Посттравматические реакции спинного мозга крысы при трансплантации мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.04, кандидат медицинских наук Мухамедшина, Яна Олеговна

• Мухамедшина, Яна Олеговна
• кандидат медицинских наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Мухамедшина, Яна Олеговна

ОГЛАВЛЕНИЕ Стр.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. Обзор литературы

1.1. Патологические реакции при травме спинного мозга

1.2. Концепция нейротрофических факторов в приложении к 22 регенерации спинного мозга

1.3. Клеточная терапия при травме спинного мозга

1.4. Генетическая модификация клеток

1.5. Генно-клеточная терапия при травме спинного мозга

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Методика проведения операции на спинном мозге

2.2. Экспериментальные группы

2.3. Генетическая модификация клеток

2.4. Гистологические методы

2.5. Иммуногистохимические методы

2.6. Оценка восстановления двигательной функции

2.7. Статистическая обработка результатов

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Сроки выживания и характеристика миграционного потен- 64 циала мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансплантированных в область контузионной травмы спинного мозга крысы

3.2. Восстановление двигательной функции

3.3. Посттравматические реакции в спинном мозге крысы после 75 трансплантации мононуклеарных клеток крови пуповины

3.4. Посттравматические изменения количества 8100В+- и 85 РБОЕ/З^-клеток

3.5. Миграция шванновских клеток в область травмы спинного

мозга

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

5. ВЫВОДЫ

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

мккп мононуклеарные клетки крови пуповины человека

НТФ нейротрофический фактор

есп> усиленный зелёный флуоресцентный белок

мозговой нейротрофический фактор

ГС,¥2 фактор роста фибробластов

GDNF глиальный нейротрофический фактор

вРАР глиальный фибрилярный кислый белок

HNu ядерный антиген человека

ШР25 белок теплового шока

NGF фактор роста нервов

N13 нейротрофин

ОЕСб глиальные клетки обонятельных структур

РОСГ/ЗИ /3-рецептор тромбоцитарного фактора роста

р75 низкоаффинный рецептор фактора роста нервов

УЕвГ сосудистый эндотелиальный фактор роста

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Посттравматические реакции спинного мозга крысы при трансплантации мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Травма спинного мозга остаётся одной из актуальных медико-социальных проблем. Эффективных методов её лечения не существует, что является причиной глубокой инвалидизации пострадавших. Возможность преодоления последствий травмы спинного мозга связывают с применением нейротрофических факторов (НТФ), которые поддерживают жизнеспособность нейронов и регенерацию аксонов в спинном мозге (Jones et al., 2001; Lu, Tuszynski, 2008; Hollis, Tuszynski, 2011). Однако в ходе клинических испытаний с системной их доставкой были выявлены неприемлемые побочные реакции и низкая эффективность (Apfel et al., 2002). При непосредственном введении НТФ в область повреждения действие оказалось нестойким вследствие быстрого расщепления протеазами. Эти трудности стимулировали поиск других способов повышения содержания НТФ в повреждённой ткани. Среди них наиболее эффективной оказалась доставка генов НТФ.

Для доставки в область травмы спинного мозга терапевтических генов начато применение вирусных и невирусных векторов (De Laporte et al., 2011; Во et al., 2011; Hutson et al., 2012). Невирусные векторы, в частности плазми-ды, несмотря на низкую трансфекционную активность, считаются более безопасными. Одновременная доставка в повреждённую ткань нескольких генов НТФ кажется наиболее эффективной, а дальнейшее её изучение пред-став-ляется актуальным. При проведении генной терапии с целью стимулирования нейрорегенерации особенно перспективна одновременная доставка генов НТФ и ангиогенных факторов. Примером может служить комбинация генов сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2) (Islamov et al., 2004; Sabti, 2007), применение которой при травме спинного мозга не исследовано.

Клеточная терапия рассматривается как один из перспективных способов преодоления последствий при травме спинного мозга. С этой целью ис-

следуют эмбриональные и нейральные стволовые клетки, глиальные клетки обонятельных структур, клетки крови пуповины, микроглия-подобные клетки, шванновские клетки и многие другие (Eftekharpour et al., 2008; Xu, Onifer, 2009; Ronaghi et al., 2010). Трансплантируемые клетки поддерживают восстановление матрикса ткани для регенерации нервных волокон, оказывают трофическое влияние на нейроны и глию, обеспечивают рост аксонов и участвуют в их ремиелинизации. Наиболее перспективными представляются клетки крови пуповины, оценке результатов экспериментальной трансплантации которых при травме спинного мозга посвящено достаточное количество работ (Hernández et al., 2011; Park et al., 2011; Sun, Ma, 2012). Трансплантация клеток крови пуповины человека при травме спинного мозга угнетает воспалительную реакцию, оказывает нейротрофическое влияние, стимулирует не-оваскуляризацию (Chen et al., 2008) и снижает экспрессию проапоптозных генов (Dasari et al., 2009). Трансплантации мононуклеарных клеток крови пуповины (МККП), как известного источника стволовых и прогениторных клеток, активно исследуют для преодоления последствий травмы и ишемии мозга, а также для лечения нейродегенеративных заболеваний (Kuh et al., 2005; Rizvanov et al., 2008; Rodrigues et al., 2012).

Несмотря на актуальность дальнейших исследований по трансплантации клеток при травме спинного мозга, стало очевидным, что только клеточная терапия в чистом виде приводит лишь к умеренному улучшению структурных показателей и недостаточному восстановлению функции. Именно поэтому для стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга внимание исследователей привлекли генетически модифицированные клетки с усиленной экспрессией терапевтических генов НТФ.

При травме спинного мозга для анализа результативности нейрореге-нерации в условиях генно-клеточной терапии, наряду с применением общепринятых критериев, таких как степень восстановления функциональных параметров, сохранность ткани, выраженность патологической кавитации, ко-

личество регенерирующих миелиновых волокон, представляется важным оценить состояние клеток конкретных популяций. Среди них астроциты как наиболее многочисленные глиальные клетки, которые обеспечивают поддержание гомеостаза в мозге и нарушение функции которых немедленно приводит к развитию нейродегенерации (Rossi, Volterra, 2009; Matyash, Kettenmann, 2010; Allaman et al., 2011).

Другим клеточным типом, на который в нашей работе было обращено особое внимание, явились шванновские клетки. Эти клетки в нормальных условиях не мигрируют в мозг из периферических нервных структур. Но они появляются в ЦНС в очагах демиелинизации и в области травматического повреждения и могут участвовать в миелинизации аксонов в ЦНС (Jasmin et al., 2000; Totoiu, Keirstead, 2005; Oudega, Xu, 2006). Несмотря на пристальный интерес к проблеме миграции шванновских клеток в область повреждения мозга и проведённые исследования в этом направлении, многие вопросы поведения этих клеток требуют изучения. Не определены динамика численности популяции шванновских клеток-мигрантов в области травматического повреждения и количество жизнеспособных клеток, способных участвовать в ремиелинизации центральных аксонов. Применительно к задачам генно-клеточной терапии представляется актуальным оценить возможность поддержания в области травмы спинного мозга популяции шванновских клеток-мигрантов и влияния на их фенотипические характеристики.

Поскольку наша работа предполагает доставку плазмидного вектора с комбинацией генов, продукты которых стимулируют неоваскуляризацию, в качестве объекта исследования выбраны перициты, экспрессирующие /3-рецептор тромбоцитарного фактора роста (PDGF/3R). Определение их количества позволит оценить значение одновременной доставки в область травматического повреждения терапевтических генов VEGF и FGF2 для ре-васкуляризации как фактора поддержания посттравматической нейрорегене-рации.

Цель исследования - оценить эффективность мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансфицированных плазмидой рВис!-УЕОР-РОР2, для преодоления последствий контузионной травмы спинного мозга крысы в условиях их однократной трансплантации в область повреждения.

Для достижения цели поставлены следующие задачи, решаемые на модели дозированной контузионной травмы спинного мозга крысы в условиях локальной доставки в область повреждения терапевтических генов на клеточных носителях:

1. Изучить сроки выживания и миграционный потенциал трансплантированных мононуклеарных клеток крови пуповины человека.

2. Исследовать динамику восстановления двигательной функции в поведенческом тесте ВВВ.

3. Оценить суммарную площадь патологических полостей, площади сохранённого серого и белого вещества на поперечных срезах спинного мозга и количество миелиновых волокон в фиксированных наружных зонах белого вещества.

4. Определить количество клеток, экспрессирующих белок 8100В, в наружных зонах белого вещества в области повреждения.

5. Установить количество периваскулярных клеток, экспрессирующих РООР/ЗЯ, в наружных зонах белого вещества в области повреждения.

6. Оценить количество и фенотип шванновских клеток, мигрировавших в область повреждения.

Научная новизна

Впервые показано стимулирующее влияние на процессы нейрорегене-рации доставки в область травмы спинного мозга комбинации генов УЕвР и РвР2 при помощи трансфицированных плазмидой рВиё-УЕОР-РОР2 МККП человека, что проявляется в уменьшении площади деструкции серого и белого вещества, патологической кавитации, увеличения количества миелиновых

волокон и улучшения восстановления двигательной функции. Получены новые данные по срокам выживания и миграционному потенциалу трансплантированных в спинной мозг крысы МККП человека, трансфицированных плазмидой рВис1-УЕОР-РОР2. Впервые при контузионной травме спинного мозга и трансплантации трансфицированных плазмидой рВис!-УЕОР-РОР2 МККП в белом веществе области повреждения показано увеличение количества 8100В+- и РВОР/Ж.+-клеток. Приоритетными являются данные о том, что трансплантация МККП в область травмы спинного мозга оказывает поддерживающее влияние на популяцию мигрирующих в мозг шванновских клеток, а в сочетании с доставкой терапевтических генов УЕвР и РОР2 этот эффект усиливается. Впервые обнаружена экспрессия белка теплового шока 25 (ШР25) в шванновских клетках, мигрирующих в белое вещество спинного мозга в пределах области повреждения и экспрессирующих глиальный фибриллярный кислый белок (ОРАР) и транскрипционный фактор Кгох20. Научно-практическая значимость работы

Полученные результаты о стимулирующем влиянии на процессы ней-рорегенерации МККП, трансфицированных плазмидой рВис1-УЕОР-РСР2, в условиях их доставки в область травмы спинного мозга обосновывают выбор этого способа генно-клеточной терапии для последующего углублённого исследования на доклиническом этапе, что позволит приступить к клиническим испытаниям. Полученные данные подтверждают актуальность и перспективность работ по усовершенствованию и последующему применению разработанной технологической платформы создания генетических конструкций в качестве инструмента для формирования на основе этой же платформы других, возможно более эффективных средств для лечения и реабилитации больных с нейротравмой и тяжёлыми неврологическими заболеваниями.

Положения, выносимые на защиту:

1. Трансплантация в область контузионной травмы спинного мозга крысы мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2, стимулирует нейрорегенерацию.

2. Доставка терапевтических генов VEGF и FGF2 в область травматического повреждения спинного мозга при помощи мононуклеарных клеток крови пуповины человека поддерживает в нём популяцию шванновских клеток-мигрантов.

Апробация материалов диссертации

Основные положения и результаты работы доложены на: IV Всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Санкт-Петербург, 2010); Всероссийской научной школе-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2010); VIII Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 2010); Всероссийской научной конференции «Регенеративная биология и медицина» (Москва, 2011); V Всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Уфа, 2012); XI Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Самара, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ, из них 6 статей в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК. Связь работы с базовыми научными программами

Работа поддерживалась грантами: РФФИ №07-04-00746-а «Стимулирование регенерации аксонов в центральной и периферической нервной системе с помощью гелевых носителей для стволовых клеток, супрамолекулярных систем с самосборкой, сосудистого эндотелиального фактора роста и ксиме-дона» (2007-2009 гг.), ОПТЭК «Выживание и дифференцировка мигрирующих в спинной мозг эндогенных шванновских клеток под влиянием нейро-трофических факторов» (2012 г.), РФФИ №12-04-31092-мол_а «Сравнение

эффективности клеточно-опосредованной и прямой доставки генов нейро-трофических факторов на посттравматическую регенерацию спинного мозга» (2012-2013 гг.).

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 2 таблицами и 34 рисунками, которые включают микрофотографии световой, флуоресцентной и конфокальной микроскопии, схемы. Библиографический список содержит 265 источника, из них 252 иностранных.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Патологические реакции при травме спинного мозга

Травма спинного мозга характеризуется многочисленными патологическими реакциями, в которые вовлечены практически все типы клеток ЦНС. Она приводит к гибели нейронов и глиальных клеток, сопровождается дегенерацией нервных волокон. Наиболее опасным и на сегодняшний день практически необратимым последствием патологических сдвигов является угнетение и выпадение двигательной функции и развитие параличей.

Современная концепция патогенеза травматического повреждения спинного мозга рассматривает два основных взаимосвязанных механизма гибели клеток: некроз и апоптоз. С некрозом связывают первичное повреждение спинного мозга, которое характеризуется развитием патологических сдвигов в результате непосредственного воздействия на ткань повреждающего фактора - механической травмы (контузия или сдавление мозга, дисцир-куляторные сосудистые расстройства).

Первичное повреждение сменяется вторичным, что приводит к наиболее серьёзным патологическим реакциям, к которым можно отнести развитие местного воспалительного ответа с повышением уровня провоспалительных цитокинов [например, фактора некроза опухоли a, (TNFa)], окислительный стресс и эксайтотоксичность (Rabchevsky, Smith, 2001; Ronaghi et al., 2010). Механизмы вторичного повреждения, включают сосудистый и воспалительный ответ. Эти реакции вызывают выраженную гибель нейронов и глиальных клеток, что проявляется распространённым восходящим и нисходящим повреждением нервных проводников, демиелинизацией и гибелью части аксонов (Beattie et al., 2002; Rowland et al., 2008; Xu et al., 2012). Исследования последних лет в качестве основной причины вторичного повреждения рассматривают активацию микроглии, приводящую к выработке многочисленных провоспалительных и нейротоксических молекул (Loane, Byrnes, 2010; Qu et al., 2012; Min et al., 2012).

Вторичное повреждение сопровождается апоптозом, который связывают с эксайтотоксическим действием глутамата (Fujieda et al., 2012), изменением содержания ионов Са (Sullivan et al., 2007), медиаторов воспаления (Pineau, Lacroix, 2007), ишемии и пр. Первым запускается апоптоз нейронов, микро- и олигодендроглии вблизи от некротического очага (этот процесс начинается в первые часы после травмы и может длиться до трех суток). Следующий пик апоптоза глии наблюдается через 7-14 суток на отдалении от эпицентра травмы и сопровождается гибелью олигодендроцитов (Min et al., 2012). Вторичное повреждение аксонов, активация внутриклеточных протеаз, нуклеаз, запуск механизма апоптоза приводит к отсроченной гибели клеток и снижению числа сохранившихся нейронов.

Вторичное повреждение при травме спинного мозга включает демие-линизацию, степень и функциональные последствия которой остаются не-уточнёнными. На модели контузионной травмы спинного мозга у крысы в работе Totoiu, Keirstead (2005) показано, что максимальное количество де-миелинизированных аксонов можно обнаружить через 1 сутки после повреждения, с последующим снижением в течение 1-2 недели и прогрессивным нарастанием к 450 суткам. В указанной работе демиелинизированные аксоны обнаружены на всех сроках эксперимента, что говорит о незавершённости процесса ремиелинизации. Поддержание структуры миелиновых волокон в спинном мозге является одной из главных терапевтических стратегий его посттравматической регенерации (Челышев, Викторов, 2009). Считается, что значительное повреждение серого вещества спинного мозга приводит к относительно небольшим функциональным нарушениям. Так, избирательное ли-ганд-опосредованное повреждение серого вещества крысы без затрагивания окружающих трактов, существенно не влияет на подвижность конечностей (Magnuson et al., 1999). Поэтому поддержание и восстановление структуры и функции белого вещества считается одной из главных задач клеточной терапии при травме спинного мозга.

Раннее было рассмотрено, что в процесс апоптоза после травмы вступают олигодендроциты, причём не только в области повреждения, но и даже на значительном расстоянии от места травмы. Поэтому меры, направленные на сдерживание посттравматического апоптоза олигодендроцитов, представляются оправданными с точки зрения сохранения структуры миелиновой оболочки и при её повреждении повышают вероятность протекания процесса ремиелинизации (Челышев и Викторов, 2009). В этом отношении достаточно интересным представляется исследование Ackery et al. (2006), где на модели компрессионной травмы спинного мозга показано использование растворимой формы Fas-рецептора, которая сдерживает вступление нейронов и олигодендроцитов в Fas-опосредованный апоптоз.

Демиелинизация, как следствие гибели олигодендроциов, приводит к нарушению проведения импульсов по нервным волокнам вследствие появления в мембране перехватов потенциалозависимых воротных калиевых каналов (Ouyang et al., 2010). При ремиелинизации возможно восстановление проведения импульсов (Waxman et al., 1994) и устранение функциональных нарушений (Jeffery et al., 1999).

Одновременно с вторичным повреждением, вследствие активации аст-роцитов, формируется глиальный рубец, который сдерживает прорастание аксонов (Fawcett, Asher, 1999). Глиальные барьеры, формирующиеся при травматическом повреждении мозга, представлены двумя структурами. Это глиальный рубец и стенка патологических полостей (цист, или кист). Обе эти структуры имеют сходное строение и содержат в качестве доминирующего клеточного типа реактивные астроциты. И в глиальном рубце, и в стенке патологических полостей астроциты вырабатывают одни и те же молекулы ингибиторы роста аксонов, в первую очередь наиболее изученные хондроитин-сульфат протеогликаны (Bradbury, Carter, 2011; Kawano et al., 2012).

Глиальный рубец образуется при нарушении целостности гематоэнце-фалического барьера и проникновении в ткань мозга молекул из внутренней

среды организма, обычно отсутствующих в ЦНС. Барьер остаётся проницаемым для подобных молекул из крови в течение двух недель после нанесения травмы. Прослежена прямая корреляция между степенью дезинтеграции ге-матоэнцефалического барьера, интенсивностью процесса образования гли-ального рубца и выраженностью инфильтрации ткани в эпицентре травмы активированными макрофагами (Kawano et al., 2012).

При травме спинного мозга глиальный рубец представлен компактным скоплением реактивных астроцитов. Они образуют многочисленные интенсивно ветвящиеся, но более короткие отростки, по сравнению с интактными астроцитами, у которых области присутствия ветвления отростков не перекрываются. Перикарионы реактивных астроцитов, в том числе и пролифери-рующих, а также плотная перекрывающая соседние клетки сеть их отростков, связанных щелевыми контактами, фактически и образуют глиальный барьер, препятствующий росту аксонов. Кроме реактивных астроцитов, как главного клеточного компонента, в составе глиального рубца присутствуют предшественники макроглии, а также активно проникающие в рубец реактивные микроглия/макрофаги. При нарушении целостности твёрдой мозговой оболочки в составе глиального рубца обнаруживаются фибробласты и периваскулярные клетки.

Со времен Ramon у Cajal глиальные барьеры рассматриваются, как главная причина недостаточности нейрорегенерации в ЦНС за счёт их способности угнетать рост регенерирующих нервных волокон. В основе этого отрицательного действия присутствуют две составляющие. Одна из них - это формирование реактивными астроцитами физического барьера, другая и, пожалуй, более значимая представлена специфическим торможением роста аксонов молекулами-ингибиторами, продуцируемыми реактивными астроцитами. Указанному способствует и появление, связанное с деструкцией миелина, в микроокружении аксонов многочисленных молекул естественных ингибиторов их роста [Nogo, миелин ассоциированного гликопротеина (MAG),

гликопротеина миелина олигодендроцитов (OMgp)] (Akbik et al., 2012; Lee et al., 2012).

С другой стороны, возникающие при травме мозга глиальные барьеры, играют положительную роль, разделяя компартменты повреждённой и нормальной ткани и участвуя в восстановлении гематоэнцефалического барьера. Эту роль связывают с участием глиальных барьеров в поддержании целостности мозга и реконструкции повреждённой ткани, необходимостью предотвращения нежелательных клеточных реакций, распространения инфекционных агентов. Формирующиеся барьерные глиальные структуры оказывают стимулирующее влияние на процессы неоваскуляризации, что важно для трофики ткани и метаболического обеспечения процесса нейрорегенерации. К полезным свойствам глиального рубца относят его способность ограничивать воспалительный ответ и сдерживать повреждение клеток. Кроме того, рассматривая позитивную роль глиального рубца, следует учитывать и то, что многие молекулы, вырабатываемые астроцитами (в том числе белок S100B), оказывают нейротрофическое влияние, а сами астроциты формируют потенциальное пространство для роста аксонов (Yao et al., 1995; Rothermundt et al., 2003). В то же время глиальный рубец снижает воспалительные реакции в ранней фазе повреждения (Gris et al., 2007). Поэтому модуляция процесса образования глиального рубца является одним из элементов возможного стимулирования регенерации.

Вблизи глиального рубца в дистальном и проксимальном отделе спинного мозга формируются мелкие полости, при слиянии которых образуются посттравматические кисты различного размера (Balentine, 1978; Sofroniew, Vinters, 2010). Процесс их образования наиболее выражен при контузионной травме спинного мозга. Полости возникают в результате первичного повреждения и вначале развития патологического процесса занимают ограниченную область эпицентра травмы и имеют небольшие размеры. В дальнейшем, по мере развития вторичного повреждения, их размеры значительно увеличива-

ются, они сливаются и формируют большую полость в пределах серого и белого вещества, отделённую от сохранённой ткани глиальным барьером (посттравматическая сирингомиелия) (Fitch et al., 1999).

Таким образом, происходит значительная деструкция как серого, так и белого вещества. В наибольшей мере повреждение затрагивает серое вещество, в котором появляются просветлённые участки, лишённые клеток и особо выражены области кровоизлияний (Kwak et al., 2005; Масгутова и др., 2008). В сером веществе, как области эпицентра травмы, так и прилегающих к ней участках возникает хроматолиз и гибель нейронов, площадь сохранённого серого вещества значительно уменьшается. Однако отмечено, что даже существенная потеря серого вещества после травмы спинного мозга не приводит к серьёзным нарушениям двигательной функции (McDonald et al., 2004). После травмы в относительно сохранённом белом веществе развивается отёк, нервные волокна ростральнее и каудальнее эпицентра травмы дегенерируют. Одновременно начинается деструкция миелиновых оболочек, апоптоз олиго-дентдроцитов, формируются указанные выше микрокисты, что приводит к уменьшению площади сохранённого белого вещества (Ek et al., 2012). Считается, что именно показателем сохранённого белого вещества определяется степень нарушений произвольных движений, то есть исключительно количеством уцелевших аксонов.

Причины возникновения патологических полостей неизвестны. В качестве гипотез рассматривали ишемию с дальнейшим высвобождением ионов Са (Young, Koreh, 1986), возбуждающих аминокислот, кининов, серотонина (Darian-Smith, 2009), геморрагии, активацию пептидаз, гидродинамический удар, макрофагальную инфильтрацию и воспаление (Tator, Koyanagi, 1997; Fitch et al., 1999). На сегодняшний день главной причиной прогрессивного образования патологических полостей при травме спинного мозга считают воспаление. Активация макрофагов приводит к усилению воспалительного ответа, выработке нейротоксических молекул, кавитации и продукции в бе-

лом веществе молекул-ингибиторов роста аксонов, таких как протеогликаны (Fitch etal., 1999).

Рассмотренные выше патологические реакции приводят к посттравматической деструкции спинного мозга, в результате чего утрачиваются двигательная и чувствительная функции организма, что приводит к глубокой ин-валидизации больных с вялыми или спастическими параличами, парезами конечностей и дисфункцией тазовых органов. Посттравматические нарушения в спинном мозге являются причиной устойчивого функционального дефицита, усугубляемого низким регенераторным потенциалом ЦНС. В то же время, параллельно развитию первичного и вторичного повреждения формируется динамическая линия восстановительно-приспособительных функциональных изменений, в первую очередь за счёт пластичности нейронов и реорганизации сосудов спинного мозга.

