Роль слияния клеток при репаративной регенерации коры головного мозга: функциональное, морфологическое и цитохимическое исследования тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.03, кандидат биологических наук Константинова, Надежда Борисовна

• Константинова, Надежда Борисовна
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Константинова, Надежда Борисовна

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

3. ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 35 ИССЛЕДОВАНИЯ

4. 2.1. Исследование двигательной активности крыс в 35 автоматизированном «открытом поле»

5. 2.2. Условный рефлекс пассивного избегания (УРГТИ)

6. 2.3 Моделирование фотоиндуцированного тромбоза 37 сосудов префронтальной коры

7. 2.4. Методы морфологического и цитохимического 39 исследования префронтальной коры головного мозга крыс в контроле и после фокальной ишемии

8. 2.4.1. Анализ в световом и электронном микроскопах

9. 2.4.2. Радиоавтографиеский анализ в световом 44 микроскопе

10. 2.4.3. Исследование мозга в парафиновых срезах

11. 2.5. Цитофогометрическое исследование

12. 2.6. Конфокальная микроскопия

13. 2.7. Иммуноцитохимическое исследование

14. 2.8. Статистический анализ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль слияния клеток при репаративной регенерации коры головного мозга: функциональное, морфологическое и цитохимическое исследования»

Актуальность проблемы

По представлению Европейской базы данных ЗДВ (HFA-DB) (Европейское региональное бюро Всемирной организации здравоохранения), психические расстройства, болезни нервной системы и органов чувств составляли в РФ в 2006 г — 1514 человек на 100000 населения. Инсульт в РФ занимает второе место среди причин смертности и первое место среди причин инвалидизации. Ежегодно им заболевает свыше 450 тыс. чел. (Верещагина Н.В. и др., 2002; Гусев Е.И., и др., 2003; Яхно Н.Н., Виленский Б.С., 2005).

Инсульт и другие цереброваскулярные болезни - ведущая причина заболеваемости и смертности в США (March В .J., et al., 2009), среди причин смертности в других индустриально развитых странах инсульт занимает третье место после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний (Green A.R., 2008).

Из нейродегенеративных заболеваний, по-видимому, самыми распространенными являются болезнь Альцгеймера и паркинсонизм. Болезнью Альцгеймера страдают в мире примерно 10% людей старше 65 лет и более 45% тех, кому за 85 (Гаврилова С.И., 2001). Исследования показали, что в возрасте 65-74 лет паркинсонизм встречается у 15% лиц, а в возрасте старше 85 лет - более чем у 50%. (сайт — www.humbio.ru)

В последние годы значительно расширились исследования по регенерации нервной системы и после открытия на рубеже XX и XXI вв. нейральных стволовых клеток в головном мозге (Reynolds В.A., Weiss S., 1992; Luskin М.В., 1993; Weiss S. et ah, 1996; Morshead C.M. etah, 1998; Weiss S, van der Kooy D., 1998; Johansson C.B. et ah, 1999; Gage F.H., 2000; Kornack D.R., Rakic P., 2001) и костном мозге (Brazelton T.R. et ah, 2000; Mezey E. et ah, 2000; Blau H.M. et ah, 2001) существенно повысился интерес к изучению стволовых клеток. Эти исследования по регенерации нервной системы преимущественно осуществляются как поиск доказательств нейроногенеза в постнатальном периоде. На эту тему опубликовано много работ, описывающих обнаружение тех или иных признаков пролиферации нейронов у взрослых млекопитающих. Роль стволовых клеток и нейральных, в частности, стали рассматривать в однообразном только клеточно-заместительном плане. При упрощенном понимании роли стволовых клеток, казалось, что это открытие ведет к немедленному решению многих медицинских проблем. Все больше стало появляться работ по применению стволовых клеток с лечебной целью в эксперименте и клинике. Мы упомянем только работы неврологической направленности (Скворцова В.Н. и др., 2008; Rossi F.M. et al., 2000; Nakatomi H. et al., 2002; Teng Y. et al., 2002;). Немало сообщений и опровергающих эти работы. Некоторые из них оказались терапевтически не эффективны. Но даже если отмечалось лечебное действие, его без специального подтверждения, нельзя объяснять непременно нейроногенезом. Это мнение выражали и сами авторы обсуждаемых работ (Скворцова В.Н. и др., 2008; Nakatomi Н. et al., 2002; Teng Y. et al., 2002;). Такие результаты, на наш взгляд, являются серьезным мотивом для тщательного всестороннего изучения феномена — нейральная стволовая клетка.

В начале XXI-ого века феномен слияния привлек исследовательский интерес тем, что изменил представления о трансдифференцировке, трансдетерминации или пластичности не только нейральных, но и прочих стволовых клеток. Под трансдифференцировкой и пластичностью подразумевается способность стволовых клеток взрослого организма превращаться в дефинитивные клетки другого зародышевого листка. Такая трактовка воспринималась с доверием до 2002-2003 гг., когда сразу в нескольких публикациях (Gussoni Е. et al., 2002; TeradaN. et al., 2002; Ying Qi-L. et al., 2002; Alvarez-Dolado M. et al., 2003; Vassilopoulos G. et al., 2003; Wang X. et al., 2003) было заявлено, что слияние стволовой клетки с дифференцированной клеткой различных тканей - событие не редкое и увеличивающееся при повреждении данной ткани. По этой причине классическое» доказательство пластичности - присутствие в дифференцированной клетке маркера стволовой — может иметь и другое объяснение. Стволовая клетка не превратилась в дефинитивную, создав при этом самостоятельно маркеры дифференцировки, а просто слилась с дифференцированной и в результате получила уже готовые маркеры, не пройдя соответствующего пути развития и собственной выработки этих маркеров.

Вышеперечисленные теоретические фундаментальные исследования и медико-социальная значимость проблемы определяют актуальность исследования механизмов регенерации нервной системы и, в первую очередь, нейронов коры. Знания в этой области расширят возможности профилактических и лечебных мероприятий для коррекции и восстановления нарушенных функций ЦНС при нейродегенеративных заболеваниях.

Цель исследования

Цель настоящего исследования: определить происходят ли слияния региональных клеток в префронтальной коре головного мозга (в норме и при создании ишемического очага) и каково значение этих слияний для репаративной регенерации.

Задачи исследования

1. При ишемическом повреждении префронтальной коры головного мозга крыс изучить выраженность слияний в поврежденной и неповрежденной зонах префронтальной коры.

2. Разработать методики определения слившихся клеток (дикарионов, гетерокарионов) и проверить достоверность слияния методами электронной и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии с различными флуорохромными зондами и иммуноцитохимическими маркерами.

3. Выяснить регенераторное значение слияния клеток коры путем количественного определения числа слияний при нарушении и восстановлении функции префронтальной зоны коры.

4. Провести авторадиографическое исследование с целью определить жизнеспособность слившихся и одноядерных клеток и способность клеток коры к пролиферации.

5. Определить биологическую роль появления в нейроне второго ядра.

Научная новизна

Впервые экспериментально доказан факт слияния региональных клеток в префронтальной зоне коры головного мозга с образование двуядерных клеток. При слиянии двух нейронов возникали дикарионы. При слиянии нейрона с олигодендроцитом образовывались гетерокарионы.

При образовании гетерокариона происходило перепрограммирование ядра олигодендроцита в нейрональном направлении с повышением дисперсности хроматина и с последующим преобразованием ядра олигодендроцита в ядро нейрона.

