Роль ядерной ламины в процессе клеточной миграции тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Овсянникова Наталья Леонидовна

  • Овсянникова Наталья Леонидовна
  • кандидат науккандидат наук
  • 2022, ФГБУН «Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук»
  • Специальность ВАК РФ00.00.00
  • Количество страниц 155
Овсянникова Наталья Леонидовна. Роль ядерной ламины в процессе клеточной миграции: дис. кандидат наук: 00.00.00 - Другие cпециальности. ФГБУН «Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук». 2022. 155 с.

Оглавление диссертации кандидат наук Овсянникова Наталья Леонидовна

Оглавление

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Строение ядерной ламины

2.1.1. Созревание ламинов

2.1.2. Структура белков ламины

2.1.3. Сборка ядерной ламины

2.2. Факторы, определяющие механические свойства ядра

2.2.1. Участие ядерной ламины в механотрансдукции

2.2.2. Роль ламинов в онкогенезе

2.3. Мутации в гене LMNA вызывают ламинопатии

2.3.1. Механические свойства ядерной ламины при прогерии

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Оборудование и реактивы

3.1.1. Реактивы

3.1.2. Наборы реагентов

3.1.3. Растворы

3.1.4. Ферменты

3.1.5. Ингибиторы клеточных протеаз

3.1.6. Антитела

3.1.7. Бактериальные штаммы и клеточные линии

3.1.8. Плазмидные векторы

3.1.9. Олигодезоксирибонуклеотиды

3.2. Методы исследования и анализа результатов

3.2.1. Молекулярное клонирование

3.2.2. Работа с эукариотическими клетками

3.2.3. Пробоподготовка и получение изображений с помощью широкопольной флуоресцентной микроскопии

3.2.4. Восстановление флуоресценции после обесцвечивания

3.2.5. Оценка жесткости поверхности клетки с помощью сканирующего ион-проводящего микроскопа

3.2.6. Оценка клеточной миграции

3.2.7. Обработка и анализ изображений

3.2.8. Анализ белковых лизатов

3.2.9. Анализ и статистическая обработка данных

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Влияние ламинов А-типа на миграцию клеток HT1080 сквозь узкие поры

4.1.1. Создание клеточных линий с разным уровнем экспрессии ламина A на основе клеток HT1080

4.1.2. Измерение клеточная жесткости клеток с помощью ион-проводящего микроскопа

4.1.3. Изменение состава ламинов A-типа влияет на подвижность HT1080 на двумерном субстрате (scratch assay)

4.1.4. Прогерин снижает миграцию клеток HT1080 в ограниченных пространствах

4.2. Исследование эффективности ингибиторов ZMPSTE24 на клеточных моделях

4.2.1. Ингибиторы матричных протеаз значимо снижают жизнеспособность HT1080

4.2.2. Инкубация с батимастатом и фозиноприлом ведет к накоплению преламина A

4.2.3. Снижение миграции в присутствии ингибиторов протеаз

4.2.4. Лопинавир и фозиноприл вызывают арест G2/M фазе в полной среде и повышают чувствительность клеток к отсутствию сыворотки

4.2.5. Присутствие лопинавира при миграции снижает клеточный стресс, связанный с появлением фокусов yH2AX

4.2.6. Динамика обмена ламина A в ядерной ламине при действии лопинавира и батимастата не изменяется

4.3. Влияние ламинов А-типа на структурную организацию и позиционирование периферического гетерохроматина

4.3.1. Поведение модельного гетерохроматинового локуса HSR при действии прогерина

4.3.2. Использование флуоресцентных Н3К9те2/3-ридеров для исследования изменения эпигенетических паттернов при действии ингибиторов

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

6. ВЫВОДЫ

7. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

9. ПРИЛОЖЕНИЯ

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Другие cпециальности», 00.00.00 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль ядерной ламины в процессе клеточной миграции»

1. Введение

Актуальность работы и предмет исследования. На сегодняшний момент смертность от онкологических заболеваний занимает третье место в мире, вслед за заболеваниями сердечно-сосудистой системы и дыхательной системы. При этом до 90% смертей, связанных с онкологией, ассоциировано с развитием метастазов - вторичных новообразований, возникающих при миграции опухолевых клеток из первичного очага [Jemal и др., 2011]. Поиск способов контроля миграции метастатических клеток является одной из актуальных задач в области как фундаментальной клеточной биологии, так и трансляционной медицины.

Существует несколько стратегий борьбы с метастазированием злокачественных опухолей. Наиболее распространенные противоопухолевые препараты нацелены на торможение клеточного цикла [Blohmer и др., 2010; Maung, O'Shaughnessy, Sledge, 2003] и ингибирование матриксных протеаз, секретируемых клетками для ремоделирования межклеточного матрикса и облегчения миграции клеток [Wojtowicz-Praga, Dickson, Hawkins, 1997]. Однако, наличие побочных действий и возникновение лекарственной устойчивости вынуждает к поиску новых направлений, одним из таких является исследование роли механических свойств клеточного ядра [la Rosa de и др., 2013]. Именно ядро, являясь самым крупным и жестким клеточным компартментом, определяет эластические свойства всей клетки [Booth-Gauthier и др., 2012], что, в свою очередь, влияет на способность клеток мигрировать в условиях ограниченного пространства, формируемого как межклеточным матриксом, так и узкими межклеточными пространствами. При этом жесткость ядра в значительной степени определяет ядерная ламина, двумерная сеть промежуточных филаментов, расположенная на внутренней ядерной мембране. Основными составляющими ядерной ламины являются белки ламины, которые относятся к промежуточным филаментам типа V. На основе гомологий последовательностей, биохимических свойств, поведения в

митозе и особенностей экспрессии ламины подразделяют на А- и В-типы. Зрелые ламины B-типа содержат на С-конце фарнезильную группу, которая обеспечивает взаимодействие белка с ядерной мембраной, в то время как у ламина A данная модификация удаляется при помощи сайт-специфической Zn-зависимой металлопротеиназы ZMPSTE24 на последней стадии созревания [Liu и др., 2006].

Кроме белков-ламинов ядерная ламина включает в себя ламин-связывающие белки, с помощью которых ламина может взаимодействовать как с хроматином, так и с цитоплазмой. Так, например, взаимодействие ядерной ламины и цитоскелета опосредуется через комплексы LINC, которые, в свою очередь, представляют собой взаимодействие неспринов, расположенных на внешней ядерной мембране, и SUN-белков, располагающихся на внутренней мембране. При этом SUN-белки связываются с белками ядерной ламины, а несприны с элементами цитоплазматического цитоскелета.

Таким образом, ламина, опосредуя контакт цитоплазма-хроматин, участвует во многих важных клеточных процессах, таких как митотическое деление, поддержание длины теломер, репликация и репарация ДНК, реорганизация хроматина, а также процессы, активируемые путем механотрансдукции - регуляция транскрипции генов и клеточной дифференцировки. Однако, самой важной функцией ламины является механическая прочность ядра, которая, в первую очередь, обеспечивается ламинами и способствует защите генетического материала. Было показано, что наибольший вклад в жесткость ядра и поддержание формы дают ламины типа А, в то время как, ламины В-типа скорее поддерживают целостность и эластичность ядерной оболочки [Buxboim и др., 2017]. Однако существование определённой корреляции между деформацией измененной формы ядра, общепринятым маркером опухолевой прогрессии, и уровнем экспрессии ламинов остается невыясненной. Для большого количества опухолей

характерно снижение экспрессии ламинов, а также их белков-партнеров - ламин-ассоциированных белков и белков LINC-комплекса [Broers, Ramaekers, 2014]. В отличие от ламина B, ламин A начинает экспрессироваться только в период клеточной дифференцировки [Pekovic, Hutchison, 2008], что, возможно, указывает на переход опухолевых клеток в «эмбриональное» состояние, для которого характерны нарушения путей механотрансдукции.

В то же время, жесткость ядра определяет способность клетки к сильной деформации, что важно для успешного прохождения клеток сквозь сужения, сформированные внеклеточным матриксом. Для опухолевых клеток было показано, что пониженный уровень экспрессии ламина A коррелирует с увеличением агрессивности опухоли, в частности, с более эффективной миграцией через поры, размер которых меньше размера ядра [Harada и др., 2014]. Подобные результаты были получены при изучении миграции клеток в микрофлюидных камерах [Denais и др., 2016; Raab и др., 2016].

С другой стороны, накопление непроцессированных форм ламина A увеличивают жесткость ядра и снижают эффективность миграции [Ovsiannikova и др., 2019]. Накопление непроцессированных форм ламина A характерно для прогероидных синдромов, вызванных мутациями в гене ламина A или ферментов, участвующих в созревании последнего [Eriksson и др., 2003; Navarro и др., 2004]. Так, для прогерии Хатчинсона-Гилфорда характерно накопление прогерина - изоформы ламина A, сохраняющей фарнезильную группу из-за делеции сайта протеолиза в результате мутации или ошибок сплайсинга. Последнее, вероятно, происходит при нормальном старении [Ashapkin и др., 2019]. Мутации в гене ZMPSTE24, как при рестриктивной дермопатии, также приводят к накоплению прогерина [Navarro и др., 2005]. Таким образом, тот факт, что увеличение жесткости ядерной оболочки возможно за счет накопления прогерина вследствие ингибирования последней стадии созревания ламина A, делает металлопротеиназу ZMPSTE24

перспективной мишенью для терапии, направленной на подавление метастазирования [Clarke, 2007]. В нашей работе мы рассматриваем 4 соединения из библиотек ингибиторов матричных протеаз и структурного гомолога ангиотензинпревращающего фермента (ACE) в качестве потенциальных ингибиторов миграции за счет подавления активности ZMPSTE24.

Целью данной работы является исследование влияния нарушений процессинга ламина A под действием ингибиторов ZMPSTE24 на состав пула ламина A, механические свойства ядра и эффективность миграции клеток в ограниченном пространстве.

Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи:

1) определить потенциальные ингибиторы ZMPSTE24 и их цитотоксичность,

2) исследовать влияние экспрессии процессированной и непроцессированной формы ламина A на жесткость ядерной оболочки методом сканирующей ион-проводящей микроскопии,

3) определить влияние ингибиторов ZMPSTE24 на скорость миграции клеток,

4) определить влияние ингибиторов ZMPSTE24 на клеточный цикл,

5) исследовать роль непроцессированной формы ламина A на степень компактизации и пространственную организацию периферического гетерохроматина.

Научная новизна исследования. Впервые установлено с помощью сканирующей ион-проводящей микроскопии увеличение жесткости ядер клеток фибросаркомы человека HT1080 при экспрессии прогерина и гиперэкспрессии ламина A. Показано, что экспрессия прогерина снижает способность к миграции в ограниченном пространстве, в то время как нокдаун ламина A увеличивает эффективность миграции. Также впервые показана

корреляция между подавлением экспрессии ламина A и увеличением скорости миграции в открытых пространствах.

Впервые продемонстрирована потенциальная активность батимастата и фозиноприла как ингибитора ZMPSTE24. Показано, что инкубация с лопинавиром, фозиноприлом и батимастатом значительно снижает миграцию клеток НТ1080 через мелкие поры. Впервые обнаружено влияние лопинавира на реорганизацию периферического гетерохроматина, связанная с перемещением Н3К9те2/3-позитивного гетерохроматина от периферии к центру ядра.

Теоретическая и практическая значимость исследования.

Полученные данные дополняют теоретические представления о роли ядерной оболочки в миграции клеток и ядерной организации. Результаты исследования лопинавира, фозиноприла и батимастата могут быть использованы для дальнейшей разработки селективных ингибиторов ZMPSTE24 с целью использования их в противоопухолевой терапии. Информация о побочных эффектах лопинавира может быть использована для разработки персонифицированной терапии ВИЧ-инфекции.

Методология и методы диссертационного исследования. В исследовании были использованы биоинженерные, биохимические методы и методы работы с культурами клеток млекопитающих для проведения экспериментальных исследований. Все использованные методики были применены в соответствии с общепринятыми мировыми стандартами и с надлежащими контролями.

Положения, выносимые на защиту:

1. Фозиноприл обладает ингибирующей активностью по отношению к ZMPSTE24, низкой цитотоксичностью и более высокой эффективностью по сравнению известными ингибиторами ZMPSTE24.

2. Повышение уровня ламина A и экспрессия прогерина приводят к увеличению жесткости ядра клеток HT1080, что подтверждается данными сканирующей ион-проводящей микроскопии.

3. Ингибиторы ZMPSTE24 снижают скорость миграции клеток в ограниченном пространстве за счет накопления фарнезилированной формы ламина A и увеличения жесткости ядерной ламины.

4. Ингибирование ZMPSTE24 вызывает торможение клеточного цикла на границе G2/M.

5. Накопление преламина A, индуцированного ингибиторами ZMPSTE24, приводит к перераспределению эпигенетических паттернов H3K9me2/3 от периферии к центру ядра.

Степень достоверности полученных результатов и апробация результатов работы. Достоверность полученных результатов обеспечена использованием современных методов и сертифицированного оборудования. Все эксперименты проводились с надлежащим количеством повторов, подтверждающим воспроизводимость результатов. В экспериментах соблюдался необходимый для корректной статистической обработки объём выборки. Данные, полученные в экспериментах, обрабатывали с использованием подходящих статистических методов.

Результаты работы были представлены на Всероссийском симпозиуме с международным участием «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, Россия, 2018), Международной конференции «27th Wilhelm Bernhard Workshop on the Cell Nucleus» (Дижон, Франция, 2019), Всероссийской конференции с международным участием «II Объединенный научный форум, включающий VI Съезд физиологов СНГ, VI Съезд биохимиков России и IX Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Дагомыс, Россия, 2019), VI Всероссийской Конференции по молекулярной онкологии (Москва, Россия, 2021). По материалам диссертации подготовлены 4 печатные

работы, входящие в международные реферативные базы данных и систем цитирования и, соответственно, в Перечень ВАК:

1. Овсянникова, Н. Л., Лаврушкина, С. В., Иванова, А. В., Мазина, Л. М., Жиронкина, О. А., Киреев, И. И. (2021). Ламин A как определяющий фактор механических свойств ядра в норме и при патологии. Биохимия, 86(10): 1563—1577.

2. Vakhrusheva, A., Endzhievskaya, S., Zhuikov, V., Nekrasova, T., Parshina, E., Ovsiannikova, N., Popov, V., Bagrov, D., Minin, A., Sokolova, O.S. (2019). The role of vimentin in directional migration of rat fibroblasts. Cytoskeleton, 76(9-10): 467- 476.

3. Лаврушкина, С. В., Овсянникова, Н. Л., Юдина, А. С., Стрелкова, О. С., Жиронкина, О. А., Киреев, И. И. (2018). Канцерогенез и старение: взгляд со стороны ядерной ламины. Цитология, 60(11):892-894.

4. Лаврушкина, С. В., Овсянникова, Н. Л., Юдина, А. С., Стрелкова, О. С., Жиронкина, О. А., Перепелина, К. И., Малашичева, А. Б., Киреев, И. И. (2018). Роль механических свойств ядра в поддержании гомеостаза тканей. Цитология, 60(11):911-915.

Структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 155 страницах, иллюстрирована 39 рисунками и 5 таблицами. Список цитируемой литературы включает 201 наименование.

2. Обзор литературы

2.1. Строение ядерной ламины

Ядерная оболочка представляет собой двойной липидный бислой, отделяющий ядерный компартмент от цитоплазмы. Она участвует в обеспечении клеточного гомеостаза, передачи сигналов и организации хроматина [МекМй, Moazed, 2010].

Ядерная оболочка состоит из внешней и внутренней мембран, разделенных перинуклеарным пространством шириной около 50 нм. Мембраны соприкасаются в местах расположения ядерных поровых комплексов, обеспечивающих селективный транспорт макромолекул внутрь ядра и из него в цитоплазму [Рт1ап, Вюктоге, 2008]. Внешняя мембрана обращена наружу к цитоплазме и переходит непосредственно в ЭПР. Внутренняя мембрана содержит в своем составе периферические и трансмембранные белки [Mewborn и др., 2010], в том числе ядерную ламину (Рис.1).

Рисунок 1. Схематическое представление ядерной ламины и ассоциированных с ней структур [Shah, Wolf, Lammerding, 2017].

Ядерная ламина представляет собой белковую сеть, основными компонентами которой являются белки ламины, относящиеся к промежуточным филаментам V типа. На данный момент известно, что гены ламинов найдены в геномах всех животных, исследованных до настоящего

времени, но при этом не обнаружены у растений и одноклеточных организмов [Dechat и др., 2008], хотя аналогичные по вторичной структуре и внутриклеточной организации (при отсутствии гомологий первичной структуры) белки были в последнее время идентифицированы и у организмов других царств многоклеточных [Fal и др., 2017; Masuda, Hikida, Fujino, 2021]. И если C. elegans имеет только один ген ламина, то в геномах высших эукариот ламины кодируются тремя генами. Ламины А-типа получаются из одного гена LMNA путем альтернативного сплайсинга [Lin, Worman, 1993], наиболее экспрессируемыми, т.н. мажорными формами, являются ламины А и С. Ламины В-типа, ламины B1 и B2 кодируются двумя разными генами, LMNB1 и LMNB2, соответственно [Verstraeten и др., 2008].

2.1.1. Созревание ламинов

Различия между ламинами типов А и В наблюдаются уже на стадии созревания белков (Рис.2). Белки обоих типов первоначально транслируются в форме преламинов, характеризующихся специфической C-концевой белковой последовательностью CAAX, т.н. CAAX-бокс, где С - цистеин, A - остаток любой алифатической аминокислоты, X - остаток любой аминокислоты.

На первом этапе созревания ламинов фарнезил-трансфераза FTase переносит фарнезил, липофильную изопренильную группу, к карбоксильной группе цистеина в CAAX-боксе. Далее отщепляются три белковых остатка (-AAX) эндопептидазами ЭПР, ZMPSTE24 и RCE1. Затем на третьем этапе цистеиновый остаток карбоксиметилируется с помощью ICMT, мембранной карбоксил-метилтрансферазой ЭПР. На этом созревание ламина B-типа заканчивается. Предполагается, что, благодаря гидрофобным карбоксиметил-и фарнезил-группам происходит закрепление ламинов B-типа на внутренней ядерной мембране и стабилизируются белок-белковые взаимодействия [Liu и др., 2006]. Однако несозревший ламин A подвергается еще одной модификации - ZMPSTE24-зависимому протеазному расщеплению, при

котором удаляются 15 аминокислот с С-конца, включая фарнезилированный и карбоксиметилированный цистеиновый остаток. В результате, созревший ламин A теряет фарнезил-группу и не способен напрямую связываться с ядерной мембраной. Следует отметить, что последовательность этих этапов во времени критична, то есть если фарнезилирование заблокировано, то последующее созревание белков оказывается невозможным.

А

Зрелый ламин А

Рисунок 2. Структура белков ядерной ламины. (А) Схематическое представление полипептидной цепи преламина. а-спиральный rod-домен (красный), NLS (серый), ^-укладка, изображенная как девять Р-листов (синий) и ^концевой СААХ-бокс (зеленый). (Б) Пост-трансляционный процессинг преламина A, В1 и В2. (В) Схематическое представление С-концевого хвостового домена созревших ламинов А, С, В1, и В2. В порядке отмеченных номеров аминокислот: начало С-концевого домена, первый остаток NLS, начало и конец и конечный остаток в хвосте созревшего ламина [Dechat и др., 2008].

2.1.2. Структура белков ламины

Все ламины имеют одинаковую доменную структуру - короткий неструктурированный N-концевой головной домен (ок. 30 а.о.), за которым следует центральный стержневой домен или rod-домен (ок. 350 а.о.). На другом конце белка располагается глобулярный и вариабельный C-концевой домен. Центральный стержневой домен организован в три а спиральных сегмента (coil 1a, coil 1b и coil 2), соединенных короткими промежуточными

субдоменами, называемыми линкерами L1 и L12. С-концевой домен включает в себя иммуноглобулин-подобный домен, сигнал ядерной локализации (NLS) для транспортировки белка в ядро и сайт связывания хроматина (Рис.ЗА) [Ahn и др., 2019].