При травме спинного мозга демиелинизация является составной частью общего процесса вторичного повреждения. К важному фактору для ремиели-низации повреждённых аксонов в ЦНС относят шванновские клетки, основными маркёрами которых являются белок периферического миелина РО, транскрипционные факторы Кгох20 и Кгох24, низкоаффинный рецептор фактора роста нервов (р75), белок S100В и GFAP (Jessen, Mirsky, 2005; Nago-shi et al., 2011). Шванновские клетки продуцируют компоненты для внеклеточного матрикса, синтезируют НТФ и не вырабатывают как олигодендроци-ты ингибиторы роста аксонов (Boyd, Gordon, 2003; Höke, Mi, 2007). В нормальных условиях шванновские клетки не мигрируют из периферической нервной системы в мозг, но они появляются в ЦНС в очагах демиелинизации и в области травматического повреждения, где могут участвовать в миелини-зации аксонов (Hagg, 2006; Zujovic et al., 2007; Lavdas et al., 2008). На модели контузионной травмы спинного мозга крысы показано, что к концу второй недели в процессе ремиелинизации аксонов участвуют не только олигоденд-роциты, но и шванновские клетки (Totoiu, Keirstead, 2005). По мнению боль-

шинства исследователей, появление шванновских клеток в области травмы спинного мозга связано с их миграцией из периферических нервных структур вследствие нарушения целостности барьера (Oudega, Xu, 2006). Согласно другому предположению олигодендроциты в области повреждения начинают экспрессировать маркёры шванновских клеток. Наконец, можно предположить возможность дифференцировки шванновских клеток из нейральных предшественников in situ. Однако два последних предположения пока не имеют строгих экспериментальных доказательств.

Предполагается, что собственные шванновские клетки, появляющиеся в области травмы спинного мозга, могут участвовать не только в ремиелини-зации аксонов (Jasmin et al., 2000; Zujovic et al., 2007), но и в восстановлении проводимости (Franklin, Barnett, 1997). Подобное поведение шванновских клеток представляется исключительно позитивным для замещения миели-нобразующей функции повреждённых или погибших олигодендроцитов. Формирующие заместительный периферический миелин шванновские клетки постепенно, без резкого нарушения двигательной функции, замещаются оли-годендроцитами (Jasmin et al., 2000).

В проблеме миграции миелинобразующих клеток из периферической нервной системы в область травмы спинного мозга особое внимание привлекают клетки пограничной шапочки, что связано с их наиболее близким расположением к области повреждения и высоким миграционным потенциалом. Эти клетки локализуются в спинномозговых нервах и в переходной зоне входа/выхода корешков, происходят из нервного гребня и являются аналогами шванновских клеток. Они маркируют точки выхода аксонов мотонейронов из спинного мозга и блокируют миграцию их перикарионов (Vermeren et al., 2003). При трансплантации клеток пограничной шапочки в демиелинизиро-ванный спинной мозг, они пролиферируют и дифференцируются. Эти клетки характеризуются способностью перемещаться в область демиелинизации, причем, более активно, чем типичные шванновские клетки, что, по-

видимому, связано с их более тесным взаимодействием с астроцитами и способностью экспрессировать полисиалированную молекулу адгезии нейронов (Zujovic et al., 2010). В ответ на миелинизацию аксонов в мозге предшественники клеток пограничной шапочки формируют миелинобразующие шван-новские клетки, а также при контакте с аксонами и астроцитами способны давать начало миелинобразующим олигодендроцитам (Zujovic et al., 2010).

Выявление функционирующих шванновских клеток в области демие-линизации при травме спинного мозга имеет большое значение для оценки эффективности его регенерации при генно-клеточной терапии и, в частности, при доставке в область повреждения клонированных генов НТФ, что поддерживает выживание и дифференцировку не только клеток мозга, но и эндогенных мигрантов.

Несмотря на дискуссионность вопроса, важным фактором посттравматической регенерации спинного мозга является реваскуляризация, которую рассматривают как регенеративную реакцию повреждённой ткани в ответ на гипоксию и ишемию. Угнетение экспрессии ангиогенных факторов [VEGF, плацентарного фактора роста (PLGF), тромбоцитарного фактора роста ВВ (PDGF-BB), ангиогенина 1 (Angl)] препятствует восстановлению повреждённых сосудов и рост новых. Адекватное соотношение регулирующих ан-гиогенез и антиангиогенных факторов способствует ремоделированию сосудов после травмы спинного мозга и стимулирует реваскуляризацию. Установлено, что повреждение мозга приводит к активации гипоксия-индуцируемым фактором (HIF«) многочисленных эффекторов, в том числе VEGF, которые способствуют не только восстановлению сосудов, но и участвуют в нейрогенезе (Madri, 2009).

Таким образом, при травме спинного мозга развивается комплекс патологических реакций, которые проявляются в два этапа и обозначаются как первичное и вторичное повреждение. Наиболее серьёзное вторичное повреждение включает воспалительный ответ, выраженную гибель нейральных кле-

ток, деструкцию и дезинтеграцию ткани серого и белого вещества, в том числе за счёт формирования патологических полостей, демиелинизацию и дегенерацию нервных волокон и как результат нарушение двигательной и чувствительной функции. Вследствие этого вторичное повреждение является объектом наиболее пристального внимания исследователей в области изыскании новых способов и средств терапии. Разрабатываемые в этом направлении новые терапевтические стратегии направлены на сдерживание развития вышеуказанных патологических реакций вторичного повреждения. При экспериментальной травме спинного мозга эффективность инновационных терапевтических подходов оценивают по выраженности проявления этих же патологических реакций. В нашей работе эффективность однократной локальной доставки в область дозированной контузиионной травмы спинного мозга крысы терапевтических генов VEGF и FGF2 на клеточных носителях мы оценивали по тем же значимым и общепринятым критериям, а именно по степени восстановления двигательной функции, сохранности серого и белого вещества, площади патологических полостей, количества миелиновых волокон, клеток астроцитарной глии, периваскулярных и шванновских клеток.

Экспериментальные модели травмы спинного мозга широко используют для расшифровки патофизиологических механизмов, а также для оценки эффективности различных терапевтических подходов. В настоящее время применяют следующие экспериментальные модели травматического повреждения спинпого мозга: контузия, компрессия, ишемия, полная или частичная перерезка. Среди них наиболее адекватной клинической картине является модель дозированной контузионной травмы спинного мозга крысы. Она воспроизводится с помощью стандартного груза, падающего с определённой высоты на открытый спинной мозг после ламинэктомии (weight-drop) (Gruner, 1992). В результате контузии происходит деструкция нервной ткани с развитием процессов, описанных раннее и и сходных с реакциями повреж-

дениями, наблюдаемыми у человека, включая глиоз, демиелинизацию и формирование кист.

Таким образом, доклинические исследования различных методов терапии при травме спинного мозга предполагают подбор наиболее адекватной и соответствующей клинике модели. На сегодняшний день этим критериям отвечает дозированная контузионная травма спинного мозга, которая имитирует анатомические, биохимические и функциональные изменения, наблюдаемые при травме спинного мозга у человека.

1.2. Концепция нейротрофических факторов в приложении к регенерации спинного мозга

Под НТФ понимают большую группу полипептидов, участвующих в контроле дифференцировки, регуляции роста и созревания нейральных клеток в центральной и периферической нервной системе. Согласно определению, НТФ должны удовлетворять минимально двум критериям: поддерживать выживание нейронов и стимулировать образование и удлинение их отростков. Обладая этими свойствами, НТФ участвуют в процессах регенерации, нейрональной и синаптической пластичности (Lu, Tuszynski, 2008).

В область посттравматических и постишемических дефектов нервной ткани НТФ доставляют, используя различные методы и подходы. Это введение фактора с применением осмотической минипомпы, доставка генов НТФ при помощи клеточных носителей и прямая генная терапия (Jones et al., 2001; Blits, Bunge, 2006; Hagg, 2007). Каждый из этих методов имеет свои преимущества и недостатки. Введение НТФ в область травмы спинного мозга сдерживает процесс вторичного повреждения и способствует восстановлению нервных связей (Thuret et al., 2006). При травме спинного мозга прямое их введение в желудочки мозга, интратекально или местно, улучшает выживание и регенерацию повреждённых нейронов (Hendriks et al., 2004). Однако при непосредственной доставке НТФ в область повреждения эффект воздействия очень кратковременный, вследствие быстрого их расщепления протеа-

зами. К недостаткам метода непосредственной доставки НТФ в ткань-мишень следует также отнести необходимость применения больших доз и связанную с этим высокую иммуногенность, а также длительное присутствие in vivo минипомпы. В ходе клинических испытаний с системной доставкой НТФ и факторов роста при различных заболеваниях были выявлены неприемлемые побочные эффекты и низкая эффективность (Apfel, 2002). Эти осложнения стимулировали поиск других методов подведения НТФ к клеткам-мишеням. Среди них наиболее эффективной оказалась доставка в повреждённую нервную ткань генов НТФ.

При спинальной травме с целью стимулирования регенерации известно применение следующих НТФ: мозговой нейротрофический фактор (BDNF), нейротрофин 3 (NT3), глиальный нейротрофический фактор (GDNF), VEGF, FGF2 (Jones et al., 2001; Awad et al., 2013). При применении каждого из них в отдельности получают определённые положительные результаты, однако поиск факторов или их комбинации, обеспечивающих наиболее существенное улучшение структуры и функции спинного мозга, продолжается. Нейротрофин 3 (Neurotrophin 3) молекула, регулирующая нейрогенез, регенерацию аксонов (Xu et al., 1995; Zhang et al., 2010) и процесс формирования миелина олигодендроцитами (Kumar et al., 1998). NT3 поддерживает выживание и пролиферацию предшественников олигодендроцитов in vitro (Barres, Raff, 1994; Yan et al., 2000; Franklin et al., 2001) и in vivo (Barres et al., 1994). Миелинизация, осуществляемая олигодендроцитами, усиливается под влиянием NT3 как в культуре клеток, так и при повреждении ЦНС (McTigue et al., 1998; Yan et al., 2000; Jean et al., 2003). NT3, выступая в роли хемоаттрактан-та, обеспечивает в спинном мозге восстановление «правильных» синаптиче-ских контактов регенерирующих чувствительных аксонов со своими мишенями (Alto et al., 2009). Наряду с другими НТФ, факторами роста и цитоки-нами [PDGF, инсулиноподобный фактор роста (IGF), FGF, лейкоз ингиби-рующий фактор (LIF)], NT3 продуцируется шванновскими клетками in vitro

и, действуя по аутокринному механизму, поддерживает выживание клеток ЦНС (Meier et al, 1999; Woodhoo, Sommer, 2008).

Мозговой нейротрофический фактор (Brain Derived Neurotrophic Factor), является представителем семейства нейротрофинов (действующих через рецепторы, связанные с тирозинкиназами TrkB - англ. tirosin-receptor-kinase В), поддерживает выживание 50% от всей популяции мотонейронов, причём, в большей мере, чем NT3.

Трансплантация генетически модифицированных фибробластов с трансгеном BDNF к 3 неделе после травмы спинного мозга способствовала значительному увеличению количества шванновских клеток в области повреждения (Blesch, Tuszynski, 2007). Последующее, начиная с 6 недели после травмы, подавление экспрессии BDNF не влияло на содержание шванновских клеток, которые, по-видимому, уже сформировали контакты с аксонами и не реагировали на нейротрофические сигналы. Возможность формирования подобных контактов в области повреждения спинного мозга и участие шванновских клеток в процессе миелинизации были показаны ранее (Weidner et al., 1999; Blesch et al., 2004).

В эксперименте доставка гена BDNF при помощи аденовирусов в обе культи спинного мозга сразу после его перерезки способствовало регенерации аксонов руброспинального тракта и значительному восстановлению двигательной функции (Koda et al., 2004). В случае доставки аналогичного вируса с геном BDNF в грудино-сосцевидную мышцу сразу после компрессионной травмы спинного мозга на уровне С4 с последующим ретроградным транспортом рекомбинантного вектора в спинной мозг показано снижение гибели нейронов и олигодендроцитов (Nakajima et al., 2007). Трансплантация нетрансфицированных нейральных предшественников в сочетании с инъекцией лентивирусов с геном BDNF через неделю после гемисекции спинного мозга и введения клеток приводила к увеличению количества и поддержанию роста аксонов (Bonner et al., 2010). Инъекция BDNF совместно с клетками

крови пуповины человека в область травмы спинного мозга улучшала функциональные показатели и способствовала регенерации аксонов (Kuh et al., 2005). Одновременную доставку генов NT3 и BDNF при помощи плазмидно-го вектора на клеточной моделе травмы спинного мозга исследовал Wang et al. (2012). Проведённое исследование выявило противоапоптозный эффект данной комбинации трансгенов.

Глиальный нейротрофический фактор (Glial-cell-line-Derived Neurotrophic Factor) входит в состав семейства трансформирующего фактора роста бета (TGF/3, transforming growth factor /3) и является продуктом генов из группы, связанных с ростом (growth associated genes). GDNF продуцируется астроци-тами и шванновскими клетками, обладает выраженным нейропротекторным действием на дофаминергические нейроны и мотонейроны спинного мозга (Cheng et al., 2002), стимулирует рост аксонов различных нейронов, их мие-линизацию, уменьшает апоптоз и дегенерацию ткани (Iannotti et al., 2003; Mills et al., 2007). Мишенями этого НТФ являются сами шванновские клетки, GDNF поддерживает их миграцию и стимулирует миелинизацию (Iwase et al., 2005; Zhang et al., 2009). При экспериментальной травме спинного мозга введение в область повреждения GDNF оказывает нейропротекторное действие, поддерживает экспрессию белков нейрофиламентов, пептида, связанного с кальцитониновым геном (CGRP) и связанного с ростом аксонов белка 43 (GAP-43) (Cheng et al., 2002). При экспериментальной травме спинного мозга не только локальное, но также и системное применение GDNF сдерживает развитие патологических проявлений (Као et al., 2008). При этом GDNF способствует увеличению количества и калибра регенерирующих аксонов, а также стимулирует рост аксонов в культуре нейронов спинального ганглия (Zhang et al., 2009).

Инъекция в область травмы спинного мозга липосом, содержащих ген GDNF, увеличивает количество выживших мотонейронов и улучшает показатели восстановления двигательной функции (Lu et al., 2004). Улучшение

функциональных и структурных показателей показано при локальной доставке гена GDNF в составе плазмидного вектора при помощи наночастиц биорастворимого полимера (Wang et al., 2008) или в комплексе с антителами против рецепторов НТФ (Barati et al., 2006). Инъекция в область травматического повреждения спинного мозга генетической конструкции на основе вируса простого герпеса с геном GDNF улучшает восстановление функции (Natsume et al., 2003). Локальная доставка в область травмы спинного мозга того же гена, но при помощи аденовирусного вектора предотвращает ретроградную атрофию кортикоспинальных мотонейронов и стимулирует восстановление двигательной функции (Tang et al., 2004).

Сосудистый эндотелиальный фактор роста (Vascular Endothelial Growth Factor) обоснованно считают одним из наиболее перспективных НТФ. Связываясь с рецептором Flk-1 (англ. fetal liver kinase receptor 1), VEGF, проявляя свойства типичного НТФ, поддерживает выживание двигательных (Isla-mov et al., 2004) и чувствительных (Sondell et al., 1999) нейронов, стимулирует нейрогенез и рост аксонов (Mackenzie, MacRuhrberg, 2012).

Доставка в область травмы спинного мозга VEGF при помощи трансфи-цированных нейральных стволовых клеток усиливает пролиферацию глиаль-ных предшественников, неоваскуляризацию и сохранение ткани (Kim et al., 2009). VEGF стимулирует пролиферацию астроцитов (Rosenstein et al., 1998), нейральных стволовых (Jin et al., 2009) и шванновских (Sondell et al., 2000) клеток. Введение в область травмы спинного мозга рекомбинантного VEGF при помощи аденовирусного вектора сдерживает апоптоз нейронов и снижает выраженность отека в области повреждения (Qiang et al., 2012). Показано поддерживающее влияние VEGF на регенерацию аксонов кортикоспинально-го тракта (Facchiano et al., 2002). Однако прямая инъекция VEGF в травмированный спинной мозг приводит к увеличению области повреждения и замедлению процесса восстановления функции (Benton, Whittemore, 2003). Применение VEGF в гелевом носителе на основе экстракта белков базальной мем-

браны (Matrigel) в условиях экспериментальной травмы спинного мозга оказывает противоположное действие, т.е. существенно поддерживает васкуля-ризацию и рост аксонов (Facchiano et al., 2002). Исследование с использованием адено-ассоциированного вируса в качестве вектора для доставки гена VEGF в эпицентр травмы спинного мозга сразу после повреждения указывает на уменьшение области повреждения и улучшение двигательной функции (Herrera et al., 2010). Совместное введение VEGF и PDGF в область гемисек-ции спинного мозга способствовало уменьшению области повреждения, значительному сокращению глиоза, окружающего зону травмы, и количества макрофагов (button et al., 2012). Однако данная терапия травмы спинного мозга не оказывала существенное влияние на плотность распределения кровеносных сосудов. Противоречивость этих данных определяет актуальность работ по анализу эффектов VEGF как потенциального стимулятора регенерации в ЦНС. VEGF был изначально известен как исключительно ангиогенный фактор. Его выраженное стимулирующее влияние на неоваскуляризацию представляется важным для устранения ишемии и нормализации кровоснабжения при нейротравме.

В пользу перспективности применения VEGF для стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга свидетельствуют положительные результаты регенерации периферического нерва при прямом введении гена VEGF на модели экспериментальной диабетической невропатии (Schratzberger et al., 2001) и перерезки седалищного нерва (Fu et al., 2007; Pereira Lopes et al., 2013).

Фактор роста фибробластов 2 (Fibroblast Growth Factor 2) - входит в состав ключевого семейства морфогенов, которые контролируют индукцию и спецификацию тканей в эмбриогенезе. FGF2, являясь фактором роста, обладает выраженным нейротрофическим действием и рассматривается как обязательный компонент в средах для направленной дифференцировки нейраль-Ных клеток in vitro. В сформированном спинном мозге FGF2 необходим для

пролиферации нейральных предшественников, что показано in vivo и in vitro (Weiss et al., 1996; Johansson et al., 1999; Kojima, Tator, 2002; Martens et al., 2002). FGF2 рассматривается в качестве узловой молекулы в патофизиологии травмы спинного мозга. Показано, что в области повреждения спинного мозга количество FGF2+-KneTOK возрастает в 15 раз (Xu et al., 2006). Введение FGF2 в комбинации с трансплантацией мезенхимных стволовых клеток человека улучшает функциональные показатели посттравматической регенерации спинного мозга (Kim et al., 2006). Инъекции в область травмы спинного мозга FGF2 совместно с эпидермальным фактором роста (EGF) уменьшает объем патологических полостей и способствует сохранности белого вещества (Jimenez Hamann et al., 2005), а интратекальное введение этих факторов улучшает восстановление функции (Kojima, Tator, 2002). Применение кондуита из хитозана с гидрогелевым матриксом на основе гепарина-фибрина-фибронектина, содержащим FGF2, на модели преодоления диастаза седалищного нерва крысы существенно улучшает показатели регенерации по сравнению с контролем (фосфатно-солевой буфер вместо гидрогеля с FGF2) (Han et al., 2010). Шванновские клетки способны вырабатывать FGF2, экспрессия которого в них возрастает при повреждении периферических нервных структур (Santos-Silva et al., 2007). FGF2 индуцирует фосфорилирование молекулы EphrinB (Bruckner et al., 1997; Chong et al., 2000), представителя семейства эфринов, которые контролируют направленный рост аксонов в развивающемся и регенерирующем спинном мозге с последующей активацией ГТФазы Rho и перестройкой цитоскелета в аксоне. С другой стороны, при травме спинного мозга FGF2 усиливает экспрессию молекулы адгезии CHL1, близкого гомолога молекулы адгезии L1 из суперсемейства иммуноглобулинов. В свою очередь CHL1 поддерживает выживание нейронов и аксоноге-нез, а также экспрессию GFAP в астроцитах (Jakovcevski et al., 2007; Grumbles et al., 2009; Jordán et al., 2009), но сдерживает прорастание нервных волокон через глиальный рубец. Молекулы FGF2, взаимодействуя с рецепторами

на поверхности астроцитов, служат сигналами для модуляции фенотипа, что проявляется в их пролиферации (астроцитозе), формировании барьера для регенерирующих аксонов и мигрирующих клеток, увеличении экспрессии GFAP и хондроитинсульфат протеогликана, основного компонента глиально-го рубца (Fahmy, Moftah, 2010). Таким образом, при травме спинного мозга FGF2 может оказывать позитивное и негативное влияние на процесс нейро-регенерации.

Имеются данные о синергизме действия VEGF и FGF2 по восстановлению целостности сосудистого русла (Ley et al., 2004). В область травмы спинного мозга одновременную доставку обоих факторов при помощи биорастворимых синтетических микрочастиц осуществили De Laporte et al. (2011). Исследование показало, что локальная доставка VEGF и FGF2 в область травмы спинного мозга способствует увеличению количества кровеносных сосудов и поддержанию роста аксонов. На моделях перерезки и тубу-ляции седалищного нерва крысы при помощи силиконовой трубки, заполненной физраствором, а также аутонервной вставки изучена эффективность регенерации в условиях однократного введения плазмиды с генами VEGF и FGF2 в центральный и периферический отрезки в непосредственной близости от линий швов (Масгутов и др., 2011; Николаев и др., 2012). В данных условиях показано улучшение функциональных показателей, а также увеличение количества регенерирующих миелиновых волокон в периферическом отрезке нерва к 30 суткам эксперимента.

Таким образом, среди многих известных молекул стимуляторов нейро-регенерации наибольшее значение имеют НТФ, которые замедляют развитие нейродегенеративных проявлений, активно поддерживают жизнеспособность нейральных клеток, стимулируют регенерацию нервных волокон и восстановление нервных связей. Из НТФ при экспериментальной травме спинного мозга наиболее изучены нейротрофины, которые действуют на клетки-мишени через рецепторы, связанные с тирозинкиназой из семейства trk. Для

преодоления последствий нейротравмы представляется актуальным исследование эффективности применения других НТФ, не принадлежащих к семейству нейротрофинов. С учётом новых данных о том, что некоторые НТФ одновременно проявляют свойства ангиогенных факторов, стимулирующих не-оваскуляризацию нервной ткани, например, такие как УЕОБ или РОР2, их выбор при травме спинного мозга представляется обоснованным, а исследование эффективности их применения актуальным. С другой стороны, в патологический процесс при нейротравме вовлечено большое количество клеток, локализованных в области повреждения. Они принадлежат к разным клеточным типам и отвечают на действие определённых НТФ. Логично предположить, что при травме спинного мозга одновременное применение в терапевтических целях не одного, а нескольких НТФ, действующих на свои клетки-мишени, будет способствовать более полному восстановлению структуры и функции. Как видно из вышеизложенного, такой опыт уже имеется, но работ в этом направлении крайне мало и касаются они в основном тех же нейротрофинов.

1.3. Клеточная терапия при травме спинного мозга

Одним из подходов для предотвращения последствий вторичного повреждения и поддержания регенерации нервных волокон при травме спинного мозга является клеточная терапия. Она направлена на замещение погибших нейронов и глиальных клеток, восстановление тканевого матрикса с направляющими путями для роста аксонов, поддержание и ремиелинизацию аксонов, трофическое обеспечение регенерации повреждённых и жизнеспособных нейронов, стимулирование пролиферации собственных стволовых клеток спинного мозга.

В качестве критериев адекватности клеточной терапии выделяют: принципиальную возможность нейральной дифференцировки, экспрессию фенотипа, обеспечивающего продукцию в новых условиях микроокружения в ткани реципиента важных для регенерации молекул, возможность экспан-

сии ех у1уо для получения достаточного количества клеток. Важной является способность трансплантированных клеток к выраженной миграции для поддержания выживания нейронов и роста аксонов реципиента в наибольшем удалении от места введения в мозг и длительному выживанию в ткани реципиента. Онкогенная и инфекционная безопасность, малоинвазивность процедуры забора материала также имеют большое значение для клеточной терапии в связи с прямой направленностью исследований на внедрение в клинику.

Одним из значимых критериев отбора способа трансплантации является минимальная инвазивность данной процедуры. Непосредственное введение клеток в область повреждения спинного мозга получило наибольшее распространение в эксперименте. Однако из-за высокой инвазивности, дополнительного травмирования и необходимости осуществления второго доступа к спинному мозгу при введении клеток не тотчас после травмы, а спустя некоторое время (оптимальный временной интервал составляет 7-14 суток, когда снижается выраженность воспалительного ответа), эта процедура менее предпочтительна, по сравнению с процедурой трансплантации клеток в кровь или интратекально. При этом вводимые клетки, преимущественно ме-зенхимного происхождения, направленно мигрируют в область повреждения, где осуществляется их хоминг (Бега\¥а е1 а1., 2005; Ьипс1Ье^ е1 а1., 2009).

