Разработка тест-систем для идентификации возбудителя весенней виремии карпа на основе методов анализа генома тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, кандидат биологических наук Щелкунов, Игорь Степанович

• Щелкунов, Игорь Степанович
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Щелкунов, Игорь Степанович

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Аквакультура: состояние и перспективы развития.

2.2. Общая характеристика возбудителя болезни. ф 2.2.1. География распространения болезни.

2.2.2. Эпизоотическая обстановка по болезни в России.

2.2.3. Клинические признаки и патолого-анатомические изменения.

2.2.4. Строение вириона

2.2.5 Антигенные свойства вируса.

2.3. Диагностика болезни.

2.3.1. Идентификация возбудителя серологическими методами.

2.3.2. Идентификация рабдовирусов рыб на основе анализа генома.

2.4. Филогенетический анализ генома рабдовирусов рыб.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка тест-систем для идентификации возбудителя весенней виремии карпа на основе методов анализа генома»

Весенняя виремия карпа (ВВК) — остропротекающая высоко контагиозная вирусная болезнь карпа, Cyprinus carpio L., характеризующаяся развитием септического процесса и массовой гибелью рыб. Заболевание проявляется в виде экссудативно-геморрагического синдрома («краснуха»), обусловленного размножением вируса в эндотелии кровеносных капилляров и почках, что приводит к нарушению водно-минерального баланса и выходу плазмы и форменных элементов крови в окружающие ткани и полости тела [ 66, 145 ]. По классификации Международного эпизоотического бюро (МЭБ) ВВК относится к категории особо опасных («декларируемых») болезней рыб [ 113 ].

В аквакультуре вспышки заболевания у карпа обычно происходят весной, спустя 2-3 недели после пересадки рыб из зимовальных в нагульные пруды. Они провоцируются техногенными стрессами и сопровождаются массовой гибелью рыб (преимущественно годовиков и двухлетков, реже -двухгодовиков и производителей), достигающей 30-40, а иногда и 70% [ 69 ]. При совместном выращивании в поликультуре с карпом возбудитель заболевания выделяли также от белого амура, белого и пестрого толстолобиков, золотого карася, европейского сома и щуки.

Болезнь широко распространена в европейских странах с развитым карповодством, с 2002 г. регистрируется в США [ 73 ], а в 2004 г. была выявлена в Китае [ 101 ]. В последние годы наблюдается тенденция к глобализации ВВК. Основным путем распространения болезни являются межхозяйственные перевозки живой рыбы, в т.ч. декоративных карповых рыб [113].

В бывшем СССР возбудитель ВВК был впервые выделен от больных рыб Н.И. Рудиковым (1972). Позднее было установлено, что ВВК широко распространена в рыбоводных хозяйствах центральной и южной зон Европейской части страны (в т.ч. в Белгородской, Курской, Липецкой, Ростовской областях и Краснодарском крае России, а также в Украине,

Молдове, Беларуси, Литве и Грузии), где она вызывала гибель до 30-57% карпа - основного объекта выращивания в отечественной аквакультуре [ 19 ]. В 1993-1995 и 2004 г.г. ВВК отмечали в рыбоводных хозяйствах Свердловской и Тверской областей, а с 2003 г. болезнь регистрируется в Московской области [ 11 ] . В современных условиях существует реальная опасность дальнейшего распространения ВВК по стране, что создает угрозу больших материально-экономических потерь в будущем, когда отечественное рыбоводство вновь заработает в полную силу.

В настоящее время диагноз на ВВК в России ставят на основании выполнения комплекса классических требований, включающих анализ эпизоотологических данных, клинических признаков заболевания и патолого-анатомических изменений, подкрепленный результатами вирусологических исследований по выделению и серологической идентификации вируса с последующей постановкой биопробы. Однако, оставаясь «золотым стандартом», традиционные вирусологические методы уже не в полной мере отвечают требованиям сегодняшнего дня. Хотя диагностика ВВК за последние годы была значительно усовершенствована, сегодня она остро нуждается в новых более быстрых, чувствительных и специфичных методах индикации и идентификации возбудителя. Коммерческие наборы реагентов для быстрого выявления вируса с помощью поликлональных и моноклональных антител производят фирмы в Чехии, Германии и Бельгии, однако эти наборы недостаточно специфичны. Разрабатываемые за рубежом молекулярно-генетические методы диагностики ВВК (зондовой антирибонуклеазной защиты, полугнездовой и гнездовой полимеразной цепной реакции, гибридизации in situ и обратной гибридизации) [ 25, 55, 94, 101, 124 ], обладая набором важных достоинств, имеют ряд недостатков, ограничивающих их использование на практике. Среди них такие как необходимость использования культур клеток рыб, радиоактивных изотопов и другие.

Выполненные в последние годы научные разработки отечественных и зарубежных авторов показали, что использование для диагностики ВВК избирательной амплификация участков вирусного генома с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), дополняя серологические методы, значительно расширяет возможности обнаружения вируса непосредственно в клинических образцах.

Одним из перспективных направлений является применение метода ^ ПЦР с последующим рестрикционным анализом и секвенированием продуктов ПЦР. Сопоставление первичных структур аналогичных участков генома различных изолятов позволяет провести дифференциацию штаммов и изолятов вируса ВВК. Преимуществом этих методов является их высокая чувствительность, специфичность, быстрота и безопасность. Поэтому изучение генома возбудителя с целью совершенствования имеющихся и разработки новых более эффективных средств диагностики и профилактики данного заболевания является актуальной научной проблемой.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы является разработка тест-систем для идентификации возбудителя весенней виремии карпа на основе методов анализа генома.

