условия культивирования in vitro

5.2.5. Удвоения числа хромосом эмбриоидов

5.2.6. Проращивание и адаптация

5.2.7. Статистический анализ

5.3. Результаты

5.3.1. Реакция генотипа и влияние условий культивирования цветковых бутонов лука на частоту эмбриогенеза

5.3.2. Продолжительность периода сбора бутонов

5.3.3. Период формирования эмбриоидов в культуре in vitro

5.3.4. Влияние образования каллуса на частоту эмбриогенеза

5.3.5. Влияние антимитотических агентов на жизнеспособность эмбриоидов лука

5.4. СХЕМА СЕЛЕКЦИИ И СЕМЕНОВОДСТВА F1-ГИБРИДОВ ЛУКА РЕПЧАТОГО (A.CEPA L.) НА ОСНОВЕ СОЗДАНИЯ ЛИНИЙ -УДВОЕННЫХ ГАПЛОИДОВ

5.4.1. Первый этап - оценка и отбор образцов из исходной коллекции

5.4.2. Второй этап - поиск и отбор генотипов - закрепителей стерильности

5.4.3. Третий этап - создание линий - удвоенных гаплоидов

5.4.4. Четвертый этап - оценка комбинационной способности ЛУГ

5.4.5. Пятый этап - создание изогенной пары

5.4.6. Шестой этап - оценка комбинационной способности и выделение перспективных гибридных комбинаций

5.4.7. Седьмой этап - организация промышленного семеноводства и производство семян коммерческого Fl-гибрида

5.5. Заключение

5.6. Библиографический список

5.7. Приложения

ГЛАВА 6. ПРОВЕДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ И РАЗРАБОТКА СХЕМЫ СЕЛЕКЦИИ Fl-ГИБРИДОВ МОРКОВИ СТОЛОВОЙ (DAUCUS CAROTA L.) НА ОСНОВЕ САМОНЕСОВМЕСТИМОСТИ С ИНТЕГРАЦИЕЙ МЕТОДОВ КУЛЬТУРЫ ТКАНЕЙ

6.1. Введение

6.1.1. Мужская стерильность

6.1.2. Самонесовместимость

6.1.3. Инбредная депрессия

6.1.4. Культура тканей в селекции моркови

6.1.5. Недостатки селекции и гибридного семеноводства моркови на основе ЯЦМС

6.2. Материалы и методы

6.2.1. Получение удвоенных гаплоидов в культуре пыльников моркови

6.2.2. Микроклональное размножение моркови

6.3. Результаты

6.3.1. Влияние температурной предобработки на эффективность эмбриогенеза в культуре пыльников моркови столовой (Daucus carota L.)

6.3.2. Изучение и оптимизация технологии микроклонального размножения in vitro самонесовместимых линий - удвоенных гаплоидов моркови

6.3.3. ГЕНЕТИКО-СЕЛЕКЦИОННАЯ СХЕМА СОЗДАНИЯ F1-ГИБРИДОВ МОРКОВИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ САМОНЕСОВМЕСТИМОСТИ НА ОСНОВЕ ИНТЕГРАЦИИ КЛАССИЧЕСКИХ И БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ СЕЛЕКЦИИ

6.4. Заключение

6.5. Библиографический список

ГЛАВА 7. ПОДХОДЫ ИНТЕГРИРОВАНИЯ И КОМБИНИРОВАНИЯ В ПОСТРОЕНИИ ГЕНЕТИЧЕСКИХ КАРТ НА ОСНОВЕ МОЛЕКУЛЯРНОГО ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ТРЕХ ПОПУЛЯЦИЙ ЛИНИЙ - УДВОЕННЫХ ГАПЛОИДОВ

7.1. Введение

7.2. Материалы и методы

7.2.1. Растительный материал

7.2.2. Молекулярные анализы

7.2.3. Построение генетической карты

7.3. Результаты и обсуждение

7.3.1. Анализ сцепления и построение генетических карт

7.3.2. Маркеры с отклоняющимся расщеплением

7.3.3. Пропущенные данные молекулярного генотипирования

7.4. Заключение

7.5. Библиографический список

7.6. Приложения

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Интеграция современных биотехнологических и классических методов в селекции овощных культур»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Исторически сложившееся неравноправное положение отечественных селекционеров по отношению к транснациональным селекционно-семеноводческим компаниям в области финансирования исследований, состояния материально-технической базы и доступности современного «инструментария» - современных методов биотехнологии, привели к устойчивой зависимости отечественных овощеводов от импорта семенного материала (до 80 %) и позволило иностранным компаниям занять доминирующее положение на рынке семян овощей.

Эффективность селекции и конкурентоспособность сорта или Б1-гибрида определяется комплексом признаков и свойств селекционного достижения, а также размером материальных и временных затрат при его создании. Своевременное удовлетворение Российских овощеводов семенами востребованных сортов и Б1-гибридов, а также успешное соперничество с зарубежными семенными компаниями в настоящее время возможно только при активном использовании в селекционном процессе наряду с традиционными методами современных биотехнологических методов селекции.

Результаты исследований отдельных российских биотехнологов ведущих НИИ и зарубежных коллег по вопросам создания линий - удвоенных гаплоидов - потенциальных родительских линий Б1-гибридов, интрогрессии целевых признаков отдаленной гибридизацией при проявлении постгамной несовместимости, клонального размножения ценных генотипов или чистых линий для целей семеноводства, а также ДНК-маркирования и картирования для использования в маркер-опосредованном отборе и др. позволяют использовать данные технологии, но только при условии их оптимизации или существенной модификации для конкретных генотипов и условий. Вместе с тем нет целостной теоретической основы и, главное, практического опыта отечественной селекции и семеноводства Б1-гибридов овощных культур на основе органичной интеграции в генетико-се-лекционных схемах методов биотехнологии и традиционной селекции.

Таким образом, для высокоэффективного использования доступных генетических ресурсов и реализации всего потенциала биотехнологических методов - увеличения эффективности селекционных программ, сокращения их продолжительности и стоимости, необходимо проведение исследований, направленных на усовершенствование/оптимизацию биотехнологий и их рациональную интеграцию в генетико-селекционные схемы создания конкурентоспособных F1-гибридов овощных культур.

Цель и задачи исследования

Цель работы - интеграция современных биотехнологических и классических методов в селекции овощных культур.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучение наследования устойчивости капусты к киле (возбудитель -Plasmodiophora brassicae Wor.) с использованием классических и молекулярно-генетических методов.

2. Проведение исследований и создание устойчивой к киле капусты (Brassica oleracea L.) с применением отдаленной гибридизации и in vitro технологии спасения зародышей (embryo rescue).

3. Проведение исследований и усовершенствование технологии создания линий - удвоенных гаплоидов Brassica в культуре изолированных микроспор.

4. Проведение исследований и разработка схемы селекции F1 -гибридов капустных культур (Brassica) на основе технологии создания линий - удвоенных гаплоидов.