Взаимосвязь структуры и функции указывает на то, что перепрограммированное ядро олигодендроцита функционировало как ядро нейрона. Слившийся с олигодендроцитом нейрон получает второй набор генов от олигодендроцита, становится тетраплоидным или, по крайней мере, гипердиплоидным и может выполнять повышенную, скорее всего, удвоенную функциональную нагрузку.

Получены данные, указывающие, что наряду с описанной Д.С. Саркисовым внутриклеточной регенерацией путем самостоятельной гиперплазии ультраструктур, нейрон может также внутриклеточно регенерировать, получая эти структуры извне от слившегося с ним ядра олигодендроцита. Приобретенный второй комплект генов может обеспечить увеличение числа любых необходимых структур.

Морфологические данные подтверждаются результатами функциональных исследований, показавшими, что улучшение условно-рефлекторной деятельности животных происходит вместе с увеличением числа слияний в префронтальной коре. Показано, что функциональные возможности стволовых нейральных клеток шире, чем было известно ранее. Если раньше роль нейральных и других стволовых клеток представлялась, как только заместительная, то наши данные свидетельствуют, что стволовая клетка через прогенитора, например, олигодендроцита, может не замещать утраченную клетку, а отдавать сохранившейся клетке свое ядро и обеспечивать, таким образом, своеобразную внутриклеточную пролиферацию генов.

Впервые обнаружено, что иногда вслед за объединением цитоплазмы происходило и объединение ядер. В таком случае двуядерный дикарион превращался в одноядерный синкарион. В единственном ядре синкариона содержание ДНК повышается и может доходить до восьми гаплоидных наборов.

Теоретическая и практическая значимость работы

Работа фундаментальная. Полученные знания могут быть использованы для оценки скорости и полноты регенерации при действии различных повреждающих факторов и терапевтических агентов. Накопление знаний в области регенерации ЦНС в дальнейшем может дать возможность рационально влиять на частоту слияния клеток и тем направлять в желаемое для врача русло ход физиологической и репаративной регенерации.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Нейроны префронтальной зоны коры (поля Frl, Fr2) могут сливаться с олигоденроцитами.

2. Улучшение условно-рефлекторной деятельности и статистически достоверное увеличение числа дикарионов в префронтальной коре указывают на регенеративное значение слияния клеток.

3. В случае слияния образуется двуядерный гипердиплоидный нейрон - дикарион. При слиянии нейрона и олигодендроцита, ядро последнего подвергается перепрограммированию в пейрональном направлении с резким усилением дисперсности хроматина и, в конце концов, становится неотличимым от ядра нейрона. Следовательно, нейрональный дикарион образуется через стадию гетерокариона. Принцип единства структуры и функции подсказывает, что завершившее перепрограммирование бывшее ядро олигодендроцита начинает экспрессировать нейрональные гены.

4. Появление дикарионов и образование синкарионов свидетельствуют о повышении плоидности нейронов коры в онтогенезе.

5. Слияние олигодендроцитов (прогениторных клеток) с нейронами с последующим внутриклеточным перепрограммированием ядер первых по образцу вторых, показывает, что биология стволовых клеток не ограничивается наращиванием числа клеток при развитии и восстановлением их количества при регенерации. Это особенно целесообразно в поддержании гомеостаза ЦНС. Стволовая клетка не образует новой дефинитивной клетки. Сложная задача компенсации повреждения или утраты нейрона, отличающегося индивидуализированным багажом памяти, решается организмом при помощи стволовой клетки путем создания второго ядра в поврежденной клетке. Второе ядро обеспечивает гиперплазию ультраструктур, материализующих память.

Апробация работы

Результаты работы были доложены на:

• V конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» в форме устного доклада (2008 г, Москва);

• Заседании Ученого совета НИИОГГП РАМН совместно с Бюро ОБМН РАМН, посвященном 85-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки РФ, академика АМН СССР и РАМН Доната Семеновича Саркисова (2009 г, Москва).

Заключение диссертации по теме «Патологическая физиология», Константинова, Надежда Борисовна

ВЫВОДЫ

1. Нейроны префронтальной зоны коры головного мозга могут сливаться с олигодендроцитами (образуя гетерокарионы). Могут создаваться и трикарионы. Часто встречаются двуядерные нейроны — дикарионы.

2. Через неделю после двустороннего ишемического инсульта, вызванного фототромбозом, память крыс нарушается - у них исчезает выработанный перед созданием инсульта УРПИ. В контроле в этот срок УРПИ полностью сохраняется. К 56-м суткам после инсульта наблюдается положительная тенденция в улучшении памяти подопытных животных, а после подкрепления рефлекса ЛП становится равным как в опыте, так и в контроле. К моменту восстановления функции регистрируется статистически достоверное морфологическое изменение в префронтальной зоне коры -увеличение содержания слившихся клеток.

3. После слияния олигодендроцита с нейроном происходит перепрограммирование ядра олигодендроцита в нейропальном направлении: ядра становятся структурно неразличимыми, а в ядре перепрограммпруемого олигодендроцита может экспрессироваться нейрональный белок — NeuN.

4. Дикарионы увеличивают число нейрональных геномов в коре и этим обеспечивают репаративную регенерацию.

5. Регенерация путем слияния клеток обусловливается внутриклеточной гиперплазией ультраструктур (генов) без увеличения числа нейронов.

6. При регенерации слиянием клеток новый нейрональный геном появляется в предсуществующем нейроне. Геном оказывается в естественном для его экспрессии окружении и может взаимодействовать с уже имеющимися структурами и веществами нейрона.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Большое число методических ошибок, обнаруженных в исследованиях постнатального нейроногенеза у млекопитающих (обзор литературы), не изменив доминирующего мнения о том, что способ регенерации мозга — нейроногенез, побудило меньшую часть занятых в этой области цитологов искать и другие способы регенерации. Мы, зная множество веских доказательств теории регенерации Д.С. Саркисова, и не встретив ни одного убедительного возражения против неё, решили исследовать феномен слияния клеток в мозге in vivo. Если можно так выразиться о биологическом феномене, то феномен слияния по своей идеологии близок к внутриклеточной регенерации Д.С. Саркисова. Кроме того, слияние обнаруживалось лишь в единственном виде нейронов Следует отметить, что до нашей работы регенераторное значение слияния не было доказано, оно (на основании трансгендерных экспериментов) лишь предполагалось (Alvarez-Dolado М. et al., 2003; Weimann J.M. et al., 2003) - в клетках Пуркинье, причем очень редко. Эти, скажем прямо, не обнадеживающие исходные данные не изменили нашего решения исследовать слияние клеток в ЦНС. В этом решении нас поддерживала мысль, что все имеющиеся до нашей работы сведения о слиянии стволовых или более высоких степеней дифференцировки клеток in vivo в любых органах и мозге, в том числе, получены в трансгенных экспериментах. Иными словами, исследовалось слияние с местными клетками только клеток костного мозга, причем в условиях крайне искусственных с тяжелыми воздействиями на реципиентов (летальное облучение, затем пересадка костного мозга и массивные дозы иммунодепрессантов для подавления реакции трансплантат — против хозяина). В таких условиях обычно не живут и не болеют ни люди, ни животные. Кроме того, летальное облучение в значительной степени, а, может быть, и полностью подавляет активность региональных стволовых клеток, которые имеют в регенерации органа существенное, а, скорее всего, решающее значение, каким бы образом эта регенерация не осуществлялась.

Для изучения отдельных моментов биологии стволовых клеток, вопросов развития и регенерации метод трансгенных пересадок оказался полезным, позволил получить ценную информацию. Но для исследования вопросов регенерации, ориентированных в качестве конечной цели на внедрение в клинику, трансгендерный метод неприемлем. Поэтому наша работа была осуществлена морфологическими и цитохимическими методами.

