Репродуктивный потенциал клонов плантации сосны сибирской (Pinus sibirica Du Tour) на юге Красноярского края тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.01, кандидат биологических наук Савельев, Станислав Сергеевич

• Савельев, Станислав Сергеевич
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Савельев, Станислав Сергеевич

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОСОБЕННОСТИ ПОЛОВОЙ РЕПРОДУКЦИИ КЕДРА СИБИРСКОГО

1.1 Дендрологическая характеристика кедра сибирского

1.2 Половая репродукция растений рода Ртш

1.3 Развитие женского гаметофита, оплодотворение и эмбриогенез у кедра сибирского

1.4 Развитие мужского гаметофита у кедра сибирского

1.5 Особенности семеношения кедра сибирского

1.6 Особенности половой репродукции кедра с однолетним циклом развития женской шишки

1.7 Контролируемое опыление у хвойных

1.8 Микроклональное размножение хвойных

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Характеристика района исследования

2.2 Характеристика «отцовских» деревьев из естественного древостоя и клоновых деревьев кедра сибирского

2.3 Методика контролируемого опыления кедра сибирского

2.4 Определение сохранности шишек и особенностей их морфогенеза

2.5 Расчет структуры урожая и семенной продуктивности кедра сибирского

2.6 Анализ качества пыльцы

2.7 Микроклональное размножение кедра сибирского

ГЛАВА 3. ОСОБЕННОСТИ ПОЛОВОЙ РЕПРОДУКЦИИ КЛОНОВ НА

ПРИВИВОЧНОЙ ПЛАНТАЦИИ КЕДРА СИБИРСКОГО В ЗАПАДНО-

САЯНСКОМ ОЛХ

ГЛАВА 4. КАЧЕСТВО ПЫЛЬЦЫ ДЕРЕВЬЕВ-ОПЫЛИТЕЛЕЙ КЕДРА СИБИРСКОГО

ГЛАВА 5. РЕПРОДУКТИВНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ ГИБРИДНОГО ПОТОМСТВА КЕДРА СИБИРСКОГО, ПОЛУЧЕННОГО В РЕЗУЛЬТАТЕ КОНТРОЛИРУЕМОГО ОПЫЛЕНИЯ НА КЛОНОВОЙ ПРИВИВОЧНОЙ

ПЛАНТАЦИИ

5.1 Эксперименты по контролируемому опылению 2005 года

5.2 Эксперименты по контролируемому опылению 2006 года

5.3 Эксперименты по контролируемому опылению 2007 года

5.4 Эксперименты по контролируемому опылению 2008 года

5.5 Сравнение структуры урожая и семенной продуктивности шишек двух

вариантов контролируемого опыления за период исследования

5.6 Выращивание гибридных семян ex situ

ГЛАВА 6. РЕГЕНЕРАЦИЯ КЕДРА СИБИРСКОГО В КУЛЬТУРЕ IN

VITRO

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ 1

ПРИЛОЖЕНИЕ 2

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Репродуктивный потенциал клонов плантации сосны сибирской (Pinus sibirica Du Tour) на юге Красноярского края»

ВВЕДЕНИЕ

Несмотря на разноплановые исследования генеративных органов сосны сибирской (кедра сибирского, Pinus sibirica Du Tour) — выявление закономерностей формирования урожаев (Некрасова, 1972; Ирошников, 1985; Воробьев, 1979; Горошкевич, 2008), изучение физиологических процессов, лежащих в основе формирования генеративных структур (Минина, Ларионова, 1979), цитоэмбриологических исследований, (Третьякова, 1990), многие аспекты репродукции данного вида остаются не решенными. Между тем, репродуктивные процессы кедра сибирского имеют ряд особенностей, отличающих его от других представителей хвойных, произрастающих на территории Сибири:

• длительный генеративный цикл (2,5 года);

• незавершенность прохождения эмбриогенеза (семена требуют длительной стратификации в течение четырех-семи месяцев);

• встречаемость в популяции уникальных особей кедров-акселератов, шишки которых созревают за 2,5 месяца (вместо двух лет) и формируют семена без зародыша (Ирошников, 1974; Минина, Ларионова, 1979; Третьякова, 1990).

Изучение репродуктивного потенциала кедра сибирского является одной из основных проблем, направленных на сохранение его генофонда. Эта проблема может быть решена сочетанием классических методов селекции, таких как искусственный отбор высокоурожайных форм, контролируемое опыление, получение хозяйственно ценных гибридов с современными методами биотехнологии, позволяющими осуществить массовое размножение улучшенных сеянцев данного вида.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Определение репродуктивного потенциала клонов кедра сибирского и выявление его регенерационной способности при контролируемом опылении ех situ и в культуре in vitro.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Исследовать половую репродукцию клонов прививочной плантации кедра сибирского на юге Красноярского края;

2. Провести сравнительный анализ пыльцы клонов и деревьев кедра сибирского из естественного древостоя, используемых в качестве опылителей;

3. Выявить структуру урожая, семенную продуктивность женских шишек и качество семян, полученных в результате свободного и контролируемого опыления у клонов кедра сибирского;

4. Оценить семенное потомство кедра сибирского, полученного в результате контролируемого опыления на способность к прорастанию и росту;

5. Индуцировать получение каллусных культур из зародышей семян кедра сибирского в культуре in vitro.

Защищаемые положения

1. Полученное в результате контролируемого опыления пыльцой кедра-акселерата жизнеспособное потомство предоставляет возможность изучить уникальное природное явление, связанное с аномальным генеративным циклом развития в системе рода Pinus.

2. Использование в качестве опылителя пыльцы дерева с однолетним циклом развития женской шишки, позволяет получить семенное потомство, которое можно успешно использовать в лесосеменной практике.