5. Проведение исследований и разработка схемы селекции F1 -гибридов лука репчатого (Allium cepa L.) на основе технологии создания линий - удвоенных гаплоидов.

6. Проведение исследований и разработка схемы селекции F1 -гибридов моркови столовой (Daucus carota L.) на основе самонесовместимости с интеграцией методов культуры тканей.

7. Проведение исследований и сопоставление эффективности подходов интегрирования и комбинирования в построении генетических карт на основе молекулярного генотипирования трех популяций линий - удвоенных гаплоидов.

Научная новизна

Впервые с помощью разработанного SCAR-маркера tau_cBrCR404 у линии капусты пекинской 20-2сс1 идентифицирован новый высокоэффективный ген устойчивости к киле (возб. P.brassicae Wor.) CrrA5, локализованный в A05 группе сцепления B.rapa.

Впервые в мире посредством отдаленной гибридизации и получения «бридж-растения» (B.rapa х B.napus, 2n = 29, AAC), сочетающего пять доминантных независимо действующих генов устойчивости к киле из линий европейской кормовой репы ЕСД04-1 и брюквы Wilhelmsburger-1, передана высокая доминантная расоспецифическая устойчивость к киле в капусту белокочанную B.oleracea (2n = 18, СС).

Молекулярно-генетическим анализом с использованием SCAR-ДНК-маркера Tau_cBrCR404 гена устойчивости CrrA5 и RAPD-маркеров, амплифици-руемых праймерами 020 и Y13 (binders et al., 2010), показано, что переданный в капусту белокочанную ген устойчивости к киле из европейской кормовой репы ЕСД04-1 (B.rapa) отличается от гена устойчивости капусты белокочанной F1 Ки-латон, ранее переданного Syngenta Seeds B V. из капусты пекинской F1 Parkin (B.rapa).

Межродовой гибридизацией капусты белокочанной (B.oleracea, 2n = 18, CC) и донора гена устойчивости к киле, японской редьки (R.sativus, 2n = 18, RR), с применением культуры семяпочек/зародышей для преодоления постгамной несовместимости и удвоением числа хромосом стерильного межродового амфи-гаплоида (B.oleracea х R.sativus, CR) получены фертильные высокоустойчивые к киле капустно-редечные гибриды Brassicoraphanus (2n = 36, геном CCRR); бек-кроссирование гибридов Brassicoraphanus линиями капусты белокочанной (B.oleracea) позволило получить устойчивые к киле растения BC2-популяций с высоким морфологическим сходством с капустой белокочанной.

Анализом числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц (ЧХЗКУ) диплоидных инбредных линий капусты белокочанной (B.oleracea) впервые установлена зависимость ЧХЗКУ от скороспелости и показана тенденция к формированию большего ЧХЗКУ у раннеспелых линий B.oleracea и меньшего - у позднеспелых, при этом у скороспелых линий ЧХЗКУ в 1,7 раза больше, чем у позднеспелых, что сопоставимо с различиями между гаплоидными и удвоенногапло-идными растениями капусты пекинской или рапса.

Впервые в России показано, что культивирование цветковых бутонов in vitro при подготовке донорных растений в пленочной необогреваемой теплице НЧЗ позволяет индуцировать гиногенный эмбриогенез у широкого спектра генотипов лука репчатого (A.cepa) со средней частотой 10,01 шт./100 бут., при этом максимальные значения частоты эмбриогенеза могут достигать - 46,7 шт./100 бут.

В результате сравнительного анализа основных характеристик «Интегрированной» DH68 и «Комбинированной» DH68 генетических карт B.rapa - число картированных маркеров, плотность маркеров, длина межмаркерных участков, показана более высокая эффективность построения генетической карты с использованием программного пакета JoinMap 4 интеграцией независимых генетических карт по сравнению с методом построения генетической карты на основе первичного объединения данных молекулярного генотипирования исходных картирующих популяций линий - удвоенных гаплоидов.

Теоретическая и практическая значимость

Разработан тесно сцепленный (2,91 сМ) с геном устойчивости к киле CrrA5 SCAR-маркер tau_cBrCR404, эффективность которого показана на коллекции устойчивых и восприимчивых к киле линий и F1-гибридов капусты пекинской (34 образца), а также в маркер-опосредованном беккроссировании при передаче гена устойчивости из турнепса ЕСД04-1 (B.rapa) в капусту белокочанную (B.oleracea).

Создано растение капусты белокочанной B.oleracea (2n = 18, СС) с геном высокой доминантной расоспецифической устойчивости к киле (возб. P.brassi-cae Wor.) - основа для создания отечественных килоустойчивых коммерческих гибридов капусты всех разновидностей B.oleracea.

Оптимизирована технология создания линий - удвоенных гаплоидов в культуре изолированных микроспор, что позволяет получать у растений капусты пекинской максимальную частоту образования эмбриоидов около 12000 шт./100 бутонов и частоту регенерации эмбриоидов 68,8 %.

Создана генетическая коллекция линий - удвоенных гаплоидов капустных культур (Brassica), капусты пекинской (B.rapa ssp. pekinensis) - 192, капусты белокочанной (B.oleracea var. capitata) - 61, брокколи (B.oleracea var. italica) - 16, кольраби (B.oleracea var. gongylodes) - 29, озимого рапса (B.napus ssp. napus) - 53; линий - удвоенных гаплоидов лука репчатого (A.cepa) - 22; линий - удвоенных гаплоидов и удвоенных гаплоидов моркови столовой (D.carota) - 76.

Созданы и зарегистрированы первые отечественные F1-гибриды капусты пекинской (B.rapa ssp. pekinensis) на основе линий - удвоенных гаплоидов, F1 Бирюза (патент №26924), F1 Мохито (патент №26925) и F1 Маркет (патент №26925).

Впервые на основе интеграции классических и современных биотехнологических методов селекции разработаны генетико-селекционные схемы создания F1-гибридов овощных культур: капустных (Brassica) культур на основе самонесовместимости и цитоплазматической мужской стерильности с интегрированной технологией производства линий - удвоенных гаплоидов; лука репчатого (A.cepa) на основе ядерно-цитоплазматической мужской стерильности с использованием технологии производства линий - удвоенных гаплоидов и маркер-опосредованного отбора; моркови столовой (D.carota) на основе самонесовместимости с применение технологий производства удвоенных гаплоидов и микрокло-нального размножения самонесовместимых родительских линий in vitro.

На основе данных молекулярного генотипирования 212 линий-удвоенных гаплоидов двух картирующих популяций (DH68F1-1 и DH68F1-3) разработана

содержащая 502 маркера, локализованных на 10 группах сцепления общей длиной 1045 сМ, и средней плотностью 2,16 сМ/маркер «Интегрированная» DH68 генетическая карта B.rapa - основа для последующего точного генетического анализа, картирования локусов количественных признаков (QTL) и маркер-опосредованного отбора.