Чтобы получить возможность сопоставления морфологических и функциональных данных, эксперимент был организован так, как это описано в главе 4. При первом просмотре полутонких срезов контрольных животных было обнаружено, что слияние не такое уж редкое событие: в среднем его можно найти в каждом срезе. Такая частота вначале настораживала и казалась наиболее верным свидетельством ошибки. Ведь мы смотрели полутонкие срезы, которые до нас видели сотни, морфологов, и никто из них не описал слияния нейронов друг с другом или с глиальной клеткой. Чтобы не исследовать, а, тем более, не опубликовать артефакт, мы попытались разработать методику окраски перикариона в эпоксидном срезе. Результаты наших поисков в этом направлении представлены в главе 2. Эти результаты нельзя признать полностью удовлетворительными. Оба предложенных нами метода окраски не так четко, как хотелось бы, отделяли перикарион от нейропиля, кроме того, перикарион казался более узким, чем в парафиновых срезах, окрашенных по Нисслю. Но, все-таки, предложенные приемы окраски гораздо лучше выявляли цитоплазму нейрона, чем наиболее популярный из «старых» методов окраски - толуидиновым синим. Это позволило использовать такой критерий слияния, как пребывание двух ядер в одной цитоплазме. Соблюдение этого критерия и стало основным приемом оценки истинности слияния в наших количественных исследованиях (глава 4). Мы поняли, что этот критерий достаточно надежен, когда проверили действительность слияния клеток в коре всеми, имеющимися у нас в то время методами: электронной микроскопией, конфокальной микроскопией, флуореметрией (глава 3).

Всё, что до сих пор говорилось о слиянии клеток, одинаково относится и к контрольной, и к подопытной группе животных, т.е. и к физиологической, и к репаративной регенерации. Однако последняя (репаративная) имеет и ещё один с большой долей вероятности связанный со слиянием момент. Имеется в виду образование большого числа «псевдодикарионов» в пенумбре. Значительная степень деструкции «псевдодикарионов» - свидетельство того, что они образованы не конструктивными (как классические слияния), а деконструктивными, разрушительными процессами. Однако мрачное начало не означает неотвратимо печального конца, т.е. гибели «псевдодикариона». Вспомним, что разрушение есть пусковой момент и движущая сила всякой регенерации, даже физиологической. Наши радиоавтографические данные показали, что даже грубые дегенеративные изменения «псевдодикариона» совместимы с сохранением их жизнеспособности. Таким образом, обнаружив такое явление, как возникновение «псевдодикарионов» мы в рамках этой работы не закрыли вопроса о возможности их превращения в истинные дикарионы.

Главным итогом работы считаем два доказательства того, что слияние клеток представляет собой форму регенерации нейронов ЦНС.

Первое доказательство — возрастное увеличение содержания дикарионов и сочетание функциональных проявлений регенерации с достоверным повышением числа слияний в коре. Статистически достоверное повышение содержания дикарионов через 57 суток после инсульта произошло в подопытной и в контрольной группах животных. В опыте содержание дикарионов было больше, чем в контроле, но разница с контролем не достигала статистической достоверности. Восстановление функции происходило только в опыте, в контроле функция не нарушалась. Поэтому отсутствие статистически достоверной разницы между опытом и контролем может быть воспринято как факт, снижающий убедительность утверждения о том, что слияния обеспечивают регенерацию и количественно выражают её развитие. Однако мы настаиваем на своем утверждении, а отсутствие достоверной разницы между опытом и контролем объясняем следующим образом. В контроле содержание дикарионов на 57-е сутки достоверно превышало таковое на 7-е сутки. Следовательно, в контроле тоже происходила регенерация — физиологическая, поскольку нарушения функции не было. Регенерация всегда компенсирует утрату. В контроле это была возрастная утрата нейронов (животные за время эксперименте стали в 2 раза старше), возможно, усиленная обучением условному рефлексу и стрессом ложной операции. Последняя, т.е. ложная операция явно выдвигается из рамок физиологической регенерации и ещё раз подчеркивает условность нашего деления на подопытную и контрольную группы. Заметим в качестве «лирического отступления», что во всех экспериментах по регенерации деление на опыт и контроль всегда условно. Оно не может быть и строго академично уже потому, что всякая регенерация есть реакция на разрушение. Хотя, конечно, деление на физиологическую и репаративную регенерацию необходимо — без него распадается вся система медицины. Таким образом, сравнивая опыт и контроль, мы определяли достоверность различия не между регенерацией и отсутствием её, а между двумя выборками, в которых физиологическая регенерация была представлена в равной степени, но в подопытной выборке физиологическая регенерация была усилена репаративной.

Локализуется процесс репаративной регенерации не всегда на месте повреждения, но часто в отдалении от него, а может происходить даже и в другом органе (Саркисов Д.С., 1970, 1993). В нашем случае повреждена была часть когнитивной зоны коры. Учитывая многочисленные связи, взаимодействие нейронов, выполняющих одну функцию, можно уверенно сказать, что процесс регенерации распространился на всю когнитивную зону. При вырезании образцов для анализа на 57-е сутки мы соблюдали только одно условие - образец должен быть из префронтальной зоны с минимальным захватом бывшей пенумбры, где возможна ошибка за счет «псевдодикарионов». Крыса животное маленькое и выполнить это условие трудно. В такой ситуации репаративное увеличение числа слияний могло не проявиться статистически значимо, «затерявшись» среди индивидуальных, а, возможно, и топографических колебаний частоты слияний у разных животных и в разных участках когнитивной зоны.

Второе доказательство - перепрограммирование ядра олигодендроцита после слияния с нейроном (глава 5). В результате этого процесса строение ядра олигодендроцита изменяется, становится похожим на строение ядра нейрона и, в конце концов, два ядра становятся одинаковыми. Принцип связи структуры и функции (частный случай закона единства материи и движения) подсказывает, что и функционально ядра становятся одинаковыми. Мы обнаружили, что в перепрограммируемом по образцу нейрона ядре олигодендроцита ещё до окончания процесса перепрограммирования может экспрессироваться классический нейрональный маркер NeuN. В результате слияния клеток появляются двуядерные или полиплоидные (см. главу 3) нейроны. Слияние клеток — внутриклеточная форма регенерации. Перепрограммирование ядра олигодендроцита происходит внутриклеточно — в цитоплазме нейрона. Количество нейронов при таком способе регенерации не увеличивается, но увеличивается число нейронных ядер, число нейронных геномов. Добавочные геномы могут располагаться в разных ядрах (дикарион) или в одном ядре (синкарион). Оба варианта создают гиперплазию первичных ультраструктур клетки — генов, а гены обеспечивают гиперплазию всех других структур и соответствующее возрастание функциональных способностей нейрона. Восхищает биологическая рациональность такого способа регенерации, соответствие этого способа структурно-функциональной организации ЦНС и нейрона, в частности.

Нейрон единственная клетка организма, обладающая свойством памяти, материализованном в многочисленных связях с другими нейронами.

Как может компенсировать утрату такой клетки новый нейрон, идея образования которого отстаивается сегодня большинством нейробиологов? Дифференцировавшийся из нейробласта нейрон - маленькая с двумя-тремя короткими отростками, лишенными синапсов, клетка (D'Amour К.А., Gage F.H., 2003; O'Shea K.S., 2003; Wurmser A.E. et al., 2004; Wang L. et al., 2009). В культуре эмбриональных нейральных клеток, да еще при нокауте проапоптозного гена р53, эмбриональные нейроны накапливаются в настолько большом количестве, что соприкасаются во многих точках. При этом удлиняются их отростки и связывают клетки друг с другом (Armesilla-Diaz A. et al., 2009). Но, ведь это всё происходит в условиях очень далеких от условий, складывающихся во взрослом мозге. Даже самые горячие апологеты нейроногенеза отмечают малочисленность «вновь образованных» постнатально нейронов.