Оценке результатов экспериментальной трансплантации клеток при травме спинного мозга посвящено большое количество работ (ЕйекИагроиг оХ а1., 2008; Ьоиго & а1., 2008; Хи, ОтГег, 2009; Ихн^Ы & а1., 2010). Результаты свидетельствуют о частичном восстановлении функции с недостаточной выраженностью положительного эффекта. При экспериментальной травме спинного мозга результаты трансплантации стволовых и прогениторных клеток исследуют на различных моделях травматического повреждения (контузия, полная или частичная перерезка, компрессия, локальное повреждение определённых трактов и др.), при повреждении различных отделов спинного

мозга (шейные, нижние грудные и др.), применяя различные методики введения клеток (в область повреждения в разных модификациях, в кровоток, интратекально, в составе биодеградируемых платформ и т.д.). Именно поэтому, на сегодняшний день не представляется возможным выделить определённый клеточный тип, при трансплантации клеток которого при травме спинного мозга происходит наиболее эффективное поддержание и стимулирование процесса нейрорегенерации.

Эмбриональные стволовые клетки. Эти клетки получают методом имму-нохирургии из внутренней клеточной массы бластоцисты. Полученные клетки применяют для направленной дифференцировки в нейральные предшественники, которые затем трансплантируют для стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга (Hendricks et al., 2006). Трансплантация эмбриональных стволовых клеток, трансформированных ретиноевой кислотой до стадии мультипотентных нейральных прогениторных клеток, выполнена на модели контузии спинного мозга крысы. Получены данные о ре-миелинизации аксонов и восстановлении проводимости по супраспинальным трактам (McDonald et al., 2004). Установлено, что эмбриональные стволовые клетки человека инъецированные в цереброспинальную жидкость парализованных крыс, инфицированных вирусом Sindbis, способны стимулировать восстановление двигательной функции (Kerr et al., 2003).

Компания Geron (USA), основываясь на данных более чем 24 доклинических исследований, в которых в общей сложности было задействовано до 2000 животных с травмой спинного мозга и трансплантировано более 5 миллиардов клеток, в 2009 г. приступила к получению эмбриональных стволовых клеток для первого этапа клинических испытаний у больных с параличом вследствие травмы спинного мозга. В рамках этого проекта планировалось через 7-14 суток после травмы ввести в область повреждения предшественники олигодендроцитов человека, полученные путём направленной дифференцировки из эмбриональных стволовых клеток. Ожидается, что эти

клетки будут поддерживать регенерацию нейронов, восстанавливать миели-новую оболочку и проводимость в повреждённых аксонах (Keirstead et al., 2005).

Нейральные стволовые и глия-рестрицированные предшественники при

экспериментальных трансплантациях при травме спинного мозга исследованы достаточно детально (Hill et al., 2004; Сао et al., 2005; Cummings et al., 2005; Mitsui et al., 2005). Трансплантируемые нейральные предшественники чаще образуют глию (Vroemen et al., 2003; Pfeifer et al., 2004). Это показано в ряде работ с использованием в качестве маркёров белков миелина и меченых трансплантируемых клеток различных типов. Трансплантация предшественников олигодендроцитов человека, полученных из эмбриональной стволовой клетки, в область контузионной травмы спинного мозга крысы улучшала восстановление двигательной функции (Keirstead et al., 2005). При этом в спинном мозге реципиента предшественники олигодендроцитов выживают и дифференцируются в зрелые клетки, которые участвуют в ремиелинизации. Восстановление миелиновой оболочки было достаточно обширным и наблюдалось во всем объёме белого вещества. Трансплантируемые клетки ремие-линизировали не менее 55% сохранённых аксонов. При трансплантации предшественников олигодендроцитов представляется достаточно вероятной возможность стимулирования процесса ремиелинизации олигодендроцитами реципиента (Kierstead et al., 2005).

Трансплантация при травме спинного мозга глия-рестрицированных предшественников модифицирует структуру ткани в области повреждения и приводит к снижению выраженности глиального рубца с уменьшением экспрессии протеогликанов, ингибирующих рост аксонов (Hill et al., 2004). При этом трансплантированные клетки обнаружены в прямом контакте с аксонами кортикоспинального тракта, что рассматривается авторами как достаточно обнадёживающий результат по применению данных предшественников с

целью стимулирования процесса ремиелинизации при травме спинного мозга.

Полученные в результате направленной дифференцировки из эмбриональной стволовой клетки предшественники нейронов человека, при трансплантации в область травмы спинного мозга в шейном отделе крысы выживали, успешно интегрировались в ткань передних рогов и дифференцировались, но только в участке, расположенном дистальнее области повреждения (Rossi et al., 2010). Вблизи эпицентра травмы трансплантируемые клетки проявляли признаки ранних предшественников и не вступали в дифференци-ровку.

В последнее время особое внимание специалистов в области клеточной терапии привлекают нейральные предшественники из клеток зачатка зуба. Стволовые клетки мягких тканей зуба происходят из нервного гребня. Клетки из пульпы (Gronthos et al., 2002) и зубного мешочка (Morsczeck et al., 2005) третьего моляра (зуба мудрости) человека в постнатальном периоде проявляют свойства стволовой мезенхимной клетки, сохраняют способность к самообновлению и дифференцировке в разные клеточные типы in vitro (Kerkis et al., 2008; Yao et al., 2008). Клетки пульпы зуба секретируют НТФ (NGF, BDNF, GDNF) и поддерживают выживание чувствительных нейронов in vitro и двигательных нейронов in vivo (Nosrat et al., 2001, 2004). Доступность и простота получения нейральных предшественников из клеток зубного зачатка, отсутствие законодательных и этических противоречий позволяют рассматривать эти клетки как перспективный материал для ауто- и аллотранс-плантаций при травме спинного мозга.

Глиальные клетки обонятельных структур (Olfactory Ensheathing Cells) вырабатывают ряд НТФ и факторов роста таких как FGF1 (Key et al., 1996), FGF2 (Chuah, Teague, 1999), NGF, BDNF, GDNF (Woodhall et al., 2001) и GGF2 (Chuah et al., 2000), молекулы адгезии NCAM (Miragall et al., 1988) и LI (Kafitz, Greer, 1997), а также компоненты внеклеточного матрикса (Treloar

а1., 1996). Экспрессируя ОБ АР, ОЕСб проявляют признаки астроцитов, что объясняет их способность сопровождать регенерирующие аксоны, прорастающие через глиальный рубец (Кашоп-СиеШ, АуНа, 1998). Фенотипические характеристики астроцитов в популяции ОЕСб позволяют предполагать их более высокую степень выживания при трансплантации в мозг и более адекватное обеспечение роста аксонов (11асШсе е1 а1., 2004; Викторов и др., 2006; Лебедев и др., 2010). Дополнительным основанием для рассмотрения ОЕСб как перспективного материала для трансплантаций при травме спинного мозга послужили лёгкая доступность и малая инвазивность процедуры забора материала, а также возможность получения аутологичных клеток. Среди недостатков ОЕСб - более низкая способность к миелинизации, чем у шваннов-ских клеток (1л е1 а1., 2007) и, как выяснилось, недостаточно высокий миграционный потенциал (Ьи е1 а1., 2006).

По механизму позитивного влияния трансплантаций ОЕСб на нейроре-генерацию, который в сущности остаётся неясным, существует представление о проявлении ОЕСб свойств иммунокомпетентных клеток и их способности модулировать выраженность процесса воспаления и вторичного повреждения в области травмы спинного мозга (Соте е1 а1., 2010; КаНпсИс е1 а1., 2010). ОЕСб человека обладают способностью миелинизировать повреждённые аксоны спинного мозга крысы и частично восстанавливать двигательную и чувствительную функции (Викторов и др., 2007). Показанное в исследованиях с трансплантацией ОЕСб улучшение восстановления функции при травме спинного мозга у грызунов, послужило основанием для проведения клинических испытаний в некоторых странах (Яаскке е1 а1., 2008).

Однако на сегодняшний день остаётся спорным вопрос об участии ОЕСб в процессах ремиелинизации при травме спинного мозга. На этот счёт существуют две точки зрения, одна из которых, что миелинизацию регенерирующих аксонов спинного мозга осуществляют трансплантированные ОЕСб.

Другая, что этот процесс происходит только с участием шванновских клеток (Викторов и др., 2006).

Шванновские клетки. При повреждении периферического нерва шваннов-ские клетки интенсивно пролиферируют и активно поддерживают все последующие этапы его регенерации (Johnson et al., 1988). Из всех известных клеточных типов именно шванновские клетки, активно продуцируя НТФ, молекулы внеклеточного матрикса, адгезии и другие молекулы, связанные с ростом аксонов (Frostick et al., 1998; Boyd, Gordon, 2003), наиболее активно стимулируют процессы нейрорегенерации. Шванновские клетки способны продуцировать небольшие количества НТФ, включая NGF, BDNF и NT3 (Heumann et al., 1987; Funakoshi et al., 1993; Naveilhan et al., 1997), молекулы внеклеточного матрикса и адгезии, но не вырабатывают, как олигодендроци-ты, ингибиторов роста аксонов. Эти свойства шванновских клеток делают их привлекательными для трансплантации в мозг с целью стимулирования ре-миелинизации и восстановления нервных связей.

Экспериментально установлено, что шванновские клетки могут участвовать в ремиелинизации аксонов ЦНС (Honmou et al., 1996). На модели контузии шейного отдела спинного мозга установлено, что трансплантация шванновских клеток поддерживает рост аксонов не только в восходящих чувствительных трактах, но и регенерацию аксонов в протяжённых нисходящих двигательных путях (Schaal et al., 2007). Трансплантация в область травмы спинного мозга крысы полученных из мультипотентных стволовых клеток подкожного жира шванновских клеток приводит к формированию ими миелиновой оболочки, характерной для периферических нервных проводников (Chi et al., 2010). В этой же работе установлено, что индуцированные шванновские клетки также как и эндогенные (собственные), экспресси-руют те же НТФ.

Трансплантация аутологичных шванновских клеток выявила высокую эффективность ремиелинизации аксонов при травме спинного мозга у обезь-

яны (Bachelin et al., 2005). При этом более половины всех ремиелинизиро-ванных волокон образованны трансплантируемыми шванновскими клетками, а оставшаяся часть - собственными олигодендроцитами. К сожалению, трансплантируемые при травме спинного мозга в очаг повреждения шван-новские клетки выживают недолго, не более двух недель. Трансплантация шванновских клеток, меченых при помощи генетического маркёра, кислой фосфатазы из плаценты человека, позволила сделать ряд выводов, имеющих важное практическое значение для клиники (Hill et al., 2006). Во-первых, трансплантируемые шванновские клетки гибнут как путем апоптоза, так и некроза. Во-вторых, проведение процедуры трансплантации не сразу после травмы спинного мозга, а спустя 7 суток, увеличивает выживание трансплантируемых клеток. В-третьих, применение иммуносупрессоров (циклоспорин) увеличивает количество выживающих трансплантируемых шванновских клеток. И, наконец, в-четвертых, трансплантация шванновских клеток приводит к выраженной инфильтрации области повреждения собственными р75-иммунопозитивными клетками, что свидетельствует о миграции в область травмы спинного мозга собственных шванновских клеток. Вторая и третья позиция подтверждены экспериментально на различных моделях травмы спинного мозга с использованием трансплантируемых клеток разных типов и стали уже общим местом в клеточной трансплантации с целью стимулирования нейрорегенерации.

Миелинобразующие шванновские клетки наиболее перспективны для ремиелинизации в ЦНС. Однако их интеграция в ткань мозга ингибируется астроцитами, что может быть преодолено путём усиления экспрессии поли-сиалированной формы молекулы адгезии нейронов (PSA-NCAM). Для достижения этой цели проведена трансфекция шванновских клеток ретровирус-ным вектором, кодирующим сиалил-трансферазу X (Papastefanaki et al., 2007). Трансплантация этих клеток при травме спинного мозга стимулирова-

ла спраутинг серотонинергических аксонов, участвующих в реализации двигательной функции.

Недостатком трансплантации шванновских клеток в ЦНС является то, что они не воспроизводят полностью паттерн миелинизации, характерный для олигодендроцитов. При ремиелинизации с участием шванновских клеток плотность распределения аксонов оказывается более низкой, чем при миелинизации олигодендроцитами, которые поддерживают оптимальный баланс между максимальной скоростью проведения импульсов и минимальным объёмом пространства, в котором сосредоточены эти волокна (Kocsis et al., 2002).

Активированные макрофаги. Трансплантация этих клеток обеспечивает частичное восстановление двигательных функций у крыс с полной перерезкой спинного мозга (Lazarov-Spiegler et al., 1996; Rapalino et al., 1998). При трансплантации активированных макрофагов 8 пациентам с травмой спинного мозга на уровне грудных (7) и поясничных (1) сегментов (степень повреждения «А» по тесту ASIA) у 3-х пациентов наблюдали улучшение («С» по тесту ASIA) (Bomstein et al., 2003; Lammertse et al., 2007). Полученные результаты позволили биофармацевтической компании Proneuron Biotechnologies (USA) коммерциализировать технологию получения аутоло-гичных активированных макрофагов для лечения больных с травмой спинного мозга в остром периоде.

Микроглия-подобные клетки. Критериям онкогенной безопасности и минимальной инвазивности в наибольшей мере удовлетворяют клетки микро-глии. В отличие от макроглии, из микроглии не развиваются злокачественные новообразования (Hartmann, von Deimling, 2009). Для клеток микроглии показана активация при инфекции, ишемии и нейродегенеративных заболеваниях, способность мигрировать в область повреждения и экспрессировать цитокины, иммуномодуляторы и нейротрофины (Ekdahl et al., 2009). Из эмбриональной стволовой клетки путем направленной дифференцировки полу-

чены микроглия-подобные клетки, экспрессирующие маркёры типичных терминально дифференцированных клеток микроглии и проявляющие их функциональные свойства (ТБисЫуа е1 а1., 2005). При введении в кровоток клетки способны мигрировать из сосудистого русла в ткань головного и спинного мозга, но не в периферические органы (ТзисЫуа е1 а1., 2005). Вышеназванные свойства клеток микроглии указывают на перспективность их использования в качестве нового источника для трансплантации при повреждении ЦНС. Несмотря на эти позитивные свойства, практически отсутствуют сведения о применении микроглии для трансплантации с целью стимулирования регенерации при травме спинного мозга.

Микроглия-подобные клетки, полученные из эмбриональных стволовых клеток мыши, при аллотрансплантации способны мигрировать из периферической крови в область латеральной гемисекции спинного мозга мыши, где выживают в течение не менее 28 суток (Масгутова и др., 2009). Ал-лотрансплантация микроглия-подобных клеток стимулирует посттравматическую регенерацию спинного мозга, что проявляется в улучшении двигательной функции, уменьшении области повреждения и сдерживании посттравматического апоптоза (Масгутова, 2010).

Мезенхимные клетки в наибольшей мере соответствуют критериям минимальной инвазивности при клеточной терапии, т.к. при введении в кровь эти клетки имеют наибольшие шансы достичь эпицентра травмы (хоминг) и интегрироваться в повреждённую ткань. Из мезенхимных клеток в условиях экспериментальной трансплантации при травме спинного мозга исследуют стволовые мезенхимные клетки, стволовые кроветворные клетки, стромаль-ные клетки костного мозга, клетки крови пуповины, активированные макрофаги и микроглию.

Полученные позитивные результаты экспериментов по стимулирующему влиянию мезенхимных клеток на посттравматическую регенерацию спинного мозга позволили приступить к клиническим испытаниям

(Karamouzian et al., 2012). В качестве источника мезенхимных клеток был выбран костный мозг, который содержит несколько типов стволовых клеток для ряда клеточных типов, участвующих в процессе восстановления повреждённой нервной ткани.

Полученные результаты с трансплантацией клеток костного мозга при травме спинного мозга свидетельствуют о стимулирующем влиянии на рост аксонов супраспинальных трактов и о частичном восстановлении двигательных функций (Hofstetter et al., 2002; Jendelova et al., 2004; Zurita, Vaquero, 2004; Bai et al., 2009). Один из возможных механизмов стимулирующего влияния стромальных клеток костного мозга на олигодендрогенез может быть связан с активацией Shh сигнального пути (Zhang et al., 2009). При кон-тузионной травме спинного мозга внутривенная инъекция меченных бромде-зоксиуридином стромальных клеток костного мозга приводит к их накоплению в области повреждения к 4-й неделе после введения (Khalatbary et al., 2007). При этом количество трансплантированных клеток в области травмы может увеличиваться по мере усиления выраженности геморрагических проявлений и повреждения кровеносных сосудов.

Под эгидой компании PrimeCell Therapeutics (USA) проведены клинические испытания по трансплантации аутологичных клеток костного мозга в спинном мозге 25 больных в Эквадоре. Установлено улучшение двигательной и чувствительной функции. В рамках другого клинического испытания проведена трансплантация аутологичных клеток косного мозга 9 пациентам с травмой спинного мозга (Sykova et al., 2006). У 6 пациентов внутрисосуди-стое введение клеток сопровождалось умеренным улучшением двигательных функций. Наиболее выраженное улучшение (по тесту ASIA от В до D) наблюдали у 41-летнего пациента с повреждением спинного мозга на уровне Сб.

Клетки крови пуповины представляются достаточно перспективными, что связано с их низкой иммуногенностью, доступностью, простотой и безопас-

ностью получения, способностью выдерживать длительное хранение. МККП человека интенсивно исследуют как источник стволовых и прогениторных клеток для трансплантаций при посттравматических и постишемических дефектах нервной ткани, а также для лечения нейродегенеративных заболеваний (Zhao et al., 2004; Kuh et al., 2005; Rizvanov et al., 2008). Несмотря на то, что эти клетки сопоставимы со стволовыми и прогениторными клетками костного мозга, а также близки им по фенотипическим признакам, клетки крови пуповины обладают большей пролиферативной активностью (Cardoso et al., 1993), колониобразующей способностью и способностью к самообновлению (Carow et al., 1993). Лимфоциты крови пуповинны имеют низкую алло-реактивность, поэтому риск возникновения реакции «трансплантант против хозяина», по сравнению с трансплантацией костного мозга, даже при частичной гистосовместимости донора и реципиента, минимален (Gluckman, Loca-telli, 2000; Шаманская и др., 2010).

Клетки крови пуповины характеризуются содержанием стволовых кроветворных, стволовых мезенхимных, прогениторных эндотелиальных клеток и других клеточных предшественников. На ряде экспериментальных моделей установлено, что клетки крови пуповины, вырабатывая колониестимули-рующий фактор 1, тромбопоэтин и интерлейкин-11, обладают иммуномоду-лирующим действием, а также продуцируют ряд НТФ, включая фактор роста нервов (NGF) и VEGF (Suen et al., 1994; Taguchi et al., 2004; Vendrame et al., 2004). Мезенхимные стволовые клетки из крови пуповины, трансплантированные в зону перерезки зрительного тракта у новорождённых крыс, секре-тируют НТФ, поддерживают выживание нейронов и регенерацию аксонов (Zwart et al., 2009). При моделировании инсульта у крыс трансплантация клеток крови пуповины уменьшала клинические проявления ишемии мозга (Chenet al., 2001).

При травме спинного мозга введение клеток крови пуповины человека в кровоток угнетает воспалительную реакцию, оказывает нейротрофическое

влияние, стимулирует неоваскуляризацию (Chen et al., 2008), снижает экспрессию проапоптозных генов и поддерживает выживание нейронов (Dasari et al., 2009). При трансплантации клеток крови пуповины в область травмы спинного мозга через 6 недель после повреждения отмечалось значительное улучшение по функциональному показателю (тест ВВВ) с повышением уровня цитокинов и факторов роста с нейропротекторным, ангиогенным и противовоспалительным действием (Chua et al., 2010). В исследовании Lee et al. (2011) на модели травмы спинного мозга собаки показана возможность клеток крови пуповины человека усиливать ремиелинизацию за счёт образования миелиновых оболочек периферического типа. В данном исследовании аксоны были ремиелинизированны Р0+-клетками, а функциональное восстановление сохранялось в течение трёх лет после трансплантации клеток. Трансплантация МККП человека в область контузионной травмы спинного мозга крысы через один час после операции улучшала функциональные показатели в большей степени, чем инъекция тех же клеток на 9 сутки после травмы в область желудочков мозга (Rodrigues et al., 2012).

Показано, что трансплантация МККП человека мышам с фенотипом бокового амиотрофического склероза увеличивает продолжительность жизни, причём терапевтический эффект зависит от количества инъецированных клеток (Chen, Ende 2000; Ende et al., 2000; Garbuzova-Davis et al., 2008). При внутривенном введении клетки крови пуповинны мигрируют преимущественно в область дегенерации нервной ткани, хотя могут быть обнаружены и в других органах (Garbuzova-Davis et al., 2003). Кроме того, установлено, что трансплантированные клетки крови пуповинны человека экспрессируют ней-ральные маркёры, такие как GFAP, нестин и нейрональную форму ¡б-тубулина.

Таким образом, анализ данных литературы по клеточной терапии при травме спинного мозга в целом свидетельствует о возможности улучшения результатов нейрорегенерации. В этом отношении исследованы результаты

трансплантации различных клеточных типов, но выделить наилучший из них не представляется возможным из-за различий в условиях проведения эксперимента, локализации (шейный, грудной, поясничный отделы), вида травмы (контузия, компрессия, гемисекция, полная перерезка, избирательное выключение трактов и пр.), выраженности травматического повреждения, способов культивирования и подготовки клеток для трансплантации, сроков введения после нанесения травмы (тотчас или спустя некоторое время), места введения трасплантируемых клеток (в область повреждения, интратекально или в кровь) наличия или отсутствия иммуносупрессии и многих других факторов. Складывается впечатление, что при выборе клеток, предназначенных для трансплантаций, исследователи пока руководствуются общими критериями, такими как онкогенная и инфекционная безопасность, а также малая инва-зивность процедуры забора материала, что важно в связи с прямой направленностью исследований на внедрение в клинику. Существенными недостатками трансплантаций стволовых и прогениторных клеток при травме спинного мозга являются их слабое выживание и неконтролируемая дифференци-ровка. Небольшой мировой опыт проведения клинических испытаний при нейротравме указывает на безусловную перспективность применения ауто-логичных клеток, а из них преимущественно клеток мезенхимного происхождения. С учётом вышеупомянутых общих критериев, конкретного опыта трансплантаций в эксперименте и опыта клинических испытаний для задач нашей работы по доставке терапевтических генов в область повреждения при травме спинного мозга клетки крови пуповины человека представляются наиболее приемлемыми и требуют дальнейшего углублённого исследования.

Кажется очевидным, что терапевтический эффект трансплантируемых клеток прямо пропорционален длительности их пребывания в ткани реципиента и выраженности миграционного потенциала. По этим критериям при травме спинного мозга получены недостаточные и часто противоречивые данные. Поэтому отбор клеток, предназначенных для трансплантаций при

травме спинного мозга по критериям их выживания и миграционному потенциалу в ткани реципиента, также представляется весьма актуальным.

1.4. Генетическая модификация клеток

Для лечения неврологических расстройств и стимулирования нейроре-генерации активно исследуют эффективность двух принципиально различных способов генетической модификации клеток. Это способы трансфекции при помощи вирусных и невирусных векторов. Они могут быть реализованы как in vivo, так и ex vivo. Метод in vivo (прямая генная терапия) предполагает прямую доставку генов к клеткам-мишеням и считается более простым для клинического применения. Основной недостаток этого метода - низкий уровень экспрессии трансгена в клетках нервной ткани. Метод ex vivo, предполагающий доставку терапевтических генов при помощи клеточных носителей, более дорогой и трудоемкий. Он связан с необходимостью получения аутологичных клеток, их культивирования, экспансии и генетической модификации in vitro, после чего клетки трансплантируют обратно в организм хозяина. Главные преимущества метода ex vivo - возможность генетической модификации клеток нужных типов и количественной оценки эффективности трансфекции in vitro. Достаточно перспективным считается способ доставки генов с полимерных материалов, или субстрат-опосредованная доставка, но он пока недостаточно исследован для поддержания нейрорегенерации. Вирусные векторы создают с помощью методов генной инженерии путём встраивания в геном вирусов экспрессионных конструкций, несущих один или более рекомбинантных генов. Подобные конструкции состоят из промотора, рекомбинантного гена и сигнала для полиаденилирования мРНК. Одним из наиболее эффективных и безопасных считается адено-ассоциированный вирус (Colella, Auricchio, 2010). Доставка генов при помощи вирусных векторов (аденовируса и вируса простого герпеса) в настоящее время остаётся ведущим методом направленной терапии нарушений в ЦНС. На нескольких экспериментальных моделях нейродегенеративных заболева-

ний показано улучшение функции. Вирусные векторы обладают высокой трансфекционной активностью, но не считаются полностью безопасными из-за вероятности инсерционного мутагенеза, выраженного воспалительного и иммунного ответов, а также токсичности.

