Сорбционные свойства и фармакологическая активность некрахмальных полисахаридов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.06, доктор медицинских наук Хотимченко, Максим Юрьевич

• Хотимченко, Максим Юрьевич
• доктор медицинских наук
• 2011

Оглавление диссертации доктор медицинских наук Хотимченко, Максим Юрьевич

Введение

Глава I. Обзор литературы 17 Некрахмальные полисахариды: структура, свойства и фармакологическая активность

1.1. Пектины

1.1.1. Структура пектинов

1.1.2. Физико-химические свойства пектинов

1.1.3. Фармакологическая активность пектинов

1.2. Альгинаты

1.2.1. Сырьевые источники альгинатов

1.2.2. Структура альгинатов

1.2.3. Физико-химические свойства альгинатов

1.2.4. Фармакологическая активность альгинатов

1.3.Фукоиданы

1.3.1. Структура фукоиданов

1.3.2. Физико-химические свойства фукоиданов

1.3.3. Фармакологическая активность фукодинов

1.4.Хитозаны

1.4.1. Структура хитозанов

1.4.2. Физико-химические свойства хитозанов

1.4.3. Фармакологическая активность хитозанов

1.5. Каррагинаны

1.5.1. Сырьевые источники каррагинанов

1.5.2. Структура каррагинанов

1.5.3. Физико-химические свойства каррагинанов

1.5.4. Фармакологическая активность каррагинанов

Глава II. Материалы и методы 63 2.1 Общая характеристика экспериментальных животных

2.2. Общая характеристика изучаемых препаратов

2.3. Экспериментальные методы

2.4. Физиологические методы исследования

2.5. Физико-химические и биохимические методы

2.6. Гематологические методы

2.7. Морфологические методы

2.8. Математическая обработка результатов СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава III. Металлсвязывающая активность некрахмальных полисахаридов

3.1. Отравления тяжелыми металлами: эпидемиология, лечение и профилактика

3.2. Оценка металл-связывающей активности некрахмальных полисахаридов

3.3. Взаимодействие некрахмальных полисахаридов с ионами меди

3.3.1. Кинетика связывания меди полисахаридами

3.3.2. Изменение медь-связывающей способности полисахаридов в зависимости от рН

3.3.3. Параметры сорбционной активности некрахмальных полисахаридов при взаимодействии с медью

3.4. Взаимодействие некрахмальных полисахаридов с ионами свинца

3.4.1. Кинетика связывания свинца полисахаридами

3.4.2. Изменение свинец-связывающей способности полисахаридов в зависимости от рН

3.4.3. Параметры сорбционной активности некрахмальных полисахаридов при взаимодействии со свинцом

3.5. Взаимодействие некрахмальных полисахаридов с ионами кадмия

3.5.1. Кинетика связывания кадмия полисахаридами

3.5.2. Изменение кадмий-связывающей способности полисахаридов в зависимости от рН

3.5.3. Параметры сорбционной активности некрахмальных полисахаридов при взаимодействии с кадмием

3.6. Взаимодействие некрахмальных полисахаридов с ионами цинка

3.6.1. Кинетика связывания цинка полисахаридами

3.6.2. Изменение цинк-связывающей способности полисахаридов в зависимости от рН

3.6.3. Параметры сорбционной активности некрахмальных полисахаридов при взаимодействии с цинком

3.7. Взаимодействие некрахмальных полисахаридов с ионами ртути

3.7.1. Кинетика связывания ртути полисахаридами

3.7.2. Изменение ртуть-связывающей способности полисахаридов в зависимости от рН

3.7.3. Параметры сорбционной активности некрахмальных полисахаридов при взаимодействии с ртутью

3.8. Взаимодействие некрахмальных полисахаридов с ионами ртути

3.8.1. Кинетика связывания ртути полисахаридами

3.8.2. Изменение ртуть-связывающей способности полисахаридов в зависимости от рН

3.8.3. Параметры сорбционной активности некрахмальных полисахаридов при взаимодействии с ртутью

Глава IV. Взаимодействие полисахаридов с металлами в условиях in vivo

4.1. Влияние полисахаридов на абсорбцию свинца в кишечнике

4.2. Влияние некрахмальных полисахаридов на выведение свинца из внутренних органов крыс

4.3. Влияние некрахмальных полисахаридов на выведение свинца у крыс 160 4.4 Влияние полисахаридов на функционирование внутренних органов в условиях экспериментальной интоксикации металлами

4.4.1. Эффективность низкоэтерифицированного пектина при экспериментальной гипофункции щитовидной железы, вызванной введением свинца

4.4.2. Эффективность деэтерифицированного пектина при токсическом поражении печени, вызванном введением свинца

Глава V. Эффективность некрахмальных полисахаридов при экспериментальной почечной недостаточности

5.1. Связывание уремических токсинов некрахмальными полисахаридами 176 5.1.1 .Кинетика связывания креатинина некрахмальными полисахаридами.

