Генотипирование серотипов вируса блютанга тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.02, кандидат биологических наук Панферова, Агнеса Владимировна

• Панферова, Агнеса Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Панферова, Агнеса Владимировна

СОДЕРЖАНИЕ Стр.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Молекулярно-эпизоотологические исследования вируса блю- 13 танга

1.2 Вариабельные и консервативные сегменты генома вируса блю- 16 танга

1.3 Особенности генов, кодирующих белки внешнего слоя капсида 17 вируса блютанга

1.4 Особенности генов, кодирующих белки кора вируса блютанга

1.5 Особенности генов, кодирующих неструктурные белки вируса 27 блютанга

1.6 Эпизоотологический анализ распространения блютанга в 28 Европе

1.6.1 Молекулярно-эпизоотологический анализ распространения 30 вируса блютанга первого серотипа

1.6.2 Молекулярно-эпизоотологический анализ распространения 32 вируса блютанга второго серотипа

1.6.3 Молекулярно-эпизоотологический анализ распространения 33 вируса блютанга четвертого серотипа

1.6.4 Молекулярно-эпизоотологический анализ распространения 35 вируса блютанга шестого серотипа

1.6.5 Молекулярно-эпизоотологический анализ распространения 36 вируса блютанга восьмого серотипа

1.6.5.1 Анализ одиночной нуклеотидной замены (полиморфизма) БЫР 38 анализ

1.6.6 Молекулярно-эпизоотологический анализ распространения 39 вируса блютанга девятого серотипа

1.6.7 Молекулярно-эпизоотологический анализ распространения 41 вируса блютанга шестнадцатого серотипа

1.7 Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей 43 генов, кодирующих неструктурные белки вируса блютанга и определение реассортаций

1.8 Распространение блютанга на территории Российской Федера- 44 ции

1.9 Выводы и обсуждения по обзору литературы

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы

2.1.1 Вирусы

2.1.2 Пробы крови, искусственно контаминированной ВБ и от экс-

периментально зараженных животных

2.1.3 Животные

2.1.4 Культуры клеток

2.1.5 Плазмида и бактериальные штаммы

2.1.6 Реактивы

2.1.7 Лабораторное оборудование

2.2 Методы

2.2.1 Выделение и очистка нуклеиновых кислот

2.2.2 Проведение ОТ-ПЦР с детекцией продуктов амлификации

методом электрофореза

2.2.3 Анализ ПЦР-продуктов

2.2.4 ОТ-ПЦР с детекцией продуктов амлификации в режиме реаль-

ного времени

2.2.5. Нуклеотидное секвенирование

2.2.6 Молекулярное клонирование продуктов ПНР

2.2.7 Программное обеспечение и интернет-ресурсы

2.2.8 Филогенетический анализ

2.2.9 Оценка аналитической чувствительности и специфичности

2.2.10 Оценка линейности и эффективности амплификации

2.2.11 Оценка воспроизводимости реакций

2.2.12 Постановка ИФА

2.2.13 Статистическая обработка результатов исследований

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Разработка ОТ-ПЦР для идентификации вируса блютанга 1,2, 64 4, 6, 8, 9, 11 и 16 серотипов

3.2 Разработка мультиплексных вариантов серотип-специфичес- 69 ких ОТ-ПЦР с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени для идентификации вируса блютанга 1 и 8,

4 и 16 серотипов

3.2.1 Разработка рекомбинантных положительных контролей для 82 мультиплексных вариантов ОТ-ПЦР РВ для идентификации вируса блютанга 1 и 8, 4 и 16 серотипов

3.2.2 Оценка разработанных мультиплексных вариантов ОТ-ПЦР 84 РВ при исследовании клинического материала от экспериментально зараженных вирусом блютанга животных

3.3 Филогенетический анализ изолятов вируса блютанга 8 серо- 88 типа, выделенных от импортированного в РФ крупного рогатого скота

3.3.1 Молекулярно-генетический анализ участка 2 сегмента генома 90 изолятов вируса блютанга, выделенных от импортированного крупного рогатого скота

3.3.2 Молекулярно-генетический анализ участка 7 сегмента генома 92 изолятов вируса блютанга, выделенных от импортированного крупного рогатого скота

3.3.3 Молекулярно-генетический анализ участка 10 сегмента генома 94 изолятов вируса блютанга, выделенных от импортированного крупного рогатого скота

3.4 Филогенетический анализ вируса блютанга 16 серотипа штам- 96 ма Тапхар

3.4.1 Молекулярно-генетический анализ участка 2 сегмента генома 98 вируса блютанга штамма Тапхар

3.4.2 Молекулярно-генетический анализ участка 3 сегмента генома 100 вируса блютанга штамма Тапхар

3.4.3 Молекулярно-генетический анализ участка 5 сегмента генома 103 вируса блютанга штамма Тапхар

3.4.4 Молекулярно-генетический анализ участка 6 сегмента генома 105 вируса блютанга штамма Тапхар

3.4.5 Молекулярно-генетический анализ участка 7 сегмента генома 107 вируса блютанга штамма Тапхар

3.4.6 Молекулярно-генетический анализ участка 10 сегмента генома 109 вируса блютанга штамма Тапхар

4 ВЫВОДЫ

5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

6 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

7 ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

A4JI - африканская чума лошадей ВБ - вирус блютанга

ВНК - культура клеток почки золотистого хомячка дцРНК - двухцепочечная рибонуклеиновая кислота dNTP - дезоксинуклеотид трифосфаты ед/мкл - единиц в микролитре ИФА - иммуноферментный анализ

кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота

КРС - крупный рогатый скот

MPC - мелкий рогатый скот

МЭБ - международное эпизоотологическое бюро

н.п. - нуклеотидная последовательность

нт - нуклеотид

об/мин - обороты в минуту

ОТ - обратная транскрипция

ОТ-ПЦР - обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция ОТ-ПЦР PB - обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция с детекцией результатов амплификации в режиме реального времени ПК - положительный контроль ПС - культура клеток почки сайги

ПСГК - культура клеток почки сибирского горного козерога

п.о. - пар оснований

РНК - рибонуклеиновая кислота

ТЦД - тканевая цитопатическая доза

ЭГБО - эпизоотическая геморрагическая болезнь оленей

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Генотипирование серотипов вируса блютанга»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Блютанг - неконтагиозное трансмиссивное заболевание широкого спектра жвачных животных, передающееся кровососущими насекомыми из рода Culicoides и характеризующееся лихорадочным состоянием, воспалительно-некротическими поражениями ротовой полости, особенно языка, пищеварительного тракта, эпителия венчика и основы кожи копыт, а также дегенеративными изменениями скелетных мышц (Сюрин В.Н. с соавт., 1998 г.). Болезнь представляет значительную социально-экономическую проблему в сфере международной торговли животными и продуктами животноводства.

Этиологическим агентом болезни является РНК-содержащий вирус, принадлежащий к роду Orbivirus семейства Reoviridae. Геном вируса блютанга (ВБ) состоит из 10 дцРНК. Наличие сегментированного генома предопределяет появление реассортантов, что, в свою очередь, может привести к возникновению вариантов вируса с новыми биологическими свойствами. На данный момент известно о 26 серотипах ВБ (Maan et al., 2011).

До 1943 г. считалось, что распространение блютанга ограничено только африканским континентом, однако на настоящий момент известно, что он зарегистрирован на всех континентах мира. С 1998 г. в Европе были зафиксированы восемь серотипов: 1, 2, 4, 6, 8, 9, 11 и 16.

Актуальность изучения блютанга для Российской Федерации (РФ) значительно возросла в 2006 г. с началом импорта племенного крупного рогатого скота (КРС) из стран Европейского Союза (ЕС), в том числе и из стран, неблагополучных на тот момент по блютангу - Германии и Голландии. За период с начала 2006 г. по июнь 2011 г. из стран ЕС было ввезено около 250 тысяч животных в хозяйства, расположенные по всей европейской территории РФ, а также на Урале и в Алтайском крае. Среди импортированного скота сотрудниками ВНИИВВиМ были обнаружены

инфицированные ВБ животные, от которых выделили пять изолятов вируса 8 серотипа.

Известно, что изоляты вируса блютанга имеют чрезвычайно высокий уровень генетической гетерогенности и с помощью средств молекулярно-генетического анализа можно определить нуклеотип, серотип и в некоторых случаях дифференцировать вакцинный вирус от полевого (Maan et al., 2007). С помощью нуклеотидного секвенирования и филогенетического анализа определяют дополнительно и другие генетические характеристики, такие как топотип и квазитип, генотипируют реассортантные варианты вируса. Таким образом, с помощью средств молекулярно-генетического анализа в настоящее время возможно в течение 2-3 дней определить серотип и генетические характеристики вируса, его пространственное и временное распространение. Данные тесты чувствительны, специфичны и в случае идентификации серотипа вируса идеально согласуются с результатами методов вирус-нейтрализации. Указанные выше факты определяют актуальность выполненной работы.