Среди других недостатков вирусных векторов - отсутствие постоянной экспрессии (аденовирус), малый размер вставки трансгенной конструкции (аденовирус, рекомбинантный адено-ассоциированный вирус), кратковременная экспрессия трансгенов (герпесвирусы), трансдукция только делящихся клеток (ретровирусы), методы получения трудоемки и дороги (В1е121ГГег е1 а1., 2007). Альтернативой генно-клеточной терапии при помощи вирусных векторов является применение невирусных (плазмидных) векторов, у которых, несмотря на более низкую трансфекционную активность, вышеупомянутые недостатки либо не проявляются совсем, либо в значительно меньшей мере.

Плазмидные конструкции. Плазмиды представляют собой кольцевые двух-цепочечные молекулы, которые были первоначально обнаруженны в бактериальных клетках и придавали своим хозяевам специфические свойства, например, способность утилизировать различные химические соединения, выживать в экстремальных условиях, быть невосприимчивыми к антибиотикам и другим неблагоприятным факторам окружающей среды, вырабатывать белки, губительные для других бактерий. Современные плазмидные конструкции, применяемые в генно-клеточной терапии, представляют собой сложные многокомпонентные системы, которые могут эффективно экспрессиро-вать несколько различных терапевтических генов. Плазмидный вектор включает в себя экспрессионную кассету, точку начала репликации и ген устойчивости к антибиотикам (ген резистентности). Помимо перечисленных компонентов плазмиды могут содержать элементы, способствующие усилению экспрессии трансгена. С целью увеличения эффекта генно-клеточной терапии предлагается экспрессировать два или более терапевтических гена в со-

ставе одного плазмидного вектора, путём создание мультицистронных генетических конструкций.

Плазмидные конструкции обладают относительно большим молекулярным весом и отрицательным зарядом, что обуславливает низкоэффективный трансмембранный транспорт. Это серьёзно ограничивают непосредственное применение растворов нуклеиновых кислот (Ledley, 1996). С целью доставки плазмидных векторов в клетки-мишени применяют как физические (инъекция, электропорация, сонопорация, баллистическая трансфекция), так и химические (катионные липиды, катионные полимеры, плюроники и др.) методы.

В настоящее время одним из ключевых способов трансфекции является элетропорация клеток in vitro. Принцип данного метода основан на временном увеличении проницаемости клеточной мембраны (образование пор) для ДНК под действием электрического поля. Механизм проникновения ДНК в клетку остаётся до конца неизученным. Имеющиеся на сегодняшний день приборы для электропорации обеспечивают относительно невысокую, но стабильную эффективность трансфекции большого числа клеток, в том числе и стволовых (Jordan et al., 2008).

Таким образом, выбор метода генетической модификации клеток с целью дальнейшей терапии ими различных заболеваний имеет большое значение. От способа доставки терапевтических генов в клетки-мишени в целом зависит успех генно-клеточной терапии, предусматривающей экспрессию молекул, способных стимулировать или поддерживать повреждённую ткань. Наиболее адекватным на сегодняшний день нам представляется применение с целью генетической модификации мультицистронных генетических конструкций, трансфицируемых в клетку путем электропорации. Этот метод можно считать полностью безопасным, наиболее простым и в тоже время эффективным.

1.5. Генно-клеточная терапия при травме спинного мозга

Целью генно-клеточной терапии является коррекция возникающих дефектов в ткани, что достигается путём доставки терапевтических генов и обеспечения их экспрессии в области повреждения. Список терапевтических генов, которые исследуют с указанной целью, достаточно велик. Это гены нейропротекторов и стимуляторов регенерации нейронов и глиальных клеток, в первую очередь НТФ, противоапоптозных молекул, молекул адгезии, антагонистов естественных ингибиторов миелинизации в ЦНС и др.

Доставка в область повреждения терапевтических генов считается одним из перспективных направлений для стимулирования нейрорегенерации. В случае травмы спинного мозга это гены, продукты которых обладают ней-ропротекторным действием и оказывают противоапоптозное действие в отношении глиальных клеток и, в первую очередь, олигодендроцитов, стимулируют прикрепление растущего аксона к субстрату (молекулы адгезии), поддерживают удлинение аксона, обеспечивают предпочтительную диффе-ренцировку нейральных клеточных предшественников в направлении образования нейронов или олигодендроцитов, но не астроцитов, поддерживают миелиногенез и ремиелинизацию.

Для повышения эффективности доставки в область повреждения нервной ткани факторов, поддерживающих выживание нейронов и рост нервных волокон, активно исследуют возможности трансплантации генетически модифицированных клеток с трансфицированными ex vivo генами НТФ (BDNF, NT3, GDNF) (Taylor et al., 2006), эритропоэтина (Lee et al., 2005; Choi et al., 2007) и молекул адгезии (Chen et al., 2005). С этой целью применяют дифференцированные, стволовые, индуцированные плюрипотентные стволовые и прогениторные клетки (Челышев, Викторов, 2009; Ronaghi et al., 2010). На моделях экспериментальной травмы спинного мозга исследования эффективности доставки терапевтических при помощи клеточных носителей практически только начинается. Для стимулирования посттравматической реге-

нерации спинного мозга могут быть использованы клеточные носители, трансфицированные вирусным или плазмидным вектором. В этом разделе данные по эффектам трансплантации трансфицированных клеток при спи-нальной травме будут распределены не по критерию применения конкретного клеточного носителя, а по характеру терапевтического гена, доставляемого при помощи клеточной терапии.

Ген BDNF. Совместная трансплантация клеток спинного мозга плода с NGF и BDNF генетически модифицированными шванновскими клетками обеспечивает существенное улучшение регенерации нервных волокон на модели контузионной травмы спинного мозга (Feng et al., 2005). Трансплантация не-трансфицированных нейральных предшественников в сочетании с инъекцией лентивирусов с геном BDNF через неделю после гемисекции спинного мозга и введения клеток приводила к увеличению количества и поддержанию роста аксонов, а также обеспечивало создание градиента НТФ с выраженным направленным ростом аксонов на расстояние до 9 мм (Bonner et al., 2010). Инъекция BDNF совместно с клетками крови пуповины человека в область травмы спинного мозга улучшала функциональные показатели, способствовала регенерации аксонов (Kuh et al., 2005).

Ген NT3. Этот НТФ, доставляемый в спинной мозг путем трансплантации трансфицированных фибробластов (Arvanian et al., 2006), глия-рестрицированных предшественников (Cao et al., 2005) или шванновских клеток (Girard et al., 2005; Guo et al., 2007) стимулирует посттравматическую регенерацию. Совместная трансплантация стволовых нейральных клеток и генетически модифицированных шванновских клеток с трансгеном NT3 поддерживает регенерацию аксонов в нейронах внутреннего пирамидного слоя коры, красного ядра и ядра Кларка, а также способствует частичному восстановлению структуры и функции спинного мозга крысы после перерезки (Guo et al., 2007).

Трансдукция рекомбинантным аденовирусом клеток Сертоли, обладающих иммуносупрессорной активностью, геном ЫТЗ и их трансплантация в остром периоде травмы спинного мозга снижало воспалительный ответ, хотя экспрессия гена ЫТЗ поддерживалась только в течение трёх суток (ТпуесИ & а1., 2006). При этом трансплантируемые клетки Сертоли выживают не менее 42 суток. Положительные результаты были получены при совместной трансплантации в полностью перерезанный спинной мозг крысы стволовых нейральных клеток и трансдуцированных рекомбинантным аденовирусом с геном ЫТЗ шванновских клеток (вио е1 а1., 2007).

Наиболее наглядно позитивный эффект трансплантации модифицированных генами НТФ ОЕСб был продемонстрирован в ряде работ (ЫикепЬе^ е1 а1., 2005; Уап е1 а1., 2009). Генетически модифицированные аденовирусным вектором с геном ЫТЗ ОЕСб были инъецированы в область односторонней перерезки кортикоспинального тракта крысы на уровне С4. К 3 месяцу после операции под влиянием нетрансфицированных клеток показано значительное уменьшение области повреждения и только при трансплантации трансфици-рованных клеток выявлено существенное увеличение количества регенерирующих аксонов кортикоспинального тракта, хотя функциональные показатели при этом не улучшались. Доставка этого же гена при помощи технологии трансфекции плазмидным вектором ОЕСб и последующая трансплантация этих клеток в область контузионной травмы спинного мозга крысы на уровне Т9 приводила к 3 месяцу не только к усилению регенерации аксонов, но и к частичному улучшению функциональных показателей е1 а1.,

2008).

На модели латеральной гемисекции спинного мозга мыши на уровне Т8 проведена оценка способности аллотрансплантированных микроглия-подобных клеток, трансфицированных плазмидной с геном 1чГТЗ и полученных путём направленной дифференцировки эмбриональных стволовых клеток мышей С57В1/6, к миграции и выживанию в области травмы (Масгутова

и др., 2009). В указанной работе показано, что модификация микроглия-подобных клеток геном NT3 повышает способность этих клеток при ал-лотрансплантации стимулировать посттравматическую регенерацию спинного мозга мыши, что установлено по критериям восстановления двигательной функции, уменьшения области повреждения, сохранности белого вещества и количества астроцитов.

Комбинацию генов BDNF и NT3 чаще других выбирали для исследований при экспериментальной травме спинного мозга. Трансдуцированные ретро-вирусом с генами BDNF и NT3 глия-рестрицированные предшественники из спинного мозга 14-суточных эмбрионов крысы, аллотрансплантированные в область повреждения спинного мозга, дифференцировались в олигодендро-циты и формировали миелиновую оболочку, что обеспечивало восстановление проводимости в спинальных трактах (Сао et al., 2005).

В более позднем исследовании на эту тему была произведена оценка результатов трансплантации нейральных предшественников в область конту-зионного повреждения при хронической травме спинного мозга, когда клетки вводили через 6 недель после приложения травмы (Kusano et al., 2010). Трансплантированные клетки были трансфицированы при помощи лентиви-русного вектора с комбинацией генов НТФ BDNF и NT3 рецепторы. Через 8 недель после трансплантации было установлено, что трансфицированные клетки лучше выживали, активнее ремиелинизировали аксоны, что обеспечивало частичное восстановление функции (Kusano et al., 2010). Трансплантация генетически модифицированных фибробластов, экспрессирующих BDNF и NT3, в спинном мозге при его умеренной компрессии способствовала восстановлению функции мочеиспускания и подвижности конечностей (Mitsui et al., 2005).

Ген GDNF. Данные о выраженном цитопротекторном действии этого НТФ в отношении двигательных нейронов головного и спинного мозга легли в основу стратегии нейропротекции при травме спинного мозга и боковом амио-

трофическом склерозе. Доставка в область перерезки спинного мозга на уровне грудного отдела гена GDNF при помощи трансфицированных ленти-вирусным вектором OECs улучшает восстановление двигательной функции в большей мере, чем трансплантация тех же, но нетрансфицированных, клеток в аналогичных условиях эксперимента (Yan et al., 2009). Улучшение морфо-функциональных показателей было показано при доставке гена GDNF в мозг в условиях его экспериментальной ишемии (Chen et al., 2009). Трансфициро-ванные клетки характеризовались более высоким уровнем выживания. При этом в ишемическом очаге уменьшалось количество клеток, вступающих в апоптоз, и повышалась экспрессия других НТФ, таких как BDNF и NT3. Полученные результаты указывают на то, что доставка гена GDNF на клеточных носителях при травме спинного мозга может сдерживать развитие по-стишемических осложнений и позитивно влиять на восстановление функции. Доставку гена GDNF при помощи трансдуцированных ретровирусом фиб-робластов в область полной перерезки или дорсальной гемисекции спинного мозга крысы осуществили Blesch, Tuszynski, (2003), которым удалось выявить признаки регенерации нервных волокон и их ремиелинизацию. Однако при этом волокна не прорастали через область повреждения и не восстанавливали связи с клетками-мишенями, что не приводило к улучшению двигательной или чувствительной функции.

Молекулы адгезии важны для интеграции трансплантируемых клеток в ткань. Молекула адгезии L1 поддерживает выживание нейронов и рост аксонов (Maness, Schachner, 2007). Эмбриональные стволовые клетки, трасфици-руемые плазмидой с геном молекулы адгезии L1, были трансплантированы в область компрессионного повреждения спинного мозга мыши (Chen et al., 2005). Трансплантируемые клетки выживали в течение не менее 1 месяца и стимулировали рост аксонов кортикоспинального тракта. При трансплантации в травмированный спинной мозг подобные клетки формировали отростки и присутствовали в ткани реципиента спустя месяц после трансплантации,

тогда как те же нетрансфицированные клетки выживали лишь в течение 7 суток. Авторы делают значимый вывод о том, что молекула адгезии L1, будучи не только связанной с поверхностью клетки, но также находясь в растворимой форме, способна стимулировать нейрорегенерацию. В качестве дальнейшей разработки этого подхода представляет интерес использование других менее опасных в плане возможной трансформации, более близких к клеткам ткани реципиента и более перспективных в смысле интеграции в эту ткань клеточных носителей данного гена.

Гены транскрипционных факторов, контролирующих направленную диф-ференцировку нейральных клеток. Для предотвращения прогрессирующей демиелинизации вследствие гибели олигодендроцитов при хронической травме спинного мозга в эксперименте осуществлена трансплантация нейральных стволовых клеток, генетически модифицированных путем транс-фекции ретровирусным вектором с геном транскрипционного фактора OHg2, ключевого регулятора олигодендрогенеза (Hwang et al., 2009). К 7 неделе после трансплантации большинство трансфицированных клеток скапливалось преимущественно в белом веществе. При этом возрастала сохранность белого вещества, уменьшался объем патологических полостей и значительно возрастала толщина миелиновой оболочки.

Трансплантация нейральных стволовых клеток, трансфицированных геном транскрипционного фактора нейрогенина-2, контролирующего спецификацию мотонейронов, в область контузионной травмы спинного мозга крысы улучшает показатели восстановления двигательной и чувствительной функции, а также процесс ремиелинизации аксонов (Hofstetter et al., 2005). Однако при этом в качестве осложнения отмечены аберрантный спраутинг аксонов и появление аллодинии (извращённое восприятие любого раздражения как болевого).

Ген VEGF. Доставка в область травмы спинного мозга гена VEGF при помощи трансфицированных нейральных стволовых клеток усиливает проли-

ферацию глиальных предшественников, неоваскуляризацию и сохранение ткани (Kim et al., 2009). На модели хронической ишемии нижней конечности крысы установлено, что трансплантация МККП человека, трансдуцирован-ных гемагглютинирующим японским вирусом с геном VEGF, увеличивает плотность капилляров в зоне ишемии, улучшает кровоток и усиливает образование новых сосудов лучше, чем трансплантация тех же нетрансфициро-ванных клеток (Ikeda et al., 2004). Трансплантация клеток крови пуповинны, трансдуцированных адено-ассоциированным вирусом с геном VEGF, активирует ангиогенез при моделировании инфаркта миокарда у мышей (Chen et al., 2005).

Ген FGF2. Исследования с применением клеточно-опосредованной доставки гена FGF2 при травме спинного мозга не проведены, имеются лишь единичные работы по нейродегенеративным заболеваниям и травматическому повреждению периферической нервной системы. Так, аллотрансплантация шванновских клеток, трансфицированных плазмидой с геном FGF2 в составе силиконового кондуита, имплантируемого в диастаз седалищного нерва крысы, поддерживала регенерацию миелиновых волокон (Haastert et al., 2008). Одновременную доставку двухкассетной плазмиды с генами VEGF и FGF2 при помощи МККП человека осуществили Rizvanov и et al. др. (2011) на модели бокового амиотрофического склероза. Полученные исследователями экспериментальные данные показали, что генетически модифицированные МККП, трансплантированные ретроорбитально мышам с фенотипом бокового амиотрофического склероза, мигрируют в очаги нейродегенерации (серое вещество поясничного утолщения спинного мозга) и дифференцируются в эндотелиальные клетки и астроциты.

Таким образом, для повышения эффективности посттравматической нейрорегенерации активно исследуют возможности применения генетически модифицированных клеток с усиленной экспрессией терапевтических генов. При травме спинного мозга трансплантация клеток, трансфицированных при

помощи вирусных и плазмидных векторов, кодирующих гены НТФ, проти-воапоптозных молекул, молекул адгезии и других стимуляторов нейрореге-нерации, оказывается более эффективной, чем трансплантация трансплантация нативных клеток.

Многочисленными экспериментальными исследованиями установлено, что трансплантация трансфицированных клеток, несущих трансген, оказывает стимулирующее влияние на посттравматическую регенерацию спинного мозга. При травме спинного мозга в патологический процесс вовлекается обширная область, прилегающая к эпицентру травмы. Поэтому для наиболее полного проявления терапевтического действия доставляемого гена необходимо обеспечить его присутствие не только в эпицентре травматического повреждения, но и в прилегающих областях, как правило, достаточно удаленных от эпицентра травмы. Для решения этой задачи адекватным инструментом для доставки терапевтических генов служат клеточные носители. Предназначенные для трансплантации клетки, используемые в качестве носителей терапевтических генов, могут сами выступать в роли мишеней для продуктов этих трансгенов, что может поддерживать их выживание и миграционный потенциал и контролировать экспрессию фенотипических признаков. Этот аспект генно-клеточной терапии остается практически неизученным. Обнадеживающие перспективы применения генно-клеточной терапии при травме спинного мозга связывают также с возможностью одновременной доставки при помощи клеточных носителей не одного, а нескольких терапевтических генов, которые могут оказывать стимулирующее влияние на процесс нейро-регенерации за счёт влияния на различные клеточные типы или нервные волокна в составе различных трактов, которые избирательно реагируют на действие различных НТФ (Jones et al., 2001).

Несмотря на имеющиеся в настоящее время работы по применению клеток крови пуповины человека при травме спинного мозга животных остается открытым вопрос о возможности увеличения эффективности этих кле-

ток. Особенно перспективным представляется трансфекция данных клеток плазмидным вектором, экспресирующим два терапевтических гена, обладающих как ангиогенными, так и нейропротекторными свойствами, а также ярко выраженным синергетическим эффектом. Всё это позволило выдвинуть гипотезу, согласно которой генетически модифицированные клетки крови пуповины человека, трансфицированные плазмидами, одновременно экспре-сирующими гены УЕОБ и РОР2, значительно усиливают терапевтический эффект используемых клеток у крыс с контузионной травмой спинного мозга.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проведены на 56 белых половозрелых лабораторных крысах, самках и самцах весом 200-250 г. Контрольную группу составили 35 животных, опытную - 21 животное (табл. 1). Содержание и работу с лабораторными животными проводили в соответствии с требованиями приказа Министерства здравоохранения Российской Федерации от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики». Проведение диссертационного исследования одобрено локальным этическим комитетом Казанского государственного медицинского университета. Животных содержали в отдельных клетках, со стандартным суточным режимом и свободным доступом к воде и корму.

Таблица 1. Экспериментальные группы животных с дозированной контузионной травмой спинного мозга

Группа Характер эксперимента Количество прооперированных крыс Количество крыс выживших к 30 суткам

Опытная Трансплантация мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансфи-

цированных плазмидой 21 16

рВи(1-УЕОР-РОР2

(МККП+рВис1-УЕОР-РОР2)

Контроль 1 Трансплантация мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансфи-

цированных плазмидой плазмидой 21 14

рЕвРР-Ш

(МККП+рЕОРР-Ш)

Контроль 2 Без трансплантации клеток 14 9

2.1. Методика проведения операции на спинном мозге

Крыс наркотизировали путем внутрибрюшинной инъекции хлоралгидрата (Sigma) (80 мг/мл, 0,4 мл на 100 г). В области операционного поля на уровне грудного отдела позвоночника шерсть выбривали. Кожу обрабатывали 70% раствором этилового спирта. Разрез кожи производили параллельно позвоночнику. Далее осуществляли два продольных разреза мышц с обеих сторон от позвоночного столба. При помощи ранорасширителя от остистых отростков и дужек позвонков отделяли сухожилия и мышцы с оттягиванием их в стороны. После выделения позвоночника проводили ламинэктомию на уровне Th8. Далее позвоночник крысы жёстко фиксировали металлическими клипсами за остистые отростки позвонков Th7 и Th9. Дозированную конту-зионную травму осуществляли с помощью вертикально падающего строго на центр (по срединной линии) визуализируемого участка спинного мозга металлического стержня весом 10 г и диаметром 2 мм (метод - weight-drop) с высоты 25 мм (Gruner, 1992). Прооперированные животные были разделены на три экспериментальные группы (табл. 1).

2.2. Экспериментальные группы

Сразу после нанесения травмы МККП человека, трансфицированные плазмидой pBud-VEGF-FGF2, инъецировали по 1 млн в 5 мкл DPBS (фос-фатно-солевой буфер Dulbecco, стерильный без ионов Са2+ и Mg2+, БиолоТ) в 2 точки на расстоянии 1 мм ростральнее и каудальнее эпицентра травмы и 0,5 мм латеральнее срединной линии при помощи гамильтоновского шприца (Sigma) (рис. 1). Животным 1-й контрольной группы в тех же условиях и в том же количестве трансплантировали МККП человека, трансфицированные плазмидой pEGFP-N2 (Clontech), содержащей ген усиленного зелёного флуоресцентного белка (EGFP). Животным 2-й контрольной группы трансплантацию клеток не проводили. В течение 7 суток после операции всем животным внутримышечно вводили гентамицин (5 мг/кг) 1 раз в сутки. В послеоперационном периоде в связи с развитием у животных нарушений мочеиспуска-

ния дважды в день проводили механическое опорожнение мочевого пузыря до восстановления его функции.

Выведение животных из эксперимента проводили в соответствии с «Правилами работы с использованием экспериментальных животных» (Приказ Минвуза от 13.11.1984 года №724). Животных опытной группы (МККП+рВис1-УЕОР-РОР2) выводили из эксперимента через 30 суток после нанесения травмы. Крыс 2-й контрольной группы (без трансплантации клеток) через 2, 14 (по одной крысе в каждый из указанных сроков) и 30 суток. Животных 1-й контрольной группы (МККП+рЕОРР-Ы2) через 2, 4, 7, 14, 21 (по две крысы в каждый из указанных сроков) и 30 суток. Животных наркотизировали и транскардиально перфузировали 4% раствором параформальде-гида (4°С). Фрагмент спинного мозга (по 2,5 см рострально и каудально от ТЬ8) общей длиной 5 см забирали вместе с позвонками. Через 12 ч от начала фиксации выделяли этот фрагмент и разделяли его на 5 равных частей, при этом эпицентр травмы находился в центральной области.

©

эпицентр травмы

Рис. 1. Схема трансплантации МККП в спинной мозг крысы.

2.3. Генетическая модификация клеток

Трансфицированные МККП были предоставлены д.б.н. Ризвано-вым A.A. (кафедра генетики, Институт фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского) федерального университета). Полученные МККП были модифицированы плазмидными конструкциями pEGFP-N2 или pBud-VEGF-FGF2 (заявка на патент РФ №2009133970) методом электропо-рации (Rizvanov et al., 2008). После проведения электропорации клетки восстанавливали in vitro в среде RPMI1640+20% FBS в течение 16-18 часов в СОг-инкубаторе при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО2, и затем трансплантировали крысам с травмой спинного мозга (рис. 2).

2.4. Гистологические методы

Через 12 ч от начала фиксации выделенный и разделённый на пять равных частей спинной мозг, помещали в 1% раствор 0s04 на фосфатном буфере с добавлением сахарозы, обезвоживали и заливали в эпон-812 (Fluka). Полутонкие поперечные срезы готовили на ультрамикротоме LKB-III (Bromma). На срезах, окрашенных метиленовым синим, измеряли суммарную площадь патологических полостей, площадь сохранённого серого и белого вещества, определяли количество миелиновых волокон на расстоянии 3 и 5 мм от эпицентра травмы в ростральном и каудальном направлении. Все подсчёты проводили с оцифрованных изображений, полученных на световом микроскопе Axio Imager AI (Carl Zeiss) с помощью программы ImageTool Version 3.0. На поперечных срезах спинного мозга подсчитывали площадь сохранённого серого и белого вещества. Морфометрию проводили у всех выживших животных на трёх серийных срезах у каждого в фиксированных зонах белого веще-

л

ства (рис. 1) площадью Si=0,56 мм . В произвольной части каждой зоны

л

площадью S2=0,0962 мм подсчитывали количество миелиновых волокон и суммарную площадь патологических полостей. Подсчёт количества иммуно-позитивных клеток производили во всей площади каждой зоны (Si=0,56 мм ).