Как же такая одиночная клетка может не в эмбриональном, а во взрослом, сформированном мозге, в плотном хитросплетении клеточных тел, сосудов и отростков вырастить свои отростки и образовать необходимое (измеряемое тысячами) количество синапсов? И в топографическом и во временном аспектах выполнение такой задачи представляется нереальным.

При регенерации путем слияния, новый нейрональный геном появляется в уже предсуществующей клетке, он с момента появления находится в адекватной цитоплазме с набором всех необходимых для функции факторов, тело клетки имеет многочисленные отростки и синапсы. В таких условиях новый геном может практически с момента появления осуществлять специфическую функцию нейрона и даже существенно усиливать её, вводя в действие вновь появившиеся гены. Данная ситуация создает возможность, хотя бы частично, компенсировать отсутствие утраченного нейрона. Полная компенсация гибели такой клетки, как большой нейрон, вероятно, недостижима. Ещё раз напоминаю — мы ведем речь о крупных нейронах коры.

Всё вышесказанное — попытка объяснить биологический смысл слияния олигодендроцита с нейроном. А как объяснить многочисленные находки слившихся нейронов? На этот счет у нас есть только предположение. Дикарион нейронов — это бывший гетерокарион олигодендроцита и нейрона после завершения перепрограммирования. Это мнение поддерживается тем фактом, что мы не заставали дикарион нейронов в начале слияния, когда сохраняется ещё остаток разделявшей клетки мембраны. В гетерокарионах такие случаи обнаруживаются часто. В рис.4 есть фрагмент мембраны между нейронными ядрами, но расположен он не типично, в среднем участке зоны соединения клеток, не будучи связан, как бывает в гетерокарионах, с окружающей два ядра клеточной мембраной. Мы не знаем, как объяснить присутствие этого фрагмента: тем, что остатки мембраны сохраняются в цитоплазме дольше, чем длится перепрограммирование или тем, что обсуждаемый дикарион фиксирован не в момент заканчивающегося слияния двух клеток, а в момент начинающегося разделения их.

Возможно, нижеследующие строки некоторые читатели сочтут более уместными в обзоре литературы. Но мы даем их здесь, после изложения основного собственного материала, что поможет представить нашу мысль гораздо короче, а, может быть, и понятнее, консолидировапее с общим статусом современной нейробиологии.

Мы излагаем свое отношение к проблеме «нейроногенез у взрослых млекопитающих» именно здесь, после того как представлены наши результаты по слиянию клеток и их обсуждение. В такой компоновке текста работы, наша позиция по проблеме нейроногенеза, как нам представляется, будет выглядеть вполне объективно, без предпочтения какой-либо точки зрения, в том числе и своей.

Мы не станем приводить, по-существу, неисчерпаемую литературу, относящуюся к роли гиппокампа в механизме запоминания и обучения ,наряду с кортикальной частью мозга. Причем в гиппокампе (приведем только несколько работ последних лет) эта роль связывается с нейроногенезом в субгранулярной зоне, с последующей миграцией вновь образованных нейронов в зубчатую извилину и встраиванием их в местные нейрональные сети, образованием синапсов (Burgess N., Maguire Е., 2002; Zhao Ch. et al., 2006; Wiltgen В., Silva J., 2007; Ageta PI. et al., 2008; Toni N., et al., 2008; Kitamura T. et al., 2009). Отсутствие нейроногенеза в патологически измененном гиппокампе, задерживает передачу памяти в кору, превращение контекстной памяти в ассоциативную (Teng Е. et al., 1999; Shors Т., Squire L.R., 2001; Maviel Th. et al., 2004). Нейроногенез в гиппокампе обеспечивает антидепрессантный эффект (Santarelli L., et al., 2003). Эти данные вместе с нашими наблюдениями - есть еще одно подтверждение мысли Доната Семеновича, о том что все органы регенерируют по разному, соответственно своей структурно-функциональной специфике и сложности.

Основным положением теории регенерации Д.С. Саркисова является то, что регенерируют все живые объекты. Но регенерируют по разному, соответственно их структурно-функциональному своеобразию. Всё, что мы пишем, относится к большим нейронам коры, называемым ещё пирамидными, хотя очень часто они ни по форме ни по тинкториальным свойствам не соответствуют этому названию. Возможно, что мелкие и более простые по структуре нейроны молекулярного и зернистого слоев регенерируют иначе и даже путем постнатального нейроногенеза, как это доказывается для промежуточных нейронов обонятельных луковиц и зубчатой извилины гиппокампа (см. литературный обзор).

На наш взгляд, идею регенерации путем слияния клеток поддерживают и данные наших предшественников, изучавших слияния в мозге трансгендерным методом. Напомним, что единственным видом нейронов, с которыми, хотя и редко, сливались пересаженные костномозговые клетки, оказались нейроны Пуркинье. Наши наблюдения показали, что в предшествующих исследованиях и не могли быть обнаружены слияния, поскольку они происходят между нейронами и местными прогениторами, например, олигодендроцитами. Всё, что мы писали о соответствии формы регенерации слиянием структурно-функциональной организации нейронов и малой вероятности регенерации морфологически сложных нейронов путем постнатального новообразования, в особой степени относится к таким крупным и структурно сложным нейронам, как нейроны Пуркинье. В них способность к слиянию настолько выражена, что проявляется даже в условиях трансгенного эксперимента, не выявляющего слияний других нейронов.

В последние годы появились экспериментальные данные, что синцитиальную теорию строения нервной системы, забытую после работ Рамон-и-Кахаля, нельзя считать абсолютно неверной. Синцитиальные связи между нейронами встречаются и усиливаются в условиях патологии (Сотников О.С. и др., 2009; Сотников О.С., Парамонова Н.М., 2010; Sotnikov O.S. et al., 2010). Эти данные тоже отражают тенденции нейронов к прямому несинаптическому соединению друг с другом.

Следует подчеркнуть, что регенерация путем слияния клеток имеет неисчерпаемый резерв, позволяющий поддерживать её в течение всей жизни. Резерв геномов, необходимых для пожизненного образования дикарионов, создается обнаруженном во многих исследованиях (Baumann N., Pham-Dinh D., 2001; Bhardwaj R.D. et al., 2006) обновлением популяции глиальных клеток в постнатальном периоде. У нас есть и собственные данные, доказывающие пролиферацию глиоцитов и, в частности, олигодендроцитов у взрослых грызунов (глава 4).

Снимок, демонстрирующий синтез ДНК в олигодендроците (рис. 34), и наши результаты по перепрограммированию обнаружили ещё одну из многочисленных методических ошибок в исследованиях постнатального нейроногенеза. Главное доказательство нейроногенеза — это присутствие в цитохимически идентифицированном нейроне какого-либо маркера пролиферации: тимидина, 5-бромдезоксиуридииа, маркера, внесенного ретровирусом и др. На нашем рис. 34 олигодендроцит в начале синтетического периода (метка локализуется около ядерной мембраны). Завершив синтетический период, он наберет ещё больше метки и, наконец, разделится. При этом метка в нем уменьшится наполовину, но полностью не исчезнет и останется в клетке навсегда. Такой меченый олигодендроцит может слиться с нейроном. Претерпев перепрограммирование, меченое ядро олигодендроцита становится меченым ядром нейрона, как по структуре, так и по функции. Находясь в нейрональной цитоплазме и экспрессируя нейрональные гены, в том числе и все цитохимические маркерные гены нейрона, ядро, о котором идет речь, будучи найденным, в срезе, конечно, будет признано образованным de novo нейроном. Исследования нейроногенеза проводят по парафиновым срезам. Поэтому, даже если срез пройдет через оба ядра дикариона, он не будет опознан. Если же срез пройдет через одно меченое (маркером пролиферации) ядро, то сочетание (колокализация) в одной клетке маркера пролиферации и маркера нейрона будет сочтено «непоколебимым» (и все же, как мы теперь знаем, ошибочным) доказательством постнатального нейроногенеза.

