Роль малых аминокислот в белковых (D1/D2) взаимодействиях в адаптации к температуре реакционного центра фотосистемы II тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Шлык-Кернер, Оксана Владимировна

• Шлык-Кернер, Оксана Владимировна
• кандидат наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат наук Шлык-Кернер, Оксана Владимировна

Оглавление

Сокращения

Резюме.

Общее введение

Фотосинтез

Структура и функция фотосистемы 2

Фотосистема 2-мембранный белковый комплекс

Температура и фотосинтез

Объяснение для модификации белка

Мотив ГлихххГли

94

Схема мутагенеза

95

Биологическая система

11

Ц ель и задачи

Глава 1 Гибкость белка обеспечивает акклиматизацию реакции фотосинтеза к

температуре

Глава 2 Б1-Гли208 найденный в точке пересечения D1/D2 субъединиц реакционного центра Фотосистемы 2 играет ключевую роль в управлении переноса электронов в

процессе фотосинтеза

Глава 3 Роль Dl-Cep209 в функциональной сборке Реакционных Центров Фотосистемы 2

91

Введение

93

Материалы и методы

Результаты

Глава 4 Общее Обсуждение и Перспективы

115

Ссылки

Сокращения

Ала • Алании

ДрГ Аргинин

дсн Аспарагин

дрг Аминокислота

дсп Аспартат

АТФ Аденозин трифосфат

Брц Реакционный центр бактерий

Хл Хлорофилл

цис Цистеин

□ I 32 кДа белковая субъединица

¡32 34 кДа белковая субъединица DCMU (3-(3,4-dichlorophyll)-1,1 -dimetyl urea

Э]-[ Электронный перенос

фд Ферредоксин

Гли Глицин

рлн Глутамин

рЛу Глутамат

Н-связь ' Водородная связь

Гис Гистидин HPLC Жидкостная хроматография Высокой эффективности

ПХ Пероксидаза Хрена

Изолейцин

МБВС Межбелковая водородная связь

кда Килодальтон

Лей Лейцин

Лиз Лизин

Мет Метионин

НАДФ Никотинамид Аденин Динуклеотид Фосфат

0д Оптическая Плотность

pggO Специальная пара хлорофилла

ПААГ Полиакриламидный гель электрофорез

щ Пластоцианин

дцр Полимеразная Цепная Реакция

pDg Банк данных белка

Фео ' Феофитин

Y\Yx Пластогидрохинон

Про ПР°Л™

ФС1 Фотосистема

ф(22 Фотосистема 2 ПВДФ Поливинилиден Дифлуорид мембрана

qa Первичный акцептор хинона

qb Вторичный акцептор хинона

рц Реакционный центр

дед Додецил Сульфат Натрия

Сер СеРин

То Оптимальная температура роста

уд Термолюминесценция

yjyj Трансмембранный

ТРИС Трис (гидроксиметил) аминоэтан

Три Триптофан

Тир Тирозин

Вал Валин

РЕЗЮМЕ

Фотосинтез-жизненно важный процесс производства биомассы и кислорода, который протекает в разнообразных средах обитания. Реакция фотосинтеза обеспечивается слаженной работой фотосистем (белковых комплексов) при постоянно меняющихся условиях окружающей среды. Один из главных компонентов этой реакции-фотосистема 2 (ФС2), катализирует свето-зависимое окисление воды и восстановление пластохинонов посредством переноса электронов через цепь пигментов-кофакторов. Эти переносчики удерживаются в пространстве реакционным центром (РЦ)-белковым комплексом, состоящим главным образом из двух разных субъединиц Б1 и Ш. Реакция переноса электронов в ФС2 начинается с поглощения кванта света молекулой хлорофилла (Р680) и заканчивается восстановлением первичного пластохинона который передает электрон вторичному пластохинону После двух таких циклов восстановления, 0,в превращается в пластогидрохинон, Р()Н2. Этот конечный продукт ФС2 диффундирует сквозь мембрану, чтобы восстановить фотосистему 1 (ФС1) через цитохром Ь6/ комплекс и таким образом запустить синтез углеводов.

Также, ФС2 очень чувствительна к различным стрессовым воздействиям окружающей среды. Например, резкие колебания температуры, могут подавить (ингибировать) реакцию фотосинтеза, вследствии нарушения целостности структуры ФС2 как наиболее лабильной из белковых систем. В соответствии с литературными данными, есть два способа зависимости реакции переноса

электрона от окружающей температуры.

1. Белковый матрикс удерживает кофакторы в пространстве, и такая ультра точная геометрия пигментов диктует скорость переноса электрона (главным образом быстрых реакций). Соответственно, эта тонкая организация может быть сильно нарушена вследствии структурных изменений или частичной денатурации белка, в результате воздействия экстремальных температур.

2. Следуя классической парадигме Аррениуса, константа скорости переноса электрона с на 0,в, должна линейно расти с повышением температуры, в конечном счёте приводя к насыщению, фотоинактивации и разрушению реакционных центров ФС2.

Однако, фотосинтетические организмы, которые растут при чрезвычайно высоких температурах (термофиллы), поддерживают фотосинтетическую активность и целостность белка. Таким образом, главный вопрос, который не решён до сих пор, состоит в том, как фотосинтетические реакции в таких организмах поддерживаются при экстремальных температурах. Вообще, оптимальная функция белка требует надлежащего баланса между двумя основными факторами: структурная "жесткость", поддерживающая определенную трехмерную структуру при физиологической температуре, и "гибкость", позволяющая белку выполнять его каталитическую функцию. Это неустойчивое равновесие между стабильностью и "гибкостью", которая связанна с функцией, может регулироваться слабыми внутримолекулярными или межмолекулярными взаимодействиями.

Знание структуры и функции ФС2 улучшились с открытием новых кристаллических структур этого мембранного белкового комплекса из термофильных цианобактерий ТЪегтоБупескососсш е1ощаШ. Параллельно, последовательность белков ФС2 РЦ из различных организмов была расшифрована с помощью новых методов биоинформатики, которые позволяют быстрое сравнение многих таких последовательностей фотосинтетических организмов, которые живут в разнообразных средах обитания. Таким образом, анализ пространственной организации кофакторов и аминокислотных (АК) остатков, недавно полученных кристаллических структур, и изменений белковых последовательностей между различными организмами, позволяет искать структурные элементы, которые приспосабливают скорость переноса электронов к окружающим температурам. Следуя этому подходу, задача моей диссертации состоит в определении роли некоторых АК остатков, формирующих белок-белковые взаимодействия между Б1 и Б2 субъединицами

в регуляции скорости переноса электронов от Од к и её акклиматизации к окружающим температурам у мезофильных и термофильных фотосинтетических организмов. Компьютерный анализ структуры белков ФС2 РЦ и мутации т бШсо показал сайты межбелковых водородных связей (Н-связь) и Ван-Дер Ваальсовых взаимодействий, потенциально важных для сохранения структурной жёсткости и функциональной гибкости1.

В частности, боковая цепь аминокислоты в сайте Б1-212 может образовывать Б1/Е>2 межбелковую водородную связь, которая играет ключевую функциональную роль. Дальнейший анализ, сделанный в ходе исследования, используя инструменты визуализации структуры белка, поднял вопрос возможной причастности структурно близких аминокислотных остатков, а именно, 01-208 и 01-209, в упомянутых молекулярных взаимодействиях. На основе результатов была выдвинута гипотеза, что эти остатки и соседние белковые впадины, образуют мотив подобный ГлихххГли, обеспечивают необходимые элементы для температурной модуляции скорости электронного переноса (ЭП)1. Чтобы проверить эту гипотезу и выяснить молекулярные механизмы, был выполнен комбинаторный мутагенез на каждом из предполагаемых аминокислотных остатков в цианобактериях БупескосуяПз РСС 6803. Используя биофизические, биохимические, физиологические измерения, и вычисления термодинамических параметров для каждого из полученных мутантов, предложенная гипотеза была проверена экспериментально. Используя комбинацию экспериментальных и компьютерных методов1, был предложен новый механизм для функциональной адаптации мембранных белков к окружающим температурам. Здесь я перечисляю главные результаты своего исследования:

I. Компьютерный поиск предполагаемых межбелковых взаимодействий показал мотив ГлихххГли в участке между В1/В2 субъединицами ФС2. Используя инструменты визуализации белковых структур, я идентифицировала малые аминокислотные остатки в этом мотиве, которые участвуют в межбелковых водородных связях между £> альфа спиралями белковых

субъединиц D1/D2. Эти связи вовлекают D1-208, 209 и 212 остатки, которые расположены в точке пересечения D альфа спиралей в центре D1/D2 гетеродимера, близко к QaQb сайту ФС2 (Эта часть была сделана в сотрудничестве с lian Samish и была далее продолжена в ходе его кандидатской диссертации.).

II. Сравнение многих аминокислотных последовательностей показало, что последовательность ГлихххГли сохранена в центре спирали D белка D1 во всех кислород производящих фотоавтотрофах.

III. После этого сравнения я нашла, что два сайта (D1-209 и D1-212) претерпевают сохранённые в эволюции изменения между мезофильными и термофильными организмами. Я предположила, что модификации последовательности в этих участках белка могут регулировать местную гибкость белка. Таким образом, эти сайты D1 могут быть "горячими точками" в адаптации скорости переноса электрона к повышенным температурам.

IV. Чтобы доказать гипотезу, я спланировала и выполнила мутаганез D1-208, 209 и 212 остатков в последовательности ГлихххГли. Двадцать четыре мутанта были получены в результате мутагенеза, и последующей селекции функциональных мутантов в этих сайтах белка, организма Synechocystis РСС 6803.

V. Физиологические и биохимические измерения активности ФС2 в разных D1-208, 209 и 212 мутантах показали, что малые АК, (такие как глицин, аланин и серии) обеспечивают быстрые темпы размножения организма, высокое количество белка D1, распределение каротиноидов, подобных дикому типу, высокие константы скорости переноса электрона и стабильное S2jQb-состояние. Средние (по размеру) АК остатки (такие как цистеин, треонин, апарагин и аспартат) показали средне нарушенную функцию ФС2. Большие АК (такие как пролин, глютамин, глутамат, валин, лейцин, изолейцин и метионин) показали сильно нарушенную функцию ФС2. Ароматические и основные заряженные большие АК остатки (такие как тирозин, триптофан, фенилаланин,

гистидин, аргинин и лизин) не выросли на чашках с селективной средой ни в одном из трёх сайтов.

VI. Замена серина в сайте Dl-Cep212 АК остатками класса I (Гли, Цис, Ала, Тре, Асп и Асн) уменьшила отрицательную величину энтропии активации реакции ЭП с QA- на QB по сравнению с диким типом и придала "гибкость" необходимую для функции ФС2. Напротив, АК класса II (Про, Вал, Лей, Иле, Глу, и Глн) увеличили отрицательную энтропию активации, таким образом уменьшающую местную "гибкость" белка и обеспечивающую "жёсткую конформацию" РЦ ФС2. Этот результат указывает на ключевую роль АК остатка серина в сайте D1-212, в функциональной "гибкости" белка ФС2.

Мутации в участке D1-209 дали шесть АК остатков класса I (Гли, Ала, Тре, Цис, Асн, и Асп) и два АК остатка класса II (Про и Вал), и показали высокую корреляцию между размером ("объемом") аминокислотного остатка и скоростью ЭП между QA- и QB при комнатной температуре. Однако, эффект мутации в этом сайте на величины констант скорости и энтропии активации не был столь же силен как в положении D1-212. Таким образом мутации в участке D1-209, кажется, главным образом, затрагивают стабильность свернутого РЦ ФС2 и, в меньшей степени, ее функциональную гибкость. Мутации в положении Dl-Gly208 дали только трех мутантов, имеющие малые АК остатки Ала, Сер и Тре в сайте D1-208. Здесь, уменьшение константы скорости реакции коррелирует с силой водородной связи (Н-связь) образуемой аминокислотным остатком. Это открытие предполагает, что конформационное изменение в контакте D1/D2 облегчает перенос электрона- к QB , и что такое конформационное изменение задерживается в результате образования межбелковой Н связи например, вводя Тре или Сер на место D1-208.

VII. Сравнение графиков Эйринга для констант скорости переноса электрона (к) в различных мутантах класса I в D1-208, 209 и 212 сайтах, продемонстрировали зависимость противоречущую закону Аррениуса при повышении температуры, с выравниванием к в точке То (где То оптимальная температура роста исследуемого организма). Кривая показала постепенный

сдвиг То к более высокой температуре при уменьшении значений плотной упаковки атомов участвующих АК остатков. Выравнивание к было объяснено с точки зрения протонной перестройки в ответ на электрон транспортную реакцию. Изучив литературные данные, я пришла к выводу, что увеличенная "гибкость" белка в "горячей точке" белка ФС2 позволяет протонный тоннельный переход при повышенной температуре и таким образом ограничивает константу скорости переноса электрона. Поскольку "гибкость" в сайтах мутаций уменьшается при внесении различных АК в точке Б1-212, более высокая температура необходима, чтобы соответствовать условиям для

тоннельного перехода.

В заключении: результаты этой диссертации предлагают экспериментальное обоснование нового механизма биокаталитической модуляции в мембраных и возможно водорастворимых белках при различных температурах окружающей среды.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль малых аминокислот в белковых (D1/D2) взаимодействиях в адаптации к температуре реакционного центра фотосистемы II»

1. ОБЩЕЕ ВВЕДЕНИЕ

Фотосинтез. Фотосинтез - процесс преобразования энергии света в энергию химических связей, в ходе которого происходит синтез углеводов в растениях, водорослях, и некоторых видах бактерий2. Биомасса и кислород, непрерывно производящийся во время фотосинтеза, обеспечивают жизнь на земле во всевозможных температурных нишах от холодной Антарктиды до обжигающе горячих источников3. Фотосинтез растений и водорослей является в основном двустадийным процессом, протекающим в хлоропластах, в то время как у фотосинтетических бактерий он происходит в складках специализированной тиллакоидной мембраны. Первая стадия является светозависимым переносом электрона через фотосинтетическую мембрану и участвует в создании протонного градиента. Сформированный энергетический потенциал приводит к синтезу АТФ и НАДФ (Рис. 1). Эти два вещества используются во второй стадии, главным образом, охватывающей цикл Кальвина для синтеза углеводов, которые являются основанием пищевых цепей на земле. Атмосферный кислород - по существу побочный продукт фотосинтеза зелёных растений, морских водорослей и цианобактерий и пополняется каждые десять лет или около этого.