Степень разработанности проблемы

Отечественные ученые (Снетков К.А. с соавт., 2002; Гаврилова Е.А. с соавт., 2009) разработали различные варианты ОТ-ПЦР для выявления генома ВБ, то есть определения серогрупповой принадлежности вируса. Однако не была изучена возможность определения серотиповой принадлежности и его генетической характеристики с помощью методов молекулярно-генетического анализа.

Для идентификации серотипов ВБ иностранными учеными разработаны варианты ОТ-ПЦР с детекцией результатов амплификации методом электрофореза и в режиме реального времени (Mertens et al., 2007; Vandenbussche et al., 2009; Hoffmann et al., 2009). Для генетической характеристики определяют нуклеотидные последовательности отдельных участков и сегментов генома, в качестве комплексного анализа выполняют полногеномное секвенирование (Maan et al., 2007; Maan et al., 2008).

В России до настоящего времени не разработано средств, основанных

на ОТ-ПЦР, позволяющих определить серотиповую принадлежность и дать генетическую характеристику ВБ.

Цель и задачи исследования

В соответствии с вышеизложенным, основная цель данных исследований заключалась в разработке средств идентификации эпизоотически значимых серотипов вируса блютанга и определении генетических характеристик изолятов вируса, выделенных на территории РФ.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) разработать ОТ-ПЦР с детекцией результатов амплификации методом электрофореза для идентификации вируса блютанга эпизоотически значимых для РФ серотипов;

2) подобрать серотип-специфические системы «олигонуклеотидные праймеры - зонд» и разработать на их основе мультиплексные варианты ОТ-ПЦР с детекцией результатов амплификации в режиме реального времени для идентификации вируса блютанга эпизоотически значимых для РФсеротипов;

3) разработать внутренний и положительный контроли реакции для мультиплексных вариантов серотип-специфических ОТ-ПЦР с детекцией результатов амплификации в режиме реального времени и установить показатели аналитической специфичности, аналитической чувствительности и воспроизводимости разработанных серотип-специфических ОТ-ПЦР;

4) подобрать специфические олигонуклеотидные праймеры для нуклеотидного секвенирования сегментов генома вируса блютанга и провести филогенетический анализ изолятов, выделенных на территории РФ.

Научная новизна результатов исследований

Впервые в РФ разработаны:

серотип-специфические ОТ-ПЦР с детекцией продуктов амплификации методом электрофореза для идентификации ВБ 1,2, 4, 6, 8, 9, 11 и 16 серотипов;

- мультиплексные варианты серотип-специфических ОТ-ПЦР с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени для идентификации ВБ 1 и 8, 4 и 16 серотипов.

Впервые в РФ определены:

- нуклеотидные последовательности 2, 7 и 10 сегментов генома пяти изолятов вируса блютанга 8 серотипа, выделенных от крупного рогатого скота, импортированного в 2007-2009 гг. в хозяйства Курской^ Калининградской и Нижегородской областей РФ, генетические характеристики изолятов и проведен их филогенетический анализ;

- нуклеотидные последовательности 2, 3, 5, 6, 7, 10 сегментов генома вируса блютанга 16 серотипа штамма Тапхар, выделенного от овец во время вспышки заболевания 1993 г. в Республике Бурятия, генетические характеристики штамма и проведен его филогенетический анализ.

Практическая значимость работы

Проведен молекулярно-генетический анализ трех сегментов генома пяти изолятов ВБ 8 серотипа, выделенных от импортированного в РФ крупного рогатого скота и шести сегментов генома ВБ штамма Тапхар 16 серотипа выделенного от овец при вспышке заболевания в 1993 г. в Республике Бурятия.

Разработаны «Методические положения по дифференциации 1, 2, 4, 8 и 16 серотипов вируса блютанга методом ОТ-ПЦР», которые утверждены академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН A.M. Смирновым 16.11.2011 г.

Разработаны «Методические положения по дифференциации 1-го, 4-го, 8-го и 16-го серотипов вируса блютанга методом мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени», которые утверждены академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН A.M. Смирновым 10.11.2011 г.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Серотип-специфическая ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации - специфичный, чувствительный и воспроизводимый метод идентификации вируса блютанга 1, 2, 4, 6, 8, 9, 11 и 16 серотипов.

2. Мультиплексные варианты серотип-специфических ОТ-ПЦР с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени -специфичные, высокочувствительные и воспроизводимые методы идентификации вируса блютанга 1 и 8, 4 и 16 серотипов.

3. Нуклеотидные последовательности и результаты филогенетического анализа 2, 7 и 10 сегментов генома пяти изолятов вируса блютанга 8 серотипа, выделенных от крупного рогатого скота, импортированного в РФ в 2008-2009 гг. и 2, 3, 5, 6, 7 и 10 сегментов генома вируса блютанга 16 серотипа штамма Тапхар, выделенного от овец во время вспышки заболевания в 1993 г. в Республике Бурятия.

Личный вклад соискателя

Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Отдельные этапы работы проводились при участии сотрудников лаборатории Диагностики и Научно-экспериментального отдела ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

Апробация результатов работы

Основные результаты исследований по теме диссертации доложены на научной конференции ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины», г. Покров, 2009 г.; на международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», посвященной 40-летию ВНИТИБП, г. Щелково, 2009 г.; ежегодном международном съезде представителей европейских референс-лабораторий по блютангу, г. Мадрид, Испания, 2010 г.; на международной конференции молодых ученых «Достижения молодых ученых в ветеринарную медицину» в ФГУ ВНИИЗЖ, г. Владимир, 2010 г.; на международной конференции "Инновационные биотехнологии в странах ЕврАзЭС" Республика Беларусь,

г. Минск, 2011 г.; на выездном заседании секции «Инфекционной патологии животных» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии в ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии 30.09.2010 г.; на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии в 2009-2011 гг.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано шесть научных работ, в том числе одна в издании, рекомендованном ВАК Министерства образования и науки РФ.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

В соответствии с формулой специальности 03.02.02 Вирусология, охватывающей проблемы разработки мер и средств предупреждения, диагностики и лечения, вызываемых вирусами заболеваний, включая области исследований - генной инженерии, исследования генетических и негенетических взаимодействий клетки и вируса, эпидемиологии и путей распространения вирусных инфекций, изучение путей передачи вирусов, выявление естественных хозяев, разработки мер предупреждения, диагностики и лечения вирусных заболеваний, совершенствование лабораторных диагностических систем, в диссертационной работе проведены исследования по разработке средств обнаружения и дифференциации эпизоотически значимых для РФ серотипов вируса блютанга на основе различных вариантов ОТ-ПЦР, с использованием генно-инженерных конструкций, определение нуклеотидной последовательности сегментов генома и филогенетический анализ серотипов вируса блютанга, выделенных на территории РФ. Результаты научного исследования соответствуют пунктам паспорта специальности - 5, 8, 10.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы, методы, результаты и обсуждение собственных исследований, выводы, практические предложения, список использованной литературы, включающий 6 отечественных и 123 иностранных источников, дополнена приложениями. Диссертация иллюстрирована 24 таблицами и 19 рисунками.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Молекулярно-эпизоотологические исследования вируса блютанга

Вирус блютанга (ВБ) эндемичен в большинстве регионов с теплым климатом, включая территории Северной и Южной Америки, Африки, Индийского субконтинента (Полуостров Индостан), Австралии и Азии. Изоляты и штаммы ВБ, которые выделены во время вспышек заболевания на этих территориях, имеют значительные генетические изменения, в некоторых случаях отражающие их географическое происхождение (Gould, 1987; Gould and Pritchard, 1990; Pritchard et al., 1995, 2004). Для большинства штаммов и изолятов ВБ наиболее значительные из этих изменений позволяют разделить все проанализированные генотипы вируса на восточные и западные группы или топотипы (Maan et al., 2007; Mertens et al., 2007). Восточная группа включает изоляты из Ближнего и Дальнего Востока, Индийского субконтинента, Австралии, Китая и Малайзии, тогда как западная группа включает вирусы из Африки, Южной и Северной Америки.