Получение из пуповикнок

ыононуклеарной фракции

восстановление

клеток после электролорзции

У5Н®

УЕОР

рис оп

В6Н рА ^^^^о^Рсту

Рея

рВис1СЕ4.1

5.0 кь ^тусн,з5

О Бу40 рА шжшА^-^ 2еос1п

Экслрсссиокн ый ллаэмедный вектор

Трансплантация траксфи цирова иных клеток

Рис. 2. Схема эксперимента с трансплантацией генетически модифицированных МККП, трансфицированных плазмидой рВис!-УЕОР-РОР2, крысам с дозированной контузионной травмой спинного мозга [из Исламова с изменениями, 2007].

Э2

Рис. 3. Зоны морфометрии. 1 - вен-тромедиальная часть переднего канатика, прилежащая к срединной щели, правая сторона; 2 - то же, левая сторона; 3 - латеральная часть бокового канатика в пределах фронтальной плоскости, проходящей через центральный канал, правая сторона; 4 - то же, левая сторона.

2.5. Иммуногистохимические методы

Иммунофлуоресцентные реакции проводили на поперечных срезах спинного мозга толщиной 20 мкм, полученных на криостате Microm HM 560 (Thermo Scientific). Срезы промывали в PBS (фосфатно-солевой буфер, рН=7,4, Биолот) с 1% Тритоном Х-100 в течение 5 минут 3 раза, далее блокировали неспецифическое связывание в PBS, содержащем 1% Тритон Х-100 и 5% сыворотку осла в течение 1 часа при комнатной температуре. Для идентификации антигена срезы инкубировали с первичными антителами против белка S100B (Dako, 1:1200), GFAP (Santa Cruz, 1:200), транскрипционного фактора Krox20 (Santa Cruz, 1:200), белка периферического миелина Р0 (Abeam, 1:100), р75 (Santa Cruz, 1:100), PDGF/3R (Sigma, 1:100), маркёра ядер клеток человека (HNu) (Chemicon, 1:100), VEGF (Sigma, 1:125) и HSP25 (Stressgen, 1:2000) в течение одних суток при 4°С. Затем срезы промывали в PBS 3 раза по 5 минут и далее инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с флуоресцентными красителями anti-mouse Alexa 647 (Invitrogen, 1:200), anti-goat Alexa 488 (Invitrogen, 1:150), anti-mouse Alexa 488 (Invitrogen, 1:200), anti-rabbit Alexa 555 (Invitrogen, 1:150) в течение 2 часов при комнатной температуре. Для визуализации ядер клеток срезы дополнительно окрашивали в течение 10 минут при комнатной температуре в растворе 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI, 10 мкг/мл фосфатно-солевого буфера, Sigma). Окрашенные срезы заключали в глицерин (Галено Фарм) и изучали при помощи конфокального сканирующего микроскопа LSM 510-Meta (Carl Zeiss). При подсчете количества клеток принадлежность иммунопозитивных структур конкретной клетке определяли по локализации ее ядра, выявляемого при помощи DAPI.

Авидин-биотиновый метод (LSAB). На аналогичных срезах на расстоянии 10 и 15 мм в ростральном и каудальном направлении от эпицентра травмы при помощи непрямой стрептавидин-биотин-пероксидазной реакцией с LSAB-kit (DAKO) выявляли экспрессию белка S100B (Millipore, 1:200),

PDGF/3R (Sigma,l:100) и транскрипционного фактора Krox20 (Covance, 1:200). Полученные срезы промывали в PBS в течение 5 минут 3 раза, в последующем блокировали эндогенную пероксидазную активность, помещая срезы в 1% раствор перекиси водорода на 20 минут. Далее срезы снова промывали в PBS (3 раза по 5 минут) и инкубировали 5 минут в блокирующем реагенте. Затем его удаляли и добавляли указанные выше первичные антитела в рабочем разведении (инкубировали в течение 1 часа при температуре 37°С). Далее срезы промывали в PBS (3 раза по 5 минут) и помещали в стреп-тавидин на 10 минут с последующей аналогичной промывкой и инкубацией в биотине 10 минут. После дальнейшей промывки в PBS (3 раза по 5 минут) проводили гистохимическое выявление пероксидазной активности раствором диаминобензидина в течение 5 минут. Срезы промывали в дистиллированной воде и заключали канадский бальзам. Количество иммунопозитивных клеток подсчитывали на оцифрованных изображениях в тех же 4 зонах белого вещества (рис. 3).

При проведении иммуногистохимических реакций параллельно осуществляли два вида отрицательных контролей. Первый из них проводили по аналогичным протоколам, но с исключением инкубации срезов с первичными либо вторичными антителами путём их замены на 5% сыворотку осла. Второй отрицательный контроль осуществляли в случаях иммуногистохимических реакций с выявлением маркёров шванновских клеток. Для этого использовали срезы тканей, в которых искомый антиген не присутствует, т.е. интактный спинной мозг крысы.

2.6. Оценка восстановления двигательной функции

Для оценки восстановления двигательной функции использовали поведенческий тест ВВВ (Basso et al., 1995). Авторы данного метода процесс восстановления произвольных движений как при легкой степени повреждения, так и при средней разделяют на три фазы: раннюю, промежуточную и позднюю. Ранняя фаза восстановления (0-7 баллов) характеризуется вялым па-

раличом задних конечностей с постепенным появлением слабых, но ясно определяемых, изолированных движений в одном или двух суставах задних конечностей. В промежуточную фазу восстановления (8-13 баллов) крысы начинают располагать стопы плантарной поверхностью к грунту, появляются ритмические, размашистые движения в задних конечностях, координации движения передних и задних конечностей. В позднюю фазу (14 - 21 баллов) крысы демонстрируют улучшение таких двигательных характеристик как положение стопы относительно туловища при опоре, пальцевой клиренс при переносе конечности, равновесие (Basso et al., 1995).

Ежедневно в течение 3 суток, предшествующих операции, животных адаптировали в открытой области (пластмассовое поле с гладким полом 90x40 см, 7 см высота стен). В конце периода обучения определяли предоперационные уровни состояния произвольных движений крыс. На седьмые сутки после контузионной травмы спинного мозга крыс исследовали через сутки в одно и то же время, располагая в центре открытого поля и регистрируя в баллах параметры произвольных движений с участием двух независимых исследователей.

2.7. Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета программ Origin7 Pro. Статистическую достоверность различий определяли с помощью t-критерия Стьюдента. Для всех статистических данных уровень достоверности был принят меньше 0,05 (Р<0,05).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Сроки выживания и характеристика миграционного потенциала мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансплантированных в область контузионной травмы спинного мозга крысы

В спинном мозге животных 1-й контрольной группы с введением МККП, трансфицированных плазмидой рЕвРР-Ш, специфическое свечение выявлено на расстоянии до 10 мм в ростральном и каудальном направлении от соответствующих точек инъекции. Это свечение наиболее интенсивно на

ранних сроках после травмы и введения клеток (2-7 суток) (рис. 4), чётко

\ \ / 1

\ / 1

\ /

\ / 1

\ 1 1

\ 1 1

\ 1

\ 1 1

\ 1 1 -

\ 1 /

\ 1 /

\ \ \ /

» /

\ \ /

1 \ /

1 \ /

< 4 * - . - '

/

/

✓ ✓

А Б

В

Рис. 4. Специфическое свечение ЕвРР в задних канатиках и в сером веществе после трансплантации МККП+рЕСРР-Ы2 (А, Б) в область повреждения спинного мозга крысы. В - отсутствие свечения ЕвРР во 2-й контрольной группе (без трансплантации клеток). А, В - 2 сутки; Б - 4 сутки после травмы. Пунктирная линия - граница между серым и белым веществом. Ув. 250.

прослеживается на более поздних сроках (14-21 сутки) (рис. 5) и постепенно затухает к 30 суткам.

Меченые ЕОИР клетки присутствуют в сохранённой ткани серого и белого вещества и проникают в патологические полости. Если к первым суткам после трансплантации люминесцирующие клетки распределены более равномерно и преимущественно в белом веществе, то к 7 суткам они образуют скопления с интенсивной флуоресценцией в вентральной части задних канатиков и особенно в прилегающей к ней дорсальной части серого вещества (рис. 5А).

/

/ / /

/ I /

I

А — Б

Рис. 5. Специфическое свечение ЕвРР после трансплантации МККП+рЕОРР-М2 в область повреждения спинного мозга крысы. А - 7 суток, задние канатики на границе с серым веществом; Б - 14 суток после нанесения травмы и введения трансфицированных клеток, локальное свечение в области главного кортикоспинального тракта и по ходу задней срединной борозды. Пунктирная линия - граница между серым и белым веществом; стрелки - передняя срединная щель. Ув. 250.

К 7 суткам области с характерным свечением ЕвРР занимают больший объем ткани, интенсивность свечения возрастает, что может быть следствием увеличения экспрессии ЕвРР в трансплантированных клетках или увеличения их количества за счёт активной пролиферации. К 14 суткам область присутствия ЕОРР+-клеток значительно сужается. К этому сроку специфическая флуоресценция ЕвРР выявлена в компактном скоплении клеток преимуще-

ственно в вентральной части задних канатиков на границе с серым веществом (рис. 5Б, 6).

, ЛI ✓

Заключение диссертации по теме «Клеточная биология, цитология, гистология», Мухамедшина, Яна Олеговна

5. Выводы:

1. Трансфицированные мононуклеарные клетки крови пуповины человека, трансплантированные в область контузионной травмы спинного мозга крысы, до 30 суток сохраняют жизнеспособность с возможностью экспрессии продуктов ре-комбинантных генов и способны мигрировать на расстояние не менее 10 мм в ростральном и каудальном направлении от эпицентра травмы.

2. Трансплантация в область травмы спинного мозга крысы мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансфицированных плазмидой рВис1-УЕОР-РОР2, улучшает восстановление двигательной функции.

3. Трансфекция мононуклеарных клеток крови пуповины человека плазмидой рВис1-УЕОЕ-РОЕ2 повышает способность этих клеток, трансплантируемых в область повреждения спинного мозга крысы, стимулировать его посттравматическую регенерацию, что установлено по критериям уменьшения патологической кавитации, площади деструкции серого и белого вещества и увеличения количества миелиновых волокон.

4. Трансплантация в область травмы спинного мозга крысы мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансфицированных плазмидой рВис1-УЕСР-РОР2, приводит к увеличению численности 8100В+-клеток в белом веществе спинного мозга.

5. Трансплантация в область травмы спинного мозга крысы мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансфицированных плазмидой рВис!-УЕСР-РОР2, приводит к увеличению количества перицитов, экспрессирую-щих /3-рецептор тромбоцитарного фактора роста, что свидетельствует о стимулирующем влиянии генно-клеточной терапии на неоиаскуляризацию.

6. Трансплантация в область травмы спинного мозга крысы мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансфицированных плазмидой рВиё-УЕОР-РОР2, поддерживает в области травмы спинного мозга популяцию шванновских клеток-мигрантов. Субпопуляции этих клеток с фенотипом Р0+- и Р0+/р75+ в белом веществе, 8100В+/СРАР+/Кгох20+ и СРАР+/Кгох20+ в области вхождения задних корешков и Н8Р25+/СРАР+/Кгох20+ в задних канатиках являются мишенями поддерживающего влияния терапевтических генов, а не фактора трансплантации клеток.

4. Заключение

Для наиболее полного достижения главных целей генно-клеточной терапии в виде стимулирования нейрорегенерации и восстановления утраченных функций спинного мозга важно максимально длительное присутствие в повреждённой ткани рецепиента трансплантируемых клеток и доставляемых ими генов стимуляторов регенерации. Полученные в работе результаты свидетельствуют о том, что МККП человека, трансплантированные в область контузионной травмы спинного мозга крысы, до 30 суток выживают в этой области с возможностью экспрессии продуктов рекомбинантных терапевтических генов. Этот срок полностью перекрывает «терапевтическое окно», в течение которого стремительно развёртываются патологические реакции вторичного повреждения, такие как повышение уровня провоспалительных цитокинов, окислительный стресс и эксайтотоксичнось, которые приводят к гибели нейральных клеток и дегенерации аксонов. Длительность пребывания трансплантируемых клеток в области травмы спинного мозга, выявленная в наших экспериментах, согласуется с величиной данного показателя в аналогичных работах с трансплантацией мезенхимных предшественников. Следует отметить, что этот положительный результат зарегистрирован нами в условиях отсутствия иммуносупрессии. Можно ожидать, что её применение обеспечит ещё более длительное присутствие в области травмы спинного мозга трансплантируемых МККП человека, способных поддерживать экспрессию терапевтических генов. Увеличение сроков пребывания клеточных носителей терапевтических генов открывает возможность для проведения генной терапии не только в острой фазе в течение короткого периода времени, но также имеет значение для преодоления последствий травмы спинного мозга на более отдалённых сроках у хронических больных. Не исключено, что сроки выживания трансфицированных МККП человека в спинном мозге крысы продлеваются за счёт экспрессии терапевтических трансгенов, которые в результате ауто- или паракринного действия могут поддерживать жизнеспособность трансплантируемых клеток или их пролиферацию. В последнем случае, с учётом трансфекции клеток при помощи плазмиды, дочерние клетки не будут экспрессировать трансгены, но при этом можно рассчитывать на терапевтическое действие самих клеток.

МККП человека, трансплантированные в область контузионной травмы спинного мозга крысы, не только длительно сохраняют жизнеспособность, но и могут мигрировать на расстояние не менее 10 мм в ростральном и кау-дальном направлении от эпицентра травмы. В условиях генно-клеточной терапии выраженность миграционного потенциала трансплантированных клеток имеет значение для доставки терапевтических генов в области, которые расположены не только в непосредственной близости от точек введения клеток, но и на удалении от них и от эпицентра травмы. В наших экспериментах способность МККП человека к миграции после трансплантации в спинной мозг крысы оказалась не ниже, чем у типированных гемопоэтических и ней-ральных стволовых клеток в аналогичных экспериментах. Следовательно, используемые нами МККП по критериям жизнеспособности и миграционному потенциалу адекватны задачам генно-клеточной терапии при травме спинного мозга.

Трансплантация в область травмы спинного мозга крысы МККП человека, трансфицированных плазмидой рВис!-УЕОЕ-ЕОР2, улучшает восстановление двигательной функции, что коррелирует с уменьшением патологической кавитации, площади деструкции серого и белого вещества и увеличением количества регенерирующих миелиновых волокон. По критериям выраженности патологической кавитации и сохранности серого и белого вещества эффективность трансплантации в область травмы спинного мозга трансфицированных клеток оказалась выше, чем в при трансплатации тех же клеток, трансфицированных плазмидой с нетерапевтическим геном ЕОБР. Полученные результаты можно объяснить действием продуктов экспрессии терапевтических трансгенов нейротрофических и одновременно ангиогенных факторов на клетки-мишени в повреждённой ткани реципиента. Увеличение количества регенерирующих волокон в белом веществе спинного мозга в результате проведения локальной генно-клеточной терапии может быть результатом прямого поддерживающего влияния НТФ, которые продуцируются трансплантированными клетками, на олигодендроциты и процесс ремиели-низации. Усиление регенерации миелиновых волокон может быть также следствием уменьшения объёма патологических полостей и увеличения области сохранённой ткани в белом веществе.

Продукты применённых нами трансгенов, доставляемых в составе плазмиды рВис!-УЕОР-РОР2, проявляют свойства одновременно нейротро-фических и ангиогенных факторов. Трансплантация МККП человека, транс-фицированных этой плазмидой, приводит к увеличению количества перицитов, экспрессирующих /3-рецептор тромбоцитарного фактора роста, что свидетельствует о стимулирующем влиянии генно-клеточной терапии на неова-скуляризацию. Усиление васкуляризации ткани в области повреждения спинного мозга можно рассматривать как благоприятный фактор для процесса стимулирования посттравматической нейрорегенерации. Восстановление кровоснабжения в повреждённой ткани может быть причиной установленной нами позитивной динамики улучшения двигательной функции, уменьшения объёма патологических полостей, увеличения области сохранённой ткани, количества миелиновых волокон, а также позитивных сдвигов в популяциях астроцитов и шванновских клеток-мигрантов.

Трансплантация МККП человека, трансфицированных плазмидой рВис1-УЕОР-РОР2, приводит к увеличению количества 8100В+-клеток в белом веществе спинного мозга. Экспрессия этого белка характерна для астроцитов, которым принадлежит ведущая роль в поддержании гомеостаза в мозге. С учётом общепринятых данных о том, что астроциты взаимодействуют с нейронами и обеспечивают их энергетическими метаболитами, участвуют в рециклировании нейромедиаторов, осуществляют антиоксидантную защиту нейронов и модулируют их электрические реакции показанное нами увеличение количества Э100В+-клеток можно рассматривать как позитивный результат генно-клеточной терапии.

На модели контузионной травмы спинного мозга нами подтверждена возможность миграции шванновских клеток в область повреждения. При этом шванновские клетки выявлены не только в эпицентре травмы и в прилегающих к нему отделах, но и на достаточном от него удалении. Результаты экспериментов с локальной доставкой в область травмы терапевтических генов УЕОР и РОР2 при помощи МККП человека поддерживает в повреждённой ткани спинного мозга популяцию шванновских клеток-мигрантов. Это влияние терапевтических генов может быть реализовано путём усиления миграции шванновских клеток из периферических нервных структур, поддержания их жизнеспособности или повышения пролиферативной активности. Нами охарактеризован фенотип этих клеток в конкретных зонах области повреждения и установлено, что миелинобразующие шванновские клетки и их предшественники являются мишенями поддерживающего влияния преимущественно продуктов терапевтических генов, а не фактора трансплантации клеток. Это представление кажется продуктивным в связи с актуальностью поиска новых терапевтических подходов при травме спинного мозга.

Несмотря на большое количество работ по применению различных типов клеток, НТФ и кодирующих их генов с целью стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга авторы практически не анализируют выживаемость экспериментальных животных. Контузионная травма спинного мозга приводит к летальному исходу не менее чем 15% прооперированных крыс (Чехонин и др., 2008), что связано с инфекционными осложнениями и острыми нарушениями нервной регуляции. В исследовании Шгагакл е1 а1. (2006) выживаемость крыс после контузионного повреждения спинного мозга достигает 100% в условиях инъекции ЫТ-З и составляет лишь 71,5% после аналогичной травмы, но без введения НТФ. В наших экспериментах выживаемость крыс при контузионной травме спинного мозга без трансплантации клеток составляет 64%, в условиях трансплантации нетрансфицированных терапевтическими генами МККП достигает 66% и существенно увеличивается до 76% при трансплантации МККП, трансфицированных плазмидой рВиё-УЕОР-РСР2. Однократная трансплантация МККП в область повреждения также влияет на послеоперационную выживаемость крыс, но лишь незначительно, поэтому разница в этом показателе в группе с трансплантацией клеток с геном ЕОРР и без трансплантации клеток не превышает 3%. Следовательно, увеличение выживаемости животных в наших экспериментах с ген-но-клеточной терапией может быть следствием морфологических и функциональных улучшений, связанных преимущественно с поддерживающим влиянием терапевтических генов.

Таким образом с целью стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга применение генетически модифицированных генами УЕвР и РОР2 МККП человека можно считать перспективным направлением генно-клеточной терапии. Вместе с тем необходимы дальнейшие детальные исследования влияния трансфицированных МККП человека в том числе на жизнеспособность нейронов и олигодендроцитов, процесс ремиелинизации и состояние глиальных барьеров при травме спинного мозга.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Мухамедшина, Яна Олеговна, 2013 год

6. Список литературы:

1. Викторов, И.В. Мультипотентные стволовые и прогенеторные клетки обонятельного эпителия / И.В. Викторов, Е.А. Савченко, О.В. Ухова, Н.Ю. Алексеева, В.П. Чехонин // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2006. -№ 4. - С. 185-191.

2. Викторов, И.В. Спонтанная нейральная дифференциация стволовых клеток в культуре обонятельного эпителия человека / И.В. Викторов, Е.А. Савченко, В.П. Чехонин // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2007. - № 4. - С. 183-188.

3. Исламов, P.P. Генная и клеточная терапия нейродегенеративных заболеваний / P.P. Исламов, A.A. Ризванов, Д.С. Гусева, А.П. Киясов // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2007. - Т. 2, № 3. -Р. 29-37.

4. Лебедев, C.B. Исследование эффективности трансплантации нейраль-ных стволовых клеток человека крысам с травмой спинного мозга: применение функциональных нагрузочных тестов и метода ВВВ / C.B. Лебедев, A.B. Карасев, В.П. Чехонин, Е.А. Савченко, И.В. Викторов, Ю.А. Челышев, Г.Ф. Шаймарданова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010. - Т. 149, № 3. - С. 355-360.

5. Масгутов, Р.Ф. Стимуляция посттравматической регенерации седалищного нерва крысы с помощью плазмиды, экспрессир с эндотели-альный фактор роста и основной фактор роста фибробластов / Р.Ф. Масгутов, И.И. Салафутдинов, A.A. Трофимова, И.Г. Ханнанова, Р.И. Муллин, P.P. Исламов, Ю.А. Челышев, A.A. Богов, A.A. Ризванов // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2011. - Т. 6, № З.-С. 67-70.

6. Масгутова, Г.А. Динамика морфологических изменений спинного мозга крысы после контузионной травмы различной степени тяжести /

Г.А. Масгутова, Ю.А. Челышев, A.B. Жарков, C.B. Лебедев, В.П. Чехонин // Морфологические ведомости. - 2008. - № 1 - 2. - С. 80-83. ч 7. Масгутова, Г.А. Миграция и выживание в области гемисекции спинно-

го мозга мыши аллотрансплантированных микроглия-подобных клеток, трансфицированных геном NT-3 / Г.А. Масгутова, Р.Ф. Масгутов, Ю.А. Челышев // Морфологические ведомости. - 2009. - № 3 - 4. -С. 42-46.

8. Масгутова, Г.А. Посттравматическая регенерация спинного мозга грызунов при трансплантации клеток обонятельной выстилки, микроглия-подобных клеток и реконструкции тканевого матрикса биосовместимыми карбомерами: Автореф. дис. к-та биол. наук: 03.03.04. / Масгутова Галина Андреевна; ФГБОУ ВПО Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарёва. - Саранск, 2010. - 19с.

9. Николаев, С.И. Регенерация седалищного нерва крысы в условиях локальной доставки генов VEGF и FGF2 / С.И. Николаев, А.Р. Галлямов, Ю.А. Челышев // Морфологические ведомости. - 2012. - Т. 2. -С. 45-50.

10.Челышев, Ю.А. Клеточные технологии ремиелинизации при травме спинного мозга / Ю.А. Челышев, И.В. Викторов // Неврологический вестник (журнал им. В.М. Бехтерева). - 2009. - № 1. - С. 49-55.

11.Челышев, Ю.А. Глиальные NG2-KneTKH в нейроонтогенезе и регенерации / Ю.А. Челышев, Г.Ф. Шаймарданова // Неврологический вестник (журнал им. В.М. Бехтерева). - 2010. - Т. 42, № 4. - С. 84-90.

12.Чехонин, В.П. Нагрузочные тесты и метод ВВВ при оценке двигательных нарушений у крыс после контузионной травмы спинного мозга / В.П. Чехонин, C.B. Лебедев, Ю.А. Челышев, A.B. Жарков, Г.А. Масгутова, C.B. Тимофеев, В.Г. Шипилов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. -№ 10. - С. 471-476.

13.Шаманская, Т.В. Использование пуповинной крови при проведении аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у детей (опыт работы московского банка стволовых клеток) / Т.В. Шаманская, Т.А. Астрелина, З.А. Подколзина, Е.Э. Карпова, и др. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2010. - Т. 5, № 2. - С. 29-35.

M.Ackery, A. Inhibition of Fas-mediated apoptosis through administration of soluble Fas receptor improves functional outcome and reduces posttraumatic axonal degeneration after acute spinal cord injury / A. Ackery, S. Robins, M.G. Fehlings // J Neurotrauma. - 2006. - V. 23, № 5. - P. 604-616.

15.Akbik, F Myelin associated inhibitors: a link between injury-induced and experience-dependent plasticity / F. Akbik, W.B. Cafferty, S.M. Strittmatter // Exp Neurol. - 2012. - V. 235, № 1. - p. 43-52.

16.Allaman, I. Astrocyte-neuron metabolic relationships: for better and for worse /1. Allaman, M. Bélanger, P.J. Magistretti // Trends Neurosci. - 2011. -V. 34, №2.-P. 76-87.

17.Alto, L.T. Chemotropic guidance facilitates axonal regeneration and synapse formation after spinal cord injury / L.T. Alto, L.A. Havton, J.M. Conner, E.R. Hollis Ii, A. Blesch, M.H.Tuszynski // Nat Neurosci. - 2009. - V. 12, №9.-P. 1106-1113.

18.Apfel, S.C. Nerve growth factor for the treatment of diabetic neuropathy: what went wrong, what went right, and what does the future hold? // Int Rev Neurobiol. - 2002. - V. 50. - P. 393-413.