В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:

- сконструировать ДНК-зонды, комплементарные различным участкам £ генома вируса ВВК, и оптимизировать условия проведения гибридизации;

- определить специфичность и чувствительность метода молекулярной гибридизации для идентификации РНК вируса весенней виремии карпа на панели вирусных изолятов;

- подобрать специфичные праймеры для амплификации различных участков генома вируса весенней виремии карпа и оптимизировать условия проведения ПЦР;

- определить специфичность и чувствительность метода полимеразной цепной реакции для идентификации РНК вируса весенней виремии карпа в зараженной культуре клеток и клиническом материале от экспериментально зараженных и естественно больных рыб;

- провести дифференциацию различных штаммов и полевых изолятов вируса ВВК на основе анализа первичной последовательности гена нуютеопротеина и рестрикционного анализа ПЦР-продуктов.

Ф Научная новизна:

- впервые клонированы последовательности генома отечественного референсного штамма 3JI4 вируса ВВК и получены фаговые ДНК-зонды, пригодные для выявления РНК вируса ВВК в зараженной культуре клеток и патматериале от больных рыб методом дот-гибридизации;

- определены праймеры и отработаны условия постановки ПЦР, позволяющие идентифицировать вирус ВВК в зараженной культуре клеток и клиническом материале от рыб;

- впервые определена нуклеотидная последовательность фрагмента гена нуютеопротеина 7 европейских и 12 отечественных изолятов вируса ВВК с целью установления их генетического родства;

- при дифференциации изолятов вируса ВВК разного географического происхождения методом рестрикционного анализа продуктов ПЦР установлена высокая однородность нуклеотидных последовательностей генома европейских изолятов, отличающая их от изолятов, выделенных в ф бывшем СССР;

- на основе анализа вариабельной части гена вирусного нуклеопротеина разработана штаммоспецифическая ПЦР, позволяющая быстро выявлять представителей отечественной мажорной геногруппы вируса

Практическая значимость. На основании полученных экспериментальных данных разработаны инструкции по применению методов молекулярной гибридизации и ПЦР для выявления РНК вируса весенней виремии карпа, которые прошли комиссионные испытания, одобрены Ученым советом и утверждены заместителем генерального директора ФГУП «ВНИИПРХ».

Разработанные методы и наборы препаратов рекомендованы для включения в схему лабораторных исследований при диагностике болезни.

Предложен способ дифференциации штаммов и полевых изолятов вируса ВВК с помощью рестрикционного анализа ПЦР-продукта и штаммоспецифической ПЦР.

Основные положения, выносимые на защиту:

- наборы препаратов для выявления РНК вируса ВВК на основе методов молекулярной гибридизации и полимеразной цепной реакции с использованием праймеров, комплементарных различным областям вирусного генома;

- способы идентификации полевых изолятов вируса ВВК в зараженной культуре клеток и пробах патологического материала, полученных от экспериментально зараженных рыб, из различных регионов Российской Федерации и зарубежья;

- методы дифференциации штаммов и полевых изолятов вируса ВВК с помощью ПЦР и рестрикционного анализа.

Апробация результатов работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ФГУП «ВНИИПРХ» и совместных заседаниях Научно-консультативного совета Межведомственной ихтиологической комиссии и Секции патологии рыб и охраны гидробионтов Отделения ветеринарной медицины РАСХН (1999 - 2005 г.г.), Научно-практической конференции «Проблемы охраны здоровья рыб в аквакультуре» (21-22 ноября 2000 г., г. Москва), Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы иммунологии, патологии и охраны здоровья рыб» (16-18 июля 2003 г., пос. Борок Ярославской обл.); Второй международной научной конференции «Биотехнология - охране окружающей среды» (25-27 мая 2004, МГУ, г. Москва); Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (26-27 мая 2005 г., г. Щелково Московской обл.); Всероссийской научно-практической конференции-семинаре «Эпизоотологический мониторинг в аквакультуре: состояние и перспективы» (13-14 сентября 2005 г., г. Москва); Четвертом Международном симпозиуме по вирусам низших позвоночных (12-15 мая 1998 г., г. Веймут, Великобритания); Первом и Втором российско-американском симпозиумах по охране здоровья рыб и других гидробионтов (12-19 июля 1998 г., п. Рыбное Московской обл. и 21-28 сентября 2003 г., г. Шефердстаун, США); Девятой и Десятой международных конференциях Европейской ассоциации ихтиопатологов (19-24 сентября 1999 г., Родос, Греция и 9-14 сентября 2001 г., г. Дублин, Ирландия); Семинаре референтных лабораторий Евросоюза по диагностике болезней карповых рыб (2-4 июня 2003 г., г. Веймут, Великобритания) и 30-ой Восточной конференции по охране здоровья рыб (13-17 июня 2005 г., г. Шефердстаун, США).

Публикация результатов. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ.

Участие соискателя в получении научных результатов.

Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Конструирование плазмидных и фаговых ДНК-зондов, синтез нерадиоактивной метки, подбор и синтез олигонуклеотидов, отработку метода ПЦР и рестрикционного анализа продуктов амплификации проводили совместно с к.х.н. Орешковой С.Ф.