5.1.2. Кинетика связывания мочевины некрахмальными полисахаридами

5.1.3. Параметры связывания креатинина некрахмальными полисахаридами

5.1.4. Параметры связывания мочевины некрахмальными полисахаридами 183 5.2. Эффективность некрахмальных полисахаридов при экспериментальной почечной недостаточности у крыс

5.2.1. Лечебные эффекты некрахмальных полисахаридов при экспериментальной почечной недостаточности

5.2.2. Профилактические эффекты некрахмальных полисахаридов при экспериментальной почечной недостаточности

Глава VI. Оценка гепатопротекторного действия некрахмальных полисахаридов

6.1. Сорбционная активность некрахмальных полисахаридов в отношении билирубина и желчных кислот

6.1.1. Взаимодействие пектата кальция и альгината кальция с билирубином

6.1.2. Сорбционная емкость некрахмальных полисахаридов по билирубину при различных рН среды

6.1.3. Параметры связывания билирубина некрахмальными полисахаридами

6.2. Связывание холевой кислоты некрахмальными полисахаридами энтеросорбентами 204 6.2.1. Сорбционная емкость некрахмальных полисахаридов по холевой кислоте при различных рН среды

6.2.3. Параметры связывания холевой кислоты некрахмальными полисахаридами и препаратами энтеросорбентами

6.3. Оценка гепатопротекторного действия некрахмальных полисахаридов у лабораторных животных с токсическим поражением печени

6.3.1. Эффекты некрахмальных полисахаридов на функциональное состояние печени у крыс с тетрахлорметановой интоксикацией

6.2.2. Влияние некрахмальных полисахаридов на состояние антиоксидантної! системы при токсическом поражении печени

Глава VII. Гиполипидемические свойства некрахмальных полисахаридов.

Глава VIII Гастропротекторные свойства некрахмальных полисахаридов. 241 ОБСУЖДЕНИЕ 252 ВЫВОДЫ 286 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Сорбционные свойства и фармакологическая активность некрахмальных полисахаридов»

Актуальность проблемы. Поиск соединений с высокой фармакологической активностью и разработка на их основе новых лекарственных препаратов являются важными задачами современной экспериментальной фармакологии и фармации. Актуальность поисковых исследований обусловлена необходимостью пополнения арсенала лекарственных средств более эффективными и менее токсичными препаратами, предназначенными для лечения и профилактики социально-значимых заболеваний. Наряду с медицинскими задачами, необходимость в создании новых фармацевтических субстанций и лекарственных средств диктуется социальными и экономическими причинами. По данным агентства «DSM Group», в 2008 г. на Российском фармацевтическом рынке 75,8% лекарственных препаратов в стоимостном объеме были представлены средствами импортного производства [Кузин, 2008]. Большинство лекарственных средств отечественного производства является препаратами-дженериками, эффективность которых по сравнению с оригинальными препаратами, как правило, значительно ниже. В настоящее время примерно 80% отечественных лекарственных препаратов производится из фармацевтических субстанций импортного производства. В период с 1991 г. до 2005 г. объем производства фармацевтических субстанций в Российской Федерации сократился с 17,5 тыс. усл. тонн до 0,98 тыс. усл. тонн. Все это негативно отражается на состоянии здоровья населения и требует более интенсивного развития биомедицинских исследований, направленных на создание новых эффективных лекарственных средств.

По разным оценкам от 40 до 70% новых лекарственных препаратов создается на основе природных молекул или их синтетических аналогов и производных. На основе природных соединений могут быть разработаны лекарственные средства с принципиально иными фармакологическими свойствами, обладающие большей терапевтической активностью или качественно новыми фармакологическими эффектами по сравнению с химически синтезированными лекарственными веществами. Существенными преимуществами лекарственных веществ из природных источников являются доступность сырья, меньшая сложность технологических процессов выделения и очистки, выраженная фармакологическая активность и, как правило, низкая токсичность. В этом отношении большой интерес вызывают представители морской флоры и фауны, которые можно рассматривать как источник новых лекарств и фармакологически активных субстанций [Bowling et al., 2007; Martinez A., 2007; Kinghorn A. et al., 2009]. В отличие от показателей видового обилия, филогенетическое (макротаксоиомическое) разнообразие в море гораздо выше, чем на суше. Из 33 типов многоклеточных животных 31 тип встречается в морских водах, 17 типов - в пресных водах и только 11 типов - на суше [Адрианов A.B., 2004]. По-видимому, благодаря многочисленным адаптациям к разнообразным факторам окружающей среды, ряд морских животных и растений вырабатывает уникальные вторичные метаболиты, нехарактерные для наземных организмов, многие из которых обладают экстремально высокой фармакологической активностью [Haefner В., 2003; Muller W. et al., 2003; Alonso D. et al., 2005; Newman D., Cragg G., 2006; Стоник B.A., Толстиков Г.А., 2008].

Основными источниками новых биологически активных соединений морского происхождения являются беспозвоночные животные, водоросли, грибы и бактерии [Belarbi Е. et al., 2003; Newman D., Hill, 2006; Saleem M. et al., 2007]. Кроме хорошо известных соединений липидной природы [Masson М. et al., 2000], объектами фармакологических исследований в последние годы стали представители таких классов химических веществ, как поликетиды, стероиды, терпены и пептиды (Florence G. et al., 2008; Mayer A., Gustafson K., 2008]. Ha стадии доклинических испытаний находятся более 200 веществ морского происхождения, проявляющих антибактериальную, антигельминтную, противогрибковую, противомалярийную, анткоагулянтную, антиагрегантную, противовоспалительную, противотуберкулезную и антивирусную активности. Ряд соединений оказывает выраженные эффекты на сердечно-сосудистую, иммунную и нервную системы [Mayer А., Hamann М., 2005; De Souza М., 2006; Laurent D., Pietra F., 2006; Mayer A. et al., 2007]. Более десятка природных соединения из морских гидробионтов и их синтетические производные находятся на стадиях клинических испытаний в качестве противоопухолевых агентов. Структура этих веществ чрезвычайно разнообразна - от простых линейных пептидов до сложных макроциклических полиэфиров [Simmons В. et al., 2005; Kinghorn А. et al., 2009]. Среди этих веществ найдены соединения, такие как спонгистатин из морских губок, которые по токсичности в отношении раковых клеток на два-три порядка превосходят применяемые противоопухолевые препараты [Gerber-Lemaire S., Vogel P., 2008].

