РНК -полимераза E. coli и регуляция транскрипции тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, доктор биологических наук Камзолова, Светлана Григорьевна

  • Камзолова, Светлана Григорьевна
  • доктор биологических наукдоктор биологических наук
  • 1983, Пущино
  • Специальность ВАК РФ03.00.03
  • Количество страниц 369
Камзолова, Светлана Григорьевна. РНК -полимераза E. coli и регуляция транскрипции: дис. доктор биологических наук: 03.00.03 - Молекулярная биология. Пущино. 1983. 369 с.

Оглавление диссертации доктор биологических наук Камзолова, Светлана Григорьевна

ВЕЕДЕНЙЕ

1. РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ГЕНОВ У Ь. cdi обзор литературы / . II

1.1. Регуляция транскрипции в промоторах.

1.1.1. Структура основного промотора.

1.1.2. Негативная и позитивная регуляция транскрипции в промоторах

1.1.2.1. Регуляция транскрипции лактозного оперона

1.1.2.2. Регуляция транскрипции галактозного оперона

1.2. Регуляция транскрипции в терминаторах.

1.2.1. Структура терминаторов

1.2.2. Регуляция терминации транскрипции с помощью специальных белков / антитермицащя транскрипции/.

1.2.3. Аттенюация как контроль экспрессии бактериальных оперонов. Регуляция терминации синтеза РНК в триптофановом опероне

1.2.4. Ретрорегуляция - контроль экспрессии генов в терминаторах на расстоянии

1.3. Интегрирующие механизмы регуляции транскрипции.

1.3.1. Роль cAMP- CRP в транскрипции

1.3.2. Изменение селективных свойств РНК-полимеразы с помощью эффекторов небелковой природы. ppGpp -супермодулятор РНК-полимеразы

ОБОСНОВАНИЕ И ЩЛЬ РАБОТЫ . ИЗ

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ .■.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

3.1. Избирательный синтез РНК на Т2-ДНК РНК-полимеразой b.tdi w vdro . РНК-полимераза - регулятор генной активности

3.1 Л. Взаимодействие РНК-полимеразы Ь.сой В с фрагментированной фаговой ДНК- матрицей

3.1.2. Взаимодействие РНК-полимеразы S. eofi В с высокополимерной Т2-ДНК, содержащей однонитевые разрывы.

4. Конформационные изменения РНК-полимеразы на различных этапах синтеза РНК

4.1.1. Модификация РНК-полимеразы 2,2',6,б' - тетраметил- 4-хлормеркуркарбобензоксипиперидин-1оксилом

4.1.2. Изучение конформационных изменений РНК-полимеразы, модифицированной спиновой меткой, на разных этапах синтеза РНК

4.2.1. Модификация РНК-полимеразы флуоресцентной меткой-флуоресцеинмеркурацетатом / ФМА /

4.2.2. Использование РНК-полимеразы, модифицированной Шк, для изучения конформационных изменений фермента на различных стадиях синтеза РНК.

5. Применение метода спиновых меток к исследованию функционирования ДНК в РНК-полимеразной системе. Конформационные изменения ДНК в комплексе с РНК-полимеразой - эффект дальнодействия в ДНК.

5.1.1. Модификация Т2-ДНК 2,2',6,6'-тетраметил-4-бромацетокси-пиперидин-1оксилом 1.

5.1.2. Изучение матричных свойств Т2-ДНК, модифицированных спин-меткой I, в РНК-полимеразной системе. Роль легкоплавких участков ДНК в инициации синтеза РНК с ранних генов

5.2.1. Модификация Т2-ДНК спиновой меткой по ОН-группам глюкозы

5.2.2. Конформационные изменения ДНК при образовании комплексов с РНК-полимеразой. Эффект дальнодействия в

6. Роль ji -субъединицы РНК-полимеразы в регуляции транскрипции

6.1.1. Генетическая характеристика рифампицинустойчивых мутантов è. tdi с высокоплейотропным эффектом

6.1.2. Биохимический анализ РНК-полимераз, выделенных из рифампицинустойчивых мутантов & 6û£i с плейотропным эффектом.

6.1.3. Влияние риф-р мутаций на специфичность синтеза РНК . 262 6.2. Изучение молекулярных механизмов изменения регуляторных свойств у г/>0 В409 РНК-полимеразы

7. Роль -субъединицы РНК-полимеразы в обеспечении точности копирования матрицы при транскрипции у coii

7.1. Направленный поиск штамма с измененной точностью транскрипции . SOI

7.2. Определение точности транскрипции, проводимой РНК-полиме- . разами ïùûitWii и rf>0 В швода.