Научная новизна

Впервые проведено контролируемое опыление деревьев клонового архива кедра сибирского в Западном Саяне, в том числе пыльцой уникального дерева с однолетним циклом развития женской шишки. Выявлены комбинации родительских пар, дающие высокопродуктивное потомство. Впервые ex situ было получено селективное потомство в результате контролируемого опыления пыльцой кедра-акселерата с однолетним циклом развития женской шишки и самоопыления. Впервые получен каллус из незрелых зародышей семян «отцовских» деревьев-опылителей кедра сибирского из естественного древостоя Западного Саяна.

Теоретическое и практическое значение

Получены новые данные по влиянию пыльцы уникальных форм деревьев кедра сибирского с однолетним циклом развития женской шишки на репродуктивную способность клонов кедра сибирского. Рекомендованы варианты контролируемого опыления, которые могут быть использованы в селекционных программах. Разработаны методы биотехнологии получения каллусных культур кедра сибирского.

Апробация результатов

Основные результаты исследований представлены на следующих региональных, всероссийских и международных конференциях: школа молодых ученых "Эмбриология и биотехнология" (Санкт-Петербург, 2005); IV Российская конференция «Флора и растительность Сибири и Дальнего Востока» (Красноярск, 2006); конференция молодых ученых «Исследования компонентов лесных экосистем Сибири» (Красноярск, 2006, 2007 и 2009); IV съезд общества биотехнологов России им. Ю.А Овчинникова (Пущино, 2006); I (IX) международная конференция молодых ботаников (Санкт-Петербург, 2006); конференция «Досягнення i проблеми генетики, селекци та бютехнологп», посвященная 120-летию со дня рождения академика HAH Украины Н.И. Вавилова (Киев, 2007); международная школа молодых ученых «Эмбриология, генетика и биотехнология» (Уфа, 2007 и Саратов, 2009); II международное совещание по сохранению лесных генетических ресурсов Сибири «Генетические основы устойчивости и продуктивности древесных растений в связи с антропогенным воздействием и глобальным изменением климата» (Новосибирск, 2009); всероссийская конференция с участием иностранных ученых «Эколого-географические аспекты лесообразовательного процесса» (Красноярск, 2009); международная научная конференция «Актуальные проблемы прикладной генетики, селекции и биотехнологии растений» (Ялта, 2009); III международное совещание «Сохранение лесных генетических ресурсов Сибири», посвященное международному году лесов (Красноярск, 2011).

Диссертационная работа выполнена при финансовой поддержке Интеграционного проекта СО РАН № 53, грантов РФФИ № 06-04—08040-офи, 07-04-96810-р_енисей_а, 08-04-00107-а, 09-04-98008-р_сибирь_а, 09-04-10023-к, 10-04-10026-к, ККФН 18С043 и проекта СФУ 1.7.09 федерального агентства по образованию.

Публикации

По результатам исследования опубликованы 22 работы, в том числе три в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 143 страницах, содержит 27 рисунков и 33 таблицы. Библиографический список включает 179 источников литературы, 55 из которых на иностранном языке.

Благодарности

Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю д.б.н., профессору И.Н. Третьяковой за ценные советы в работе над диссертацией. Кроме того, автор признателен директору Государственного предприятия Красноярского края «Красноярское управление лесами, Ермаковский филиал, Даурское подразделение» Ю.А. Череповскому за предоставленную возможность проведения экспериментальных работ на клоновых архивах кедра сибирского в Западно-Саянском ОЛХ и зам. директора Западно-Саянского ОЛХ В.Ю. Череповскому за помощь в проведении работ по гибридизации.

ГЛАВА 1. ОСОБЕННОСТИ ПОЛОВОЙ РЕПРОДУКЦИИ КЕДРА СИБИРСКОГО

1.1 Дендрологическая характеристика кедра сибирского

Таксономическое положение кедра сибирского: царство - Eukaryota, подцарство - Plantae, отряд - Pinophyta, класс - Pinopsida, порядок - Pinales, семейство — Pinaceae, род - Pinus, вид — Pinus sibirica Du Tour (Price et al., 1998).

Кедр сибирский, сосна сибирская {Pinus sibirica Du Tour) - вечнозелёное дерево, достигающее 35-44 метров в высоту и 1,8 метра в диаметре ствола. Максимальная продолжительность жизни 800-850 лет.

Этот вид отличается густой, часто многовершинной кроной с толстыми сучьями. Ствол буро-серый, у старых деревьев образует трещиноватую чешуйчатую кору. Ветвление мутовчатое. Побеги последнего года коричневые, покрыты длинными рыжими волосками. Хвоя тёмно-зелёная с сизым налётом, длиной 6-14 сантиметров, мягкая, в разрезе трёхгранная, слегка зазубренная, растёт пучками, по пять хвоинок в пучке. Дерево относится к теневыносливым видам (Красноборов, 1976).

Корневая система состоит из короткого стержневого корня, от которого отходят боковые корни. Боковые корни оканчиваются мелкими корневыми волосками, на концах которых развивается микориза. На хорошо дренированных, особенно лёгких по механическому составу почвах при коротком стержневом корне (до 40-50 сантиметров) у кедра развиваются мощные якорные корни, проникающие на глубину до 2-3 метров. Якорные корни вместе с прикорневыми лапами обеспечивают устойчивость мощного ствола и кроны. Древесина кедра мягкая, с приятным запахом, высоко ценится, применяется, в частности, для производства карандашей (Воробьев, 1983; Поликарпов и др., 1986).

Вегетационный период у кедра очень короткий (40-45 дней). По этой причине его можно отнести к медленнорастущим видам.

Кедр сибирский - однодомное, раздельнополое растение. Растение анемофильное. Мужские шишки (микростробилы) собраны у основания побега (прироста текущего года), женские шишки (макростробилы) образуются на концах ростовых побегов, когда последние заканчивают свой рост, возле верхушечной почки. Микростробилы на своей оси несут микроспорофиллы, более крупные у основания, чем у вершины. На оси женских шишечек размещены кроющие чешуи. В их пазухах находятся семенные чешуи с двумя семяпочками. Семенные чешуи у основания шишек также более крупные, чем у вершины (Некрасова, 1972; Горошкевич, 1996 б, 2008).