В выполнении отдельных разделов работы оказали помощь: старший научный сотрудник Т.И. Щелкунова, кандидат биологических наук Тикунова Н.В. и доктор биологических наук Ильичев А.А., которым автор выражает искреннюю признательность.

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Щелкунов, Игорь Степанович

6. ВЫВОДЫ

6.1. Путем клонирования в однонитевой фаговый вектор М13шр8 фрагментов размером 248 н.о. М-гена вируса ВВК (позиции 134 - 381) и 405 н.о. N-гена (позиции 979 - 1383) получены и помечены биотином два ДНК-зонда: зонд M13-SVCV-M8 (на геномную РНК вируса) и зонд M13-SVCV-N8 (на вирусную мРНК). Оптимальные результаты выявления РНК вируса ВВК при использовании обоих зондов были достигнуты после 16-часовой гибридизации при температуре 65°С в гибридизационном растворе, состоящем из 6xSSC, 5xDenhardt, 0,5% SDS, 0,05 мг/мл денатурированной ДНК лосося и ДНК-зонда в концентрации 100 нг/мл.

6.2. Оба зонда согласованно работали на панели вирусных изолятов и клиническом материале от рыб. Методом дот-гибридизации зонды специфически выявляли РНК 19-и испытанных штаммов вируса ВВК и не реагировали с образцами нуклеиновых кислот других вирусов, контрольных культур клеток и тканей здоровых рыб. ДНК-зонды выявляли вирус ВВК с г с1 титром не ниже 10 ТЦД50 в пятне (примерно 10 ТЦД5о/см ).

6.3. В результате анализа первичных последовательностей генома вируса весенней виремии карпа подобран набор из 8 специфичных праймеров для амплификации различных участков гена вирусного нуклеопротеина (N-гена) и оптимизированы условия проведения ПЦР-анализа.

6.4. Использование в первом раунде ПЦР праймеров N3 и N5 (отжиг при 60°С, продукт 418 п.н.) и во втором раунде праймеров N3 и N4 (отжиг при 62°С, продукт 388 п.н.) позволяло в обоих раундах специфически выявлять РНК всех 10-и испытанных изолятов вируса ВВК. Специфичность получаемых продуктов была подтверждена их гидролизом эндонуклеазой рестрикции Rsal на фрагменты ожидаемого размера. Образования аналогичных продуктов с образцами нуклеиновых кислот других вирусов, контрольных культур клеток и тканей здоровых рыб не наблюдали.

6.5. Чувствительность выявления вируса ВВК методом ПЦР в зараженной культуре клеток составила 1064 ТЦДзо/мл в первом раунде и достигала 10"0'9 ТЦД50/мл. во втором. Чувствительность выявления вируса в клинических материалах от больных рыб варьировала в зависимости от вида л материала и достигала 10 ТЦД5о/см . По частоте выявления вируса у рыб со скрытым и хроническим течением ВВК-инфекции метод полугнездовой ПЦР в 12 и более раз превосходил традиционный метод выделения вируса на культуре клеток (соответственно 100% и 8,3%), тогда как при тестировании клинических образцов от рыб с острой формой ВВК уступал ему примерно в 2 раза.

6.6. Предложен метод генетического типирования вируса ВВК с помощью рестрикционного анализа с использованием набора из 6 эндонуклеаз рестрикции (Rsal, Clal, BsoMAI, Tru9I, Psil и Fokl) фрагмента N1-N2 гена вирусного нуклеопротеина. Метод позволил разделить 24 исследованных штамма вируса ВВК на пять генетических групп: две мажорные (соответственно, европейские и отечественные изоляты) и три переходные минорные (отечественные изоляты) группы. Установлено, что европейские и отечественные изоляты вируса образуют два самостоятельных генетических кластера, что подкрепляет имеющиеся литературные данные и сделанный нами ранее вывод об их антигеном различии. При этом европейские изоляты вируса отличает более высокий уровень взаимной гомологии N-гена (около 95%). Выявлена географо-генетическая корреляция для групп 2 и 4, представленных изолятами из бывшего СССР.

6.7. Предложенная штаммоспецифическая ПЦР позволяет дифференцировать российские изоляты 3JI4, 1.4 и N3, входящие в мажорную генетическую группу 5, от пяти исследованных европейских изолятов и российских изолятов Уд и Р4, относящихся к другим генетическим группам. Это создает возможность для быстрого выявления представителей основной генетической группы вируса ВВК, циркулирующих на территории бывшего СССР.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

7.1. Разработаны и утверждены заместителем генерального директора ФГУП «ВНИИПРХ» «Инструкция по применению тест-системы для идентификации вируса весенней виремии карпа методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот» и «Инструкция по выявлению РНК вируса весенней виремии карпа методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции» и наборы препаратов к ним.

7.2. Разработанные тест-системы на основе дот-гибридизации и полимеразной цепной реакции могут быть использованы для идентификации штаммов и полевых изолятов вируса ВВК и рекомендованы для включения в схему и порядок лабораторных исследований при диагностике болезни.