Димеры формируются из двух параллельно-ориентированных белков за счет гидрофобного взаимодействия гептадных повторов в центральном стержневом домене (Рис.ЗБ). В результате, димер представляет собой растворимую супер-спираль с заряженной поверхностью. Предполагается, что далее гомодимеры организуются в нити по принципу голова-к-хвосту [Nigg, 1992]. Однако какие именно взаимодействия и механизмы стоят за формированием ламиновых сетей - разветвленного соединения нитей, которые наблюдаются в клетке, на данный момент неизвестно.

Сложности изучения данного вопроса возникают из-за высокой скорости сборки, большой гибкости структуры и плохой растворимости белков. В результате структура полимера описана с помощью электронного микроскопа только в низком разрешении, а рентгеноструктурный анализ высокого разрешения возможен только для коротких растворимых фрагментов [Krimm и др., 2002; Strelkov и др., 2004]. Однако, в 2019 году была предложена новая модель сборки ламинов. Авторы предполагают, что тетрамер ламина будет формироваться так же, как и тетрамер виментина, - два димера, связанных в поперечном направлении по принципу голова-к-хвосту [Ahn и др., 2019], что полностью соответствует структуре тетрамерных нитей ламинов А- и В-, показанных ранее с помощью методов крио-электронной томографии [Turgay и др., 2017] (Рис.ЗВ, Г). Основными силами, которые формируют образование тетрамера, являются A11- и еА22-взаимодействия между димерами ламина, которые подобны взаимодействиям A11 и A22, формирующим тетрамер виментина. A11 предполагает антипараллельное взаимодействие между coil 1b, eA22 - между coil 2. Кроме того, тетрамерная

модель является одной из немногих, которая смогла объяснить возникновение некоторых ламинопатий, вызванных точечными мутациями ламина A.

Рисунок 3. (А) Полноразмерная модель димера ламина A, реконструированная в работе [Ahn и др., 2019] с использованием данных РСА предыдущих лет. Неструктурированные регионы: N-конец и NLS-содержащий регион (с 386 по 428 а.о.) и C-конец - обозначены пунктиром. (Б) Схема взаимодействия гептадных повторов, участвующих в стабилизации димера. (В) Модель сборки нити ламина A, образованной за счет взаимодействий A11 и eA22 на участках a и b соответственно. Данные взаимодействия аналогичны A11- и A22-взаимодействиям, стабилизирующим тетрамерное состояние виментина. [Ahn и др., 2019] с изменениями. (Г) Структура нити ламина A, полученная в работе [Turgay и др., 2017] с использованием криоэлектронной томографии. (Д) Визуализация сетей ламина A и B1, а также хроматина (DAPI) в клетках HeLa при экспрессии экзогенного ламина A (верхняя строка) и прогерина (нижняя строка) [Booth и др., 2015].

2.1.3. Сборка ядерной ламины

Достаточно мало известно о взаимодействиях ламинов разных типов между собой. Используя метод FRET и tdFLIM при ко-экспрессии ламинов А-и В-типов в клетках млекопитающих, исследователи обнаруживают как гомо-, так и гетеротипичные взаимодействия между различными типами ламинов [Delbarre и др., 2006]. При этом количество гомотипичных контактов существенно превышает число гетеротипичных. Также авторы статьи отмечают неравномерное распределение белков ламины по поверхности ядерной мембраны.

А

В

Б

-^Т&ч

ШШЬ

¿mm

тШт

■ il.-is.,-*.3.

Шёщш*

Рисунок 4. Модели организации ядерной ламины. (А) Модель иерархической организации [Delbarre и др., 2006]. (Б) Визуализация структуры ядерной ламины с помощью микроскопии сверхвысокого разрешения STORM. Ламин B1 (зеленый), ламин A (красный), размер масштабного отрезка 2 мкм (слева) и 500 нм (справа). (В) Представление модели на основе снимка [Nmezi и др., 2019].

Также было показано, что снижение уровня ламина B1 приводит к дезорганизации ламиновых сетей, в то время как нокдаун ламина A никак не влияет на сборку [Shimi и др., 2008]. Авторы предложили модель иерархической организации ядерной ламины (Рис.4А), где ламин B заякоревается на ядерную оболочку и далее взаимодействует с ламином A. Однако, в следующих работах авторы отвергли эту модель. Исследуя сборку

ламинов при серии нокаутов разных изоформ ламинов в мышиных эмбриональных клетках, они показали, что каждый из ламинов (A, B1 или B2) может собираться в равномерно организованную сеть, когда он экспрессируется на достаточном уровне [Shimi и др., 2015]. Если же в клетке экспрессируется несколько ламинов, то наиболее высоко экспрессируемый ламин независимо от своего типа облегчает организацию остальных, которые экспрессируются на более низких уровнях. Однако, образование гомополимеров, вероятно, предпочтительно, поскольку при достаточном уровне ламинов A- и B-типа методами электронной микроскопии и микроскопии сверхвысокого разрешения было показано формирование независимых сетей [Nmezi и др., 2019] (Рис.4Б, В).

2.2. Факторы, определяющие механические свойства ядра

Важным участником стабилизации формы ядра в условиях механического стресса является хроматин. Эксперименты с изолированными ядрами, обработанными микрококковой нуклеазой для удаления всей ДНК, показали, что сами по себе ламины не могут поддерживать форму ядра. В отсутствие хроматина ядро демонстрирует высокую пластичность под механической нагрузкой [Banigan, Stephens, Marko, 2017].

С биофизической точки зрения хроматин представляет собой полимер с различной степенью уплотнения [Ou и др., 2017]. Само же ядро описывают с помощью хемомеханической модели, согласно которой на периферии ядра располагается полужесткая сеть ламинов, а внутри - вязкоупругий полимерный хроматиновый гель [Banigan, Stephens, Marko, 2017].

Исследования показывают, что при небольших (на несколько микрон) кратковременных деформациях хроматин действует подобно упругой пружине [Bouck, Bloom, 2007; Stephens и др., 2017]. При этом длительное (более 30 минут) или большое по величине приложение силы вызывает реорганизацию ядерного пространства, в том числе изменение компактизации хроматина и перемещение ядерных телец [Booth-Gauthier и др., 2012]. Хотя и

с точки зрения реологии увеличение жесткости при уплотнении закономерно для подобного полимера [Chalut и др., 2012; Spagnol, Dahl, 2016], нельзя исключать вариант компактизации за счет изменения эпигенетического состояния, активированного через сигнальные пути в результате стресса.

Таким образом, хроматин, вероятно, играет главную роль в ответе на малые и краткие воздействия, где он ведет себя подобно упругой пружине. Также он отвечает за первичный ответ при более длительных и сильных стрессах, когда нивелирование воздействия происходит за счет реорганизации хроматина. В то же время ядерная ламина обуславливает вторичный ответ и адаптацию к механическим воздействиям за счет увеличения своей жесткости. Действительно, для твердых тканей, подверженных механическому напряжению, характерно увеличение экспрессия ламинов. Действительно, была обнаружена положительная корреляция между жесткостью ткани в целом и экспрессией ламина A, которая увеличивается в 30 раз, а ламина B1 в 3 раза при увеличении жесткости ткани (Рис.5) [Swift и др., 2013]. При этом в группе твердых тканей наблюдаются незначительные различия экспрессии ламинов B-типа.

Предполагается, что в случае тканей, подвергающихся механическому стрессу, именно ламины A-типа вносят основной вклад в жесткость ядерной оболочки, тогда как уровень экспрессии ламина B практически постоянен [Lammerding и др., 2006; Pajerowski и др., 2007]. Это хорошо соотносится с тем, что ламины A являются более поздним приобретением с эволюционной точки зрения по сравнению с ламинами B, которые присутствуют практически у всех Metazoa [Constantinescu и др., 2006; Pekovic, Hutchison, 2008].

Помимо эволюционного аспекта, экспрессия ламинов зависит от стадии онтогенеза [Mounkes и др., 2003]. Ламин B синтезируется во всех клетках многоклеточных организмов в течение всего развития. В то же время экспрессия ламинов A-типа меняется при коммитировании клеток: ламин A/C отсутствует в стволовых, эмбриональных клетках и обнаруживается только в

дифференцированных клетках [Prather и др., 1991; Rober и др., 1990], которые оказываются жестче своих эмбриональных предшественников [Pajerowski и др., 2007]. Более того, искусственная экспрессия ламина A в ооцитах лягушек, где ламин A в нормальных условиях отсутствует, приводит к зависящему от уровня экспрессии ламина A увеличению жесткости ядра [Schäpe и др., 2009].

А

Б

го с 3

н

ф

го с 5

I-<

л

I

го 15

О)

о

Преобладание ламина A-типа Кость

" /

Костный мозг •

Хрящ

X*

Жир Мышцы

I-1 ■ 4*'

Печень

Vf*** Почка

.** я Мозг Преобладание ламина Б-тип а

Log (жесткость) 1 10

Жесткость ткани (кПа} Рисунок 5. Жесткость ткани коррелирует с соотношением ламин Л:ламин В. (А) Корреляция отношения ламинов с жесткостью ткани. (Б) Корреляция жесткости ткани и содержания ламина B-типа [Swift и др., 2013].

Долгое время считалось, что ламин A/C определяет механические свойства ядра, тогда как ламин B1 отвечает только за позиционирование ядра в клетке [Ji и др., 2007]. Позже, когда выяснилось, что экспрессия ламинов обоих типов положительно коррелирует с жесткостью ядра [Swift и др., 2013], была предложена теория, где ламин A/C отвечает за вязкость, а ламины B1 и B2 вносят вклад в упругость. Однако, эти выводы до сих пор не подтвердились ни экспериментально, ни методами механического моделирования.