Зрелые женские шишки кедра сибирского крупные, вытянутые, яйцевидной формы, сначала фиолетовые, а затем коричневые, по диаметру они достигают 5-8 см, по длине до 13 см. Шишки вызревают в течение 14-15 месяцев. Каждая шишка содержит от 30 до 150 семян. Семена крупные, без крыльев. Плодоносить кедр начинает в среднем в возрасте 60 лет, иногда и позже. С одного дерева можно получить до 12 кг чистого ореха. Кедровые орехи - ценный пищевой продукт, могут употребляться в пищу как в сыром виде, так и после термообработки. По количеству фосфатидного фосфора кедровые орехи превосходят все другие виды орехов и семена масличных культур и равноценны сое - наиболее богатому источнику лецитина среди растительного сырья (Николаева и др., 1999; Feirer, 1995; Ireland, 1999).

Кедр сибирский распространён в Западной Сибири от 48 до 66° с.ш., в Восточной Сибири и на Урале. На запад от Урала распространяется лишь до Тиманского кряжа. В Центральном Алтае верхняя граница распространения кедра сибирского лежит на высоте 1900-2000 м над уровнем моря, а в южных районах она поднимается до высоты 2400 метров. Кедр сибирский растет также и на территории Монголии и Северного Китая. Также встречается и в горах Сихотэ-Алинь (наряду с корейским кедром) (Critchfield, 1966; Авров, 2000, 2001).

1.2 Половая репродукция растений рода Ртт

Женская шишка кедра сибирского, как и других видов рода Ртт, рассматривается как образование, происходящее эволюционно от спороносного колоска разноспоровых архегониальных растений. Их ископаемые предки -Psilophytales, перешедшие от водного к наземному образу жизни, уже имели спорангии на концах вертикально направленных веток, отходящих от горизонтального корневища. К происшедшим от них папоротникообразным {Р1епс1ор$1(1а) относятся папоротники, голосемянные и покрытосемянные (Р1еп(1орку1а - Сутпозрегтае и Ащюярегтае), характеризующиеся тем, что основным поколением у них является спорофит (Тахтаджян, 1978).

Из древесных растений семейства сосновых только род Ртш, представителем которого является кедр сибирский (сосна сибирская), имеет женские шишки с двухлетним циклом внепочечного развития. Шишки первого года жизни характеризуются интенсивно идущим формированием семяпочек, в них происходит макроспорогенез и развивается свободноядерная женская клетка. Начало образования женского гаметофита и активация жизнедеятельности всего мегастробила определяется опылением (Минина, Ларионова, 1979; Третьякова, 1990).

Более полный способ оценки половой репродукции кедра сибирского предложен С.Н. Горошкевичем и В.Н. Воробьевым (1989), где используется среднеквадратичное отклонение для ранжирования мужских и женских побегов, а для выделения половых типов - корреляционная решетка. В соответствии с этим, все деревья разделены на условно мужской, условной женский и обоеполый половые типы. Как считают авторы, такой способ оценки половой изменчивости позволит изучить возрастную, экологическую и географическую изменчивость половой структуры популяции не только кедра сибирского, но и других древесных пород, а также связать половой статус деревьев с различными морфологическими признаками.

Как известно, смена поколений (гаметофитного и спорофитного цикла)

ч «-» и тт и

является характерной чертой цикла развития растении. У высших растении предельно редуцированный в процессе эволюции гаплоидный гаметофит представлен весьма незначительным размером и трофическими особенностями, связанными с телом хорошо развитого, расчлененного на отдельные органы диплоидного спорофита. Массивность тела спорофита обеспечивает его приспособительные способности большого биологического значения. Они заключаются в увеличении возможности достигнуть большого числа различных генетических рекомбинаций, необходимых для изменчивости и независимости размножения от половых процессов.

Кроме того, диплоидная фаза допускает гетерозиготность и сохранение в потенциальном виде генетических вариаций, которые могут проявиться в каких-то новых условиях. Из двух поколений спорофит является более совершенным в морфологическом, анатомическом и биохимическом отношениях, поэтому в нем заложены наиболее значительные потенциальные силы генома (Минина, Третьякова, 1983).

Хеслоп-Харрисон высказал предположение о том, что переход диплофаза-гаплофаза и выраженность каждой из них зависит в значительной степени от состояния цитоплазмы. Последняя должна быть совершенно освобождена от диплофазного влияния, прежде чем займет свое положение по отношению репрессированного гаметофитного ядра (Heslop-Harrison, 1972).

Таким образом, характерным для сосновых таких, как кедр сибирский, является наличие единого спорофитно-гаметофитного цикла. В него включается спорогенез, а также гаметогенез и эмбриогенез, заканчивающийся образованием семян (Банникова, 1975; Яковлев, 1978).

По определению Синга (Singh, 1978) женский гаметофит голосемянных растений представляет собой большую многоклеточную структуру, которая выполняет двойную функцию. С одной стороны, он дает образование гаметы, с другой - обеспечивает питание зародыша.

В течение второго вегетативного периода в женской шишке сосны происходят важнейшие подготовительные и последующие процессы, связанные с кульминационным моментом в жизни растения - актом оплодотворения и развитием семени.

1.3 Развитие женского гаметофита, оплодотворение и эмбриогенез у кедра сибирского

Развитие генеративных органов у сосны характеризуются трехлетним циклом развития, характерным для данного вида (Некрасова, 1972; Третьякова, 1990). В первый год развития в конце июля происходит заложение и развитие генеративных почек. Весной следующего года (второй год) в середине мая завершаются эмбриональные процессы в почках, и происходит формирование семяпочек. В первой декаде июня протекают процессы опыления, прорастания пыльцы и развивается свободно-ядерный женский гаметофит (до середины июля). Весной третьего года цикла развития в семяпочках возобновляются эмбриональные процессы: в мае формируется клеточный гаметофит (Третьякова, 1990).