Перспективную группу веществ, преимущественно морского происхождения, составляют некрахмальные полисахариды [Хотимченко Ю.С. и др., 2005], к которым относятся альгинаты и фукоиданы морских бурых водорослей, каррагинапы красных водорослей, хитин и его производное хитозан морских ракообразных, а также пектины морских трав и наземных растений. Они широко применяются в пищевой промышленности в качестве стабилизаторов, загустителей и гелеобразователей и в меньших масштабах - в фармацевтической промышленности как формообразующие вещества [Redgwell R., Fischer М., 2005]. В последние годы эти полисахариды стали объектом нанотехнологических исследований в качестве структурных компонентов систем адресной доставки лекарственных молекул и микрокапсулирования [Liu Z. et al., 2008].

Все некрахмальные полисахариды объединены общим свойством: в желудочно-кишечном тракте они не гидролизуются амилазами слюнных и панкреатических желез и не абсорбируются из кишечника в кровь, однако, в толстой кишке подвергаются деградации под действием ферментов бактериальной микрофлоры [Wong J.M. et al., 2006]. Уникальным свойством этих полисахаридов является способность поглощать большое количество воды и в присутствии, как правило, двухвалентных ионов образовывать гели. Механизм гелеобразования лежит в основе способности некрахмальных полисахаридов связывать и прочно удерживать ионы металлов и другие ионизированные молекулы [Kohn R., 1987]. У большинства исследованных полисахаридов обнаружены те или иные фармакологические эффекты, заслуживающие внимания в плане создания новых фармацевтических субстанций. Так, пектины, альгинаты и хитозаны обладают достоверным гипохолестеринемическим и гипотриглицеридемическим эффектами [Panlasigui L.N. et al., 2003; Shields K.M. et al., 2003]. Гепатопротекторное и нефропротекотрное действие обнаружено у фукоиданов [Kawano N. et al., 2007; Veena C.K. et al., 2007]. В экспериментальных исследованиях и клинических наблюдениях была доказана терапевтическая эффективность пектинов при инфекционной патологии, проявляющаяся в снижении явлений интоксикации

Ященя O.B. и др., 2001], а также при отравлении ртутью [Соболев М.Б. и др., 1999]. У пектинов и хитозанов выявлены бактерицидные и фунгицидные эффекты, а у фукоиданов и каррагинанов - противовирусная активность [Neurath A.R. et al. 2002; Carlucci M.J. et al., 2004; Adhikari U. et al., 2006; Buck C.B. et al., 2006], которая сочетается с иммуностимулирующим эффектом [Yoshikawa Y. et al., 2008] и способностью к индукции синтеза интерферонов [Tsuji R.F. et al., 2003]. Помимо этого, у фукоиданов и каррагинанов установлена антикоагулянтная активность [Liang A. et al., 2006; Cicala С. et al., 2007], которая y высокосульфатированных фукоиданов сопоставима с таковой препаратов гепарина [Qui X.D. et al., 2006]. Фукоидан проявляет таюке антиагрегантные свойства [Mourao P.A.S., 2004], а альгиновая кислота, наоборот, обладает протромботической активностью, что на практике реализовалось в создании перевязочных материалов с гемостатическими свойствами [Pielesz A. et al., 2008]. Результаты многих исследований указывают на наличие противоопухолевой активности у некрахмальных полисахаридов. Пектины в эксперименте снижают частоту рака толстого кишечника, что было подтверждено результатами клинических наблюдений. На моделях перевиваемых опухолей у мышей показана противоопухолевая активность альгинатов. В ряде работ продемонстрирована способность фукоиданов ингибировать рост опухолей и ' уменьшать интенсивность процессов метастазирования [Алексеенко Т.В. и др., 2007; Cumashi A. et al., 2007; Li D.Y. et al., 2008]. Получены данные о противоопухолевой активности и каррагинанов [Zhou G. et al., 2006], хотя в литературе имеются факты, указывающие на их онкогенное действие [Tobacman J.K. et al., 2001; Hata К. et al., 2006]. Весьма перспективными препаратами для лечения и профилактики язвенной болезни представляются фукоиданы, которые, с одной стороны, обладают антипептическими и противовоспалительными свойствами [Shibata H. et al., 2000; Yamamoto Y. et al., 2000], a с другой, препятствуют адгезии Helycobacter pylori на мембраны эпителиальных клеток слизистой желудка [Shibata H.et al., 1999].

