Совершенствование средств мониторинга блютанга на основе полимеразной цепной реакции тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 06.02.02, кандидат ветеринарных наук Гаврилова, Екатерина Анатольевна

• Гаврилова, Екатерина Анатольевна
• кандидат ветеринарных наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат ветеринарных наук Гаврилова, Екатерина Анатольевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 .Характеристика вируса блютанга.

1.1.1. Устойчивость к физико-химическим воздействиям.

1.1.2. Структурная организация генома и полипептидный состав вируса.

1.2. Антигенные свойства вируса блютанга.

1.3. Патогенез, тропизм, цикл репродукции вируса.

1.4. Клиническая картина блютанга.

1.4.1. Клинические признаки у КРС.

1.4.2. Клинические признаки у овец.

1.5. Эпизоотическая ситуация по блютангу в мире.

1.6. Эпизоотическая ситуация по блютангу в Европе.

1.7. Диагностика блютанга.

1.7.1. Применение ПНР в идентификации вируса блютанга.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Совершенствование средств мониторинга блютанга на основе полимеразной цепной реакции»

Актуальность

В 2006 г. в Западной Европе было зарегистрировано заболевание блютангом. В последующем установлено, что болезнь вызывается вирусом, относящимся к 8 серотипу. Актуальность блютанга для Российской Федерации значительно возросла с начала 2006 г., когда российскими внешнеторговыми организациями был начат импорт племенного крупного рогатого скота из стран Евросоюза, в том числе из неблагополучных по нему стран. Блютанг может быть занесен в Россию не только из стран Евросоюза, но и из стран Центрально-Азиатского и Дальневосточного регионов. Кроме того, на территории России есть все условия для «укоренения» заболевания. Прежде всего - это наличие различных видов мокрецов, потенциальных резервуаров и переносчиков вируса (С. йеюиЩ, С. оЪяоШш, С. риИсаггх и др), которые вызвали распространение болезни в странах Европы (Захаров В.М., 2007, 2009). В целом необходима строгая целенаправленная система, предусматривающая комплекс мер по недопущению заноса болезни, включающих раннюю диагностику, четкие схемы мониторинга и надзора, эффективные противоэпизоотические мероприятия. Согласно «Санитарному кодексу наземных животных МЭБ» основными методами диагностики блютанга при экспорте животных являются ИФА и ОТ-ПЦР. Одним из достоинств ПЦР-анализа является обнаружение вирусного генома у животных, начиная с первых дней заболевания, когда еще не сформировался иммунный ответ организма.

Таким образом, при ввозе животных из неблагополучных стран или зон, а таюке в ходе проведения противоэпизоотических мероприятий при вспышках блютанга необходимо проведение быстрых и эффективных лабораторных исследований, позволяющих в кратчайшие сроки выявить возбудитель.

Избирательная амплификация отдельных участков вирусного генома с помощью полимеразной цепной реакции, дополняя серологические методы, открывает новые возможности для разработки тест-систем для идентификации вируса блютанга. В 2003 г. Снетковым К.А. были разработаны наборы препаратов для выявления РНК вируса блютанга и ЭГБО методом ПЦР с электрофоретической детекцией результатов. В 2008 г. сотрудниками лаборатории Биофизики ГНУ ВНИИВВиМ был усовершенствован набор препаратов для выявления генома вируса блютанга методом ПЦР с электрофоретической детекцией.

Одним из перспективных направлений является использование метода ПЦР в режиме реального времени. Его принципиальной особенностью является количественная оценка динамики накопления продуктов полимеразной цепной реакции с автоматической регистрацией результатов. Он позволяет получать результат в 2-3 раза быстрее по сравнению с классической ПЦР с электрофоретической системой детекции; снижает риск контаминации, связанный с исключением 3-го этапа ПЦР (электрофореза); использование внутреннего контрольного образца (ВКО) позволяет проследить прохождение реакции в каждой пробе, что согласно новым рекомендациям МЭБ (OIE, 2008) является необходимым условием при создании тест-систем на основе ПЦР.

Цель и задачи исследований

Целью данной работы является совершенствование и разработка молекулярно-биологических средств мониторинга блютанга в пробах крови и патологического материала на основе полимеразной цепной реакции.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Подобрать специфические праймеры и олигонуклеотидные зонды для идентификации генома вируса блютанга.

2. Разработать тест-систему на основе метода ПЦР в режиме реального1 времени для идентификации генома вируса блютанга, содержащую внутренний контрольный образец (ВКО), при исследовании материала от инфицированных животных.

3. Провести сравнительное изучение чувствительности и специфичности разработанных тест-систем с использованием праймеров, комплементарных различным участкам генома вируса блютанга.

4. Провести мониторинговые исследования на наличие генома вируса блютанга в пробах крови, взятых от импортированных животных, с использованием разработанных тест-систем.

Научная новизна работы

Подобраны специфические олигонуклеотиды к различным сегментам генома вируса блютанга, использование которых в ПНР позволяет выявлять вирус в низкой концентрации.