ATP Synthèse

Рисунок 1. Поток электронов проходит от ФС2 (окислитель Н20) к ФС1 (восстановитель НАДФ) в процессе фотосинтеза зеленых растений и цианобактерий. Эта реакция запускается поглощением квантов света ФС2 (первичным донором Р680) и PSI (Р700). Восстановленный пластохинон PQH2 является мобильным электронным переносчиком, направляющим электроны в цитохром bf комплекс. Оттуда, восстановленный пластоцианин (PC) несет электроны к PSI, который создаёт восстановленный ферредоксин (Fd). Этот восстановитель несёт электроны к NAD+, чтобы сформировать NAD®. Протонный градиент через тиллакоидную мембрану формируется, когда электроны текут через цитохром ô/комплекс, и используется АТФ синтазой, чтобы синтезировать АТФ.

Световые реакции происходят в тиллакоидиой мембране объединенным действием реакционных центров и антенн. Это мембранные белковые комплексы со встроенными в них молекулами хлорофилла и другими кофакторами, которые составляют фотосистемы. В кислород производящих фотосинтетических организмах два различных реакционных центра, известные как фотосистема I (ФС1) реакционный центр (РЦ) и фотосистема II (ФС2) реакционный центр (РЦ) работают в тандеме4. ФС2 окисляет воду и переносит электроны к ФС1 которая принимает электроны чтобы восстановить НАД до НАДФ (Рис. 1).

В этой работе я исследую взаимодействие между стабильностью и функциональной "гибкостью" ФС2 в адаптации скорости переноса электронов к температурам окружающей среды различных фотосинтетических организмов. Структура и функция фотосистемы 2. ФС2-это вода/пластохинол оксидоредуктаза, которая запускается светом и функционирует как ключевой компонент фотосинтетических мембран в кислород производящих организмах (Рис. 2). Функциональная ФС2 состоит из более чем 20, главным образом полипептидных субъединиц, которые связывают до 250 молекул хлорофилла и много других кофакторов, ионов и водных молекул5. Присутствие таких кофакторов, как известно, влияет на фолдинг, олигомеризацию и стабильность мембранных белков6.

Недавно, структура ФС2 из термофильной цианобактерии ТИегтозупескососсш е1оща.Ш, был решена сначала в среднем разрешении 3.5А 7, а затем в более высоком разрешении З.ОА8. Центральная единица белкового комплекса ФС2-это реакционный центр. Функциональное ядро ФС2 представляет собой гетеродимер, состоящий из двух гомологичных белковых субъединиц, О] и Б2, наряду с одной единицей цитохрома Ь559. Каждый из Б1 и В2 белков состоят из пяти (А, В, С, £> и Е) трансмембранных (ТМ) альфа спиралей. Причём Б и Е альфа спирали перекрещиваются в центре и образуют белковый домен, который удерживает все кофакторы (Рис. 2). Окислительно-восстановительная деятельность связанных кофакторов смодулирована окружающим белком, в то время как направленность, скорость и квантовый выход энергии/переноса электрона, очень чувствительны к пространственной организации кофакторов. ФС2 была предметом многочисленных исследований, нацеленных на решение задач взаимодействия структуры и функции белка9"12.

Электрон транспортные реакции в РЦ ФС2 начинаются с поглощения фотона специальной парой хлорофилла, названной Р680. Этот электронный донор становится возбуждённым, и электрон далее передаётся через цепь электрон транспортных переносчиков к дополнительному хлорофиллу, к феофитину, к первичному пластохинону QA и наконец к вторичному

пластохинону, Qв■ Хинон ()в превращаются в пластохинол и может принять второй электрон и два протона (синхронизация ЭП и протонного переноса все еще не ясна), формируя пластогидрохинон PQH2. Этот конечный продукт восстановления ФС2 диффундирует сквозь мембрану, чтобы восстановить цитохром ЬЬ/ комплекс как часть электронных и протонных процессов переноса.

Первые три электронных переноса в ФС2 очень быстры из-за механического квантового тоннелирования через белковый матрикс14. Константа скорости для этого процесса зависит от разницы между окислительно-восстановительными энергиями переносчиков электрона и их относительной геометрии, увеличивается при понижении температуры и выравнивается, при определенной низкой температуре15. Четвертый и определяющий шаг включает последовательные два восстановления с помощью <2л-

Было показано, что скорость первого переноса электрона от Оа- к ограничена конформационным изменением в РЦ, выделенном из пурпурных и зеленых не производящих кислород бактерий.

Рисунок 2. Реакционный центр фотосистемы 2 из ТЬегтохутсИососст е1оп%аХт. 01 и Э2 субъединицы показаны как ленты зеленого и голубого цвета, соответственно. Электрон транспортные кофакторы включают: специальная пара хлорофилла Р680 (красный), дополнительные хлорофиллы (оранжевые), феофитины (темно-синий), пластохиноны (фиолетовый) и негемовое железо (бордовый). Активный элекгронтранспортный путь обозначены стрелками в левой части реакционного центра. Файл (2¿/х!) структуры взят из банка данных белка (р<1Ь) 13.

В небольшом количестве адаптированных в темноте кристаллов таких РЦ вторичный хинон занимает дистальное или не функциональное положение, в то время как в РЦ приспособленных к свету он находится в проксимальном или функциональном положении16,1'. Выло сделано предположение,что движение Qв от дистального до проксимального связывающего участка ()в отражает конформационное изменение, которые, таким образом, контролируют ЭП от Ол- до Ов-

Однако исследования, которые стремились подтвердить движение хинона, были не в состоянии обнаружить дистальное положение . Точно так

же мутант Ь-Р209У бактериального реакционного центра, у которого есть уже в проксимальном положении19, не показал существенных различий в первом ЭП от <9г до 20. Таким образом, движение хиноиа, кажется, не ограничивают скорость процесса ЭП. Механизм, лежащий в основе конформационного изменения белка, которое управляет процессом ограничивающим скорость ЭГ1 все еще, остается нерешенным вопросом. Возможно такие конформационные изменения должны быть связаны с трансмембранной (ТМ) природой белков РЦ ФС2. В то время как ТМ спирали образуют структуру, держащую функциональные кофакторы и переносчики в пространстве, специфические меж-спиральные взаимодействия, могут, контролировать локальные конформационные изменения.

Фотосистема 2- мембранный белковый комплекс. Мембранные белки выполняют много жизненно важных биологических функций, таких как сигнальный перенос, энергетическое преобразование и проведение пассивного

и активного транспорта21.

Однако, только небольшая фракция структур мембранных белков известна при высоких разрешениях, из-за трудностей, связанных с кристаллизацией. В результате отношения структуры и функции многих мембранных белков с известными последовательностями поняты слабо22. Общее понятие - то, что третичная структура мембранных белков, главным образом, составлена из узлов альфа-спиралей, в то время как бета складчатые домены формируются в редких случаях. Согласно двухэтапной модели сворачивания, мембранные белки сначала сворачиваются в независимо устойчивые ТМ альфа спирали. Вторая стадия - взаимодействие таких альфа спиралей, которые формируют третичную структуру белка23. Понимание молекулярных факторов, которые управляют ассоциацией ТМ спиралей, остается одним из главных вопросов в исследовании отношений структуры-функции мембранных белков. Факторы, которые управляют сворачиванием и функциональной стабильностью мембранных белков, были изучены в различных системах24"32. Было предположение, что нековалентиые

взаимодействия полярных остатков в ТМ спиралях сильно влияют на сворачивание или ассоциацию интегральных мембранных белков'3-34. Значение Н-связсй между ТМ спиралями недавно стало центром нескольких исследований35. Модели и экспериментальные исследования ФС2 и бактериального реакционного центра (БРЦ) предполагают, что такие связи способствуют функциональной стабильности комплекса24 36. Исследования, проведённые в нашей группе, предполагают роль меж-спиральных Н связей в обеспечении функциональной гибкости белков137 38.

Стало очевидно, что упаковка альфа спиралей является фундаментальной для стабилизации и функции всех мембранных белков6 и как показали результаты в последние годы, мотивы плотной упаковки атомов, и полярные остатки, часто вовлечены во взаимодействие альфа спиралей''9.

Малые АК остатки, найденные между альфа спиралями и образующие [малые] ххх [малые] мотивы, ([малые] представляет Гли, Ала или Сер), которые обеспечивают близкие и плотные межбелковые взаимодействия40. Кроме того, малые АК вступают в сеть Н-связей (Са-Н...О), образованных при помощи атомов, которые формируют остов альфа спиралей41. Эти связи стабилизируют димеры спиралей и позволяют выполня ть ТМ белкам специфические функции. Например, малые АК остатки, расположенные между спиралями и формирующие поры ионных каналов, прдположительно обеспечивают конформациоииую гибкость белка42.

Вообще, исследование функциональных состояний мембранных белков показало, что малые АК остатки стабилизируют структуру мембранных белков и в то же время обеспечивают функциональную "гибкость" этой структуры40.

Температура и фотосинтез. Было найдено, что ФС2 играет особенно важную роль в реакции фотосинтеза на экологические изменения и внешние стрессовые влияния. Главный фокус исследований фотосинтеза был: изучение первичного сайта фотоингибирования, переход состояний (ФС1/ФС2), фосфорилирования белков и биогенезис43.

Здесь я адресую вопрос того, как фотосинтез смодулирован в ответ на окружающую температуру в разных видах цианобастерий и что является молекулярным механизмом, который управляет температурной адаптацией скорости ЭП передачи электрона в белковых комплексах ФС2.

Температура - один из главных факторов окружающей среды, которые определяют распределение фотосинтетических организмов в природе. Среды обитания, занятые фотосиитетическими организмами находятся в пределах от очень низких температур арктической пустыни до около 50оС в пустынях и до 70оС в горячих источниках. Как было показано Berry and Bjorkmann44, растения, которые растут при холодной температуре показывают максимальные скорости фотосинтеза при более низкой температуре, чем делают растения, выращенные при теплой температурой и увеличение температуры роста привело к увеличению оптимальной температуры для фотосинтеза.

Экстремальные температуры могут сильно подавлять фотосинтез, разрушая целостность ключевых фотосинтетических белков. Эти биомолекулы приспосабливаются к чрезвычайным условиям с помощью сохранением функционального состояния белка с характерным и хорошо уравновешенным компромиссом стабильности и "гибкости". Кроме того было показано во многих сравнительных исследованиях гомологичных белков из экстремофильных организмов, что регулирование локальной "гибкости" -

45-48

ключевое событие в адаптации этих белков к повышенным температурам Было найдено, что сайты растворимых белков, которые, кажется, играют ключевую роль в функциональной адаптации, являются участками, которые влияют на изменения конформации областей белка движущихся во время

49

катализа .

Цель этой работы в раскрытии механизмов, которые лежат в основе термической акклиматизации фотосинтеза. Более конкретно, я стремилась количественно определять адаптацию скорости ЭП от QA- к Qb к внешней температуре ФС2, и найти структурные элементы, которые регулируют эту адаптацию.

Моя рабочая гипотеза - то, что определенные АК остатки, найденные в области контакта белковых субъединиц 131 и 02, обеспечивают элемент локальной гибкости. Эта локальная "гибкость" может быть смодулирована, изменяя размер АК остатков, тип и силу межбелкового взаимодействия. В результате изменение энтропии активации для процесса ЭП обеспечивает средства для измения оптимальной деятельности белков РЦ ФС2.

Объяснение для модификации белка. В результате анализа данных т 5///С0 кристаллической структуры белков РЦ ФС2 было показано, что участок контакта О альфа спиралей содержит последовательность подобную ГлихххГли в центре ТМ белкового домена. Такие области, как утверждается, в литературе обеспечивают локальную подвижность белка. Эта гибкость должна зависеть от способности соответствующих АК остатков приобретать множественные конформации, что обеспечивается малыми АК остатками. Таким образом, если моя гипотеза правильна, введение АК остатков, которые образуют сильные межмолекулярные взаимодействия (такие как сильно полярные или большие АК остатки), может привести к изменению функции белков РЦ и в особенности изменению скорости (?л-<2в ЭП. Более того потенциальные АК образующие белок-белковые взаимодействия в этом домене могут контролировать конформационный переход из неактивной в активную белковую конформацию и таким образом энтальпию активации процесса ЭП. Следовательно, замена таких остатков должна затронуть стабильность неактивного комплекса и таким образом процесс ЭП. Самые вероятные АК остатки, которые могут давать такие эффекты и поэтому являются благоприятными кандидатами мутагенеза: 01-208, и 0-212, находятся в контакте двух белковых субъединиц (Рис. 3). Однако сравнение множественных АК последовательностей белков показало, что 01-209 также изменяется между мезофиллами и термофиллами, делая его кандидатом для мутагенеза в моей диссертационной работе.

Рисунок 3. Реакционный центр фотосистемы 2 из Thermosynechococcus elongatus. D1 и D2 субъединицы показаны как ленты зеленого и голубого цвета, соответственно. Электрон транспортные кофакторы включают: специальная пара хлорофилла Р680 (красный), дополнительные хлорофиллы (оранжевые), феофитины (темно-синий), пластохиноны (фиолетовый) и негемовое железо (бордовый). Активный электронгранспотный путь обозначены стрелками в левой части реакционного центра. D1-208, 209, 212 и D2-207. 208, 211 малые аминокислотные остатки показаны как сферы атомов. Файл (2axt) структуры взят

из банка данных белка ipdb)

13

Я выдвинула гипотезу, что локальная подвижность белка, важна для регуляции ()А- Ов ЭП по нескольким причинам: 1. Колебания й альфа спиралей в и 02 белках могут быть причиной реорганизации пространственной геометрии хинонов, и возможно других участников электрон транспортной цепи в такие конформации которые приводят к облегчённому ЭП (без барьера энергии активации).

2. Такое колебание может помочь протонному перемещению через электрон транспортный путь таким образом стабилизируя различные редокс состояния в белках РЦ.

Мотив ГлихххГли. Мотивы подобные ГлихххГли были теоретически изучены в нашей группе как потенциальные кандидаты для изменения местной "гибкости" белка при помощи МБВС в мембранных белках1'3738. Присутствие последовательности подобный ГлихххГли в РЦ ФС2, было исследовано, используя последовательности О альфа спиралей главных белков ФС2 01 и 02 из различных организмов. Множественное выравнивание последовательностей выдало мотив подобный ГлихххГли в й альфа спиралях главных белков (Рис. 4). Сохранённый в процессе эволюции 01-0208ххх8/С/А212 мотив плотной упаковки атомов расположен в середине последовательности Э спирали субъединицы 01. Подобный 02-0/А207хххС211 мотив плотной упаковки атомов расположен в середине спирали О белка 02 (Рис. 4). Остатки, которые, как предполагают, сформировали предполагаемые межбелковые взаимодействия, найдены в составе 01-С208ххх8/С/А212 мотива. В белках РЭП они включают 01-212 как донора Н-связи с 02-207, и остаток 01-208 (в основной цепи) как акцептора 02-211. Сайт 209 вовлечен, как предполагается, в Ван Дер Ваальсовы взаимодействия, но его боковая цепь направлена наружу от межбелкового пространства, и 01-208, как ожидается, управляет главными конформационными изменениями в этой области.