Следует подчеркнуть, что представители каждой группы некрахмальных полисахаридов представляют собой гетерогенные соединения, различающиеся не только источниками происхождения, но и параметрами физико-химических свойств, таких как молекулярная масса, вязкость, растворимость в воде, степень этерификации и сульфатирования, что, к сожалению, не учитывается в большинстве работ по оценке биологической активности углеводных биополимеров и, на наш взгляд, является причиной многочисленных противоречивых фактов, имеющихся в литературе, посвященной фармакологии этих полисахаридов. Отсутствие общепринятых количественных показателей для стандартизации препаратов некрахмальных полисахаридов затрудняет проведение сравнительной оценки фармакологической эффективности полисахаридов друг с другом, а также с лекарственными препаратами аналогичного действия. Сформулированные проблемы определили цели и задачи настоящей работы.

Цель работы:

Изучить сорбционные свойства, фармакологические эффекты и механизмы действия некрахмальных полисахаридов и обосновать возможности использования данных веществ для разработки новых фармацевтических субстанций и лекарственных средств.

Задачи работы:

1. Изучить металлсвязывающие свойства природных пектинов, альгинатов, хитозанов, каррагинанов и фукоидана при взаимодействии с ионами меди, ртути, кадмия, свинца, цинка и стронция и определить с помощью математических моделей сорбции основные константы связывания.

2. Провести сравнительный анализ количественных параметров связывания тяжелых металлов некрахмальными полисахаридами и лекарственными препаратами из группы энтеросорбентов и определить наиболее перспективные образцы для дальнейшей разработки на их основе новых лекарственных средств.

3. Исследовать металлсвязывающую активность образцов пектинов с различной степенью этерификации при взаимодействии с ионами меди, ртути, кадмия, свинца, цинка и стронция и установить зависимость сорбционной емкости полисахаридов от степени этерификации.

4. На модели свинцовой нагрузки у лабораторных животных оценить влияние пектинов, альгинатов, хитозана, каррагинанов и фукоидана на депонирование и экскрецию тяжелых металлов.

5. Оценить гипохолестеринемическую, гипотриглицеридемическую и антиоксидантную активность пектинов, альгинатов, каррагинанов и фукоидана на различных моделях экспериментальной гиперлипидемии.

6. Исследовать биохимические характеристики наличия и выраженности гепатопротекторного эффекта пектинов и альгинатов у животных с экспериментальным тетрахлорметановым поражением печени, а также оценить их антиоксидантные свойства на данной модели.

7. На экспериментальных моделях повреждения слизистой желудка оценить гастропротективные эффекты пектинов, альгинатов, хитозана и каррагинанов.

8. Определить сорбционную емкость пектинов и альгинатов в отношении мочевины и креатинина и изучить лечебные и профилактические эффекты этих полисахаридов при экспериментальной почечной недостаточности.

9. Провести анализ зависимости сорбционных свойств и фармакологических эффектов некрахмальных полисахаридов от их физико-химических свойств на примере высокоэтерифицированных и низкоэтерифицированных пектинов с целью стандартизации полисахаридных препаратов.

Научная новизна и теоретическое значение работы:

Работа является комплексным научным исследованием, посвященным фармакологии некрахмальных полисахаридов. Дана сравнительная оценка сорбционных свойств, антитоксической, липиднормализующей, гепатопротективной, гастропротективной и нефропротектиновной активности пектинов, альгинатов, хитозана, каррагинанов и фукоидана.

На основе математического аппарата моделей сорбции Лэнгмюра, Фрейндлиха и Брюне-Эммета-Таллера определены параметры максимальной сорбционной емкости, аффинитета и прочности связывания металлов природными и модифицированными некрахмальными полисахаридами. Установлена зависимость количественных значений констант связывания от степени этерификации пектинов, содержания кальция в молекуле альгинатов и пектинов, от степени сульфатирования каррагинанов. Определены наиболее эффективные образцы некрахмальных полисахаридов, препятствующих накоплению металлов в организме и ускоряющих их выведение.

Установлены константы связывания желчных кислот, билирубина, мочевины и креатинина пектинами и альгинатами. Показана зависимость гипохолестеринемического и гипотриглицеридемического действия пектинов и альгинатов от молекулярной массы и характеристической вязкости полисахаридов. Определены образцы пектинов, альгинатов, хитозана и каррагинанов, обладающие лечебным и профилактическим действием при экспериментальном токсическом поражении печени и почек.

На различных моделях повреждения слизистой желудка крыс показано антиульцерогенное действие альгината кальция, альгината натрия, пектата кальция, хитозана, фукоидана и каррагинанов.

Проведен всесторонний анализ зависимости фармакологических эффектов некрахмальных полисахаридов от их химической структуры, молекулярной массы, вязкости и других физико-химических параметров. Количественные характеристики физико-химических свойств предложены в качестве показателей стандартизации препаратов некрахмальных полисахаридов.

Теоретическое значение работы заключается в установлении новых, не известных ранее закономерных связей структуры и физико-химических свойств некрахмальных полисахаридов с их биологической активностью. Установлены новые механизмы фармакологического действия углеводных биополимеров.

Практическая значимость работы и реализация результатов исследования:

Практическим итогом проведенного исследования стало базирующееся на полученных результатах обоснование дальнейшей разработки лекарственных средств на основе низкоэтерифицированных пектинов, солей пектовой и альгиновой кислот, предназначенных для применения в качестве энтеросорбентов. Высокая сорбционная емкость пектинов и альгинатов по тяжелым металлам, значительно превышающая таковую препаратов активированного угля и лигнина, сочетающаяся с возможностью их длительного безопасного приема, позволяют рассматривать эти вещества как перспективные препараты для профилактики и лечения хронических отравлений тяжелыми металлами. Пектат кальция может быть рекомендован для дальнейшей разработки в качестве гастропротективного средства.