Методология и методы исследования

Работа выполнена в 2006 - 2015 гг. в ФГБОУ ВО РГАУ - МСХА имени К.А.Тимирязева. Посев, выращивание растений и гибридизацию проводили согласно общепринятым методикам. Наследование признаков определяли гибридологическим анализом. Межвидовое происхождение растений оценивали анализом комплекса фенотипических признаков. Удвоение хромосомного набора отдаленных гибридов проводили обработкой точек роста растений 0,01 % колхицином. Анализ устойчивости/восприимчивости растений к киле проводили на искусственном инфекционном фоне с применением модифицированного пипе-точного метода (Voorrips, Visser, 1993; Монахос, Монахос, 2009).

Молекулярные анализы. Выделение ДНК проводили согласно цетилтри-метиламмоний бромид (ЦТАБ) методике (Murray, Thompson, 1980) с незначительными модификациями, а также с использованием набора реактивов «DNAeasy kit» (Qiagen, USA) и прибора для автоматического выделения ДНК «KingFisher 96» (Thermo Electron, Finland) в соответствии с методиками производителей.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили по стандартному для каждого типа маркеров протоколу или в соответствии с рекомендациями авторов. Процедуру AFLP-маркирования осуществляли в соответствии с методикой (Vos et al., 1995).

Разделение продуктов амплификации проводили электрофорезом в агароз-ном или денатурирующем полиакриламидном геле. Анализ GT-маркеров проводили с использованием системы светового сканирования «Light Scanner Hi-Res Melting system» (Idaho Technology Inc., USA), а учет маркеров - с использованием прилагаемого к прибору программного пакета, Light Scanner Software.

Клонирование фрагментов ДНК проводили с использованием плазмиды pGEM-T Vector System I («Promega», США) согласно инструкции фирмы производителя; определение нуклеотидной последовательности клонированных фрагментов ДНК выполняли методом секвенирования. Анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программы BLAST на сервере NCBI (National Center for Biotechnology Information, США) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) и Brassica database (BRAD, Cheng et al., 2011).

Поиск ДНК-маркеров проводили методом массового сегрегационного анализа (BSA) (Michelmore et al., 1991). Пары праймеров разрабатывали с использованием программы Primer 3 (Rozen and Skaletsky, 2000; Untergasser et al., 2012). Анализ сцепления и построение генетических карт были проведены с использованием программного обеспечения JoinMap 4 (Stam, 1993; Van Ooijen, 2006) и MapDisto version 1.7 (Lorieux, 2006).

Цитологические анализы. Подсчет числа хромосом осуществляли в ми-тотических клетках корневых меристем или мейотических клетках пыльников молодых бутонов. Цитологические препараты готовили методом распластывания клеток (Пухальский и др., 2007) с небольшими модификациями. Жизнеспособность пыльцы определяли подсчетом числа окрашиваемых и неокрашивае-мых 1 % ацетокармином пыльцевых зерен. Стадию развития микроспор определяли микроскопированием препаратов при окрашивании ядер клеток микроспор ДНК-специфичным флуоресцентным красителем DAPI (Custers, 2003). Подсчет числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц листьев растений проводили согласно описанию (Savitsky, 1966) с незначительными модификациями.

Культура тканей. Создание гаплоидов и удвоенных гаплоидов капустных культур проводили в культуре изолированных микроспор по (Custers, 2003). Спасение гибридных зародышей межвидовых скрещиваний капустных растений проводили в соответствие с описанием (Harbert et al., 1969) с некоторыми модификациями. Создание удвоенных гаплоидов лука репчатого проводили в культуре изолированных цветковых бутонов по методике (Jakse and Bohanec, 2003) и по неопубликованной методике, используемой в компании Кора Сид, Италия

(Пагани, неопубл.). Создание удвоенных гаплоидов моркови столовой проводили в культуре изолированных пыльников на питательных средах, рекомендованных (Gorecka et al., 2009; Hu et al., 1993 и Тюкавин, 2010), микроклональное размножение моркови проводили в каллусной и суспензионной культурах.

Статистическую обработку данных и установление существенности различий вариантов опыта проводили, используя методы: критерий %2, t-крите-рий Стьюдента, однофакторный и двухфакторный дисперсионный анализ. Показатели, выраженные в процентах, преобразовывали с использованием функции arcsinVx.

Положения, выносимые на защиту

1. Новый ген устойчивости к киле (P. brassicae Wor.) CrrA5 вида B. rapa и тесно сцепленный с ним высокоспецифичный молекулярный маркер.

2. Селекционные программы по интрогрессии доминантных генов и создание растений капусты белокочанной (B.oleracea) с высокой расоспецифиче-ской устойчивостью к киле.

3. Интеграция современных биотехнологических и классических методов селекции в генетико-селекционных схемах ускоренного создания F1-гибридов овощных культур.

4. Подходы интегрирования и комбинирования при построении генетических карт.

Апробация результатов

Результаты исследований представлены на научных конференциях: Международная научно-практическая конференция «Агротехнологии XXI века» (Москва, 2007); 5th ISHS International Symposium on Brassicas and the 16th Crucifer Genetics Workshop (Lillehammer, Norway, 2008); Межд. науч. конф. мол. ученых и специалистов посвященная выдающимся педагогам Петровской академии, Москва, 2008); 17th Crucifer Genetics Workshop (Saskatoon, Canada, 2010); Международная научно-практическая конференция «Капустные овощные культуры. Актуальные вопросы селекции и семеноводства. Современные технологии выра-

щивания» (Краснодар, 2010); XI и XIII молодежная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2011, 2013); Научная конференции молодых ученных и специалистов, посвященная 125-летию со дня рождения академика Н.И. Вавилова (Москва, 2012); Научная конференция молодых ученых и специалистов, посвященная 170-летию со дня рождения К.А. Тимирязева (Москва, 2013); Международная научно-практическая конференция «Современные тенденции развития селекции и семеноводства капустных культур» (МО, ВНИИССОК, 2013); Международная научная конференция, посвященная 150-летию академика В.Р. Вильямса (Москва, 2013); Международная научно-практическая конференция «Селекция на адаптивность и создание нового генофонда в современном овощеводстве» (6 Квасниковские чтения) (МО, Верея, 2013); Международная научно-практическая конференция «Экологические проблемы современного овощеводства и качество овощной продукции» (МО, Верея, 2014); Международная научная конференция, посвященная 85-летию со дня образования ФГБНУ ВНИИО «Научные достижения и перспективы инновационного развития отрасли овощеводства» (МО, Верея, 2015).

