Факторы, влияющие на эффективность секреции рекомбинантного активатора плазминогена урокиназного типа клетками дрожжей тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат физико-математических наук Романова, Нина Владимировна

• Романова, Нина Владимировна
• кандидат физико-математических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Романова, Нина Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: СЕКРЕТОРНЫЙ ПУТЬ БЕЛКОВ В КЛЕТКАХ

ДРОЖЖЕЙ И МЛЕКОПИТАЮЩИХ.

Введение.

1. Общая организация секреторного пути.

1.1. Транслокация белка из цитозоля в эндоплазматический ретикулум (ЭР).

1.2. Внутриклеточная система транспорта секреторных белков.

1.2.1. Комплексы окаймления СОРИ и СОР1 участвуют в транспорте белков между

ЭР и аппаратом Гольджи.^

1.2.2. Клатриновое окаймление участвует в транспорте белков из поздних компартментов аппарата Гольджи в лизосомы (вакуоль), от плазматической мембраны в аппарат Гольджи или лизосому (вакуоль).

1.2.3. Секретируемые белки покидают эукариотическую клетку преимущественно конститутивным образом.^

1.2.4. Слияние транспортных везикул с мембранами происходит при участии цитозольных и мембранных белков.^

1.3. Сортировка секреторных белков в секреторных путях.

1.3.1. Сортировка растворимых белков.

1.3.2. Сортировка мембранных белков, проходящих начальные этапы секреторного

ПУТИ.

1.3.2.1. Сигналы локализации белков в мембранах аппарата Гольджи.

1.3.3. Сигналы сортировки трансмембранных белков в лизосомы.

1.4. Модификации секреторных белков.

1.4.1. Гликозилировапие.

1.4.1.1. Ы-гликозилирование.

1.4.1.2. О-гликозилирование.

1.4.2. Протеолитический процессинг.

2. Контроль качества укладки белков в ЭР (ЕК(^С).

2.1. Сборка и укладка белков происходит в ЭР.

2.1.1. В дрожжах S. cerevisiae идентифицированы сборочные факторы.

2.2. Контроль качества укладки белков в ЭР.

2.2.1. Роль моноглюкозилированных N-гликозидов в системе контроля качества (ERQC).

2.2.2. Роль кальнексина и кальретикулина в системе контроле качества (ERQC).

2.3. Модель контроля качества укладки белков в ЭР млекопитающих.

2.4. Контроль качества укладки белков отличается у дрожжей Sch. pombe, S.cerevisiae и млекопитающих.^ ¡

2.5. Маннозидаза I участвует в формировании сигнала для системы деградации неправильно свернутых белков.^

2.6. Альтернативные модели системы контроля качества в клетках млекопитающих.

2.7. ERp57 в комплексе с кальнексином/кальретикулином способствует правильной укладке белков.^

2.8. Модель контроля качества укладки белков в дрожжах S. cerevisiae - контроль качества без участия кальнексина, кальретикулина и глюкозилтрансферазы (GT).

2.9. Гомологи компонентов системы укладки белков в дрожжах Н. polymorpha.

3. Ответ клетки на накопление неправильно свернутых белков (IJPR).

3.1. НАС1-активация механизма UPR.

4. Деградация белков в секреторном пути.

4.1. Деградация белков, ассоциированная с эндоплазматическим ретикулумом (ERAD).

4.1.1. Компоненты система убиквитинилирования в клетках дрожжей.

4.1.2. Компоненты системы ERAD в клетках дрожжей.

4.2. Деградация белков в вакуоли.

4.2.1. Вакуоль.

4.2.2. Некоторые белки, проходящие путь секреции, направляются в вакуоль на деградацию.

4.2.3. Рецептор вакуолярного сортинга VpslOp способен направлять в вакуоль неправильно свернувшиеся белки.,,,

ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Штаммы микроорганизмов.

1.1. Условия культивирования.