Препараты некрахмальных полисахаридов с энтеросорбционными свойствами могут рассматриваться в качестве дополнительных средств в комплексном лечении заболеваний, сопровождающихся явлениями интоксикации.

На основании проведенных экспериментальных исследований, анализа физико-химических характеристик и технологических процессов выделения, очистки и химической модификации полисахаридов разработана и зарегистрирована в установленном порядке нормативная документация на производство и реализацию биологически активных добавок к пище, действующим компонентом которых является пектин со степенью этерификации менее 5%, комбинация пектинов с суммарной степенью этерификации 50% и альгинат кальция. Действующие компоненты рассматриваются в качестве основы для разработки лекарственных средств с энтеросорбционными свойствами.

Разработанные технологии получения модифицированных некрахмальных полисахаридов и способы их применения защищены четырьмя патентами Российской Федерации.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Некрахмальные полисахариды обладают выраженной металлсвязывающей способностью в отношении токсичных металлов, таких как свинец, кадмий, ртуть, стронций и могут стать основой для разработки новых лекарственных средств, предназначенных для лечения и профилактики заболеваний, обусловленных действием тяжелых металлов. Наиболее перспективными для дальнейшего изучения в качестве средств профилактики и лечения хронических поражений тяжелыми металлами деэтерифицированный пектин, альгинат натрия, пектат кальция, альгинат кальция.

2. Механизмы связывания ионов меди, свинца, кадмия и цинка пектинами и альгинатами отличаются от процессов связывания ионов ртути и стронция. Сорбция ионов меди, свинца, кадмия и цинка происходит за счет образования координационных связей между карбоксильными и гидроксильными группами галактуроновых кислот в пектине и гулуроновых кислот в альгинате и ионом метала с формированием упорядоченной структуры гомогенных активных связывающих центров. Связывание ртути и стронция происходит за счет образования координационных связей между карбоксильными и гидроксильными группами галактуроновых кислот в пектине и гулуроновых кислот в альгинате, приводящего к хаотичному формированию гетерогенных активных связывающих центров. Дополнительное введение ионов кальция в сорбционную систему связывания ртути и стронция приводит к упорядочиванию структуры активных связывающих центров.

3. Препараты пектинов, альгинатов, хитозана и фукоидана при энтеральном введении оказывают липиднормализующее действие, позволяющее рассматривать их в качестве основы для разработки средств профилактики атеросклероза.

4. Препараты пектинов, альгинатов и хитозана оказывают гастропротективное действие на различных моделях поражения слизистой желудка и является перспективной основой для создания новых противоязвенных средств.

5. Препараты пектинов, альгинатов и хитозана способствуют нормализации биохимических параметров печеночной интоксикации при экспериментальной поражении печени, что позволяет рассматривать их в качестве потенциальных гепатопротекторов. Одним из механизмов антитоксического действия некрахмальных полисахаридов является их антиоксидантная активность.

6. Препараты альгинатов и пектинов при энтеральном введении уменьшают явления уремической интоксикации и могут найти применение в комплексном лечении почечной недостаточности.

Апробация работы:

Основные результаты работы были доложены и обсуждены на IV Международном симпозиуме «Биологически активные добавки к пище: XXI век» (С.-Петербург, 2000), Русско-японском международном медицинском симпозиуме (Благовещенск, 2000), X-XVI Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2003, 2004, 2005, 2006, 2007, 2008, 2009), 2-ом Съезде российского научного общества фармакологов «Фундаментальные проблемы фармакологии» (Москва, 2003), Международном симпозиуме «International Conference on Development Pharmacology» (Harbin, China, 2004), Международном симпозиуме «China-Russia International Conference on Pharmacology» (Harbin, China,

2005), XV Мировом фармакологическом конгрессе «Pharmacology in the 21st Century: A Bridge between the Past and the New Molecular Frontiers» (Beijing, China,

2006), V Дальневосточном региональном конгрессе с международным участием «Человек и лекарство» (Владивосток, 2008), XVI Мировом конгрессе базисной и клинической фармакологии «WorldPharma 2010» (Copenhagen, Denmark, 2010).

Материалы диссертации были доложены и обсуждены на заседании Проблемной комиссии по фармакологии, клинической фармакологии и фармации Владивостокского государственного медицинского университета. По результатам обсуждения диссертация была рекомендована к защите.

Публикации:

По материалам диссертации опубликовано 62 печатные работы, в том числе 1 монография, 36 статей, в том числе 16 в журналах, рекомендованных ВАК к защите докторских диссертаций, 21 тезис докладов, 4 патента Российской Федерации.

Финансовая поддержка

Работа выполнялась при финансовой поддержке грантов РФФИ № 01-0449413 «Сравнительная эффективность и механизмы сорбционной активности высокоэтерифицированных и низкоэтерифицированных пектинов», ДВО РАН - СО РАМН № 06-III-A-05-468 «Первичные фармакологические исследования, токсикологические испытания, стандартизация и разработка лекарственных препаратов на основе некрахмальных полисахаридов», РФФИ-ДВО № 09-03-98512 «Условия и механизмы образования комплексов наночастиц некрахмальных полисахаридов с ионами поливалентных металлов», Государственных контрактов в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы»: Государственный контракт №02.512.11.2090 «Разработка фармакологических средств защиты человека от действия радионуклидов, токсических металлов и эндогенных метаболитов на основе биопрепаратов из морских животных и растений», Государственный контракт №02.512.12.2043 «Разработка фармакологических средств на основе модифицированных некрахмальных полисахаридов для использования в терапии злокачественных новообразований».