Разработана «Тест-система» с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов реакции в режиме реального времени для выявления генома вируса блютанга с использованием внутреннего контрольного образца. Показана высокая чувствительность метода, которая составила 1,5 ^ ТЩЬо/см3. Модифицированная методика ОТ-ПЦР в режиме реального времени с предварительной амплификацией специфического участка кДНК позволила повысить чувствительность метода до 0,5 ^ ТЦД50/см3.

С помощью комплекса молекулярно-биологических методов (ОТ-ПЦР в режиме реального времени, нуклеотидного секвенирования и последующего филогенетического анализа 10-го сегмента генома) при исследовании животных, импортированных из стран ЕС, идентифицирован 8-ой серотип вируса блютанга.

Установлено, что геном вируса блютанга выявляется в пробах крови и патологического материала от инфицированных животных в течение 90 дней у овец и 173 дней у КРС (период наблюдения), начиная с 3 дня после заражения.

Практическая значимость

Разработанная «Тест-система для выявления генома вируса блютанга (ВБ) методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени» утверждена Россельхознадзором (ПВР-1-5.0/02618 от 30.08.2010г.) и внедрена в практику для выявления РНК вируса блютанга в пробах крови, патологического материала и в инфицированных культурах клеток.

Для использования ветеринарнойшрактикой разработаны «Методические рекомендации по выявлению генома вируса блютанга (ВБ) методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени», утверждены директором ГНУ ВНИИВВйМ Россельхозакадемии (28; 1212009 г.), а также рассмотрены и одобрены на секции «Инфекционной патологии» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (30.09.2010г.).

Публикации результатов исследований По теме диссертации опубликовано: 5 научных статей, в том числе 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ. '

Апробация работы Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ГНУ ВНИИВВйМ (2008-2010 гг.).

Материалы» диссертации доложены на конференции молодых ученых. ГНУ ВНИИВВйМ Россельхозакадемии «Актуальные проблемы инфекционной, патологии ветеринарной медицины» (г. Покров, 2009 г.), Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», посвященной! 40-летию ВНИТИБП (г. Щелково, 2009г.).

Основные положения, выносимые иа защиту:

1. Получена«. тест-система на основе ОТ-ПЦР в режиме реального времени, содержащая внутренний контрольный образец; для идентификации генома вируса блютанга в пробах крови и патологического материала от инфицированных животных.

2: Установлена; чувствительность и специфичностьусовершенствованных и разработанных тест-систем с использованием праймеров, гомологичных различным; сегментам генома вируса блютанга.

3. Получены данные мониторинговых исследований распространения блютанга на территории РФ с использованием разработанных тест-систем на основе ОТ-ПЦР.

Структура и объем диссертационной работы

Диссертация изложена на 145 страницах, включая приложение. Иллюстрирована 26 таблицами и 28 рисунками. Список литературы включает 135 источников, в том числе 99 зарубежных авторов.

Личный вклад автора в выполнении работы

Основной объем исследований проведен автором самостоятельно. Консультативную и методическую помощь при выполнении отдельных этапов работы оказывали следующие сотрудники института: к.б.н. Малоголовкин A.C. (освоение молекулярно-биологических методов, клонирование рекомбинантной плазмиды). Часть работы по выделению вируса выполнена совместно с аспирантом лаборатории Диагностики Вялых И.В. и сотрудником Отдела биологического и технологического контроля (ОБТК) Бобровской Н.К.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов», Гаврилова, Екатерина Анатольевна

5. ВЫВОДЫ

1. На основе анализа банка нуклеотидных последовательностей подобраны уникальные праймеры, комплементарные участку 5 сегмента генома вируса блютанга, а также дополнительный специфический праймер, комплементарный участку 10 сегмента генома. Отработаны оптимальные условия постановки «полугнездовой» ОТ-ПЦР, позволяющей выявлять геном вируса блютанга в пробах крови и патологического материала.

2. Разработанная тест-система на основе ОТ-ПЦР в режиме реального времени, содержащая внутренний контрольный образец, позволяет выявлять наличие генома вируса блютанга с аналитической чувствительностью 1,5 lg

3 3

ТЦД50/см (675 копии кДНК/см ) в пробах крови больных животных, начиная с 3 суток после заражения.

3. Модифицированная методика ОТ-ПЦР в режиме реального времени с предварительной амплификацией специфического участка кДНК, л обеспечивает увеличение пороговой чувствительности до 0,5 lg ТЦД50/см .

4. Установлено, что геном вируса блютанга персистирует в организме экспериментально зараженных животных в течение 173 (КРС) и 90 (MPC) суток после заражения (период наблюдения) с пиком виремии, приходящимся на 7-9 сутки после заражения.

5. Установлено различными вариантами ОТ-ПЦР наличие генома вируса блютанга в пробах крови КРС, импортированных из Голландии, Германии, Швейцарии и Австрии. За период 2008-2009гг выявлено 100 положительных из 85390 проб крови.