Как показывает структура ФС2, мотив плотной упаковки расположен между главными белками, формирующий межбелковые взаимодействия в центре ключевых белков ФС2. Таким образом нарушение или разрушение межбелковых взаимодействий могут вызвать изменение в пространственном расположении кофакторов и изменить скорости ЭП на донорном и также па акцепторном участке ФС2. Кроме того, эти взаимодействия могут регулировать местную "гибкость" белка и таким образом играть центральную роль в температурной адаптации скорости катализа ФС2.

Огдаг^эт

Р8В1_ЗУКГЕЬ РЗВ1_ЗУМУи РЗВ2_ЗУЫЕЬ РЗВ2_5УЫУЗ рв ва_суара рэва_сньке РЗВА_ЗР10Ь 02

135Ь:Б рзвб_зуыуз рб вб_суара РБ ВБ_СНЬКЕ рввю брюь

Рисунок 4. Многократное выравнивание последовательности в О альфа спиралях и 02 белков из различных организмов. Сохраненные в эволюции мотивы подобные ГлихххГли (выделенные рамкой) иайденны в центре ТМ I) альфа спирали и Э2 главных белков ФС2. Последовательности взяты из базы данных Я^вркИ (или РОВ, когда доступны). Донорные МБВС акцепторные остатки выделены голубым и зелёным цветом, соответственно.

Дополнительно, результаты множественного выравнивания последовательностей показали, что Цис или Ала занимают сайт Э1-212 во всех исследованных последовательностях термофильных цианобактерий и термотолерантной красной водоросли Суашёшт СаШагшт, Ала занимает место 01-209 в тех же самых организмах. Кроме того Ала занимает сайт ЭI -209 и 212 в рэЬА1 копии белка 01 в ЗупесИосуБ^Б 6803. Эта копия рассматривается как молчащая и дивергентная, и экспрессируется она только в условиях недостатка кислорода. Упомянутые остатки в Э1-209 и 212 позициях заменены Сер во всех кислород производящих мезофильных организмах (Рис. 4), которые являются единственными сайтами несущими консервативные изменения в последовательностях термофильных и мезофильных организмов в О и Е ТМ цепях. Следовательно я выдвинула гипотезу, что Э1-209 и 212 участки могут быть "горячими точками" в тепловой адаптации сложного белкового комплекса ФС2.

-В пе11х вес[иепсе-208 212

РРНОЬСУАСУР1 РРНОЬСУАСУР' РРНМЬОУАСУР! РРНМЬС\7АС\7Р' РРНММСУАСУР' РРНМЬСУАОУР' РРНМЬСУАСУР'

РРНММСУАСУЬ' РРИММСУАСГЬ1 РРНММСУАСУЬ1 РРНММСУАСУЬ' РРНММСУАСУЬ'

ШвЗЬУТВ сзБУтг

сагл/тв

СЗЬУТв СБЫ/ТЯ

^бгл/ТБ

1НСАТУЕЫ НЮАТУЕЫ шватч/еы ШСАТУЕЫ |ЫДА1НОАТУЕЫ

Р ЬеИх------

РЗВ1_ЗУЫЕЬ РЗВ1_ЗУЫУи РЗВ2_ЗУЛЕЬ

рзвазуиуз

Р5ВА_СУАСА РЗВА_СУАРА РЭВ2_ЗУЫУЗ РЗВА_ЗР10Ь РЗВА СНЬКЕ

С13СТРЫРМ1УРдАЕН-Ы1ЬМНРРН0ЬвУАСУРССАЬРСАМНСЗЬУТЗЗЫНЕТТЕТЕЗА С18СТРКРМ17Р0АЕН-Н1ЬМНРЕН0ЬвУАСУРССАЪРСАМНСЗЬУТЗЗЬ1ЯЕТТЕТЕЗА С13СТРМРМ1УР0АЕН-Ы1ЬМНРРНМЬСУАСУРССАЬРААМНСЗЬУТЗЗЫРЕТТЕТЕЗТ О13СТРМРМЪУЬОАЕН-МУЪМНРРН№СУАСУРССАЬРААМНСБЪУТ35Ъ1йЕТТЕУЕ50 С130ТРМРМЬУР0АЕН-ШЬМНРРНМАаУАСУР0САЬРЗАМНСЗЪУТЗЗЫЯЕТТЕМЕЗР СГЗСТРЫРМЬУРОАЕН-ШЬМНРРНШвУАСУРССЗЬРЗАЖСЗЬУТЗЗЬХРЕТТЕЫЕЗА С13СТРНРМ1УРОАЕН-М1ЬМНРРНМЬвУАСУРОСБЪРЗАМНвЗЬУТЗЗЬШЕТТЕУЕЗО С13вТРМРМ1УР0АЕН-Ы1ЬМНРРНМЬвУАОУРСвЗЬРЗАМНСЗЬОТЗЗЫРЕТТЕЫЕЗА ОХЗСТРЯРМХУРОАЕН-тЪМНРРНМЬаУАаЮвСВЬРЗШНвЗЬУТЗЗЪХЯЕТТЕНЕЗА

Е ЬеИх-----

РЗВ1_ЗУЫЕЬ PSB1_SYNVU РЗВ2_ЗУНЕЬ рзв1_зушз РЁВА_СУАСА РЗВА_СУАРА РвВ2_ЗУШ'3 РЗВА_ЗР10Ь РЭВА СНЫ?Е

NYGYKFGQEEETYNIVAAHGУFGRLIFQYASFNNSRSLHFPLAAWPWGVWFTALGISTM NYGYKFGQEEETУNIVAAHGУFGRLIFQYASFШSRSLHFFLAAWRWGVWFAALGISTM ИУСУКРООЕЕЕТУМ1УААН6УРСРЬ1РОУАЗРШЗРЗЬНРРЬААНРУУС:№РААЬС13ТМ

NYGYKLGQEEETYNIVAAHGYFGRLIFQYASFШSRALHFFLGLWPWGIWLTSIGISTM NAGYKFGQEEETYNIVAAHGYFGRLIFQYASFNNSRSLHFFLALWPWGIWFTALGLSTM ОТвУККС0ЕЕЕТта1УААНвУРвКЪ1Р0УАЗРШЗЕЗЪНРРЬвАГСРУ1СШРТАМвУЗТМ NEGYRFGQEEETYNIVAAHGYFGRLIFQYASFNNSRSLHFFLAAWPWGIWFTALGISTM NEGYRFGQEEETYNIVAAHGYFGRLIFQYASFNNSRSLHFFLAAWPVXGXWFTALGLSTM

Рисунок 5. Многократное выравнивание последовательностей В и Е альфа спиралей белка О} из теплолюбивых цианобакгерий (красные буквы) и мезофильных организмов (черные буквы). Последовательности из термотолерантных красных водорослей СуатсИит саЫагшт и дивергентной ряЬА! копии белка показаны розовыми буквами. Последовательности взяты из базы данных ЗулБзркЯ.

Схема мутагенеза. Направленный и комбинаторный подходы мутагенеза были применены в белках ФС2 для введения направленных и случайных мутаций в особые участки или области белка52. Эти методы использовались, чтобы ввести чувствительные зонды для оценки структурных требований белковой последовательности, сопровождаемые функциональной селекцией, и привели к идентификации аминокислотных остатков, которые могут быть введены в участки белка, сохраняя функцию ФС223"". Здесь я предлагаю изменить 01-208, 209 и 212 малые остатки найденные в межбелковом пространстве с помощью комбинаторного мутагенеза девятнадцатью другими аминокислотами в цианобактериях Зупескосузйз вида РСС6803, чтобы исследовать функциональную роль этих остатков.

Биологическая система. Цианобактерия 5упесИосуъИз вида РСС 6803 была выбрана как экспериментальная система для мутагенеза белка Это -одноклеточная не азот фиксирующая цианобактерия и обитатель пресного водоёма (Рис. 6).

Рисунок 6. Одноклеточные прокариотические сине-зеленые водоросли ЗупесЪосуяИя вида РСС 6803. Эта линия была изолирована из пресноводных озёр, и было доставлена в Коллекцию Клеточных культур института Пастера (РСС) в 1968.

Её фотосинтетический аппарат структурно, спектроскопически и функционально идентичен высшим растениям. Кроме того геном этого организма (-3.6 миллиона пар оснований) полностью секвенирован56, клетки могут подвергаться спонтанной трансформации (то есть, сама захватывает ДНК), и интегрирует ДНК в геном с помощью двойной гомологичной рекомбинации, приводящей к генной замене.

Бактерии БупесНосузИя 6803 можно вырастить в отсутствие функциональной ФС2 (то есть является фотогетеротрофом) добавляя в среду глюкозу и

25

позволяет мутировать оба РЦ (ФС1 РЦ и ФС2 РЦ) несмотря на их фотосинтетический статус12,57. У этого организма есть три копии рйЬА гена (ряЬА!, ряЬАЛ и рбЪАШ), которые подобны в их основной последовательности, но которые экспрессируются при различной интенсивности света50.

2.НЕЛЬ И ЗАДАЧИ

Моя цель исследования состояла в том, чтобы найти:

1). Как малые аминокислотные остатки, найденные в белок-белковом пространстве, способствуют функции комплекса ФС2? (Физиологические и биохимические исследования)

2). До какой степени модификации этих определенных остатков изменяют конформационную подвижность белка и температурно-зависимый кинетический профиль ЭП от QA- к QB1 (Температурно-зависимые измерения ЭП от QA- к QB и термодинамические вычисления).

Более конкретными моими задачами были:

1). Измерить температурно-зависимые скорости ЭП от QA- к QB в организмах из сред обитания с высокими температурами, чтобы получить их профили температурной деятельности.

2).Выбрать АК остатки, которые могли бы быть вовлечены в специфические функциональные межбелковые взаимодействия. Начальный выбор был основан на филогенетическом сохранении известных последовательностей главных белков ФС2, среди организмов производящих кислород. Кроме того я использовала программу Swiss-PDB Viewer, чтобы визуализировать межбелковые электростатические взаимодействия в кристаллической структурной модели ФС2.

3). Исследовать потенциально функциональные остатки с помощью методики насыщающего мутагенеза объединённого с функциональной селекцией в D1-208, 209 и 212 сайтах в цианобактериях Synechocystis вида РСС 6803.

4). Провести физиологические и биохимические измерения полученных мутантов, измерить температурно зависимый кинетику ЭП от QA- к QB и проанализировать термодинамику полученных мутантов, чтобы выяснить роль различных АК боковых цепей в функции РЦ ФС2 и местной подвижности белка.

5). Критически проанализировать роль мутантных сайтов используя активность мутированных организмов и сравнить их с активностью дикого типа.

ГЛАВА 1

Подвижность Белка Адаптирует Фотосинтетическое Преобразование Энергии к Окружающей Температуре.

Оксана Кернер1'*, Илан Самиш1'2'*, Давид Кафтан1'3'*, Нета Холланд1'4, П.С. Марути Сай5, Хадар Клесс1, Авигдор Шерц1

*Кафедра прикладной ботаники, Институт имени Вейцмана, Реховот, 76100 Израиль.

*Эти авторы в одинаковой степени внесли свой вклад в данную работу. 2Настоящий адрес: Кафедра биохимии и молекулярной биофизики, Медицинский факультет и кафедра химии, Факультет искусств и наук, Пенсильванский университет, Филадельфия, Пенсильвания, 19104, США. 3Настоящий адрес: Лаборатория нанобиологии, Институт физической биологии USB и институт системной биологии и экологии ASCR, Замек 136, CZ-37333, Новые Грады, Чехия.

4Настоящий адрес: кафедра биологии, Израильский институт технологий, Хайфа 32000, Израиль.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Шлык-Кернер, Оксана Владимировна, 2006 год

Литература

1. Okamura, М. Y., Paddock, M. L., Graige, M. S. & Feher, G. Proton and electron transfer in bacterial reaction centers. Biochim Biophys Acta 1458, 14863 (2000).

2. Iwata, S. & Barber, J. Structure of photosystem II and molecular architecture of the oxygen-evolving centre. Curr Opin Struct Biol 14, 447-53 (2004).

3. Wraight, C. A. Proton and electron transfer in the acceptor quinone complex of photosynthetic reaction centers from rhodobacter sphaeroides. Front Biosci 9, 309-37 (2004).

4. Ferreira, K. N., Iverson, Т. M., Maghlaoui, K., Barber, J. & Iwata, S. Architecture of the photosynthetic oxygen-evolving center. Science 303, 18318 (2004).

5. Loll, В., Kem, J., Saenger, W., Zouni, A. & Biesiadka, J. Towards complete cofactor arrangement in the 3.0 A resolution structure of photosystem II. Nature 438, 1040-4 (2005).

6. Moser, С. C. et al. in Advances in Protein Chemistry 63: Membrane Proteins 71-109 (Academic Press Inc, 2003).

7. Li, J., Gilroy, D., Tiede, D. M. & Gunner, M. R. Kinetic phases in the electron transfer from P+QA-QB to P+QAQB- and the associated processes in Rhodobacter sphaeroides R-26 reaction centers. Biochemistry 37, 2818-29 (1998).

8. Garbers, A., Reifarth, F., Kurreck, J., Renger, G. & Parak, F. Correlation between protein flexibility and electron transfer from QA-* to QB in PSII membrane fragments from spinach. Biochemistry 37, 11399-404 (1998).

9. Xu, Q. & Gunner, M. R. Exploring the energy profile of the Q(A)(-) to Q(B) electron transfer reaction in bacterial photosynthetic reaction centers: pH dependence of the conformational gating step. Biochemistry 41, 2694-701 (2002).

10. Joshi, M. & Fragata, M. Heat-induced changes in the photochemical centres and the protein secondary structures of photosystem II studied by variable fluorescence and difference FT-IR spectroscopy. Zeitschrift Fur Naturforschung C-a Journal of Biosciences 54, 35-43 (1999).

11. Deisenhofer, J., Epp, O., Sinning, I. & Michel, H. Crystallographic refinement at 2.3 A resolution and refined model of the photosynthetic reaction centre from Rhodopseudomonas viridis. JMol Biol 246, 429-457 (1995).