Связь работы с научными проектами и программами

Грант (субсидии) Министерства сельского хозяйства РФ, 2014 г., тема «Создание конкурентоспособных сортов зерновых и овощных культур на основе использования современных методов биотехнологии для обеспечения импортоза-мещения на агропродовольственном рынке России» (доп. соглашение №1 от 21.04.2014 №2559/13 к соглашению №№ 3112/13 от 30.12.2013); Грант Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере, 2012 г., тема «Проведение исследований, разработка схемы селекции F1 гибридов капустных овощных культур и F1 гибридов капусты пекинской» совместно с ООО «Селекционная станция имени Н.Н.Тимофеева» (контракт №10220р/17334 от 28.04.2012); Проект IOP Genomics «Brassica vegetable nutrigenomics» (№ IGE050010) и Post Doctorate at Wageningen University в рамках программы Европейского Союза Erasmus Mundus Partnerships, 2010; Государственный заказ на выполнение НИОКР в сфере агропромышленного комплекса на 2008 - 2009 годы

МСХ РФ, 2008 - 2009 гг., тема «Проведение научных исследований и разработка технологии семеноводства F1 гибридов капусты устойчивых к основным заболеваниям» (контракт №1412\13 от 30.08.2008);

Публикация результатов исследований

По теме диссертации опубликовано 56 научных работ, в том числе 20 статей в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, 19 статей в сборниках докладов и тезисов, 1 монография, 4 методические рекомендации, 1 учебно-методическое пособие; получено 8 авторских свидетельств и 3 патента на Fl-гибриды капусты пекинской.

Личный вклад соискателя

Результаты экспериментальных и теоретических исследований получены автором лично и совместно с коллегами из РГАУ - МСХА имени К.А.Тимирязева (лаборатория генетики, селекции и биотехнологии овощных культур, кафедра селекции и семеноводства садовых культур, станция защиты растений), ООО «Селекционная станция имени Н.Н.Тимофеева», Университета Вагенин-гена, (Нидерланды), а также с аспирантами и студентами, работавшими под руководством диссертанта. Соискателю принадлежат разработка программы исследования, разработка схем и проведение основных экспериментов, теоретическое обобщение полученных результатов.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 335 страницах, состоит из введения, основной части, представленной 7 главами, и заключения и включает 39 таблиц, 70 рисунков, 19 приложений. Библиографический список включает 424 источника, в том числе 393 на иностранных языках.

Благодарность

Автор выражает глубокую признательность и благодарность генеральному директору ООО «Селекционная станция имени Н.Н.Тимофеева» к.с.-х.н. Г.Ф.Монахосу, руководителю Development and Quality Group Wageningen UR Plant Breeding Dr. G.Bonnema, а также коллегам д.б.н. А.Н.Игнатову, д.с.-х.н.

Ф.С.Джалилову, к.б.н. Р.А.Комахину, J.Bucher, PhD. N.Zhang, к.с.-х.н. В.Д.Богдановой, к.б.н. Е.М.Ветчинкиной, аспирантам Нгуен Минь Ли, А.В.Чистовой, А.В.Байдиной и всем, кто принимал участие в проведении экспериментов и обсуждении результатов.

Заключение диссертации по теме «Селекция и семеноводство», Монахос Сократ Григорьевич

1.3.4. Заключение

Таким образом, в данной работе мы разработали SCAR-маркер tau_cBrCR404 тесно сцепленный (2,91 сМ) с геном устойчивости к киле СггА5, и

с его помощью локализовали данный ген на хромосоме A05 B.rapa. Ни один из восьми ранее картированных локусов устойчивости B.rapa не имеет положения на 5-й хромосоме. Генетическая связь маркера и локуса устойчивости с анкерными InDel маркерами 5-й группы сцепления эталонной генетической карты B.rapa (Wang et al., 2011) в дополнении к высокой степени гомологии сиквенса маркера с локусом AENI01003844.1 хромосомы А05 полногеномного сиквенса капусты пекинской сорта Chiifu-401-42 (BRAD, Cheng et al.,2011) позволяет уверенно утверждать о выявлении нового ранее неизвестного локуса устойчивости к киле.

Впервые идентифицированный ген устойчивости к киле CrrA5, локализованный в группе сцепления A05, должен представлять особый интерес для молекулярных генетиков и селекционеров, ранее не использовавших его. Предстоит провести дополнительные анализы и исследования для установления сходства и различия этого гена по строению и функции с другими изученными генами устойчивости к киле B.rapa.

SCAR-маркер tau_cBrCR404 протестирован на коллекции инбредных линий и Fl-гибридов, показал свою эффективность и будет полезен в маркер-опосредованном отборе при создании новых килоустойчивых сортов капусты с использованием высокоэффективного доминантного гена CrrA5. Применение данного маркера с маркерами других генов устойчивости позволит объединить несколько генов в одном генотипе и создать гибриды капусты с высокой расоспе-цифической устойчивостью.

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Монахос Сократ Григорьевич, 2016 год

1.4. Библиографический список

1. Воронин, М. Plasmodiophora brassicae - организм, причиняющий капустным растениям болезнь, известную под названием "кила". - Тр. С.-Петербургского общества естествоиспытателей, VIII. - С.-Петербург: 1877, - С. 169-201.

2. Квасников, Б.В. Методика оценки сортов капусты на устойчивость к киле / Б.В. Квасников, Т.А. Белик. - М.: ВАСХНИЛ, 1970. - 16 с.

3. Кривченко, В.И. Характеристика генофонда капусты по устойчивости к Plasmodiophora brassicae / В.И. Кривченко, Г.В. Боос, М.Е. Сурмава // Труды

по прикладной ботанике, генетике и селекции. - 1982. - Т. 72.- Вып. 3.- С. 113 - 120.

4. Миронов, А.А. Создание мужски стерильных линий лобы (Raphanus sativus L. convar. lobo Sazon. et Stankev), оценка комбинационной способности устойчивых к киле линий: дис. ... канд. с-х. наук: 06.01.05 / Миронов Алексей Александрович. - М., 2007. - 140 с.

5. Монахос, Г.Ф. Капуста пекинская Brassica rapa L. Em. Metzg. ssp. pekinensis (Lour.) Hanelt. Биологические особенности, генетика, селекция и семеноводство / Г.Ф. Монахос, С.Г. Монахос. - М.: Изд-во РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, 2009. - 182 с.

6. Монахос, Г.Ф. Генетические источники устойчивости к киле крестоцветных (Plasmodiophora brassicae Wor.) при селекции пекинской капусты / Г.Ф. Монахос, Н.С. Теренина // Известия ТСХА. - 1998. - Вып. 3. - С. 87-93.

7. Монахос, Г.Ф. Наследование устойчивости к киле (Plasmodiophora brassicae Wor.) у линий листовой капусты (Brassica oleracea ssp. acephala) / Г.Ф. Монахос, А.А. Ушанов // Известия ТСХА. - 1998. - № 2. - С. 106-115.

8. Монахос, С.Г. Создание молекулярного маркера гена устойчивости к киле (Plasmodiophora brassicae Wor.) для селекции родительских линий капусты пекинской (Brassica rapa L.) / С.Г. Монахос, А.Н. Игнатов // Известия ТСХА.

- 2007. - C. 26-30.