6. По результатам филогенетического анализа изолят ФКл/4-09 (Суворовский), выделенный в ГНУ ВНИИВВиМ, имеет высокую степень гомологии (98%) с группой европейских и южно-африканских изолятов, формирующих один генетический кластер 8-го серотипа вируса блютанга.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработана и утверждена Россельхознадзором (ПВР-1-5.0/02618 от 30.08.2010г.) тест-система на основе ОТ-ПЦР в режиме реального времени, позволяющая в короткие сроки выявлять геном вируса блютанга в пробах крови и патологического материала при проведении мониторинговых исследований.

На основании проведенных исследований разработаны, утверждены и рекомендованы для практического использования в диагностических лабораториях Российской Федерации, а также научно-исследовательских учреждениях:

1. «Методические рекомендации по выявлению генома вируса блютанга (ВБ) методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени» утверждены директором ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (28.12.2009г.). Рассмотрены и одобрены на секции «Инфекционной патологии» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (30.09.2010г.).

Список литературы диссертационного исследования кандидат ветеринарных наук Гаврилова, Екатерина Анатольевна, 2010 год

1. Анализ риска заноса блютанга (катаральной лихорадки овец) со скотом, импортируемым в Россию из стран Западной Европы/ А.К. Караулов,

2. B.М. Гуленкин, М.А. Титов, В.М. Захаров, Н.С. Дудникова, CA. Дудников// Российский ветеринарный журнал СХЖ. — 2008. — Спец.выпуск сентябрь.1. C.33-35.

3. Блютанг скрытая угроза/ Д.В. Кол басов, A.A. Коломыцев, К. А. Снетков, A.B. Книзе, С.А. Коломыцев// Ветеринарная жизнь. - 2006. - №17. -С.6.

4. Блутанг (катаральная лихорадка овец)// Российский ветеринарный журнал СХЖ. 2008. - Спец. выпуск. - сентябрь. - С.49-50.

5. Вирусные болезни животных/ В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев, Н.В. Фомина.- М.: ВНИТИБП, 1998.- 928с.

6. Вспышка катаральной лихорадки овец в Бурятии/ В.П. Левченко, Г.А. Угрюмов, В.Г. Гончиков, Б.Б. Цыдыпов, А.К. Пуев, М.Г. Штыбова, Д.А. Петухов// Ветеринария. 1995. - №4. - С.7-8.

7. Захаров, В.М. Комплексность мер по предотвращению заноса и распространения блютанга в Российской Федерации/ В.М. Захаров// Ветеринария. 2009. - №5. - С.3-5.

8. Идентификация и типирование вируса катаральной лихорадки овец/ И.Ф. Вишняков, A.A. Стрижаков, М.Б.Новикова, А.В.Луницин, В.В. Куриннов, Г.М. Карпов, В.И. Балышева, К.С. Волокитина// Ветеринария. -1995. -№4.-С.20-25.

9. Луницин, A.B. Блютанг продвигается на восток эффективные методы его предотвращения/ A.B. Луницин// Ветеринарная жизнь. - 2008. -№21. - С.З.

10. Метод ингибирования ИФА для серологического мониторинга блютанга/ A.A. Стрижаков, М.Б. Новикова, В.В. Куриннов, A.B. Луницин// Ветеринария. 2003. - №12. - С.23-25.

11. Митрофанов, П.М. Патологоанатомическая диагностика малоизвестных инфекционных болезней сельскохозяйственных животных. -Саранск, 1997.- 105с.

12. Сборник статей Международной научно-практической конференции/ ГНУ ВНИИВВиМ.- Покров, 2000. С. 143-146.

13. Новикова, М.Б. Непрямой вариант ТФ ИФА для выявления антител, специфичных к вирусу KJIO/ М.Б. Новикова, И.Ф. Вишняков, Б.В. Новиков// Институт экспериментальной ветеринарной медицины: информ. бюл. 1994. — Харьков, 1995.-С.55.

14. Особо опасные болезни животных. Справочник/ И.А. Бакулов, В.М. Котляров, A.C. Донченко, И.Ю. Хухоров, С.Ф. Терновая, A.B. Книзе.- Покров-Новосибирск, 2002. С.99-109.

15. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)/ H.A. Федоров, Ю.С. Суханов, А.Х. Асади Мобархан, М.И. Артемьев,- М., 1996.- С.36.

16. ПЦР «в реальном времени»/ Д.В. Ребриков, Г.А. Саматов, Д.Ю. Трофимов, П.А. Семенов, A.M. Савилова, И.А. Кофиади, Д.Д. Абрамов.-М.: Бином. Лаборатория знаний, 2009.- 223с.

17. Распространение блютанга в Европе и его реальная угроза для животноводства России/ В.М. Захаров, В.М. Гуленкин, А.К. Караулов, С.А.Дудников// Российский ветеринарный журнал. 2007. - №4. - С.4-6.