12. Senes, A., Engel, D. E. & DeGrado, W. F. Folding of helical membrane proteins: the role of polar, ГлихххГли-like and proline motifs. Curr Opin Struct Biol 14, 465-79 (2004).

13. Curran, A. R. & Engelman, D. M. Sequence motifs, polar interactions and conformational changes in helical membrane proteins. Curr Opin Struct Biol 13,412-7(2003).

14. Friedman, R-., Nachliel, E. & Gutman, M. The role of small intraprotein cavities in the catalytic cycle of bacteriorhodopsin. Biophys /85, 886-96 (2003).

15. Eilers, M., Shekar, S., Shieh, T., Smith, S. & Fleming, P. Internal packing of helical membrane proteins. Proc Natl Acad Sci USA 97, 5796-5801 (2000).

16. Knapp, M. J., Rickert, K. & Klinman, J. P. Temperature-dependent isotope effects in soybean lipoxygenase-1: Correlating hydrogen tunneling with protein dynamics. J Am Chem Soc 124, 3865-3874 (2002).

17. Kohen, A., Cannio, R., Bartolucci, S. & Klinman, J. P. Enzyme dynamics and hydrogen tunnelling in a thermophilic alcohol dehydrogenase. Nature 399, 496-9 (1999).

18. Liang, Z. X., Lee, T., Resing, K. A., Ahn, N. G. & Klinman, J. P. Thermal-activated protein mobility and its correlation with catalysis in thermophilic alcohol dehydrogenase. Proc Natl Acad Sci USA 101, 9556-61 (2004).

19. Wong, K. F., Selzer, T., Benkovic, S. J. & Hammes-Schiffer, S. Chemical Theory and Computation Special Feature: Impact of distal mutations on the network of coupled motions correlated to hydride transfer in dihydrofolate reductase. Proc Natl Acad Sci USA 102, 6807-12 (2005).

20. Kohen, A. & Klinman, J. P. Enzyme catalysis: Beyond classical paradigms. Acc Chem Res 31, 397-404 (1998).

21. Hammes-Schiffer, S. & Iordanova, N. Theoretical studies of proton-coupled electron transfer reactions. Biochim Biophys Acta 1655, 29-36 (2004).

22. Remy, A. & Gerwert, K. Coupling of light-induced electron transfer to proton uptake in photosynthesis. Nat Struct Biol 10, 637-44 (2003).

23. Somero, G. N. Protein adaptations to temperature and pressure: complementary roles of adaptive changes in amino acid sequence and internal milieu. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 136, 577-91 (2003).

24. Zavodszky, P., Kardos, J., Svingor & Petsko, G. A. Adjustment of conformational flexibility is a key event in the thermal adaptation of proteins. Proc Natl Acad Sci USA 95, 7406-11 (1998).

25. Bower, M. J., Cohen, F. E. & Dunbrack, R. L., Jr. Prediction of protein side-chain rotamers from a backbone-dependent rotamer library: a new homology modeling tool. J Mol Biol 267,1268-82 (1997).

26. Word, J. M. et al. Visualizing and quantifying molecular goodness-of-flt: small-probe contact dots with explicit hydrogen atoms. J Mol Biol 285, 171133 (1999).

27. Senes, A., Ubarretxena-Belandia, I. & Engelman, D. M. The Calpha —H...O hydrogen bond: a determinant of stability and specificity in transmembrane helix interactions. Proc Natl Acad Sci USA 98, 9056-61 (2001).

28. Goldberg, E. (M.Sc. thesis, Weizmann Institute of Science, 2004).

29. Liang, J., Edelsbrunner, H., Fu, P., Sudhakar, P. V. & Subramaniam, S. Analytical shape computation ofmacromolecules: II. Inaccessible cavities in proteins. Proteins 33, 18-29 (1998).

30. Nedbal, L., Trtilek, M. & Kaftan, D. Flash fluorescence induction: a novel method to study regulation of Photosystem II. JPhotochem Photobiol B: Biol 48, 154-157(1999).

Дополнительная информация сопровождает работу.

Утверждение о столкновении интересов: авторы заявляют, что у них нет столкновения финансовых интересов.

Вопросы и требования к материалам должны быть отправлены на адрес: Avigdor. [e-mail]

Выражение признательности: Мы благодарны Б. Лолл, Дж. Бисиадка и В. Зангер за то, что они отправили нам свои координаты РЦ фотосистемы II до публикации. М. Эдельман за тщательное прочтение работы, С. Питроковски за содействие в сборе данных и В.Л. ДеЛано за содействие в применении новых методов PyMol. Это исследование поддерживалось грантом SPF #533, Организацией Виллстаттер-Аврон-Минерва, занимающейся вопросами фотосинтеза, Министерством образования, молодежи и спорта Чехии (MSM6007665808), Академией наук Чехии (Институционная исследовательская концепция AVOZ60870520) и Национальным институтом здоровья США (RR08605-06). А. Шерца, занимающего должность профессора биохимии в фонде имени Yadelle и Robert Sclare.

Рисунок 1. Сохранённые в эволюции структурные и функциональные элементы в пурпурных бактериях РЦ фотосистемы II. а. Свет вызывает ЭП от специальной пары хлорофиллов {Рщ РС2 зеленый) через дополнительный хлорофилл (СМ о! желтый) и феофитин (Ркеоы пурпурный) к кофакторам хинонов {<2а и Qв красный), удерживаемых субъединицами (фуксия) и 1)2 (голубой). Изображены негемовое железо (розовый) и атомы, идущие вдоль трех основных впадин (оранжевый). Ь. Потенциальная межбелковая водородная связь (пунктирная линия) между спиралями I) и Е двух субъединиц. Изображены остатки, вовлеченные в эти связи, например 01-С212 (атом серы, отмеченная звездочкой). Для ясности нарисованы только две самые большие впадины.

Рисунок 2. Скорость ЭП от в мезофильных и термофильных

цианобактериях. а. Графики Эйринга для ЭП в мезофиллах {Бупескосузия 6803, закрытые круги) и термофилах (ТкегтоБупескососст еЬщаШя, открытые круги). Ь. Графики Эйринга для ЭП в В1-212 мутантах класса I цистеин (треугольники), и аланин (ромбы), сравниваемые с Бупескосуз^ 6803 серии дикий тип (закрашенные круги).

Рисунок 3. Эффект остатков В1-212 на впадину РЦ фотосистемы II в структуре Ткегтозупескососсш еЪщаПя . а. Остаток класса I (серин, сферическое изображение) сохраняет впадину открытой; Ь. Остаток класса II (глутамин) разрушает одну из впадин и окаймляет самую большую впадину, которая в другом случае окружена гибкими боковыми цепями.

Рисунок 4. Температурная зависимость и параметры активации ЭП от (2а~^(2в в мутантах Э1-212 БупескосузШ 6803. а. Графики Эйринга в Б1-8212 (закрытые круги), Б1-У212 (открытые квадратики) и 01-С>212 (закрытые квадратики). Ь. Соотношение между энтропией активации и энтальпией для ЭП от С^а-и значениями плотной упаковки атомов остатков сайта Б1-212. Остатки класса I (закрытые круги) отличаются от остатков класса II (закрытые квадратики).

Рисунок 1.

Рисунок 2. а

с

?5 '? у

2.4 • 2.5

2.3 2.2 °о О ои° ° \ р 2.3 2.1

2.1 2.0 с 1.9

1.9 о\ 1.7

1.8 1.5

1 7 1 3

2.7 2.9 3.1 3.3 3.5 1.000/Т (К"1)

3.7

л |С (32 °С) .Б (26 "С)

•

А (33 °С)

\ V л

3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 1,000/Т (К"1)

In (k / T)

0)

packing value

«

s

©

s?

4-

'jj

Дополнительный материал

Дополнительный материал S1: Участие инактивации или денатурации РЦ в не-Аррениусном поведении.

Очевидная ферментная деятельность, противоречащая закону Аррениуса, часто связывается с инактивацией и денатурацией белка при повышенных температурах. Недавно предложена модель, что смесь таких активных и

неактивных ферментов, несет ответственность за сниженную ферментную

80

активность при температурах, значительно превышающих температуру роста . Однако существующие экспериментальные возможности позволяют проследить за работой фермента РЦ фотосистемы II (см. основной текст Методы) и, таким образом, провести деление между относящимися и не относящимися РЦ ФСII к термостабильности.

Термостабильность ФС II в диком типе и в мутантах была установлена из амплитуды самого быстрого компонента затухания флуоресценции, который прямо пропорционален концентрации РЦ ФС II, активного в ЭП от QA к QB-Рисунок S1 показывает амплитуду компонента флуоресценции РЦ фотосистемы И, с самой короткой продолжительностью жизни, полученную при различных температурах, как объяснялось в разделе Методы. Значительные изменения в амплитуде флуоресценции дикого типа (D1-S212, заштрихованные круги) не наблюдались до ~37°С, и Т]/2 (50% инактивации) была достигнута при ~45°С. Подобные кривые с практически такой же Ту2 были получены для аланипа и цистеина. Таким образом, Т0 (25°С, Рис. 2а, 4а) не зависит от теплоустойчивости мутантов класса I и дикого типа Synechocystis 6803. Мутанты класса И могут продемонстрировать такую же температурную зависимость, как мутанты класса I (Val - открытые треугольники) или гораздо более низкую теплоустойчивость (Gin - открытые круги) с хорошо определенным Аррениусным поведением во всех измерениях (Рис. 4Ь). Совместно, эти данные исключают участие инактивации или денатурации РЦ

фотосистемы II в не-Лррениусиом поведении мезофиллов, теплоустойчивых, термофилов и мутантов класса I, описанных в этом исследовании.

0.25

о >

го 0)

ь

Ш

со

о

О

ч—»

(5

а> .с -(—»

ч—

О

й) -О =3

1

Д А д Д

ААОД

°° 6А 0.2- 0 • • • е А

о д

о

0.15 о

0.1

0.05

д

О •

д

о

0

• вег о 01п д Уа!

о

0 10 20 30

ТетрегаШге, °С

40

д

од*

I

50

Дополнительный материал 82: Эволюционное сохранение мотива СхххО во взаимодействующей области двух основных субъединиц РЦ.

ь р.сеъ_ янобн 178 беееткаьаьаьнса

ь исбь" _ин0у1 178 зеъеуиамаъсънсс

01 рбв1_ _зуш/и 203 асуессаъесамнсз

01 _зуыеь 203 асуессаъеаамнсз

01 рэвг" _зуыуз 203 асуессзьеэамнсз

01 рбва^ _суаса 203 асуессаьезамнсз

01 рбва" _сньие 203 асуессзьезамнсэ

01 рбва" _$рюъ 203 асуессзьезамнсэ

02 1$51 с! 202 асуъссаъьса1нса

02 ыр 681245 асуьсоаьъса1нса

02 рбво_ _SYNYЗ 202 ас1ъссаьъса1нса

02 рбво" снъке 203 асуъсааъъса1нса

02 рбво" _5РЮЬ 203 ¡\GVLGliALLCAIHGA

М исем_ 1ш0у1 205 сеаусссьъеаанса

М ксем" _нн03н 207 аеьусзаьъеамнса

Выравнивание последовательности В спиралей из РЦ фотосистемы II и из пурпурных бактерий показывает сохраненный мотив последовательности подобный Схххв (заштрихован серым цветом) в точке пересечения субъединиц. Имена последовательностей даны согласно Зу^эрго! (или РОВ, если не доступны). Для сохранения последовательности см. полный список несохраненных последовательностей ниже. Мотив найден в центре трансмембранной области , где О и £ спирали двух главных белков фотосистемы II (01 и 02) и бактериального РЦ (Ь и М) но,одерживают сохраненную МБВС (описанную в Дополнительной Таблице $4).

Последовательное выравнивание А К последовательностей О спиралей РЦ фотосистемы II и РЦ пурпурных бактерий показывает сохраненную последовательность мотива Охххв (серый фон) в точке пересечения субъединиц. Идентификаторы последовательностей даны согласно Бч^зроЛ (или РОВ). Для последовательности 01. смотрите внизу полный список несохраненных сайтов. Мотив обнаружен в центре области ТМ, где спирали £> и Е двух главных субъединиц РЦ фотосистемы II (01 и 02) и бактериального РЦ (I. и М) удерживают межбелковую водородную связь (описанную в

дополнительной таблице S4). Смотрите дополнительный материал S7 с описанием методов.

Dl-Cep209 и Dl-Cep212 сохранены в эволюции разных видов. Исключения найдены в экстремофилах - галотолеранты, термофилы и копии гена Synechocystis 6803, который, как известно, экпрессируется при изменениях условий освещения*1. Очень мало последовательностей мезофиллов также показали изменения в сайте D1-209. Мы составили список всех обнаруженных несохраненных последовательностей. Когда известны несколько копий гена psbA, указывается конкретная копия гена. Если доступны идентификаторы генов, то они даются кодом Swissprot, если не доступны, то дается код из банка генов.

Несохраненные позиции аминокислотных остатков в сайтах D1-209 и D1-212 включают следующие последовательности:

1. D1 (Сер209) Ала - PSBA-1 (Swissprot: PSBA_CYACA) из экстремофила (процветает при температуре> 45 оС, рН=1 и/или высокая соленость), красная морская водоросль Cyanidium caldarium&2.

2. Dl (Сер209) Ала - (локус: YP_476691, gi: 86607929) из экетремофилыюй цианобактерии Йеллоустонский B-Prime, известный также как Synechococcus JA-2-ЗВ'а (2-13). У A-Prime линии есть та же самая последовательность в этом регионе (местоположение: YP_4747I9, gi: 86605956).

3. Dl (Сер209) Ала- (локус: NP_848970, gi: 30468083) из термо-ацидофильной одноклеточной красной морской водоросли Cyanidioschyzon merolae линия 10D, которая найдена в кислом горячем источнике83 (локус: ААМ62037, gi: 21913561).

4. Dl (Сер209) Ала - (локус: AAR30280, gi: 39753030) из термо-ацидофильной одноклеточной красной морской водоросли Galdieria maxima из кислого горячего источника83.

5. D1 (Сер209) Ала - (локус: АВА21206. gi: 17132876) - Nostoc (или Anabena) вид РСС 7120 - мезофил, азот фиксирующая цианобактерия.

6. D1 (Cep209) Ала - (локус: BAB75441, gi: 75701530) - Anabaena variabilis ATCC 29413 - мезофил, азот фиксирующая цианобактерия, водород производящая цианобактерия.

7. D1 (Сер209) Ала - (местоположение: AAZ59080, gi: 72003278) -Prochlorococcus mar inns str. NATL2A - доминирует над фитопланктоном в тропических и субтропических океанах.

