Изучение механизма транскрипции на примере этапов транскрипционного цикла РНК полимеразы бактериофага Т7 Escherichia coli тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Кукарин, Александр Вячеславович

• Кукарин, Александр Вячеславович
• кандидат биологических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Кукарин, Александр Вячеславович

ВВЕДЕНИЕ.

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Краткие сведения о ДНК зависимой РНК полимеразе бактериофага Т7 Escherichia coli.

2. Этапы транскрипционного цикла.

2.1 Инициация.

2.2 Элонгация.

2.3 Терминация.

3. Терминационные последовательности РНК полимеразы бактериофага Т7.

3.1 Терминационные последовательности первого класса (образующие стабильные шпилькообразные структуры).

3.1.1 Влияние контекста последовательности матрицы перед терминаторами первого класса.

3.1.2 Влияние стабильности шпильки.

3.1.3 Влияние А:Т богатого участка, расположенного после шпильки.

3.2 Терминационные последовательности второго класса.

3.2.1 Роль нематричной цепи в процессе терминации.

3.2.2 Роль последовательности ДНК в терминации на сигналах второго класса.

3.2.3 Влияние контекста последовательности матрицы на терминацию второго класса.

3.2.4 Последовательность консенсуса является сайтом паузы Т7 РНК полимеразы

3.2.5 Роль А:Т богатой последовательности, расположенной после консенсуса, в терминации.

4. Мутантные ферменты со сниженной эффективностью терминации на ГПТ.

5. РНК полимеразы родственных бактериофагов узнают терминационные последовательности второго класса.

6. Модель терминации на шпилькообразующем терминаторе.

7. Кинетическая модель терминации.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Разделение связывающей и инициаторной функций промотора РНК-полимеразы бактериофага Т7.

1.1 Приближения РНК-полимеразы к однонитевому промотору при помощи ДНК связывающего домена белка Gal4 не достаточно для инициации транскрипции.

1.2 Двуцепочечный олигонуклеотид, имеющий последовательность участка связывания промотора, активирует транскрипцию на однонитевой матрице.

1.3 Одноцепочечная ДНК должна содержать полную последовательность промотора для проявления эффекта активации.

1.4 Модель активации транскрипции участком связывания промотора in trans.

1.5 Удаление интеркалирующей петли не приводит к транскрипции на однонитевой матрице.

2. Характеризация терминационного сигнала из гена предшественника прогормона паращитовидной железы человека.

2.1 Влияние точечных мутаций на эффективность терминации на ПТТ терминаторе.

2.2 Обе цепи двойной спирали ДНК необходимы для функционирования ПТГ терминатора.

2.3 Нарушения двуспиральности ДНК перед ПТТ терминатором негативно отражаются на его функциональности.

ВЫВОДЫ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Бактериальные штаммы.

Плазмиды.

Питательные среды.

Приготовление компетентных клеток и трансформация бактерий.

Выделение плазмидной ДНК.

Использование ферментов в процедурах клонирования.

Электрофорез фрагментов ДНК в агарозных гелях.

Анализ первичной последовательности ДНК.

Разделение РНК и ДНК методом денатурирующего электрофореза в полиакриламидных гелях.

Электрофоретическое разделение белков в денатурирующих условиях.

Транскрипция in vitro.

Приготовление транскрипционных матриц из синтетических ДНК олигонуклеотидов. 63 Получение точечных мутаций при помощи олигонуклеотид-направленного мутагенеза

Метод разделения ДНК в неденатурирующих условиях.

Метод изменения электрофоретической подвижности ДНК в полиакриламидном геле.

Выделение Т7 РНК полимеразы с использованием аффинной хроматографии.

Выделение Т7 РНК полимеразы методом ионнообменной хроматографии.

Выделение GAL4-T7 РНК полимеразы методом ионнообменной хроматографии.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение механизма транскрипции на примере этапов транскрипционного цикла РНК полимеразы бактериофага Т7 Escherichia coli»