Самое печальное и смешное в захватившем почти весь мир экспериментальной неврологии порыве к нейроногенезу заключается в том, что порыв, сконцентрировавший в себе огромный научный потенциал и огромные финансовые и технические ресурсы, обусловлен не какими-то научными фактами, а чисто умозрительным представлением-мечтой, что вводя нейральные стволовые клетки или манипулируя клетками-предшественницами можно легко устранять неврологические расстройства. Об этом прямо говориться в сравнительно недавней и в техническом отношении прорывной работе L.N. Manganas с соавт. (Manganas L.N. et al., 2007). Авторы идентифицировали метаболический биомаркер нейральных клеток — предшественниц и смогли следить за его изменениями в живом мозге человека и крысы по результатам протонной магнитно-резонансной спектроскопии. Все отмеченные изменения авторы трактуют исключительно в понятиях нейроногенеза, игнорируя тот факт, что такие же изменения ими регистрируются и при глиогенезе.

Наша работа показывает, что нейральпая стволовая клетка, конечно, через клетки предшественницы, выполняет важнейшую биологическую роль - пожизненный глиогенез и тем обеспечивает регенерацию нервной системы, пополнение числа нейрональных геномов. Поэтому манипуляции клетками-предшественницами - разработан метод направленного выращивания в культуре пре-олигодендроцитов (Zhang S.C. et al., 1998; Glaser Т. et al., 2004) или какие-то иные воздействия, способствующие слиянию клеток, могут оказаться терапевтически более действенными, нежели введения в мозг или спинномозговую жидкость стволовых клеток.

Д.С. Саркисов постоянно подчеркивал недальновидность и ошибочность противопоставления внутриклеточной регенерации и регенерации путем деления клеток. Конечно, эти формы регенерации не существуют изолированно. Уже, хотя бы потому, что внутриклеточная регенерация эволюционно древняя (существует у одноклеточных организмов) и универсальная (существует во всех живых объектах) является фундаментом, на котором надстраивается регенерация путем размножения клеток. Описанная нами регенерация нейронов путем слияния клеток -замечательный пример взаимосвязи указанных двух форм регенерации. Конечно, слияние клеток - это внутриклеточная регенерация по её основному определению: происходит без увеличения числа клеток и материально обеспечивается гиперплазией внутриклеточных структур (в нашем случае первично генов, а следственно и всех остальных структур клетки). Под такое определение полностью подходит и полиплоидия гепатоцитов. Но, полиплоидия гепатоцитов — это внутриклеточная регенерация «в чистом виде». Пролиферация генов при ней происходит путем внутриклеточного копирования генов, ранее содержавшихся в клетке. При регенерации путем слияния клеток дополнительные гены вносятся в клетку «пришедшим» ядром. В нейроне они не появляются de novo, а лишь дерепрессируются.

Полиплоидия нейронов отличается по механизму возникновения от полиплоидии гепатоцитов. Первоосновой «прихода» добавочных ядер в нейроны является размножение стволовых клеток, что обеспечивает текущий в течение всей жизни глиогенез.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Константинова, Надежда Борисовна, 2010 год

1. Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Дж.Р. Методики и основные эксперименты по изучению мозга поведения.- М.: Высш. шк.- 1991.- 399с.

2. Верещагина Н.В., Пирадова М.А., Суслипа З.А. Инсульт. Принципы диагностики, лечения и профилактики.- М.: Интермедика.- 2002,-208с.

3. Викторов И.В., Андреева Н.А., Барсков И.В. Роль свободных радикалов и перекисного окисления липидов в патологии мозга при гипоксии и ишемию // Информационный бюллетень РФФИ.- 1996.- Т.4.- С.284.

4. Викторов И.В. Стволовые клетки мозга млекопитающих: биология стволовых клеток in vivo и in vitro. // Известия АН. Сер. биол.-2001.- №6.-С.646-655.

5. Гаврилова С.И. Болезнь Альцгеймера (деменция альцгеймеровского типа). // Нейродегенеративные болезии и старение. Рук-во для врачей. Под ред. Завалишина И.А., Яхно Н.Н., Гавриловой С.И.- М.:-2001.- С.9-79.

6. Гусев Е.И., Скворцова В.И., Страховская JI.B. Эпидемиология инсульта в России. // Журн. Неврол. и психиатр, (приложение «Инсульт»).-2003.- №8.- С.4-9.

7. Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга.- М.: Медицина.- 2001.- 326с.

8. Кругликов Р.И. Нейрохимические механизмы обучения и памяти.-М.: Наука.- 1981.-211с.

9. Лурия А.Р. Высшие корковые функции человека и их нарушения при локальных поражениях мозга.- М.: Академический проект.- 2000.- 512с.

10. Максимов А.А. Учение о тканях.- С.Пб.:- 1915.- 614с.

11. Малайцев В.В., Богданова И.М., Сухих Г.Т. Современные представления о биологии стволовой клетки. // Архив патологии.- 2002.-№4.- С.7-11.

12. Мирзоян Р.С., Саратиков А.С., Плотников М.Б. Методические указания по экспериментальному изучению препаратов для лечения нарушений мозгового кровообращения и мигрени.- М.: Ремедиум,- 2000.-С.159-162.

13. Пальцын А.А., Колокольчикова Е.Г. Метод двойной метки в электронно-микроскопической авторадиографии. // Бюл. Эксперим. Биол. и Мед.- 1978.- №11.- С.626-629.

14. Пальцын А.А., Константинова Н.Б. Метод окрашивания полутонких срезов ткани мозга. // Бюл. Эксперим. Биол. и Мед.- 2009.- №5.-С.598-600.

15. Рабинович С.С., Селедцов В.И., Банул Н.В., Повещенко О.В., Сенюков В.В., Астраков С.В., Самарин Д.М., Тарабан В .Я. Клеточная терапия мозгового инсульта. // Клет. техн. в биол. и мед.- 2005.- №1.-С.25-28.

16. Рингерц Н., Сэвидж Р. Гибридные клетки.- М.: Мир,- 1979.- 415с.

17. П.Романова Г.А., Шакова Ф.М., Гудашева Т.А., Островская Р.У.

18. Нарушения обучения и памяти, вызванные фототромбозом префронтальной коры головного мозга крыс: эффекты ноопепта. // Бюл. Эксперим. Биол. и Мед.- 2002.- Т.134.- № 12.- С.614-616.

19. Романова Г.А. Когнитивные расстройства при повреждении префронтальной коры и их коррекция (экспериментальное исследование).-Реферат докторской диссертации в виде научного доклада.- М.- 2003.- 80с.

20. Саркисов Д.С. О формах регенераторной реакции. // Экспер. хир. и анастез.- 1962.-№2.- С.3-7.

21. Саркисов Д.С. Регенерация и ее клиническое значение.- М.: Медицина.- 1970.-283с.

22. Саркисов Д.С., Пальцыи А.А., Втюрин Б.В. Электронно-микроскопическая радиоавтография клетки. АМН СССР.-М.: Медицина.-1980.- 264с.