8. D1 (Сер209) Ала - (локус: EAQ69357, gi: 86168099) - Synechococcus вид RS9917 - галотолерантпая цианобактерия.

9. D1 (Сер209) Ала (Сер212) Цис - PSBA-1 (Swissprot: PSBA1_SYNEN или PSBA1_SYNEL), один из двух psbA генов из теплолюбивой цианобактерии Synechococcus elongatus naegel&A.

10. D1 (Сеp209) Ала, (Cep212) Ала - PSBA-2 (Swissprot: PSBA2_SYNEN или PSBA2_SYNEL), один из двух psbA генов от теплолюбивого cyanobacterium Synechococcus elongatus паеgelift4.

11. D1 (Cep209) Ала, (Cep212) Цис - PSBA-1 (Swissprot; PSB1_SYNVU), теплолюбивая цианобактерия Synechococcus vulcanus.

12. D1 (Cer209) Ала, (Фен211) Иле - (локус: ВАС90597, gi: 35213225) из одноклеточной, светочувствительной, без тилакоидной 85 цианобактерии Gloeobacter violaceus вид РСС 7421 из швейцарских известковых пород.

13. D1 (Сер212) Цис - PSBA-1, (TrEMBL; Q9S3W5) - истинная нитевидная теплолюбивая цианобактерия Mastigocladas laminosus.

14. Dl (Сер209) Ала, (Сер212) Ала- PSBA-1 (Swissprot PSB1_SYNY3, Synechocystis вид 6803) 86.Эта копия гена PSBA-1 не экспрессируется в обычных условиях, но может работать при условиях сильного света81.

15. D1 (Сер209) Ала, (Лей210) Фен (Сер212) Цис - (локус: ZP_00108645, gi: 23126757) Nostoc punctiforme вид РСС 73102 - мезофил, азот фиксирующая цианобактерия.

Дополнительный рисунок БЗ: Структурные мотивы внутри РЦ фотосистемы II.

A. Межбелковая водородная связь между спиралями О и £ субъединиц 01 и 02 РЦ фотосистемы II. Это изображение является Рис. 1Ь с увеличенным масштабом, однако без нарисованных диаграмм белковых субъединиц О! и 02 и впадин, для чёткости представления. Отмечены остатки, образующие межбелковые водородные связи находящиеся в трансмембранной области (см. дополнительную таблицу 54).

B. Межбелковая водородная связь, включающая 01-212 и непосредственно прилегающие к нему участки. Если смотреть со стороны субъедипицы 02, можно увидеть, что атом 01-С212 Эв (отмеченный '*') может действовать и как акцептор межбелковой водородной связи, и как донор. Будучи донором, водород должен «выбирать» между двумя альтернативными водородными связями. Отмечены атомы, участвующие в межбелковой водородной связи. С-Е. Внутрибелковыс впадины, обнаруженные в трансмембранной области между субъединицами 01 и 02 РЦ фотосистемы II. Три самые большие впадины (см. дополнительную таблицу 85) формируют сплошной ареал высокой гибкости как раз под гистидииами, лигирующие нсгемовое железо, и, в сущности, до центра этого белкового комплекса. Атомы, идущие вдоль этих впадин (панель с) одинаково распределены между субъединицами 01 и 02 (заполненное пространство, цвет от цвета цепочки) и состоят только из спиралей £> и Е. Самая большая впадина расположена в центре четырехспирального узла (панель (1) как показано сверху. Фокусирование на впадинах и остатках, участвующих в межбелковой водородной связи (панель е), показывает, что две эти структурные черты тесно переплетены.

Дополнительная таблица 84: Потенциальные межбелковые водородные связи

вовлекающие трансмембранные области Р и Е спиралей в РЦ пурпурных

бактерий и фотосистемы II.

РЭВ/ Рез. НВ

Организм Реф. (А) НВ Донор Акцептор Б-А БН-А Угол

М-А1а213СА Ь-8ег2370С 3.7 2.9 131

1тЗх87 2.55 Ь-Азп183Ж>2 М-8ег212 О 3.3 2.3 152

М-®у220СА ь-Швгзоо 3.5 2.9 117

Ь-АвпШШг М-8ег2120 3.3 2.4 148

1рсг88 2.65 М-А1а213СА Ь-Абп1830В1 Ь-8ег2370С 4.3 4.0 3.2 3.1 176 132

Ь-АБП183МЭ2 М-8ег2120 3.1 2.22 148

1ац89 2.2 М-А1а213СА Ь-Азп1830Б1 4.4 3.3 165

р М-А1а217СА Ь-8ег237СЮ 3.4 2.9 111

>5 М-ау220СА Ь-Н1з2300 3.6 3.0 119

а Ь-8ег23700 М-А1а2130 2.8 1.85 165

^ с. к К с (С Е-У. 1а1ё89 2.6 М-А1а213СА М-А1а217Ы Ь-Азп1830Б1 Ь-8ег237СЮ 3.1 3.4 3.3 2.2 2.6 2.8 140 126 107

М-8ег271(Ю Ь-А1а1840 2.9 2.03 144

Ь-Азп183Ш2 М-Суз2ЮО 3.4 2.57 146

5. уггайл 1ргс66 2.3 Ь-А1а184СА м-сувгюзо м- Азп1470Б1 М-8ег2710С 4.2 3.3 140

Ь-ШуШСА 3.7 3.4 3.0 2.8 120 114

Ь-АвпШШг М-8ег2110 2.8 1.9 145

Т. Сер1с1ит 1еу890 2.2 М-А1а212СА Ь-Азп1910Б1 4.5 3.4 177

М-А1а272СА Ь-Суз19280 4.1 3.3 126

• 01-С1у208СА БЬСузгШО В1-СуБ212СА Б1-А1а213СА т-СувШ ее Б2-01у2070 02-Суз2118в 02-МеШ10 4.3 3.4а 4.2а 3.8 3.3 2.8 149 143

В1-01у216СА В2-№82680 3.3 2.5 130

1з517 3.5 01-Ьеи275СА В1-А1а276СА В2-Суз21180 Бг-Суягио 3.8а 3.6 2.9 123

В2-Суз2118С Б1-01у2080 Б1-Ьеи2750 4.0а 3.5а

2 <и н о Б2-Суз21Ш Б2-А1а212СА В1-Суз21280 В1-Ьеи2750 3.6а 4.2 3.5 130

Т. elongatus Б2-01у215СА В1-Шэ2720 3.2 2.7 110

я о о 01-А1а209СА Б2-01у2070 4.0 3.0 152

и о Б1-01у208СА Б2-Суз2118в 3.9 3.2 127

о Д" Б1-А1а276СА Б2-А1а2120 4.1 3.4 124

а* 02-А1а212СА Б1-Ьеи2750 3.9 2.9 147

2ах1;8 3.0 БЬСузгШО 01-А1а213СА 02-Ме12710 Б2-01у2070 02-Ме12710 3.2 3.2а 3.6 1.9 2.7 178 138

02-С1у215СА 01-Шз2720 3.3 2.9 101

Б1-01у216СА В2-Суэ211 вв В2-Шз2680 Б1-01у2080 Б1-Ьеи2750 3.1 3.1а 4.0 2.7 2.8 99 156

02-Ме1271СА БЬСузгШв 3.8а 3.2 ИЗ

* См. Дополнительный Материал 87 для деталей о примененном методе.

Дополнительная таблица S5 Впадины, найденные между РиЕ спиралями в

РЦ пурпурных бактерий и фотосистемы II.

PDB Молекуля Атомы, образующие впадину

рная

КОД/

поверхнос

212 ть(А3) остаток

Дикий тип - фотосистема II (D1-212 = Cvs)

2axt

46.8 Dl: Phe-211-O, Cys-212-CA, His-215-CB, Leu-275-CB/CDl/CD2

D2: Leu-210-0, Cys-211-CA/C/CB/SG, His-214-CB/CD2, Gly-215-N, Met_271-CE_

31.8 Dl: G-208-CA, F-211-CB/CD1, F-274-0/CD2, L-275-CA/0/CD2, W-278-CB/CD1, P-279-CD

_D2: C-211-SG_

7.9 Dl: C-212-SG

_D2: G-207-CA, L-210-CD1, M-274-CB/CG1, P-275-CD_

6.2 Dl: C-212-SG

_D2: L-210-CD1, M-271-CA, V-274-CB, P-275-CD_

6.3 D1 : H-272-CD2, L-275-CD1

_D2: H-214-CD2, G-215-N/CA_

фотосистема II РЦ - Мутация Dl-212 основанная на библиотеке ротамеров_

40.2 Dl: F-211-С/О, RESIDUE-212-СА, Н-215-СВ, L-275-CB/CD1/CD2 D2: C-211-CA/C/CB/SG, H-214-CB/CD2, G-215-N, M-271-CE * В мутантах Глн и Глу атом ОЕ1 вовлечен, вызывая уменьшение 0.1, и 0.2 все Â3 в объеме впадины, соответственно. В Apr и Три впадина 39.7 Â3 из-за

остатки _подобных причин._

28.8 Dl: G-208-CA, F-211-CD1, F-274-0/CD2, L-275-CA/Q/CD2. W-278-CB/CD1, P-279-CD

__D2: C-211-SG_

Gly 48.7 Dl: А-209-СА/0, G-212-CA/C

D2: G-207-CA/C/0, L-210-CB/CD1, C-211-N, M-271-CA/O/CB/CG/CE, Р-275-CB/CG/CD

Ala/Cys/ 21.9 D1:A-212-CB

Ser D2: G-207-CA, L-210-CB/CD1, M-271-CA/O/CB/CG/CE, P-275-CD _* В Cys / Сер атомы - те же самые, но впадина на 0.1 Â3 меньше

Бактериальный Реакционный Центр (только самая большая впадина)

lay16 108 L subunit: Leul87-0/CDl, Hisl90-CB/CD2, Glyl91-N/CA, M subunit: Leu215-0/CG/CDl/CD2, Phe216-CA/CDl/CEl/CZ, His219-CB/CG/CD2/NE2, Ile265-C/0/CGl/CG2/CDl, His266-CA/CD2, Ala269CB, U108-C1M

2ргс66 135 L subunit: Leul87-0/CDl/CD2, Hisl90-CB/CD2, Glyl91-N/CA, M subunit: Leu213-C/O/CB/CD1/CD2, Phe214-CA/CDl/CEl/CZ, His217-CB/CG/ND1 /CD2/CD1 /NE2, Val263-C/0/CGl/CG2, His264-CA/0/CG/CD2, Gly26-7N/CA/C, Trp268-N, 7MQ501-C3M

• См. Дополнительный Материал S7 для деталей о примененном методе.

Дополнительный материал S6: Схема комбинаторного мутагенеза

A. условия роста Synechocystis, РСС6803. Линии Synechocystis 6803 были выращены на агаровых пластинках BG-1191 при 50цмоль (фотоны) м"2с_1 белого света в 30°С при наличии 2 ммоль глюкозы.

B. Мутагенез Synechocystis 6803, основанный на ПЦР. Мутация гена psbAII в

Q9

позициях 634-636 , соответствующая Dl-Cep212, была внесена с использованием комбинаторных праймеров DopA/DopB (раздел С), кодирующих 16 остатков на этом участке. Олигонуклеотиды Р5, РЗ и Р212 были созданы, чтобы соответствовать известным последовательностям в гене psbAII (таблица внизу). Модификация участка рестрикции Nsil была введена в третьем кодоне ниже участка 212; для отбора колоний трансформантов. Конечный продукт PCR использовался для трансформации образца реципиента ASRS268-27093 в гене psbAII, как было описано55. Особые олигонуклеотиды Х212 были созданы, чтобы внедрить кодоны в участок D1-212, соответствующие (глицин, лизин, гистидин, фенилаланин, триптофан, тирозин, аргинин, метионин, аспартат, глутамин и глутамат) аминокислотам, которые не были получены или введены при помощи комбинаторного мутагенеза.

С. Олигонуклеотиды используемые в мутагенезе

Олигонуклеотидыа Нуклеотидная последовательностьь

Позиция в гене0

DopAd CGGTGGTAGCTTGTTCYDBGCCATGCA7GGTTCC 618-651

DopBd CGGTGGTAGCTTGTTCVHWGCCATGCA7GGTTCC 618-651

Р212 GAACAAGCTACCACCGAATACACCAGC 633-607

РЗ GGATTAATTCTCTAGACTCTCTA ATGG1 233-1179

Р5 CCAAAACGCCCTCTGTTTACC (-187Н-166)

Р260 GCCGTGGGCGGCAACGATGTTGTAGG 759-734

Р4 CTTCCACATGTTAGGTGT 588-605

Х212е CGGTGGTAGCTTGTTCxxxGCCATGCArGGTTCC 618-651

а Олигонуклеотиды Р260 и Р4 использовались для того, чтобы секвенировать ПЦР продукт b Олигонуклеотиды перечислены в 5' к 3' направлении. Сайты рестрикции Nsil введенны как молчащие мутации и их модификации находятся в курсиве. с psbAII, нумеруются как описано92 d Универсальный код для вырожденных олигонуклеотидов Y (С, Т); D (g, А, Т); В (g, Т, С); V (g, А, С); H (А, Т, С); W (А, Т). е Последовательность ххх представляет определенные кодоны для Трп (TGG), Тир (TAC), Фен (ТТТ), Apr (CGG), Глн (CAA), Глу (GAA), Гис (САС), Асп (GAT), Лиз (AAA), Гли (GGT) и Мет (ATG).

Дополнительный материал S7: Методы In Silico

A. Сохранение сайтов Dl-Cep209 и Dl-Cep212. Степень сохранения РЦ фотосистемы II была определена при помощи (а) поиска последовательности Synechocystis 6803 DI в базе данных BLOCKS94; и при помощи поиска в базе данных последовательностей PSI-BLAST95, используя и исходную последовательность D1 и представительную последовательность (последовательность Cobbler) из базы данных Blocks94 - блок IPB000484B. В добавок, заново последовательные релевантные организмы искались посредством Проекта Entrez Геном, и Blast поиск был проведен в отношении последовательностей цианобактерий и растений, которые были не подробно откомментированы в базе данных ДНК и в обозначенных базах данных, как например Cyanobase96.