В начале июня в апикальном конце женского гаметофита появляются 2-4 клетки архегониев. В течение 2 дней центральная клетка архегониев увеличивается в размере в 2 раза и в апикальной ее части располагаются 2 шейковые клетки. Через 10-14 дней после появления архегониев центральная клетка архегониев делится, образуя яйцеклетку и брюшную канальцевую клетку. Последняя располагается в верхней микропилярной части архегониев вблизи шейковых клеток и в течение суток разрушается (Третьякова, 1990).

Перед оплодотворением ядро яйцеклетки достигает максимальной величины и смещается в центр архегония. В этот период значительно усиливается рост семяпочек и в целом женских шишек. Возобновление активности мужского гаметофита начинается с момента деления ядра центральной клетки. В пыльцевой трубке образуется две одинаковые по размеру сперматогенные клетки. С этого момента начинается рост пыльцевых

трубок к архегониям (Третьякова, 1990). Все содержимое пыльцевых трубок через шейковые клетки входит в яйцеклетку. Слияние мужских и женских ядер происходит в центре архегониев и совпадает со временем опыления семяпочек первого года. Одно из ядер мужской гаметы подходит к ядру яйцеклетки и погружается в него. Оболочки ядер растворяются, происходит образование двух групп хромосом - идет первое деление зиготы. Деление зиготы завершается за сутки. В оплодотворении участвует 1 мужская гамета, остальные 3 мужских ядра в пыльцевой трубке, не принимавшие участие в оплодотворении, через 1-2 дня дегенерируют. В пределах одного мегагаметофита из 2-4 архегониев оплодотворяются, как правило, 2 и в каждом архегонии идет параллельное развитие по типу простой и кливажной полиэмбрионии (Минина, Третьякова, 1983).

После оплодотворения наступает стадия проэмбриогенеза. Стадия проэмбриогенеза у сосны сибирской включает свободное деление ядер, миграцию свободных ядер к основанию архегония и первые клеточные деления (Некрасова, 1972; Третьякова, 1990).

Во время этой стадии ядро зиготы делится поперечно в центре архегония и образует 2 ядра проэмбрио. Свободные ядра лежат в неоплазме, сформированной из перенуклеарной зоны яйцеклетки и небольшого количества «отцовской» цитоплазмы пыльцевой трубки, которая сопровождала спермии. Свободные ядра делятся и формируют 4 ядра проэмбрио свободно лежащих в неоплазме. Эти 4 ядра мигрируют в халазальный конец архегония и располагаются в один ряд в гранулированной неоплазме. Последующий этап развития включает синхронное деление свободных ядер проэмбрио. Каждая из 4-х клеток делится поперечно и формирует 8-и ядерное проэмбрио. Затем клетки нижнего этажа синхронно делятся, и образуется 12-клеточное проэмбрио и, наконец, делятся клетки верхнего этажа, и образуется 4-х этажное 16-клеточное проэмбрио. Результаты исследования показали, что первые дочерние ядра проэмбрио оказались примерно в 1,5 раза меньше яйцеклетки. С каждым последующим делением размер ядер увеличивается (Третьякова, 1990).

Распределение ярусов проэмбрио согласуется с литературными данными (Mehra, Dogra, 1976; Aderkas et al, 1991). Нижний ярус представлен эмбриональными клетками, второй - суспензорными, третий - розеточный и четвертый (верхний) остается открытым, т.е. его ядра свободно лежат в цитоплазме без образования клеточных стенок.

При прохождении проэмбриональной стадии развития в мегагаметофитных клетках, дающих начало зародышевому каналу, начинается накопление нуклеиновых кислот, белков и особенно крахмала (Третьякова, 1990).

Во второй декаде июня клетки суспензорного яруса проэмбрио растягиваются и выталкивают клетки нижнего эмбрионального яруса через оболочку архегония в ткани мегагаметофита. В это время проэмбриональная стадия развития переходит во вторую стадию - стадию раннего эмбриогенеза (Третьякова, 1990).

Стадия раннего эмбриогенеза включает быстрое растяжение эмбрионального суспензора (первичного суспензора) и деление эмбрионального этажа, формирующего группу маленьких эмбриональных клеток расположенных в мегагаметофите (Singh, 1972).

При внедрении в зародышевый канал рост суспензоров идет в различных направлениях. В результате чего каждое проэмбрио расщепляется на отдельные эмбрионы, т.е. идет кливажная полиэмбриония (кливаж). Наряду с кливажной можно наблюдать и простую полиэмбрионию (Третьякова, 1990).

Первичный суспензор растягивается, и эмбриональные клетки делятся, поперечно формируя вторичный суспензор. Вторичный суспензор состоит из эмбриональных трубчатых клеток, которые делятся и формируют меристематические клетки без специальных меристематических зон. Клетки мегагаметофитов, находящиеся в центре, теряют свое содержимое, и лизируются формируя коррозийную полость. В это время оставшиеся клетки мегагаметофита интенсивно накапливают запасные вещества в форме мелких протеиновых и липидных тел, а также содержат амилопласты, набитые крахмалом (Третьякова, 1990).

Проксимальные клетки зародыша кедра сибирского делятся преимущественно поперечно, клетки растягиваются и продуцируют фибриллы и витки клеток, которые делятся и формируют эмбриональные трубки вторичных суспензорных клеток, образуя суспензорную систему. Эти клетки меньше, чем первичный суспензор и служат, вероятно, для того, чтобы протолкнуть эмбриональные клетки глубже в мегагаметофит (Singh, 1972; Батыгина, 1999).

Эмбрио наиболее продвинутые в коррозийную полость делятся более энергично и формируют большее число клеток, по сравнению с эмбрио лежащим позади. Последние либо прекращают свое развитие, либо их развитие очень сильно замедляется, в то время как дистальное эмбрио увеличивается в размере (Третьякова, 1990).

Начало дифференциации зародыша означает наступление третей стадии развития - позднего эмбриогенеза.