18. Система эпизоотологического мониторинга особо опасных экзотических, малоизученных, в том числе зооантропонозных болезней животных/ И.А. Бакулов, A.B. Книзе, В.М. Котляров, И.В. Дмитренко, A.A. Коломыцев, A.JI. Семенихин. М., 2001. - 76с.

19. Снетков, К.А. Идентификация возбудителей блютанга и эпизоотической геморрагической болезни оленей с помощью ПЦР: Дис.канд. биол. наук 03.00.06/ Константин Александрович Снетков -Покров, 2003.-116с.

20. Спрыгин, А.В. Разработка методов диагностики микоплазмозов кур и изучение изолятов Mycoplasma gallisepticum, выявленных на территории Российской Федерации: Дис.канд. биол. наук 03.00.23/ Александр Владимирович Спрыгин Щелково, 2009. - 144с.

21. Стрижаков, А.А. Получение и использование моноклональных антител к вирусу KJIO: автореф. дис. канд. биол. наук 03.00.06/ Всерос. НИИ вет. вирусологии и микробиологии. Покров, 1994 - 25с.

22. Стрижаков, А.А. Создание средств эпитопного анализа структурных и неструктурных полипептидов вируса блютанга/ А.А. Стрижаков// Вестник РАСХН. 2003. - №3. - С.63-66.

23. Сюрин, В.Н. Частная ветеринарная вирусология/ В.Н. Сюрин, Н.Ф. Фомина,-М.: Колос, 1979.- С. 174-181.

24. Сюрин, В.Н. Диагностика вирусных болезней животных. Справочник/ В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Н.В. Фомина.- М.: ВО Агропромиздат, 1991.- С.254-270.

25. Сэндвич-метод твердофазного иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител для обнаружения антигенов вируса блютанга/

26. A. А. Стрижаков, М.Б. Новикова, В.В. Куринов, А.В. Луницин// Сельскохозяйственная биология. 2003. - №4. — С. 114-120.

27. Тимина, A.M. Разработка ПЦР в реальном времени для выявления и количественной оценки Mycoplasma hyopneumoniae/ A.M. Тимина, М.В. Челышева, А.В. Щербаков// Российский ветеринарный журнал СХЖ. 2008. -Спец.выпуск .— сентябрь. - С.53-55.

28. Шоопала, Д. Особенности проявления инфекционной катаральной лихорадки овец в Намибии/ Д. Шоопала// Ветеринария. 2005. - №12. - С.22-23.

29. Шуляк, Б.Ф. Блутанг новая угроза животноводству России?/ Б.Ф. Шуляк // Российский ветеринарный журнал. - 2007. - №1. - С.2-3.

30. Эпизоотология и меры борьбы с блютангом/ А.А. Стрижаков, Н.И. Закутский, А.А. Коломыцев, А.В. Книзе// Ветеринария. 2008. - №8. - С. 1822.

31. Эпизоотологический лексикон: учебное пособие для с.-х. вузов/

32. B.В. Макаров, А.А. Гусев, Е.В. Гусева, О.И. Сухарев. М.: Колосс, 2001. -176с.

33. A comparison of different orbivirus proteins that could affect virulence and pathogenesis/ H. Huismans, V. Van Staden, W.C. Fick, M. van Niekerk, T.L. Meiring //Vet. Ital. 2004. - Vol.40, N4. - P.417-425.

34. A possible overwintering mechanism for bluetongue virus in the absence of the insect vector/ H. Takamatsu, P.S. Mellor, P.C. Mertens, P.A. Kirkham, J.N. Burroughs, M.E. Parkhouse// J. Gen. Virol. 2003. -Vol.84, N1. - P.227-235.

35. Abu Elzein, E.M.E. Bluetongue in Sudan/ E.M.E. Abu Elzein// Rev. sci. tech. OffintEpiz. 1985. - Vol.4, N4. -P.795-801.

36. Alexander, G.I. Bluetongue research in Australia —1993/ G.I. Alexander, G. Gpgard // Australian Veterinary Journal.- 1994.- Vol.71, N6.-P.182-183.

37. Bandyopadhyay, S.K. Detection of bluetongue vims genome segment 6 sequences by RT-PCR/ S.K. Bandyopadhyay, R.S. Kataria, A.K. Tiwari// Indian J. of Experimental Biology. 1998. - Vol.36.- P. 1034-1037.

38. Barrat-Boyes, S.M. Pathogenesis of bluetongue virus infection of cattle/ S.M. Barrat-Boyes, N.J. MacLachlan// J. Am. Vet. Med. Assoc. 1995. -N206. -P.1322-1329.

39. Bexiga, R. Differential diagnosis of bluetongue 8/ R. Bexiga, H. Guyot, G. Saegerman // Bluetongue in northern Europe. 2008.- P.57-68.

40. Bluetongue in Northern Europe/ E. Thiry, C. Saegerman, H. Guyot, M. Bodmer et al.// Vet.Rec.- 2006.- P. 159,327.

41. Bluetongue virus detection by two real-time RT-qPCRs targeting two different genomic segments/ J.F. Toussaint, C. Sailleau, E. Breard, S. Zientara, K. De Clercq //J. of Virological Methods. 2007. -N140. - P.l 15-123.