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 327 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 8 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы.

Заключение диссертации по теме «Фармакология, клиническая фармакология», Хотимченко, Максим Юрьевич

Заключение

Результаты проведенных исследований показали, что при взаимодействии с ионами двухвалентных металлов все некрахмальные полисахариды проявляют связывающую активность, которая существенно превышает таковую у зарегистрированных лекарственных препаратов энтеросорбентов - активированного угля, полифепана и микрокристаллической целлюлозы. Сорбционная емкость полисахаридов находится в зависимости от значений рН. Как правило, наибольшая связывающая активность проявляется в диапазоне рН от 4,0 до 8,0. Исключением является образец хитозана, который при рН ниже 5,0 находится в неионизированной форме и не проявляет связывающей активности [Jodra Y., Mijangos F., 2001]. В связи с этим максимальная эффективность хитозана проявлялась при рН около 7,0. Следует отметить, что многие металлы при рН 7,0 и выше образуют нерастворимые гидроксиды и не могут образовывать связи с полимерными сорбентами, вследствие чего металл-связывающая активность хитозана во всех экспериментах оставалась ниже, чем у других полимеров. Комплексная оценка связывающей активности некрахмальных полисахаридов при помощи математических моделей сорбции показала, что при взаимодействии с ионами всех изученных металлов, за исключением ртути и стронция, связывание происходит за счет образования активных связывающих центров однородной структуры, каждый из которых взаимодействует с одним ионом металла. Подтверждением этого вывода является применимость к описанию сорбционных процессов в этих случаях модели Лэнгмюра. Невозможность описания сорбционных взаимодействий при помощи модели БЭТ для оценки связывания всех металлов указывает на то, что один активный центр молекул всех изучаемых полисахаридов, также как и препаратов энтеросорбентов, может взаимодействовать только с одним ионом металла. В случае взаимодействия водорастворимых полисахаридов, активные центры которых в водных растворах диссоциируют с высвобождением катионов натрия, с ионами ртути и стронция, как правило, не происходит формирования однородных связывающих центров, что, вероятно, объясняется свойствами ионов металла. Стронций и ртуть не образуют с карбоксильными группами координационных связей, которые, в конечном счете, образуют контактную ячейку по типу "egg-box"

Gant G.T. et al., 1973], состоящую и четырех остатков карбоксильных групп. Связывание происходит с отдельными карбоксильными группами, которые не складываются в упорядоченную структуру. Данное предположение, прежде всего, подтверждается высокими значениями R2, полученными при расчете уравнения Фрейндлиха. Поскольку модель Фрейндлиха не позволяет рассчитать параметры относительного количества активных связывающих центров и аффинитета, качественная сравнительная характеристика ртуть- и стронций-связывающей активности была затруднена и были использованы данные зависимости сорбционной емкости полисахаридов от рН, позволяющие оценить сравнительную сорбционную емкость полисахаридов и энтеросорбентов в данных условиях. Результаты показали, что наибольшая сорбционная емкость по ртути и стронцию характерна для препаратов пектата кальция и альгината кальция. При этом связывание стронция двумя этими препаратами происходит по типу модели Лэнгмюра, что отличает их от других образцов полисахаридов. Данное явление можно объяснит тем, что ионы кальция, находящиеся в молекуле полимера формируют активные связывающие центры, состоящие из четырех остатков карбоксильных групп. Далее процесс связывания ионов стронция или ртути происходит по типу ионообмена: ион кальция в каждой ячейке связывания заменяется на ион ртути или стронция без нарушения структуры самой ячейки. Пектины и альгинаты, молекулы которых не содержат ионов кальция, в растворе образуют ионизированные формы и при добавлении ионов стронция или ртути происходит хаотичный процесс формирования «неполноценных» связывающих центров. Несмотря на то, что образцы деэтерифицированного пектина и альгината натрия проявляли большую связывающую активность в отношении ионов стронция, образцы альгината и пектата кальция следует признать более активными в отношении ионов ртути и стронция, поскольку с практической точки зрения наиболее перспективными являются соединения, обладающие способностью связывать ионы металла в условиях их малых концентраций в сорбционной системе.