Изучение механизмов экспрессии генетической информации является одним из наиболее актуальных направлений в современной молекулярной биологии. Нарушения процессов экспрессии приводят к снижению жизнеспособности (болезням) или летальны. По данной тематике проводятся широкие исследования в мировых научных центрах. Первый этап экспрессии генов, транскрипция, осуществляется ДНК-зависимыми РНК полимеразами (РНКП), которые присутствуют у всех известных клеточных организмов и многих вирусов.Общепринято разделять РНКП на две группы: многосубъединичные и односубъединичные.Сложные многосубъединичные РНКП характерны для клеточных организмов, односубъединичные кодируются геномами некоторых вирусов и бактериофагов.Бактериофаг Т7 Escherichia coli кодирует собственную РНКП для экспрессии средних и поздних генов. Этот белок, молекулярной массой 98 кДа, содержит одну полипептидную цепь, в отличие от мультисубъединичных ферментов клеточных организмов. В то же время РНК полимераза фага Т7 обладает всеми функциями, необходимыми для полноценного синтеза РНК (Sousa, 1996; McAllister, 1997). Совпадение этапов транскрипции, сходство организации транскрипционных комплексов и наличие функционально гомологичных элементов в структурах РНК полимераз у всех организмов позволяют говорить о единообразии механизма транскрипции в природе. Универсальность транскрипционного аппарата наряду с относительно простым устройством фаговых РНК полимераз позволили ферменту фага Т7 занять уникальное место среди классических моделей для изучения транскрипции. Там, где результаты исследований многосубъединичных полимераз оказываются трудноинтерпретируемыми, изучение Т7 РНКП позволяет выявить основные детали протекания транскрипционного цикла и понять принципы транскрипционного механизма в целом.В транскрипционном цикле различают три стадии: инициацию, элонгацию и терминацию. На первой стадии транскрипции РНК полимераза узнаёт специфическую I. jt.Й последовательность промотора. После связывания фермента происходит разделение цепей ДНК на инициаторном участке и начинается синтез РНК-транскрипта. После нескольких циклов синтеза абортивных продуктов происходит переход к элонгации. На этой стадии происходит удлиннение РНК до тех пор, пока фермент не встретит сигнал терминации, что приводит к диссоциации транскрипционного комплекса и высвобождению готового РНКпродукта. Последние исследования позволили сделать качественный скачок в проблеме понимания процесса элонгации. В то же время наибольший интерес, как менее изученные, представляют стадии инициации и терминации.Целями данной работы являлось разделение связывающей и инициаторной функций промотора РНК-полимеразы фага Т7 и выяснение принципа действия ПТГ терминатора. В процессе исследований решались следующие задачи (а) определение влияния связывания фермента с ДНК на эффективность инициации; (б) определение минимальной длины связывающего участка одноцепочечного промотора при которой происходит инициация; (в) выявление возможных иных функций участка связывания; (г) моделирование взаимодействия фермента с одноцепочечным промотором при добавлении двухцепочечного олигонуклеотида, содержащего участок связывания промотора; (д) определение последовательности ДНК необходимой для функционирования ПТГ терминатора; (е) выявление структуры ДНК необходимой для функционирования ПТГ терминатора.Впервые показано, что участок связывания промотора несёт другую важную функцию, помимо связывающей - активацию полимеразы в транскрипционно-компетентное состояние.Продемонстрирована ранее не описанная возможность физического разделения участков связывания и инициации для промотора Т7 РНКП. Впервые показано, что Т7 РНКП инициирует синтез РНК на одноцепочечной ДНК, содержащей промотор.Впервые определена минимальная нуклеотидная последовательность нового типа терминационного сигнала РНК полимеразы бактериофага Т7 (ATCTGTT в нематричной цепи). При мутации в любом из положений этого консенсуса терминации не происходит.Впервые продемонстрировано, что для терминации абсолютно необходимо наличие i i^ нематричной цепи в районе терминатора, иными словами двуспиральности ДНК. Даже при незначительных нарушениях непрерывности нематричной цепи (разрыва с отсутствием одного нуклеотида) перед терминатором эффективность терминации значительно снижается.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Кукарин, Александр Вячеславович

1. Продемонстрировано, что участок связывания промотора РНК-полимеразы фага Т7 выполняет две функции: обеспечивает привлечение фермента к ДНК и активацию РНК-полимеразы фага Т7 в инициационно-компетентное состояние.2. Показано, что РНК полимераза фага Т7 приобретает способность к инициации транскрипции на одноцепочечном промоторе при добавлении в реакцию двуцепочечного олигонуклеотида, содержащего последовательность участка связывания промотора.3. Показано, что активация полимеразы невозможна при наличии мутаций на участке связывания промотора в составе одноцепочечной матричной цепи.4. Предложена модель взаимодействия полимеразы с одноцепочечным промотором на начальной стадии инициации.5. Продемонстрировано, что последовательность ПТГ терминатора (ATCTGTT) узнаётся РНК полимеразой фага Т7 специфически. Мутации в составе этого консенсуса нарушают функционирование терминатора.6. Продемонстрирована необходимость непрерывности двойной спирали ДНК для ^ терминации на ПТГ терминаторе в районе терминатора и перед ним. Показано, что присутствие фагового лизоцима не стимулирует терминацию на ПТГ терминаторе в виде одноцепочечной ДНК. Отличие принципа взаимодействия полимеразы с данным терминатором от шпилькообразующих терминаторов позволяет отнести ПТГ терминатор к отдельному классу П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Бактериальные штаммы В работе использовали следующие штаммы Escherichia coir.Штамм Генотип Происхождение BL21 Е. соЛВ: F- dcm ompThsdS (гв- гпвг) да/ Novagen, США DH5a Л1аси1б9(ф80 dlacZAMlS) recAl endAl дугА96 Life Technologies, США thi-1 hsdR17supE44 relAl XL-1 Blue recAl endAl gyrA96 thi-1 hsdR17supE44 relAl Stratagene, США lac [FproAB lacFZAIHlS TnlO (Tef)] Плазмиды Для экспрессии РНК полимеразы дикого типа использовали плазмиду рВН161 (Не и сотр., 1997). При приготовлении транскрипционных матриц для РНК полисмеразы Т7 использовали плазмиды рВН183, рВН202, рВН220, рВН221, которые линеаризовали при помощи рестрикционной эндонуклеазы Hind I I I (Не и сотр., 1998).Питательные среды Для выращивания клеточных культур при выделении плазмид и белков использовалась питательная среда Лурия-Бертани (LB) (Sambrook и сотр., 1989). В твёрдые среды для заливания чашек Петри добавляли 1,5 % агара. Концентрация ампициллина составляла 100 м кг/мл.Приготовление компетентных клеток и трансформация бактерий Компетентные клетки вышеупомянутых штаммов готовили по описанию и хранили в