Стадия позднего эмбриогенеза включает дифференциацию зародыша и его развитие. Эта стадия в условиях Западного Саяна начинается в середине I декады июля (через 4 недели после оплодотворения).

Дифференциация, зародыша происходит очень быстро. Первыми появляются корневые меристемы, внешняя часть которых со временем развивается в корневой чехлик. В конце I декады июля (через 3 недели после внедрения в зародышевый канал) зародыш находится в «точковой» стадии развития. Созревание зародыша у кедра сибирского происходит в третьей декаде августа. Однако семена его находятся в недоразвитом состоянии и занимают V2-V4 зародышевого канала. Поэтому, семена кедра сибирского требуют длительной стратификации в течение 3-4 месяцев при низкой положительной температуре.

1.4 Развитие мужского гаметофита у кедра сибирского

Как известно, при формировании нового растительного организма in vivo обычно происходит слияние генетического материала «материнской» и

«отцовской» особи. У голосеменных, и в частности хвойных растений, за передачу наследственной информации «отцовской» особи отвечает мужской гаметофит - пыльцевое зерно.

Согласно характеристике, приведенной Е.Г. Мининой (Минина, 1984), «зрелое пыльцевое зерно с момента вылета из пыльника — независимое, относительно долгоживущее, микроскопически малое, но физиологически активное и самостоятельное бесхлорофилльное растение». В развивающемся пыльцевом зерне протекают процессы деления и роста. Пыльцевое зерно называют также гаметофитом, то есть растением, предельно редуцированным в эволюции, конечной функцией которого является продуцирование и питание мужских гамет (спермиев).

Развитие мужского гаметофита у сосны сибирской (кедра сибирского) можно разделить на два периода (Третьякова, 1990). Первый период охватывает процессы, протекающие в микроспорангиях и ведущие к образованию зрелых пыльцевых зерен. В период пыления мужской гаметофит сосны сибирской очень редуцирован и состоит из четырех клеток: 1-й проталлиальной, 2-й проталлиальной (быстро дегенерируют), клетки-трубки и генеративной клетки (рис. 1).

Эмбриональная клетка

Эмбриональная клетка 1-я проталлиальная клетка

Антеридиальная инициаль 2-я проталлиальная клетка

Генеративная клетка Клетка-трубка

Сперматогенная клетка Стерильная клетка

Мужская гамета Мужская гамета

Рисунок 1. Формирование мужского гаметофита сосны сибирской (по Sterling, 1963; цит. по Stanley, 1974)

Второй период начинается во время опыления семяпочек, после попадания пыльцевых зерен на нуцеллус семяпочки. В течение этого периода происходит прорастание пыльцы, рост пыльцевой трубки и формирование мужских гамет.

В первый период роста мужского гаметофита на нуцеллусе семяпочки составляет около месяца. После чего развитие мужского гаметофита останавливается. В семяпочках второго года только за неделю до оплодотворения осуществляется второй период роста пыльцевой трубки. При этом происходит деление сперматогенной клетки на две мужские гаметы (Stanley, 1974; Третьякова, 1990). В процессе формирования пыльцевые трубки могут ветвиться и образовывать изгибы и вздутия, так как они выполняют гаусториальную функцию (Сунцов, 1982).

Жизнеспособность и физиолого-биохимические свойства пыльцы хвойных.

Физиолого-биохимические процессы в пыльцевом зерне у хвойных изучены слабо по сравнению с покрытосеменными растениями. До сих пор отсутствуют обзоры по метаболизму пыльцы хвойных, как это сделано на пыльце цветковых растений (Некрасова, 1973, 1976, 1983; Минина, 1984; Heslop-Harisson, 1972). По физиологии и биохимии пыльцы голосеменных имеются лишь отдельные сводки. В работе В.П. Размологова и Н.В. Цингер (1972) рассматривается ряд отличительных черт мужских генеративных структур голосеменных от покрытосеменных растений. Для первых характерно наличие проталлиальных клеток (заростка), увеличение числа делений мужского гаметофита (пять вместо двух) и разветвление пыльцевых трубок. Предполагается, что эти признаки обусловлены перестройкой физиологических процессов, связанных с синтезом метаболитов, влияющих на сексуализацию (Крамер, 1983). Установлено, что уровень физиологической активности пыльцы и пыльцевых трубок голосеменных растений ниже, чем покрытосеменных (Размологов, Цингер, 1972; Минина, Ларионова, 1979). Так, например, активность окислительных ферментов (пероксидазы и цитохромоксидазы) у первых очень низкая. По мнению В.А. Поддубной-Арнольди (1976), слабая

ферментативная активность пыльцевых зерен является приспособлением для сохранения энергетического потенциала в период переноса пыльцы.

В работах Т.П. Некрасовой (1983) и Е.Г. Мининой (Минина, 1984), Р. Стенли и X. Линкенс (1974), а также публикациях других авторов было показано, что пыльца хвойных характеризуется большим разнообразием запасных жизненно необходимых веществ и физиологически активных соединений (Ларионова, 1974, 1986; Ларионова и др., 1977; Минина, Ларионова. 1979; Ekberg, 1972; Kopcewicz, 1969; Michalski, 1967). Важную роль в развитии пыльцевых зерен выполняют регуляторы роста (фитогормоны и ингибиторы роста), контролирующие рост пыльцевой трубки и оплодотворение (Козубов, 1974; Ларионова и др., 1977; Минина, Ларионова, 1979; Kopcewicz, 1969; Michalski, 1967). В зрелой пыльце Р. sylvestris и Р. sibirica обнаружены ауксиноподобные вещества и гиббереллины. Выделяются ауксины, которые идентифицируются как ИУК (Ларионова, 1974).