Похожие диссертационные работы по специальности «Другие cпециальности», 00.00.00 шифр ВАК

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Овсянникова Наталья Леонидовна, 2022 год

8. Список литературы

1. Agarwal A. K. Zinc metalloproteinase, ZMPSTE24, is mutated in mandibuloacral dysplasia // Hum. Mol. Genet. 2003. Т. 12. № 16. С. 1995-2001.

2. Agrelo R. и др. Inactivation of the Lamin A/C Gene by CpG Island Promoter Hypermethylation in Hematologic Malignancies, and Its Association With Poor Survival in Nodal Diffuse Large B-Cell Lymphoma // J. Clin. Oncol. 2005. Т. 23. № 17. С. 3940-3947.

3. Ahn J. и др. Structural basis for lamin assembly at the molecular level. // Nat. Commun. 2019. Т. 10. № 1. С. 3757.

4. Alhudiri I. M. и др. Expression of Lamin A/C in early-stage breast cancer and its prognostic value // Breast Cancer Res. Treat. 2019. Т. 174. №2 3. С. 661-668.

5. Ashapkin V. V. и др. Are There Common Mechanisms Between the Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome and Natural Aging? // Front. Genet. 2019. Т. 10. С. 455.

6. Banigan E. J., Stephens A. D., Marko J. F. Mechanics and Buckling of Biopolymeric Shells and Cell Nuclei // Biophys. J. 2017. Т. 113. № 8. С. 16541663.

7. Basile M. S. и др. Anticancer and Differentiation Properties of the Nitric Oxide Derivative of Lopinavir in Human Glioblastoma Cells. // Molecules. 2018. Т. 23. № 10. С. 2463.

8. Bell E. S. и др. Low lamin A levels enhance confined cell migration and metastatic capacity in breast cancer // bioRxiv. 2021. С. 2021.07.12.451842.

9. Belmont A. S., Sedat J. W., Agard D. A. A three-dimensional approach to mitotic chromosome structure: evidence for a complex hierarchical organization. // J. Cell Biol. 1987. Т. 105. № 1. С. 77-92.

10. Belmont A. S., Zhai Y., Thilenius A. Lamin B distribution and association

with peripheral chromatin revealed by optical sectioning and electron microscopy tomography. // J. Cell Biol. 1993. T. 123. № 6. C. 1671-1685.

11. Belt E. J. T. h gp. Loss of lamin A/C expression in stage II and III colon cancer is associated with disease recurrence // Eur. J. Cancer. 2011. T. 47. № 12. C. 1837-1845.

12. Bernstein W. B., Dennis P. A. Repositioning HIV protease inhibitors as cancer therapeutics // Curr. Opin. HIV AIDS. 2008. T. 3. № 6. C. 666-675.

13. Blohmer J. U. h gp. Epirubicin and cyclophosphamide versus epirubicin and docetaxel as first-line therapy for women with metastatic breast cancer: Final results of a randomised phase III trial // Ann. Oncol. 2010. T. 21. № 7. C. 14301435.

14. Booth-Gauthier E. A. h gp. Force-induced changes in subnuclear movement and rheology // Biophys. J. 2012a. T. 103. № 12. C. 2423-2431.

15. Booth-Gauthier E. A. h gp. Force-Induced Changes in Subnuclear Movement and Rheology // Biophys. J. 2012b. T. 103. № 12. C. 2423-2431.

16. Booth E. A. h gp. Nuclear stiffening and chromatin softening with progerin expression leads to an attenuated nuclear response to force // Soft Matter. 2015. T. 11. № 32. C. 6412-6418.

17. Bouck D. C., Bloom K. Pericentric Chromatin Is an Elastic Component of the Mitotic Spindle // Curr. Biol. 2007a. T. 17. № 9. C. 741-748.

18. Bouck D. C., Bloom K. Pericentric Chromatin Is an Elastic Component of the Mitotic Spindle // Curr. Biol. 2007b. T. 17. № 9. C. 741-748.

19. Brink M. C. h gp. A role for MeCP2 in switching gene activity via chromatin unfolding and HP1y displacement. // PLoS One. 2013. T. 8. № 7. C. e69347.

20. Broers J. L. V. h gp. Dynamics of the nuclear lamina as monitored by

GFP-tagged A-type lamins // J. Cell Sci. 1999. T. 112. № 20. C. 3463-3475.

21. Broers J. L. V. h gp. Decreased mechanical stiffness in LMNA-/- cells is caused by defective nucleo-cytoskeletal integrity: Implications for the development of laminopathies // Hum. Mol. Genet. 2004. T. 13. № 21. C. 2567-2580.

22. Broers J. L. V, Ramaekers F. C. S. The role of the nuclear lamina in cancer and apoptosis. // Adv. Exp. Med. Biol. 2014. T. 773. C. 27-48.

23. Buxboim A. h gp. Matrix elasticity regulates lamin-A,C phosphorylation and turnover with feedback to actomyosin // Curr. Biol. 2014. T. 24. №2 16. C. 19091917.

24. Buxboim A. h gp. Coordinated increase of nuclear tension and lamin-A with matrix stiffness outcompetes lamin-B receptor that favors soft tissue phenotypes // Mol. Biol. Cell. 2017. T. 28. № 23. C. 3333-3348.

25. Beroud C. h gp. UMD (Universal Mutation Database): A generic software to build and analyze locus-specific databases // Hum. Mutat. 2000. T. 15. № 1. C. 86-94.

26. Caille N. h gp. Contribution of the nucleus to the mechanical properties of endothelial cells // J. Biomech. 2002. T. 35. № 2. C. 177-187.

27. Cao K. h gp. Progerin and telomere dysfunction collaborate to trigger cellular senescence in normal human fibroblasts // J. Clin. Invest. 2011. T. 121. №2 7. C. 2833-2844.

28. Caux F. h gp. A New Clinical Condition Linked to a Novel Mutation in Lamins A and C with Generalized Lipoatrophy, Insulin-Resistant Diabetes, Disseminated Leukomelanodermic Papules, Liver Steatosis, and Cardiomyopathy // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2003. T. 88. № 3. C. 1006-1013.

29. Chalut K. J. h gp. Chromatin decondensation and nuclear softening accompany Nanog downregulation in embryonic stem cells // Biophys. J. 2012.

T. 103. № 10. C. 2060-2070.

30. Chang W. h gp. Imbalanced nucleocytoskeletal connections create common polarity defects in progeria and physiological aging // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2019. T. 116. № 9. C. 3578-3583.

31. Chen C. Y. h gp. Accumulation of the inner nuclear envelope protein Sun1 is pathogenic in progeric and dystrophic laminopathies // Cell. 2012. T. 149. № 3. C. 565-577.

32. Chen N. Y. h gp. An absence of lamin B1 in migrating neurons causes nuclear membrane ruptures and cell death // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2019. T. 116. № 51. C. 25870-25879.

33. Chen Z. J. h gp. Dysregulated interactions between lamin A and SUN1 induce abnormalities in the nuclear envelope and endoplasmic reticulum in progeric laminopathies // J. Cell Sci. 2014. T. 127. № 8. C. 1792-1804.

34. Cho S. h gp. Progerin phosphorylation in interphase is lower and less mechanosensitive than lamin-a,c in ips-derived mesenchymal stem cells // Nucleus. 2018. T. 9. № 1. C. 235-250.

35. Chojnowski A. h gp. Heterochromatin loss as a determinant of progerin-induced DNA damage in Hutchinson-Gilford Progeria // Aging Cell. 2020. T. 19. № 3. C. e13108.

36. Chong J. X. h gp. A Population-Based Study of Autosomal-Recessive Disease-Causing Mutations in a Founder Population // Am. J. Hum. Genet. 2012. T. 91. № 4. C. 608-620.

37. Clarke R. W. h gp. Low Stress Ion Conductance Microscopy of Sub-Cellular Stiffness // Soft Matter. 2016. T. 12. № 38. C. 7953-7958.

38. Clarke S. G. HIV protease inhibitors and nuclear lamin processing: Getting the right bells and whistles // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2007. T. 104. № 35.

C. 13857-13858.

39. Cobb A. M. h gp. Disruption of PCNA-lamins A/C interactions by prelamin A induces DNA replication fork stalling // Nucleus. 2016. T. 7. № 5. C. 498-511.

40. Coffinier C. h gp. A potent HIV protease inhibitor, darunavir, does not inhibit ZMPSTE24 or lead to an accumulation of farnesyl-prelamin a in cells // J. Biol. Chem. 2008. T. 283. № 15. C. 9797-9804.

41. Coffinier C. h gp. Deficiencies in lamin B1 and lamin B2 cause neurodevelopmental defects and distinct nuclear shape abnormalities in neurons // Mol. Biol. Cell. 2011. T. 22. № 23. C. 4461-4703.

42. Constantinescu D. h gp. Lamin A/C Expression Is a Marker of Mouse and Human Embryonic Stem Cell Differentiation // Stem Cells. 2006. T. 24. № 1. C. 177-185.

43. Cristofoli F. h gp. De Novo Variants in LMNB1 Cause Pronounced Syndromic Microcephaly and Disruption of Nuclear Envelope Integrity // Am. J. Hum. Genet. 2020. T. 107. № 4. C. 753-762.

44. Dahl K. N. h gp. Power-law rheology of isolated nuclei with deformation mapping of nuclear substructures // Biophys. J. 2005. T. 89. № 4. C. 2855-2864.

45. Darini C. Y. h gp. Targeting cancer stem cells expressing an embryonic signature with anti-proteases to decrease their tumor potential // Cell Death Dis. 2013. T. 4. № 7. C. e706.

46. Davidson P. M., Lammerding J. Broken nuclei - lamins, nuclear mechanics, and disease // Trends Cell Biol. 2014. T. 24. № 4. C. 247-256.

47. Dechat T. h gp. Nuclear lamins: major factors in the structural organization and function of the nucleus and chromatin // Genes Dev. 2008. T. 22. № 7. C. 832853.

48. Delbarre E. h gp. The truncated prelamin A in Hutchinson-Gilford progeria

syndrome alters segregation of A-type and B-type lamin homopolymers // Hum. Mol. Genet. 2006. T. 15. № 7. C. 1113-1122.