1.2. Штаммы бактерий Е. соП.

1.2.1. Среды для выращивания Е. соП.

1.3. Штаммы дрожжей.

1.3.1. Среды для выращивания дрожжей.

2. Генетические методы.

2.1. Трансформация дрожжей Н. ро1утогрка и сегеУ1^1'ае.

2.2. Выделение и анализ ДНК клеток Н. ро1утогрка.

2.3. Гибридизационный анализ дрожжевой ДНК.

3. Клонирование.

3.1. Выделение плазмидной ДНК из Е. соП.

3.2. Трансформация Е. соН.

4. Методы работы с белками.

4.1. Тестирование ферментативной активности иРА.

4.2. Индукция экспрессии иРА в штаммах Н. ро1утогрка и сеге\1$1ае.

4.3. Измерение суммарного клеточного белка (биуретовый метод).

4.4. Электрофорез и иммуноблоттинг.

4.5. Анализ иРА из культуралыюй среды.

4.6. Приготовление и фракционирование дрожжевых лизатов.

4.7. Определение количества иРА в препаратах культуральной среды или дрожжевых лизатах с использованием иммуноблоттинга.

5. Получение антисыворотки против карбоксипептидазы У (СРУ).

6. Плазмиды.

6.1. Место стыковки сигнальной последовательности с различными вариантами иРА.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. Зависимость эффективности секреции иРА от уровня экспрессии в клетках Н. ро1утогрЬа.^

1.1. Зависимость продукции иРА от количества копий и места интеграции экспрессиоппой кассеты.^

1.2. Экспрессия иРА в клетках Н. ро1утогрЬа под контролем промотора гена РВИ.

2. Свойства секретируемого и внутриклеточного иРА.

3. Эффективность секреции иРА зависит от наличия в составе молекулы Ы-концевых доменов и участка М-гликозилирования.^

4. Низкая эффективность секреции иРА коррелирует с его агрегацией в путях секреции.^

5. Экспрессия вариантов иРА с сигналом задержки в ЭР.

6. Влияние температуры инкубации при экспрессии иРА в клетках дрожжей Н. ро1утогрЬа.g^

7. Экспрессия иРА в дрожжах Я. сеге\1$1ае.

8. Мутации, приводящие к улучшению секреции иРА.

8.1. Эффективность сортировки в вакуоль карбоксипептидазы У в клетках мутантов, « сверхсекретирующих иРА.

8.2. Нарушение рецептора УрэЮр не увеличивает эффективность секреции иРА.

8.3. Мутациярер4Л не влияет на эффективность секреции иРА.

8.4. Агрегация иРА в мутантах, «сверхсекретирующих» иРА.

8.4.1. Агрегация иРА и иРА-КХ)ЕЬ в клетках мутантартй.

8.4.2. Влияние мутаций ори24 и гег1-27 на агрегацию иРА.

8.4.2.1. Влияние мутации на агрегацию иРА-КЭЕЬ.

8.4.2.2. Влияние мутации ори24 на агрегацию иРА-КЭЕЬ.

8.5. Экспрессия иРА под контролем промотора гена РИП в клетках «сверхсекреторных» мутантов.д^

8.6. Свойства секретируемого и внутриклеточного иРА при экспрессии в клетках мутанта ртг! Н. ро1утогрЬа.^

9. Влияние «сверхсекреторных» мутаций на чувствительность к дитиотрейтолу.

9.1. Влияние мутации retl-27 H. polymorpha на чувствительность клеток к дитиотрейтолу.pg

9.2. Влияние мутаций pmrl и pmtl H. polymorpha на чувствительность клеток к дитиотрейтолу.дд

ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Высокого уровня секреции иРА нельзя добиться путем увеличения уровня экспрессии.jqq

2. При высоком уровне экспрессии иРА накапливается внутриклеточно в виде агрегатов, формирующихся в ЭР.j qj

3. Агрегация uPA не ипгибирует секрецию иРА.