Основную фракцию сухой пыльцы хвойных составляют углеводы -полисахариды до 50%, крахмал - 2-9,2%, низкомолекулярные углеводы - 4-10% массы (Stanley, Linskens, 1974; Некрасова, 1983; Осетрова, 1972; Самсонова, Титов, 1978;). В пыльце сосен, в том числе сосны сибирской, установлено 8 Сахаров: мальтоза, сахароза, галактоза, глюкоза, сорбоза, фруктоза, рибоза, рамноза (Chira, Berta, 1965). Низкомолекулярные углеводы в пыльце голосеменных растений, так же и покрытосеменных, представлены преимущественно глюкозой, фруктозой и сахарозой.

Пыльцевые зерна находятся в тесном контакте с окружающей средой, так как оболочка их пронизана тяжами протоплазмы, которые выполняют функцию взаимодействия пыльцы с внешними факторами (Поддубная-Арнольди, 1976; Сидорский, 1979). При обработке пыльцы разного рода соединениями и внешними воздействиями качество ее может изменяться (Николаева, 1974). Стимулирующий или ингибирующий эффект на рост пыльцевых трубок оказывали спирт, аминокислоты, гормоны, каротиноиды, колхицин, сахара, витамины, пурины, экстракты дрожжей, микроэлементы, тяжелые металлы,

температура в сочетании с влажностью и др. (Голубинский, 1974; Nygaard, 1969).

1.5 Особенности семеношения кедра сибирского

Форма кроны кедра сибирского - очень существенный признак, т.к. она определяет степень семеношения дерева (Воробьев и др., 1979, 1989). А.Ф. Правдин (1963) установил в Западном Саяне цилиндрическую, слаборазвитую редкую, компактную, булавовидную и конусовидную форму кроны. А.И. Ирошников (1964) выявил деревья со сравнительно редкой широкой и густой (сильно разветвленной) компактной кроной. Большое многообразие типов кроны у кедровых сосен отражает этапы развития деревьев, влияние фитоценотических, генетических и абиотических факторов (Правдин, 1963; Ирошников, 1985 и др.). По ширине крон в популяциях кедра сибирского преобладают в основном ширококронные формы (Правдин, 1963).

И.А. Бех и И.В. Таран (1979) в древостоях Приобья у свободностоящих деревьев кедра сибирского выделяют, кроме цилиндрической и булавовидной формы кроны, еще пирамидальную, яйцевидную и обратнояйцевидную. Т.П. Андреевский (1984) отмечает, что наиболее урожайными в Свердловской области являются кедры с булавовидной формой кроны. В припоселковых кедровниках Западной Сибири повышенная урожайность наблюдалась у кедров с шаровидной и овально-цилиндрической формой кроны (Авров, 1989; Попов и др., 1985).

В пределах кроны одного дерева форма и окраска шишек остаются практически одинаковыми, размеры же их колеблются незначительно. Однако изменчивость этих признаков у разных деревьев, но в пределах одной популяции очень существенна (Правдин, 1963). По конфигурации шишек были выделены такие формы: круглошишечные, цилиндрические, конусовидные, яйцевидные (Воробьев, 1974; Киргизов, 1987 и др.). А.И. Ирошников (1974) выделил в кедровниках Западного Саяна формы деревьев с крупными, типичными и мелкими шишками.

И.А. Бех и И.В. Таран (1979) выделяли формы деревьев по размерам шишек с крупными шишками (8 см и более), средними (6-8 см) и мелкими (меньше 6 см). Считается, что шишки цилиндрической формы на 20-30% превышают по массе семян конусовидные, а шишки круглой формы имеют наиболее крупные семена. Особо крупные семена характерны для деревьев, формирующих длинные шишки цилиндрической, широкоовальной и шаровидной формы с утолщенными семенными чешуями (Ирошников, 1985). Выход же семян из шишек у крупношишечных форм кедра по массе в 2-3 раза больше, чем у мелкошишечных форм. Е.В. Титов (1995) отмечает, что деревья кедра сибирского с крупными шишками имеют ускоренное развитие всех генеративных и вегетативных органов. По развитию апофиза И.А. Луганский (1961) в кедровниках среднего Урала выделил следующие формы: с крючковатым, бугорчатым и плоским. Такие же формы по апофизу шишек для кедровников Западного Саяна отмечает А.И. Ирошников (1963), в Рудном Алтае - Н.Я. Киргизов (1987). Отмечено, что для шишек с сильно выраженным крючковатым апофизом характерно несколько большее число пустых семян. Считается (Правдин, 1964; Мамаев, 1972 и др.), что все вариации видов хвойных, различающихся строением чешуй, имеют наследственную структуру. Деревья, имеющие шишки с апофизом разных типов, по мнению С. А. Мамаева (1972), по существу, ничем не отличаются друг от друга. У них одна средняя высота, сходный средний диаметр и окраска семян. Форма апофиза не связана с каким-либо другим признаком дерева. А.И. Ирошников (1974) считает, что размер и форма шишек находятся в тесной связи с параметрами семян.

По окраске шишек Л.Ф. Правдин (1963, 1964) выделяет деревья со светлосерыми, розовыми и фиолетовыми шишками, но он отмечает, что окраска шишек всегда изменяется по мере созревания и не остается постоянной у зрелой шишки.

И.И. Таланцев и др. (1978), И.А. Щерба и др. (1998) указывают на наличие одно-, двух-, трех-, и многошишечных (4-9 штук) форм, выделенных по расположению шишек в пучке. Определена принадлежность кедра к правой или

левой формам по преобладанию шишек с вращением семенных чешуй: по ходу часовой стрелки - правая и против - левая (Щерба, Калинин, 1999).

Потенциально кедр сибирский способен ежегодно давать урожаи, хотя и не одинаковые по силе в связи с пульсирующим характером всех процессов жизнедеятельности вследствие неравномерного притока энергии (Роберте, 1978).

Семя представляет собой созревшую семяпочку (Тренин, 1988). У хвойных оно состоит из зародыша, эндосперма, внутренней тонкой пленки и наружной скорлупы.