9. Монахос, С.Г. Селекционная ценность генов устойчивости к киле линий Brassica rapa L. и эффективность молекулярных маркеров картированных ло-кусов / С.Г. Монахос, М.Л. Нгуен // Изв. ТСХА. - 2013. - Вып. 6. - С. 68-81.

10.Монахос, С.Г. Селекция капусты пекинской с использованием биотехнологических методов / С.Г. Монахос, М.Л. Нгуен // Картофель и овощи. - 2014.

- Вып. 9. - С. 34-35.

11.Монахос, Г.Ф. Наследование устойчивости к киле у линий дайкона / Г.Ф. Монахос, И.Н. Зубик //Докл. ТСХА. - 2000. - Вып. 272. - С. 85-88.

12.Aist, J.R. Plasmodiophora brassicae - the organism and life cycle: what we think we know, what we know, and what we need to find out / J.R.Aist // Woronin 100 International Conference on Clubroot. - Madison, 1977. - P. 11-15.

13.Aruga, D. Distribution of CRa in clubroot resistance (CR) cultivars of Chinese cabbage / D. Aruga, H. Ueno, H. Matsumura, E. Matsumoto, N. Hayashida // Plant Biotechnology. - 2013. - Vol.30. - P. 393-397.

14.Ashikawa, M. Studies on breeding of clubroot-resistance in cole crops. Screening of cole crops for clubroot resistance / M. Ashikawa, H. Yoshikawa, K. Hida // Bull. of the Veg. and Orn. Crop Res. St. - 1980. - P. 35-73.

15.Ayers, G.W. Genetics of resistance in rutabaga to races of Plasmodiophora brassicae / G.W. Ayers, K.E. Lelacheur // Can J Plant Sci. - 1972. - Vol. 52. - P. 897900.

16.Bradshaw, J.E. Transfer of resistance to clubroot (Plasmodiophora brassicae) to swedes (Brassica napus L. var. napobrassica Peterm) from B.rapa / J.E. Bradshaw, D.J. Gemmell, R.N. Wilson. //Ann. Appl. Biol. - 1997. - Vol.130. - P. 337-348.

17.Braselton, J.P. Karyotypic analysis of Plasmodiophora brassicae based on serial thin sections of pachytene nuclei / J.P. Braselton // Can J Bot. - 1981. - Vol.60. -P. 403-408.

18.Buczacki, S. Plasmodiophora - an interrelationship between biological and practical problems / S. Buczacki // Zoosporic plant pathogens - a modern perspective. -Academic Press London, 1983. - P. 161-191.

19.Buczacki, S. Study of physiologic specialization in Plasmodiophora brassicae: proposals for attempted rationalization through an international approach / S. Buczacki, H. Toxopeus, P. Mattusch et al. // Trans. Br. mycol. Soc., 1975. - P. 295303.

20.Cheng, F. BRAD, the genetics and genomics database for Brassica plants / F. Cheng, S. Liu, J. Wu et al. // BMC Plant Biol. -2011. - Vol. 11. - P. 136.

21.Chiang, M.S. Transfer of resistance to race 2 of Plasmodiophora brassicae from Brassica napus to cabbage (B. oleracea var. capitata). I. Interspecific hybridization

between B. napus and B. oleracea var. capitata / M.S. Chiang, B.Y. Chiang, W.F. Grant // Euphytica. - 1977. - Vol. 26. - P. 319-336.

22.Chiang, B.Y. Transfer of resistance to race 2 of Plasmodiophora brassicae from Brassica napus to cabbage (B. oleracea spp. capitata). IV. A resistant 18-chromo-some B1 plant and its B2 progenies / B.Y. Chiang, M.S. Chiang, W.F. Grant, R. Crête // Euphytica. - 1980. - Vol. 29. - P. 47-55.

23.Chiang, M. Inheritance of clubroot resistance in cabbage (B.oleracea var. capitata) / M. Chiang, R. Crete // Can. J. Genet. Cytol. - 1970. - P. 253-256.

24.Chiang, M. S. Transfer of resistance to race 2 of Plasmodiophora brassicae from Brassica napus to cabbage (B. oleracea spp. capitata). V. The inheritance of resistance / M. S. Chiang, R. Crête // Euphytica. - 1983. - Vol. 32.- P. 479-483.

25.Chiang, M.S. Diallel analysis of the inheritance of resistance to 6 of Plasmodiophora brassicae in cabbage / M.S. Chiang, R. Crête // Can J Plant Sci. - 1976. -Vol. 56. - P. 865-868.

26.Chiang, M.S. Richelain: a clubroot resistant cabbage cultivar / M.S. Chiang, R. Crête // Can J Plant Sci. - 1989. - Vol. 69. - P. 337-340.

27.Colhoun, J. Clubroot disease of crucifers caused by Plasmodiophora brassicae Woron. / J. Colhoun // A monograph. Phytopathol. Paper. - 1958. - Vol. 3. - P. 1109

28.Crête, R. Worldwide importance of clubroot / R. Crête // Clubroot News. - 1981. - Vol. l. - P. 6-7.

29.Crute, I.R. Variation in Plasmodiophora brassicae and resistance to clubroot disease in Brassicas and allied crops - a critical review / I.R. Crute, A.R. Gray, P. Crisp, S.T. Buczacki // Plant Breed. Abstr. - 1980. - Vol. 50. - P. 91-104.

30.Crute, I.R. The relationship between Plasmodiophora brassicae and its hosts: the application of concepts relating to variation in inter-organismal associations / Crute I.R. // Adv Plant Pathol 1986. - Vol. 5. - P. 1-52.

31.Crute, I.R. The relationship between genotypes of three Brassica species and collections of Plasmodiophora brassicae / I.R. Crute, K. Phelps, A. Barnes, S.T. Buczacki, P. Crisp // Plant Pathol. - 1983. - Vol. 32. - P. 405-420.

32.Dekhuijzen, H.M. Electron microscope studies on the root hairs and cortex of a susceptible and resistant variety of Brassica campestris infected with Plasmodiophora brassicae / H.M. Dekhuijzen // Neth. J. Pl. Path. - 1979. - Vol. 85. - Р. 117.

33.Dekhuijzen, H.M. The occurrence of free and bound cytokinins in plasmodia of Plasmodiophora brassicae isolated from tissue cultures of clubroots / H.M. Dekhuijzen // Pl. Cell Rep. - 1981. - Vol. 1. - Р. 18-20.

34.Diederichsen, E. Genetics of clubroot resistance in Brassica napus 'Mendel' / E. Diederichsen, J. Beckmann, J. Jorg Schondelmeier, F. Dreyer // Acta Hortic. -200б. - Vol. 70б. - Р. 307-311.

35.Diederichsen, E. Characterization of clubroot resistance in recent winter oilseed rape material / Diederichsen E., Deppe U., Sacristan M.D. // Proceedings of the 11th International Rapeseed Congress. - Copenhagen, Denmark, 2003. - Vol. 1. -Р. б8-70.