B. Анализ распределения водорода и водородной связи. Водород был добавлен

7 П

в структуру при использовании REDUCE , и межбелковые водородные связи

были показаны при помощи компьютерной программы37, которая следовала геометрическим критериям41 для предполагаемых связей. Геометрические критерии включают в себя: DH < 3.5 Ä и DH-A угол >120° (или DH-A угол > 100°, если DH<3Ä), где D, А и DH атом-донор, атом-акцептор и водород, обнаруженные в атоме-доноре. Эти ограничения, особенно дозволенная

97

дистанция D/A пары и угол DH-A, более гибкие, чем те, что даны Desiraju . Ограничения используются для гарантии того, что даже при неидеальном разрешении анализируемых структур, все потенциальные водородные связи охвачены. В связи с этим, несколько взаимодействий изображены в дополнительной таблице S4, в которой DH-A и/или границы угла не соответствуют. В качестве альтернативы, в некоторых случаях водородные связи могут переместиться между двумя позициями, но они не могут занять обе позиции одновременно. Эти взаимодействия представлены для того, чтобы продемонстрировать близкую межбелковую упаковку в этой области.

C. Анализ внутримолекулярной впадины. Анализ впадины был проведен с

по QO о

VOLBL ' с использованием паттерна 1 А-радиуса, используемого для впадин. Белки анализировались без водорода. Добавление водорода вызвало сокращение размера впадины примерно на 30% (данные не показаны). Примечательно, что связующая ниша кофакторов окружена некоторым количеством впадин. Так как исследование было ограничено областью внутри четырех-спирального узла трансмембранного ядра белка, были изображены только впадины, окруженные атомами из спиралей DnE.

D. Графическое представление структурных мотивов. Структуры были нарисованы при помощи PyMol (Уаррен JI. ДеЛано «Система молекулярной графики PyMol» ООО ДеЛано Сайнтифик, Сан Карлос, Калифорния, США. http://www.pymol.org). Для того чтобы воспроизвести результат анализа полости VOLBL78'98, радиусы атома были изменены на выведенные OPLS радиусы Ван-дер-Ваальса, как используется в VOLBL, и найдены в файле param.dat. Для того, чтобы сузить изображение поверхности до впадины, псевдо атомы были введены во впадины. Затем, использовалась функция

поверхностьделитьвыбор для того, чтобы ограничить представленную поверхность до области, смежной с этими псевдо атомами. Поверхность была изображена при использовании команды «показать поверхность, белок и (расширение псевдо_атомов 3)». Это привело к отображению поверхности впадины, но также и частей других впадин, обнаруженных вокруг связующей ниши кофакторов. Для того чтобы устранить последние с изображения, радиус Ван-дер-Ваальса атомов кофакторов был установлен для достаточно большого числа.

Литература

1. Peterson, М. Е., Eisenthal, R., Danson, M. J., Spence, A. & Daniel, R. M. A new intrinsic thermal parameter for enzymes reveals true temperature optima. J Biol Chem 279, 20717-22 (2004).

2. Salih, G. F. & Jansson, C. Activation of the silent psbAl gene in the cyanobacterium Synechocystis sp strain 6803 produces a novel and functional D1 protein. Plant Cell 9, 869-78 (1997).

3. Glockner, G., Rosenthal, A. & Valentin, K. The structure and gene repertoire of an ancient red algal plastid genome. JMol Evol 51, 382-90 (2000).

4. Ohta, N. et al. Complete sequence and analysis of the plastid genome of the unicellular red alga Cyanidioschyzon merolae. DNA Res 10, 67-77 (2003).

5. Motoki, A., Shimazu, Т., Hirano, M. & Katoh, S. The two psbA genes from the thermophilic cyanobacterium Synechococcus elongatus. Plant Physiol 108, 1305-6 (1995).

6. Nakamura, Y. et al. Complete genome structure of Gloeobacter violaceus PCC 7421, a cyanobacterium that lacks thylakoids. DNA Res 10, 137-45 (2003).

7. Osiewacz, H. D. & Mcintosh, L. Nucleotide sequence of a member of the psbA multigene family from the unicellular cyanobacterium Synechocystis 6803. Nucleic Acids Res 15, 10585 (1987).

8. Camara-Artigas, A., Brune, D. & Allen, J. P. Interactions between lipids and bacterial reaction centers determined by protein crystallography. Proc Natl AcadSci USA 99, 11055-60 (2002).

9. Ermler, U., Fritzsch, G., Buchanan, S. K. & Michel, H. Structure of the photosynthetic reaction centre from Rhodobacter sphaeroides at 2.65 A resolution: cofactors and protein-cofactor interactions. Structure 2, 925-36 (1994).

10. Stowell, M. et al. Light-induced structural changes in photosynthetic reaction center: implications for mechanism of electron-proton transfer. Science 276, 812-816(1997).

11. Deisenhofer, J., Epp, O., Sinning, I. & Michel, H. Crystallographic refinement at 2.3 A resolution and refined model of the photosynthetic reaction centre from Rhodopseudomonas viridis. J Mol Biol 246, 429-457 (1995).

12. Nogi, Т., Fathir, I., Kobayashi, M., Nozawa, T. & Miki, K. Crystal structures of photosynthetic reaction center and high-potential iron-sulfur protein from Thermochromatium tepidum: thermostability and electron transfer. Proc Natl AcadSci USA 97, 13561-6 (2000).

13. Ferreira, K. N., Iverson, Т. M., Maghlaoui, K., Barber, J. & Iwata, S. Architecture of the photosynthetic oxygen-evolving center. Science 303, 18318 (2004).

14. Loll, В., Kern, J., Saenger, W., Zouni, A. & Biesiadka, J. Towards complete cofactor arrangement in the 3.0 A resolution structure of photosystem II. Nature 438, 1040-4 (2005).

15. Stowell, M. et al. Light-induced structural changes in photosynthetic reaction center: implications for mechanism of electron-proton transfer. Science 276, 812-816(1997).

16. Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M. & Stanier, R. Y. Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria. Journal of Genetic Microbiology 111, 1-61 (1979).

17. Ravnikar, P. D., Debus, R., Sevrinck, J., Saetaert, P. & Mcintosh, L. Nucleotide sequence of a second psbA gene from the unicellular cyanobacterium Synechocystis 6803. Nucleic Acids Res 17, 3991 (1989).

18. Kless, H, Oren-Shamir, M., Malkin, S, Mcintosh, L. & Edelman, M. The D-E region of the D1 protein is involved in multiple quinone and herbicide interactions in photosystem II. Biochemistry 33, 10501-10507 (1994).

19. Kless, H. & Vermaas, W. Combinatorial mutagenesis and structural simulations in the environment of the redox-active tyrosine YZ of photosystem II. Biochemistry 35, 16458-16464 (1996).

20. Henikoff, J. G., Greene, E. A., Pietrokovski, S. & Henikoff, S. Increased coverage of protein families with the blocks database servers. Nucleic Acids Res 28, 228-30 (2000).

21. Altschul, S. F. et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res 25, 3389-402 (1997).

22. Nakamura, Y., Kaneko, T., Hiosawa, M., Miyajima, N. & Tabata, S. CyanoBase, a www database containing the complete nucleotide sequence of the genome of Synechocystis sp. strain PCC6803. Nucleic Acids Res 26, 63-67 (1998).

23. Word, J. M. et al. Visualizing and quantifying molecular goodness-of-fit: small-probe contact dots with explicit hydrogen atoms. J Mo I Biol 285, 171133 (1999).

24. Goldberg, E. (M.Sc. thesis, Weizmann Institute of Science, 2004).

25. Senes, A., Ubarretxena-Belandia, I. & Engelman, D. M. The Calpha —H...O hydrogen bond: a determinant of stability and specificity in transmembrane helix interactions. Proc Natl Acad Sci USA 98, 9056-61 (2001).

26. Desiraju, G. R. Hydrogen bridges in crystal engineering: interactions without borders. Acc Chem Res 35, 565-73 (2002).

27. Liang, J., Edelsbrunner, H., Fu, P., Sudhakar, P. V. & Subramaniam, S. Analytical shape computation of macromolecules: II. Inaccessible cavities in proteins. Proteins 33, 18-29 (1998).

28. Liang, J., Edelsbrunner, H., Fu, P., Sudhakar, P. V. & Subramaniam, S. Analytical shape computation of macromolecules: I. Molecular area and volume through alpha shape. Proteins 33, 1-17 (1998).

ГЛАВА 2

Остаток Б1-Гли208 найденный в точке пересечения субъединиц D1/D2 реакционного центра фотосистемы II играет ключевую роль в контролировании переноса электронов в процессе фотосинетза.

Оксана Шлык-Кернер, Давид Кафтан и Авигдор Шерц'*

I Кафедра прикладной ботаники, Институт имени Вейцмана, Реховот, 76100 Израиль.

Предметная классификация: белки, полинуклеотиды и другие биологически важные макромолекулы.

Ключевые слова: комбинаторный мутагенез, уплотнение (упаковка), водородная связь, мембранные белки, реакционный центр.

Используемые аббревиатуры: бактериальный реакционный центр (БРЦ), водородная связь (Н-связь), полимеразная цепная реакиця (ПЦР), фотосистема

II (ФСII), фотосинтетический реакционный центр (ФЦР), термолюминесценция (TJI), трансмембранный (ТМ).

Ответственный автор: Авигдор Шерц, e-mail: [e-mail] Телефон: [phone]. Факс: [phone]

Резюме

7 Я

В соответствии с кристаллической структурой ФС II ' , Гли208 белковой субъединицы расположен в центре цепочки переноса электронов, тесно упакован с Б2-Гли207 на границе белков 01Ю2 РЦ фотосистемы II, и может участвовать в слабой водородной связи, как например донор С=0 по отношению к 8у остатка Б2-Цис211. Здесь мы выстраиваем гипотезу, что эти взаимодействия чрезвычайно важны для конформационных изменений белка, которые руководят скоростью переноса электронов от ()А к ()в в РЦ ФС II. Чтобы изучить эту гипотезу, остаток Б1-Гли208 был замещен на девятнадцать других аминокислот при помощи комбинаторного мутагенеза в цианобактериях Бупескосуз^ РСС6803. Только три малые аминокислотные остатки Ала, Сер и Тре в позиции Б1-Гли208 поддержали фотоавтотрофный рост. Температурная зависимость константы скорости (к) для дальнейшего переноса электронов от ()А к <2в в целых клетках дикого типа и мутантах, представила не-Аррениусное поведение, как недавно сообщалось для дикого типа и мутантов Б1-21299. До температуры Т0, которая близка к оптимальной температуре роста 8упес1юсуз1л8 РСС6803, константа скорости увеличивалась экспоненциально температуре. При более высокой Т0, к выравнивалась или даже слегка понижалась. Во всех трех мутантах, Т0 была перемещена к более высоким температурам, сравнимой с температурой дикого типа, но в другой степени: 2.5°С для Ала, 7.5°С для Сер и 12.5°С для мутанта Тре. Константа скорости для обратного ЭП (рекомбинация зарядов) стала увеличиваться вместе с температурой на всей области измерения (0-50°С). Однако она была значительно сниженной для мутантов Сер и Тре, способных вводить боковые цепи, которые образуют водородные связи с более высокой энергией активации. Примечательно, что мутации сильно снизили уровень устойчивого состояния Б1, энергетическую стабилизацию $2,з0,в также как и состояния 82(2а и сильно изменили содержание каротиноидов. В совокупности, наши данные предполагают, что небольшие остатки на сайте Б1-208, которые делают возможным Ван Дер Ваальсовы взаимодействия и слабую Н-связь между субъединицами белка, необходимы и для структуры и

для функциональной гибкости РЦ ФС II. Значительное замедление скорости ЭП при введении более сильных внутриспиральных Н-связей (с участием боковых цепей доноров или акцепторов Н-связи.) далее предполагает, что прямой и обратный ЭП, контролируется конформационным изменением белков, которое требует местной гибкости на контактной поверхности субъединиц белков Dl и Б2.

1. Введение

Реакционный центр (РЦ) фотосистемы II (ФС II) - это мембранный белково-хлорофильный комплекс, который превращает солнечную энергию в электрохимический потенциал в про и эукариотах. Превращение энергии происходит при помощи электронного переноса (ЭП), вызванного прямым светом, между различными кофакторами, которые нековалентно держаться белковой матрицей. Сформировавшийся потенциал катализирует водное окисление и мобилизацию протонов, результатом чего является освобождение молекулярного кислорода и гидрохинона. Структура ФС II в термофильных цианобактериях ТИегтозупесИососся е1ощаШя недавно была представлена при

7 Я

разрешении 3.5 А и 3.0 А, показывающих сильную схожесть с давно известными структурами РЦ различных видов пурпурных бактерий100,101. Как предполагалось прежде, ядро РЦ ФС II состоит из двух гомологических белковых субъединиц, названных Б1 и Б2, каждая из которых содержит пять трансмембранных спиралей, названных А, В, С, £> и Е. По большому счету, редокс-активные компоненты согласованы спиралями О двух субъединиц в близкой к С2 симметрии. Эти спирали пересекают друг друга в середине мембраны, формируя структуру, похожую на «X». Части альфа-цепей «X» согласуют негембвое железо, а также связывают два пластохинона (<2л и ()в), совместно образуя сторону акцептора комплекса РЦ ФС II. Две части, погруженные в цитазоль, включают в себя сторону донора и содержат особую пару хлорофиллов (Хл), названную Р680, два дополнительных Хл и фенилаланин102. Следуя прямому или непрямому (посредством антенны Хл) фотовозбуждению, электрон перемещается со стороны донора к стороне

акцептора комплекса РЦ в несколько этапов. Здесь молекула 0,А перемещает электрон к Qв, который подвергается дополнительному протонированию либо до, либо во время, либо после восстановления60. Окислившаяся группа Хл (Р680 и дополнительный Хл) подвергается восстановлению при помощи остатка Тир и становится готовой для другого фотоокисления. После получения другого электрона со стороны донора через <2а и прохождения дополнительного протонирования, вдвое восстановленный <2я покидает связывающий участок как ОН2 и замещается другой молекулой из группы хинонов. Электрон, извлеченный из кластера Мп возвращает окисленный Тир в исходное состояние. При каждом цикле из четырех ЭП (определяющих состояния 8184 ), две молекулы воды окисляются и одна молекула кислорода освобождается.