Вследствие того, что РНК-полимераза имеет определенный уровень ошибки, во время последовательных циклов репликации вируса появляются точечные мутации. Вирус передается к новым хозяевам-млекопитающим посредством специфических векторов-насекомых и, таким образом, некоторые из этих изменений закрепляются и становятся постоянными в популяции вируса. Географическое разделение позволяет вирусам из разных территорий приобретать уникальные точечные мутации, некоторые из которых способствуют тому, что они становятся подходящими для передачи и выживания в соответствующих локальных экосистемах. Процессы реассортации сегментами генома и селекции постепенно привели к появлению характерных региональных вариантов вируса. Уровень дивергентности, который установлен между восточными и западными

группами вируса свидетельствует о том, что они генетически разделялись в течение длительного периода времени.

Вирус блютанга характеризуется существованием большого колическтва серотипов. Сначала Howell (1960) описал первые 12 и позже (Howell, 1970) еще 4 серотипа (13 - 16 серотипы). Серотипы ВБ 17-24 типировал Erasmus (данные неопубликованы). Интересно, что ВБ 17 серотипа был первоначально выделен в США (Barber, 1979), тогда как 18 и 19 серотипы - во время клинических случаев блютанга в Южной Африке в 1976 г. (Erasmus, неопубликованные данные). 20 и 21 серотипы впервые выделены в Австралии (St. George et al., 1978). Следующие два серотипа 22 и 23 впервые выделены от мокрецов рода Culicoides, пойманных в Южной Африке (Nevill et al., 1992) и позже 23 серотип - от крупного рогатого скота в Австралии (Gard et al., 1987). ВБ 24 серотипа выделен от овцы (Erasmus, неопубликованные данные) и мокрецов из Южной Африки (Nevill et al., 1992).

На настоящий момент известно 25 (1-24, 26) серотипов ВБ, чья особенность определена специфичностью взаимодействий между белками на поверхности капсида вируса, вовлеченными в процесс прикрепления к клетке и проникновения и нейтрализующими антителами хозяина-млекопитающего. Гены ВБ, кодирующие поверхностные капсидные белки имеют различия в нуклеотидной последовательности, которые коррелируют как с серотипом вируса, так и с географическим происхождением его изолята. Распространение серотипов и их количество также варьирует в зависимости от географической локализации. Большинство серотипов ВБ обнаружили в Африке и на полуострове Индостан, остальные - в других частях Азии, Австралии, Южной и Северной Америки.

В 2008 г. опубликована статья о появлении нового вируса блютанга, который обнаружили у коз в Швейцарии, по результатам генетического анализа он был обозначен как 25 серотип. В 2010 г. снова обнаружили новый

вирус у овец и коз в Кувейте, по результатам реакции нейтрализации и дальнейшего генетического анализа, он также определен как новый 26 серотип. Кроме того, по неопубликованным данным в 2011 г. у коз в Норвегии обнаружен новый вирус, вероятно 27 серотип, в настоящий момент генетические исследования продолжаются.

С 1998 г., шесть серотипов ВБ были зарегистрированы в Европе. Данные серотипы составили уникальную смесь генетических вариантов вируса из разных географических локализаций (востока и запада), что позволило добавить европейский континент к списку «захваченных» ВБ территорий.

Проведенные молекулярно-эпидемиологические исследования на настоящий момент позволяют осуществить сравнительный анализ последовательностей сегментов генома новых неизвестных изолятов ВБ с уже существующими и охарактеризованными, для которых известны место и дата происхождения. Кроме того, с помощью средств молекулярно-генетического анализа возможно определить серотип, топотип и дифференцировать вакцинные от полевых штаммов вируса. Постепенно возникающие новые изменения в нуклеотидной последовательности генома вируса могут повлиять на формирование отдельных квазитипов вируса и его реассортантных вариантов. Небольшие различия в нуклеотидной последовательности сегментов могут быть характерны даже для варианта вируса, выделенного во время одной вспышки заболевания. Таким образом, в настоящее время возможно проследить пространственное и временное распространение отдельных вариантов вируса, тогда как ранее с использованием только классических серологических методов, это сделать было невозможно.

Молекулярно-эпизоотологические исследования ВБ находятся в зависимости от развития баз нуклеотидных последовательностей сегментов генома вариантов вируса, для которых известна история происхождения

(дата вспышки, дата вирусовыделения и т.д.), географическая локализация происхождения изолята, а также история его пассирования. Новые и уже существующие варианты вируса должны храниться в долгосрочных референтных коллекциях (например, референс-коллекция ВБ Института Здоровья Животных в Пирбрайте, Великобритания). Такие коллекции вируса позволяют ученым проводить наиболее полные исследования, которые позволяют связать генетические характеристики изолятов вируса напрямую с их биологическими свойствами и эпизоотологией.

1.2 Вариабельные и консервативные сегменты генома вируса блютанга

Десять линейных дцРНК сегментов генома ВБ варьируют по размеру от 3944 п.о. до 822 п.о. (пример для ВБ 8 серотипа) (Mertens et al., 2005; Maan et al., 2008). Они обозначены как сегменты 1-10, в соответствии с уменьшением молекулярной массы.

Геном ВБ кодирует 10 белков вируса, каждый белок - один из сегментов дцРНК (Mertens et al., 1984). Семь белков (VP1-VP7) являются структурными компонентами вирусной частицы, остальные три (NS1,NS2 и NS3) - неструктурными белками, которые синтезируются во время репликации вируса в инфицированных клетках. С помощью исследования перекрестной гибридизации (Huismans and Bremer, 1981; Huismans et al., 1987; Mertens et al., 1987) и сравнения нуклеотидных последовательностей (Bonneau et al., 1999, 2000; Wilson et al.,2000; Singh et al., 2004; Potgieter et al., 2005; Maan et al., 2007, 2008; Balasuriya et al., 2008) установлены изменения в нуклеотидных последовательностях сегментов генома ВБ и структуре белков, которые они кодируют. Белки капсида, расположенные на поверхности вирусной частицы более вариабельны, чем белковые компоненты кора вируса или неструктурные белки (Maan et al., 2008).

1.3 Особенности генов, кодирующих белки внешнего слоя капсида вируса блютанга

Внешний капсид частицы вируса ВБ состоит из двух белков VP2 и VP5, они являются наименее консервативными, их кодируют 2 и 6 сегменты соответственно. Изменения в этих компонентах наружного капсида отражают адаптационные процессы вируса к хозяину и вектору, продиктованные необходимыми условиями для прикрепления и проникновения вируса в клетки разных видов/тканей и ответа на воздействие антител хозяев-позвоночных.

Исследования реассортантных вариантов ВБ показали, что оба белка внешнего капсида VP2 и VP5 ВБ влияют на специфичность взаимодействий между вирусной частицей и нейтрализующими антителами (Cowley и Gorman 1989; Mertens et al., 1989). VP2 поверхностный белок капсида ВБ, представляет главную антигенную мишень для связывания нейтрализующими антителами (Huismans and Van Dijk, 1990; Roy et al., 1990; DeMaula et al., 2000; Maan et al., 2007, 2008; Mertens et al., 2007). Анализ нуклеотидных последовательностей 2-го сегмента референтных штаммов 26 серотипов ВБ также подтвердил, что он представляет собой наименее консервативный участок генома ВБ (рис. 1 и 2) и имеет от 29 % до 59 % нуклеотидных изменений между серотипами (Maan et al., 2007) (рис. 1 и 3).

RSAr~^-A3585129 RSflrnT/lS-A555139.

-"SA— »A»il38 HSA— /05-ASKlJ6

. RSAnr/l$-AjS8SH) F ftSÄT77 /0 7-AJ5S5128

H

I RSA—t/02 RSÄrnrrtM-AjSSSi22

RSAmr/16*A3585i37 В RSAmr/Ö3-AJSß$124 RSAnrr/l3-AJS85i34

HSfcm/2l-A358514? ftSAmr/ 14-A35S5135 ' „ RSÄmr/0S-A)S85127 100

O.05

' HM590G^2 L ✓

. RSAfTTr/lO-AJ58S131 1 RStarr/24-A}585145 •RSAmT/ll-A358S132 R]^nrr/17-A}SS513S RSAf itt/04-AJ585i 25 Д RSAmrj20-A]S85141

к'Я5Атт/15-Ш.5136 J

T/22-AJ585H3 g R£Arrrr/i2-AJ5S5i33

Рис. 1 Филогенетическое дерево, построенное на основании нуклеотидных последовательностей 2 сегмента 26 ссротипов ВЬ. Дерево сконструировано с использованием программы MEGA2 (параметры по умолчанию) и на основе полноразмерных нуклеотидных последовательностей 2 сегмента референтных штаммов 26 серотипов ВН. Десять эволюционных точек разветвления показаны черными точками на дереве, которые соответствуют 12 нуклеотипам, обозначенным A-L (Маап et al., 2007)

Филогенетический анализ 2 сегмента более 300 изолятов ВБ подтвердил их разделение на 26 групп или кладов, точно отражая серотип вируса, с менее 33 % нуклеотидных изменений в последовательности внутри каждого серотипа, и от 29 % до 59 % замен между серотипами (Маап et а!., 2007; Mertens et al., 2007). Однако, некоторые серогипы ВБ наиболее близко генетически связанны, чем другие, что позволяет сгруппировать их в 12 различных нуклеотипов, стандартно они обозначаются буквами А, В, С, D, Е, F, G, Н, 1, J, К, L) и имеют от 29 % до 33 % нуклеотидных различий между вирусами, принадлежащими к разным серотипам, но одному и тому же нуклеотипу по 2 сегменту (рис.1). Серотипы ВБ, представляющие один

нуклеотип по 2 сегменту также могут иметь близкие серологические связи (рис.5) (Маап е1 а!., 2007).