30% глицерине в присутствии 50 мМ хлорида кальция при -70** Трансформацию проводили по описанию Сэмбрука и сотр. (Sambrook и сотр., 1989).Выделение плазмидной ДНК Для выделения больших количеств плазмидной ДНК использовали метод щелочного лизиса с последующим использованием полиэтиленгликоля (Sambrook и сотр., 1989). В микроколичествах плазмидную ДНК выделяли на силикагелевых мембранных колонках QUIAprep с использованием набора фирмы Qiagen, США. Использование ферментов в процедурах клонирования В процедурах клонирования плазмидной ДНК использовали различные ресгрикционные эндонуклеазы, щелочную фосфатазу телёнка и Т4 ДНК лигазу (New England Biolabs, США).Для повышения эффективности клонирования продуктов ПЦР их фофорилировали по 5'-

концу при помощи Т4 полинуклеотид киназы (New England Biolabs, США).Электрофорез фрагментов ДНК в агарозных гелях Для идентификации, разделения и очистки молекул ДНК проводили электрофорез в 1-

2% агарозных гелях в 0,04 М трис-ацетатном буфере, рН 7,8 (Sambrook и сотр., 1989). При нанесении в образцы добавляли 10 кратный буфер нанесения, содержащий 0,04 М трис ацетатный буфер, 50% глицерин, 0.25% бромфеноловый синий и 0.25% ксиленцианол.Анализ первичной последовательности ДНК Для определения последовательности ДНК в составе плазмид использовали метод секвенирования по Сэнгеру с двуцепочечнои ДНК при помощи набора Sequenase 2.0 DNA sequencing фирмы USB (США) согласно рекомендации производителя. В качестве радиоактивной метки использовали а-^^З- АТР (NEN, США). Олигонуклеотидные праймеры заказывали в Macromolecular Resources, США. После проведения электрофореза в 6% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях гель фиксировали в растворе, содержащем 15% метанола, 5% уксусной кислоты в течение 30 мин., переносили на фильтровальную бумагу 3мм Chr (Whatman, США) и высушивали на сушилке Slab Dryer 483 (Bio-Rad, США). Высушенные гели экспонировали в течение 14-18 часов с рентгеновской плёнкой RX-B (Labscientific, США) и проявляли при помощи автоматического прибора X-

ОМАТ М35 processor (Kodak, США).Разделение РНК и ДНК методом денатурирующего электрофореза в полиакриламидных гелях Для разделения продуктов транскрипционных реакций использовали электрофорез в

12% или 20% полиакриламидных гелях (соотношение акриламида к метиленбисакриламиду

19:1) в трис- боратном буфере (0,09 М Трис - борная кислота, 2 мМ ЭДТА, рН 8,0-8,5) в присутствии 7 М мочевины (Sambrook и сотр., 1989). Перед нанесением образцов к ним добавляли равный объём буфера нанесения. Использовали буфера нанесения следующего сосотава: буфер с мочевиной, содержащий двукратный трис-боратный буфер, 8 М мочевину и 50 мМ ЭДТА, а также формамидный буфер, содержащий 90% формамид и 50 мМ ЭДТА. Электрофорез проводили при постоянной мощности 85 Вт в течение полутора часов для

20% гелей и 75 Вт, 1 час для 12% гелей.Электрофоретическое разделение белков в денатурирующих условиях Для анализа образцов использовали электрофоретическое разделение белков в 7% и

10% полиакриламидных гелях в трис- глициновом буфере в присутствии додецилсульфата натрия (Sambrook и сотр., 1989). Перед нанесением на гель к образцам добавляли четырёхкратный буфер нанесения (0,2 М Трис- С1, рН 6,8, 4 % ДСП, 1 М меркаптоэтанол, течение 2 мин. Электрофорез проводили в аппарате Miniprotean I I (Bio-Rad, США). После проведения электрофореза гель переносили в фиксирующий раствор, содержащий 10% уксусной кислоты и 45% этанола, и нагревали до кипения, затем переносили на качалку на 10 мин. Прокрашивание проводили в 0,02% растворе кумасси бриллиантового голубого R450 в 10% уксусной кислоте на качалке (10 мин.) с предварительным нагреванием.Отмывку осуществляли в профетом 5% растворе уксусной кислоты в течение 10 мин. на качалке с помещением в кювету бумажной салфетки Kimwipes EX-L (Kimberly-Clark, США) для адсорбции излишнего количества красителя. Процедуру отмывки повторяли, при этом заменяли салфетку на свежую. Гель фотографировали при помощи фотокамеры Polaroid (США) или хранили в высушенном виде. Для этого гель выдерживали ночь в 2% растворе глицерина, переносили на фильтровальную бумагу 3мм Chr (Whatman, США) и высушивали на сушилке Slab Dryer 483 (Bio-Rad, США).Транскрипция in vitro Использовали буферные растворы следующего состава: Буферный раствор ГГТ: 30 мМ HEPES, рН 7,8; 100 мМ глутамат калия; 15 мМ ацетат магния; 0,25 мМ ЭДТА; 0,05% твин-20; 1 мМ ДТТ. Буферный раствор трис-С1: 20 мМ Трис-С1, рН 7,9; 8 мМ хлорид магния; 0,1 мМ ЭДТА; 0,05% твин-20, 1 мМ ДТТ. Трис-ацетатный буферный раствор: 40 мМ Трис-ацетат, рН 7,9; 10 мМ ацетат магния; 0.05% твин-20, 1 мМ ДТТ. Буферные растворы приготавливали в десятикратной концентрации (ГГТ в