49. Denais C. M. h gp. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration // Science. 2016. T. 352. № 6283. C. 353-358.

50. Dorner D. h gp. Lamina-associated polypeptide 2a regulates cell cycle progression and differentiation via the retinoblastoma-E2F pathway // J. Cell Biol. 2006. T. 173. № 1. C. 83-93.

51. Dufour A. h gp. Role of the hemopexin domain of matrix metalloproteinases in cell migration // J. Cell. Physiol. 2008. T. 217. № 3. C. 643651.

52. Eisch V. h gp. Progerin impairs chromosome maintenance by depleting CENP-F from metaphase kinetochores in Hutchinson-Gilford progeria fibroblasts // Oncotarget. 2016. T. 7. № 17. C. 24700-24718.

53. Eriksson M. h gp. Recurrent de novo point mutations in lamin A cause Hutchinson-Gilford progeria syndrome // Nature. 2003. T. 423. № 6937. C. 293298.

54. Fal K. h gp. Nuclear envelope: a new frontier in plant mechanosensing? // Biophys. Rev. 2017. T. 9. № 4. C. 389-403.

55. Fatkin D. h gp. Missense Mutations in the Rod Domain of the Lamin A/C Gene as Causes of Dilated Cardiomyopathy and Conduction-System Disease // N. Engl. J. Med. 1999. T. 341. № 23. C. 1715-1724.

56. Fernandez P. h gp. Transformation Resistance in a Premature Aging Disorder Identifies a Tumor-Protective Function of BRD4 // Cell Rep. 2014. T. 9. № 1. C. 248-260.

57. Finlan L. E., Bickmore W. A. Porin new light onto chromatin and nuclear organization // Genome Biol. 2008. T. 9. № 5. C. 222.

58. Fracchia A. h gp. Increased Lamin B1 Levels Promote Cell Migration by Altering Perinuclear Actin Organization // Cells. 2020. T. 9. № 10. C. 2161.

59. Friedl P., Wolf K., Lammerding J. Nuclear mechanics during cell migration // Curr. Opin. Cell Biol. 2011. T. 23. № 1. C. 55-64.

60. Gilchrist S. h gp. Altered protein dynamics of disease-associated lamin A mutants // BMC Cell Biol. 2004. T. 5. № 46.

61. Goldman R. D. h gp. Accumulation of mutant lamin A causes progressive changes in nuclear architecture in Hutchinson-Gilford progeria syndrome // Proc. Natl. Acad. Sci. 2004. T. 101. № 24. C. 8963-8968.

62. Gordon L. B. h gp. Progeria: A Paradigm for Translational Medicine // Cell. 2014. T. 156. № 3. C. 400-407.

63. Grigoryev S. A., Bulynko Y. A., Popova E. Y. The end adjusts the means: Heterochromatin remodelling during terminal cell differentiation // Chromosom. Res. 2006. T. 14. № 1. C. 53-69.

64. Guelen L. h gp. Domain organization of human chromosomes revealed by mapping of nuclear lamina interactions // Nature. 2008. T. 453. № 7197. C. 948951.

65. Guilak F., Tedrow J. R., Burgkart R. Viscoelastic Properties of the Cell Nucleus // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. T. 269. № 3. C. 781-786.

66. Hall-Beyer M. GLCM Texture: A Tutorial v. 3.0 March 2017 // Arts Res. Publ. 2017. № 2017- 03. C. 75.

67. Hamadouche T. h gp. Founder effect and estimation of the age of the c.892C>T (p.Arg298Cys) mutation in LMNA associated to Charcot-Marie-Tooth subtype CMT2B1 in families from North Western Africa // Ann. Hum. Genet. 2008. T. 72. № 5. C. 590-597.

68. Harada T. h gp. Nuclear lamin stiffness is a barrier to 3D migration, but

softness can limit survival // J. Cell Biol. 2014. T. 204. № 5. C. 669-682.

69. Hatch E. M., Hetzer M. W. Nuclear envelope rupture is induced by actin-based nucleus confinement // J. Cell Biol. 2016. T. 215. № 1. C. 27-36.

70. Hegele R. A. h gp. Sequencing of the reannotated LMNB2 gene reveals novel mutations in patients with acquired partial lipodystrophy // Am. J. Hum. Genet. 2006. T. 79. № 2. C. 383-389.

71. Helvert S. Van, Storm C., Friedl P. Mechanoreciprocity in cell migration // Nat. Cell Biol. 2018. T. 20. № 1. C. 8-20.

72. Hernandez-Vallejo S. J. h gp. HIV protease inhibitors induce senescence and alter osteoblastic potential of human bone marrow mesenchymal stem cells: Beneficial effect of pravastatin // Aging Cell. 2013. T. 12. № 6. C. 955-965.

73. Hobson C. M. h gp. Correlating nuclear morphology and external force with combined atomic force microscopy and light sheet imaging separates roles of chromatin and lamin A/C in nuclear mechanics // Mol. Biol. Cell. 2020. T. 31. № 16. C. 1788-1801.

74. Houben F. h gp. Disturbed nuclear orientation and cellular migration in Atype lamin deficient cells // Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. 2009. T. 1793. № 2. C. 312-324.

75. Hu X. T. h gp. Overexpression of progerin results in impaired proliferation and invasion of non-small cell lung cancer cells // Onco. Targets. Ther. 2020. T. 13. C. 2629-2642.

76. Hu Y., Ivashkiv L. B. Costimulation of Chemokine Receptor Signaling by Matrix Metalloproteinase-9 Mediates Enhanced Migration of IFN-a Dendritic Cells // J. Immunol. 2006. T. 176. № 10. C. 6022-6033.

77. Hudson M. E. h gp. Identification of differentially expressed proteins in ovarian cancer using high-density protein microarrays //

Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2007. T. 104. № 44. C. 17494-17499.

78. Irianto J. h gp. Nuclear Lamins in Cancer // Cell. Mol. Bioeng. 2016. T. 9. № 2. C. 258-267.

79. Isokane M. h gp. Plasma-membrane-anchored growth factor pro-amphiregulin binds A-type lamin and regulates global transcription // J. Cell Sci. 2008. T. 121. № 21. C. 3608-3618.

80. Jacobs S. A., Khorasanizadeh S. Structure of HP1 Chromodomain Bound to a Lysine 9-Methylated Histone H3 Tail // Science. 2002. T. 295. № 5562. C. 2080-2083.

81. Jemal A. h gp. Global cancer statistics // CA. Cancer J. Clin. 2011. T. 61. № 2. C. 69-90.

82. Ji J. Y. h gp. Cell nuclei spin in the absence of lamin B1 // J. Biol. Chem. 2007. T. 282. № 27. C. 20015-20026.

83. Jia Y. h gp. Lamin B1 loss promotes lung cancer development and metastasis by epigenetic derepression of RET // J. Exp. Med. 2019. T. 216. № 6. C. 1377-1395.

84. Kariya R. h gp. HIV protease inhibitor Lopinavir induces apoptosis of primary effusion lymphoma cells via suppression of NF-kB pathway // Cancer Lett. 2014. T. 342. № 1. C. 52-59.

85. Kaspi E. h gp. Low lamin A expression in lung adenocarcinoma cells from pleural effusions is a pejorative factor associated with high number of metastatic sites and poor Performance status // PLoS One. 2017. T. 12. № 8. C. e0183136.

86. Kelley J. B. h gp. The Defective Nuclear Lamina in Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome Disrupts the Nucleocytoplasmic Ran Gradient and Inhibits Nuclear Localization of Ubc9 // Mol. Cell. Biol. 2011. T. 31. № 16. C. 3378-3395.

87. Kennedy B. K., Pennypacker J. K. RB and Lamins in Cell Cycle Regulation

and Aging // Advances in Experimental Medicine and Biology / nog peg. E. Schirmer, J. de las Heras. : Springer, New York, NY, 2014. C. 127-142.

88. Khalatbari A. h gp. Ritonavir and Lopinavir Suppress RCE1 and CAAX Rab Proteins Sensitizing the Liver to Organelle Stress and Injury // Hepatol. Commun. 2020. T. 4. № 6. C. 932-944.

89. Khan Z. S., Santos J. M., Hussain F. Aggressive prostate cancer cell nuclei have reduced stiffness // Biomicrofluidics. 2018. T. 12. № 1. C. 014102.

90. Khanna P., Opitz J. M., Gilbert-Barness E. RESTRICTIVE DERMOPATHY: REPORT AND REVIEW // Fetal Pediatr. Pathol. 2008. T. 27. № 2. C. 105-118.

91. Koch A. J., Holaska J. M. Emerin in health and disease // Semin. Cell Dev. Biol. 2014. T. 29. C. 95-106.

92. Kojima S. I., Vignjevic D., Borisy G. G. Improved silencing vector co-expressing GFP and small hairpin RNA // Biotechniques. 2004. T. 36. № 1. C. 7479.

93. Kong L. h gp. Lamin A/C protein is overexpressed in tissue-invading prostate cancer and promotes prostate cancer cell growth, migration and invasion through the PI3K/AKT/PTEN pathway // Carcinogenesis. 2012. T. 33. № 4. C. 751759.

94. Krimm I. h gp. The Ig-like structure of the C-terminal domain of lamin A/C, mutated in muscular dystrophies, cardiomyopathy, and partial lipodystrophy // Structure. 2002. T. 10. № 6. C. 811-823.

95. la Rosa J. de h gp. Prelamin A causes progeria through cell-extrinsic mechanisms and prevents cancer invasion // Nat. Commun. 2013. T. 4. № 1. C. 2268.

96. Lammerding J. h gp. Lamins a and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics // J. Biol. Chem. 2006. T. 281. № 35. C. 25768-25780.

97. Lammerding J. Mechanics of the nucleus // Compr. Physiol. 2011. T. 1. № 2. C. 783-807.

98. Leco K. J. h gp. MATRIX METALLOPROTEINASE INHIBITORS // Encyclopedia of Respiratory Medicine. : Elsevier, 2006. C. 9-18.

99. Lee J. h gp. A matrix metalloproteinase inhibitor, batimastat, retards the development of osteolytic bone metastases by MDA-MB-231 human breast cancer cells in Balb C nu/nu mice // Eur. J. Cancer. 2001. T. 37. № 1. C. 106-113.