23. Саркисов Д.С. Очерки истории общей патологии.- М.: Медицина.-1993.- 511с.

24. Сотников О.С., Арчакова Л.И., Новаковская С.А., Соловьева И.А. Проблема синцитиальной связи при патологии. // Бюл. Эксперим. Биол. и Мед.- 2009.- Т. 147.- №2.- С.207т210.

25. Сотников О.С., Парамонова Н.М. Цитоплазматическая синцитиальная связь одна из трех форм межнейрониой связи. // Успехи физиологических наук.- 2010.- Т.41.- №1.- С.45-57.

26. Харрис Г. Ядро и цитоплазма.- М.: Мир.- 1973.- 188с.

27. Хухо Ф. Нейрохимия: Основы и принципы.- М.: Мир.- 1990.- 384с.

28. Хэм А., Кормак Д. Гистология.- М.: Мир,- 1983.- Т.3.-293с.

29. Чертков И.Л., Дризе Н.И. «Пластичность» костпо-мозговых стволовых клеток. // Тер. архив,- 2004.- №7.- С.5-11.

30. Урбах В.Ю. Биометрические методы.- М.: Наука.- 1964.- 415с.

31. Шванн Т. Микроскопические исследования о соответствии в структуре и росте животных и растений.- М.-Л.: Изд. Акад. Наук.- 1939.-С.452.

32. Ярыгин К.Н. Регенерация органов и тканей: иерархическая и стохастическая модели. Ежегодная Всероссийская и международная научная конференция «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении».- М.: 2007.- С.8 -11.

33. Яхно Н.Н., Виленский Б.С. Инсульт как медико-социальная проблема. // Русский медицинский журнал. -2005.- Т.13.- №12.- С.807-815.

34. Ackman J.B., Siddiqi F., Walikonis R.S., LoTurco J.J. Fusion of microglia with pyramidal neurons after retroviral infection. // J. Neurosci.- 2006.-V.26.-№44.-P.l 1413-1142.

35. Ageta H., Murayama A., Migishima R., Kida S., Tsuchida K., Yokoyama M., Inokuchi K. Activin in the brain modulates anxiety-related behavior and adult neurogenesis. // PLoS ONE.- 2008.- 3.- el 869.

36. Alberio R., Campbell K.H., Johnson A.D. Reprogramming somatic cells into stem cells. // Reproduction.- 2006- V.132.- №5.- P.709-720.

37. Armesilla-Diaz A., Bragado P., Del Valle I., Cuevas E., Lazaro I., Martin C., Cigudosa J.C., Silva A. p53 regulates the self-renewal and differentiation of neural precursors. // Neurosci.- 2009.- V.158.- №4.- P. 13781389.

38. Baumann N., Pham-Dinh D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. // Physiol. Rev.- 2001.- V.81.- P.871-927.

39. Beltrami C.A., Finato N., Rocco M., Feruglio G.A., Puricelli C., Cigola E., Quaini F., Sonnenblick E.H., Olivetti G., Anversa P. Structural basis of end -stage failure in ischemic cardiomyopathy in humans. // Circ.- 1994.- V.89.- P. 151163.

40. Blau H.M., Brazelton T.R., Weimann J.M. The evolving concept of a stem cell: entity of function? // Cell.- 2001.- V.105.- P.829-841.

41. Brazelton T.R., Rossi F.M., Keshet G.J., Blau H.M. From marrow to brain: expression of neuronal phenotypes in adult mice. // Science.- 2000.- V.290.-P.1775-1779.

42. Bugress N., Becker S., King J., O'Keefe J. Memory for events and their spatial context: models and experiments. // Philosophical Transaction of the Royal Society of London B: Biological Sciences.- 2001.- V.356.- №1413.- P. 1493-1503.

43. Camargo F.D., Finegold M., Goodell M.A. Hematopoietic myelomonocytic cells are the major source of hepatocyte fusion partners. // J. Clin. Invest.- 2004.- V.113.- №9.- P.1266-1271.

44. Campagnoli C., Roberts I.A.G., Kumar S., Bennett P.R, Bellantuono I., Fisk N.M. Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal blood, liver, and bone marrow. // Blood.- 2001.- V.98.- P.2396-2402.

45. Chen E.H., Grote E., Mohler W., Vignery A. Cell-cell fusion. // FEBS.-2007.- V.581.- P.2181-2193.

46. Chen E.H. Cell fusion. Overviews and Methods. Humana Press.- 2008.421p.

47. Cowan C.A., Atienza J., Melton D.A., Eggan K. Nuclear reprogramming of somatic cells after fusion with human embryonic stem cells. // Science.- 2005.- V.309.- P. 1369-1373.

48. Daadi M.M., Weiss S. Generation of tyrosine hydroxylase producing neurons from precursors of the embryonic and adult forebrain. // J. Neurosci.-1999.- V.19.- №11.- P.4484-4497.

49. Dalakas E., Newsome P.N., Harrison D.J., Plevris J.N. Hematopoietic stem cell trafficking in the liver injury. //FASEB.- 2005.- V.19.- P.1225-1231.

50. D'Amour К.A., Gage F.H. Genetic and functional differences between multipotent neural and pluripotent embryonic stem cells. // PNAS.- 2003.- V. 100.-suppl. 1.- P.l 1866-11872.

51. Danzer S.C. Postnatal and adult neurogenesis in the development of human disease. // Neuroscientist.- 2008.- V.14.- №5.- P.446-458.

52. Dayer A.G., Cleaver K.M, Abouantoun Т., Cameron H.A. New GABAergic interneurons in the adult neocortex and striatum are generated from different precursors. // JCB.- 2005.- V.168- P.415-427.

53. Dazsalia V., Heldmann U., Lindvall O., Kokaia Z. Stroke induced neurogenesis in aged brain. // Stroke.- 2005.- V.36.- P.1790-1795.

54. Duncan A.W., Hickey R.D., PaulkN.K., Culberson A.J., Olson S.B., Finegold M.J., Grompe M. Ploidy reductions in murine fusion-derived hepatocytes. // PLoS. Genet.- 2009.- 5(2): el000385.

55. Ehninger D., Kempermann G. Regional effects of wheel running and environmental enrichment on cell genesis and microglia proliferation in the adult murine neocortex. // Cereb. Cortex.- 2003.- V.13.- P.845-851.

56. Engel A., Walter P. Membrane lysis during biological membrane fusion: collateral damage by misregulated fusion machines. // J. Cell. Biol.- 2008.-V.183.- №2.- P.181-186.

57. Eriksson P.S., Perfilieva E., Bjork-Eriksson Т., Alborn A.M., Nordborg C., Peterson D.A., Gage F.H. Neurogenesis in'the adult human hippocampus. // Nat. Med.- 1998.- V.4.- P. 1313-1317.

58. Gage F.H. Mammalian neural stem cells. // Sience.- 2000.- V.287.-P.1433-1438.

59. Gajkowska В., Frontczak-Baniewicz M., Gadamski R., Barskov I. Photochemically-induced vascular damage in brain cortcx. Transmission and scanning electron microscopy study. // Acta Neurobiol. Exp.- 1997,- V.57.- P.203-208.

60. Gheusi G., Lledo P-M. Control of early events in olfactory processing by adult neurogenesis. // Chem. Senses.- 2007.- V.32- P.397-409.

61. Glaser Т., Perez-Bouza A., Klein K., Brustle O. Generation of purified oligodendrocyte progenitore from embryonic stem cells. // FASEB.- 2004.-published online October 14.- P. 1-20.