В развитии семени центральная роль принадлежит зародышу. От его жизнеспособности зависят все изменения, происходящие в эндосперме и оболочках, с развитием семян в свою очередь связаны изменения всей созревающей шишки. В третьей декаде июня после оплодотворения рост шишки замедляется, а в середине июля прекращается полностью. С весны двухлетние шишки сочные, смолистые и тяжелые. Чешуйки их плотно сомкнуты. Семена в это время одеты мягкой наружной и рыхлой внутренней оболочками белого цвета. Заключенный в них эндосперм студенист. По Тренину (1988), это первый этап преимущественного формирования эндосперма. Зародыша еще нет.

В первых числах июля начинается образование зародышевого канала. Морфологически семена кедра сибирского становятся видимыми в первых числах июля, когда формируется проэмбрио в зародышевом канале. Наружная скорлупа семени постепенно твердеет, при раздавливании щелкает; эндосперм становится молочно-белым, так как в нем начинается отложение запасных веществ. Рыхлая внутренняя оболочка (остаток нуцеллуса) постепенно уплотняется до пленки, отдавая имеющиеся в ней вещества на рост зародыша. В конце этой стадии скорлупа семени начинает окрашиваться в желтый цвет, переходящий постепенно к оранжевому. Семя прочно связано с вязкой мякотью чешуйки, в которую оно погружено. Шишки постепенно одревеснеют, в них увеличивается количество смолы (Некрасова, 1972).

В период активного роста зародыша и его дифференциации (первая половина июля) уплотнение оболочек семян усиливается, скорлупа становится ярко-оранжевой, затем образуется темное пятнышко на узком микропилярном конце семени, с которого начинается потемнение скорлупы. Шишки постепенно теряют влагу, мякоть чешуек становится более плотной, и семена из шишки начинают свободно выделяться. Отрыв семян от плаценты означает прекращение подачи в них воды. Это момент резкого перелома к созреванию. Эндосперм делается молочно-белым. Начинается стадия созревания, которую можно сопоставить с молочной зрелостью семян у покрытосемянных (Терехин, 1973).

Начало высыхания шишек связано с образованием отдельного слоя в основании ее черешка. Поток питательных веществ в шишку ослабляется.

Завершение развития зародыша у кедра сибирского (конец июля - начало августа) сопровождается полным потемнением наружной оболочки семени и превращением внутренней оболочки в темную золотисто-коричневую пленку. Шишки при этом сильно усыхают, уменьшается их смолистость.

Исследования показали, что в третьей декаде июля в развитии семян кедра сибирского завершается первый период, который характеризуется преобладанием синтеза и связан с ростом и накоплением запасных веществ (Минина, Ларионова, 1979). Конец июля - начало августа - это время затухания жизнедеятельности, хотя и постепенно. Жизнеспособность зародышей максимальна, заканчивается жиронакопление шишки, и семена интенсивно теряют влагу.

Вскоре после того, как шишки станут свободно шелушиться, они начинают легко отделяться от побегов вследствие образования пробкового отделительного слоя ткани в черешках. Ко второй половине июля семена хорошо снабжены необходимым запасом крахмала и жира, поток питательных веществ в шишку прекращается. Стадия высыхания шишек соответствует постэмбриональной фазе развития зародыша. В подзоне южной тайги она наступает в августе (Тренин, 1988; Третьякова, 1990).

Влажность зрелых семян без скорлупы составляет около 30%, влажность чешуек без зрелой шишки около 65%. В этом состоянии чешуйки обламываются даже при слабом нажиме, и семена свободно высыпаются. Созревание сопровождается естественным опадением шишек после первого сильного ветра, особенно если он будет с дождем (Роберте, 1978).

1.6 Особенности половой репродукции кедра с однолетним циклом развития женской шишки

Среди особей сосны сибирской в древостоях Западного Саяна систематически встречаются отдельные уникальные формы с признаками акселерации развития женских шишек. Созревание женских шишек и формирование семян у данных форм деревьев происходит в год опыления в течение 1,5-2,5 мес. (вместо 14-15 мес.). Формируются беззародышевые семена с развитым эндоспермом (Ирошников, 1974; Минина, Ларионова, 1979; Третьякова, 1990). Внешне «аномалии» проявляются в локализации зрелых женских шишек на кончиках побегов там, где обычно располагается озимь (Минина, Ларионова, 1979).

В конце 90-х гг. в древостоях Западного Саяна Ю.А. Череповским (Третьякова и др., 2003) были обнаружены еще две особи сосны сибирской с «аномальными» однолетними женскими шишками. Акселерация женских шишек у данных особей была еще более заметной по сравнению с описанными выше деревьями. Уже через 1,5 месяца после опыления (конец 2-й декады июня) у данных особей женские шишки были хорошо заметны в кроне деревьев на кончиках однолетних побегов. Общей морфологической характеристикой деревьев, отличающих их от описанных выше «аномальных» деревьев (Минина, Ларионова, 1979) является внешний вид женских побегов, несущих однолетние шишки - большая часть таких побегов была лишена хвои. Хвоя

и г*

располагалась в апикальнои части женских побегов, прилегающем к женским шишкам (Третьякова, Новоселова, 2003).

По данным физиолого-биохнмических исследований однолетние женские шишки уникальных особей сосны сибирской характеризовались активным метаболизмом: содержали большое количество ауксинов и гиббереллинов, а также накапливали свободные аминокислоты и низкомолекулярные углеводы (Минина, Ларионова, 1979).

Цитоэмбриологические исследования И.Н.Третьяковой (1990) показали, что заложение генеративных структур, микро- и макроспорогенез, начальные этапы формирования гаметофитов у аномальных деревьев с однолетним циклом развития женской шишки происходили также как у типичных деревьев. Однако, через 1 месяц после опыления у «аномальных» особей резко возрастала активность женского гаметофита, через 2 месяца появлялись архегонии, и формировалась яйцеклетка, в то время как оплодотворения яйцеклетки не происходило вследствие отсутствия роста пыльцевых трубок или их медленного роста. Таким образом, «аномальные» особи не могут быть размножены семенным путем (Новоселова, 2003; Новоселова, Савельев, 2005).