Часто обсуждается роль белковой матрицы в контроле над скоростью переноса электронов и в выходе энергии. В то время как реакции ЭП на стороне донора следуют тонелльному переходу и зависят, в основном от геометрии кофакторов и относительных редокс-энергий104, передача электронов от QA до сильно зависит от гибкости белка63. Таким образом, реакции на стороне донора зависят от температуры' выше 273К и сильно ускоряются при криогенных температурах, в то время как перенос электронов от Од до О^в показывает обратное поведение - оно полностью исчезает при замораживании белка в темноте и подвергается экспоненциальному ускорению при более высоких температурах. Важно то, что такое ускорение могло бы привести к накоплению востановленных Qв, ведущему к фотоповреждению или фотоингибированию105. Таким образом, скорости ЭП следует избегать дальнейшего ускорения, когда температура выше физиологической. Более того, недавно мы показали, что константа скорости ПЭ от ()А к <2в выравнивается при достижении физиологической температуры мезофиллов и термофилов, достигая очень похожих скоростей при разных температурах". Мы отнесли температурную адаптацию скорости ЭП к мотиву ГлихххГли, находящемуся рядом с белковыми впадинами, близкими к области пересечения спиралей £>. Мы

показали при помощи анализа т яШсо, что, изменяя размер и, таким образом, значения плотной упаковки атомов одного или двух остатков установленного мотива, одна из впадин, обнаруженная рядом с участком £}в, может стать полностью заблокированной. Эксперименты в организме показали, что энтропия активации для ЭП от QA к ()в модифицирована, делая возможным наблюдаемую температурную адаптацию мезофиллов и термофилов к различным температурам среды". Изменения в энтропии активации были связаны с модификацией в местной гибкости белка из-за разрушения впадины. Один из остатков, важный для этого приспособления, Б1-212 занимает просветную сторону мотива ГлихххГли, в то время как второй, 01-209, близок к точке пересечении двух £> спиралей. Примечательно, что комбинаторный мутагенез остатка 01-212 предоставил 13 различных фотоавтотрофных мутантов, а в участке Б-209 было получено только 8 мутантов. Эти находки поднимают несколько вопросов: как и насколько возможно модифицировать гибкость белка без нарушения ее стабильности? И наоборот - насколько можно увеличить стабильность определенной белковой структуры без нарушения ее функциональности? Являются ли действия/результаты отдельных остатков аддитивными? Подходит ли этим функциям мотив ГлихххГли, в частности? Некоторые из этих вопросов задавались в контексте других белковых коплексов39. Однако, важная роль скорости ПЭ от QAк Qв в фундаментально важном фотосинтетическом превращении энергии, четкая взаимосвязь между трансформациями установленного мотива ГлихххГли и скоростью реакции, доступные структуры с высоким разрешением участвующих белков и возможность проследить эту реакцию в целых клетках, сделали ответы на эти вопросы чрезвычайно привлекательными.

Предполагается, что часть мотива ГлихххГли, обращенная в люмен, например, участок Б1-212, оказывается в основном вовлеченной в определение местной гибкости центрального комплекса Б1/Б2, остатки на другом краю мотива, близкого или находящегося на точке пересечения «X», также сильно влияют на стабильность комплекса. Это связано с тем, что следуя недавно

опубликованным структурам ФС II при разрешениии 3.5 А и 3.0 А, эти остатки достигают ближайшего контакта с белками D1 и D2, где спирали двух белковых субъединиц тесно переплетены и могут также участвовать в обеих основных и боковых цепях водородных связей. Таким образом, ценная информация, касающаяся взаимодействия между функциональной гибкостью и стабильностью мембранного белка должна быть получена поиском результатов мутаций вдоль мотива ГлихххГли.

В этой работе мы сфокусировали наше внимание на сайте D1-208. Этот участок обычно занят остатком Тли и в эукариотических и в прокариотических организмах (Рис. 2). Остатку Гли не достает боковой цепи, таким образом он способен образовывать большое разнообразие пространственных конформаций основной цепи и повышать местную гибкость белка. Несколько исследований показали, что остатки Гли осутствуют в трансмембранных областях политопных и пронизывающих мембрану белках. Там они функционируют как молекулярные метки, которые ориентируют спирали в свёрнутых белках106'107. Более того, Гли обнаруживается в последовательности мотива ГлихххГли, которая обуславливает взаимодействие спиралей108"110. Анализ спиралей в мембранных белках показывает высокую концентрацию Гли в поверхностях спираль-спираль и в точках пересечения спиралей107'111. Гли часто замещается другими небольшими остатками, например Ала, Сер и Тре, определяющими мотив ГлихххГли. В целом, предполагается, что Гли и другие небольшие остатки, расположенные на границах спиралей, стабилизируют спиральные мембранные белки (делая возможным максимально плотную упаковку атомов) и допускают функциональную гибкость структуры40. Замещение Гли на таких границах остатками, которые делают возможной сильную Н-связь, могут увеличить димеризацию спиралей, но повышенная структурная жесткость может сильно повредить белковую функциональность112"114. В свете этих наблюдений, мы начали изучать следствие комбинаторного мутагенеза на сайте D1-208 РЦ ФС II, используя измерения фотосинтетической деятельности и скоростей ЭП, как описано", у различных мутантов. Из 20

остатков аминокислот, введенных на этот участок, только три (Ала, Тре, Сер), все небольшие остатки с достаточно высокими значениями плотной упаковки атомов, создали мутантов, способных к фотоавтотрофному росту. Таким образом, наличие небольших остатков с высоким значением плотной упаковки атомов на сайте Б1-208, очень важно для структуры Б1/Б2. Тем не менее, связи, образованные боковыми цепями мутантных остатков Сер и Тре, например межбелковая водородная связь, сильно ухудшает константу скорости прямого и обратного ЭП, возможно увеличивая жесткость белка в точке пересечения «X» и ограничивая конформационные изменения во время ЭП от Ра к С)в- Затем, эти остатки сильно уменьшают стабильное состояние Б1 и увеличивают молекулярные сшивки между белковыми субъединицами Б1 и Б2. В совокупности, наши данные предполагают, что внутри установленного мотива ГлихххГли, Б1-208 играет роль в предоставлении подходящей функциональной структуры, пока Б1-212 и Б1-209 играют регулирующую роль в приспособлении константы скорости ЭП к физиологической температуре. Эти наблюдения подчеркивают значимость Гли в функциональной структуре мембранных белков и важность содержания остатков в определении его биологической функции.

2. Материалы и методы

Сравнительный анализ последовательностей. Последовательности центрального белка Б1 РЦ ФС II (Рис. 1), полученные из базы данных 8\¥188Рго1 (http://www.expasy.org) были выровнены с помощью СЬШТА!^116 и вручную отредактированы. Структурные модели, полученные рентгено-структурным анализом, РЦ ФС II при разрешении 3.0 А0 (2ах1 рёЬ файл) из Ткегтояупескососсш е1о^Шт были проанализированы с помощью программы просмотра Swiss-pdb-viewer, чтобы визуализировать взаимодействия субъединиц в трансмембранной области (Рис. 2).

Условия культивирования и рост. Дикий тип и мутантные образцы БупескосуяШ РСС 6803 были выращены в ВО 11, содержащем 1.5% агара,

5ммоль глюкозы, 0.3% тиосульфата натрия и 25 цг.мл"1 канамицина. Жидкостные культуры были выращены при 30°С в 250 мл стеклянных колбах

О 1

при 40ц моль м" с" белового света в отсутствии глюкозы и канамицина; насыщение кислородом обеспечивалось магнитным перемешивающим устройством при 200 оборотах в минуту или, как альтернатива, воздушным насосом для измерения флуоресценции. Клетки для измерения флуоресценции хлорофилла были получены в среднеэкспонциональной фазе роста. До измерений клетки были заново помещены в свежий BG11, чтобы достичь 4}шоль (хлорофилл а)"1.

Скорости роста. 10]лл капля клеток жидкостной культуры (OD73o=0.1),

выращенной при стандартном освещении и температурных условиях, была

размещена на агарозной пластине среды BG-11. Эти клетки выращивались в

течение 3 дней под слабым освещением (10р,моль м"2с_1). Жидкостные культуры

2 1

также были перемещены под слабое освещение (Юцмоль м" с") и выращивались в течение 7 дней.

Подготовка мутантов. Основанный на ПЦР, комбинаторный мутагенез гена psbAII Synechocystis РСС 6803, кодирующего белок D1, был выполнен, как описывалось55'ш. Фрагмент гена У psbAII, имеющий мутацию в позициях 622624 , соответствующий 01-Гли208, был создан с помощью праймера РЗ и дегенерированного праймера Р208 (Таблица 1), кодирующего все 20 аминокислот. В дополнение, была введена молчащая мутация в третий кодон ниже сайта мутации 208, чтобы создать участок рестрикции Nsil, используемый для просмотра колоний трансформантов (см. Таблицу 1). Фрагмент гена 5', необходимый для гомологичной двойной рекомбинации (Рис. 2) и фрагмент 3', были очищены из агарозного геля. Линейный продукт ДНК окончательной ПЦР, объединяющей 3' и 5' фрагменты ДНК (Рис. 2) был использован для

117

трансформации образца реципиента, как описывалось . Наличие мутации было подтверждено рестрикцией продукта ПЦР с Nsil и секвенированием с использовании праймеров Р260 и PIV (Таблица 1) в обеих нитях гена. Особые олигонуклеотиды Х208 (Таблица 1) были созданы, чтобы ввести кодоны в

участок D1-208, соответствующие аминокислотам, которые не были получены при комбинаторном мутагенезе (Рис. 2).

Анализ пигментов. Содержание каротиноидов было определено HPLC Philips PU 4100 с использованием колонки для обращённо-фазовой хроматографии Spherisorb ODS-1 (Уотерс, США), согласно описанной процедуре118. Определение хлорофилла. Хлорофилл а был получен из взвеси клеток после экстракции метанолом, и определен с помощью коэффициента J1 ихтентал л ер а119.

ДСН-ПААГ и иммуноблоттинг. Тилакоиды были получены, как было описано

120

ранее . Тилакоидные белки были растворены в буферном растворе (0.5 М Трис-соляная кислота рН 6.8, 1% ДСН, 24% глицерина и 4% 2-меркаптоэтанола) додецилсульфата натрия (ДСН), оставленные при комнатной температуре на 1 час и разделены при помощи 12.5% ДСН-ПААГ (полиакриламидный гель). Эквивалент 2.5рг хлорофилла был помещен в лунку геля. Белки были помещены на поливинилиден дифлуоридную (ПВДФ) мембрану (Hybond-P, Амершам) и была проведена иммунная детекция с использованием усиленной хемолюминесценционной реакции (Пирс). Был проведен блоттинг с первыми антителами против белка D1 и гена psaC (Агрисера, Швеция). Вторые HPR-конъюгированные антисыворотки были куплены у компаний Промега и Сигма, соответственно.

Анализ фотосинтетической деятельности в целых клетках. Затухание флуоресценции хлорофилла, следующее за насыщающей вспышкой и серией коротких, дозированных вспышек (продолжительность импульса 4рс) было измерено в пределах 0-50±0.1°С при помощи стандартной версии флуореметра двойной модуляции F1-100, оборудованного терморегулятором TR 2000 (P.S. Инструменты, Брно, Чехия). Стандартная флуоресценция была измерена в различное время после каждого импульсного инициирования и подогнана к трех-экспоненциальной функции F=a, exp(-k i x)+a2exp(-k2x)+a3 exp (-k3x) при помощи подходящего нелинейного алгоритма наименьших квадратов. Самая быстрая константа скорости была установлена при передаче электронов от QA

до Qb и при рекомбинации S2Qa в отсутствии и в наличие ингибитора DCMU, соответственно121. Термолюминесцентный сигнал был измерен при помощи установки P.S. Instrument (Брно, Чехия) в пределах от -20 ± 50°С. Одиночная насыщающая вспышка была применена при -10°С. Рекомбинация S2Qb (В полоса) и S2Qa (Q полоса) отслеживалась при тепловом режиме в 0.7°С с"1 в отсутствии и в наличии ингибитора DCMU, соответственно.

3. Результаты

Структура и секвенирование ФС II. Остаток D1-208, который находится на стороне донора мотива ГлихххГли, расположен прямо на точке пересечения спиралей D в ядерном комплексе РЦ ФС II (Рис. 1) в непосредственной близости к Б2-Гли207, содействующей хорошему уплотнению белковых субъединиц D1/D2. Более того, Гли208 расположен в центре пути ЭП и может быть вовлечен в регулирование местной динамики белков и, таким образом, в скорость ЭП на участках донора и акцептора. Как показано сравнительным анализом последовательностей, Гли208 сохранен в центре трансмембранной спирали D во всех изученных фотосинтезных организмах (Рис. 2), за исключением Vigna ungiculata, где он был замещен остатком Сер. Важно то, что замещение D1-F208 на Сер, который имеет более низкое packing значение, вероятно повысит Т0, температуру, при которой скорость Qa к Qb выравнивается". Действительно, Vigna ungiculata - это теплолюбивая культура, переносящая жару и сухость, но не терпящая холод.

Подготовка мутантов и физиологическая характеристика жизнеспособных мутантов. Примененный мутагенез при использовании праймера, который содержит вырожденную последовательность кодона в позиции G208 белка D1 (Таблица 1) произвел 3 вида фотоавтотрофных мутантов (G208A, G208S и G208T). Все три мутанта сохраняют фотосинтетическую деятельность, хотя и в разных степенях. Другие 16 замен аминокислот в позиции D1-208 не смогли обеспечить жизнеспособность, вероятно из-за сильного вмешательства в

свертывание РЦ ФС II или фотосинтетическую деятельность, необходимых для поддержания фотоавтотрофного роста.

Три (G208A, G208S и G208T) мутанта росли фотоавтотрофно в жидкостных и твердых культурах при стандартном освещении и температуре. Скорости фотоавтотрофного роста были изучены на твердой среде при слабом освещении и стандартной температуре. Рост мутанта Тре оказался медленнее чем такого же дикого типа, в то время как Ала и Сер мутанты были примерно равны в скорости роста с диким типом (Рис. 3).

Количество центрального полипептида D1 в ФС II и полипептида PsaC в PSI, в

обычном состоянии, было проанализировано для тилакоидов четырех линий,

2 1 2 1 выращенных при слабом (10 цмоль м" с" ) и стандартном (40 рмоль м" с" )

освещении с помощью иммуноблоттинга (Рис. 4). Все три мутанта,

выращенные под стандартным освещением, показали сильное уменьшение

(70%) количества полипептида D1. Тогда как выращенные при слабом

освещении, мутант G208A продемонстрировал уменьшение на 50%, a G208S и

G208T показали уменьшение на 60% и 70% в уровне D1, соответственно, по

сравнению с диким типом. Важно отметить, что количество продукта гена PsaC

(PSI) было равно дикому типу в мутантах Ала и Сер, выращенных при слабом

освещении, в то время как количество продукта в мутанте Тре уменьшилось на

50%. Различие в -10-20% в количестве продукта гена PsaC было обнаружено во

всех видах, выращенных при нормальном освещении. В дополнение, наши

результаты продемонстрировали перекрестное сшивание продуктов белка D1

вероятнее всего с белком D2. Количество агрегатов D1/D2 увеличилось во всех

мутантах D1-208, по сравнению с диким типом. Каротиноиды из клеток дикого

типа и мутантов, включая миксоксантофил, зеаксантин, эхиненон и (З-каротин

были отделены и идентифицированы при помощи высокопроизводительной

жидкостной хроматографии. Количество различных каротиноидов, полученных

из тилакоидов дикого типа, оказалось равным (Рис. 5). Линия мутанта G208A

содержала такое же количество (3-каротина, слегка сниженное количество

зеаксантина и увеличенное количество миксоксантофила и эхиненона, по

сравнению с немутантным типом. Количество р-каротина и зеаксантина, полученных из мутантов 02088 и 0208Т, значительно снизилось, а количество миксоксантофила и эхиненона значительно увеличилось относительно тех же каротиноидов, полученных из дикого типа.