4. Домены молекулы иРА влияют на эффективность секреции этого белка клетками дрожжей.jq

5. Накопление белка в ЭР мешает укладке новых молекул.

6. Неправильно свернутый иРА может элиминироваться путем деградации.

7. Вклад различных процессов, происходящих в ЭР, в эффективность секреции иРА.

7.1. Схема секреции иРА в дрожжах при «низком» уровне экспрессии этого белка.

7.2. Схема секреции иРА в дрожжах при «высоком» уровне экспрессии этого белка.

8. Гликозилирование влияет па эффективность укладки иРА.

9. Возможные причины «сверхсекреции» иРА.

9.1. «Сверхсекреторные» мутации pmtl и ори24 H. polymorpha.

9.2. «Сверхсекреция» у мутантов с нарушенным балансом ионов кальция в секреторном пути.^

10. Чувствительность «сверхсекреторных» мутантов к реагентам, провоцирующим образование несвернутых белков в ЭР.^ ^

11. Секреция иРА клетками дрожжей S. cerevisiae.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Факторы, влияющие на эффективность секреции рекомбинантного активатора плазминогена урокиназного типа клетками дрожжей»

Прогресс в исследованиях молекулярных механизмов функционирования эукариотической клетки в последние десятилетия был в существенной степени обеспечен использованием дрожжей Saccharomyces cerevisiae в качестве модельного организма. Это обусловлено легкостью проведения генетических и геипо-инженерных манипуляций с этим организмом. Многие клеточные процессы являются консервативными, что делает знания, полученные в исследованиях дрожжевой клетки, приложимыми к описанию аналогичных процессов в клетках высших эукариот.

Схожесть процессов синтеза и созревания белков делает дрожжи хорошим организмом-хозяином для экспрессии гетерологичных эукариотических генов. Путем экспрессии в дрожжах можно получать различные белки, используемые в промышленности, медицине и научных исследованиях. Стоит отметить, что многие процессы, происходящие в клетках различных эукариот, существенно дивергировали в ходе эволюции. Изучение процесса секреции белков высших эукариот в клетках дрожжей позволяет выявить особенности организации секреторного пути дрожжевой клетки. Однако результаты, полученные на одном модельном объекте, например на S. cerevisiae, часто оказываются не приложимыми к описанию процессов происходящих в клетках других организмов. Поэтому использование альтернативных модельных объектов позволяет понять, какие процессы в клетке эволюционно консервативны, а какие отражают особенности данного организма. Более того, та или иная особенность нового модельного объекта может быть использована как эффективный инструмент исследования, который в большей степени подходит для решения конкретной экспериментальной задачи.

В данной работе мы изучали особенности прохождения по дрожжевому пути секреции человеческого белка - активатора плазминогена урокиназного типа (иРА). Оказалось, что метилотрофпые дрожжи Hansenula polymorpha имеют ряд преимуществ перед более традиционным модельным объектом - S. cerevisiae для решения поставленных экспериментальных задач. Именно использование Н. polymorpha позволило подробно изучить многие закономерности, связанные с секрецией иРА клетками дрожжей.

Метилотрофные дрожжи Н. polymorpha уже более 15 лет используются в качестве организма-хозяина для экспрессии рекомбинантпых белков. Этот организм также давно привлекает исследователей, изучающих метаболизм метанола и функционирование пероксисом, а в последнее время все шире используется и в работах по изучению других процессов, например, гликозилирования белков, ассимиляции нитрата и нитрита, регуляции генной экспрессии и др. Недавно при финансировании фирмой Rhein Biotech была определена последовательность нуклеотидов более 90% генома Н. ро1утогрка, что в существенной степени облегчает проведение молекулярно-генетических исследований на этом объекте.