62. Gould E., Reeves A.J., Graziano M.S., Gross C.G. Neurogenesis in the neocortex of adult primates. // Science.- 1999.- V.286.- P.548-552.

63. Gould E., Vail N., Wagers M., Gross C.G. Adult generated hippocampal and neocortical neurons in macaques have a transient existence. // PNAS.- 2001.- V.98.- P.10910-10917.

64. Green A.R. Pharmacological approaches to acute ischaemic stroke: reperfusion certainly, neuroprotection possibly. // British J. of Pharm.- 2008.-V.153.- S325-S338.

65. Gurdon J.B., Byrne J.A., Simonsson S. Nuclear reprogramming and stem cell creation. // PNAS.- 2003.- V.100.- suppl.l.- P.l 1819-11822.

66. Hayes N.L., Nowalcowski R.S. Exploiting the dynamics of S-phase tracers in developing brain: interkinetic nuclear migration for cells entering versus leaving the S-phase. // Dev. Neurosci.- 2000.- V.22.- P.44-55.

67. Howard A., Pelc S. Nuclear incorporation of P ~ as demonstrated by autoradiographs. //Exp. Cell Res.- 1951.- V.2.- P. 178-187.

68. Ishikawa F., Yasukawa M., Yoshida S., Nakamura K., Nagatoshi Y., Kanemaru Т., Shimoda K., Shimoda S., Miyamoto Т., Okamura J., Shultz L.D.,1.135l

69. Harada M. Human cord blood- and bone marrow-derived CD34+ cells regenerate gastrointestinal epithelial cells. // FASEB.- 2004.- express article 10.1096/Q.04-2396fje.

70. Jessberger S., Clemenson G.D., Gage Jr.H, Gage F.H. Spontaneous fusion and nonclonal growth of adult neural stem cells. // Stem Cells.- 2007.-V.25.- P.871-874.

71. Jin K., Minami M., Xie L., SunY., Мао X., Wang Y., Simon R., Greenberg D. Ischemia-induced neurogenesis is preserved but reduced in the aged rodent brain. // Aging. Cell.- 2004.- V.3.- P.373-377.

72. Jin K., Wang X., Xie L., Мао X.O., Zhu W., Wang Y., Shen J., Mao Y., Banwait S., Greenberg D. Evidence for stroke-induced neurogenesis in the human brain. // PNAS.- 2006.- V.103. №35.- P. 13198-13202.

73. Johansson C.B., Momma S., Clarke D.L., Risling M., Lendahl U., Frisen J. Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system. // Cell.- 1999.- V.96.- P.25-34.

74. Kitamura Т., Saitoh Y., Takashima N., Murayama A., Niibori Y., Ageta H., Sekiguchi M., Sugiyama H., Inokuchi K. Adult neurogenesis modulates the hippocampus-dependent period of associative fear memory. // Cell.- 2009.- V.139.-P/814-827.

75. Kohler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. // Narure.- 1975.- V.256, №5517.- P.495-497.

76. Koketsu D., Mikami A., Miyamoto Y., Hisatsune T. Nonrenewal of neurons in the cerebral neocortex of adult macaque monkeys. // J. Neurosci.-2003,- V.23.- P.937-942.

77. Kolb B. Functions of the frontal cortex of the rat: a comperative review. // Brain Res. Rev.- 1984.- V.8.- P.65-98.

78. Kolb В., Pedersen В., Ballermann M., Gibb R., Whishaw I.Q. Embryonic and postnatal injections of bromdeoxyuridine produce age-dependent morphological and behavioral abnormalities. // J. Neurosci.- 1999.- V.19.- №6.-P.2337-2346.

79. Kornack D.R., Rakic P. Continuation of neurogenesis in the hippocampus of the adult macaque monkey. // PNAS.- 1999.- V.96.- P.5768-5773.

80. Kornack D.R., Rakic P. The generation, migration and differentiation of olfactory neurons in the adult primate brain. // PNAS.- 2001.- V.98.- №8.- P.4752-4757.

81. Kornack D.R., Rakic P. Cell proliferation without neurogenesis in adult primate neocortex. // Science.- 2001b.- V.294.- P.2127-2130.

82. LaBarge M.A., Blau H.M. Biological progression from adult bone marrow to mononucleate muscle stem cell to multinucleate muscle fiber in response to injury. // Cell.- 2002.- V.l 11.- P.589-601.

83. Lipton P. Ischemic cell death in brain neurons. // Physiol. Rev.- 1999.-V.79.-№4.-P. 1431-1568.

84. Luskin M.B. Restricted proliferation and migration of postnatally generated neurons derived from the forebrain subventricular zone. // Neuron. 1993.- V.l 1.- P.173-189.

85. March B.J., Williams-Karnesky R.L., Stenzel-Poore M.P. Toll-like receptor signaling in endogenous neuroprotection and stroke. // Neurosci.-2009.-V.158.- P.1007-1020.

86. Maviel Th., Durlcin T.P., Menzaghi F., Bontempi B. Sites of neocortical reorganization critical for remote spatial memory. // Scince.- 2004.- V.305.- P. 9699.

87. Mezey E., Chandross K.J., Harta G., Maki R.A., McKercher S.R. Turning blood into brain: cells bearing neuronal antigens generated in vivo from bone marrow. // Science.- 2000.- V.290.- P. 1779-1782.

88. Milikowski C., Berman I. Color Atlas of basic histopathology -lrd ed. Prentice-Hall International, Inc.- 1997.- 615p.

89. Mintz В., Baker W.W. Normal mammalian muscle differentiation and gene control of isocitrate dehydrogenase synthesis. // PNAS.- 1967.- V.58.- P.592 -598.

90. Mooney S.M., Miller M.W. Postnatal generation of neurons in the ventrobasal nucleus of the rat thalamus. // J. Neurosci.- 2007.- V.27.- №19.-P.5023-5032.

91. Morrison S.J. Stem cell potential: can anything make anything? // Cur. Biol.- 2001.- V.11.-R7-R9.

92. Morshead C.M., Czaig C.G., van der Kooy D. In vivo clonal analyses reveal the properties of endogenous neural stem cell proliferation in the adult mammalian forebrain. //Development.- 1998.- V.125.- P.2251-2261.

93. Musina R.A., Yegorov Ye.Ye., Belyavskiy A.V. Stem cell: properties and prospective medical applications. // Mol. Boil.- 2004.- V.38.- №4.- P.469-481.

94. Nedergaard M. Mechanisms of brain damage in focal cerebral ischemia. // Acta. Neurol. Scand.- 1988.-V.77.-P.81-101.

95. Ogle B.M., Cascalho M., Piatt J.L. Biological implications of cell fusion. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol.- 2005.- V.6.- № 7.- P.567-575.

96. Ohab J.J., Carmichael S.T. Poststroke neurogenesis: Emerging principles of migration and localization neurons. // Neuroscientist.- 2008.- V. 14.-№4.- P.369-380.

97. O'Malley K., Scott E.W. Stem cell fusion confusion. // JCB.- 2004.-V.32.- № 2.- P.l 31-134.

98. Orkin S.H., Zon L.I. Hematopoiesis and stem cells: plasticity versus developmental heterogeneity. // Nat. Imm.- 2002.- V.3.- №4.- P.323-328.

99. O'Shea K.S. Neural differentiation of embryonic stem cells. In Neural Stem Cells.- Humana Press.- 2003.- 3-14p.

100. Paxinos G., Watson C. Atlas of anatomy of rat brain. The rat brain in stereotaxic coordinates. San Diego.: Academic Press.- 1998.- 474c.