36.Diederichsen, E. Status and Perspectives of Clubroot Resistance Breeding in Cru-cifer Crops. / E. Diederichsen, M. Frauen, E.G.A. Linders, K. Hatakeyama, M. Hi-rai // J Plant Growth Regul. - 2009. - Vol. 28. - Р. 2б5-281.

37.Dixon, G.R. The Occurrence and Economic Impact of Plasmodiophora brassicae and Clubroot Disease / G.R. Dixon // J. Plant. Growth. Regul. - 2009. - Vol. 28. -Р. 194-202.

38.Dixon, G.R. The susceptibility of Brassica oleracea cultivars to clubroot / G.R. Dixon, D.L. Robinson // Plant Pathol. - 198б. - Vol. 35. - Р. 101-107

39.Donald, C. Integrated Control of Clubroot / C. Donald, I. Porter // J. Plant Growth. Regul. - 2009. - Vol. 28. - Р. 289-303.

40.Donald, E.C. Pathotypes of Plasmodiophora brassicae, the cause of clubroot, in Australia / E.C. Donald, S.J. Cross, J.M. Lawrence, I.J Porter // Ann Appl Biol. -200б. - Vol. 148. - P. 239-244.

41.Figdore, S.S. Association of RFLP markers with trait loci affecting clubroot resistance and morphological characters in Brassica oleracea L. / S.S. Figdore, M.E. Ferrerira, M.K. Slocum, P.H. Williams // Euphytica. - 1993. - Vol. б9. - P. 33-44.

42.Graf, H. Chromosome polymorphism of the obligate biotrophic parasite Plasmodi-ophora brassicae / H. Graf, M. Faehling, J. Siemens // J. Phytopathol. . - 2004. -Vol. 152(2). - P. 86-91.

43.Grandclement, C. Detection and analysis of QTLs based on RAPD makers for polygenic resistance to Plasmodiophora brassicae Woron in Brassica oleracea L. / C. Grandclement, G. Thomas // Theor Appl Genet. - 1996. - Vol. 93. - P. 86-90.

44.Gustafsson, M. Genetic studies on resistance to clubroot in Brassica napus / M. Gustafsson, A.S. Falt // Ann Appl Biol. - 1986. - Vol. 108. - P. 409-415.

45.Happstadius, I. Identification of Brassica oleracea germplasm with improved resistance to Verticillium wilt. / I. Happstadius, A. Ljungberg, B. Kristiansson, C. Dixelius // Plant Breed. - 2003. - Vol. 122. - P. 30-34.

46.Hatakeyama, K. Identification and Characterization of Crr1a, a Gene for Resistance to Clubroot Disease (Plasmodiophora brassicae Woronin) in Brassica rapa L. [Электронный ресурс] / K. Hatakeyama, K. Suwabe, R.N. Tomita et al. - PLoS ONE., 2013. - Режим доступа: http://joumals.plos.org/plosone/arti-cle?id=10.1371/journal.pone.0054745

47.Hayashida, N. Construction of a Practical SCAR Marker Linked to Clubroot Resistance in Chinese Cabbage, with Intensive Analysis of HC352b Genes / N. Hayashida, Y. Takabatake, N. Nakazawa // J. Japan. Soc. Hort. Sci. - 2008. - . -Vol. 77. - P. 150-154.

48.Hirai, M. Genetic analysis of clubroot resistance in Brassica rapa / M. Hirai // Breed Sci. - 2006. - Vol. 56. - P. 223-229.

49.Hirai, M. A novel locus for clubroot resistance in Brassica rapa and its linkage markers / M. Hirai, T. Harada, N. Kubo et al. // Theor. Appl. Genet. - 2004. - Vol. 108. - P. 639-643.

50.Hwang, S.F. Seedling age and inoculum density affect clubroot severity and seed yield in canola / S.F. Hwang, H.U. Ahmed, S.E. Strelkov, B.D. Gossen, G.D. Turnbull, G. Peng, R.J. Howard // Can. J. Plant Sci. - 2010. - Vol. 91. - P. 183-190.

51.Ikegami, H. Scanning electron microscopy of Plasmodiophora brassicae in diseased root cells of turnip and Chinese cabbage (Studies on the clubroot of cruciferous plants III) / H. Ikegami et al. // Ann. phytopathol. Soc. Japan. - 1978. - Vol. 44. - P. 456-464.

52.Ingram, D.S. The life history of the Plasmodiophora brassicae Woron. / D.S. Ingram, I.C. Tommerup //Proc. R. Soc. London. - 1972. - Vol. 180. - P. 103-112.

53.Jones, D.R. Factors affecting tests for differential pathogenicity in populations of Plasmodiophora brassicae / D.R. Jones, D.S. Igram, G.R. Dixon // Plant Pathol. -1982. - Vol. 31. - P. 229-238.

54.Kamei, A. QTL analysis of clubroot resistance in radish (Raphanus sativus L.) / A. Kamei, M. Tsuro, N. Kubo, M. Hirai // Proceedings of the 111th meeting of the Japanese Society of Breeding. Breed Res. - 2007. - Vol. 9. - P. 83.

55.Kato, T. Fine mapping of the clubroot resistance gene CRb and development of a useful selectable marker in Brassica rapa / T. Kato, K. Hatakeyama, N. Fukino, S. Matsumoto // Breeding Science. - 2013. - Vol. 63. - P. 116-124.

56.Kato, T. Identification of a clubroot resistance locus conferring resistance to a Plasmodiophora brassicae classified into pathotype group 3 in Chinese cabbage (Brassica rapa L.) / T. Kato, K. Hatakeyama, N. Fukino, S. Matsumoto // Breeding Science. - 2012. - Vol. 62. - P. 282-287.

57.Kikuchi, M. Conversion of RAPD markers for a clubroot resistance gene of Brassica rapa into sequence - tagged sites (STSs) / M. Kikuchi, H. Ajisaka, Y. Ku-ginuki, M. Hirai // Breeding Sci. - 1999. - №49. - P. 83-88.

58.Kobelt, P. Histological characterization of the incompatible interaction between Arabidopsis thaliana and the obligate biotrophic pathogen Plasmodiophora brassicae. / P. Kobelt, J. Siemens, M.D. Sacristan // Mycol Res. - 2000. - Vol. 104. - P. 220-225.

59.Kole, A.P. On the susceptibility of non-crucifers to the zoosporangial stage of Plasmodiophora brassicae / A.P. Kole, J.J. Philipsen // Tijdschrift over Plantenziekten. - 1956. - Vol. 62. - P. 167-170.

60.Kroll, T.K. A quantitative description of the colonization of susceptible and resistant radish plants by Plasmodiophora brassicae / T.K. Kroll, G.H. Lacy, L.D. Moore // Phytopathol Z. - 1983. - Vol. 108. - P. 97-105.

61.Kuginuki, Y. RAPD markers linked to a clubroot-resistance locus in Brassica rapa L. / Y. Kuginuki, H. Ajisaka, M. Yui et al. // Euphytica. - 1997. - Vol. 89. - P. 149-154.