Рис. 2 Филогенетические деревья, построенные по методу присоединения соседей (NJ) для 1-10 сегментов генома ВБ, показывающие их относительные уровни гетерологии. Каждое из деревьев, соответствует определенному сегменту генома ВБ европейских и других штаммов ВБ и показаны в одинаковых масштабах. Для данных вирусов и сегментов генома, 2 и 6 сегменты наиболее вариабельные, далее следуют 7 и 10. которые остаются консервативными сегментами, показывая почти эквивалентные уровни гетерологии и четкое восточно (Е) - западное (W) группирование. Дерево 2А показывает сравнение 2 сегмента 1, 2, 4, 8, 9 и 36 европейских серотипов ВБ. 2В - только для последовательностей 2 сегмента штаммов Вб 8 серотипа (Маап et а!., 2008)

Различия в нуклеотидной последовательности 2 сегмента ВБ дают возможность их группировки внутри каждого серотипа по географическому происхождению, с разделением на восточные и западные линии или топотипы (рис.6). Штаммы ВБ, принадлежащие к одному и тому же топотипу (по 2 сегменту) одного серотипа имеют менее 13 % иуклеотидных различий в последовательности сегмента (рис.3). Восточная группа ВБ обычно включает вирусы из Индии, Индонезии, Китая или Австралии, западная - вирусы из Африки и Северной или Южной Америки (рис.6) (Маап et aL, 2004, 2007, 2008; Mertens et al., 2007). Однако, в некоторых случаях были обнаружены

вирусы, которые не соответствовали данному принципу группировки, то есть они появились в нехарактерной для них географической локализации. В каждом случае это могло быть связано с внедрением штамма вируса из другой территории (как наблюдалось в Индии).

Так как 2 сегмент является наиболее вариабельным сегментом генома ВБ, изменения в его нуклеотидной последовательности дают основание для молекулярно-эпизоотологических исследований, которые могут быть использованы для установления или подтверждения серотипа вируса, географического происхождения линии вируса, к которой он принадлежит и для определения различия даже между близко связанными штаммами вируса одной эпизоотии или одной территории. Кроме того, анализ 2 сегмента изолятов ВБ, принадлежащих к разным серотипам также необходим для подбора специфических олигонуклеотидных праймеров, которые используются в натоящее время в тестах, основанных на ОТ-ГГЦР (Mertens et al., 2007). ОТ-ГЩР широко применяется для определения серотипа и топотипа ВБ, как европейских полевых, так и вакцинных штаммов, для обнаружения экзотических серотипов ВБ, которые появлялись в Северной Америке.

% Amino acid identity BTV Same ser0,ype'53016 ,opotyPV

BTV: Same serotype. dllforonl lopotypo ■4-►

BTV Different serotype; same nucieolype

Botwcon Orbivirus spec\os f'v U'»^"! serotype & nucttolypo 1

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Панферова, Агнеса Владимировна

4 ВЫВОДЫ

1. Разработанные серотип-специфические ОТ-ПЦР с детекцией продуктов амплификации методом электрофореза для идентификации вируса блютанга

1. 2, 4, 6, 8, 9, 11 и 16 серотипов являются специфичными и воспроизводимыми методами с аналитической чувствительностью 1,5 - 2,5 ^ ТЦД50/см3.

2. Разработанные мультиплексные варианты серотип-специфических ОТ-ПЦР с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени для идентификации вируса блютанга 1 и 8, 4 и 16 серотипов, включающие внутренний и положительный контроли являются специфичными, воспроизводимыми и экспрессными методами с аналитической л чувствительностью 0,25 - 0,75 ^ ТЦД50/см .

3. Для генотипирования изолятов вируса блютанга, выделенных на территории РФ, подобраны специфические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные нуклеотидным последовательностям 2, 7 и 10 сегментов генома вируса блютанга 8 серотипа и 2, 3, 5, 6, 7 и 10 сегментов генома вируса блютанга 16 серотипа.

4. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей участков 2, 7 и 10 сегментов генома пяти изолятов вируса блютанга 8 серотипа, выделенных от крупного рогатого скота, импортированного в РФ в 2008-2009 гг., показал, что изоляты по указанным сегментам идентичны между собой и гомологичны европейскому варианту вируса, представляющему западный топотип 8 серотипа.

5. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей участков 2, 3, 5, 6, 7 и 10 сегментов генома вируса блютанга 16 серотипа штамма Тапхар, выделенного от овец во время вспышки заболевания в 1993 г. в Республике Бурятия, показал, что штамм Тапхар генетически родственен изоляту 16 серотипа, выделенному в Западном Пакистане в 1960 г.

5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Нуклеотидные последовательности сегментов генома ВБ изолятов, выделенных на территории РФ, могут быть использованы для определения генетических характеристик и формирования международных баз данных в молекулярной эпизоотологии.

Специфические оригинальные олигонуклеотидные праймеры для определения нуклеотидных последовательностей сегментов генома вируса блютанга 8 и 16 серотипов, проведения генетической характеристики изолятов ВБ и создания генетических паспортов рекомендуются для практического применения в научно-исследовательских и диагностических лабораториях.

Методические положения по дифференциации 1, 2, 4, 8 и 16 серотипов вируса блютанга методом ОТ-ПЦР», утвержденные академиком -секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии A.M. Смирновым 16.11.2011 г.

Методические положения по дифференциации 1 -го, 4-го, 8-го и 16-го серотипов вируса блютанга методом мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени», утвержденные академиком -секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии A.M. Смирновым 10.11.2011 г. предлагаются для практики при идентификации некоторых серотипов вируса блютанга.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Панферова, Агнеса Владимировна, 2012 год

6 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев, Н.В. Фомина // ВНИТИБП.- Москва, 1998.- С.928.

2. Выделение вируса блютанга от импортированного крупного рогатого скота / И.В. Вялых, Т.П. Фёдоров, И.В. Ногина, В.В. Куриннов, М.Б. Новикова // Ветеринария. - 2010. - №8. - С. 23-26.

3. Выделение, идентификация и типирование вируса KJIO в Бурятии/ И.Ф. Вишняков, A.A. Стрижаков, М.Б. Новикова, A.B. Луницин, В.В. Куриннов, Г.М. Карпов// Проблемы вирусологии (молекулярная биология, иммунология, диагностика, биотехнология, эпизоотология и эпидемиология). - Тезисы докладов научной конференции. Министерство науки и новых технологий Республики Казахстан, Национальный центр по биотехнологии, НИСХИ, пгт. Гвардейский. -1994.-ч.2.-С.16-18.

4. Идентификация и типирование вируса катаральной лихорадки овец / И.Ф. Вишняков, A.A. Стрижаков, М.Б.Новикова, A.B.Луницин, В.В. Куриннов, Г.М. Карпов, В.И. Балышева, К.С. Волокитина // Ветеринария. - 1995. - №4. - С.20-25.

5. Использование полимеразной цепной реакции для идентификации вирусов КЛО и ЭГБО / К.А. Снетков, H.H. Власов, С.Ж. Цыбанов, A.A. Стрижаков, А.Ю. Чичикин // Генодиагностика инфекционных заболеваний: материалы Всероссийской научно-практической конференции.- Москва, 2002. - С.366-368.

6. Сравнительная оценка вариантов ПЦР-анализа для выявления генома вируса блютанга / Е.А. Гаврилова, Д.В. Колбасов, A.C. Малоголовкин, С.Ж. Цыбанов // Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины: материалы конференции молодых ученых ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. - Покров, 2009. - С. 83-87.

7. A comparison of Different Orbivirus proteins that could affect virulence and pathogenesis/ H. Huismans, V. van Staden, W.C. Fick, M. van Niekerk and T.L. Meiring// Vet. Ital. - 2005. - Vol.40. - P.417-25.