Сравнительная оценка коэффициентов сорбционной активности показала, что наиболее перспективными соединениями с точки зрения связывания двухвалентных металлов являются производные пектинов и альгинатов. Такие полисахариды, как фукоидан, хитозан и каррагинан, хотя и проявляют активность при взаимодействии с металлами, но их связывающая способность отличается специфичностью. Они активно взаимодействуют с одними металлами и не проявляют заметной активности в отношении других. Помимо этого, несмотря на большое количество активных связывающих центров, хитозан и фукоидан отличаются крайне низкими значениями коэффициента аффинитета, что не позволяет рассматривать их в качестве эффективных сорбентов в отношении металлов. Каррагинан по всем параметрам сорбционной активности значительно уступает другим некрахмальным полисахаридам. Оценка металл-связывающей активности пектинов и альгинатов показала, что для связывания большинства металлов наиболее эффективны натриевые формы этих полисахаридов - альгинат натрия и пектин со степенью этерификации 1%. Введение в молекулу ионов кальция, конкурирующего за активные центры полимера, значительно снижает активность полисахаридов, что проявляется уменьшением значений коэффициентов сорбции. Как было отмечено выше, исключением является взаимодействие полисахаридов с ионами стронцияи ртути. Степень этерификации пектинов также является фактором, определяющим их металл-связывающую способность. Наличие метальных радикалов, присоединенных к карбоксильным группам остатков галактуроновой кислоты, уменьшает количество активных связывающих центров, также приводит к формированию «неполноценных» связывающих центров, состоящих не из четырех карбоксильных групп, а трех, или даже двух, что в итоге проявляется снижением выраженности аффинитета.

В результате проведенных исследований был сделан вывод о том, что наиболее активными в отношении ионов двухвалентных металлов являются-альгинат натрия и пектин со степенью этерификации около 1%.

Глава IV

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПОЛИСАХАРИДОВ С МЕТАЛЛАМИ В

УСЛОВИЯХ IN VIVO

Тяжелые металлы в виде солей всегда находятся в окружающем воздухе, накапливаются в почвах [Nadal М. et al., 2004], присутствуют в водных источниках [Harada М., 1995], содержаться в предметах обихода [Fisher A.A., Le Coutuer D.G., 2000; Su M. et al., 2002]. Вследствие этого жители развитых промышленных стран, в особенности урбанизированных районов, постоянно подвергаются воздействию тяжелых металлов, которые попадают в организм через органы дыхания (ингаляционный путь), желудочно-кишечный тракт (энтеральный путь) и кожные покровы. Одним из путей эффективного решения проблемы токсического воздействия тяжелых металлов на организм жителей промышленных районов является поиск средств, препятствующих проникновению ионов металлов во внутренние среды организма, а также способствующих их эффективному выведению через желудочно-кишечный тракт и мочевыделительную систему.

Некрахмальные полисахариды обладают способностью связывать и удерживать ионы тяжелых металлов за счет образования ковалентных и водородных связей. Наибольшая связывающая активность некрахмальных полисахаридов проявляется в среде, кислотность которой близка к таковой тонкого кишечника. Таким образом, нахождение некрахмальных полисахаридов в просвете кишечника может препятствовать абсорбции тяжелых металлов в кровь, а также ускорять их выведение из организма через пищеварительный тракт.

Оценку металлсвязывающей способности некрахмальных полисахаридов в условиях in vivo проводили на модели энтеральной свинцовой интоксикации у белых беспородных крыс.

4.1. Влияние некрахмальных полисахаридовна абсорбцию свинца в кишечнике

Эксперименты проводили на белых беспородных крысах-самцах с массой тела 150-200 г. Крыс рандомизировали на группы в соответствии с изучаемыми полисахаридами. Первая группа - контрольная, получала обычную диету. Вторую группу составили животные, которым энтерально с помощью металлического зонда вводили ацетат свинца в дозе 50 г/кг массы тела один раз в сутки. Остальные животные входили в опытные группы, которым за 40-60 мин до введения ацетата свинца также энтерально вводили один из полисахаридов в виде раствора или суспензии в дозах 0,1 г/кг или 0,5 г/кг массы тела. Эксперимент продолжали в течение 18 дней при использовании полисахаридов в дозе 0,1 г/кг и 21 день при использовании полисахаридов в дозе 0,5 г/кг. По истечении этих сроков животных декапитировали под легким эфирным наркозом. Навески органов массой около 500 мг высушивали в термостате при температуре 60-80°С в течение суток и определяли содержание свинца.

Ниже приведены результаты определения количества депонированного свинца в печени, сердце, почках и бедренной кости у крыс, в кишечнике которых ацетат свинца и исследованные полисахариды находились одновременно и в одинаковых условиях. Полученные результаты позволяют судить об эффективности некрахмальных полисахаридов в условиях in vivo и сопоставить ее с выраженностью сорбционной активности в in vitro условиях.

В печени за 18 и 21 день эксперимента концентрация свинца увеличилась с 3,6 ± 0,6 мкг/г сухой ткани до 12,4 ± 1,8 мкг/г и с 4,2 ± 0,8 мкг/г до 14,8 ±1,7 мкг/г, соответственно. Таким образом, концентрация свинца увеличилась в среднем в 3,4 и 3,5 раза, соответственно. При одновременном введении ацетата свинца и альгината кальция в дозе 0,1 г/кг концентрация свинца в печени увеличилась только в 2,2 раза, а в дозе 0,5 г/кг - только 1,5 раза. Уменьшение концентрации свинца в группах «ацетат свинца + альгинат кальция» статистически достоверно по сравнению с животными группы «ацетат свинца». В результате одновременного введения ацетата свинца и деэтерифицированного пектина в дозе 0,1 г/кг концентрация свинца в печени увеличилась в 2,0 раза, а в дозе 0,5 г/кг - в 1,4 раза. Различия в концентрации свинца в группах «ацетат свинца» и «ацетат свинца + деэтерифицированный пектин» статистически достоверны. Вследствие введения ацетата свинца и пектата кальция в дозе 0,1 г/кг депонирование свинца в печени возросло в 2,1 раза по сравнению с контрольной группой. Применение пектата кальция в дозе 0,5 г/кг привело к накоплению свинца в 1,4 раза по сравнению с контролем. Снижение депонирования свинца по сравнению с нелеченными животными статистически достоверны. Препараты высокоэтерифицированного пектина, полифепана и активированного угля в дозах 0,1 и 0,5 г/кг не уменьшали накопление свинца в печени (табл. 8 и 9).