В лаборатории молекулярной генетики ИЭК РКНПК МЗ РФ на протяжении ряда лет проводятся исследования по изучению факторов, влияющих на секрецию различных чужеродных белков клетками дрожжей & сегех'тае и Н. ро1утогрка. Одни из этих белков, иРА, неспособен эффективно секретироваться, что позволило получить мутации, увеличивающие эффективность секреции этого белка. Был клонирован ряд генов, в которых произошли эти мутации. Однако, оставалось невыясненным, какие именно механизмы препятствуют секреции иРА. Данная работа посвящена изучению факторов, определяющих низкую эффективность секреции иРА клетками дрожжей и механизмов, приводящих к ее увеличению в результате геномных мутаций.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

СЕКРЕТОРНЫЙ ПУТЬ БЕЛКОВ В КЛЕТКАХ ДРОЖЖЕЙ И

Введение

Человеческая клетка, в среднем, содержит 10 ООО различных белков, клетка дрожжей около 5000. Дчя нормального функционирования клетки каждый из этих белков должен оказаться в нужном компартменте или мембране ком парт мент л Направление новоси итерированных полипептпдных цепей к «месту назначения», так называемая сортировка белков («prolein sorting») - необходимый процесс для компартментацим и функционирования эукариотической клетки. При этом некоторые белки, кодируемые ДНК. находящейся в митохондриях и хлоропластах. синтезируются на рибосомах в этих органеллах и остаются там же. Однако большинство митохондриатьных белков и белков хлоропласт, а также все белки других органелл. кодируются ядерной ДНК. Они синтезируются на рибосомах в цитозоле и распределяются по орган ел лам при помощи систем узнавания с Игнатов сортировки.

Для прохождения секреторного пуш также используются сигналы сортировки новое и итерированная полипептидная цепь направляется в полость эндоплазматического ретикулума (ЭР), датее попадает в аппарат Гольджи, направляется к плазматической мембране и секретпруется (рисунок i).

МЛЕКОПИТАЮЩИХ

Рисунок 1. Секреторный путь в эукариотических клетках.

1) Все ядерные мРНК транслируются на цитозольных рибосомах.

2} Рибосомы, синтезирующие секреторные белки направляются к шероховатому ЭР, благодаря наличию сигнальной последовательности.

3) После трансляции в полость ЭР секреторные белки попадают в аппарат Гольджи при помощи везикулярного транспорта

4а, 4Ь, 4с) Секреторные белки направляются далее: либо секретируются, либо попадают в лизосомы (вакуоль), либо остаются в плазматической мембране

Стоит отметить, что белками секреторного пути являются не только те, которые в конечном итоге секретируются, но и ферменты и белки, которые постоянно присутствуют в полости ЭР, аппарате Гольджи, лизосомах, а также белки, «интегрированные» в мембраны этих органелл или плазматическую мембрану.

Данный обзор будет посвящен описанию организации секреторного пути и механизмов, при помощи которых секреторные белки клеток дрожжей и млекопитающих сортируются по клеточным компартментам. Особое внимание будет уделено «созреванию» (модифицированию) белка и прохождению им системы «контроля качества».

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Романова, Нина Владимировна

117 ВЫВОДЫ

1. Человеческий активатор плазминогена урокиназного типа (иРА) плохо секретируется клетками дрожжей по причине неэффективного сворачивания в эндоплазматическом ретикулуме.

2. Дефект укладки иРА в дрожжевом эндоплазматическом ретикулуме в существенной степени определяется М-концевыми доменами этого белка.

3. При высоком уровне синтеза иРА происходит его внутриклеточное накопление в виде высокомолекулярных агрегатов. Агрегаты формируются в эндоплазматическом ретикулуме. Количество белка в агрегированной форме зависит от эффективности его укладки в эндоплазматическом ретикулуме.

4. Мутации ори24, ге11-27 и рти, увеличивающие эффективность секреции иРА, снижают степень агрегации этого белка в эндоплазматическом ретикулуме, что свидетельствует об улучшении условий для правильного сворачивания этого белка.