7.3. Предложенные методы штаммоспецифической ПЦР и рестрикционного анализа вариабельного участка N1-N2 гена нуклеопротеина могут быть использованы для тонкой дифференциации и генетического типирования вируса, в том числе без выделения его от рыб. Это позволит оперативно отслеживать перемещение вирусных штаммов по территории страны и своевременно принимать необходимые меры профилактики и борьбы с болезнью.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Щелкунов, Игорь Степанович, 2005 год

1. Гончаров, Г.Д. Серологическая диагностика, как новое доказательство вирусной природы "краснухи" карповых / Г.Д. Гончаров // Рыбное хозяйство. -1949.- №4.- С. 45-47.

2. Гончаров, Г.Д. Вирусная краснуха рыб в СССР и за рубежом / Г.Д. Гончаров // Совещ. по болез. рыб. 22-27 марта 1957. Тез. докл. М., Л., 1957.-С. 28.

3. Грищенко, Л.И. Патоморфологические изменения при естественном течении весенней вирусной болезни карпов / Л.И. Грищенко // II Всесоюз. симпоз./ Новые методы леч. инф. бол. рыб. Тез. докл. М., 1975.-С. 26-27.

4. Литвиненко, В.В. Выявление антител против Rhabdovirus carpio в сыворотке крови рыб при помощи люминесцентной микроскопии / В.В. Литвиненко, Ю.Д. Тимниханов // Рыбное хозяйство. 1989. -Вып. 43.-С. 62-64.

5. Надточей, Г.А. Морфология возбудителя весенней вирусной болезни рыб / Г.А. Надточей, Н.И. Рудаков // Бюллетень ВИЭВ. М., 1975.- Вып. 20.- С. 20-21.

6. Осадчая, Е.Ф. Выделение цитопатогенных агентов от карпов при острой форме краснухи / Е.Ф.Осадчая // Ветеринария.- 1964.- №9.- С. 29.

7. Осадчая, Е.Ф. Рабдовирусы, выделенные от больных краснухой карпов, и некоторые их свойства / Е.Ф.Осадчая // Рыбное хозяйство. -1977.-№5.- С. 36-39.

8. Осадчая, Е.Ф. Патогенность вирусов, выделенных при краснухе (весенней виремии) карпов, и клинико-морфологическая характеристика естественного течения болезни и в эксперименте / Е.Ф.Осадчая, А.П. Руденко // Рыбное хозяйство.- 1981,- Вып. 32.- С. 66-70.

9. Осадчая, Е.Ф. Выделение рабдовирусов при хроническом течении краснухи карпов / Е.Ф.Осадчая, В.В. Литвиненко, Ю.Д. Тимниханов // Тез. докл. Республ. научн.-практ. конф. Киев, 1982. - С. 63-64.

10. Пичугина, Т. Д. Сравнительное изучение изолятов возбудителя весенней вирусной болезни рыб в реакции нейтрализации / Т. Д. Пичугина // Труды ВИЭВ / Проблемы ветеринарной иммунологии.-М., 1983.-С. 141-143.

11. Пичугина, Т. Д. Весенняя виремия карпов / Т. Д. Пичугина, М. Н. Борисова, Е. А. Завьялова, И. С. Щелкунов, Т. И. Щелкунова // Ветеринария. 2004.- №5.- С. 28-30.

12. Рудаков, Н.И. Выделение вируса от карпа / Н.И. Рудаков // I Всес. симп. по инфекц. болезням рыб / Профилактика, лечение и диагностика инфекционных болезней рыб. Тез. докл. М., 1972.- С. 62-65.

13. Рудаков, Н.И. Весенняя вирусная болезнь рыб / Н.И. Рудаков // Ветеринария. 1975.- №6.- С. 64-66.

14. Рудаков, Н.И. Диагностика весенней вирусной болезни рыб / Н.И. Рудаков // II Всесоюз. симпоз./ Новые методы леч. инф. бол. рыб. Тез. докл. М., 1975.-С. 93-95.

15. Рудаков, Н.И. Свойства возбудителя весенней вирусной болезни / Н.И. Рудаков, Т.Д. Пичугина, М.К. Анисимов // II Всесоюз. симпоз./ Новые методы леч. инф. бол. рыб. Тез. докл. М., 1975 С. 96-97.

16. Рудаков, Н.И. Особенности течения вспышек весенней вирусной болезни в зависимости от погодных условий / Н.И. Рудаков, Т.Д. Пичугина // Тез. докл. V Всес. симп. по инфекц. болезням рыб. М., 1986. - С. 86-87.

17. Факгорович, К.А. Гистологические изменения в печени, почках, коже и головном мозгу больных краснухой рыб / К.А. Факгорович // Известия ГосНИИОРХ. JT., 1969.-Т. 69.-С. 83-102.

18. Щелкунов, И.С. О выделении вируса от белого толстолобика с синдромом краснухи / И.С. Щелкунов, JI.H. Юхименко, И.Д. Тромбицкий, Т.И. Щелкунова, А.П.Манчу // Экспресс-информ. ЦНИИТЭИРХ. 1984. - Вып. 4. - С. 3-7.

19. Щелкунов, И. С., Необычный случай осеннего выделения Rhabdovirus carpio от карпа/ Щелкунов И.С., Т.И. Щелкунова // Тез. докл. IX Всес. сов. по паразитам и болезням рыб. Д., 1990. -С. 149-150.

20. Ahne, W. A rhabdovirus isolated from grass carp (Cteno-pharyngodon idella Val) / W. Ahne //Archives of Virology.- 1975.-Vol. 48-P. 181-185.