100. Li G., Sudlow G., Belmont A. S. Interphase cell cycle dynamics of a late-replicating, heterochromatic homogeneously staining region: Precise choreography of condensation/decondensation and nuclear positioning // J. Cell Biol. 1998. T. 140. № 5.

101. Li L. h gp. Lamin B1 Is a Novel Therapeutic Target of Betulinic Acid in Pancreatic Cancer // Clin. Cancer Res. 2013. T. 19. № 17. C. 4651-4661.

102. Limia C. h gp. Emerging Roles of the Endoplasmic Reticulum Associated Unfolded Protein Response in Cancer Cell Migration and Invasion // Cancers (Basel). 2019. T. 11. № 5. C. 631.

103. Lin F., Worman H. J. Structural organization of the human gene encoding nuclear lamin A and nuclear lamin C // J. Biol. Chem. 1993. T. 268. №2 22. C. 1632116326.

104. Liu B. h gp. Depleting the methyltransferase Suv39h1 improves DNA repair and extends lifespan in a progeria mouse model // Nat. Commun. 2013a. T. 4. № 1. C. 1868.

105. Liu L. h gp. P-Asarone induces senescence in colorectal cancer cells by inducing lamin B1 expression // Phytomedicine. 2013b. T. 20. № 6. C. 512-520.

106. Liu L. h gp. Chromatin organization regulated by EZH2-mediated H3K27me3 is required for OPN-induced migration of bone marrow-derived

mesenchymal stem cells // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2018. T. 96. C. 29-39.

107. Liu Q. h gp. Dynamics of Lamin-A Processing Following Precursor Accumulation // PLoS One. 2010. T. 5. № 5. C. e10874.

108. Liu Y. h gp. DNA damage responses in progeroid syndromes arise from defective maturation of prelamin A // J. Cell Sci. 2006. T. 119. № 22. C. 4644-4649.

109. Lochs S. J. A., Kefalopoulou S., Kind J. Lamina Associated Domains and Gene Regulation in Development and Cancer // Cells. 2019. T. 8. № 3. C. 271.

110. Ma J. h gp. EZH2-mediated microRNA-139-5p regulates epithelialmesenchymal transition and lymph node metastasis of pancreatic cancer // Mol. Cells. 2018. T. 41. № 9. C. 868-880.

111. Marima R. h gp. The dual protease inhibitor lopinavir/ritonavir (LPV/r) exerts genotoxic stress on lung cells // Biomed. Pharmacother. 2020. T. 132. C. 110829.

112. Marullo F. h gp. Nucleoplasmic Lamin A/C and Polycomb group of proteins: An evolutionarily conserved interplay // Nucleus. 2016. T. 7. № 2. C. 103111.

113. Masuda K., Hikida R., Fujino K. The plant nuclear lamina proteins NMCP1 and NMCP2 form a filamentous network with lateral filament associations // J. Exp. Bot. 2021. T. 72. № 18. C. 6190-6204.

114. Matralis A. N. h gp. Molecular tools that block maturation of the nuclear lamin A and decelerate cancer cell migration // Bioorg. Med. Chem. 2018. T. 26. № 20. C. 5547-5554.

115. Maung K., O'Shaughnessy J. A., Sledge G. W. Capecitabine/Bevacizumab Compared to Capecitabine Alone in Pretreated Metastatic Breast Cancer: Results of a Phase III Study) // Clin. Breast Cancer. 2003. T. 3. № 6. C. 375-377.

116. McQuin C. h gp. CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology // PLOS Biol. 2018. T. 16. № 7. C. e2005970.

117. Mehmood S. h gp. Mass spectrometry captures off-target drug binding and provides mechanistic insights into the human metalloprotease ZMPSTE24 // Nat. Chem. 2016. T. 8. № 12. C. 1152-1158.

118. Meijering E., Dzyubachyk O., Smal I. Methods for Cell and Particle Tracking // Methods in Enzymology. , 2012. C. 183-200.

119. Mekhail K., Moazed D. The nuclear envelope in genome organization, expression and stability // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2010. T. 11. № 5. C. 317-328.

120. Memedula S., Belmont A. S. Sequential recruitment of HAT and SWI/SNF components to condensed chromatin by VP16 // Curr. Biol. 2003. T. 13. № 3. C. 241-246.

121. Méndez J. Temporal regulation of DNA replication in mammalian cells // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2009. T. 44. № 5. C. 343-351.

122. Mewborn S. K. h gp. Altered Chromosomal Positioning, Compaction, and Gene Expression with a Lamin A/C Gene Mutation // PLoS One. 2010. T. 5. № 12. C. e14342.

123. Mitchell M. J. h gp. Lamin A/C deficiency reduces circulating tumor cell resistance to fluid shear stress // Am. J. Physiol. Physiol. 2015. T. 309. № 11. C. C736-C746.

124. Moss S. F. h gp. Decreased and aberrant nuclear lamin expression in gastrointestinal tract neoplasms // Gut. 1999. T. 45. № 5. C. 723-729.

125. Mounkes L. C. h gp. A progeroid syndrome in mice is caused by defects in A-type lamins // Nature. 2003. T. 423. № 6937. C. 298-301.

126. Naetar N. h gp. LAP2alpha maintains a mobile and low assembly state of A-type lamins in the nuclear interior // Elife. 2021. T. 10. C. e63476.

127. Navarro C. L. h gp. Lamin A and ZMPSTE24 (FACE-1) defects cause nuclear disorganization and identify restrictive dermopathy as a lethal neonatal laminopathy // Hum. Mol. Genet. 2004. T. 13. № 20. C. 2493-2503.

128. Navarro C. L. h gp. Loss of ZMPSTE24 (FACE-1) causes autosomal recessive restrictive dermopathy and accumulation of Lamin A precursors // Hum. Mol. Genet. 2005. T. 14. № 11. C. 1503-1513.

129. Navarro C. L., Cau P., Levy N. Molecular bases of progeroid syndromes // Hum. Mol. Genet. 2006. T. 15. C. R151-R161.

130. Nguyen A. V. h gp. Stiffness of pancreatic cancer cells is associated with increased invasive potential // Integr. Biol. 2016. T. 8. № 12. C. 1232-1245.

131. Nigg E. A. Assembly and cell cycle dynamics of the nuclear lamina // Semin. Cell Biol. 1992. T. 3. № 4. C. 245-253.

132. Nmezi B. h gp. Concentric organization of A- and B-type lamins predicts their distinct roles in the spatial organization and stability of the nuclear lamina // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2019. T. 116. № 10. C. 4307-4315.

133. Novelli G. h gp. Mandibuloacral Dysplasia Is Caused by a Mutation in LMNA-Encoding Lamin A/C // Am. J. Hum. Genet. 2002. T. 71. № 2. C. 426-431.

134. Olins A. L. h gp. Nuclear envelope and chromatin compositional differences comparing undifferentiated and retinoic acid- and phorbol ester-treated HL-60 cells // Exp. Cell Res. 2001. T. 268. № 2. C. 115-127.

135. Osmanagic-Myers S., Foisner R. The structural and gene expression hypotheses in laminopathic diseases - Not so different after all // Mol. Biol. Cell. 2019. T. 30. № 15. C. 1786-1790.

136. Ostlund C. h gp. Pathogenic mutations in genes encoding nuclear envelope proteins and defective nucleocytoplasmic connections // Exp. Biol. Med. 2019. T. 244. № 15. C. 1333-1344.

137. Ou H. D. h gp. ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction in interphase and mitotic cells // Science. 2017. T. 357. № 6349. C.eaag0025.

138. Ovsiannikova N. L. L. h gp. The role of the nuclear lamina in cell migration: the connection with aging and metastasis // Biopolym. Cell. 2019. T. 35. № 3. C. 227-228.

139. Padiath Q. S. h gp. Lamin B1 duplications cause autosomal dominant leukodystrophy // Nat. Genet. 2006. T. 38. № 10. C. 1114-1123.

140. Pajerowski J. D. h gp. Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation // Proc. Natl. Acad. Sci. 2007. T. 104. № 40. C. 15619-15624.

141. Pekovic V., Hutchison C. J. Adult stem cell maintenance and tissue regeneration in the ageing context: The role for A-type lamins as intrinsic modulators of ageing in adult stem cells and their niches // J. Anat. 2008. T. 213. № 1. C. 5-25.

142. Pfeifer C. R. h gp. Constricted migration increases DNA damage and independently represses cell cycle // Mol. Biol. Cell. 2018. T. 29. № 16. C. 19481962.

143. Phair R. D., Gorski S. A., Misteli T. Measurement of Dynamic Protein Binding to Chromatin In Vivo, Using Photobleaching Microscopy // Methods in Enzymology. 2003. C. 393-414.

144. Pillay J. h gp. Functional heterogeneity and differential priming of circulating neutrophils in human experimental endotoxemia // J. Leukoc. Biol. 2010. T. 88. № 1. C. 211-220.

145. Prather R. S. h gp. The expression of nuclear lamin A and C epitopes is regulated by the developmental stage of the cytoplasm in mouse oocytes or embryos // J. Exp. Zool. 1991. T. 257. № 1. C. 110-114.

146. Prusov A. N. h gp. Rosette-like structures from nuclei with condensed (chromomeric) chromatin but not from nuclei with diffuse (nucleomeric or nucleosomic) chromatin // Cell Biol. Int. Rep. 1983. T. 7. № 10. C. 849-858.

147. Raab M. h gp. ESCRT III repairs nuclear envelope ruptures during cell migration to limit DNA damage and cell death // Science. 2016. T. 352. № 6283. C. 359-362.

148. Rajgor D. h gp. Multiple Novel Nesprin-1 and Nesprin-2 Variants Act as Versatile Tissue-Specific Intracellular Scaffolds // PLoS One. 2012. T. 7. № 7. C. e40098.

149. Rees P. A., Lowy R. J. Optimizing reduction of Western blotting analytical variations: use of replicate test samples, multiple normalization methods, and sample loading positions // bioRxiv. 2020. C. 2020.12.16.423026.