пятикратной) с использованием деионизированной воды, полученной на установке Milli-Q Кроме буферного раствора в компоненты реакции обычно входили по 0,5 мМ АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ, 0,2 мкКи у-^ ^Р- ГТФ (специфическая активность 6000 Ки/ммоль), 50 мкМ матрицы и 20 нг фермента. При приготовлении реакций уникальные компоненты помещали в индивидуальные пробирки, а из общих компонентов составляли реакционную смесь для унифицирования условий. Реакционные смеси и индивидуалные компоненты, разнесённые Транскрипцию инициировали добавлением смеси к ферменту (при тестировании разных

ферментов) или смеси к матрице (при тестировании различных матриц).Для приготовления реакций накопления продуктов транскрипции в зависимости от времени приготавливали общую транскрипционную смесь, из которой после начала реакции отбирали образцы равного объёма через необходимые временные интервалы. Образцы смешивали с равным объёмом буфера для нанесения образцов.После проведения электрофореза гель переносили на использованный лист рентгеновской плёнки или лист фильтровальной бумаги 3мм Chr (Whatman, США) и экспонировали с экраном Phospoimager (Molecular Dynamics). Экран сканировали на приборе Storm 860 (Molecular Dynamics). Результаты анализировали при помощи программы ImageQuant 4.2 и ImageQuant 5.2 (Molecular Dynamics).Приготовление транскрипционных матриц из синтетических ДНК олигонуклеотидов Для приготовления транскрипционных матриц использовали олигонуклеотиды фирм Oligos, США и Macromolecular Resources, США. Полученный сухой осадок ДНК растворяли в деионизированной воде Milli-Q (Millipore, США) в объёме от 20 мкл до 100 мкл, в зависимости от количественного выхода реакции синтеза. Концентрацию ДНК определяли на спектрофотометре Ultraspec I I (Pharmacia LKB, England). Отжиг проводили в объёме 40 мкл транскрипционного буфера, включавшем по 2 мкл рабочего раствора (концентрация 10 мкМ) каждого олигонуклеотида. Смесь выдерживали 10 мин. при 70® С, после чего подвергали медленному охлаждению в течение полутора часов при комнатной температуре.Получение точечных мутаций при помощи олигонуклеотид-направленного мутагенеза Точечные замены в ПТГ сигнале были получены при помощи ПЦР на плазмиде рВН220.Амплификацию проводили при помощи PrimeZyme (Biometra) в соответствии с J рекомендациями производителя. Компоненты реакции в объёме 100 включали 10 мкл 10-

кратного буферного раствора, 10 нг плазмидной матрицы, 1 мкМ каждого праймера, по 200 мкМ дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ, 1,5 мМ хлорид магния и 1 единицу термостабильной ДНК полимеразы PrimeZyme. Общий для всех реакций праймер DL31 (5' GTGAAITCAATTAATACGACTCACTATAG) содержал последовательность промотора и рестрикционный сайт EcoRI (подчёркнуто). Второй праймер Dl_33 (5' GCTCTAGATATCAAAACAGATGATCCCCGGGTACCA) содержал последовательность терминатора и рестрикционный сайт Xbal. Для получения мутаций в последовательности терминатора использовали различные варианты второго праймера с одиночными заменами в соответствующих положениях последовательности (см. таблицу). Реакционные смеси на приборе MicroCycler Е (Eppendorf, США) со следующими параметрами инкубации: 1 мин.вышеупомянутыми рестрикционными эндонуклеазами и клонировали в предварительно обработанный теми же эндонуклеазами плазмидный вектор pUC19 с получением плазмид представленных в таблице. Последовательность клонированного фрагмента подтверждали при помощи секвенирования.Метод разделения ДНК в неденатурирующих условиях Для экспериментов ДНК олигонуклеотиды метили при помощи Т4 полинуклеотидкназы (Sambrook и сотр., 1989). Для разделения фрагментов ДНК использовали трис- ацетатную буферную систему и 10% полиакриламидныи гель с отношением акриламида к метиленбисакриламиду 19:1. Перед наносением образцов к ним добавляли 1/10 объёма буфера нанесения (0,04 М трис-ацетатный буфер, 50% глицерин, 0.25% бромфеноловый синий и 0.25% ксиленцианол). При проведении электрофоретического разделения использовали стёкла 170x170 мм, при толщине геля 1.5 мм и аппарат модели SE 400 (Hoefer Scientific Instruments, США). Разделение проводили при напряжении 50-100 в течение 5-7 часов. После проведения электрофореза гель вынимали из стёкол и экспонировали с экраном Phospoimager (Molecular Dynamics). Экран сканировали на приборе Storm 860 (Molecular Dynamics). Результаты анализировали при помощи профаммы ImageOuant 5.2 (Molecular Dynamics).Метод изменения электрофоретической подвижности ДНК в полиакриламидном геле Для экспериментов ДНК олигонуклеотиды метили при помощи Т4 полинуклеотидкназы (Sambrook и сотр., 1989). Для разделения фрагментов ДНК использовали трис- ацетатную буферную систему и 5% полиакриламидныи гель с отношением акриламида к метиленбисакриламиду 19:1. Гель и буферный раствор содержал 10 мМ ацетат магния.Образцы в объёме 10 мкл наносили в трис-ацетатном транскрипционном буфере, содержащем 5% глицерина. В крайнюю дорожку геля наносили равный объём разбавленного в 10 раз буферного раствора с красителем (0,04 М трис-ацетатный буфер,