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Молекулярная биология», 03.00.03 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «РНК -полимераза E. coli и регуляция транскрипции»

Положение, что все организмы контролируют экспрессию генетической информации, хранящейся в их ДНК, стало уже биологическим трюизмом. ДНК каждой клетки любого организма содержит большое число генов, каждый из которых кодирует специализированную информацию, в сумме программируя громадный биологический и биохимический потенциал, никогда целиком клеткой не реализуемый. Избирательное и ограниченное использование этого потенциала, адекватное моменту времени и условиям внешней среды, предохраняет организм от ненужных энергетических трат и тем самым даёт ему селективное преимущество. Реализация клеточного потенциала должна быть скоординирована таким образом, чтобы обеспечить, во-первых, эффективную репродукцию клетки и во-вторых, выживание её в условиях селективного давления окружающей среды. Только в этом случае возникшие регуляторные системы могли сохраниться в эволюционном процессе. Эти требования, предъявляемые эволюционным отбором к регуляторным механизмам, хорошо прослеживаются на существующих регуляторных системах, которые выполняют две главных задачи: I/ осуществляют контроль за реализацией программы биологического развития, ведущей к клеточной репродукции (контроль клеточного развития) и 2/ обеспечивают адекватный и энергетически выгодный ответ клетки на изменение условий внешней среды (адаптивный контроль) .

В данном обзоре и работе будут разобраны регуляторные механизмы, функционирующие на уровне генной экспрессии, у ¿. соЕь . Последние 30 лет называют эпохой ренессанса в биологии и это, главным образом, благодаря многочисленным исследованиям и фундаментальным достижениям в области регуляции активности генов в прокариотах, полученным, в основном, на Ь. сой и колифагах. Литература по этой проблеме столь обширна и информативна, что рассмотреть здесь все

- б известные сейчас регуляторные системы í. coi'1 не представляется возможным. Положение осложняется отсутствием общей теории, которая позволила бы унифицировать их с позиций какого-нибудь универсального принципа или в рамках небольшого числа общих принципов. С каждой вновь открытой регуляторной системой накапливались всё новые исключения, не.укладывающиеся в классическую схему регуляции Жако-ба и Моно /I/, отличающиеся от неё не только в деталях, но во многих случаях и по основному механизму. В настоящее время таких исключений накоплено так много, что исследователям пришлось расстаться с оптимистической мыслью об универсальности принципа Жакоба-Мо-но и осознать факт многобразия стратегических приёмов и принципов, использованных природой при создании регуляторных систем. За последние 15 лет кроме негативного контроля Жакоба-Моно была найдена позитивная регуляция с помощью специализированных белков-регуляторов индивидуального /2/ или общего действия /3-5/; обнаружены специфические регуляторные механизмы, действующие на стадии тер-минации транскрипции /6,7/; стала известна регуляция, осуществляемая через сопряжение транскрипции и трансляции, и очень своеобразное проявление этого механизма - аттенюация /8-10/;' становится очевидным, что в I. cotí , по-видимому, широко распространен сложный транскрипционный контроль, проявляемый окончательно через стадию трансляции и потоку называемый трансляционным контролем /II/; вместо постулированного Жакобом и Моно конститутивного синтеза белков-регуляторов оказалось, что многие из них подвержены аутогенному контролю /12/, который, вероятно, вообще характерен для экспрессии белков, взаимодействующих с нуклеиновыми кислотами /13/; найдены интегрирующие системы регуляции /14, 15/; стало известно явление ретрорегуляции, механизм которого пока не вполне понятен . /16/; кроме классической однонаправленной полицистронной транскрипции существует дивергентная, конвергентная и "разорванная" транскрипция ■ оперонов /17/ с вытекающими отсюда дополнительными ре-гуляторными возможностями /18,19/. По образному выражению одного из специалистов, исследование регуляторных механизмов прокариот стало тем-то вроде "массового увлечения коллекционированием молекулярных штампов" /17/.