21. Ahne, W. Fruhlingsviramie der Karpfen. Atiologie,Vorkom-men und Bekampfung. Tagungsbericht des Seminars der DVG/ W. Ahne // Diagnose und Behandlungen von Fischkrankheiten, Munchen- 1978. -112 S.

22. Ahne, W. Untersuchungen uber die akute Form der infekti-osen Bauchwassersucht bei Cypriniden (Cyprinus carpio, Cte-nophaiyngodon idella) /W. Ahne //Munchen.-1979.-Vol. 19.-P. 1-112.

23. Ahne, W. Egtved virus: occurrence of strains not clearly identifiable by means of virus neutralization tests / W. Ahne, P.E.V. Jorgensen, NJ. Olesen, W. Schafer, P. Steinhagen// J. Appl. Ichthyol. -1986. Vol. 2. - P. 187-189.

24. Ahne, W. A ribonuclease protection assay can distinguish spring viraemia of carp virus from pike fry rhabdovirus / W. Ahne , G. Kurath, J.R. Winton // Eur. Ass. Fish Pathol.- 1998. -Vol.18.- P. 220224.

25. Ahne, W. Spring viraemia of carp / W. Ahne, H.V. Bjorklund, S. Essbauer, N. Fijan, G. Kurath, J.R. Winton //Dis. Aquat. Org.- 2002. -Vol. 52. -P. 261-272.

26. Alonso, M. Nested PCR improves detection of infectious hematopoietic necrosis virus in cells coinfected with infectiouspancreatic necrosis virus / M. Alonso, S. Rodriguez, S.I.J. Perez-Prieto // Virol. Methods. 1999. P. 1-9.

27. Ariel, E. Assessment of a commercial kit collection for diagnosis of the fish viruses: IHNV, 1PNV, SVCV and VHSV. / E. Ariel, N. J. Oleson // Bull. Eur. Ass. Fish Pathol. -2001.Vol 21. -P. 6-11.

28. Basurco, B. Genetic diversity and phylogenetic classification of viral hemorrhagic septicemia virus / B. Basurco, P. Vende, A.F. Monnier, J.R.Winton, P.de Kinkelin, A. Benmansour // Vet. Res. -1995. -Vol. 26.- P. 460-463.

29. Bearzotti, M. The glycoprotein of viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV): antigenicity and role in virulence / M. Bearzotti, A.F. Monnier, P. Vcnde, J. Grosclaude, P. de Kinkelin, A. Benmansour // Vet. Ded.- 1995. -Vol. 26.-P. 413-422.

30. Bernard, J. Nucleocapsid gene sequence of a North American isolate of viral haemorrhagic septicaemia virus, a fish rhabdovirus / J. Bernard, M. Bremont, J. Winton//J Gen. Viral.- 1992.- Vol. 73.- P. 1011-1014.

31. Bernard, J. Cloning and sequencing the messenger RNA of the N gene of viral haemorrhagic septicaemia virus / J. Bernard, F. Lecocq-Xhonneux, M. Rossius, M.E. Thiry, P. de Kinkelin, J.// Gen. Virol.-I990.-Vol. 71.-P. 1669-1674.

32. Betts, A.M. Nucleotide sequence analysis of the entire coding regions of virulent and avirulent strains of viral haemorrhagic septicaemia virus

33. A.M. Betts, D.M. Stone // Virus Genes.- 2000.-Vol. 20.- P. 259-262.

34. Bjorklund, H.V. Comparison of the polymerases (L genes) of spring viraemia of carp virus and infectious hematopoietic necrosis virus / H.V. Bjorklund, E.J. Emmenegger, G. Kurath // Virus Res.- 1995.-Vol. 26.- P. 394-398.

35. Bjorklund, H. Diagnostic methods and reference panel of reagents for detection and typing of fish viruses / H. Bjorklund, N. Lorenzen, T. Vesely, I. Shchelkunov, S. Oreshkova // Consolidated Report 19992001.

36. Bovo, G. Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction / G. Bovo, G. Giorgetti, P.E.V. Jorgensen, N.J. Olesen // Anal. Biochem. -1987. -Vol. 162.- P. 156-159.

37. Bruchhof, B. Differential diagnosis offish pathogenic rhabdoviruses by reverse transcriptase-dependent polymerase chain reaction / B. Bruchhof, O. Marquardt, P.J. J. Enzmann // Viral. Methods.- 1995.-Vol.55.-P. 111-119.

38. Chiou, P.P. Polymerase chain amplification of infectious hematopoietic necrosis virus RNA extracted from fixed and embedded fish tissue / P.P. Chiou, B.S. Drolet, J.C. Leong // J. Aqual. Anim. -1995.-Vol.7.- P. 9-15.

39. Chomczynski, P. Single method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction / P. Chomczynski, N. Sacchi // Anal. Biochem. 1987. - Vol. 162. - P. 156-159.

40. Clerx J. Comparative protein analysis of nonsalmonid fish rhabdoviruses / J. Clerx, M. J. Horzinek// Gen. Virology.-1978. -Vol. 40.- P. 287-295.

41. Dixon, P.P. Rapid detection of fish rhabdoviruses by the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) / P.P Dixon, B.J. Hill // Aquaculture.- 1984.- Vol. 42.- P. 1-12.