5. Улучшение укладки иРА у мутанта ге//-27 связано с нарушением баланса кальция в секреторном пути.

6. Нарушение транспортировки белков из поздних компартментов аппарата Гольджи в вакуоль не увеличивает эффективность секреции иРА, но увеличивает протеолитический процессинг этого белка.

7. Протеолитический процессинг иРА в существенной степени не зависит от вакуолярных протеаз, активируемых продуктом гена РЕР4, протеиназой А.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработка методов генной инженерии позволила получать многие белки путем их экспрессии в клетках бактерий. Казалось, что проблема получения белков высших эукариот для фармакологического использования решена. Однако, многие важные белки не приобретают правильную конформацию и посттрансляционные модификации, необходимые для их активности, в результате прохождения через компартменты эукариотического пути секреции. Для решения этой проблемы было предложено использовать одноклеточный эукариотический организм - дрожжи. Однако, многие процессы в секреторном пути проходят по-разному у разных эукариот и многие животные белки не способны преодолеть секреторный путь дрожжей или их модификация ферментными системами чужеродного организма также не обеспечивает им необходимых свойств. В этом случае теоретически можно пойти по пути генетической модификации оргапизма-хозяипа, которые изменили бы устройство его секторного пути, сделав его более подходящим для экспрессии белков высших эукариот. Эта задача требует понимания того, почему белки высших эукариот часто не секретируются клетками дрожжей. В нашей работе мы предприняли попытку разобраться в причинах плохой секреции человеческого uPA и изучить, какие изменения в секреторном пути дрожжевой клетки могут улучшать секрецию этого белка.

В анализе зависимости уровня секреции от уровня экспрессии uPA в дрожжах Я. polymorpha было обнаружено, что одна копия экспрессионной кассеты, содержащей промотор МОХ, обеспечивает максимальный уровень секреции. Увеличение уровня экспрессии при введении в геном большего числа копий экспрессионной кассеты или его снижение при использовании более «слабого» промотора приводило к снижению скорости секреции. Однако даже при «оптимальном» уровне экспрессии количество секретированного белка оставалось ничтожным.

Оказалось, что при высоких уровнях экспрессии uPA накапливается впутриклеточно в виде высокомолекулярных агрегатов. Увеличение уровня экспрессии сопровождалось увеличением внутриклеточного агрегированного белка и снижением секреции. Полученные в данной работе результаты исключают предположение о том, что агрегация является причиной низкого уровня секреции uPA клетками дрожжей, а является следствием неспособности этого белка эффективно приобретать правильную конформацию в дрожжевом ЭР. Что и является причиной низкого уровня секреции uPA клетками дрожжей.

Мы обнаружили, что низкая эффективность секреции uPA определяется его доменной организацией. А именно: без N-концевых доменов белок секретировался намного эффективнее, чем полпоразмерпый вариант, и практически не обнаруживался в клетках в виде высокомолекулярных агрегатов. Очевидно, что И-копцевые домены определяют неспособность иРА эффективно приобретать правильную укладку в ЭР клеток дрожжей.

В данной работе мы продемонстрировали, что неспособность иРА эффективно приобретать правильную конформацию в дрожжевом ЭР является основной причиной низкого уровня секреции этого белка клетками дрожжей. В существенной степени к такому заключению удалось прийти благодаря использованию разработанного нами подхода по оценке эффективности укладки белка в ЭР по степени его агрегации. Этот метод оказался применим только для анализа штаммов с высоким уровнем экспрессии иРА. Такой уровень экспрессии можно было достичь у трансформантов Н. ро1утогрка, несущих только одну копию экспрессиоппой кассеты стабильно интегрированную в геном, а в аналогичных трансформантах & сегеу'шае необходимого уровня экспрессии достичь не удавалось.