Хотя узнавание любого нового регуляторного механизма, которым трирода снабдила клетку, расширяет наши горизонты в понимании основ шзнедеятельности и занятие им увлекательно и интересно само по себе, зсё-таки на какой-то стадии появляется неудовлетворённость непрогно-шруемостью новых регуляторных систем и возникает желание прежде, гем двигаться дальше, получить ответ на следующие вопросы: Как много [овых регуляторных механизмов можно ещё ожидать обнаружить у со И ? \е. познаваемы ли они в обозримый промежуток времени; есть ли сре-¡и них та ключевая система, которой, возможно, не достаёт исследова-'елям для формулирования универсального принципа, и связанный с этим опрос о возможности построения общей теории, которая позволила бы бъяснять и предсказывать разнообразие регуляторных систем в конкретнее терминах связи между их структурой и функциональной и экологиче-кой информацией регулируемых ими систем.

При любых попытках ответить на эти вопросы необходимо принимать о внимание прежде всего эволюционное прошлое существующих регуляторах систем, рассматривая его в двух главных аспектах. /. Разнообразие механизмов, с помощью которых регулируется генети-зский потенциал клетки, отражает разнообразные потребности организма, зтрудно понять, что регуляторная система, которая совершнствовалась эволюционном процессе по её способности обеспечивать клетку постоян-эй высокой концентрацией какого-либо белка, должна принципиально от-дчаться от системы, отобранной за её способность быстро изменять энцентрацию какого-то белка в ответ на неожиданные изменения окружа-цей среды. Такое рассмотрение, по сути, с позиций адаптивной ценно-. сти естественного отбора, констатируя разнообразие регуляторных механизмов, позволяет в то же время объединять их, группируя по "специализации", что, вероятно, отражается в существовании общих типов регуляции / например, негативная регуляция, характерная для многих катаболитных и биосинтетических оперонов/. Теоретическое моделирование эволюции основных клеточных процессов /биосинтетических, катаболитных, белок синтезирующего аппарата/ показывает, что каждый из них характеризуется своим основным типом регуляции и что общее количество разных типов регуляции, возможных в 6. соИ , вполне ограниченно /13/ и в этом смысле реально познаваемо, более того, можно надеяться, что большая часть их, процитированная выше, уже выявлена. 2/. Учитывая случайный характер мутационного процесса, приводящего к возникновению каждой конкретной регуляторной системы, нужно ожидать многообразие в деталях даже среди однотипных регуляторных систем, которые играют одинаковую роль по отношению к сходным метаболическим процессам одного организма /например, негативная и позитивная регуляция Вас и ^аЕ -оперонов сой /, либо по отношению к одному и тоьгу же клеточному процессу у разных организмов /например, регуляция Ьгр -оперона в Ц.соИ/ £етйа, Фзеи&тт, ВваМщ, МмШоскг /I?/ /. Это многообразие отражает способность эволюционного процесса предлагать разные(функционально эквивалентные) решения на одну и ту же регуляторную задачу. Свойства регуляторной системы, как и любой биологической системы вообще, отображают не только её настоящую функцию, но и её историю, и в этом смысле каждая конкретная система, имеющая своё собственное прошлое, уникальна и не предсказуема.

Возвращаясь к поставленным выше вопросам, приходится ответить отрицательно о возможности построения универсальной теории, обладающей как объясняющей, так и предсказательной силой в отношении однозначной взаимосвязи между структурной организацией регуляторной системы и функциональной и экологической информацией регулируемой ею системы. По-видимому, само требование фрмулирования универсальной теории регуляции в таких терминах неправильно или, по меньшей мере, безнадежно на современном этапе. Знание конкретного устройства и функционирования каждой индивидуальной регуляторной системы может быть только эмпирическим и требует экспериментального исследования именно этой системы.

ДНК Ь.сЖ содержит ~4000 генов, число независимо регулируемых генетических единиц в несколько раз меньше, но тоже огромно. Совершенно очевидно, что еще очень долго мы не сможем узнать детальную картину сложной регуляторной сети, с помощью которой клетка даже такого простого организма, как %.Сой , поддерживает тот сбалансированный порядок метаболических процессов, который отличает жизнь от конгломерата химических реакций.

Признавая первоочередную необходимость детального изучения каких- то специальных систем по соображениям практических нужд человека, все-таки более перспективным подходом для фундаментальных исследований концептуального характера в этой области, по-видимому, является поиск и анализ общих регуляторных механизмов, выделена различных типов регуляции среди уже изученных систем и попытка их обобщений с целью обнаружения универсальных принципов. Даже самые несовершенные обобщения и формулирование самых гипотетических универсальных принципов представляется на современном этапе более полезным, чем детальное исследование еще одной конкретной регуляторной системы.