50% глицерин, 0.25% бромфеноловый синий и 0.25% ксиленцианол) для наблюдения за фронтом разделения. Электорофорез проводили при постоянной силе тока 35 мА в течение

3-4 часов. После проведения электрофореза гель вынимали из стёкол, переносили на фильтровальную бумагу 3мм Chr (Whatman, США) и высушивали на сушилке Slab Dryer 483 (Bio-Rad, США). Высушенный гель экспонировали с экраном Phospoimager (Molecular Dynamics). Экран сканировали на приборе Storm 860 (Molecular Dynamics). Результаты анализировали при помощи профаммы ImageOuant 4.2 и 5.2 (Molecular Dynamics).Выделение Т7 РНК полимеразы с использованием аффинной хроматографии Для получения РНК полимеразы использовали штамм BL21, несущий плазмиду рВН161, которая несёт модифицированный ген РНК полимеразы с добавлением шести остатков гистидина к N- концу фермента (Не и сотр., 1997). Для приготовления ночной культуры в пробирку с 3 мл среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, переносили одиночную колонию со свежей чашки и инкубировали 16-18 часов без встряхивания при 30" 0,5 мл культуры переносили в 100 мл среды LB в колбе объёмом 500 мл и инкубировали при 600 нм, отбирали образец культуры (1 мл) для анализа (приготовление см. ниже), после чего добавляли 0,1 М ИПТГ до конечной концентрации 0,5 мМ и продолжали инкубацию в течение 4 часов. Клетки собирали центрифугированием (25 мин., 3500 об/мин (Sorvall RT 6000В, Du Pont, США)) в 50 мл полипропиленовых пробирках BlueMax (Becton Dickinson культуры отбирали 125 мкл, переносили в 1,5 мл полипропиленовую пробирку Eppendotf, центрифугировали 2 мин. при 15000 об/мин (VSMC-13, Shelton Scientific, США). Клеточный осадок ресуспендировали в 60 мкл воды, добавляли 20 мкл буфера нанесения (0,2 М Трис С1, рН 6,8, 4 % ДСН, 1 М меркаптоэтанол, 40% глицерин, 0,001 % бромфеноловый синий) и полиакриламидном геле (см. выше). К выделению приступали при наличии ясно видимой зоны экспрессированного белка после индукции. Клеточный осадок из 100 мл культуры

0,5 М хлорид натрия, 0.05% твин-20, 5 мМ р-меркаптоэтанол, 1 мМ ЭДТА, 4% глицерин) в 15 мл центрифужной пробирке. К суспензии добавляли 1/100 100 мМ раствора фенилметилсульфонилфлуорида (Sigma, США) для ингибиторования протеазной активности и 1/100 10% раствора деоксихолата натрия. Клетки подвергали обработке ультразвуком на приборе 550 Sonic Dismembrator (Fisher Scientific) в течение 20 мин. в режиме 30 сек.включено, 30 сек. выключено в ледяной бане. Разрушенные компоненты клеток удаляли центрифугированием 15 мин., 10000 д, 4** С (Sorvall, RC-B5, Du Pont, США). К супернатанту добавляли 5 М раствор хлорида натрия до конечной концентрации 0,8 М и 1/40 10% раствора полиэтиленимина и инкубировали 10 мин. на льду. После удаления осадка насыщенного раствора сульфата аммония (рН 7) и выдерживали 30 мин. на льду. Осадок мл буфера для лизиса, содержащего 5 мМ имидазола и 0,1 мМ фенилметилсульфонилфлуорида, нерастворённые компоненты удаляли колонку для афинной хроматографии на N1^ "^ - агарозном сорбенте (Quiagen). Для приготовления колонки использовали 1 мл суспензии Ni^*- агарозы в 50% этаноле, которую помещали в пустую хроматографическую колонку Poly-Prep (Bio-Rad, США, номер по каталогу 731-1550), после чего позволяли сорбенту осесть при протекании раствора под действием силы тяжести. В результате получали около 0,6 мл сформированного носителя.Колонку промывали 2 мл (более 3 объёмов) воды, 3 мл (более 5 объёмов) 50 мМ сульфата никеля (для достижения максимальной ёмкости) и 2 мл воды. Колонку уравновешивали 2 мл буфера для лизиса, содержащего 5 мМ имидазола. Мёртвый объём колонки составлял около 200 мкл (б капель). После нанесения супернатанта собирали фракции в объёме 1,5 мл.Колонку последовательно промывали буфером для лизиса, содержащим имидазол в возрастающих концентрациях: 5 мл буфера с 20 мМ имидазола, 1 мл с 60 мМ и 3 мл с 200 мМ. Содержание РНК полимеразы проверяли нанесением образцов фракций на гель с ДСН, Обычно пик содержался в двух последних фракциях. Полученный раствор концентрировали или Vivaspin 50000 MWCO (Vivascience, Германия). Во время концентрации производили смену буфера на буфер для хранения (40 мМ трис-НС1 (рН 7.9), 100 мМ хлорид натрия, 5 мМ р-меркаптоэтанол, 1 мМ ЭДТА, 4% глицерин). После концентрации к раствору белка добавляли глицерин до конечной концентрации 50%. Концентрацию белка определяли спектрофотометрически при длине волны 280 нм, используя коэффициент экстинкции 1,4 х Выделение Т7 РНК полимеразы методом ионнообменной хроматографии При выделении мутантных белков, не модифицированных добавлением остатков гистидина, использовали метод ионнообменной хроматографии. Приготовление клеточных культур, индукцию и озвучивание проводили как описано выше. После переосаждения сульфатом аммония осадок растворяли в 4 мл буфера нанесения Р11 (20 мМ фосфат натрия (рН 7.7), 50 мМ хлорид натрия, 2 мМ ЭДТА, 0,1 мМ фенилметилсульфонилфлуорид, 5 мМ р меркаптоэтанол, 5 мМ 5% глицерин) и деализовали против 100 объёмов этого же буфера подготовленную колонку с фосфоцеллюлозой Р11 (Whatman, США). Сорбент обрабатывали согласно рекомендации производителя. 2 мл суспендированной фосфоцеллюлозы помещали в колонку Poly-Prep (Bio-Rad) и позволяли сорбенту осесть при протекании раствора под действием силы тяжести. В результате получали около 1 мл сформированного носителя.Мёртвый объём составлял около 300 мкл (7 капель). Колонку уравновешивали 5 мл буфера нанесения Р11. После нанесения диализного раствора на колонку собирали фракции по 1,5 мл. Колонку промывали 5 мл буфера нанесения Р11. Белок элюировали в четырёх фракциях по 1 мл буфера для элюции (буфер нанесения, содержащий 200 мМ фосфат натрия (рН 7.7) и 400 мМ хлорид натрия). Пиковые фракции определяли при помощи денатурирующего электрофореза в геле. К объединённым фракциям добавляли 15 объёмов буфера доведения (12,5 мМ фосфат натрия (рН 7.7), 25 мМ хлорид натрия, 5 мМ р-меркаптоэтанол, 5 мМ 5%