8. A comparison of six different bluetongue virus isolates by cross-hybridization of the dsRNA genome segments/ P.P.C. Mertens, S. Pedley, J. Cowley and J.N. Burroughs// Virology. - 1987. - Vol.161. - P.438-47.

9. A duplex RT-PCR assay for detection of genome segment 7 (VP7 gene) from 24 BTV serotypes/ S. Anthony, H. Jones, K.E. Darpel, H. Elliott, S. Maan, A. Samuel, P.S. Mellor and P.P.C. Mertens// J. Virol. Methods. - 2007. -Vol. 141. -P.188-97.

10. A European field strain of bluetongue virus derived from two parental vaccine strains by genome segment reassotment/ C.A. Batten, S. Maan, A.E. Shaw, N.S. Maan and P.P.C. Mertens// Virus Res. - 2008. - Vol.137,N.l. -P.56-63.

11. Active circulation of bluetongue vaccine virus serotype-2 among unvaccinated cattle in central Italy/ G. Ferrari, C. De Liberato, G. Scavia, R. Lorenzetti, M. Zini, F. Farina, A. Magliano, G. Cardeti, F. Scholl, M. Guidoni, M.T. Scicluna, D. Amaddeo, P. Scaramozzino and G.L. Autorino// Prev. Vet. Med. - 2005. - Vol.68. - P. 103-13.

12. An inactivated vaccine for the control of bluetongue virus serotype 16 infection in sheep in Italy/ G. Savini, G.F. Ronchi, A. Leone, A. Ciarelli, P. Migliaccio, P. Franchi, M.T. Mercante and A. Pini// Vet. Microbiol. - 2007. -Vol.124.-P. 140-6.

13. Analysis and phylogenetic comparisons of full-length VP2 genes of the 24 bluetongue virus serotypes/ S. Maan, N.S. Maan, A.R. Samuel, S. Rao, H. Attoui and P.P.C. Mertens// J. Gen. Virol. - 2007. - Vol.88. - P.621-30.

14. Analysis and phylogenetic comparisons of full-length VP2 genes of the 24 bluetongue virus serotypes/ S. Maan, N.S. Maan, A.R. Samuel, S. Rao, H. Attoui and P.P.C. Mertens// J. Gen. Virol. - 2007. - Vol.88. - P.621-30.

15. Analysis of the roles of bluetongue virus outer capsid proteins VP2 and VP5 in determination of virus serotype/ P.P.C. Mertens, S. Pedley, J. Cowley, J.N. Burroughs, A.H. Corteyn, M.H. Jeggo, D.M. Jennings and B.M. Gorman// Virology. - 1989.-Vol.170.-P.561-5.

16. Analysis of the roles of bluetongue virus outer capsid proteins VP2 and VP5 in determination of virus serotype/ P.P.C. Mertens, S. Pedley, J. Cowley, J.N. Burroughs, A.H. Corteyn, M.H. Jeggo, D.M. Jennings and B.M. Gorman// Virology. - 1989. - Vol.170. - P.561-5.

17. Barber, T.L. Temporal appearance and species of origin of bluetongue virus serotypes in the United States/ T.L. Barber// Am. J. Vet. Res. - 1979. -Vol.40.-P. 1654-6.

18. Bluetongue in Bulgaria, Office International des Epizooties (OIE)/ OIE Disease Information. - 2006.

www. oie. int/eng/info/hebdo/AIS_74. HTM# S ec 8.

19. Bluetongue in Bulgaria: additional information/ Anon// Dis. Info. - 1999. -Vol.12.-P.122.

20. Bluetongue in Croatia: suspected outbreak/ Anon// Dis. Info. - 2001. -Vol.14.-P.262-5.

21. Bluetongue in France: in the island of Corsica/ Anon// Dis. Info. - 2000. -Vol. 13. - P.195-7.

22. Bluetongue in Greece and Italy/ Anon// Dis. Info. - 2001. - Vol.14. - P.215-18.

23. Bluetongue in Greece: confirmation of diagnosis/ Anon// Dis. Info. - 1998. -Vol.11.-P. 166-7.

24. Bluetongue in Greece: follow-up report no. 2/ Anon// Dis. Info. - 2001. -Vol.14.-P.262-5.

25. Bluetongue in Kosovo (FRY), territory under United Nations interim administration/ Anon// Dis. Info. - 2001. - Vol.14. - P.242-3.

26.Bluetongue in Northern Europe/ J.F. Toussaint, F. Vandenbussche, J. Mast, L. Demeestere, N. Goris, W. Van Dessel, E. Vanopdenbosch, P. Kerkhofs, S. Zientara, C. Sailleau, G. Czaplicki, G. Depoorter, and J.M. Dochy// Vet. Rec. -2006.-Vol.159.-P.327.

27. Bluetongue in the Former Yugoslav Republic of Macedonia: follow-up 1/ Anon// Dis. Info. - 2001. - Vol.14. - P.265-8.

28.Bluetongue in western Turkey/ A.D. Yonguc, W.P. Taylor, L. Csontos, and E. Worrall//Vet Rec. - 1982.-Vol.111.-P.144-6.

29. Bluetongue in Yugoslavia/ Anon// Dis. Info. - 2001. - Vol.14. - P.280-1.

30.Bourn, D. Livestock dynamics in the Arabian Peninsula: A regional review of national livestock resources and international livestock trade/ D. Bourn// 2003. <http://ergodd.zoo.ox.ac.uk/download/reports/Livestock%20Dynamics%20in %20the%20Arabian%20 Peninsula.pdf>( Ani mal Production and Health Division of the Food and Agricultural Organization of the United Nations.

31.Climate change and the recent emergence of bluetongue in Europe/ B.V. Purse, P.S. Mellor, D.J. Rogers, A.R. Samuel, P.P.C. Mertens, and M. Baylis//, Nat. Rev. Microbiol. - 2005. - Vol.3. - P. 171-81.

32.Competitive ELISA for serodiagnosis of bluetongue: evaluation of group-specific monoclonal antibodies and expressed VP7 antigen/ A.Afshar, B.T. Eaton, P.F.Wright, J.E. Pearson, J. Anderson , M. Jeggo and H.C. Trotter//J. Vet. Diagn. Invest. - 1992. - Vol.4. - P.231-7.

33.Complete nucleotide sequence of RNA segment 3 of bluetongue/ L.I. Pritchard, A.R. Gould, W.C. Wilson, L. Thompson, P.P.C. Mertens and A.M. Wade-Evans//Vir. Res. - 1995. - Vol.35. -P.247-261.

34. Complete sequence characterization of the genome of the St Croix River virus, a new orbivirus isolated from cells of Ixodes scapularis/ H. Attoui, J.M. Stirling, U.G. Munderloh, F. Billoir, S.M. Brookes, J.N. Burroughs, P. de Micco, P.P.C. Mertens and X. de Lamballerie// J. Gen. Virol. - 2001. -Vol.82.-P.795-804.

35.Complete sequence determination and genetic analysis of Banna virus and Kadipiro virus: proposal for assignment to a new genus (Seadornavirus) within the family Reoviridae/ H. Attoui, F. Billoir, P. Biagini, P. de Micco, and X. de Lamballerie// J. Gen. Virol. - 2000. - Vol.81. - P. 1507-15.

36.Completion of the sequence analysis and comparisons of genome segment 2 (encoding outer capsid protein VP2) from representative isolates of the 24 bluetongue virus serotypes/ S. Maan, N.S. Maan, A.R. Samuel, R. O'Hara, A.J. Meyer, S. Rao and P.P.C. Mertens// Vet. Ital. - 2004. - Vol.40. - P.484-8.

37.Cowley, J.A. Cross-neutralization of genetic reassortants of bluetongue virus serotypes 20 and 21/ J.A. Cowley and B.M. Gorman// Vet. Microbiol. - 1989. -Vol. 19. - P.37-51.

38. Cowley, J.A. Cross-neutralization of genetic reassortants of bluetongue virus serotypes 20 and 21/ J.A. Cowley and B.M. Gorman// Vet. Microbiol. - 1989. -Vol.19.-P.37-51.

39.DeMaula, C.D. Changes in the outer capsid proteins of bluetongue virus serotype ten that abrogate neutralization by monoclonal antibodies/ C.D. DeMaula, K.R. Bonneau and N.J. MacLachlan// Virus Res. - 2000. - Vol.67. P.59-66.

40.DeMaula, C.D. Changes in the outer capsid proteins of bluetongue virus serotype ten that abrogate neutralization by monoclonal antibodies/ C.D. DeMaula, K.R. Bonneau and N.J. MacLachlan// Virus Res. - 2000. - Vol.67. -P.59-66.