42. Einer-Jensen, K. Evolution of the fish rhabdovirus viral haemorrhagic septicaemia virus / K. Einer-Jensen, P. Ahrens, R. Forsberg, N. Lorenzen // J. Gen. Virol.- 2004. Vol. 85.- P. 1167-1179.

43. Einer-Jensen, K. Detection and typing of fish viruses / K. Einer-Jensen, H. Bjorklund, S. Oreshkova, I. Shchelkunov, T. Vesely, N. Lorenzen / Bull. Eur. Ass. Fish Pathol.- 2002. -Vol. 22. -P. 158-165.

44. Emmenegger, E.J. Genetic diversity and epidemiology of theinfectious hematopoietic necrosis vims in Alaska / E.J. Emmenegger,

45. T.R. Meyers, Т.О. Burton, G. Kurath // Ris Aquat. Org.- 2000. -Vol.40.-P. 163-176.

46. Emmenegger, E.J. Genetic characterization of infectious hematopoietic necrosis virus of coastal salmonids stocks in Washington state/ E.J. Emmenegger, G.Kurath//J. Aquat. Anim. Health.-2002.-Vol.14.- P.25-34.

47. Estepa, A. Detection of trout haemorrhagic septicaemia rhabdovirus by capture with monoclonal antibodies and amplification with PCR / A. Estepa, C.D., De Bias, F. Ponz, J.M. Coil // Vet. Res.- 1995.-Vol.26.1. P. 530- 532.

48. Fellmann, F. Simplified protocol of solid-phase cDNA libraries for multiple PCR amplification / F. Fellmann, J-L. Pretet, D. Fellmann // Biotechniques.- 1996.- Vol. 21.- P. 766-770.

49. Fichtner, D. Characterisation of viral haemorrhagic septicaemia (VHS) virus isolates / D. Fichtner, S. Bergmann, P. Enzmann, F. Weiland, H.

50. Г Granzow // Bull. Eur. Ass. Fish Pathol.- 1998.- Vol.18. P. 56-61.

51. Fijan, N. Isolation of the viral causative agent from the acute form of infectious dropsy of carp/ N. Fijan, Z. Petrinic, D. Sulimanovic, L.O. Zwillenberg// Vet. Arh- 1971.-Vol.-P. 125-138.

52. Fijan, N. Isolation of Rhabdovirus carpio from sheatfish, Silurus glanis, fry / N. Fijan, Z. Matasin, Z.s. Jeney, J. Olah, L.O. Zwillenberg // Proc. Int. Seminar "Fish, Pathogens and Environment in European Polyculture".- 1981.- P. 48-58.

53. Garver, K.A. Two distinct Phylogenetic clades of infectious hematopoietic necrosis overlap within the Columbia river basin / K.A Garver, R.M. Troyer, G. Kurath // Dis. Aquat. Org. 2003. - Vol. 55. -P. 187-203.

54. Goncharov G.D. Rubella, a viral fish disease / G.D. Goncharov // Ann. of the N.Y. Acad, of Sci. / 1965. Vol. 126. - P. 521-523.

55. Goodwin, A.E. First report of spring viraemia of carp virus (SVCV) in North America / Goodwin A.E. //J. Aquat. Anim Health. 2002 - Vol. 14. - P. 161164.

56. Gravell, M. A permanent cell line from the fathead minnow (Pimephales promelas) / M. Gravell, R. Malsberger, N.Y. Ann // Acad. Sci.- 1965. -Vol. 126.-P. 555-565.

57. Gupta, K.C. 5X terminal sequences of spring viraemia of carp virus RNA synthesized in vitro / K.C.Gupta, D.H.L. Bishop, P.Roy // J. Virol. -1979.-Vol. 30. -P. 735-745.

58. Hattenberger-Baudouy, A.M. Serum neutralization test for epidemiological studies of salmonid rhabdoviruses in France / A.M. Hattenberger-Baudouy, M. Danton, G. Merle, P. de Kinkelin // Vet. Res.- 1995.-Vol. 26.-P. 512-520.

59. Hedrick, R.P. Host and geographic range extensions of the North American strain of viral hemorrhagic septicemia virus / R.P. Hedrick, W.N. Batts, S. Yun, G.S. Traxler, J. Kaufman, J.R. Winton // Dis. Aquat. Org.- 2003. Vol. 55. -P. 211-220.

60. Hill, B. Procedures for the isolation and identification of IPN, VHS, IHN and SVC viruses from diseased fish / B. Hill // Fisheries research technical report, Lowestoft. -1976-Vol.- 27.:P. 1-16.

61. Hoffmann, B. Determination of the complete genomic sequence and analysis of the gene products of the virus of spring viremia of carp, a fish rhabdovirus/ B. Hoffmann, H.Schutz, T.Mettenleiter// Virus Res. -2002.- Vol. 84.-P. 89-100.

62. Holland, J. Rapid evolution of RNA genomes/ J. Holland, K. Spindler, F. Horodyski, E. Grabau, S. Nichol, S.VandePol // Science.- 1982.- Vol. 215.-P. 1577-1585.

63. Hsu, Y.L. A comparison of detection methods for infectious hematopoietic necrosis virus / Y.L. Hsu, J.C. Leong // J. Fish Dis.-1985.- Vol. 8.-P. 1-12.