101. Petty M.A., Wettstein J.G. Elements of cerebral mikrovascular ischaemia. // Brain Res. Brain Res. Rev.- 2001.- V.36.- P.23-34.

102. Politis P.K., Makri G., Thomaidiu D., Geissen M., Rohrer H., Matsas R. BM88/CEND1 coordinates cell cycle exit and differentiation of neuronal precursors. // PNAS.- 2007.- V.l04.- №45.- P.l 7861-17866.

103. Priller J., Persons D.A., KlettF.F., Kempermann G., Kreutzberg G.W., Dirnagl U. Neogenesis of cerebellar Purkinje neurons from gene-marked bone marrow cells in vivo. // JCB.- 2001.- V.l55.- №5.- P.733-738.

104. Prockop D.J. Reparative power of multipotent stromal cells from bone marrow. // FASEB.- 2006,- 20:A867.

105. Rakic P. Neurogenesis in adult primates. // Prog. Brain Res.- 2002.-V.138.- P.3-14.

106. Reynolds B.A., Weiss S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. // Science.- 1992.-V.- 255.- P.1707-1710.

107. Rosemary L. Experimental neuronal protection in cerebral ischemia. // J. Clin. Neurosci.- 1997.- V.5.- P.290-302.

108. Ross M.H., Romrell L.J., Kaye G.I. Histology: a text and atlas.- 3rd ed. Lippincott Williams and Wilkins.- 1995.- 823p.

109. Rossi F.M., Keshet G.J., Blau H.M. From marrow to brain: expression of neuronal phenotypes in adult mice. // Science.- 2000.- V.290.- P. 1775-1779.

110. Shors T.J., Miesegaes G., Beylin A., Zhao M., Rydel Т., Gould E. Neurogenesis in adult in involved in the formation of trace memories. // Nature.-2001.- V.15.- P.372-375.

111. Sotnikov O.S., Paramonova N.M., Archakova L.I. Ultrastructural analysis of interneuronal syncytial perforations. // Cell Biol. Int.- 2010,- V.34.-P.361-364.

112. Spalding K.L., Bhardwaj R.D., Buchholz B.A., Druid H., Frisen J. Retrospective birth dating of cells in humans. // Cell.- 2005. V.122- P.133-143.

113. Springer M.L., Brazelton T.R., Blau H.M. Not the usual suspects: the unexpected sources of tissue regeneration. // J. Clin. Invest.- 2001.- V.107.- №11.-P.1355-1356.

114. Tae Do J., Wook Han D., Gentile L., Sobek-Klocke I., Stehling M., Taek Lee H., Sholer H.R. Erasure of cellular memory by fusion with pluripotent eels. // Stem Cells.- 2007.- №25.- P.1013-1020.

115. Tamura A., Graham D.I., McCulloch J., Teasdale G.M. Focal cerebral ischemia in the rat: Destription of techniqe and early neuropathological conceqences following middle cerebral artery occlusion. // J. Cereb. Blood. Flow. Metab.- 1981.- V.I.-P.53-60.

116. Teng E., Squire L.R. Memory for places learned iong ago is intact after hippocampal damage. //Nature.- 1999.- V.400.- P.675-677.

117. Terada N., Hamazaki Т., Oka M., Hold M., Mastalerz D.M., Nakano Y., Meyer E.M., Morel L., Petersen B.E., Scott E.W. Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by spontaneous cell fusion. // Nature.- 2002.- V.416.1. P.542—545.

118. Toni N., Laplagne D.A., Zhao C., Lombardi G., Ribalc C.E., Gage F.H., Schindler A.F. Neurons bom in the adult dentate gyrus from functional synapses with target cells. // Nat. Neurosci.- 2008,- V.l 1,- №8,- P.901-907.

119. Vassilopoulos G., Wang P-R., Russell D.W. Transplanted bone marrow regenerates liver by cell fusion. //Nature.- 2003,- V.422- P.901-904.

120. Ventura R.E., Goldman J.E. Dorsal radial glia generate olfactory bulb interneurons in the postnatal murine brain. // J. Neurosci.- 2007.- V.27.- №16.-P.4297-4302.

121. Wagers A.J., Weissman I.L. Plasticity of adult stem cells. // Cell.-2004.- V.l 16,- №5.- P.639-648.

122. Wang X., Willenbring H., Akkari Y., Torimaru Y., Foster M., Al-Dhalimy M., Lagasse E., Finegold M., Olson S., Grompe M. Cell fusion is the principal source of bone-marrow-derived hepatocytes. // Nature.- 2003.- V.422.-P.897-901.

123. Watson B.D., Dietrich W.D., Busto R. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. // Ann. Neurol.- 1985.- V.17.-P.497-504.

124. Weimann J.M., Johansson C.B., Trejo A., Blau H.M. Stable reprogrammed heterokaryons form spontaneously in Purkinje neurons after bone marrow transplant. // Nat. Cell Biol.- 2003.- V.5.- №11.- P.959-966.

125. Weiss S., van der Kooy D. CNS stem cells: Where is the biology (a.k.a. beef)? // J. Neurubiol.- 1998,- №36,- P.307-314.

126. Weiss S., Reynolds B.A., Vescovi A.L., Morshead C., Craig C.G., Kooy D. Is there a neural stem cell in the mammalian forebrain? // Tren. In Neurosci.- 1996.- V.19.- №9.- P.387-393.

127. Wiltigen B.J., Silva A.J. Memory for context becomes less specific with time. // Learm. Mem.- 2007.- V. 14,- №4.- P.313-317.

128. Wurmser A.E., Gage F.H. Stem cells: Cell fusion causes confusion. // Nature.- 2002.- V.416.- P.485-487.

129. Wurmser A.E., Nakashima K., Summers R.G., Toni N., D'Amour K.A., Lie D.C., Gage F.H. Cell fusion-independent differentiation of neural stem cells to the endothelial lineage. //Nature.- 2004,- V.430.- P.350-356.

130. Yamanaka S. Pluripotency and nuclear reproPriller J., Persons D.A., Klett F.F. et al., 2001).gramming. // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci.-2008.- V.363.- P.2079-2087.

131. Ying Qi-L, Nichols J, Evans E.P, Smith A.G. Changing potency by spontaneous fusion. // Nature.- 2002.- V.416.- P.545-548.

132. Yu J., Vodyanik M.A., He P., Slukvin I.I., Thomson J.A. Human embryonic stem cells reprogram myeloid precursors following ccll-cell fusion. // Stem Cells.- 2006.- V.24.- №1.- P. 168-176.

133. Zhang R.L., Zhang Z.G., Chopp M. Neurogenesis in the adult ischemic brain: generation, migration, survival, and restorative therapy. // Neuroscientist.- 2005.- V.l 1.- №5,- P.408-416.

134. Zhang S.C., Lundberg C., Lipsitz D., О Connor L.T., Duncan I.D. Generation of oligodendroglial progenitors from neural stem cells. // J. Neurocytol.- 1998.- V.27.- P.475-489.

135. Zhao Ch., Teng E.M., Summers R.G., Ming G., Gage F.H. Distinct morphological stages of dentate granule neuron maturation in the adult mouse hippocampus. // J. of Neurosci.- 2006.- V.26.- №1.- P.3-11.

136. Zigova Т., Sanberg P.R., Sanchez-Ramons J.R. Neural Stem Cells. Methods and Protocols. Humana Press.- 2003.- 380p.

137. Zuk P.A., Zhu M., Mizuno H., Huang J., Futrell J.W., Katz A.J., Benhaim P., Lorenz H.P., Hedrick M.H. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell based therapies. // Tiss. Engin.- 2001.- V.7.- №2.-P.211-228.