19.Arvanian, V.L Combined delivery of neurotrophin-3 and NMDA receptors 2D subunit strengthens synaptic transmission in contused and staggered double hemisected spinal cord of neonatal rat / V.L. Arvanian, W.J. Bowers, A. Anderson, P.J. Horner, H.J. Federoff , L.M. Mendell // Exp Neurol. -2006. - V. 197, № 2. - P. 347-352.

20.Awad, B.I. Potential Role of Growth factors in SCI management / B.I.Awad, M.A. Carmody, M.P. Steinmetz // World Neurosurg. - 2013. [Epub ahead of print].

21.Bachelin, C. Efficient myelin repair in the macaque spinal cord by autologous grafts of Schwann cells / C. Bachelin, F. Lachapelle, C. Girard, P. Moissonnier, C. Serguera-Lagache, J. Mallet, D. Fontaine, A. Chojnwski, E. Le Guern, B. Nait-Oumesmar, A. Baron-Van Evercooren // Brain. -2005. - V. 128, № 3. - P. 540-549.

22.Bai, L. Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells induce Th2-polarized immune response and promote endoge№us repair in animal models of multiple sclerosis / L. Bai, D.P. Lenn, V. Eaton, K. Maier, A.I. Caplan, S.D. Miller, R.H. Miller // Glia. - 2009. - V. 57, № 11. -P. 1192-1203.

23.Balentine, J.D. Pathology of experimental spinal cord trauma, I: the necrotic lesion as a function of vascular injury // Lab Invest. - 1978. - V. 39. -P. 236-253.

24.Barati, S. GDNF gene delivery via the p75(NTR) receptor rescues injured motor neurons / S. Barati, P.R. Hurtado, S.H. Zhang, R. Tinsley, I.A. Ferguson, R.A. Rush // Exp Neurol. - 2006. - V. 202, № 1. - P. 179-188.

25.Barres, B.A. A crucial role for neurotrophin-3 in oligodendrocyte development / B.A. Barres, M.C. Raff, F. Gaese, I. Bartke, G. Dechant, Y.A. Barde // Nature. - 1994. - V. 367, № 6461. - P. 371-375.

26.Barres, B.A. Control of oligodendrocyte number in the developing rat optic nerve / B.A. Barres, M.C. Raff // Neuron. - 1994. - V. 12, № 5. -P.935-942.

27.Basso, D.M. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats / D.M. Basso, M.S. Beattie, J.C. Bresnahan // J of Neurotrau-ma. - 1995. - V. 12, № l.-P. 1-21.

28.Basso, D.M. Neuroanatomical substrates of functional recovery after experimental spinal cord injury implications of basic science research for human spinal cord injury // Phys Ther. - 2000. - V. 80. - P. 808-817.

29.Beattie, M.S. Cell death in models of spinal cord injury / M.S. Beattie, G.E. Hermann, R.C. Rogers // Prog Brain Res. - 2002. - V. 137. - P. 37-47.

30.Benton, R.L. VEGF165 therapy exacerbates secondary damage following spinal cord injury / R.L. Benton, S.R. Whittemore // Neurochem Res. -2003.-V. 28, № 11.-P. 1693-1703.

31.Betsholtz, C. Role of pericytes in vascular morphogenesis / C. Betsholtz, P. Lindblom, H. Gerhardt // EXS. - 2005. - V. 94, № 1. - P. 115-125.

32.Bleiziffer, O.E. Gene transfer strategies in tissue engineering / E. Friksson, R.E. Yao Fhorch, U. Kneser // J Cell Mol Med. - 2007. - V. 11, № 2. -P. 206-223.

33.Blesch, A. Cellular GDNF delivery promotes growth of motor and dorsal column sensory axons after partial and complete spinal cord transections and induces remyelination / A. Blesch, M. H. Tuszynski // J Comp Neurol. -2003. - V. 467, № 3. - P. 403-417.

34.Blesch, A. Transient growth factor delivery sustains regenerated axons after spinal cord injury / A. Blesch, M.H. Tuszynski // Neurosci. - 2007. - V. 27, №39.-P. 10535-10545.

35.Blesch, A. Axonal responses to cellularly delivered NT-4/5 after spinal cord injury / A. Blesch, H. Yang, N. Weidner, A. Hoang, D. Otero // Mol Cell Neurosci. - 2004. - V. 27, № 2. - P. 190-201.

36.Blits, B. Direct gene therapy for repair of the spinal cord / B. Blits, M.B. Bunge // J Neurotrauma. - 2006. - V. 23, № 3-4. - P. 508-520.

37.Bo, X. Gene therapy approaches for neuroprotection and axonal regeneration after spinal cord and spinal root injury / X. Bo, D. Wu, J. Yeh, Y. Zhang //Curr Gene Ther.-201 l.-V. 11, №2.-P. 101-115.

38.Bomstein, Y. Features of skin-coincubated macrophages that promote recovery from spinal cord injury / Y. Bomstein, J.B. Marder, K. Vitner, I. Smirnov, G. Lisaey, O. Butovsky, V. Fulga, E. Yoles // J Neuroimmunol. - 2003. - V. 142, № i_2. - P. 10-16.

39.Bonner, J.F. Promoting directional axon growth from neural progenitors grafted into the injured spinal cord / J.F. Bonner, A. Blesch, B. Neuhuber, I. Fischer // J Neurosci Res. - 2010. - V. 88, № 6. - P. 1182-1192.

40.Boyd, J.G. Neurotrophic factors and their receptors in axonal regeneration and functional recovery after peripheral nerve injury / J.G. Boyd, T. Gordon // Mol Neurobiol. - 2003. - V. 27, № 3. - P. 277-324.

41.Bradbury, E.J. Manipulating the glial scar: chon-droitinase ABC as a therapy for spinal cord injury / E.J. Bradbury, L.M. Carter // Brain Res Bull. -2011.-V. 84.-№4-5.-P. 306-316.

42.Bruckner, K. Tyrosine phosphorylation of transmembrane ligands for Eph receptors / K. Bruckner, E.B. Pasquale, R. Klein // Science. - 1997. -V. 275, № 5306. - P. 1640-1643.

43.Cao, Q. Functional recovery in traumatic spinal cord injury after transplantation of multineurotrophin-expressing glial-restricted precursor cells / Q. Cao, X.M. Xu, W.H. Devries, G.U. Enzmann, P. Ping, P. Tsoulfas, P.M. Wood, M.B. Bunge, S.R. Whittemore // J Neurosci. - 2005. - V. 25, № 30.-P. 6947-6957.

44.Cardoso, A.A. Release from quiescence of CD34+ CD38- human umbilical cord blood cells reveals their potentiality to engraft adults / A.A. Cardoso, M.L. Li, P. Batard, A. Hatzfeld, E.L. Brown, J.P. Levesque, H. Sookdeo, B. Panterne, P. Sansilvestri, S.C. Clark // Proc Natl Acad Sci USA. - 1993. -V. 90, № 18.-P. 8707-8711.

45.Carow, C.E. Human multipotential progenitor cells (CFU-GEMM) have extensive replating capacity for secondary CFU-GEMM: an effect enhanced

by cord blood plasma / C.E. Carow, G. Hangoc, H.E. Broxmeyer // Blood. -1993. - V. 81, № 4. - P. 942-949.

46.Chen, H.K. Combined cord blood stem cells and gene therapy enhances an-giogenesis and improves cardiac performance in mouse after acute myocardial infarction / H.K. Chen, H.F. Hung, K.G. Shyu, B.W. Wang, J.R. Sheu, Y.J. Liang, C.C. Chang, P. Kuan // Eur J Clin Invest. - 2005. - V. 11, № 35. -P. 677-686.

47.Chen, R. The potential for the use of mononuclear cells from human umbilical cord blood in the treatment of amyotrophic lateral sclerosis in SOD1 mice / R. Chen, N. Ende // J Med. - 2000. - V.31, №1-2. - P. 21-30.

48.Chen, B. Neuroprotective effect of grafting GDNF gene-modified neural stem cells on cerebral ischemia in rats / B. Chen, X.Q. Gao, C.X. Yang, S.K. Tan, Z.L. Sun, N.H. Yan, Y.G. Pang, M. Yuan, G.J. Chen, G.T. Xu, K. Zhang, Q.L.Yuan // Brain Res. - 2009. - V. 1284. - P. 1-11.

49.Chen, C.T. Infusion of human umbilical cord blood cells ameliorates hind limb dysfunction in experimental spinal cord injury through antiinflammatory, vasculogenic and neurotrophic mechanisms / C.T. Chen, N.H. Foo, W.S. Liu, S.H. Chen // Pediatr Neonatol. - 2008. - V. 49, № 3. -P. 77-83.

50.Chen, J. Cell adhesion molecule 11-transfected embryonic stem cells with enhanced survival support regrowth of corticospinal tract axons in mice after spinal cord injury / J. Chen, C. Bernreuther, M. Dihne, M. Schachner // J Neurotrauma. - 2005. - V. 22, № 8. - P. 896-906.

51.Chen, J. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats / J. Chen, P.R. Sanberg, Y. Li, L. Wang, M. Lu, A.E. Willing, J. Sanchez-Ramos, M. Chopp // Stroke. -2001. - V. 32, № 11. - P. 2682-2688.

52.Cheng, H. Neuroprotection of glial cell line-derived neurotrophic factor in damaged spinal cords following contusive injury / H. Cheng, J.P. Wu, S.F. Tzeng // J Neurosci Res. - 2002. - V. 69, № 3. - P. 397-405.

53.Chi, G.F. Schwann cells differentiated from spheroid-forming cells of rat subcutaneous fat tissue myelinate axons in the spinal cord injury / G.F. Chi, M.R. Kim, D.W. Kim, M.H. Jiang, Y. Son // Exp Neurol. - 2010. - V. 222, №2.-P. 304-317.

54.Choi, B.H. A hypoxia-inducible gene expression system using erythropoietin 3' untranslated region for the gene therapy of rat spinal cord injury / B.H. Choi, Y. Ha, C.H. Ahn, X. Huang, J.M. Kim, S.R. Park, H. Park, H.C. Park, S.W. Kim, M. Lee // Neurosci Lett. - 2007. - V. 412, № 2. -P. 118-122.

55.Chong, L.D. Fibroblast growth factor receptor-mediated rescue of x-ephrin Bl-induced cell dissociation in Xe№pus embryos / L.D. Chong, E.K. Park, E. Latimer, R. Friesel, I.O. Daar // Mol Cell Biol. - 2000. - V. 20, № 2. -P. 724-734.

56.Chua, S.J. The effect of umbilical cord blood cells on outcomes after experimental traumatic spinal cord injury / S.J. Chua, R. Bielecki, N. Yamanaka, M.G. Fehlings, I.M. Rogers, R.F. Casper // Spine. - 2010. - V. 35, № 16. -P. 1520-1526.

57.Chuah, M.I. and Teague, R. Basic fibroblast growth factor in the primary olfactory pathway: mitogenic effect on ensheathing cells // Neuroscience. -1999. - V. 88, № 4. - P. 1043-1050.

58.Chuah, M.I. Glial growth factor 2 induces proliferation and structural changes in ensheathing cells / M.I. Chuah, J. Cossins, E. Woodhall, R.Tennent, G. Nash, A.K. West // Brain Res. - 2000. - V. 857, № 1-2. -P. 265-274.

59.Colella, P. AAV-mediated gene supply for treatment of degenerative and neovascular retinal diseases / P. Colella, A. Auricchio // Curr Gene Ther. -

2010. - V. 10, № 5. _ p. 371-380.

öO.Cummings, B.J. Human neural stem cells differentiate and promote locomotor recovery in spinal cord-injured mice / B.J. Cummings, N. Uchida, S.J. Tamaki, D.L. Salazar, M. Hooshmand, R. Summers, F.H. Gage, A.J. Anderson // Proc Natl Acad Sei USA.- 2005. - V. 102, № 39. -P. 14069-14074.

öl.Darian-Smith, C. Synaptic plasticity, neurogenesis, and functional recovery after spinal cord injury // Neuroscientist. - 2009. - V. 15, № 2. - P. 149-165.

62.Dasari, V.R. Umbilical cord blood stem cell mediated downregulation of fas improves functional recovery of rats after spinal cord injury / V.R. Dasari, D.G. Spomar, L. Li, M. Gujrati, S.J. Rao, D.H. Dinh // Neurochem Res. -2008.-V. 33, № l.-P. 134-149.

63.Dasari, V.R. Neuronal apoptosis is inhibited by cord blood stem cells after spinal cord injury / V.R. Dasari, K.K. Veeravalli, A.J. Tsung, C.S. Gondi, M. Gujrati, D.H. Dinh, J.S. Rao // J. Neurotrauma. - 2009. - V. 26, № 11. -P. 2057-2069.

64.De Laporte, L. Vascular endothelial growth factor and fibroblast growth factor 2 delivery from spinal cord bridges to enhance angiogenesis following injury / L. De Laporte, A. Rieux, H.M. Tuinstra // J Biomed Mater Res. -

2011. - V. 98, № 3. - P. 372-382.

65.Dezawa, M. Marrow stromal cells: implications in health and disease in the nervous system / M. Dezawa, M. Hoshino, Y. Nabeshima, C. Ide // Curr Mol Med. - 2005. - V. 5, № 7. - P. 723-732.

66.Eftekharpour, E. Current status of experimental cell replacement approaches to spinal cord injury / E. Eftekharpour, S. Karimi-Abdolrezaee, M.G. Fehlings // Neurosurg Focus. - 2008. - V. 24, № 3-4. - P. 1-13.

67.Ek, C.J. Pathological changes in the white matter after spinal contusion injury in the rat / C.J. Ek, M.D. Habgood, R. Dennis, K.M. Dziegielewska, C. Mallard, B. Wheaton, N.R. Saunders // PLoS One. - 2012. - V. 7, № 8. -P. 1-13.

68.Ekdahl, C.T. Brain inflammation and adult neurogenesis: the dual role of microglia / C.T. Ekdahl, Z. Kokaia, O. Lindvall // Neuroscience. - 2009. -V. 158, №3.-P. 1021-1029.

69.Ende, N. Human umbilical cord blood effect on sod mice (amyotrophic lateral sclerosis) / N. Ende, F. Weinstein, R. Chen, M. Ende // Life Sci. - 2000. -V. 67, № 1. - P.53-59.

70.Facchiano, F. Promotion of regeneration of corticospinal tract axons in rats with recombinant vascular endothelial growth factor alone and combined with ade№virus coding for this factor / F. Facchiano, E. Fernandez, S. Mancarella, G. Maira, M. Miscusi, D. D'Arcangelo, G. Cimino-Reale, M.L. Falchetti, M.C. Capogrossi, R. Pallini // J Neurosurg. - 2002. - V. 97, № l.-P. 161-168.

71.Fahmy, G.H. Fgf-2 in astroglial cells during vertebrate spinal cord recovery / G.H. Fahmy, M.Z. Moftah // Front Cell Neurosci. - 2010. - V. 4, № 4. -P. 1-9.

72.Fawcett, J. W. The glial scar and central nervous system repair / J. W. Faw-cett, R. A. Asher // Brain Res Bull. - 1999. - V. 49, № 6. - P. 377-391.

73.Feng, S.Q. Treatment of spinal cord injury with co-grafts of genetically modified Schwann cells and fetal spinal cord cell suspension in the rat / S.Q. Feng, X.H. Kong, S.F. Guo, P. Wang, L. Li, J.H. Zhong, X.F. Zhou // Neurotox Res. - 2005. - V. 7, № 1-2. - P. 169-177.

74.Fitch, M.T. Cellular and molecular mechanisms of glial scarring and progressive cavitation: in vivo and in vitro analysis of inflammation-induced secondary injury after CNS trauma / M.T. Fitch, C. Doller, C.K. Combs,

G.E. Landreth, J. Silver // J Neurosci. - 1999. - V. 19, № 19. -P. 8182-8198.

75.Franklin, R.J. Do olfactory glia have advantages over Schwann cells for CNS repair? / R.J. Franklin, S.C. Barnett // J Neurosci Res. - 1997. - V. 50, № 5. - P.665-672.

76.Franklin, R.J. What roles do growth factors play in CNS remyelination? / R.J. Franklin, G.L. Hinks, R.H. Woodruff, M.T. O'Leary // Prog Brain Res. -2001.-V. 132.-P. 185-193.

77.Frostick, S.P. Schwann cells, neurotrophic factors, and peripheral nerve regeneration / S.P. Frostick, Q. Yin, G.J. Kemp // Microsurgery. - 1998. -V. 18, №7.-P. 397-405.

78.Fu, C.Favorable effect of local VEGF gene injection on axonal regeneration in the rat sciatic nerve / C. Fu, G. Hong, F. Wang // J Huazhong Univ Sci Tech№log Med Sci. - 2007. - V. 27, № 2. - P. 186-189.

79.Fujieda, Y. Metabolite profiles correlate closely with neurobehavioral function in experimental spinal cord injury in rats / Y. Fujieda, S. Ueno, R. Ogi-no, M. Kuroda, T.J. Jonsson, L. Guo, T. Bamba, E. Fukusaki // PLoS One. -2012.-V. 7, №8.-P. 1-8.

80.Funakoshi, H. Differential expression of mRNAs for neurotrophins and their receptors after axotomy of the sciatic nerve / H. Funakoshi, J. Frisen, G. Barbany, T. Timmusk, O. Zachrisson, V.M. Verge, H. P. Verge // J Cell Biol. - 1993. - V. 123, № 2. - P. 455-465.

81.Garbuzova-Davis, S. Human umbilical cord blood treatment in a mouse model of ALS: optimization of cell dose / S. Garbuzova-Davis, C.D. San-berg, N. Kuzmin-Nichols, A.E. Willing, C. Gemma, P.C. Bickford, C. Miller, R. Rossi, P.R. Sanberg // PLoS One. - 2008. - V. 3, № 6. - P. 1-14.

82.Garbuzova-Davis, S. Intravenous administration of human umbilical cord blood cells in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis: distribution, migration, and differentiation / S. Garbuzova-Davis, A.E. Willing, T. Zigo-

va, S. Saporta, et al. // J Hematother Stem Cell Res. - 2003. - V.12, № 3. -P. 255-70.

83.Girard, C. Grafts of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin 3-transduced primate Schwann cells lead to functional recovery of the demye-linated mouse spinal cord / C. Girard, A.P. Bemelmans, N. Dufour, J. Mallet, C. Bachelin, B. Nait-Oumesmar, A. Baron-Van Evercooren,

F. Lachapelle // J Neurosci. - 2005. - V. 25, № 35. - P. 7924-7933.

84.Gluckman, E. Umbilical cord blood transplants / E.Gluckman, F. Locatelli // Curr Opin Hematol. - 2000. - V. 7, № 6. - P.353-357.

85.Gorrie, C.A. Effects of human OEC-derived cell transplants in rodent spinal cord contusion injury / C.A. Gorrie, I. Hayward, N. Cameron,

G. Kailainathan, N. Nandapalan, R. Sutharsan, J. Wang, A. Mackay-Sim, P.M. Waite // Brain Res. - 2010. - V. 1337. - P. 8-20.

86.Gris, P. Transcriptional regulation of scar gene expression in primary astrocytes / P. Gris, A. Tighe, D. Levin // Glia. - 2007. - V. 55. - P. 1145-1155.

87.Gronthos, S. Stem cell properties of human dental pulp stem cells / S. Gronthos, J. Brahim, W. Li, L.W. Fisher, N. Cherman, A. Boyde, P. DenBesten, P.G. Robey S. Shi // J Dent Res. - 2002. - V. 81, № 8. -P. 531-535.

88.Grumbles, R.M. Neurotrophic factors improve motoneuron survival and function of muscle reinnervated by embryonic neurons / R.M. Grumbles, S. Sesodia, P.M.Wood, C.K. Thomas // J Neuropathol Exp Neurol. - 2009. -V. 68, № 7. - P. 736-746.

89.Gruner, J.A. A monitored contusion model of spinal cord injury in the rat // J Neurotrauma. - 1992. - V. 9, № 2. - P. 123-126.

90.Guo, J.S. Cotransplant of neural stem cells and NT-3 gene modified Schwann cells promote the recovery of transected spinal cord injury / J.S. Guo, Y.S. Zeng, H.B. Li, W.L. Huang, R.Y. Liu, X.B. Li, Y. Ding, L.Z. Wu, D.Z. Cai // Spinal Cord. - 2007. - V. 45, № 1. - P. 15-24.

91.Haastert, K. The effects of FGF-2 gene therapy combined with voluntary exercise on axonal regeneration across peripheral nerve gaps / K. Haastert, Z. Ying, C. Grothe // Neurosci Lett. - 2008. - V. 443, № 3. - P. 179-183.

92.Hagg, T. Collateral sprouting as a target for improved function after spinal cord injury // Neurotrauma. - 2006. V. 23. - P. 281-294.

93.Hagg, T. Intracerebral infusion of neurotrophic factors // Methods Mol Biol. - 2007. - V. 399.-P. 167-180.

94.Han, H. A novel basic fibroblast growth factor delivery system fabricated with heparin-incorporated fibrin-fibronectin matrices for repairing rat sciatic nerve disruptions / H. Han, Q. Ao, G. Chen, S. Wang, H. Zuo // Biotechnol Lett. - 2010. - V. 32, № 4. - P. 585-591.

95.Han, S.S. Transplantation of glial-restricted precursor cells into the adult spinal cord: survival, glialspecific differentiation, and preferential migration in white matter / S.S. Han, Y. Liu, C. Tyler-Polsz, M.S. Rao, I. Fischer // Glia. -2004. - V. 45.-P. 1-16.

96.Haninec, P. Enhancement of musculocutaneous nerve reinnervation after vascular endothelial growth factor (VEGF) gene therapy / P. Haninec, R. Kaiser, V. Bobek, P. Dubovy // BMC Neurosci. - 2012. - V. 13, № 57. -P.1-11.

97.Hartmann, C. and von Deimling, A. Molecular pathology of oligodendrogli-al tumors // Recent Results Cancer Res. - 2009. - V. 171. - P. 25-49.

98.Hellstrom, M. Lack of pericytes leads to endothelial hyperplasia and abnormal vascular morphogenesis / M. Hellstrom, H. Gerhardt, M. Kalen, X. Li, U. Eriksson, H. Wolburg, C. Betsholtz // J Cell Biol. - 2001. -V. 153. -P. 543-553.

99.Hendricks, W.A. Predifferentiated embryonic stem cells prevent chronic pain behaviors and restore sensory function following spinal cord injury in mice / W.A. Hendricks, E.S. Pak, J.P. Owensby, K.J. Menta, M. Glazova,

J. Moretto, S. Hollis, K.L. Brewer, A.K. Murashov // Mol Med. - 2006. -V. 12, № 1-3.-P. 34-46.

100. Hendriks, W.T. Viral vector-mediated gene transfer of neurotrophins to promote regeneration of the injured spinal cord / W.T. Hendriks, M.J. Ruitenberg, B. Blits, G.J. Boer, J. Verhaagen // Prog Brain Res. - 2004. -V. 146.-P. 451-476.

101. Hernández, J. Adult stem cell transplants for spinal cord injury repair: current state in preclinical research / J. Hernández, A. Torres-Espin, X. Navarro // Curr Stem Cell Res Ther. - 2011. - V. 6, № 3. - P. 273-287.

102. Herrera, J.J. Sustained expression of vascular endothelial growth factor and angiopoietin-1 improves blood-spinal cord barrier integrity and functional recovery after spinal cord injury / J.J. Herrera, L.M. Sundberg, L. Zentilin // J Neurotrauma. - 2010. - Vol. 27, № 11. - P. 2067-2076.

103. Heumann, R. Differential regulation of mRNA encoding nerve growth factor and its receptor in rat sciatic nerve during development, degeneration, and regeneration: role of macrophages / R. Heumann, D. Lindholm, C. Bandtlow, M. Meyer, M.J. Radeke, T.P. Misko, E. Shooter, H.Thoenen // Proc Natl Acad Sci USA. - 1987. - V. 84, № 23. - P. 8735-8739.

104. Hill, C.E. Acute transplantation of glial-restricted precursor cells into spinal cord contusion injuries: survival, differentiation, and effects on lesion environment and axonal regeneration / C.E. Hill, C. Proschel, M. Noble, M. Mayer-Proschel, J.C. Gensel, M.S. Beattie, J.C. Bresnahan // Exp Neurol. - 2004. - V. 190, № 2. - P. 289-310.

105. Hill, C.E. Labeled Schwann cell transplantation: cell loss, host Schwann cell replacement, and strategies to enhance survival / C.E. Hill, L.D. Moon, P.M. Wood, M.B. Bunge // Glia. - 2006. - V. 53, № 3. -P. 338-343.