42. Bluetongue virus isolations from midges belonging to the Obsoletus complex (Culicoides, Diptera: Ceratopogonidae) in Italy/ G. Savini, M. Goffredo, F. Monaco, A. Di Gennaro, M.A. Cafiero et al.//Vet. Rec. 2005. - N157. - P. 133139.

43. Bluetongue virus isolations from vectors and ruminants in Central America and the Caribbean/ C.L. Mo, L.Ii. Thompson, E.J. Homan et al.// Am. J. Vet. Res. 1994. - Vol.55, N2. - P.211-215.

44. Bluetongue virus replication, molecular and structural biology/P.P.C. Mertens, J. Diprose, S. Maan, K.P. Singh, H. Attoui and A.R. Samuel// Vet. Ital. -2004. Vol.40, N4. - P.426-437.

45. Bluetongue Virus Structural Components/ H. Huismans, A.A. Van Dijk// Current Topics in Microbiology and Immunology.- 1990.- Vol.162.- P.21-41.

46. Bluetongue virus surveillance in a newly infected area/ A.Giovannini, P.Calistri, A. Conte, L. Savini, D. Nannini, C. Patta, U. Santucci and V. Caporale //Vet. Ital. 2004. - Vol.40, N3. - P.188-197.

47. Bluetongue virus: European Community inter-laboratory comparison tests to evaluate ELISA and RT-PCR detection methods/C.A. Batten, K. Bachanek-Bankowska, A. Bin-Tarif, L. Kgosana, A.J. Swain et al//Vet. Microbiol. 2007. -nov. — P. 17.

48. Bluetongue: Laboratory diagnosis/ K. De Clercq, F. Vandenbussche, V T. anbinst, E. Vandemeulebroucke, N. Goris, S. ZientaraII Bluetongue in northern Europe. 2008,- P.68-80.

49. Brewer, A.W. The pathogenesis of bluetongue virus infection of bovine blood cells in vitro: ultrastructural characterization/ A.W. Brewer, N.J. MacLachlan// Arch. Virol. 1994. - Vol.136, N3-4. - P.287-298.

50. Brightwell, G. Development of internal controls for PCR detection of Bacillus anthracis/ G. Brightwell, M. Pearce, D. Leslie// Mol. Cell. Probes. 1998. - Vol.12. -P.367-377.

51. Campbell, C.H. Current Knowledge on the Biochemistry and Immunology of Bluetongue/ C.H. Campbell, J. Marvin and Grubman// Prog. Vet. Microbiol. Immun.- 1985.- Vol.1.- P. 58-79.

52. Climate change and the recent emergence of bluetongue in Europe/ B.V. Purse, P.S. Mellor, D.J. Rogers, A.R. Samuel, P.P. Mertens and M. Baylis// Nat. Rev. Microbiol. 2005.- Vol.3, N2. -P.171-181.

53. Clinical aspects of bluetongue in ruminants/ H. Guyot, A. Mauroy, N. Kirschvink, F. Rollin, C. Seagerman// Bluetongue in northern Europe. 2008.-P.34-53.

54. Comparison of genome segments 2, 7 and 10 of bluetongue viruses serotype 2 for differentiation between field isolates and the vaccine strain/ E. Breard, C. Sailleau, H. Coupier, K. Mure-Ravaud, S. Hammoumi et al.//Vet Rec.2003. Vol.34, N6. - P.777-789.

55. Detection of bluetongue virus in clinical samples by polymerase chain reaction/ G.Y. Akita, J. Glenn, A.E. Castro, B.I. Osburn// Journal-of-Veterinary-Diagnostic-Investigation.- 1993.- Vol.5, N2.- P.154-158.

56. Detection of bluetongue virus serogroup by polymerase chain reaction/ G.Y. Akita, J. Chinsangaram, B.I. Osburn, M. Ianconescu, R. Kaufman //Journal-of-Veterinary-Diagnostic-Investigation.- 1992.- Vol.4, N4.- P.400-405.

57. Differential diagnosis of bluetongue virus using a reverse transcriptase-polymerase chain reaction for genome segment 7/ S. Anthony, S. Maan, A.R. Samuel, P.S. Mellor, P.P.C. Mertens// Vet. Ital. 2004. - Vol.40, N4. - P.546-551.

58. Differentiation between field and vaccine strain of bluetongue virus serotype 16/ F. Monaco, C. Camma, S. Serini and G. Savini // Vet. Microbiol. — 2006.-N116.-P.45-52.

59. Differentiation of Italian field and South African vaccine strains of bluetongue virus serotype 2 using real-time PCR/ G. Orru, P.D. Santis, E. Solinas, G. Savini, V. Piras and V. Caporale // J. Virol. Methods. 2004. - N122. - P.37-43.