41. Development and validation of a real timeRT-PCR assay to detect genome bluetongue virus segment 1/ A.E. Shaw, P. Monaghan, H.O. Alpar, S. Anthony, K.E. Darpel, C.A. Batten, A. Guercio, G. Alimena, M. Vitale, K. Bankowska, S. Carpenter, H. Jones, C.A. Oura, D.P. King, H. Elliott, P.S. Mellor and P.P.C. Mertens// J. Virol. Methods. - 2007. - Vol.145. - P. 115-26.

42.Differentiation between field and vaccine strain of bluetongue virus serotype 16/ F. Monaco, C. Camma , S. Serini and G. Savini// Vet. Microbiol. - 2005. -Vol.116.-P.45-52.

43.Disease outbreaks reported to the OIE in November-December 1998/ Anon// Bull. Off. Int. Epizoot. - 1998. - Vol.110. - P.506.

44.Disease outbreaks reported to the OIE January-February 2000/ Anon// Bull. Off. Int. Epizoot. - 2000. - Vol.112. - P. 16.

45.Disease outbreaks reported to the OIE July-August 1999/ Anon// Bull. Off. Int. Epizoot. - 1999. - Vol. 111.- P.379.

46.Disease outbreaks reported to the OIE July-August 2000/ Anon// Bull. Off. Int. Epizoot. - 2000. - Vol.112. - P.687-8.

47.Disease outbreaks reported to the OIE September-October 2000/ Anon// Bull. Off. Int. Epizoot. - 2000. - Vol.112. - P.552.

48.Enhanced infectivity of modified bluetongue virus particles for two insect cell lines and for two Culicoides vector species/ P.P.C. Mertens, J.N. Burroughs,

A. Walton, M.P. Wellby, H. Fu, R.S. O'Hara, S.M. Brookes and P.S. Mellor// Virology. - 1996. - Vol.217. - P.582-93.

49.Erasmus, B. J. Bluetongue virus/ B. J. Erasmus, Z. Dinter and B. Morein// Virus infections of Ruminants. New York: Elsevier Science Publishers - 1990. - P. 227-37.

50.Exotic bluetongue viruses identified from ruminants in the southeastern USA from 1999-2006/ D.J. Johnson, P.P.C. Mertens, S. Maan, and E.N. Ostlund// Proceedings of Annual Conference of American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians (AAVLD). Reno, NV. - 2007. - P.l 18.

51.Fievre catarrhale du mouton (bluetongue)/ J. Manso-Ribeiro, J.A. Rosa-Azevedo, F.O. Noronha, M.C. Braco-Forte, C. Grave-Periera and M. Vasco-Fernande//Bull.Off. Int.Epizoot. - 1957. - Vol.48. -P.350-67.

52.Genetic diversity of bluetongue viruses in south east Asia/ L.I. Pritchard, I. Sendow, R. Lunt, S.H. Hassan, J. Kattenbelt, A.R. Gould, P.W. Daniels and

B.T. Eaton// Virus Res. - 2004. - Vol.101. - P. 193-201.

53. Gibbs, P.J. The epidemiology of Bluetongue// P.J. Gibbs and E.C. Greiner// Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. - 1994. - Vol.17. -P.207-20.

54. Gould, A.R. Phylogenetic analyses of complete nucleotide sequence of the capsid protein (VP3) of Australian epizootic hemorrhagic disease of deer virus (serotype 2) and cognate genes from other orbiviruses/ A.R. Gould and L.I. Pritchard// Virus Res. - 1991.-Vol.21.-P. 1-18.

55. Gould, A.R. Relationships amongst bluetongue viruses revealed by comparisons of capsid and outer coat protein nucleotide sequences/ A.R. Gould and L.I. Pritchard// Virus Res. - 1990. - Vol.17. - P.31-52.

56. Gould, A.R. The complete nucleotide sequence of bluetongue virus serotype 1 RNA3 and a comparison with other geographic serotypes from Australia,

South Africa and the United States of America, and with other orbivirus isolates/ A.R. Gould// Virus Res. - 1987. - Vol.7. - P. 169-83.

57. Howell, P.G. The application of improved techniques to the identification of strains of bluetongue virus/ P.G. Howell, N.A. Kumm and M.J. Botha// Onderstepoort J. Vet. Res. - 1970. - Vol. 37. - P.59-66.

58. Huismans, H. A comparison of an Australian bluetongue virus isolate (CSIRO 19) with other bluetongue virus serotypes by cross-hybridization and cross-immune precipitation/ H. Huismans and C.W. Bremer// Onderstepoort J. Vet. Res. - 1981.-Vol.48. - P.59-67.

59. Huismans, H. A comparison of an Australian bluetongue virus isolate (CSIRO 19) with other bluetongue virus serotypes by cross-hybridization and cross-immune precipitation/ H. Huismans and C.W. Bremer// Onderstepoort J. Vet. Res.- 1981.-Vol.48.-P.59-67.

60. Huismans, H. Bluetongue virus structural components/ H. Huismans and A.A. Van Dijk// Current Topics in Microbiology and Immunology: Bluetongue Viruses. Springer-Verlag, Germany. - 1990. - Vol.162. -P.21-41.

61. Huismans, H. Bluetongue virus structural components/ H. Huismans and A.A. Van Dijk// Current Topics in Microbiology and Immunology: Bluetongue Viruses. - Springer-Verlag, Germany. - 1990. - Vol. 162. - P.21-41.

62. Huismans, H. The genetic relatedness of a number of individual cognate genes of viruses in the bluetongue and closely related serogroups/ H. Huismans, M. Cloete and A. le Roux// Virology. - 1987. - Vol.161. - P.421-8.

63. Huismans, H. The genetic relatedness of a number of individual cognate genes of viruses in the bluetongue and closely related serogroups// H. Huismans, M. Cloete and A. le Roux// Virology. - 1987. - Vol.161. - P.421-8.

64. Hutchinson, I. R. The role of VP7(T13) in initiation of infection of bluetongue virus/1. R. Hutchinson// PhD thesis, University of Hertfordshire. -1999.

65. Hyatt, A.D. Release of bluetongue virus-like particles from insect cells is mediated by BTV nonstructural protein NS3/NS3a/ A.D. Hyatt, Y. Zhaoand, P. Roy// Virology. - 1993. - Vol.193. - P.592-603.

66. Mellor, P.S. African horse sickness/ P.S. Mellor and C. Hamblin// Vet Res. -2004.-Vol.35.-P.445-66.

67. Mellor, P.S. Bluetongue virus in the Mediterranean Basin, 1998-2001/ P.S. Mellor and E.J. Wittmann// Vet. J. - 2002. - Vol.164. - P. 20-37.

68. Mellor, P.S. Culicoides biting midges: Their role as arbovirus vectors/ P.S. Mellor, J. Boorman and M. Baylis// Annu. Rev. Entomol. - 2000. - Vol.45. -P. 307-40.

69. Mellor, P.S. The transmission and geographical spread of African Horse Sickness and Bluetongue viruses/ P.S. Mellor and J. Boorman/ Ann. Trop. Med. Parasitol. - 1995. - Vol.89. - P. 1-15.

70. Mertens, P.P.C. Assignment of the genome segments of bluetongue virus type 1 to the proteins which they encode/ P.P.C. Mertens, F. Brown and D.V. Sangar// Virology. - 1984. - Vol.135. - P.207-17.

71. Mertens, P.P.C. dsRNA viruses/ P.P.C. Mertens// Virus Res. - 2004. -Vol.101.-P.3-13.

72. Mertens, P.P.C. Molecular epidemiology studies of bluetongue virus. The Bluetongue virus core: a nano-scale transcription machine/ P.P.C. Mertens and J. Diprose// Virus Res. - 2004. - Vol.101. - P.29-4.

73. Mertens, P.P.C. Orbivirus and Coltivirus/ P.P.C. Mertens// Encyclopedia of Virology, 2nd edn. - London, 1999. - Vol. 2. - P. 1043-74.

74. Mertens, P.P.C. Purification and properties of virus particles, infectious subviral particles and cores of bluetongue virus serotypes 1 and 4/ P.P.C. Mertens, J.N. Burroughs and J. Anderson// Virology. - 1987. - Vol.157. - P.375-86.

75. Mertens, P.P.C., Pedley, S., Cowley, J. and Burroughs, J.N. (1987b) A comparison of six different bluetongue virus isolates by cross-hybridization of the dsRNA genome segments/ P.P.C. Mertens, S. Pedley, J. Cowleyand J.N. Burroughs// Virology. - 1987. - Vol.161. -P.43 8-47.