В сердце за период эксперимента концентрация свинца увеличилась с 8,9 ±1,4 мкг/г сухой ткани до 26,3 ± 3,1 мкг/г и с 10,0 ±1,6 мкг/г до 28,2 ± 2,9 мкг/г в экспериментах с использованной дозой полисахаридов 0,1 и 0,5 г/кг, соответственно. Таким образом, накопление свинца в сердце увеличилось в среднем в 3,0 и 2,8 раза, соответственно. В группе животных, которым одновременно с ацетатом свинца вводили альгинат кальция в дозе 0,1 г/кг концентрация свинца увеличилась только в 1,8 раза, а при использовании альгината кальция в дозе 0,5 г/кг - только в 1,2 раза. Уменьшение накопления свинца в сердце после применения альгината кальция является статистически достоверным. После введения ацетата свинца с деэтерифицированным пектином в дозе 0,1 г/кг концентрация свинца в сердце увеличилась в 1,9 раза, а после введения пектина в дозе 0,5 г/кг-в 1,5 раза. Различия в концентрации свинца в группах «ацетат свинца» и «ацетат свинца + деэтерифицированный пектин» достоверны. Введение ацетата свинца одновременно с пектатом кальция в дозе 0,1 г/кг привело к накоплению свинца в сердце в 1,6 раза превышающем контрольные поаказтели, а после введения пектата кальция в дозе 0,5 г/кг — в 1,5 раза. Увеличение в концентрации свинца в обеих группах было статистически достоверным. Препараты высокоэтерифицированного пектина, полифепана и активированного угля в дозах 0,1 и 0,5 г/кг не влияли на депонирование свинца в сердце лабораторных животных (табл. 8 и 9).

В почках за период эксперимента концентрация свинца увеличилась с 10,7 ± 2,6 мкг/г сухой ткани до 60,9 ± 8,4 мкг/г и с 12,2 ± 2,4 мкг/г до 64,3 ± 7,2 мкг/г в экспериментах с использованными дозами 0,1 и 0,5 г/кг, соответственно. Таким образом, концентрация свинца увеличилась в среднем в 5,7 и 5,3 раза. Введение ацетата свинца на фоне использования альгината кальция в дозе 0,1 г/кг привело к повышению уровня свинца в сердце в 4,0 раза. Применение альгината кальция в дозе 0,5 г/кг привело к накоплению свинца в сердце в 2,4 раза превышающему контрольные значения. Различия в концентрации свинца в группах «ацетат свинца» и «ацетат свинца + альгинат кальция» статистически достоверны только при сравнении параметров группы, получавшей дозу альгината 0,5 г/кг. После введения ацетата свинца одновременно с деэтерифицированным пектином в дозе 0,1 г/кг концентрация свинца в сердце увеличилась в 5,1 раза. Применение деэтерифицированного пектина в дозе 0,5 г/кг привело к увеличению содержания свинца в сердце в 1,8 раза. Статистически достоверным было расценено уменьшение накопления свинца в сердце животных, получавших 0,5 г/кг деэтерифицированного пектина. Введение ацетата свинца с пектатом кальция в дозе 0,1 г/кг привело к увеличению содержания в сердце металла в 4,4 раза, в то время как пектат кальция в дозе 0,5 г/кг способствовал тому, что количество свинца в сердце составило 220% от показателей контроля, что расценивалось как статистически значимое различие по сравнению с другими группами. Препараты высокоэтерифицированного пектина, полифепана, и активированного угля в обеих исследованных дозах не изменяли интенсивность накопления свинца в почках (табл. 8 и 9).

В бедренной кости за 18 и 21 день эксперимента концентрация свинца увеличилась значительно: с 34,8 ± 4,6 мкг/г сухой ткани до 364,7 ± 43,7 мкг/г в эксперименте с дозой 0,1 г/кг и с 34,8 ± 4,6 мкг/г до 377,2 ± 46,3 мкг/г в эксперименте с дозой 0,5 г/кг. Таким образом, концентрация свинца увеличилась в среднем в 10,5 и 10,8 раза, соответственно. В группе животных, которым вводили ацетат свинца вместе с альгинатом кальция в дозе 0,1 г/кг концентрация свинца в бедренной кости увеличилась в 8,6 раза. Использование дозы альгината кальция 0,5 г/кг привело к увеличению концентрации свинца всего лишь в 3,8 раза. Достоверными были различия между группой животных, получавших альгинат в большей дозе, и нелеченными животными. После введения ацетата свинца с деэтерифицированным пектином в дозе 0,1 г/кг концентрация свинца увеличилась в 7,5 раза. 0,5 г/кг деэтерифицированного пектина введенного вместе с ацетатом свинца привело к увеличению содержания свинца в бедренной кости в 4,5 раза. Различия в концентрации свинца в группах «ацетат свинца» и «ацетат свинца + деэтерифицированный пектин» достоверны при применении обеих