Прямой перенос электронов Од к Од в мутантах. Эффект мутагенеза на участке Б1-6208 на деятельность РЦ ФС II был изучен при помощи измерения скорости прямого ЭП (ра к СЬ), при температуре от 0 до 50°С с использованием флуоресценции хлорофилла из целых клеток. Образцы, адаптированные к темноте, были возбуждены одиночной сильной вспышкой либо в присутствии либо в отсутствии БСМи, что привело к образованию состояний БгОл или соответственно. Позже, серия слабых

вспышек была применена к образцу, флуоресценция хлорофилла была измерена и кривая затухания была разложена на три компонента, как

99 »

описывалось раньше . Флуоресцентный сигнал с самой короткой продолжительностью жизни в отсутствие БСМи, контролировал скорость ЭП <2л к 0,в. Константы скорости (к) ЭП Qл к Qв были вычислены при температуре 0-50°С с помощью теории переходного состояния122 (Рис. 6). Дикий тип продемонстрировал недавно отмеченную" двухфазную температурную зависимость мезофиллов с характерной энергией активации до того, как достигается Т0=25°С, что слегка ниже физиологической температуры БупескосуяШ 6803. При более высокой Т0 на протяжении физиологического предела, константа скорости ЭП оказалось независимой от температуры (Рис. 6) и снизилась при более высоких температурах, вероятно из-за денатурации РЦ ФС II. Для мутантов в208А, в2088 и в208Т, мы нашли, что Т0=27.5, 32.5 и 37.5°С, соответственно. Таким образом, Ала едва перемещает Т0, в то время как Сер и Тре, оба способны к образованию Н-связи через группу ОН, переместили Т0 на 7.5 и 12.5°С, соответственно. Вероятно, сдвиг Т0 мутантов относительно дикого типа, соотносится со способностью мутантных АК входить в межбелковые водородные связи, в составе В спирали (Рис. 1), а не с размером

остатков или значений плотной упаковки атомов, как обнаружено на участке 01-212".

Термодинамические параметры (АН1, А8* и АЕ*) для зависимой от температуры части 1п(к/Т) )ос1/Т кривых были подсчитаны для мутантов и дикого типа Б1-208 (Таблица 1). Хотя абсолютная величина обеих АН* и А8* слегка изменилась между различными мутантами, только АЕ1 последовательно увеличивалась вместе с размером остатка (Рис. 7).

Обратная передача электронов и рекомбинация пар радикалов О/бУ и ОпБ^. Рекомбинация отдельных зарядов в состоянии 82<2/ прошла через прямую и непрямую мобилизацию электрона со стороны донора до стороны акцептора в комплексе РЦ ФС II. Непрямая рекомбинация включает обратную передачу электронов от хинонов к активному феофитину как результат возбужденного состояния и ведет к замедленной флуоресценции из возбужденного состояния первичного донора и антенного хлорофилла54. При прямой рекомбинации

123

электрон идет назад к комплексу первичного донора через излучение тепла. Скорость прямой рекомбинации может быть измерена при помощи наблюдения за флуоресцентным затуханием в присутствии БСМи, как описывалось

54 123

ранее ' . Используя этот подход, мы нашли константу скорости к для прямой рекомбинации в диком типе и в трех полученных мутантах. Измерения проводились при температуре 0-50°С. Полученные константы скорости находятся в пределах ранее сообщенных значений для различных видов Бупескосузйз 680354'123. Однако, скорость рекомбинации ЭП показывает ясную экспоненциальную зависимость от температурной инверсии согласно Эйрингу (1п(к/Т) )ос1/Т) для мутантов Сер и Тре, но не для дикого типа и мутанта Ала (Рис. 8). Примечательно, что пока энтропии активации для различных видов практически идентичны, энтальпии активации значительно увеличились для Тре и Сер, но не для Ала (Таблица 2, рис. 8). Принимая во внимание способность Тре и Сер участвовать в межбелковой водородной связи боковой цепи, эти данные предполагают, что стабилизируется конформационным изменением, которое необходимо направить в обратную сторону, когда

происходит рекомбинация зарядов. Различие в -1.4 Ккал М"1 между энтальпией активации дикого типа и Тре и Сер находится в пределах энергии Н-связи для

1 ОА

боковой цепи/остова ' .

Измерения термолюминесценции (ТЛ) отслеживают энергию активации,

необходимую для обратного переноса электронов через непрямой маршрут. То

есть, рекомбинация электронной дырки, оставленной на стороне донора и

экстра электрона на стороне акцептора после захвата восстановленного Оа или

{2в при помощи быстрого охлаждения после возбуждения от сильной 126

вспышки . Здесь мы сфокусировались на пиках Вир, представляющих рекомбинации состояний и ^б/, соответственно. Сигналы ТЛ в

отсутствии БСМТГ показывают, что замещение Б1-С208 на Сер и Тре, но не на Ала, заметно увеличило температуру ТЛ пика В (Рис. 9), то есть, стабилизировало состояние Яг.збя в порядке Сер>Тре>Ала~Гли и, таким образом, увеличило энергию активации для непрямой рекомбинации зарядов (Рис. 9 и Таблица 3). Пик показывает противоположную тенденцию, то есть, он перемещается к более низкой температуре в порядке Ала>Тре>Сер~Гли. Эти данные указывают на то, что Ала и Тре, но не Сер, дестабилизируют состояние В совокупности, замещение Б1-0208 на противоположные остатки значительно увеличивает окислительно-восстановительную разность энергий между 6У<2/ и Qв/Qв'^

4. Обсуждение

Недавние исследования описали большое количество остатков Гли на контактных участках трансмембранных спиралей и положили начало поискам их роли. Способствуют ли эти остатки функционированию или укладке целого белка? В этом исследовании мы обратились к этому вопросу, получив мутации в сайте Б1-0208 и проверяя скорости превращения энергии в результате фотосинтеза и конформационную гибкость белкового комплекса РЦ ФС II. Деятельность РЦ была проанализирована в полученных фотоавтотрофных

мутантах, путем отслеживания кинетики и термодинамики прямого ЭП от ()А~ к Qв, также как и обратного ЭП от S2Qл или Ядзбя" к окисленному донору. Взаимодействие между гибкостью и стабильностью мембранных белков является ключевым аспектом в поддержании их биологической активности, особенно при различных физиологических температурах48. Гибкость необходима для того, чтобы запустить функции, которые вовлекают обратимые изменения в третичных или четвертичных белковых структурах. Полученные структуры могут быть стабильными и в равновесии как при чередовании между

127

активными и неактивными формами белка в ионных каналах или нестабильными и временными как при активации/возбуждении фермента из основного состояния в переходное состояние122. В первом случае, гибкость белка отражается в энтропии и энтальпии активации каталитического процесса, а во втором случае она соотносится с термодинамической стабильностью двух альтернативных структур.

Белки должны быть стабильными при физиологических температурах, чтобы сохранить особые трехмерные структуры, необходимые для функционирования. Термостабильность белков может быть увеличена или понижена в ответ на температуру среды обитания путем изменения количества

46

ионных мостиков и водородных связей между их структурными мотивами . Полученная стабильность не должна пересекаться с функциональной гибкостью128. Однако, стабилизация определенных белковых структур может сильно повлиять и даже упразднить каталитическую активность, относящуюся

1 1 Л

к белковым структурным изменениям в мембранных беклках . Таким образом, следует использовать другие механизмы для приобщения ферментной активности к физиологической температуре. Один вариант - это сохранение участков локальной гибкости белков, которые помогут адаптировать каталитические константы скорости к физиологической температуре, независимо от стабильности различных белковых структур45'47. Наличие нелинейных Эйринговых или Аррениусных графиков представляет доказательства конформационных переходов, зависящих от температуры, к

более гибкой структуре в ферментах дикого типа. Существует ряд примеров в

литературе о нелинейных зависимостях Аррениуса, которые относятся к

локальным структурным изменениям в ферменте, которые могут быть вызваны

100 1

температурными колебаниями в окружающей среде .

Часто, поиск т яШсо вовлеченных белковых мотивов предполагает только незначительные структурные различия между мезофильными и экстремофильными ферментами46. Предполагалось, что небольшие изменения в структуре в точках контакта субъединица-субъединица, отдаленные от активного участка, отвечают за температурную адаптацию лактатдегидрогеназы-А глобулярного белка (А4-ЫШ)128. Использование биокаталитических испытаний для подтверждения этой гипотезы обычно подвергает белок нереальным условиям, а испытаниям в организме часто недостает необходимого экспериментального разрешения. Таким образом, более чем два десятилетия считалось, что изменение из неактивной в активную белковую структуру руководит ЭП от <2/ к (¿в11'60-Однако, природа и положение этого изменения не могли быть идентифицированы не смотря на обширные исследования и многие теоретические дискуссии18'60. В дополнение, Уашавак! е1 а1 предположил, что перемещение восстановленного хинона, является моментом, ограничивающим скорость переноса электрона из ФС II в ФС I, который модулирует максимальные скорости рядом с температурой роста133. Они предположили, что высокий потенциал фотосинтетической адаптации к температуре связан с высокой пластичностью реакции переноса электрона в ФС II по отношению к температуре среды. Эти наблюдения подкрепляются нашим недавним исследованием, где мы показали, что при модулировании энтропии активации константа скорости ЭП ()А~ к подвергается адаптации к соответствующим температурам роста мезофиллов и термофилов". Важно, что эта модуляция была соотнесена с местной гибкостью белка, полученной при помощи мотива ГлихххГли и впадины на контактном участке двух спиралей Д и предполагается, что она становится эффективной только после разъединения

межбелковой водородной связи на их точке пересечения. Следовательно, мы предположили", что двустороннее разъединение межбелковой водородной связи делает возможным предложенное чередование между «неактивной» и «активной» структурами белка. Таким образом, остатки в мотиве ГлихххГли должны изменять скорость ЭП при помощи: 1. Модуляции свободного пространства впадины и, таким образом, энтропии активации; 2. Модуляции прочности межбелковой водородной связи в точке пересечения «X» и, таким образом, энтальпии активации ЭП. Ожидается, что изменения второго типа будут иметь сильный эффект на стабильность активных и неактивных структур белка, в то время как изменения первого типа нет.

Более того, в предыдущем исследовании мы показали, что остатки в Б1-212 и Б1-209 эффективны в модулировании энтропии активации ЭП и приспособления деятельности РЦ ФС II к различным температурам среды". Однако, они имеют только незначительный эффект на термальную стабильность РЦ ФС II в полученных мутантах Б1-212, так же как и на энтальпию активации процесса ЭП. Кроме того, энергия обоих состояний ()А~ и Qв', как было отмечено из ТЛ сигналов, не сильно повреждалась различными мутациями (неопубликованные данные).

В противоположность этому, здесь мы показываем , что замещение 01-208 на небольшие полярные остатки значительно увеличило энергию активации процесса ЭП (прямого и обратного), в то же самое время имея значительно меньший эффект на энтальпию активации ЭП. Повышенная энергия активации вероятно возникла из увеличенной стабильности неактивной белковой структуры, как было обнаружено в увеличенном количестве поперечно сшитых белков при гелевом электрофорезе (Рис. 4) и в температурных колебаниях различных ТЛ сигналов. Пока ТЛ сигнал 0 (связанный со стабильностью QA') передвинулся к более низкой температуре (дестабилизация состояния £26/), ТЛ сигнал В передвинулся к более высокой температуре (стабилизация состояния 82,з(2вРис. 9).

В совокупности, эти данные поддерживают гипотезу, что мотив ГлихххГли вовлечен в регулирование скорости ЭП путями: 1. Блокированием трансформации неактивных и активных форм, используя разъединение и соединение межбелковой водородной связи. 2. Модулируя гибкость активного состояния, чтобы начать адаптацию к температуре среды. Количество и тип АК остатков, которые могли войти в различные участки в мотиве ГлихххГли, отражают гибкость этого участка - 13, 8 и 3 для D1-212, D1-209 и D1-208, соответственно. Наши результаты могут дать структурированное объяснение возникновения «эффекта Кляйнфельда»134. Возможно, легкое вращение спиралей D относительно друг друга, когда РЦ ФС II активен, сопровождается новым взаимодействием в точке пересечения этих спиралей, которое помогает сохранить активную конфармацию белка, если идет замораживание во время освещения.

Полная клеточная реакция на мутагенез мотива ГлихххГли предполагает, что белковый РЦ ФС II играет важную роль в мембранной организации тилакоида. Она также поддерживается значительно сниженным количеством Р-каротина относительно других кофакторных пигментов РЦ ФС II. Важно, что содержание других каротиноидов, которые, как недавно предположили, обладают мембранной стабилизирующей функцией (зеаксантин так же как и миксоксантофил)135'136, было сильно увеличено. На этой стадии не ясно случается ли относительное понижение содержания D1 на трансляционном уровне, отражающем неправильное скручивание гетеродимеров РЦ ФС II, или оно отражает повреждение D1 из-за более тесного связывания между субъединицами D1 и D2. Недавние исследования показали значительную агрегацию белка D1 с окружающими полипептидами, то есть с белками D2,

СР43 и PsbE, при фотоингибиторных условиях в организме. После обработки

2 1

клеток светом большой интенсивности (-5000 рЕ м" с") сформировалось большое количество агрегатов, а после привыкания к темноте или слабом освещении ((-50 рЕ m'V1) сформировалось очень мало или вообще не сформировались агрегатов в диком типе шпината. Авторы предполагают, что

одной из причин формирования агрегатов могли стать структурные изменения в РЦ ФС II при повышенной температуре, особенно в местах связывания QA и QB, что могло привести к возникновению большого количества активных форм кислорода при освещении. Наши результаты предполагают, что возможно при структурном изменении, вызванном мутацией на участке D1-G208, скопление агрегатов D1 становится значительным, предотвращая жизненный цикл белка D1, который чаще необходим при условиях с сильным освещением.

Пояснения к рисункам