76. Molecular analysis of the NS3/NS3 A gene of Bluetongue virus isolates from the 1979 and 1998-2001 epizootics in Greece and their segregation into two distinct groups/ S.V. Nikolakaki, K. Nomikou, M. Koumbati, O. Mangana, M. Papanastassopoulou, P.P.C. Mertens and O. Papadopoulos// Virus Res. - 2005. -Vol.114.-P.6-14.

77. Molecular epidemiology of bluetongue virus serotype 4 isolated in the Mediterranean Basin between 1979 and 2004/ E. Breard, C. Sailleau, K. Nomikou, C. Hamblin, P.P.C. Mertens, P.S. Mellor, M. El Harrak and S. Zientara// Virus Res. - 2007. - Vol.125. -P.191-7.

78. Molecular epidemiology of bluetongue viruses from disease outbreaks in the Mediterranean Basin/ S. Maan, A.R. Samuel, N.S. Maan, H. Attoui, S. Rao and P.P.C. Mertens// Vet. Ital. - 2004. - Vol.40. - P.489-96.

79. Molecular epidemiology studies of bluetongue virus/ H. Takamatsu, P.S. Mellor, P.P.C. Mertens, P.A. Kirkham, J.N. Burroughs and R.M.E. Park-house// A possible overwintering mechanism for bluetongue virus in the absence of the insect vector// J. Gen. Virol. - 2003. - Vol.84. - P.227-35.

80. Morphological and molecular characterization of a cypovirus (Reoviridae) from the mosquito Uranotaenia sapphirina (Diptera: Culicidae)/ A. Shapiro, T.

Green, S. Rao, S. White, G. Carner, P.P.C. Mertens and J. Becnel// J. Virol. - 2005. - Vol.79. - P.9430-8.

81. Nevill, E.M. A six-year survey of viruses associated with Culicoides biting midges throughout South Africa (Diptera: Ceratopogonidae)/ E.M. Nevill, B.J. Erasmus and G.J. Venter// In: T.E. Walton and B.I. Osburn (eds), Bluetongue, African Horse Sickness and Related Orbiviruses. Proceedings of the 2nd International Symposium. Boca Raton: FL: CRC Press, Inc. - 1992. -P.314-19.

82. Orbivirus, Reoviridae/ P.P.C. Mertens, S. Maan, A. Samuel and H.Attoui// Virus Taxonomy, VHIth Report of the ICTV. - London, 2005. -P.466-83.

83. Panagiotatos, D.E. Regional overview of bluetongue viruses, vectors, surveillance and unique features in Eastern Europe between 1998 and 2003/ D.E. Panagiotatos// Vet. Ital. - 2004. - Vol.40. - P.61-72.

84. Phylogenetic relationships of bluetongue viruses based on gene S7/ W.C. Wilson, H.C. Ma, E.H. Venter, A.A. van Djik, B.S. Seal and J.O. Mecham/ Virus Res. - 2000. - Vol.67. - P. 141-51.

85. Phylogenetic relationships of bluetongue viruses based on gene S7/ W.C. Wilson, H.C. Ma, E.H. Venter, A.A. van Djik, B.S. Seal and J.O. Mecham// Virus Res. - 2000. - Vol.67. - P. 141-51.

86. Phylogenetic analysis of African horse sickness virus segment 10: sequence variation, virulence characteristics and cell exit/ L.A. Martin, A.J. Meyer, R.S. O'Hara, H. Fu, P.S. Mellor, N.J. Knowles and P.P.C. Mertens// Arch. Virol. Suppl. - 1998. -Vol.14. -P.281-93.

87. Phylogenetic analysis of bluetongue virus genome segment 6 (encoding VP5) from different serotypes/ K.P. Singh, S. Maan, A.R. Samuel, S. Rao, A. Meyer, and P.P.C. Mertens// Vet. Ital. - 2004. - Vol.40. - P.479-83.

88.Phylogenetic analysis of bluetongue virus genome segment 6 (encoding VP5) from different serotypes/ K.P. Singh, S. Maan, A.R. Samuel, S. Rao, A. Meyer and P.P.C. Mertens// Vet. Ital. - 2004. - Vol.40. - P.479-83.

89. Phylogenetic analysis of the S7 gene does not segregate Chinese strains of bluetongue virus into a single topotype/ K.R. Bonneau, N.Z. Zhang, W.C. Wilson, J.B. Zhu, F.Q. Zhang, Z.H. Li, K.L. Zhang, L. Xiao, W.B. Xiang and N.J. MacLachlan// Arch. Virol. - 2000. - Vol.145. - P. 1163-71.

90. Phylogenetic analysis of the S7 gene does not segregate Chinese strains of bluetongue virus into a single topotype/ K.R. Bonneau, N.Z. Zhang, W.C. Wilson, J.B. Zhu, F.Q. Zhang, Z.H. Li, K.L. Zhang, L. Xiao, W.B. Xiang and N.J. MacLachlan// Arch. Virol. - 2000. - Vol.145. - P. 1163-71.

91. Polydorou, K. (1978) The 1977 outbreak of bluetongue in Cyprus/ K. Polydorou// Trop. Anim. Health Prod. - 1978. - Vol.10. - P.229-32.

92. Possible origin of the bluetongue epidemic in Cyprus, August 1977/ R.F. Sellers, E.P. Gibbs, K.A. Herniman, D.E. Pedgley and M.R. Tucker// Epidemiology and Infection. - 1979. - Vol.83. - P.547-55.

93. Possible use of vaccination against bluetongue in Europe:report of the Scientific Committee on animal health and animal welfare/ European Commission. - Brussels. - 2000. - P.27.

94. Rapid cDNA synthesis and sequencing techniques for the genetic study of bluetongue and other dsRNA viruses/ S. Maan, S. Rao, N.S. Maan, S.J. Anthony, H. Attoui, A.R. Samuel and P.P.C. Mertens// J. Virol. Methods. -2007.-Vol.143.-P. 132-9.

95. Roy, P. Structure of the bluetongue virus genome and its encoded proteins/ P. Roy, J.J.A. Marshall and T.J. French// Current Topics in Microbiology and Immunology: Bluetongue Viruses. - Springer-Verlag, Germany. - 1990. - Vol.162. -P.43-87.

96.Roy, P. Structure of the bluetongue virus genome and its encoded proteins/ P. Roy, J.J.A. Marshall and T.J. French// Current Topics in Microbiology and Immunology: Bluetongue Viruses. - Springer-Verlag, Germany, 1990. -Vol.162. -P.43-87.

97.Sailleau, C. Nucleotide sequence comparison of the segments S10 of the nine African horsesickness virus serotypes/ C. Sailleau, S. Moulay and S. Zientara// Arch. Virol. - 1997. - Vol.142. - P.965-78. 98.Samuel, A.R. Foot-and-mouth disease type O viruses exhibit genetically and geographically distinct evolutionary lineages (topotypes)/ A.R. Samuel and N.J. Knowles// J. Gen. Virol. - 2001. - Vol.82. -P.609-21.

99. Samuel, A.R. Genetic analysis of type O viruses responsible for epidemics of foot-and-mouth disease in North Africa/ A.R. Samuel, N.J. Knowles and

D.K.J. Mackay// Epidemiol. Infect. - 1999. - Vol.122. - P.529-38.

100. Scientific Opinion of the Scientific Panel on Animal Health and Welfare on the EFSA Selfmandate on bluetongue origin and occurrence/ EFSA report -2007. - EFSA J. - Vol.480. - P. 1-20.

101. Sequence analysis of bluetongue virus serotype 8 from the Netherlands 2006 and comparison to other European strains/ S. Maan, N. S. Maan, N. Rosssmith, C. A. Batten, A. E. Shaw, S. J. Anthony, A. R. Samuel, K. E. Darpel, E. Veronesi, C. A. L. Oura, K. P. Singh, K. Nomikou, A. C. Potgieter, H. Attoui,

E. van Rooij, P. van Rijn, K. D. Clercq, F. Vandenbussche, S. Zientara, E. Bre'ard, C. Sailleau, M. Beer, B. Hoffman, P.S. Mellor and P. P. C. Mertens// Virology. - 2008. - Vol. 377. -P.308-18.

102. Sequence analysis of bluetongue virus serotype 8 from the Netherlands 2006 and comparison to other European strains/ S. Maan, N. S. Maan, N. Ross-smith, C. A. Batten, A. E. Shaw, S. J. Anthony, A. R. Samuel, K. E. Darpel, E. Veronesi, C. A. L. Oura, K. P. Singh, K. Nomikou, A. C. Potgieter, H. Attoui, E. van Rooij, P. van Rijn, K. D. Clercq, F. Vandenbussche, S. Zientara, E. Bre'ard, C. Sailleau, M. Beer, B. Hoffman, P. S. Mellor and P. P. C. Mertens// Virology. - 2008. - Vol.377. - P.308-18.