106. Hofstetter, C.P. Allodynia limits the usefulness of intraspinal neural stem cell grafts; directed differentiation improves outcome / C.P. Hofstetter,

N.A. Holmstrom, J.A. Lilja, P. Schweinhardt, J. Hao, C. Spenger, Z. Wiesenfeld-Hallin, S.N. Kurpad, J. Frisen, L. Olson // Nat Neurosci. -2005. - V. 8, № 3. - P. 346-353.

107. Hofstetter, C.P. Marrow stromal cells form guiding strands in the injured spinal cord and promote recovery / C.P. Hofstetter, E.J. Schwarz, D. Hess, J. Widenfalk, A. El Manira, D.J. Prockop, L. Olson // Proc Natl Acad_Sci USA. - 2002. - V. 99, № 4. - P. 2199-2204.

108. Höke, A. In search of №vel treatments for peripheral neuropathies and nerve regeneration / A. Höke, R. Mi // Discov. Med. - 2007. - V. 39, № 7. -P. 109-112.

109. Hollis, E.R. Neurotrophins: potential therapeutic tools for the treatment of spinal cord injury / E.R. Hollis, M.H. Tuszynski // Neurotherapeu-tics. - 2011. - V. 8, №4.-P. 694-703.

110. Honmou, O. Restoration of Normal conduction properties in demyeli-nated spinal cord axons in the adult rat by transplantation of exogenous Schwann cells / O. Honmou, P.A. Felts, S.G. Waxman, J.D. Kocsis // J Neurosci. - 1996. - V. 16, № 10.-P. 3199-3208.

111. Hutson, T.H. Corticospinal tract transduction: a comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector / T.H. Hutson, J. Verhaagen, R.J. Yânez-Munoz, L.D. Moon // Gene Ther. - 2012. - V. 19, № l.-P. 49-60.

112. Hwang, D.H. Transplantation of human neural stem cells transduced with 01ig2 transcription factor improves locomotor recovery and enhances myelination in the white matter of rat spinal cord following contusive injury / D.H. Hwang, B.G. Kim, E.J. Kim, S.I. Lee, I.S. Joo, H. Suh-Kim, S. Sohn, S.U. Kim//BMC Neurosci.-2009.-V. 10.-P. 1-16.

113. Iannotti, C. Glial cell line-derived neurotrophic factor-enriched bridging transplants promote propriospinal axonal regeneration and enhance mye-

lination after spinal cord injury / C. Iannotti, H. Li, P. Yan, X. Lu, L. Wirth-lin, X.M. Xu // Exp Neurol. - 2003. - V. 183, № 2. - P. 379-393.

114. Ikeda, Y. Development of angiogenic cell and gene therapy by transplantation of umbilical cord blood with vascular endothelial growth factor gene / Y. Ikeda, N. Fukuda, M. Wada, T. Matsumoto, A. Satomi, S. Yokoyama, S. Saito, K. Matsumoto, K. Kanmatsuse, H. Mugishima // Hypertens Res. - 2004. - V. 27, № 2. - P. 119-128.

115. Islamov, R.R. Induction of VEGF and its Fit—1 receptor after sciatic nerve crush injury / R.R. Islamov, V. Chintalgattu, E.S. Pak, L.C. Katwa, A.K. Murashov // Neuroreport. - 2004. - V. 15, № 13. - P. 2117-2121.

116. Iwase, T. Glial cell line-derived neurotrophic factor-induced signaling in Schwann cells / T. Iwase, C.G.Jung, H. Bae, M. Zhang, B. Soliven // J Neurochem. - 2005. - V. 94, № 6. - P. 1488-1499.

117. Jakovcevski, I. Glial scar expression of CHL1, the close homolog of the adhesion molecule LI, limits recovery after spinal cord injury /1. Jakovcevski, J.Wu, N.Karl, I. Leshchyns'ka, V. Sytnyk, J. Chen, A. Irintchev, M.Schachner // J Neurosci. - 2007. - V. 27, № 27. - P. 7222-7233.

118. Jasmin, L. Schwann cells are removed from the spinal cord after effecting recovery from paraplegia / L. Jasmin, G. Janni, T.M. Moallem, D.A. Lappi, P.T. Ohara // J Neurosci. - 2000. - V. 20, № 24. - P.9215-9223.

119. Jean, I. Neurotrophin-3 specifically increases mature oligodendrocyte population and enhances remyelination after chemical demyelination of adult rat CNS /1. Jean, C. Lavialle, A. Barthelaix-Pouplard, C. Fressinaud // Brain Res.-2003.-V. 972, № 1-2.-P. 110-118.

120. Jeffery, N.D. Behavioural consequences of oligodendrocyte progenitor cell transplantation into experimental demyelinating lesions in the rat spinal cord / N.D. Jeffery, A.J. Crang, M.T. O'Leary, S.J. Hodge, W.F. Blakemore//Eur J Neurosci.- 1999,- Vol. 11.-P. 1508-1514.

121. Jendelova, P. Magnetic resonance tracking of transplanted bone marrow and embryonic stem cells labeled by iron oxide nanoparticles in rat brain and spinal cord / P. Jendelova, V. Herynek, L. Urdzikova, K. Glogaro-va, J. Kroupova, B. Andersson, V. Bryja, M. Burian, M. Hajek, E.Sykova // J Neurosci Res. - 2004. - V. 76, № 2. - P. 232-243.

122. Jessen, K.R. The origin and development of glial cells in peripheral nerves / K.R. Jessen, R. Mirsky // Neuroscience. - 2005. - V. 6. -P. 671-682.

123. Jimenez Hamann, M.C. Injectable intrathecal delivery system for localized administration of EGF and FGF-2 to the injured rat spinal cord / M.C. Jimenez Hamann, C.H. Tator, M.S. Shoichet // Exp Neurol. - 2005. -V. 194, № l.-P. 106-119.

124. Jin, H. Role of the oxygen-dependent degradation domain in a hypoxia-inducible gene expression system in vascular endothelial growth factor gene therapy / H. Jin, M.L. Liu , H.A. Kim, M. Lee, S. An, J. Oh, J. Cho, S. Yi, K. Kim, D. Yoon, Y. Ha // Spine. - 2009. - V. 34, № 26. -P. 952-958.

125. Johansson, C.B. Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system / C.B. Johansson, S. Momma, D.L. Clarke, M. Risling, U. Lendahl, J. Frisen // Cell. - 1999. - V. 96, № 1. - P. 25-34.

126. Johnson, E.M. Expression and possible function of nerve growth factor receptors on Schwann cells / E.M. Johnson, M. Taniuchi, P.S. DiStefano // Trends Neurosci. - 1988. - V. 11, № 7. - P. 299-304.

127. Jones, L.L. Neurotrophic factors, cellular bridges and gene therapy for spinal cord injury / L.L. Jones, M. Oudega, M.B. Bunge, M.H.Tuszynski // J Physiol.-2001.-V. 533, № l.-P. 83-89.

128. Jordan, E.T. Optimizing electroporation conditions in primary and other difficult-to-transfect cells / E.T. Jordan, M. Collins, J. Terefe, L. Ugozzoli, et al. // J Biomol Tech. - 2008. - V. 19, № 5. - P.328-334.

129. Jordan, P.M. Generation of spinal motor neurons from human fetal brain-derived neural stem cells: role of basic fibroblast growth factor / P.M. Jordan, L.D. Ojeda, J.R. Thonhoff, J. Gao, D. Boehning, Y. Yu, P. Wu // J Neurosci Res. - 2009. - V. 87, № 2. - P. 318-332.

130. Kafitz, K.W. Role of laminin in axonal extension from olfactory receptor cells / K.W. Kafitz, C.A. Greer // J Neurobiol. - 1997. - V. 32, № 3. -P. 298-310.

131. Kalincik, T. Selected changes in spinal cord morphology after T4 transection and olfactory ensheathing cell transplantation / T. Kalincik, K. Jozefcikova, R. Sutharsan, A. Mackay-Sim, P. Carrive, P.M.Waite // Au-ton Neurosci.-2010.-V. 158, № 8.-P. 31-38.

132. Kao, C.H. Exogenous administration of glial cell line-derived neurotrophic factor improves recovery after spinal cord injury / C.H. Kao, S.H. Chen, C.C. Chio, C.K. Chang, M.T. Lin // Resuscitation. - 2008. -V. 77, №3,-P. 395-400.

133. Karamouzian, S. Clinical safety and primary efficacy of bone marrow mesenchymal cell transplantation in subacute spinal cordinjured patients / S. Karamouzian, S.N. Nematollahi-Mahani, N. Nakhaee, H. Eskandary // Clin Neurol Neurosurg. - 2012. - V. 114, № 7. - P. 935-939.

134. Kawano, H. Role of the lesion scar in the response to damage and repair of the central nervous system / H. Kawano, J. Kimura-Kuroda, Y. Komuta, N. Yoshioka, H.P. Li, K. Kawamura, Y. Li, G. Raisman // Cell Tissue Res. - 2012. - V. 349. - P. 169-180.

135. Keirstead, H.S. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury / H.S. Keirstead, G. Nistor, G. Bernai, M. Totoiu, F. Cloutier, K.(Sharp, O. Steward // J Neurosci. - 2005. - V.25, № 19. - P. 4694-4705.

136. Kerkis, I. Early transplantation of human immature dental pulp stem cells from baby teeth to golden retriever muscular dystrophy (GRMD) dogs:

Local or systemic? / I. Kerkis, C.E. Ambrosio, A. Kerkis, D.S. Martins, E. Zucconi, S.A. Fonseca, R.M. Cabrai, C.M. Maranduba, T.P. Gaiad, A.C. Morini, N.M. Vieira, M.P. Brolio, O.A. Sant'Anna, M.A. Miglino, M. Zatz // J Transi Med. - 2008. - V. 6, №. - P. 1-13.

137. Kerr, D.A. Human embryonic germ cell derivatives facilitate motor recovery of rats with diffuse motor neuron injury / D.A. Kerr, J. Liado, M.J.-Shamblott // Neurosci. - 2003. - V. 23, № 12. - P. 5131-5140.

138. Key, B. Expression and localization of FGF-1 in the developing rat olfactory system / B. Key, H.B. Treloar, L. Wangerek, M.D. Ford, V. Nur-combe // J Comp Neurol. - 1996. - V. 366, № 2. - P. 197-206.

139. Kim, H.M. Ex vivo VEGF delivery by neural stem cells enhances proliferation of glial progenitors, angiogenesis, and tissue sparing after spinal cord injury / H.M. Kim, D.H. Hwang, J.E. Lee, S.U. Kim, B.G. Kim // PLoS One. - 2009. - V. 4, № 3. _ p. MO.

140. Kim, K.N. Effect of human mesenchymal stem cell transplantation combined with growth factor infusion in the repair of injured spinal cord / K.N. Kim, S.H. Oh, K.H. Lee, D.H. Yoon // Acta Neurochir Suppl. - 2006. -V. 99-P. 133-136.

141. Kocsis, J.D. Cell transplantation of peripheral-myelin-forming cells to repair the injured spinal cord / J.D. Kocsis, Y. Akiyama, K.L. Lankford, C. Radtke // J Rehabil Res Dev. - 2002. - V. 39, № 2. - P. 287-298.

142. Koda, M. Adenovirus vector-mediated in vivo gene transfer of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) promotes rubrospinal axonal regeneration and functional recovery after complete transection of the adult rat spinal cord / M. Koda, M. Hashimoto, M. Murakami // J. Neurotrauma. - 2004. -V. 21, №3,-P. 329-337.

143. Kojima, A. Intrathecal administration of epidermal growth factor and fibroblast growth factor 2 promotes ependymal proliferation and functional

recovery after spinal cord injury in adult rats / A. Kojima, C.H. Tator // J Neurotrauma. - 2002. - V. 19, № 2. - P. 223-238.

144. Kuh, S.U. Functional recovery after human umbilical cord blood cells transplantation with brain-derived neutrophic factor into the spinal cord injured rat / S.U. Kuh, Y.E. Cho, D.H. Yoon, K.N. Kim, Y. Ha // Acta Neuro-chir (Wien). - 2005. - V. 147, № 9. - P. 985-992.

145. Kumar, S. NT-3-mediated TrkC receptor activation promotes proliferation and cell survival of rodent progenitor oligodendrocyte cells in vitro and in vivo / S. Kumar, M.A. Kahn, L. Dinh, J. de Vellis // J Neurosci Res. -1998. - V. 54, № 6. - P. 754-765.

146. Kusano, K. Transplanted neural progenitor cells expressing mutant NT3 promote myelination and partial hindlimb recovery in the chronic phase after spinal cord injury / K. Kusano, M. Enomoto, T. Hirai, P. Tsoulfas, S. Sotome, K. Shinomiya, A. Okawa // Biochem Biophys Res Commun. -2010. - V. 393, № 4. - P. 812-817

147. Kwak, E.K. The role of inducible nitric oxide synthase following spinal cord injury in rat / E.K. Kwak, J.W. Kim, K.S. Kang, Y.H. Lee, Q.H. Hua, T.I. Park, J.Y. Park, Y.K. Sohn // J. Korean Med Sei. - 2005. -V. 20.-P. 663-669.

148. Lammertse, D. Guidelines for the conduct of clinical trials for spinal cord injury as developed by the ICCP panel: clinical trial design / D. Lammertse, M.H. Tuszynski, J.D. Steeves, A. Curt, J.W. Fawcett, C. Rask, J.F. Ditunno, M.G. Fehlings, J.D. Guest, P.H. Ellaway, N. Kleitman, A.R. Blight, B.H. Dobkin, R. Grossman, H. Katoh, A. Privat, M.Kalichman // Spinal Cord. - 2007. - V. 45, № 3. - P. 232-242.

149. Lavdas, A.A. Schwann cell transplantation for CNS repair / A.A. Lavdas, F. Papastefanaki, D. Thomaidou, R. Matsas // Curr Med Chem. - 2008. - V. 15, №2.-P. 151-160.

150. Lazarov-Spiegler, O. Transplantation of activated macrophages overcomes central nervous system regrowth failure / O. Lazarov-Spiegler, A.S. Solomon, A.B. Zeev-Brann, D.L. Hirschberg, V. Lavie, M. Schwartz // FASEB J. - 1996.-V. 10.-P. 1296-1302.

151. Ledley F.D. Pharmaceutical approach to somatic gene therapy // PharmRes. - 1996.-V. 13, № 11. - P.1595-1614.

152.. . Lee, J.H. Schwann cell-like remyelination following transplantation of human umbilical cord blood (hUCB)-derived mesenchymal stem cells in dogs with acute spinal cord injury / J.H. Lee, W.H. Chung, E.H. Kang, D.J. Chung, C.B. Choi, H.S. Chang, J.H. Lee, S.H. Hwang, H. Han, B.Y. Choe, H.Y Kim // Journal of the Neurological Sciences. - 2011. - V. 300. -P. 86-96.

153. Lee, J.K. Role of myelin-associated inhibitors in axonal repair after spinal cord injury / J.K. Lee, B. Zheng // Exp Neurol. - 2012. -V. 235, № 1. -P. 33-42.

154. Lee, M. Ischemic injury-specific gene expression in the rat spinal cord injury model using hypoxia-inducible system / M. Lee, E.S. Lee, Y.S. Kim, B.H. Choi, S.R. Park, H.S. Park, H.C. Park, S.W. Kim, Y. Ha // Spine (Phila Pa 1976). - 2005. - V. 30, № 24. - P. 2729-2734.

155. Ley, C.D. Angiogenic synergy of bFGF and VEGF is antagonized by Angiopoietin-2 in a modified in vivo Matrigel assay / C.D. Ley, M.W. Olsen, E.L.Lund // Microvasc Res. - 2004. - V. 68, № 3. -P. 161-168.

156. Li, Y. Transplanted Schwann cells, Not olfactory ensheathing cells, myelinate optic nerve fibres / Y. Li, D. Li, G. Raisman // Glia. - 2007. -V. 55, №3.-P. 312-316.

157. Lindahl, P. Pericyte loss and microaneurysm formation in PDGF-B deficient mice / P. Lindahl, B. Johansson, P. Leveen, C. Betsholtz // Science. - 1997. - V. 277. - P. 242-245.

158. Loane, D.J. Role of microglia in neurotrauma / D.J. Loane, K.R. Byrnes // Neurotherapeutics. - 2010. - V. 7. - P. 366-377.

159. Louro, J. Stem and progenitor cell therapies: recent progress for spinal cord injury repair / J. Louro, D.D. Pearse // Neurol Res. - 2008. - V. 30, № l.-P. 5-16.

160. Lu, P. Growth factors and combinatorial therapies for CNS regeneration / P. Lu, M. H. Tuszynski // Experimental neurology. - 2008. - V. 209. -P. 313-320

161. Lu, K.W. Protective effect of liposomemediated glial cell line-derived neurotrophic factor gene transfer in vivo on motoneurons following spinal cord injury in rats / K.W. Lu, Z.Y. Chen, T.S. Hou // Chin J Traumatol. -2004. - V. 7, № 5. - P. 275-279.

162. Lu, P. Olfactory ensheathing cells do №t exhibit unique migratory or axonal growth-promoting properties after spinal cord injury / P. Lu, H.Yang, M. Culbertson, L. Graham, A.J. Roskams, M.H. Tuszynski // J Neurosci. - 2006. - V. 26, № 43. - P. 11120-11130.

163. Lundberg, J. Endovascular transplantation of stem cells to the injured rat CNS / J. Lundberg, K. Le Blanc, M. Soderman, T. Andersson, S. Holmin // Neuroradiology. - 2009. - V. 51, № 10. - P. 661-667.

164. Lutton, C. Combined VEGF and PDGF treatment reduces secondary degeneration after spinal cord injury / C. Lutton, Y.W. Young, R. Williams, A.C. Meedeniya, A. Mackay-Sim, B. Goss // J Neurotrauma. - 2012. -V. 29, №5.-P. 957-970.

165. Maatkamp, A. Decrease of Hsp25 protein expression precedes degeneration of motoneurons in ALS-SOD1 mice / A. Maatkamp, A. Vlug, E. Haasdijk, D. Troost, P.J. French, D. Jaarsma // Eur J Neurosci. - 2004. -V. 20, № l.-P. 14-28.

166. Mackenzie, F. Diverse roles for VEGF-A in the nervous system / F. Mackenzie, C. MacRuhrberg // Development. - 2012. - V. 139, № 8. -P. 1371-1380.

167. Madri, J.A. Modeling the neurovascular niche: implications for recovery from CNS injury // J Physiol Pharmacol. - 2009. - V. 60, № 4. -P. 6095-6104.

168._ _ Magnuson, D.S. Comparing deficits following excitotoxic and contusion injuries in the thoracic and lumbar spinal cord of the adult rat / D.S. Magnuson, T.C. Trinder, Y.P. Zhang et al. // Exp Neurol. - 1999. -V. 156.-P. 191-204.

169. Maness, P.F. Neural recognition molecules of the immunoglobulin superfamily: signaling transducers of axon guidance and neuronal migration / P.F. Maness, M. Schachner // Nat Neurosci. - 2007. - V. 10, № 1. -P. 19-26.

170. Martens, D.J. In vivo infusions of exoge№us growth factors into the fourth ventricle of the adult mouse brain increase the proliferation of neural progenitors around the fourth ventricle and the central canal of the spinal cord / D.J. Martens, R.M. Seaberg, D. van der Kooy // Eur J Neurosci. -2002. - V. 16, № 6. - P. 1045-1057.

171. Matyash, V. Heterogeneity in astrocyte morphology and physiology / V. Matyash, H. Kettenmann // Brain Res Rev. - 2010. - V. 63, № 1-2. -P. 2-10.

172. McDonald, J.W. Repair of the injured spinal cord and the potential of embryonic stem cell transplantation / J.W. McDonald, D. Becker, T.F. Holekamp, M.Howard, S. Liu, A. Lu, J. Lu, M.M. Platik, Y. Qu, T.Stewart, S. Vadivelu // J Neurotrauma. - 2004. - V. 21, № 4. -P. 383-393.

173. McTigue, D.M. Neurotrophin-3 and brain-derived neurotrophic factor induce oligodendrocyte proliferation and myelination of regenerating

axons in the contused adult rat spinal cord / D.M. McTigue, P.J. Horner,

B.T.Stokes, F.H.Gage // J Neurosci. - 1998. - V. 18, № 14. -P. 5354-5365.

174. Meier, C. Developing Schwann cells acquire the ability to survive without axons by establishing an autocrine circuit involving insulin-like growth factor, neurotrophin-3, and platelet-derived growth factor-BB /

C. Meier, E. Parmantier, A. Brennan, R. Mirsky, K.R. Jessen // J Neurosci. -1999. - V. 19, № 10. - P. 3847-3859.

175. Mills, C.D. GDNF selectively promotes regeneration of injury-primed sensory neurons in the lesioned spinal cord / C.D. Mills, A.J. Allchorne, R.S. Griffin, C.J. Woolf, M. Costigan // Mol Cell Neurosci. - 2007. - V. 36, №2.-P. 185-194.

176. Min, K.J. Spatial and temporal correlation in progressive degeneration of neurons and astrocytes in contusion-induced spinal cord injury / K.J. Min, H.K. Jeong, B. Kim, D.H. Hwang, H.Y. Shin, A.T. Nguyen, J.H. Kim, I. Jou, B.G. Kim, E.H. Joe // J Neuroinflammation. - 2012. - V. 9, № 100-P. 1-13.

177. Miragall, F. Expression of cell adhesion molecules in the olfactory system of the adult mouse: presence of the embryonic form of N-CAM / F. Miragall, G. Kadmon, M. Husmann, M. Schachner // Dev Biol. - 1988. -V. 129, №2.-P. 516-531.

178. Mitsui, T. Transplants of fibroblasts expressing BDNF and NT3 promote recovery of bladder and hindlimb function following spinal contusion injury in rats / T. Mitsui, I. Fischer, J.S. Shumsky, M.Murray // Exp Neurol. - 2005. - V. 194, №2. -P. 410-431.

179. Morsczeck, C. Isolation of precursor cells (PCs) from human dental follicle of wisdom teeth / C. Morsczeck, W. Götz, J. Schierholz, F. Zeilhofer, U. Kuhn, C. Mohl, C. Sippel, K.H. Hoffmann // Matrix Biol. -2005. - V. 24, № 2. - P. 155-165.

180. Murashov, A.K. Crosstalk between p38, Hsp25 and Akt in spinal motor neurons after sciatic nerve injury / A.K. Murashov, I.U. Haq, C. Hill, E. Park, M. Smith, X. Wang, X. Wang, D.J. Goldberg, D.J. Wolgemuth // Brain Res. Mol. - 2001. - V. 93, № 2. - P. 199-208.

181. Nagoshi, N. Schwann cell plasticity after spinal cord injury shown by neural crest lineage tracing / N. Nagoshi, S. Shibata, M. Hamanoue, Y. Ma-buchi, Y. Matsuzaki, Y. Toyama, M. Nakamura, H. Okano // Glia. — 2011. — V. 59, №5. -P. 771-784.

182. Nakajima, H. Rescue of rat anterior horn neurons after spinal cord injury by retrograde transfection of ade№virus vector carrying brain-derived neurotrophic factor gene / H. Nakajima, K. Uchida, S. Kobayashi // J. Neu-rotrauma. - 2007. - Vol. 24, № 4. - P. 703-712.

183. Narazaki, D.K. Spinal cord regeneration: the action of neurotrophin-3 in spinal cord injury in rats / D.K. Narazaki, T.E. Barros Filho, C.R. Oliveira, A.F. Cristante, A.S. Iutaka, R.M. Marcon, R.P. Oliveira // Clinics (Sao Paulo). - 2006. - V. 61, № 5. - P. 453-460.

184. Natsume, A. Enhanced functional recovery after proximal nerve root injury by vector-mediated gene transfer / A. Natsume, D. Wolfe, J. Hu, S. Huang, V. Puskovic, J.C. Glorioso, D.J. Fink, M. Mata // Exp. Neurol. -2003. - V. 184, № 2. - P. 878-886.

185. Naveilhan, P. Differential regulation of mRNAs for GDNF and its receptors Ret and GDNFR alpha after sciatic nerve lesion in the mouse / P. Naveilhan, W.M. ElShamy, P. Ernfors // Eur J Neurosci. - 1997. - V. 9, №7.-P. 1450-1460.

186. Nishio, Y. The use of hemopoietic stem cells derived from human umbilical cord blood to promote restoration of spinal cord tissue and recovery of hindlimb function in adult rats / Y. Nishio, M. Koda, T. Kamada, Y.Someya, K. Yoshinaga, S. Okada, H. Harada, A. Okawa, H. Moriya, M. Yamazaki // J Neurosurg Spine. - 2006. - V. 5, № 5. - P. 424-433.