62.Kuginuki, Y. Variation in virulence of Plasmodiophora brassicae in Japan tested with clubroot-resistant cultivars of Chinese cabbage (Brassica rapa L. ssp. pe-kinensis) / Y. Kuginuki, H. Yoshikawa, M. Hirai // European Journal of Plant Pathology. - 1999. - Vol. 105. - Р. 327-332.

63.Landry, B.S. A genetic map for Brassica oleracea based on RFLP markers detected with expressed DNA sequences and mapping of resistance genes to race 2 of Plasmodiophora brassicae (Woronin) / B.S. Landry, S.E. Lincoln, T. Etoh // Genome.

- 1992. - Vol. 35. - Р. 409-420.

64.Lorieux, M., A Tool for Easy Mapping of Genetic Markers [Электронный ресурс] / M. Lorieux // Poster (P886) presented at the Plant and Animal Genome XIV conference. - San Diego, 2006. - URL: http://mapdisto.free.fr/

65.Ludwig-Muller, J. Glucosinolate content in susceptible and tolerant Chinese cabbage varieties during the development of the clubroot disease / J. Ludwig-Muller et al. // Phytochemistry. - 1997. - Vol. 44. - Р. 407-414.

66.MacFarlane, I. Factors affecting the survival of Plasmodiophora brassicae Wor. in the soil and its assessment by a host test / I. MacFarlane //Ann. appl. Biol. - 1952.

- Vol. 39. - Р. 239-256.

67.Manzanares-Dauleux, M. J. Mapping of one major gene and of QTL involved in resistance to clubroot in Brassica napus / M.J. Manzanares-Dauleux, R. De-loureme, F. Baron, G. Thomas // Theor Appl Genet. - 2000. - Vol. 101. - Р. 885891.

68.Manzanares-Dauleux, M.J. Assessment of biological and molecular variability between field isolates of Plasmodiophora brassicae / M.J. Manzanares-Dauleux, I. Divaret, F. Baron, G.Thomas // Plant Pathol. - 2001. - Vol. 50(2). - Р. 165-173.

69.Matsumoto, E. Linkage analysis of RFLP markers for clubroot resistance and pigmentation in Chinese cabbage (Brassica rapa ssp. pekinensis) / E. Matsumoto, C. Yasui, M. Ohi, M. Tsukada // Euphytica. - 1998. - Vol. 104. - Is. 2. - P. 79-86.

70.Matsumoto, E. Behavior of DNA Markers linked to Clubroot Resistance Gene in Segregating Population of Chinese Cabbage (Brassica rapa ssp. pekinensis) / E. Matsumoto, N.Hayashida, M. Ohi // J. Japan. Soc. Hort. Sci. - 2005. - №74. - P. 367 - 373.

71.Michelmore, R.W. Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis: A rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations / R.W. Michelmore, I. Paran, R.V. Kes-seli // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1991. - Vol. 88. - P. 9828-9832.

72.Mithen, R. A contribution to the life history of Plasmodiophora brassicae: secondary plasmodia development in root galls of Arabidopsis thaliana / R. Mithen, R. Macrath // Mycol. Res. - 1992. - Vol. 96. - P. 877-885.

73.Moriguchi, K. A genetic map based on RAPD, RFLP, isozyme, morphological markers and QTL analysis for clubroot resistance in Brassica oleracea / K. Morigu-chi, C. Takagi, K. Ishii, K. Nomura // Breed Sci. - 1999. - Vol. 49. - P. 257-265.

74.Murray, M.G. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA / M.G. Murray, W. F. Thompson // Nucl. Acid. Res. - 1980. - Vol. 8. - P. 4321-4325.

75.Nikolaev, S.I. The twilight of Heliozoa and rise of Rhizaria, an emerging supergroup of amoeboid eukaryotes / S.I. Nikolaev, C. Berney, J.F. Fahrni et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2004. - Vol. 101. - P. 8066-8071.

76.Niwa, R. Complete sructure of nuclear rDNA of the obligate plant parasite Plas-modiophora brassicae: Intraspecific polymorphisms in the exon and group I intron of the large subunit rDNA / R. Niwa, A. Kawahara, H. Murakami et al. // Protist. -2011. - Vol. 162. - P. 423-434.

77.Nomura, K. Evaluation of F2 and F3 plants introgressed with QTLs for clubroot resistance in cabbage developed by using SCAR markers / K. Nomura, Y. Minegishi, C. Kimizuka-Takagi, T. Fujioka, K. Moriguchi, R. Shishido, H. Ike-hashi // Plant Breed. - 2005. - Vol. 124. - P. 371-375.

78.Osaki, K. Pathogenicity of Plasmodiophora brassicae populations from small, spheroid, resistant-type clubroot galls on roots of clubroot-resistant cultivars of Chinese cabbage (Brassica rapa L. subsp. pekinensis) / K. Osaki, S. Tanaka, S. Ito // J Gen Plant Pathol. - 2008. - Vol. 74. - P. 242-245.

79.Pageau, D. Impact de l'hernie des cruciferes [Plasmodiophora brassicae] sur la productivite et la qualite du canola / D. Pageau, J. Lajeunesse, J. Lafond // Can. J. Plant Pathol. - 2006. - Vol. 28. - P. 137-143.

80.Piao, Z. SCAR and CAPS mapping of CRb, a gene conferring resistance to Plasmodiophora brassicae in Chinese cabbage (Brassica rapa ssp. pekinensis) / Z. Piao, Y. Deng, S. Choi et al. // Theor. Appl. Genet. - 2004. - Vol. 108. - P. 14581465.

81.Piao, Z. Genetics of Clubroot Resistance in Brassica Species / Z. Piao, N. Ramchi-ary, Y.P. Lim // J Plant Growth Regul. - 2009. - Vol. 28. - P. 252-264.

82.Proudfoot, K. Breeding crucifers for clubroot resistance / K. Proudfoot // Proc. Can. Phytopath. Soc. - 1976. - Vol. 43. - P. 37-38.

83.Rocherieux, J. Isolate-specific and broad spectrum QTLs are involved in the control in Brassica oleracea / J. Rocherieux, P. Glory, A. Giboulot, S. Boury, G. Barbeyron, G. Thomas, M.J. Manzanares-Dauleux // Theor Appl Genet. - 2004. -Vol. 108. - P. 1555-1563.

84.Rowe, R.C. Evaluation of radish cultivars for resistance to clubroot (Plasmodiophora brassicae) race 6 for midwestern United States / R.C. Rowe // Plant Disease. - 1980. - Vol. 64. - P. 462-464.

85.Saito, M. Fine mapping of the clubroot resistance gene, Crr3, in Brassica rapa/M. Saito, N. Kubo, S. Matsumoto, K. Suwabe // Theor. Appl. Genet. - 2006. - №114 - P. 81-91.