60. Distribution of bluetongue in the United States of America, 1991-2002/ E.N. Ostlund, K.M. Moser, D.J. Johnson, J.E. Pearson, B.J. Schmitt // Vet. Ital.2004. Vol.40,N3. - P.83-88.

61. Eaton, B.T. Developing new orbivirus diagnostic platforms/ B.T. Eaton and G.R. White // Vet. Ital. 2004. - Vol.40, N.4 - P.525-530.

62. Emergence of bluetongue in the Mediterranean Basin and Entomological surveillance in France/ T. Baldet et al.// Rev. clevage Med. Veter. Pays. Trop. 2005. - Vol.58, N3. - P.125-132.

63. Epidemiological surveillance of bluetongue in Sicily/ S. Caracappa, M. Bagnato, P. Sghembry, A. Guercio et al.// Vet. Ital. 2004. - Vol.40, N3. - P. 124130.

64. First occurrence of Culicoides obsoletus-transmitted Bluetongue virus epidemic in Central Europe/ H. Mehlhom, V. Walldorf, S. Klimpel, B. Hahn, F. Jaeger, J. Eschweiler, B. Hoffmann and M. Beer// Parasitol. Res. 2007. - Vol.101, N1. -P.219-228.

65. Fukusho, A. Variation in the bluetongue virus neutralization protein VP2/ A. Fukusho, G.D. Ritter, P. Roy// J. Gen. Virol.- 1987,- Vol.68.- P. 29672973.

66. Genetic Characterization of Toggenburg Orbivirus, a new Bluetongue virus, from goats, Switzerland/ M.A. Hofmann, S. Renzullo, M. Mader, V. Chaignat et al.// Emerging Infectious Diseases.- 2008.- Vol.14, N13. P.1855-1861.

67. Gomez-Tejedor, C. Brief overview of bluetongue situation in Mediterranean Europe, 1998-2004/ C. Gomez-Tejedor// Vet. Ital. 2004. - Vol.40, N3. - P.57-60.

68. Gorman, B.M. The bluetongue viruses/ B.M. Gorman //Current topics in Microbiology and Immunology. 1990. - Vol.162 - P. 1-19.

69. Gould, A.R. Relationships amongst bluetongue viruses revealed by comparisons of capsid and outer coat protein nucleotide sequences/ A.R. Gould and L.I. Pritchard //Finis Res. 1990. -N17. -P.31-52.

70. Grubman, M.J. Identification of bluetongue virus type 17 genome segments coding for polypeptides associated with virus neutralization andintergroup reactivity/ M.J. Grubman, J.A. Appleton, C.J. Letchworth // Virology.-1983.- Vol.131.-P.355-366.

71. Hamblin, C. Bluetongue virus antigen and antibody detection, and the application of laboratory diagnostic techniques/ C. Hamblin// Vet. Ital. 2004. -N40. - P.538-545.

72. Huismans, H. Control of transcription during the expression of the bluetongue virus genome/ H. Huismans, D.W. Verwoerd // Virology.- 1973.- Vol. 52,- P.81-88.

73. Hwang, G.Y. Analyses and conservation of sequences among the cognate L3 segments of the five United States bluetongue viruses/ G.Y. Hwang, M. Xiang, J.K.K. Li// Virus-Research.- 1994.- Vol.32, N3.- P.381-389.

74. Identification and characterization of conserved and variable regions in the neutralization VP2 gene of bluetongue virus/ H. Ghiasi, A. Fukusho, Y. Eshita and P. Roy//Virology. 1987.-N160.-P. 100-109.

75. Identification of a novel bluetongue virus vector species of Culicoides in Sicily/ S. Caracappa, A. Torina, A. Guercio, R. Vitale, A. Calabro, G. Purpari et al// Vet. Rec.- 2003.- Vol.153, N3. -P.71-74.

76. Isolation of bluetongue virus serotype 12 from an outbreak of the disease in South America/ A. Clavilo et al.// Vet. Rec. 2002. - Vol.151, N10. -P.301-302.

77. Johnson, D.J. Validation of a reverse transcriptase multiplex PCR test for the serotype determination of U.S. isolates of bluetongue virus/ D.J. Johnson, W.C. Wilson, P.S. Paul //Vet. Microbiology. -2000. -N76. -P.105-115.

78. Kirkland, P.D. Bluetongue viruses, vectors and surveillance in Australia the current situation and unique feature/ P.D. Kirkland// Vet. Ital. - 2004. - Vol.40, N3. - P.47-50.

79. La fievre catarrhale ovine (bluetongue): quand une maladie du sud s"invite au nord/E. Albina, S. Zientara, C. Sailleau, A. Perrin, C. Cetre-Sossah, E. Breard, C. Grillet //Virology. 2007. -Nil.- P.63-74.

80. Lager, I.A. Bluetongue virus in South America: overview of viruses, vectors, surveillance and unique features/ I.A. Lager // Vet. Ital. 2004. - Vol.40, N3. - P.89-93.

81. Lecatsas, G. Electron microscopic study of the formation of bluetongue viruses/ G. Lecatsas // Onderstepoort J. Vet. Res.- 1968.- Vol. 35.- P.139-149.