150. Rheinlaender J., Schaffer T. E. Mapping the creep compliance of living cells with scanning ion conductance microscopy reveals a subcellular correlation between stiffness and fluidity // Nanoscale. 2019. T. 11. № 14. C. 6982-6989.

151. Rober R. A. h gp. Cells of the cellular immune and hemopoietic system of the mouse lack lamins A/C: Distinction versus other somatic cells // J. Cell Sci. 1990. T. 95. № 4. C. 587-598.

152. Robinett C. C. h gp. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. // J. Cell Biol. 1996. T. 135. № 6. C. 1685-1700.

153. Roncato F. h gp. Reduced lamin a/c does not facilitate cancer cell transendothelial migration but compromises lung metastasis // Cancers (Basel). 2021. T. 13. № 10. C. 2383.

154. Rowat A. C. h gp. Nuclear Envelope Composition Determines the Ability of Neutrophil-type Cells to Passage through Micron-scale Constrictions // J. Biol. Chem. 2013. T. 288. № 12. C. 8610-8618.

155. Sandre-Giovannoli A. De h gp. Lamin A Truncation in Hutchinson-Gilford Progeria // Science. 2003. T. 300. № 5628. C. 2055-2055.

156. Scaffidi P., Misteli T. Lamin A-dependent nuclear defects in human aging // Science. 2006. T. 312. № 5776. C. 1059-1063.

157. Schape J. h gp. Influence of lamin A on the mechanical properties of amphibian oocyte nuclei measured by atomic force microscopy // Biophys. J. 2009. T. 96. № 10. C. 4319-4325.

158. Schindelin J. h gp. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis // Nat. Methods. 2012. T. 9. № 7. C. 676-682.

159. Shah P. h gp. Nuclear Deformation Causes DNA Damage by Increasing Replication Stress // Curr. Biol. 2021. T. 31. № 4. C. 753-765.

160. Shah P. P. h gp. Lamin B1 depletion in senescent cells triggers large-scale changes in gene expression and the chromatin landscape // Genes Dev. 2013. T. 27. № 16. C. 1787-1799.

161. Shah P., Wolf K., Lammerding J. Bursting the Bubble - Nuclear Envelope Rupture as a Path to Genomic Instability? // Trends Cell Biol. 2017. T. 27. № 8. C. 546-555.

162. Shimi T. h gp. The A- and B-type nuclear lamin networks: Microdomains involved in chromatin organization and transcription // Genes Dev. 2008. T. 22. № 24. C. 3409-3421.

163. Shimi T. h gp. Structural organization of nuclear lamins A, C, B1, and B2 revealed by superresolution microscopy // Mol. Biol. Cell. 2015. T. 26. № 22. C. 4075-4086.

164. Shin J. W. h gp. Mechanobiology of bone marrow stem cells: From myosin-II forces to compliance of matrix and nucleus in cell forms and fates // Differentiation. 2013. T. 86. № 3. C. 77-86.

165. Shumaker D. K. h gp. Mutant nuclear lamin A leads to progressive alterations of epigenetic control in premature aging // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2006. T. 103. № 23. C. 8703-8708.

166. Smigiel R. h gp. Novel frameshifting mutations of the ZMPSTE24 gene in two siblings affected with restrictive dermopathy and review of the mutations described in the literature // Am. J. Med. Genet. Part A. 2010. T. 152. № 2. C. 447452.

167. Solovei I. h gp. LBR and lamin A/C sequentially tether peripheral heterochromatin and inversely regulate differentiation // Cell. 2013. T. 152. № 3. C. 584-598.

168. Spagnol S. T., Dahl K. N. Spatially resolved quantification of chromatin condensation through differential local rheology in cell nuclei fluorescence lifetime imaging // PLoS One. 2016. T. 11. № 1. C. e0146244.

169. Srivastava L. K. h gp. Spatial distribution of lamin A/C determines nuclear stiffness and stress-mediated deformation // J. Cell Sci. 2021. T. 134. № 10. C. jcs248559.

170. Stephens A. D. h gp. Chromatin and lamin A determine two different mechanical response regimes of the cell nucleus // Mol. Biol. Cell. 2017. T. 28. № 14. C. 1984-1996.

171. Stephens A. D. h gp. Physicochemical mechanotransduction alters nuclear shape and mechanics via heterochromatin formation // Mol. Biol. Cell. 2019. T. 30. № 17. C. 2320-2330.

172. Strelkov S. V. h gp. Crystal structure of the human lamin a coil 2B dimer: Implications for the head-to-tail association of nuclear lamins // J. Mol. Biol. 2004. T. 343. № 4. C. 1067-1080.

173. Stuurman N., Heins S., Aebi U. Nuclear Lamins: Their Structure, Assembly, and Interactions // J. Struct. Biol. 1998. T. 122. № 1-2. C. 42-66.

174. Sushanth S. Role of Lamin A and Telomerase in DNA Damage Response : дис. Пуне, 2016, С. 60.

175. Swift J. и др. Nuclear Lamin-A Scales with Tissue Stiffness and Enhances Matrix-Directed Differentiation // Science. 2013. Т. 341. № 6149. С. 1240104.

176. Tilli C. M. L. J. и др. Lamin expression in normal human skin, actinic keratosis, squamous cell carcinoma and basal cell carcinoma // Br. J. Dermatol. 2003. Т. 148. № 1. С. 102-109.

177. Tonn J. C. и др. Effect of synthetic matrix-metalloproteinase inhibitors on invasive capacity and proliferation of human malignant gliomas in vitro // Int. J. Cancer. 1999. Т. 80. № 5. С. 764-772.

178. Turgay Y. и др. The molecular architecture of lamins in somatic cells // Nature. 2017. Т. 543. № 7644. С. 261-264.

179. Venables R. S. и др. Expression of individual lamins in basal cell carcinomas of the skin // Br. J. Cancer. 2001. Т. 84. № 4. С. 512-519.

180. Vergnes L. и др. Lamin B1 is required for mouse development and nuclear integrity // Proc. Natl. Acad. Sci. 2004. Т. 101. № 28. С. 10428-10433.

181. Verstraeten V. L. R. M. и др. Increased mechanosensitivity and nuclear stiffness in Hutchinson-Gilford progeria cells: effects of farnesyltransferase inhibitors // Aging Cell. 2008. Т. 7. № 3. С. 383-393.

182. Vigouroux C. и др. Lamin A/C gene: Sex-determined expression of mutations in Dunnigan-type familial partial lipodystrophy and absence of coding mutations in congenital and acquired generalized lipoatrophy // Diabetes. 2000. Т. 49. № 11. С. 1958-1962.

183. Vortmeyer-Krause M. и др. Lamin B2 follows lamin A/C- mediated nuclear mechanics and cancer cell invasion efficacy // bioRxiv. 2020. С .2020.04.07.028969.

184. vos W. H. De h gp. Repetitive disruptions of the nuclear envelope invoke temporary loss of cellular compartmentalization in laminopathies // Hum. Mol. Genet. 2011. T. 20. № 21. C. 4175-4186.

185. Wang Y. h gp. Blocking farnesylation of the prelamin A variant in Hutchinson-Gilford progeria syndrome alters the distribution of A-type lamins // Nucleus. 2012. T. 3. № 5. C. 452-462.

186. Wang Y. h gp. Effect of lamin-A expression on migration and nuclear stability of ovarian cancer cells // Gynecol. Oncol. 2019. T. 152. № 1. C. 166-176.

187. Wheaton K. h gp. Progerin-Induced Replication Stress Facilitates Premature Senescence in Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome // Mol. Cell. Biol. 2017. T. 37. № 14.

188. Willis N. D. h gp. Lamin A/C Is a Risk Biomarker in Colorectal Cancer // PLoS One. 2008. T. 3. № 8. C. e2988.

189. Wolf K. h gp. Physical limits of cell migration: Control by ECM space and nuclear deformation and tuning by proteolysis and traction force // J. Cell Biol. 2013. T. 201. № 7. C. 1069-1084.

190. Wong K.-F., Luk J. M. Discovery of Lamin B1 and Vimentin as Circulating Biomarkers for Early Hepatocellular Carcinoma // Liver Proteomics / nog peg. D. Josic, D. C. Hixson. Totowa, NJ: Humana Press, 2012. C. 295-310.

191. Worman H. J., Schirmer E. C. Nuclear membrane diversity: underlying tissue-specific pathologies in disease? // Curr. Opin. Cell Biol. 2015. T. 34. C. 101112.

192. Wu D. h gp. Nuclear localization signal deletion mutants of lamin A and progerin reveal insights into lamin A processing and emerin targeting // Nucl. (United States). 2014. T. 5. № 1. C. 66-74.

193. Yokoyama Y. h gp. Cancer-associated upregulation of histone H3 lysine

9 trimethylation promotes cell motility in vitro and drives tumor formation in vivo // Cancer Sci. 2013. Т. 104. № 7. С. 889-895.

194. Yoon C. и др. PI3K/Akt pathway and Nanog maintain cancer stem cells in sarcomas // Oncogenesis. 2021. Т. 10. № 1. С. 12.

195. Young S. G. и др. Understanding the roles of nuclear A- and B-type lamins in brain development // J. Biol. Chem. 2012. Т. 287. № 20. С. 16103-16110.

196. Zhang X., Lv Y. Suspension state increases reattachment of breast cancer cells by up-regulating lamin A/C // Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. 2017. Т. 1864. № 12. С. 2272-2282.

197. Zhironkina O. A. и др. Mechanisms of nuclear lamina growth in interphase // Histochem. Cell Biol. 2016. Т. 145. № 4. С. 419-432.

198. Zink D., Fischer A. H., Nickerson J. A. Nuclear structure in cancer cells // Nat. Rev. Cancer. 2004. Т. 4. № 9. С. 677-687.

199. Киреев И. И. и др. Динамика структурной реконструкции митотических хромосом после их искусственной деконденсации in vivo // Цитология. 1986. Т. 32. № 5. С. 449-453.