глицерин). Полученный раствор наносили на подготовленную колонку с DE52 (Whatman, США). Диэтиламиноэтилцеллюлозный сорбент обрабатывали согласно рекомендации производителя. 2 мл суспендированного сорбента помещали в колонку Poly-Prep (Bio-Rad) и позволяли сорбенту осесть при протекании раствора под действием силы тяжести. В результате получали около 1 мл сформированного носителя. Мёртвый объём составлял около 300 мкл (7 капель). Колонку уравновешивали 5 мл буфера нанесения DE52 (25 мМ фосфат натрия (рН 7.7), 50 мМ хлорид натрия, 5 мМ р-меркаптоэтанол, 5 мМ 5% глицерин).После нанесения образца колонку промывали 5 мл буфера нанесения DE52, фракции собирали в объёме 1,5 мл. Связанный белок элюировали буферным раствором, содержащим 25 мМ фосфат натрия (рН 7.7), 125 мМ хлорид натрия, 5 мМ р-меркаптоэтанол, 5 мМ 5% \ глицерин. Пиковые фракции объединяли и концентрировали, как описано выше.Выделение GAL4-T7 РНК полимеразы методом ионнообменной хроматофафии При выделении данного белка использовали метод ионнообменной хроматографии на фосфоцеллюлозе. Приготовление клеточных культур, индукцию и озвучивание проводили как описано выше для выделения РНК полимеразы методом ионнообменной хоматографии.В методику далее внесены следующие изменения. При переосаждении сульфатом аммония добавляли 3/5 объема насыщенного раствора сульфата аммония, затем все процедуры выполнялись как описано выше. Буфер для нанесения на фосфоцеллюлозную колонку содержал 20 мМ фосфат натрия (рН 7.7), 200 мМ хлорид натрия, 2 мМ ЭДТА, 0,1 мМ фенилметилсульфонилфлуорид, 5 мМ р-меркаптоэтанол, 5 мМ 5% глицерин. Для промывания колонки использовали этот же буфер, содержащий 80 мМ фосфата натрия. В буфере для элюции концентрация фосфата натрия составляла 400 мМ. Пиковые фракции определяли, концентрировали и хранили, как описано выше. Концентрацию белка определяли при помощи денатурирующего электрофореза против контрольного стандарта РНК полимеразы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Кукарин, Александр Вячеславович, 2003 год

1. Ляхов д. л., Ильгенфриц X., Чернов Б. К., Драган М., Речинский В. О., Похолок Д.К.,

2. Туницкая В. Л., Кочетков Н. (1992). "Сайт-специфический мутагенез остатка Lys-172 РНКполимеразы фага Т7: характеризация транскрипционных свойств мутантных белков."

3. Молекулярная биология 26(5): 1022-35.

4. Туницкая В. Л., Лучин В., Мемелова Л. В., Ляхов Д. Л., Речинский В. О., Кочетков

5. Н. (1989). "Аффинная модификация ДНК зависимой РНК-полимеразы бактериофага Tl 5'-Рфлюорофосфонилбензоил аденозином: влияние модификации на взаимодействие с субстратом." Молекулярная биология 23(5): 1273-8.