64. Huang, C. Characterization of the infectious hematopoietic necrosis virus glycoprotein using neutralizing monoclonal antibodies / C. Huang, M.S. Chien, M. Landolt, J. Winton, // Dis. Aqual. Org.- 1994.-Vol. 18. P. 29-35.

65. Huang, С. Mapping the neutralizing epitopes on the glycoprotein of * infectious haematopoietic necrosis virus, a fish rhabdovirus / C. Huang,

66. M.S. Chien, M. Landolt, W. Batts, J. Winton // J. Gen. Virol.- 1996.-Vol. 77.- P. 3033-3040.

67. Ke, L.D. A reliability test of standard-based quantitative PCR: exogenous vs endogenous standards / L.D. Ke, Z. Chen, W.K. Yung // Mol. Cell. Probes.- 2000. -Vol.14. P. 127-135.

68. Kim C.H. Neutralization resistant variants of infectious hematopoietic necrosis virus have altered virulence and tissue tropism/ C.H. Kim, J.R Winton, J.C.Leong//J. Virol. 1994. - Vol. 68. - P. 8447-8453.

69. Kim, S.J. Detection of fish virus by using immunomagnetic separation and polymerase chain reaction (IMS-PCR) / S.J. Kim, H.K. Oh, T-J. Choi //J. Korean Fish. Soc.- 1997.- Vol.30.-P. 948-955.

70. Kiuchi, A. Comparison of the primary sequence of spring viraemia of carp virus M protein with that of vesicular stomatitis virus / A. Kiuchi, P. Roy// Virology.- 1984. -Vol.134. -P. 238-243.

71. Kocan, R. North American strain of viral hemorrhagic septicemia virus is highly pathogenic for laboratory-reared Pacific herring / R. Kocan, M. Bradley, N. Elder, T. Meyers, W. Bans, J. Winton // J. Aquat. Anim. 1997.Vol.9.-P. 279-290.

72. Koutna, M. Identification of spring viraemia of carp virus (SVCV) by combined RT-PCR and nested PCR / M. Koutna, T. Vesely, I. Psikal, J. Hulova // Dis. Aquat. Org. 2003. -Vol.55.- P. 229-235.

73. Kurath, G. The NV genes of fish rabdoviruses: development of RNase protection assays for rapid assessment of genetic variation / G. Kurath, K.H. Higman, H.V. Bjorklund // Vet. Res.- 1995. Vol.26.- P. 477485.

74. Kurath, G. Phylogeography of infectious hematopoietic necrosis virus in North America / G. Kurath, R.M. Troyer, E.J. Emmenegger, K. Einer-Jensen, E.D. Anderson//J. Gen.Virol.-2003.- Vol.84.- P.803-814.

75. Lannan, C.N. Fish cell lines: establishment and characterization of nine cell lines from salmonids/ C.N. Lannan, J.R. Winton, J.L. Fryer // In vitro. 1984.- Vol. 20. - P. 671-676.

76. Lannan, C.N. Fish cell culture: A protocol for quality control / C.N. Lannan//J. Tiss. Cull. Methods.- 1994.- Vol.16.- P.95-98.

77. Leong, J. Strains of infectious hematopoietic necrosis (1HN) virus may be identified by structural protein differences / J. Leong, Y.L. Hsu, H.M. Engelking, D. Mulcahym // Dev. Biol. Stand.- 1981.-Vol.49.-P. 43-55.

78. Leong, J.C. Molecular biological tools to detect fish pathogens / J.C. Leong // J. Fish Biol.- 1995.- Vol.47.-P. 61-75.

79. Liu, C.T.-Y. Detectionof spring viraemia of carp virus (SVCV) in fish tissues by semi-nested RT-PCR/ C.T.-Y. Liu, N.T. Schmidt, D.M. Stone// The Forth Intern. Symp. on Viruses of Lower Vertebrates. Book of Abstracts.- Weymouth, UK, 1998.- PP-05.

80. Lorenzen. N. Affinity purification of the structural proteins of a fish rhabdovirus by the use of monoclonal antibodies / N. Lorenzen // J. Virol. Methods.- 1992.-Vol. 38.-P. 297-303.

81. McAllister, P.E. Identification of the three serotypes of viral hemorrhagic septicemia virus by immunoblot assay using antiserum to serotype F1 / P.E. McAllister, W.J. Owens // Bull. Eur. Ass. Fish Palhol.- 1987.-Vol. 7.- P. 90-92.

82. McAllister, P.E. Immunoblot assay: A rapid and sensitive method for identification of salmonid viruses / P.E. McAllister, W.B. Schill // J. Wildl. Dis.- 1986.-Vol.22. -P. 468-74.

83. McCain, B.B. Antigenic relationships in a group of three viruses of salrnonid fish by cross neutralization / B.B. McCain, J.L. Fryer, K.S. Pilcher // Proc. Soc. Exp. Biol. Med.- 1971.-Vol. 137.-P. 1042-1046.

84. Morzunov, S.P. The complete genome structure and phylogenetic relationship of infectious hematopoietic necrosis virus/ S.P. Morzunov, J.R. Winton, S.T. Nichol // Vir. Res.- 1995.-Vol. 38.-P. 175-192.

85. Oshima, K.H. The genetic diversity and epizootiology of infectious hematopoietic necrosis virus / K.H. Oshima, K.H. Higman, C.K. Arakawa et.al. // Vir. Res.- 1995.-Vol. 35.-P. 123-141.