В данной работе предложен и изучен один из общих механизмов регуляции транскрипции у с помощью самого фермента транскрипции РНК-полимеразы. В "чистом виде" этот тип регуляции используется при транскрипции конститутивных генов, которые кодируют большую и функционально наиболее значимую часть клеточных белков /20/.Именно данный механизм обеспечивает сбалансированность и постоянство состава важнейших клеточных белков при достаточно широкой вариации условий. Кроме того, этот механизм составляет основу "строгого контроля" и является составной частью, по существу, почти всех других регуляторных механизмов, действующих на стадии транскрипции.

Обнаруженное впервые в данной работе взаимодействие между удаленными участками ДНК, индуцируемое РНК-полимеразой /эффект дальнодействия/, представляется нам принципиально важным для координации функционирования экспрессируемых генов. В условиях независимой регуляции каждой из функциональных единиц генома существование координирующего механизма требуется, во-первых, для сбалансированного синтеза РНК в пределах общего транскрипционного пула. Кроме того, наложение координирующего контроля на индивидуальные контроли должно обеспечить более тонкую регулировку активности соответствующих метаболических процессов в зависимости от общего метаболического состояния, т.е. гарантировать более адекватную и энергетически выгодную подгонку клеточных функциональных активностей друг к другу. Осуществление такого координирующего контроля через саму молекулу ДНК является идеальным вариантом по двум критериям. Он надежен, поскольку осуществляется без привлечения посредников - это автономный координирующий механизм транскрипции / аутохромосомный координирующий механизм /. И он универсален, поскольку справедлив для всех генов. Функционирование такого координирукхцего механизма экспериментально не показано, он является гипотетическим. Существование у ДНК способности переносить структурно-функциональную информацию на большие расстояния, показанное в этой работе, является необходимым условием для осуществления такого контроля. Преиыгущества, которые он дает клетке, столь огромны и очевидны, что нам представляется это достаточным условием, чтобы его обсуждать.

I. РЕГУЛЯЩЯ АКТИВНОСТИ ГЕНОВ У £. сой. / обзор литературы/

Обсуждение проблемы регуляции активности генов у1 .бактерий и 5актериофагов следует начать с фундаментального тезиса о том, что ¡пецифичность и эффективность синтеза белков у прокариот контроли-уется, главным образом, на уровне транскрипции через изменение матичной активности соответствующих генов. Этот вывод впервые был до-азан в работах, выполненных в 1962-1966гг. под руководством Р.Б.Хе-ина. Более подробно об этом написано в разделе "Результаты и их об-уждение", поскольку с участия в этих исследованиях /21/ начиналась анная работа и сформировалось общее её направление, относящееся к зучению регуляторных механизмов транскрипции у <?. coil

Используемый прокариотами способ решения регуляторных задач, в шовном, уже на первой стадии реализации генетической информации яв-тется экономически наиболее выгодным, так как он позволяет с самого 1чала устранить излишние энергетические траты на экспрессию ненужных ¡нов. Поскольку регуляция на посттранскрипционных стадиях у прокари-' играет лишь вспомогательную роль, очевидно, что регуляторные меха-[змы,функционирующие при синтезе РНК, настолько надежны, что в состо-:ии самостоятельно, без существенной помощи, обеспечить упорядочен :-сть и сбалансированность клеточных процессов у этих организмов.