Анализ степени агрегации иРА у мутантов Н. ро1утогрка с увеличенной эффективность секреции этого белка показал, что в этих штаммах улучшены условия для правильной укладки молекулы иРА в ЭР. Мутации ори24 и рт11 нарушали гликозилирование белков в секреторном пути, при этом мы предполагаем, что их влияние на секрецию иРА обусловлено не нарушением гликозилирования самого иРА, а связано с ответом клетки на общий дефект гликозилирования белков. Анализ взаимодействия мутации геИ-27 со сверхэкспрессией гена РМЯ1 позволил получить данные, указывающие на важную роль баланса ионов кальция в секреторном пути и в эффективности укладки молекулы иРА.

Мы также рассматривали возможность влияния вакуолярной деградации на эффективность секреции иРА, однако обнаружили, что ни нарушение транспортировки молекул из поздних компартментов аппарата Гольджи в вакуоль при помощи рецептора вакуолярной сортировки УрэЮр, ни отсутствие протеиназы А, активирующей протеолитический комплекс вакуоли, не изменило уровень секреции иРА клетками дрожжей.

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Романова, Нина Владимировна, 2004 год

1. Захаров,И.А., Кожин,С.А., Кожина,Т.Н., Федорова,И.В. (1984). Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов. Л:Наука.

2. Agaphonov,M.O., Beburov,M.Y., Ter-Avanesyan,M.D., and Smirnov,V.N. (1995). A disruption-replacement approach for the targeted integration of foreign genes in Hansenula polymorpha. Yeast 11, 1241-1247.

3. Agaphonov,M.O., Trushkina,P.M., Sohn,J.H., Choi,E.S., Rhee,S.K., and Ter-Avanesyan,M.D. (1999). Vectors for rapid selection of integrants with different plasmid copy numbers in the yeast Hansenula polymorpha DL1. Yeast 15, 541-551.

4. Amara,A„ Littman,D.R. (2003). After Hrs with HIV J Cell Biol. 162(3), 371-5.

5. Andersson,H., Kappeler,F., and Hauri,H.P. (1999). Protein targeting to endoplasmic reticulum by dilysine signals involves direct retention in addition to retrieval. J. Biol. Chem .274, 15080-15084.

6. Aridor,M. and Traub,L.M. (2002). Cargo selection in vesicular transport: the making and breaking of a coat. Traffic. 3, 537-546.

7. Astrup T. and Mullerts S. (1952). Fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity. Arch. Biochem. Biophys 40, 346-351.

8. Baksh,S., Burns,K., Andrin,C., and Michalak,M. (1995). Interaction of calreticulin with protein disulfide isomerase. J. Biol. Chem. 270, 31338-31344.

9. Balch,W.E., McCaffery,J.M., Plutner,H., and Farquhar,M.G. (1994). Vesicular stomatitis virus glycoprotein is sorted and concentrated during export from the endoplasmic reticulum. Cell 76, 841-852.

10. Baldari,C., Murray,J.A., Ghiara,P., Cesareni,G., and Galeotti,C.L. (1987). A novel leader peptide which allows efficient secretion of a fragment of human interleukin 1 beta in Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 6,229-234.

11. Ballou,C.E. (1990). Isolation, characterization, and properties of Saccharomyces cerevisiae mnn mutants with nonconditional protein glycosylation defects. Methods Enzymol. 185:440-70., 440-470.

12. Balow,J.P., Weissman,J.D„ and Kearse,K.P. (1995). Unique expression of major histocompatibility complex class I proteins in the absence of glucose trimming and calnexin association. J. Biol. Chem. 270, 29025-29029.

13. Bankaitis,V.A., Johnson,L.M., and Emr,S.D. (1986). Isolation of yeast mutants defective in protein targeting to the vacuole. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 83, 9075-9079.

14. Bannykh,S.I., Rowe,T., and Balch,W.E. (1996). The organization of endoplasmic reticulum export complexes. J. Cell Biol. 135, 19-35.