86. Roy, P. Characterization of spring viraemia of carp virus mRNA species and the 3' sequence of the viral RNA / P. Roy, K.C. Gupta, A. Kiuchi // Virus Res.- 1984.- Vol.l.-P. 189-202.

87. Sanger, F. DNA sequencing with the chain-terminating inhibitors/ F. Sanger, S. Nicklen, A.R. Coulson// Pros. Natl. Acad. Sci. USA.- 1977.1. Vol. 75.- P. 5453-5467.

88. Sanz, F. A. Techniques for diagnosing viral diseases of salmonid fish / F. A. Sanz, J. M. Coil // Dis. Aquat. Org.- 1992.-Vol. 13.-P. 211-223.

89. Sanz, F. Monoclonal antibodies against the structural proteins of viral haemorrhagic septicaemia virus isolates / F. Sanz, B. Basurco, M. Babin // J. Fish Dis.- 1993.-Vol. 16.-P. 53-63.

90. Shutze, H. Complete genomic sequence of viral hemorrhagic septicemia virus, a fish rhabdovirus / H. Shutze, E. Mundt, T.C. Mettenleiter//Virus Genes.- 1999.-Vol. 19. -P. 59-65.

91. Snow, M. Analysis of the nucleoprotein gene identifies distinct lineages of viral haemorrhagic septicaemia virus within the European marine environment/ M. Snow, C.O. Gunningham, W.T. Melvin, G. Kurath // Vims Res.- 1999.-Vol. 63.-P. 35-44.

92. Steinhauer, D.A. Rapid evolution of RNA viruses/ D.A. Steinhauer, J.J. Holland// Ann. Rev. Microbiol. 1987. - Vol. 41. - P. 409-433.

93. Strommen, H.K. Detection of viral haemorrhagic septicaemia (VHS) virus in fish tissues by semi-nested polymerase chain reaction (PCR) / H.K. Strommen, D.M. Stone // Methodology in Fish Disease Res.-1998.- P.203-209.

94. Takano, R. Isolation of viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV) from wild Japanese flounder, Paralichthys olivaceus/ R. Takano, T. Nishizawa, M. Arimoto, K. Muroga // Bull. Eur, Ass. Fish Pathoi.-2000.-Vol. 20. P. 186-192.

95. Thiery, R. Phylogenetic analysis of viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV) isolates from France (1971-1999)/ R.Thiery, C. de

96. Boisseson, J. Jeffroy, J. Castric, P. de Kinkelin, A. Benmansour// Dis. Aquat. Org. 2002. - Vol. 52.- P. 29-37.

97. Troyer, R.M. Genetic analyses reveal unusually high diversity of infectious hematopoietic necrosis virus in rainbow trout aquaculture/ R.M. Troyer, S.E. La Patra, G. Kurath // J. Gen. Virol.- 2000.-Vol.81.-P.2823-2832.

98. Troyer, R.M. Molecular epidemiology of infectious hematopoietic necrosis virus reveals complex virus traffic and evolution within southern Idaho aquaculture / R.M. Troyer, G. Kurath// Dis. Aquat. Org. -2003. Vol. 55.- P. 175-185.

99. Vestergaard Jorgensen, P.E. Egtved virus: antigenic variation in 76 isolates examined in neutralization tests and by mean of fluorescent antibody technique / P.E. Vestergaard Jorgensen // Diseases of Fish. Academic Press.- 1972.- P. 333-339.

100. Williams, K. Multiplex reverse transcriptase PCR assay for simultaneous detection of three fish viruses/ K. Williams, S. Blake, A. Sweeney, J.T. Singer, B.L. Nicholson//J. din. Microbiol. 1999. -Vol. 37.-P. 4139-4141.

101. Winton, J.R. Neutralizing monoclonal antibodies recognize antigenic variants among isolates of infectious hematopoietic necrosis virus/ J.R. Winton, C.K.Arakawa, C.N. Lannan, J.L. Fryer // Dis. Aquut. Org.-1988.-Vol.4.-P. 199-204.

102. Winton, J.R. Evolution of fish rhabdoviruses/ J.R. Winton//In: Proceedings of the OJI International Symposium on Salmonid Diseases.

103. Hokkaido University Press.- Sapporo, Japan, 1992,- P. 88-95.

104. Wolf, K. Fish Viruses and Fish Viral Diseases/ K. Wolf// Cornell University Press, Ithaca,-NY, 1988. 476 p.

105. Yoshinaka, T. Detection of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) using RT-PCR combined with tissue culture / T. Yoshinaka, Y. Hori, A. Motonishi, K. Kasai // Bull. Nail. Salmon Res. Cent.- 1998.-Vol.l.- P. 29-34.

106. Yoshinaka, T. Detection of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) by using polymerase chain reaction (PCR) combined with the most probable number (MPN) method / T. Yoshinaka, M. Yoshimizu, Y. Ezura//Aquat. Anim. 1999.-Vol. 11.-P. 154-157.

107. Yoshinaka, T. Detection and identification of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) by reverse transcription (RT)-polymerase chain reaction (PCR) / T. Yoshinaka, M. Yoshimizu, T. Sawabe, Y. Ezura // Fish.Sci.- 1997.-Vol. 63.- P. 592-595.it