82. MacLachlan, N.J. Bluetongue and equine viral arteritis viruses as models of virus-induced fetal injury and abortion/ N.J. MacLachlan, A.J. Conley and P.C. Kennedy// Anim. Repwd. Sci. 2000.- N.60-61. - P.643-651.

83. MacLachlan, N.J. Bluetongue: pathogenesis and duration of viremia/ N.J. MacLachlan //Vet. Ital. 2004. - Vol.40, N4. - P.462-467.

84. MacLachlan, N.L. The pathogenesis and immunology of bluetongue virus infection of ruminants/ N.L. MacLachlan //Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 1994. -N17. -P.197-206.

85. McColl, K.A. Bluetongue virus infection in sheep: haematological changes and detection by polymerase chain reaction/ K.A. McColl and A.R. Gould// Aust. Vet. J. 1994. - N71. - P.97-101.

86. Meiswinkel, R. Potential new culicoides vector in northern Europe/ R. Meiswinkel, P. van Rijn, P. Leijs// Vet. Rec. 2007. -N161. - P. 564-565.

87. Mellor, P.S. Bluetongue virus in the Mediterranean basin 1998-2001/ P.S. Mellor and E. Wittmann //Vet. J. 2002. - Vol.164. - P.20-37.

88. Mellor, P.S. Infection1 of the vectors and bluetongue epidemiology in Europe/ P.S. Mellor // Vet. Ital. 2004. - Vol.40, N3. - P. 167-174.

89. Mellor, P.S. The Replication of Bluetongue Virus in Culicoides Vectors/ P.S Mellor// Current Topics in Microbiology and Immunology.- 1990.- Vol. 162.-P.143-161.

90. Mellor, P.S. The transmission and geographical spread of African horse sickness and bluetongue viruses/ P.S. Mellor and J. Boorman //Ann. Trop. Med. Parasitol.- 1995. Vol.89-P. 1-15.

91. Melville, L.F. Bluetongue surveillance methods in an endemic area: Australia/ L.F. Melville// Vet. Ital. 2004. - Vol.40, N3. - P. 184-187.

92. Mertens, P.P. Assignment of the genome segments of bluetongue virus type 1 to the proteins which they encode/ P.P. Mertens, F. Brown and D.V. Sangar// Virology. 1984. -N135. -P.207-217.

93. Murray, M.D. The seasonal abundance offemal biting-midges, Culicoides brevitarsis (Diptera, Ceratopogonidae), in coastal south-eastern Australia/ M.D. Murray // Aust. J. loot. 1991.- N39. - P.333-342.

94. Nomikov, K. Overview of bluetongue in Greece/ K. Nomikov, O. Mangana-Vougiouka and D.H. Panagiotatos //Vet. Ital. 2004. - Vol.40, N3. -P.108-116.

95. OIE quality Standard and Guidelines for Veterinary Laboratories: infectious diseasis. OIE, Paris, 2008.

96. Osburn, B.I. Bluetongue virus/ B.I. Osburn //Veterinary-Clinics-of-North-America-Food-Animal-Practice. 1994. - Vol.10, N3. -P.547-550.

97. Polymerase chain reaction and non radio labeled DNA probe for detection of BTV/ Y. Malik, G. Prasad, Minakshi and S. Maan// Indian J. of Animal Sciences. 2001.- Vol.71, N5. - P.405-409.

98. Ramadevi, N. Bluetongue virus core protein VP4 has nucleoside triphosphate phosphohydrolase activity/ N. Ramadevi, P. Roy// J. Gen. Virol. -1998. Vol.79, N10. - P.2475-2480.

99. Rapid and simple method for purification of nucleic acids/ R. Boom, S.J.A. Sol, M.M.M. Salimans, C.L. Jansen, P.M.E. Wertheim-van Dillen and J. van der Noordaa// J. of Clinical Microbiology. 1990. - Vol.28, N3. -P.495-503.

100. Rapid detection and quantitation of bluetongue virus (BTV) using a Molecular Beacon fluorescent probe assay/ G. Orru, M.L. Ferrando, M. Meloni, M. Liciardi, G. Savini, P. De Santis // Journal of Virological Methods. 2006. - N137. - P.34-42.

101. Regional overview of bluetongue viruses in South-East Asia: viruses,vectors and surveillance/ P.W. Daniels, I.Sendow, L.I. Pritchard, Sukarsih and B.T. Eaton // Vet. Ital. 2004. - Vol.40, N3. - P.94-100.

102. Results of current surveillance of likely bluetongue virus vectors of the genus Culicoides in Catalonia, Spain/ V. Sarto i Monteys, C. Aranda, R. Escosa, N. Pages and D. Ventura// Vet. Ital. 2004. - Vol.40, N3. - P. 130-133.

103. Rossmann, M.G. Courageous science: structural of bluetongue virus core/ M.G. Rossmann and Y. Tao// Structure.- 1999.- Vol.7.- N3.- P.43-46.