6. Bandwar, R. Р., Y. Jia, N. М. Stano and S. S. Patel (2002). "Kinetic and thermodynamic basisof promoter strength: multiple steps of transcription initiation by T7 RNA polymerase are modulated by the promoter sequence." Biochemistry^1{11): 3586-95.

7. Brieba, L. G. and R. Sousa (2001). "T7 promoter release mediated by DNA scrunching."1. Embo J 20{23): 6826-35.

8. Brieba, L. G. and R. Sousa (2001). "The T7 RNA polymerase intercalating Ьа1ф1п isimportant for promoter opening during initiation but not for RNA displacement or transcription bubble stability during elongation." Biochemistry 40{13у. 3882-90.

9. Cheetham, G. M., D. Jeruzalmi and T. A. Steitz (1999). "Structural basis for initiation oftranscription from an RNA polymerase- promoter complex." /Vaft/ле 399(6731): 80-3.

10. Cheetham, G. M. and T. A. Steitz (1999). "Structure of a transcribing T7 RNA polymeraseinitiation complex." Science 286(5448): 2305-9.

11. Christiansen, J. (1988). "The 9S RNA precursor of Escherichia coli 5S RNA has threestructural domains: implications for processing." IVudeic Acids Res 16{15): 7457-76.

12. Dunn, J. J. and F. W. Studier (1980). "The transcription termination site at the end of theearly region of bacteriophage T7 DNA." /Vucieic Acids Res 8{10): 2119-32. *^. л

13. Dunn, J. J. and F. W. Studier (1983). "Complete nucleotide sequence of bacteriophage T7

14. DNA and the locations of T7 genetic elements." J/i/o/fi'/o/166(4): 477-535.

15. Golomb, M. and M. Chamberiin (1974). "Characterization of T7-specific ribonucleic acidpolymerase. IV. Resolution of the major in vitro transcripts by gel electrophoresis." J Biol Chem 249(9): 2858-63.

16. Gunderson, S. I., K. A. Chapman and R. R. Burgess (1987). "Interactions of T7 RNApolymerase with T7 late promoters measured by footprinting with methidiumpropyl-EDTAiron(II)." Biochemistry 2S{e)\ 1539-46.

17. Hartvig, L. and J. Christiansen (1996). "Intrinsic termination of T7 RNA polymerase mediatedby either RNA or DNA." EmboJlS{X7)\ 4767-74.

18. He, В., A. Kukarin, D. Temiakov, S. T. Chin-Bow, D. L. Lyakhov, M. Rong, R. K. Durbin and

19. W. T. McAllister (1998). "Characterization of an unusual, sequence-specific termination signal for

20. T7 RNA polymerase." 7 5fo/C77e/n 273(30): 18802-11.

21. He, В., M. Rong, D. Lyakhov, H. Gartenstein, G. Diaz, R. Castagna, W. T. McAllister and R. K.

22. Durbin (1997). "Rapid mutagenesis and purification of phage RNA polymerases." Protein Expr Purif9(1): 142-51.

23. Huang, J. and R. Sousa (2000). "T7 RNA polymerase elongation complex structure andmovement." 7 Ato/5/0/303(3): 347-58. 1.eda, R. A. (1992). "The efficiency of promoter clearance distinguishes T7 c la^ I I and class

24. Jeng, S. Т., J. F. Gardner and R. I. Gumport (1990). "Transcription temnination bybacteriophage T7 RNA polymerase at riio- independent terminators." J Biol Chem 265(7): 382330.

25. Jia, Y. and S. S. Patel (1997). "Kinetic mechanism of transcription initiation by bacteriophage

26. T7 RNA polymerase." B/oc/iem/stry 36(14): 4223-32.

27. V Kumar, A. and S. S. Patel (1997). "Inhibition of T7 RNA polymerase: transcription initiationand transition from initiation to elongation are inhibited by T7 lysozyme via a ternary complex with

28. RNA polymerase and promoter DNA." B/oc/iem/stry 36(45): 13954-62.

29. DHA."/^o/Ce//В/о/16(7): 3773-80.1.ng, M. L., S. S. Risman, J. F. Klement, N. McGraw and W. T. McAllister (1989). "Abortive initiation by bacteriophage T3 and T7 RNA polymerases under conditions of limiting substrate."

30. Macdonald, L. E., R. K. Durbin, J. J. Dunn and W. T. McAllister (1994). "Characterization oftwo types of termination signal for bacteriophage T7 RNA polymerase." J Mol Biol 238(2): 145-58.

31. Macdonald, L. E., Y. Zhou and W. T. McAllister (1993). "Termination and slippage bybacteriophage T7 RNA polymerase." 7 A/o/5to/232(4): 1030-47.

32. Martin, С Т., D. К. Muller and J. E. Coleman (1988). "Processivity in eariy stages of;;) transcription by T7 RNA polymerase." Biochemistry 17{11): 3966-74.

33. Maslak, M. and C. T. Martin (1993). "Kinetic analysis of T7 RNA polymerase transcriptioninitiation from promoters containing single-stranded regions." Biochemistry 32{16): 4281-5.