187. Nosrat, I.V. Dental pulp cells produce neurotrophic factors, interact with trigeminal neurons in vitro, and rescue motoneurons after spinal cord injury / I.V. Nosrat, J. Widenfalk, L. Olson, C.A. Nosrat // Dev Biol. - 2001. -V. 238, № l.-P. 120-132.

188. Nosrat, I.V. Dental pulp cells provide neurotrophic support for dopaminergic neurons and differentiate into neurons in vitro; implications for tissue engineering and repair in the nervous system / I.V. Nosrat, C.A. Smith, P. Mullally, L. Olson, C.A. Nosrat // Eur J Neurosci. - 2004. - V. 19, № 9. -P. 2388-2398.

189. Oudega, M. Schwann cell transplantation for repair of the adult spinal cord / X.M. Xu // J Neurotrauma. - 2006. - V. 23, № 3-4. - P.453-467.

190. Ouyang, H. Compression induces acute demyelination and potassium channel exposure in spinal cord / H. Ouyang, W. Sun, Y. Fu, J. Li, J.X. Cheng, E. Nauman, R. Shi // J Neurotrauma. - 2010. - V. 27, № 6. -P. 1109-1120.

191. Papastefanaki, F. Grafts of Schwann cells engineered to express PSA-NCAM promote functional recovery after spinal cord injury / F. Papastefanaki, J. Chen, A.A. Lavdas, D. Thomaidou, M. Schachner, R. Matsas // Brain. - 2007. - V. 130, № 8. - P. 2159-2174.

192. Park, D.H. Transplantation of umbilical cord blood stem cells for treating spinal cord injury / D.H. Park, J.H. Lee, C.V. Borlongan, P.R. San-berg, Y.G. Chung, T.H. Cho// Stem Cell Rev.- 201 l.-V. 7. - P. 181-194.

193. Pereira Lopes, F.R. Double gene therapy with granulocyte colony-stimulating factor and vascular endothelial growth factor acts synergistically to improve nerve regeneration and functional outcome after sciatic nerve injury in mice / F.R. Pereira Lopes, P.K. Martin, F. Frattini, A. Biancalana, F.M. Almeida, M.A. Tomaz, P.A. Melo, R. Borojevic, S.W. Han, A.M. Martinez // Neuroscience. - 2011. - V. 230. - P. 184-197.

194. Pfeifer, K. Adult neural progenitor cells provide a permissive guiding substrate for corticospinal axon growth following spinal cord injury / K. Pfeifer, M. Vroemen, A. Blesch, N. Weidner // Eur J Neurosci. - 2004. -V. 20, №7.-P. 1695-1704.

195. Pieri, I. Modulation of HSP25 expression during anterior horn motor neuron degeneration in the paralysé mouse mutant / I. Pieri, C. Cifuentes-Diaz, J.P. Oudinet // J. Neurosci. Res. - 2001. - V. 65, № 3. - P. 247-253.

196. Pineau, I. Proinflammatory cytokine synthesis in the injured mouse spinal cord: multiphasic expression pattern and identification of the cell types involved / I. Pineau, S. Lacroix // J Comp Neurol. - 2007. - V. 500. -P. 267-285.

197. Qiang, H. Neuroprotective effects of recombinant adeno-associated virus expressing vascular endothelial growth factor on rat traumatic spinal cord injury and its mechanism / H. Qiang, C. Zhang, Z. Shi, M. Ling // Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. - 2012. - V. 26, № 6. -P. 724-730.

198. Qu, W. Inhibition of EGFR/MAPK signaling reduces microglial inflammatory response and the associated secondary damage in rats after spinal cord injury / W. Qu, D. Tian, Z. Guo, J. Fang, Q. Zhang, Z. Yu, M. Xie, H. Zhang, J. Lii, W.Wang // Journal of Neuroinflammation. - 2012. - V. 9, № 178.-P. 1-14.

199. Rabchevsky, A.G. Therapeutic interventions following mammalian spinal cord injury / A.G. Rabchevsky, G.M. Smith // Arch Neurol. - 2001. -V. 5, №5.-P. 721-726.

200. Radtke, C. Potential of olfactory ensheathing cells for cell-based therapy in spinal cord injury / C. Radtke, M. Sasaki, K.L. Lankford // J. Rehabilitation Research & Development. - 2008. - V. 45, № 1. - P. 141-152.

201. Radtke, C. Remyelination of the Nonhuman primate spinal cord by transplantation of H-transferase transgenic adult pig olfactory ensheathing

cells / C. Radtke, Y. Akiyama, J. Brokaw, K.L. Lankford, K.Wewetzer, W.L. Fodor, J.D. Kocsis // FASEB J. - 2004. - V. 18, № 2. - P. 1-16.

202. Ramón-Cueto, A. Olfactory ensheathing glia: properties and function / A. Ramón-Cueto, J. Avila // Brain Res Bull. - 1998. -T.46, №3. -P. 175-187.

203. Rapalino, O. Implantation of stimulated homologous macrophages results in partial recovery of paraplegic rats / O. Rapalino, O. Lazarov-Spiegler, E. Agranov, G.J. Velan, E. Yoles, M. Fraidakis, A. Solomon, R. Gepstein, A. Katz, M. Belkin, M. Hadani, M. Schwartz // Nat Med. -1998.-V. 4, №7.-P. 814-821.

204. Rizvanov, A.A. Genetically modified human umbilical cord blood cells expressing vascular endothelial growth factor and fibroblast growth factor 2 differentiate into glial cells after transplantation into amyotrophic lateral sclerosis transgenic mice / A.A. Rizvanov, D.S. Guseva, I.I. Salafut-dinov, N.V. Kudryashova, F.V. Bashirov, A.P. Kiyasov, M.E. Yalvaç, I.M. Gazizov, M.S. Kaligin, F. Sahin, M.A. Mukhamedyarov, A. Palotás, R.R. Is-lamov // Exp Biol Med. - 2011. - V. 236, № 1. - P. 91-8.

205. Rizvanov, A.A. Human umbilical cord blood cells transfected with VEGF and L(1)CAM do not differentiate into neurons but transform into vascular endothelial cells and secrete neuro-trophic factors to support neu-ro-genesis-a novel approach in stem cell therapy / A.A. Rizvanov, A.P. Kiyasov, I.M. Gaziziov, T.S. Yilmaz, M.S. Kaligin, D.I. Andreeva, A.K. Shafigullina, D.S. Guseva, S.L. Kiselev, A. Palotas, R.R. Islamov // Neurochem Int. - 2008. - V. 53, № 6. - P. 389-394.

206. Rodrigues, L.P. Transplantation of mononuclear cells from human umbilical cord blood promotes functional recovery after traumatic spinal cord injury in Wistar rats / L.P. Rodrigues, D. Iglesias, F.C. Nicola, D. Steffens, L. Valentim, A. Witczak, G. Zanatta, M. Achaval, P. Pranke, C.A. Netto // Braz J Med Biol Res. - 2012. - V. 45, № 1. - P. 49-57.

207. Ronaghi, M. Challenges of Stem Cell Therapy for Spinal Cord Injury: Human Embryonic Stem Cells, Endogenous Neural Stem Cells, or Induced Pluripotent Stem Cells? / M. Ronaghi, S. Erceg, V. Moreno-Manzano, M. Stojkovic // Stem cells. - 2010. - V. 28. - P. 93-99.

208. Rosenstein J.M. Patterns of brain angiogenesis after vascular endothelial growth factor administration in vitro and in vivo / J.M. Rosenstein, N. Mani, W.F. Silverman, J.M. Krum // Proceeding of the national academy of sciences USA. - 1998. - V. 95, № 12.-P. 7086-7091.

209. Rossi, D. Astrocytic dysfunction: insights on the role in neurodegeneration / D. Rossi, A. Volterra // Brain Res Bull. - 2009. - V. 80, № 4-5. -P. 224-232.

210. Rossi, S.L. Histological and functional benefit following transplantation of motor neuron progenitors to the injured rat spinal cord / S.L. Rossi, G. Nistor, T. Wyatt, H.Z. Yin, A.J. Poole, J.H. Weiss, M.J. Gardener, S. Dijkstra, D.F. Fischer, H.S. Keirstead // PLoS One. - 2010. - V. 5, № 7. -P. 1-15.

211. Rothermundt, M. S100B in brain damage and neurodegeneration / M. Rothermundt, M. Peters, J.H. Prehn, V. Arolt // Microsc Res Tech. -2003. - V. 60, № 6. - P. 614-632.

212. Rowland, J.W. Current status of acute spinal cord injury pathophysiology and emerging therapies: promise on the horizon / J.W. Rowland, G.W. Hawryluk, B. Kwon, M.G. Fehlings // Neurosurg Focus. - 2008. -V. 25, №5. -P. 1-17.

213. Ruff, C.A. Cell-based transplantation strategies to promote plasticity following spinal cord injury / C.A. Ruff, J.T. Wilcox, M.G. Fehlings // Experimental neurology. - 2012. - V. 235, № 1. - P. 78-90.

214. Ruitenberg, M.J. NT-3 expression from engineered olfactory en-sheathing glia promotes spinal sparing and regeneration / M.J. Ruitenberg,

D.B. Levison, S.V. Lee, J. Verhaagen, A.R. Harvey, G.W. Plant // Brain. -2005. - V. 128, № 4. - P. 839-853.

* 215. Sabti, H.A. Therapeutic angiogenesis in cardiovascular disease //

J Cardiothorac Surg. - 2007. - V. 2, № 49. - P. 1-7.

216. Santos-Silva, A. FGF/heparin differentially regulates Schwann cell and olfactory ensheathing cell interactions with astrocytes: a role in astrocy-tosis / A. Santos-Silva, R. Fairless, M.C. Frame, P. Montague, G.M. Smith, A. Toft, J.S. Riddell, S.C. Barnett // J Neurosci. - 2007. - V. 27, № 27. -P. 7154-7167.

217. Schaal, S.M. Schwann cell transplantation improves reticulospinal axon growth and forelimb strength after severe cervical spinal cord contusion / S.M. Schaal, B.M. Kitay, K.S. Cho, T.P. Lo, Barakat, D.J. Marcillo, A.R. Sanchez, C.M. Andrade, D.D. Pearse // Cell Transplant. - 2007. - V. 16, №3,-P. 207-228.

218. Schratzberger, P. Reversal of experimental diabetic neuropathy by VEGF gene transfer / P. Schratzberger, D.H. Walter, K. Rittig, F.H. Bahl-mann, R. Pola, C. Curry, M. Silver, J.G. Krainin, D.H. Weinberg, A.H. Ropper , J.M. Isner // J Clin Invest. - 2001. - V. 107, № 9. - P. 10831092.

219. Shen, B. Effect of controlled release microspheres incorporating bFGF on Schwann cells / B. Shen, F.X. Pei, J. Chen, H. Duan // Sichuan Xue Ban. - 2005. - V. 36, № 6. - P. 873-886.

220. Shen, C.T. Infusion of human umbilical cord blood cells ameliorates hind limb dysfunction in experimental spinal cord injury through antiinflammatory , vasculogenic and neurotrophic mechanisms / C.T. Shen, N.H. Foo, W.S. Liu, S.H. Chen // Pediatr Neonatol. - 2008. - V. 49, № 3. -P. 77-83.

221. Sofroniew, V.M. Astrocytes: biology and pathology / V.M. Sofro-niew, V.H. Vinters // Acta Neuropathol. - 2010. - V. 119. - P. 7-35.

222. Sondell, M. Vascular endothelial growth factor has neurotrophic activity and stimulates axonal outgrowth, enhancing cell survival and Schwann cell proliferation in the peripheral nervous system / M. Sondell,

G. Lundborg, M. Kanje // J Neurosci. - 1999. - V. 19, № 14. - P. 5731-5740.

223. Sondell, M. Vascular endothelial growth factor is a neurotrophic factor which stimulates axonal outgrowth through the flk-1 receptor / M. Sondell, F. Sundler, M. Kanje // Eur J Neurosci. - 2000. - V. 12. -P. 4243-4254

224. Suen, Y. Decreased macrophage colony-stimulating factor mRNA expression from activated cord versus adult mononuclear cells: altered post-transcriptional stability / Y. Suen, S.M. Lee, J. Schreurs, E. Knoppel, M.S. Cairo // Blood. - 1994. - V. 84, № 12. - P. 4269-4277.

225. Sullivan, P.G.Temporal characterization of mitochondrial bioenerget-ics after spinal cord injury / P.G. Sullivan, S. Krishnamurthy, S.P. Patel // J Neurotrauma. - 2007. - V. 24. - P. 991-999.

226. Sun, T. Repairing Neural Injuries Using Human Umbilical Cord Blood / T. Sun, Q.H. Ma // Mol Neurobiol. - 2012. [Epub ahead of print]

227. Sykova, E. Bone marrow stem cells and polymer hydrogels—two strategies for spinal cord injury repair / E. Sykova, P. Jendelova, L. Urdzi-kova, P. Lesny, A. Hejcl // Cell Mol Neurobiol. - 2006. - V. 26, № 7-8. -P. 1113-1129.

228. Taguchi, A. Administration of CD34+ cells after stroke enhances neurogenesis via angiogenesis in a mouse model / A. Taguchi, T. Soma,

H. Tanaka, T. Kanda, H. Nishimura, H. Yoshikawa, Y. Tsukamoto, H. Iso, Y. Fujimori, D.M. Stern, H. Naritomi, T. Matsuyama // J Clin Invest. -2004. - V. 114, № 3. - P. 330-338.

229. Tang, X.Q. Adenovirus-mediated delivery of GDNF ameliorates corticospinal neuronal atrophy and motor function deficits in rats with spinal

cord injury / X.Q. Tang, Y. Wang, Z.H. Huang, J.S. Han, Y. Wan // Neuroreport. - 2004. -V. 15, № 3. - P. 425-429.

230. Tator, C.H. Vascular mechanisms in the pathophysiology of human spinal cord injury / C.H. Tator, I. Koyanagi // J Neurosurg. - 1997. - V. 86. -P. 483-492.

231. Taylor, L. Neurotrophin-3 gradients established by lentiviral gene delivery promote short-distance axonal bridging beyond cellular grafts in the injured spinal cord / L. Taylor, L. Jones, M.H. Tuszynski, A. Blesch // J Neurosci. - 2006. - V. 26, № 38. - P. 9713-9721.

232. Thuret, S. Therapeutic interventions after spinal cord injury / S. Thu-ret, L.D. Moon, F.H. Gage // Nature. - 2006. - V. 32, № 7. - P. 628-663.

233. Totoiu, M.O. Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyelination / M.O. Totoiu, H.S. Keirstead // J Comp Neurol. -2005.-V. 486.-P. 373-383.

234. Treloar, H.B. Expression of extracellular matrix molecules in the embryonic rat olfactory pathway / H.B. Treloar, V. Nurcombe, B. Key // J Neu-robiol. - 1996. - V. 31, № i.-p. 41-55.

235. Trivedi, A.A. Suitability of allogeneic Sertoli cells for ex vivo gene delivery in the injured spinal cord / A.A. Trivedi, T. Igarashi, N. Compag-none, X. Fan, J.Y. Hsu, D.E. Hall, C.M. John, L.J. Noble-Haeusslein // Exp Neurol. - 2006. - V. 198, № 1. - P. 88-100.

236. Tsuchiya, T. Characterization of microglia induced from mouse embryonic stem cells and their migration into the brain parenchyma / T. Tsuchiya, K.C. Park, S. Toyonaga, S.M. Yamada, H. Nakabayashi, E. Nakai, N. Ikawa, M. Furuya, A. Tominaga, K. Shimizu // J Neuroimmu. -2005. - V. 160, № 1-2. - P. 210-218.

237. Vendrame, M. Infusion of human umbilical cord blood cells in a rat model of stroke dose-dependently rescues behavioral deficits and reduces infarct volume / M. Vendrame, J. Cassady, J. Newcomb, T. Butler,

K.R. Pennypacker, T. Zigova, C.D. Sanberg, P.R Sanberg, A.E. Willing // Stroke. - 2004. - V. 35, № 10. - P. 2390-2395.

238. Vermeren, M. Integrity of developing spinal motor columns is regulated by neural crest derivatives at motor exit points / M. Vermeren, G.S. Maro, R. Bron, I.M. McGonnell, P. Charnay, P. Topilko, J. Cohen // Neuron. - 2003. - V. 37, № 3. - P.403-415.

239---- Vroemen, M. Adult neural progenitor cell grafts survive after acute

spinal cord injury and integrate along axonal pathways / M. Vroemen, L. Aigner, J. Winkler, N. Weidner // Eur J Neurosci. - 2003. - V. 18, № 4. -P. 743-751.

240. Wang, J. The observation of phenotypic changes of Schwann cells after rat sciatic nerve injury / J. Wang, P. Zhang, Y. Wang, Y. Kou, H. Zhang,

B. Jiang // Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol. - 2010. - V. 38, № 1. - P. 24-28.

241. Wang, Y. BDNF and NT-3 expression by using glucocorticoid-induced bicistronic expression vector pGC-BDNF-IRES-NT3 protects apop-totic cells in a cellular injury model / Y. Wang, J. Gu, J. Wang, X. Feng, Y. Tao, B. Jiang, J. He, Q. Wang, J. Yang, S. Zhang, J. Cai, Y. Sun // Brain Res.-2012.-V. 1448.-P. 137-143.

242. Wang, Y.C. Sustained intraspinal delivery of neurotrophic factor encapsulated in biodegradable nanoparticles following contusive spinal cord injury / Y.C. Wang, Y.T. Wu, H.Y. Huang, H.I. Lin, L.W. Lo, S.F. Tzeng,

C.S. Yang // Biomaterials. - 2008. - V. 29, № 34. - P. 4546-4553.

243. Waxman, S.G. Enhancement of action potential conduction following demyelination: experimental approaches to restoration of function in multiple sclerosis and spinal cord injury / S.G. Waxman, D. Utzschneider, J. Kocsis // Prog. Brain Res. - 1994. - V. 100. - P. 233-243.

244. Weidner, N. Nerve growth factor-hypersecreting Schwann cell grafts augment and guide spinal cord axonal growth and remyelinate central nerv-

ous system axons in a phenotypically appropriate manner that correlates with expression of LI / N. Weidner, A. Blesch, R.J. Grill, R.J.Tuszynski // J Comp Neurol. - 1999. - V. 413, № 4. - P. 495-506.

245. Weiss, S. Multipotent CNS stem cells are present in the adult mammalian spinal cord and ventricular neuroaxis / S. Weiss, C. Dunne, J. Hewson, C. Wohl, M. Wheatley, A.C. Peterson, B.A. Reynolds // J Neurosci. - 1996. - V. 16, № 23. - P. 7599-7609.

246. Woodhall, E. Cultured olfactory ensheathing cells express nerve growth factor, brain-derived neurotrophic factor, glia cell line-derived neurotrophic factor and their receptors / E. Woodhall, A.K. West, M.I. Chuah // Brain Res Mol Brain Res. - 2001. -V. 88, № 1-2. - P. 203-213.

247. Woodhoo, A. Development of the Schwann cell lineage: from the neural crest to the myelinated nerve / A. Woodhoo, L. Sommer // Glia. -2008. - V. 56, № 14. - P. 1481-1490.

248. Wu, J. Ex vivo Non-viral vector-mediated neurotrophin-3 gene transfer to olfactory ensheathing glia: effects on axonal regeneration and functional recovery after implantation in rats with spinal cord injury / J. Wu, T.S. Sun, J.X. Ren, X.Z. Wang // Neurosci Bull. - 2008. - V. 24, № 2. -P. 57-65.

249. Xu, H. Oligodendrocyte and spinal cord injury / H. Xu, J. Wang, Y. Zhai, B. Huang, X. Zhou // Sheng Wu Yi Xue Gong Cheng Xue Za Zhi. -2012. - V. 29, № 6. - P. 1226-1229.

250. Xu, X.M. A combination of BDNF and NT-3 promotes supraspinal axonal regeneration into Schwann cell grafts in adult rat thoracic spinal cord / X.M. Xu, V. Guenard, N. Kleitman, P. Aebischer, M.B. Bunge // Exp Neurol. - 1995. - V. 134, № 2. - P. 261-272.

251. Xu, X.M. Transplantation-mediated strategies to promote axonal regeneration following spinal cord injury / X.M. Xu, S.M. Onifer // Respir Physiol Neurobiol. - 2009. - V. 169, № 2. - P. 171-182.

252. Xu, Y. Increase in bFGF-responsive neural progenitor population following contusion injury of the adult rodent spinal cord / Y. Xu, M. Kitada, M. Yamaguchi, M. Dezawa, C. Ide // Neurosci Lett. - 2006. - V. 397, № 3. - P. 174-179.

253. Yan H.B. The repair of acute spinal cord injury in rats by olfactory ensheathing cells graft modified by glia cell line-derived neurotrophic factor gene in combination with the injection of monoclonal antibody IN-1 / H.B. Yan, Z.M. Zhang, D.D. Jin, X.J.Wang, K.W. Lu // Zhonghua Wai Ke Za Zhi. - 2009. - V. 47, № 23. - P. 1817-1820.

254. Yan, H. NT-3 weakly stimulates proliferation of adult rat 01 (-)04(+) oligodendrocyte-lineage cells and increases oligodendrocyte myelination in vitro / H. Yan, P.M. Wood // J Neurosci Res. - 2000. - V. 62, № 3. -P. 329-335.

255. Yao, D.L. Cryogenic spinal cord injury induces astrocytic gene expression of insulin-like growth factor I and insulin-like growth factor binding protein 2 during myelin regeneration / D.L. Yao, N.R. West, C.A. Bon-dy, M. Brenner, L.D. Hudson, J. Zhou, G.H. Collins, H.D. Webster // J Neurosci Res. - 1995. - V. 40, № 5. _ p. 647-659.

256. Yao, S. Differentiation of stem cells in the dental follicle / S. Yao, F. Pan, V. Prpic, G.E. Wise // J Dent Res. - 2008. - V. 87, № 8. -P. 767-771.

257. Young, W. Potassium and calcium changes in injured spinal cords / W. Young, I. Koreh // Brain Res. - 1986. V. 365. - P. 42-53.

258. Zhang, J. Bone marrow stromal cells increase oligodendrogenesis after stroke / J. Zhang, Y. Li, Z.G. Zhang, M. Lu, J. Borneman, B. Buller, S. Savant-Bhonsale, S.B. Elias, M. Chopp // J Cereb Blood Flow Metab. -2009. - V. 29, № 6. - P. 1166-1174.

259. Zhang, L. GDNF-enhanced axonal regeneration and myelination following spinal cord injury is mediated by primary effects on neurons /

L. Zhang, Z. Ma, G.M. Smith, X. Wen, Y. Pressman, P.M. Wood, X.M. Xu //Glia. - 2009. - V. 57, № 11.-p. 1178-1191.

260. Zhang, W. Implantation of adult bone marrow-derived mesenchymal stem cells transfected with the neurotrophin-3 gene and pretreated with reti-noic acid in completely transected spinal cord // Brain Res. - 2010. -V. 1359.-P. 256-271.

261. - Zhao, Z.M. Intraspinal transplantation of CD34+ human umbilical cord blood cells after spinal cord hemisection injury improves functional recovery in adult rats / Z.M. Zhao, H.J. Li, H.Y. Liu, S.H. Lu, R.C. Yang, Q.J. Zhang, Z.C. Han // Cell Transplant. - 2004. - V. 13, № 2. - P. 113-122.

262. Zujovic, V. Boundary cap cells are highly competitive for CNS re-myelination: fast migration and efficient differentiation in PNS and CNS myelin-forming cells / V. Zujovic, J. Thibaud, C. Bachelin, M. Vidal, F. Coulpier, P. Charnay, P. Topilko, A. Baron-Van Evercooren // Stem Cells. - 2010. - V. 28, № 3. - P.470-479.

263. Zujovic, V. Remyelination of the central nervous system: a valuable contribution from the periphery / V. Zujovic, C. Bachelin, B.A. Evercooren // Neuroscientist. - 2007. - V. 13, № 4. - P. 383-391.

264. Zurita, M. Functional recovery in chronic paraplegia after bone marrow stromal cells transplantation / M. Zurita, J. Vaquero // Neuroreport. -2004.-V. 15, №7.-P. 1105-1108.

265. Zwart, I. Umbilical cord blood mesenchymal stromal cells are neuroprotective and promote regeneration in a rat optic tract model / I. Zwart, A.J. Hill, F. Al-Allaf, M. Shah, J. Girdlestone, A.B. Sanusi, H. Mehmet, R. Navarrete, C. Navarrete, L.S. Jen // Exp Neurol. - 2009. - V. 216, № 2. -P. 439-448.