86.Sakamoto, K. Mapping of Isolate-Specific QTLs for Clubroot Resistance in Chinese Cabbage (Brassica rapa L. ssp. pekinensis) / K. Sakamoto, A Saito., G. Taguchi et al. // Theor. Appl. Genet. - 2008. - №117. - P. 759-767.

87. Seaman, W. A new race of Plasmodiophora brassicae affecting "Badger Shipper" / W. Seaman, J. Walker, R. Larson // Phytopathology. - 1963. - Vol. 53. - P. 14261429.

88.Siemens, J. Molecular Biology of Plasmodiophora brassicae / J. Siemens, S. Bul-man, F. Rehn, T. Sundelin // J. Plant Growth. Regul. - 2009. - Vol. 28. - P. 245251.

89.Some, A. Variation for virulence on Brassica napus L. amongst Plasmodiophora brassicae collections from France and derived single-spore isolates / A. Some, M.J. Manzanares, F. Laurens, F. Baron, G. Thomas, F. Rouxel // Plant Pathol. - 1996. - Vol. 45. - P. 432-439.

90.Strelkov, S.E. Pathotype classification of Plasmodiophora brassicae and its occurrence in Brassica napus in Alberta, Canada / S.E. Strelkov, V.P. Manolii, T. Cao, S. Xueand, S.F. Hwang // J. Phytopathol. - 2007. - Vol. 155. - P. 706-712.

91.Suwabe, K. Identification of two loci for resistance to clubroot (Plasmodiophora brassicae Woronin) in Brassica rapa L / K. Suwabe, H. Tsukazaki, H. Iketani et al. // Theoretical Application Genetic. - 2003. - №107. - P. 997 - 1002.

92.Suwabe, K. Simple sequence repeat-based comparative genomics between Brassica rapa and Arabidopsis thaliana: the genetic origin of clubroot resistance / K. Suwabe, H. Tsukazaki, H. Iketani et al. // Genetics. - 2006. - №173. - P. 309-319.

93.Nagaoka, T. Identification of QTLs that control clubroot resistance in Brassica oleracea and comparative analysis of clubroot resistance genes between B. rapa and B. oleracea / T. Nagaoka, M.A.U. Doullah, S. Matsumoto, S. Kawasaki, T. Ishikawa, H. Hori, K. Okazaki // Theor Appl Genet. - 2010. - Vol. 120(7). - P. 1335-46

94.Kato, T. Matsumoto Identification of a clubroot resistance locus conferring resistance to a Plasmodiophora brassicae classified into pathotype group 3 in Chinese cabbage (Brassica rapa L.) / T. Kato, K. Hatakeyama, N. Fukino, S. Matsumoto // Breeding Science. - 2012. - Vol. 62. - P. 282-287.

95.Toxopeus, H. Clubroot control - the breeding and genetics of resistance / H. Tox-opeus // Woronin + 100 international conference on clubroot. - Madison, Wisconsin, 1978b. - P. 29-35.

96.Toxopeus, H. Outlines of breeding programs for clubroot resistance in Brassica crops / H. Toxopeus // Woronin + 100 international conference on clubroot. - Madison, Wisconsin, 1978a. - P. 124-126.

97.Toxopeus, H. Clubroot resistance in turnip, II. The "slurry" screening method and clubroot races in the Netherlands / H. Toxopeus, A. Janssen // Euphytica. - 1975. - Vol. 24. - P. 751-755.

98.Ueno, H. Molecular characterization of the CRa gene conferring clubroot resistance in Brassica rapa / H. Ueno, E. Matsumoto, D. Aruga, S. Kitagawa, H. Matsumura, N. Hayashida // Plant Mol Biol. - 2012. - Vol. 80. - P. 621-629.

99.Untergasser, A. Primer3 - new capabilities and interfaces / A. Untergasser, I. Cutcutache, T. Koressaar et al. // Nucleic Acids Res. - 2012. - Vol. 40(15). - P. 115.

100. Voorrips, R.E. Plasmodiophora brassicae: aspects of pathogenesis and resistance in Brassica oleracea / R.E. Voorrips // Euphytica. - 1995. - Vol. 83. - P. 139-146.

101. Voorrips, R.E. Examination of resistance to clubroot in accessions of Brassica oleracea using a glasshouse seeding test / R.E. Voorrips, D.L. Visser // Neth. J. Pl. Pathol. - 1993. - Vol. 99. - P. 269 - 276.

102. Voorrips, R.E. Production, characterization and interaction of single-spore isolates of Plasmodiophora brassicae / R.E. Voorrips // Eur J Plant Pathol. - 1996. -Vol. 102. - P. 377-383.

103. Voorrips, R.E. Mapping of two genes for resistance to clubroot (Plasmodiophora brassicae) in a population of doubled haploid lines of Brassica oleracea by means of RFLP and AFLP markers / R.E. Voorrips, M.C. Jongerious, H.J. Kanne // Theor Appl Genet. - 1997. - Vol. 94. - P. 75-82.

104. Wallenhammar, A.C. Prevalence of Plasmodiophora brassicae in a spring oilseed rape growing area in central Sweden and factors influencing soil infestation levels / A.C. Wallenhammar // Plant Pathol. - 1996. - Vol. 45. - P. 710-719.

105. Wang, Y. A sequence-based genetic linkage map as a reference for Brassica rapa pseudochromosome assembly / Y. Wang, S. Sun, B. Liu et al. // BMC Genomics. - 2011. - Vol. 12. - P. 239.

106. Webb, P.C.R. Zoospores, believed to be those of Plasmodiophora brassicae, in the root hairs of non-cruciferous plants / P.C.R. Webb // Nature. - 1949. - Vol. 163. - P. 608.

107. Werner, S. Genetic mapping of clubroot resistance genes in oilseed rape / S. Werner, E. Diederichsen, M. Frauen, J. Schondelmaier, C. Jung // Theor Appl Genet. - 2008. - Vol. 116. - P. 363-372.

108. Williams, P.H. A system for the determination of races of Plasmodiophora brassicae that infect cabbage and rutabaga / P.H. Williams // Phytopathology. - 1966. - Vol. 56. - P. 624 - 626.

109. Wit, F. Inheritance of reaction to clubroot in turnips / F. Wit // Hortic. Res. -1964. - Vol. 5. - P. 47-49.

110. Xue, S. Isolation and variation in virulence of single-spore isolates of Plasmodiophora brassicae from Canada / S. Xue, T. Cao, R.J. Howard, S.F. Hwang, S.E. Strelkov // Plant Dis. - 2008. - Vol. 92. - P. 456-462.

111. Yoshikawa, H. Breeding for clubroot resistance in Chinese cabbage / H. Yoshi-kawa // Chinese cabbage. Proceedings of the 1st international symposium / N.S. Talekar, T.D. Griggs. - Tsukuba, Japan, 1981. - P. 405-413.

112. Yoshikawa, H. Studies on breeding of clubroot resistance in cole crops / H. Yoshikawa // Bull Natl Res Inst Veg Ornam Plants Tea Jpn. - 1993. - Ser A 7. - P. 1165.