34. McAllister, W. T. (1997). "Transcription by T7 RNA polymerase." Nucleic Acids and Molecular1. Biology 11: 15-25.

35. McAllister, W. T. and R. J. McCarron (1977). "Hybridization of the in vitro products ofbacteriop&hage T7 RNA polymerase to restriction fragments of T7 DNA." Virology S7{2y. 288-98.

36. McAllister, W. Т., Morris, A. H. Rosenberg and F. W. Studier (1981). "Utilization ofbacteriophage T7 late promoters in recombinant plasmids during infection." J Mol Biol 153(3): 527-44.

37. Mead, D. A., E. Szczesna-Skorupa and B. Kemper (1986). "Single-stranded DNA 'blue' T7promoter plasmids: a versatile tandem promoter system for cloning and protein engineering." 1. Protein Eng 1(1): 67-74.

38. Mentesana, P. E., S. T. Chin-Bow, R. Sousa and W. T. McAllister (2000). "Characterization ofhalted T7 RNA polymerase elongation complexes reveals multiple factors that contribute to stability." J Mol Я/о/302(5): 1049-62. 1. Л -4) i л

39. Milligan, J. F., D. R. Groebe, G. W. Witherell and O. С Uhlenbeck (1987)."Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates." Nucleic /lac's/?e515(21): 8783-98.

40. Moffatt, B. A. and F. W. Studier (1987). "T7 lysozyme inhibits transcription by T7 RNApolymerase." Ce//49(2): 221-7.

41. Muller, D. K., С Т. Martin and J. E. Coleman (1988). "Processivlty of proteolytically modifiedforms of T7 RNA polymerase." Biochemistry 27(15): 5763-71.

42. Ostrander, E. A., P. Benedetti and J. C. Wang (1990). "Template supercoiling by a chimeraof yeast GAL4 protein and phage T7 RNA polymerase." Science 249(4974): 1261-5.

43. Patra, D., E. 1^. Lafer and R. Sousa (1992). "Isolation and characterization of mutantbacteriophage T7 RNA polymerases."-7 Л/о/Я/о/224(2): 307-18.

44. Place, С, J. Oddos, H. Buc, W. T. McAllister and M. Buckle (1999). "Studies of contactsbetween T7 RNA polymerase and its promoter reveal features in common with multisubunit RNA polymerases." Biochemistry 38{16y. 4948-57.

45. Raskin, С A., G. A. Diaz and W. T. McAllister (1993). "T7 RNA polymerase mutants withaltered promoter specificities." Proc Natl Acad Sci U S A 90(8): 3147-51.

46. Rong, M., B. He, W. T. McAllister and R. K. Durbin (1998). "Promoter specificitydeterminants of T7 RNA polymerase." Proc Natl Acad Sci U S A 95(2): 515-9.

47. Sambrook, J., E. F. Fritsch and T. Maniatis (1989). Molecular Cloning : a laboratory manual.

48. Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

49. Sousa, R. (1996). "Structural and mechanistic relationships between nucleic acidpolymerases." Trends Biochem Sci 21{S)\ 186-90.

50. Sousa, R., Y. J. Chung, J. P. Rose and B. С Wang (1993). "Crystal structure ofbacteriophage T7 RNA polymerase at 3.3 A resolution." /Vaftyre 364(6438): 593-9.

51. Sousa, R., D. Patra and E. M. Lafer (1992). "Model for the mechanism of bacteriophage T7

52. RNAP transcription initiation and termination." 7/i/o/Ял?/224(2): 319-34.1. Л,1

53. Stano, N. М. and S. S. Patel (2002). "The intercalating beta-hairpin of T7 RNA polymeraseplays a role in promoter DNA melting and in stabilizing the melted DNA for efficient RNA synthesis." J Mo/ Bio/315(5): 1009-25.

54. Tahirov, T. H., D. Temiakov, M. Anikin, V. Patlan, W. T. McAllister, D. G. Vassylyev and S.

55. Yokoyama (2002). "Strucure of a T7 RNA polymerase elongation complex at 2.9 A resolution."1. Nature420(6911): 43-50.

56. RNA polymerase promoter." J Mo/ В/о/273('^): 775-81.

57. Villemain, J., R. Guajardo and R. Sousa (1997). "Role of open complex instability in kineticpromoter selection by bacteriophage T7 RNA polymerase." 7 А/о/^Уо/273(5): 958-77.

58. Villemain, J. and R. Sousa (1998). "Specificity in transcriptional regulation in the absence ofspecific DNA binding sites: the case of T7 lysozyme." J/i/c/5'/o/281(5): 793-802.

59. Weston, B. F., I. Kuzmine and С Т. Martin (1997). "Positioning of the start site in theinitiation of transcription by bacteriophage T7 RNA polymerase." 7 Л/о/^Уо/272(1): 21-30.

60. Young, R. A. (1979). "Transcription termination in the Escherichia coli ribosomal RNA operonrrnC." J В/о/ C/iem 254(24): 12725-31.

61. Zhang, X. and F. W. Studier (1995). "Isolation of transcriptionally active mutants of T7 RNApolymerase that do not support phage growth." 7/i/o/F/b/250(2): 156-68.

62. Zhang, X. and F. W, Studier (1997). "Mechanism of inhibition of bacteriophage T7 RNApolymerase byT7 lysozyme."7A/o/5'/o/269(l): 10-27. » 1. Й