103. Sequence comparison of the L2 and S10 genes of bluetongue viruses from the United States and the People's Republic of China/ K.R. Bonneau, N. Zhang, J. Zhu, F. Zhang, Z. Li, K. Zhang, L. Xiao, W. Xiang and N.J. MacLachlan//Virus Res. - 1999. - Vol.61. - P.153-60.

104. Sequence comparison of the L2 and S10 genes of bluetongue viruses from the United States and the People's Republic of China/ K.R. Bonneau, N. Zhang, J.Zhu, F. Zhang, Z. Li, K. Zhang, L. Xiao, W. Xiang and N.J. MacLachlan//Virus Res. - 1999. - Vol.61. - P. 153-60.

105. Sequencing and RT-PCR assays for genome segment 2 of the 24 bluetongue virus serotypes identification of exotic serotypes in the southeastern USA (1999-2006)/ P.P.C. Mertens, N.S. Maan, D.J. Johnson, E.N. Ostlund, and S. Maan// World Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians (WAVLD) - 13th International Symposium Proceeding. - Melbourne, Australia,2007. - P.55.

106. Shimshony, A. Bluetongue in Israel - a brief historical overview/ A. Shimshony// Vet. Ital. - 2004. - Vol.40.,N.3. - P. 116-8.

107. Slingenbergh, J.H.W. Will the new livestock revolution succeed?/ J.H.W. Slingenbergh, G. Hendrickx, G.R.W. Wint// Agri World Vision. - 2002. -Vol.2. -P.31-3.

108. Structure of the bluetongue virus capsid/ D.W. Verwoerd, H.J. Els, E. De Villiers and H. Huismans// J. Virol. - 1972. - Vol.10. - P.783-94.

109. Studies on overwintering of bluetongue viruses in insects/ D.M. White, W.C. Wilson, C.D. Blair and B.J. Beaty// J. Gen. Virol.- 2005. - Vol.86. - P.453-62.

110. Taylor, W.P. and Mellor, P.S. (1994) Distribution of bluetongue virus in Turkey, 1978-81/ W.P. Taylor and P.S. Mellor// Epidemiol. Infect.- 1994. -Vol.112.-P.623-3.

111. The isolation of a bluetongue serotype new to Australia/ G.P. Gard, J.E. Shorthose, R.P. Weir and B.J. Erasmus// Aust. Vet. J. - 1987. - Vol.64. -P. 87-8.

112. The atomic structure of the bluetongue virus core/ J.M. Grimes, J.N. Burroughs, P. Gouet, J.M. Diprose, R. Malby, S. Zientara, P.P.C. Mertens and D. I. Stuart//Nature. - 1998. - Vol.395. -P.470-8.

113. The Crystal-Structure of Bluetongue Virus VP7/ J. Grimes, A.K. Basak, P. Roy and D. Stuart// Nature. - 1995. - Vol.373. - P.67-170.

114. The design of primers and use of RT-PCR assays for typing European BTV isolates: differentiation of field and vaccine strains/ P.P.C. Mertens, N.S. Maan, G. Prasad, A.R. Samuel, A.E. Shaw, A.C. Potgieter, S.J. Anthony and S. Maan// J. Gen. Virol. - 2007. - Vol.88. - P.2811-23.

115. The design of primers and use of RT-PCR assays for typing European BTV isolates: differentiation of field and vaccine strains/ P.P.C. Mertens, N.S. Maan, G. Prasad, A.R. Samuel, A.E. Shaw, A.C. Potgieter, S.J. Anthony and S. Maan// J. Gen. Virol. - 2007. - Vol.88. - P.2811-23.

116. The Highly ordered double stranded RNA genome ofbluetongue virus revealed by crystallography/ P. Gouet, J. M. Diprose, J. M. Grimes, R. Malby, J.N. Burroughs, S. Zientara, D.I. Stuart and P.P.C. Mertens// Cell. - 1999. -Vol.97.-P. 481-90.

117. The isolation ofbluetongue virus from Culicoides collected in the Northern Territory of Australia/ T.D. St George, H.A. Standfast, D.H. Cybinski, A.L. Dyce, M.J. Muller, R.L. Doherty, J.G. Carley, C. Filippich, and C.L. Frazier// Aust. Vet. J. - 1978. - Vol.54. - P.153^1.

118. The NS3 proteins of global strains ofbluetongue virus evolve into regional topotypes through negative (purifying) selection/ U.B. Balasuriya, S.A. Nadler, W.C. Wilson , L.I. Pritchard, A.B. Smythe, G. Savini, F. Monaco, P. De Santis, N. Zhang, W.J. Tabachnick, and N.J. MaclachlanII Vet. Microbiol. -2008.-Vol.126, 91-100.

119. The NS3 proteins of global strains ofbluetongue virus evolve into regional topotypes through negative (purifying) selection/ U.B. Balasuriya, S.A. Nadler, W.C. Wilson, L.I. Pritchard, A.B. Smythe, G. Savini, F. Monaco, P. De Santis, N. Zhang, W.J. Tabachnick and N.J. Maclachlan// Vet. Microbiol. -2008. -Vol.126. -P.91-100.

120. Translocation portals for the substrates and products of a viral transcriptase complex: the Bluetongue virus core/ J.M. Diprose, J.N. Burroughs, G.C. Sutton, A. Goldsmith, P. Gouet, R. Malby, I. Overton, S. Zientara, P.P.C. Mertens, D.I. Stuart and J.M. Grimes // EMBO J. - 2001. - Vol.20. - P.7229-39.

121. Transmission of bluetongue virus in Italy/ G. Savini, M. Goffredo, F. Monaco, P. de Santis and R. Meiswinkel// Vet. Rec. - 2003. - Vol.152. -P.119.

122. Transmission pathways of foot-and-mouth disease virus in the United Kingdom in 2007/ E.M. Cottam, J. Wadsworth, A.E. Shaw, R.J. Rowlands, L. Goatley, S. Maan, N.S. Maan, P.P.C. Mertens, K. Ebert, Y. Li, E.D. Ryan, N. Juleff, N.P. Ferris, J.W. Wilesmith, D.T. Haydon, D.P. King, D.J. Paton and N.J. Knowles // PLoS Pathog. - 2008. -Vol.18. - P.4.

123. Vaccines against bluetongue in Europe/ G. Savini, N.J. MacLachlan, J.M. Sanchez-Vizcaino and S. Zientara// Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. -2008.-Vol.31. - P. 101-20.

124. Vassalos, M. Cas de Fie'vre catarrhale du muton dans Pille de Lesbos (Greece)/ M. Vassalos// Bull. Off. Int.Epizoot. - 1980. - Vol.92. -P.547-55.

125. Veronesi, E. Live attenuated bluetongue vaccine viruses in Dorset Poll sheep, before and after passage in vector midges (Diptera: Ceratopogonidae)/ E. Veronesi, C. Hamblin and P.S. Mellor// Vaccine. -2005. -Vol.23. -P.5509-16.

126. VP2 gene sequence analysis of some isolates of bluetongue virus recovered in the Mediterranean Basin during the 1998-2002 outbreak/ G. Savini, A.C. Potgieter, F. Monaco, O. Mangana-Vougiouka, K. Nomikou, H. Yadin and V. Caporale// Vet Ital. - 2004. - Vol.40. - P.473-8.

127. VP2 segment sequence analysis of some isolates of bluetongue virus recovered in the Mediterranean Basin during the 1998-2003 outbreak/ A.C. Potgieter, F. Monaco, O. Mangana, K. Nomikou, H. Yadin and G. Savini// J. Vet. Med. B. Infect. Dis. Vet. Public Health. - 2005. - Vol.52. - P.372-9.

128. VP2 segment sequence analysis of some isolates of bluetongue virus recovered in the Mediterranean Basin during the 1998-2003 outbreak/ A.C. Potgieter, F. Monaco, O. Mangana, K. Nomikou, H. Yadin and G. Savini// J. Vet. Med. B. Infect. Dis. Vet. Public Health. - 2005.- Vol.52. - P.372-9.

129. Wade-Evans, A.M. Development of the polymerase chain reaction for the detection of bluetongue virus in tissue samples/ A.M. Wade-Evans, P.P.C. Mertens and C.J. Bostock// J. Virol. Methods. - 1990. - Vol.30. - P. 15-24.