104. Roy, P. Bluetongue virus genetic and genome structure/P. Roy// Virus Research.- 1989.- Vol.13, N3,- P.179-206.

105. Roy, P. Bluetongue virus proteins/ P. Roy// Gen. Virol. 1992. - N73. -P.3051-3064.

106. Roy, P. Structure of the bluetongue virus genome and its encoded proteins/ P. Roy, J.J. Marshall, T.J. French // Curr. ToP. Microbiol. Immunol. -1990. -N162. -P.43-87.

107. Seagerman, C. Bluetongue: Epidemiology in the European Union/ C. Seagerman, D. Berkvens, Ph. Mellor // Bluetongue in northern Europe. 2008. -P. 13-24.

108. Segment 10 based molecular epidemiology of bluetongue virus (BTV) isolates from Turkey: 1999-2001/ A. Ozkul, A. Erturk, E. Caliskau, F. Sarae, C. Ceylan et al.// Virus Rec. 2009. - Vol.142, N1-2. - P. 134-139.

109. Sequence analysis of the S10 gene of six Bluetongue virus isolates from India/ G.S. Desai, M. Hosamane, R.S. Kataria, S.S. Patil, K. Prabhudas et al.// Trasbound Emerg Dis. 2009. - Vol.56, N8. - P.329-336.

110. Serogrouping of United States and some African serotypes of bluetongue virus using RT-PCR/ I.E. Aradaib, M.E. Mohamed, T.M. Abdalla, J. Sarr, M.A. Abdalla et al.// Vet. Microbiol. 2005. - N111(3-4). - P.145-150.

111. Singer, R.S. Maximal predicted duration of viremia in bluetongue virus-infected cattle/ R.S. Singer, N.J. MacLachlan, T.E. Carpenter// J. Vet. Diagn. Invest. 2001. -N13. -P.43-49.

112. Tabachnick, W.J. Culicoides and the global epidemiology of bluetongue virus infection/ W.J. Tabachnick// Vet. Ital. 2004. - Vol.40, N3. - P.145-150.

113. Taylor, W.P. The epidemiology of Bluetongue/ W.P. Taylor// Rev. sci. tech. Off int. Epiz. 1986. - Vol.5, N2. -P.351-356.

114. The atomic structure of the bluetongue virus core/ J.M. Grimes, J.N. Burroughst, P. Gouet, J.P. Diprose, P. Malby, S. Zientara, P.P.C. Mertens; D.I. Stuart//Nature.- 1998.- Vol.395, N1.- P.138-146.

115. The current situation of bluetongue in Turkey/ A. Erturk, N. Tatar, O. Kabakli, S. Incoglu, S.G. Cizmeci and F.M. Barut //Vet. Ital. 2004. - Vol.40, N3. -P.137-140.

116. The epizootiological occurrence of bluetongue in the central Balkans/ B. Djuricic, D. Nedic, D. Lausevic and M. Pavlovic // Vet. Ital. 2004. - Vol.40, N3. -P.105-107.

117. The membrane trafficking protein calpactin forms a complex with bluetongue virus protein NS3 and mediates virus release/A.R. Beaton, J. Rodriguez, Y.K. Reddy, P. Roy// Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A. 2002.- Sep. 16.

118. Thiry, E. Bluetongue: virology, pathogenesis and biology of the culicoides vector/ E. Thiry, J.Y. Zimmer, E. Haubruge // Bluetongue in northern Europe 2008. - P.3-13.

119. Verwoerd, D.W. Characterization of Bluetongue Virus Ribonucleic Acid/ D.W. Verwoerd, H. Louw, and R.A. Oellermann // Journal of Virology.-1970,- Vol.5, N1.- P.1-7.

120. Verwoerd, D.W. Purification and characterization of bluetongue virus/ D.W. Verwoerd// Virology. 1969. -N38. -P.203-212.

121. Wade-Evans, A.M. Development of the polymerase chain reaction for the detection of bluetongue virus in tissue samples/ A.M. Wade-Evans, P.P. Mertens and C.J. Bostock //J. Virol. Methods 1990. -N30. - P. 15-24.

122. Ward, M.P. The epidemiology of bluetongue virus in Australia a review/ M.P. Ward // Austr. Vet. J. - 1994. - Vol.71, N1. - P.3-7.

123. Wilson, W.C. Nested and multiplex polymerase chain reactions for the identification of bluetongue virus infection in the biting midge, Culicoides variipennis/ W.C. Wilson and C.C. Chase// J. Virol. Methods 1993. - N45. - P.39-47.

124. Wittmann, E. J. Effect of temperature on the transmission of orbiviruses by the biting midge, Culicoides sonorensis/ E. J. Wittmann, P. S. Mello, M. Baylis// Med. Vet. EntomoL- 2002.- N2.- P. 147-156.

125. Yongue, A.D. Bluetongue in western Turkey/ A.D. Yongue, W.P. Taylor// Vet. Rec. 1982. - Vol.111, N7. - P. 144-146.