В основе регуляции транскрипции у прокариот лежит тщательно ганизованная сеть контрольных "старт" и "стоп"- сигналов, кодируе^-х специфическими последовательностями ДНК, с которыми взаимодей-вует РНК-полимераза, дополняемая.сетью контрольных сигналов для эциальных белков-регуляторов, также кодируемых специфическими по-здовательностями ДНК. Взаимодействие РНК-полимеразы с контрольны-последовательностями - промоторами и терминаторами определяет эф-ятивность .инициации и терминации синтеза РНК на соответствующих участках ДНК. J\ pnori понятно, что белки или любые другие факторы, изменяющие взаимодействие РНК-полимеразы с промоторами и терминаторами, должны иметь регуляторное проявление в транскрипции, причем регуляция может осуществляться, по крайней мере, на двух уровнях транскрипции - на стадиях инициации и терминации синтеза РНК. Обобщённо элементарную единицу транскрипции можно определить как некоторую протяженную последовательность ДНК, ограниченную на одном конце "старт"-последовательностью или промотором, на другом содержащем "стоп"-последовательность или терминатор. Для многих транскрипционных единиц J. coíi характерно наличие дополнительных контрольных последовательностей, входящих в состав промотора, частично перекрывающихся с ним или находящихся вблизи от него, которые взаимодействуют со специальными регуляторньши белками, что приводит к изменению эффективности взаимодействия РНК-полимеразы с промотором. В этих случа-: ях приходится говорить о сложной структуре регуляторного участка, контролирующего инициацию синтеза РНК. Во избежание путаницы принята следующая терминология. Промотором называют участок ДНК, необходимый для того, чтобы РНК-полимераза могла начать с него синтез РНК со скоростью, максимально наблюдаемой для данной транскрипционной единицы ¿w vivo • В состав промотора включают как участки, с которыми взаимодействует РНК-полимераза /основной промотор/, так и участки, с которыми взаимодействуют белки-активаторы, помогающие РНК-по-лимеразе начать синтез РНК. Оператором называют участок ДНК, с которым взаимодействуют белки-репрессоры, мешающие РНК-полимеразе начать синтез РНК. Совокупность всех регуляторных участков, определяющих частоту инициаций синтеза РНК, часто называют промоторной зоной. Из общих соображений можно ожидать, что терминаторы также могут иметь сложную структуру и включать в себя участки, взаимодействующие не только с РНК-полимеразой, но и с белками-регуляторами,действующими на стадии терминации. Однако до сих пор сложно устроенных терминаторов среди изученных не найдено, возможно, из-за относительно малой их изученности. В простейшем случае транскрипционная эдиница содержит один структурный ген. Очень часто два или большее количество генов образуют одну единицу транскрипции, называемую обычно опероном. В этом случае все гены транскрибируются в единую поли-^стронную мРНК и контролируются координирование. Как правило, в еди-шй оперон группируются гены, кодирующие метаболически взаимосвязан-ше белки, например, белки, осуществляющие последовательные этапы ка-сого-либо биосинтетического или катаболитного процессов. В некоторых случаях отдельные единицы транскрипции перекрываются, приводя иногда ; разнонаправленной транскрипции в участках перекрывания. Экспрессия >тих перекрывающихся транскрипционных единиц регулируется во времени 'аким образом, чтобы избежать одновременной разнонаправленной транскрипции.

Таким образом, был рассмотрен общий принцип структурно-функци-нальной организации ДНК, согласно которому ДНК кроме структурных енов содержит регуляторные участки, взаимодействие которых с РНК-по-имеразой и регуляторными белками определяет эффективность синтеза НК с соответствующих структурных генов. Именно организация сигналь-ых контрольных участков около структурных генов превращает кодируе-ый ими биохимический потенциал в реальную клеточную биологию. Поэто-у исследование проблемы регуляции транскрипции, в значительной сте-зни, сводится к изучению механизмов функционирования различного ро-а, транскрипционных контрольных последовательностей ДНК - промоторов, 1ераторов, терминаторов и др., а также выяснению принципов их взаим-эй организации в ДНК. В ДНК последовательность оснований является зточником информации, она определяет специфичность участка. Контроль-ю последовательности ДНК, узнаваемые одним и тем же ферментом или згуляторныи белком, должны быть идентичны или, по меньшей мере, анагичны. Поэтому различные виды контрольных транскрипционных последовательностей, по-видимому, можно попытаться определить в терминах прототиповой последовательности. Однако сама по себе последовательность ДНК ещё ничего не может сказать о функционировании контрольного сигнала. Контрольная последовательность должна быть узнана и антерпретирована соответствующим белком, чтобы это имело регуляторное тоследствие. Поэтому задача состоит в том, чтобы определить, как бел> ш могут дискриминировать последовательности ДНК и как узнавание последовательностей сопровождается регуляторным актом.

Ниже будут представлены известные рабочие модели взаимодействия транскрипционных контрольных последовательностей с их белками, возможные механизмы их действия в некоторых конкретных регуляторных системах и возможные общие принципы функционирования их в регуляции ?ранскрипции у $. со£ь .

Похожие диссертационные работы по специальности «Молекулярная биология», 03.00.03 шифр ВАК

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.