200. Киреев И. И. и др. Ультраструктура митотических хромосом клеток СПЭВ при их обратимой искусственной деконденсации in vivo // Цитология. 1988. Т. 30. № 8. С. 926-932.

201. Лужин А. В. Роль PIK-киназ в клеточном ответе на ядрышковый и репликативный стрессы: дис. ... канд. биол. наук. 03.01.03. Москва, 2020. 119 с.

132

9. Приложения

Приложение 1

Название соединения по тексту Название по номенклатуре IUPAC Рег. номер CAS Биологическая активность

Лопинавир (2S)-N-[(2S,4S,5S)-5-[[2-(2,6-диметилфенокси)ацетил]амино]-4-гидрокси-1,6-дифенилгексан-2-ил] -3 -метил-2-(2-оксо-1,3-диазинан-1 -ил)бутанамид 19272517-0 Ингибитор протеазы ВИЧ-1

Батимастат (2S,3R)-N-гидрокси-N'-[(2S)-1-(метиламино)-1 -оксо-3 -фенилпропан-2-ил]-3-(2-метилпропил)-2-(тиофен-2-илсулфанилметил)бутандиамид 13037060-4 Ингибиторы матричных протеаз

FM59390 ^)-2-[[4-[4-(1-бензофуран-2-илметокси)фенил]фенил]сульфани ламино] -3 -метилбутановая кислота 85437082-4

Фозиноприл ^^)-4-циклогескил-1-[2-[(2-метил-1-пропаноилоксипропокси)-(4-фенилбутил)фосфорил]ацетил]пир ролидин-2-карбоновая кислота 98048-976 Ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента (ACE)

Зофеноприл (2S,4S)-1-[(2S)-3-бензоилсульфанил-2-метилпропаноил]-4-фенилсульфанилпирролидин-2-карбоновая кислота 81872-108

Приложение 2

Построение треков с помощью пакета МТгасЫ программы ImageJ для оценки подвижности клеток НТ1080, экспрессирующие ламин Л-ОБР (красный). Представлено первых 12 кадров с временным интервалом 5 минут в фазово-контрастном режиме (зеленый).

\

о />

о

Ж О ^

% 7Г

я

,-п

О

М

Л

9

а

о

о

У

я* -

в5*

о

* *

Л ' я

А, ■ '

Г.З

О* д.

Л

10

11

12

Приложение 3

dir = getDirectory("Choose Directory"); files = getFileList(dir); ThrshldMthd = false; for (i=0; i<lengthOf(files); i++) { showProgress(i+1, files.length); open(dir+files[i]); image=getTitle();

run("Set Scale...", "distance=1 knowN = 0.22 unit=mcm");

run("Duplicate...", "title=duplicate");

StarDistOrNot(ThrshldMthd, "duplicate");

selectWindow(image);

roiManager("show all");

waitForUser("ROI");

N = roiManager("count");

print(image + " " + n);

roiManager("Reset");

("Clear Results");

run("Close All");

}

function StarDistOrNot(answer, nameImage) {

// if answer is true, nuclei are detected via StarDust. false - via Otsu selectWindow(namelmage); run("Gaussian Blur...", "sigma=5"); if (answer) {

run("Command From Macro",

"command=[de.csbdresden.stardist.StarDist2D], args=['input,:,"+nameImage+"', 'modelChoice':'Versatile (fluorescent nuclei)', ,normalizeInput':,true', ,percentileBottom,:,0.0', 'percentileTop':'100.0', 'probThresh':'0.479071', 'nmsThresh':'0.3', 'outputType':'ROI Manager', 'nTiles':'1', 'excludeBoundary':'2', 'roiPosition':'Automatic', 'verbose':'false', 'showCsbdeepProgress':'false', 'showProbAndDist':'false'], process=[fal se]");

} else {

//run("Auto Threshold", "method=Otsu ignore_black white");

waitForUser("Threshold");

run("Fill Holes");

run("Dilate");

run("Fill Holes");

run("Watershed");

run("Analyze Particles...", "size=50-500 display exclude summarize

add"); //size in mcm!! }

}

Приложение 4

Изучение влияния экспрессии ламина A и прогерина на миграцию HT1080 в мембранах. Снимки верхней (top) и нижней части (bottom) мембран с размером пор 8 (А) и 3 мкм (Б). Съемка проводилась в двух каналах: DAPI (синий) и GFP (зеленый), для детекции трансфицированных клеток. Широкопольная флуоресцентная микроскопия, размер масштабного отрезка 100 мкм.

А

Б

Приложение 5

Вестерн-блот белковых лизатов НТ1080 после инкубации с (А) фозиноприлом (Б) зофеноприлом, (В) FM59390, (Г) батимастатом и (Д) окраска тотального белка при вестерн-блоттинге лизатов клеток, инкубированных с лопинавиром и ДМСО в качестве контроля (К). Значения представлены в мкМ.

А

Б

К К 20 20 60 60

анти-ламин А/С

В

Г

Д

Приложение 6

Изучение влияния (А) лопинавира, батимастата и (Б) фозиноприла на миграцию НТ1080 в мембранах. Снимки нижней части мембран с размером пор 8 и 3 мкм. Съемка проводилась канале DAPI (синий). Широкопольная флуоресцентная микроскопия, размер масштабного отрезка 100 мкм.

А

Приложение 7

Оценки пролиферативной активности клеток НТ1080 под действием (А) лопинавира, батимастата и (Б) фозиноприла в полной среде (FBS) и без сыворотки (-FBS), DAPI (синий). Репликативная метка EdU (красная). Иммунофлуоресцентное окрашивание фосфорилированного серина-10 гистона Н3 (красный). Широкопольная флуоресцентная микроскопия, размер масштабного отрезка 20 мкм.

А

60 мкМ

Фозиноприл 20 мкМ

Контроль

-*•

-РВБ

1 1 ч

> •

%

1 о 1

#

» 1 А

Л»: 1 1

1 Р I ■Г • ' " 1

у. » % 1 % • А Ф А

^ ■ # * Ж % I® •

1 «

х

со со

о "О =г

о со

ГО

СО

го

сл

гп

о.

с

го

со

Приложение 8

dir = getDirectory("Choose Directory"); files = getFileList(dir); ThrshldMthd = true; IntThreshold = 2000; //setBatchMode(true); for (i=0; i<lengthOf(files); i++) { showProgress(i+1, files.length); open(dir+files[i]); img=getTitle(); if (Stack.isHyperstack) { setSlice(9);

frame=getSliceNumber();

run("Duplicate...", "duplicate channels=2 duplicate frames="+frame); imgMark=getTitle();

run("Duplicate...", "duplicate channels=1 duplicate frames="+frame); imgDAPI=getTitle(); } else {

run("Duplicate...", "title=duplicate duplicate"); run("Split Channels"); imgMark="C2-duplicate"; imgDAPI="C1 -duplicate";

}

StarDistOrNot (ThrshldMthd, imgDAPI); selectWindow(img); roiManager("show all"); waitForUser("ROI"); nucleus=roiManager("count"); selectWindow(imgMark); k=0;

for (count=nucleus-1; count>=0; count-) { roiManager("Select", count); roiManager("measure"); intensity = getResult("CpegHee", 0); close("Results"); if (intensity>IntThreshold) {

k+=1; }

}

print(nucleus+" "+k); roiManager("reset"); close("*"); run("Clear Results");

}

function StarDistOrNot(answer, namelmage) { // if answer is true, nuclei are detected via StarDust. false - via Otsu selectWindow(namelmage); run("Gaussian Blur...", "sigma=15"); if (answer) {

run("Command From Macro",

"command=[de.csbdresden.stardist.StarDist2D], args=['input,:,"+nameImage+"', 'modelChoice':'Versatile (fluorescent nuclei)', ,normalizeInput':,true', ,percentileBottom,:,0.0', 'percentileTop':'100.0', 'probThresh':'0.479071', 'nmsThresh':'0.3', 'outputType':'ROI Manager', 'nTiles':'1', 'excludeBoundary':'2', 'roiPosition':'Automatic', 'verbose':'false', 'showCsbdeepProgress':'false', 'showProbAndDist':'false'], process=[fal se]");

} else {

run("Auto Threshold", "method=Otsu ignore_black white");

run("Fill Holes");

run("Dilate");

run("Fill Holes");

run("Watershed");

run("Analyze Particles...", "size=50.00-400.00 show=[Count Masks]

display exclude summarize add"); //size in mcm }

}

Приложение 9

Макрос для ImageJ, выполняющий автоматическую коррекцию FRAP изображений и определение фотообесцвеченной области на ядерной ламине с последующим полуавтоматическим определением области референса и без сигнала для коррекции фотообесцвечивания и темнового шума, соответственно.

dir=getDirectory("source data are stored"); dir2=getDirectory("to put results"); list=getFileList(dir); bins=4095

max=round(655.36*0.5) //Threshold 0,5% - max % overexpressed px for(i=0;i<list.length;i++){ //Checking overexposure open(dir+list[i]);

if (isImageOverexpose(bins, max)) { run("Clear Results"); run("Close All"); continue;

}

run("Set Scale...", "distance=0 knowN = 0 unit=pixel"); //reset (scale)

run("StackReg ", "transformatioN = Affine"); //Drift

Correction

setBleachingArea(list [i]);

//1.Set Bleached Area

run("Fit Rectangle");

Roi.setName("RecBleachArea");

roiManager("Add");

run("Set Scale...", "distance=1 knowN = 1 unit=unit");

setAreaSeries("RecBleachArea", 0.2, 3, 0, 1); //Series of Bleached Area, 0.2=20%

run("Threshold..."); // keep open to check overepression!!

makeRotatedRectangle(5, 5, 30, 30, 30); //random

//2.Set Reference Area (semi-automatic)

waitForUser("Position the probe!!!! Set Reference Area");

roiManager("Add");

setAreaSeries("RefArea", 0.2, 3, 0, 1); //Series of RefArea //waitForUser("Position the probe!!!!");

setArea(list[i], "Background"); //3.Set Background (semi-automatic)

roiManager("multi measure");

saveAs("Results", dir2+list[i]+".csv");

roiManager("Reset")

run("Clear Results");

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.