До сих пор не известны причины акселерации форм кедра сибирского с однолетним циклом развития женской шишки. По мнению И.Н. Третьяковой (2003), акселерация таких особей связана с женскими генеративными структурами, которые значительно опережают в развитии мужские. В период созревания яйцеклеток у аномальных форм (через 2 месяца после опыления) в мужском гаметофите или не происходит никаких изменений, или пыльцевые трубки только начинают свой вторичный рост. В результате такого асинхронного развития мужского и женского гаметофитов оплодотворения не происходит и зародыши не образуется.

Данные цитоэмбриологического исследования зрелых аномальных яйцеклеток кедра сибирского показали, что в них происходит гаплоидное деление в форме партеногенеза, одного из разновидностей апомиксиса, явления широко встречающегося у прогрессивных семейств покрытосемянных растений (Хохлов, 1967; Терехин, 1973).

Акселерация генеративного цикла и партеногенетическое деление ядра яйцеклетки у аномальных особей, а также их высокий физиолого-биохимический потенциал вегетативных и генеративных органов позволили Е.Г. Мининой высказать предположение об эволюционной продвинутости форм-акселератов кедра сибирского (Минина, Ларионова, 1979; Третьякова, 1990).

1.7 Контролируемое опыление у хвойных

Контролируемое опыление или гибридизация — это использование тестированной высококачественной пыльцы в целях выведение новых сортов путем переопыления. В отличие от отбора, возможности которого ограничены уровнем естественной изменчивости признаков, опыты по контролируемому опылению позволяют получать растения с нужным сочетанием хозяйственно-ценных свойств родительских форм, таких как урожайность и скороплодность. Внутривидовая гибридизация используется как метод генетического (гибридологического) анализа при изучении наследования, межвидовая вносит большой вклад в познание эволюции древесных видов (СгксЬйеШ, 1967; Авров, 1993; Хагман, 1972).

Наиболее впечатляющие результаты получены при гибридизации сельскохозяйственных и плодовых растений. Однако среди лесных древесных пород, по мнению Д.В. Райта (1978), более перспективна межвидовая гибридизация (Авров, 1992). Это связано с тем, что у близких видов в некоторых родах из разных районов произрастания не возникает генетических барьеров, препятствующих скрещиванию (Минина и др., 1974).

Современное состояние работ по гибридизации древесных видов позволяет считать ее перспективным и актуальным методом селекции, требующим дальнейшего развития (Хазова и др., 1974, 1988; Молотков и др., 1982). В зависимости от биологических особенностей лесных видов и целевого назначения гибридов исследования проводится главным образом на быстроту роста, устойчивость и высокую урожайность (Титов, 1988, 1999).

Необходимость получения быстрорастущих гибридов сосны, ели, лиственницы, березы, тополя связана с возрастающей потребностью в древесине. Выведение высокоурожайных гибридов у кедровых сосен и создание на их основе целевых плантаций на больших площадях наряду с отбором в естественных популяциях и размножением хозяйственно-ценных форм и естественных популяциях позволит в будущем увеличить заготовку орехов в России (Титов, 1980).

Получение репродуктивного гетерозиса - длительный процесс (Гилязетдинов, 1985) . Вместе с тем проведение контролируемых скрещиваний позволяет сократить время для подбора высокоурожайных комбинаций деревьев для создания прививочных промышленных орехопродуктивных плантаций. По результатам взаимодействия родителей выявляются в короткие сроки генотипы, дающие с определенными особями повышенные урожаи семян (Титов, 1988).

Предпосылками для успешной гибридизации кедра сибирского являются высокий полиморфизм и разнообразие природно-климатических условий произрастания, влияющих на скрещиваемость и свойства гибридов. Наиболее перспективными для проведения скрещиваний кедра сибирского являются горные районы Алтая и Саян (Авров, 1989). В них на сравнительно небольшой территории в различных высотных поясах сконцентрирован чрезвычайно богатый и разнообразный генофонд этого основного орехоплодного дерева России (Воробьев и др., 1979; Горошкевич, 1996 а).

Получение ценных гибридов во многом зависит от подбора родительских пар. По современным представлениям основой гетерозисный селекции является генетическая разнокачественность партнеров по биологическим признакам и свойствам по происхождению (Молотковский, 1968).

Прежде всего, выделяют половые типы деревьев, так как весь ход развития организма определяет сексуализация, которая имеет высокую генетическую обусловленность. Половой тип дерева отражает физиологическую разнокачественность мужских и женских особей и способствует эффективному

осуществлению полового процесса, обусловливающего семеношение и проявление гетерозиса (Титов, 1980, 1988).

Выделение половых типов однодомных растений, к которым относятся кедровые сосны, проводится по соотношению мужских и женских побегов. У взрослых деревьев мужских побегов всегда образуется больше, чем женских. Выделяются деревья трех половых типов: женского, мужского и смешанного. По мнению Т.Н. Некрасовой (1972), при резком преобладании мужских побегов деревья относятся к мужскому типу, при умеренном - к смешанному, при небольшом, не более чем в 10 раз, к женскому.

По данным Е.В. Титова (1977), в нижней части субальпийского пояса Северо-Восточного Алтая у 80-100-летних деревьев кедра сибирского женского полового типа мужских шишек больше, чем женских макростробилов не более чем в 21 раз, у смешанного в 22-77, а у мужского в 80-120 раз. Самое низкое соотношение генеративных органов, или половой индекс, у всех категорий деревьев отмечается и годы пониженного их образования.

При примерно одинаковом количестве мужских генеративных органов на дереве ведущим показателем сексуализации является количество макростробиллов (Титов, 1977).

В насаждениях преобладают особи смешанного полового типа. На их долю приходится около половины деревьев. Количество индивидуумов женской сексуализации достигает 28-32 %, мужской - 15-20 %. Наиболее отчетливо проявляется половая дифференциация деревьев в низко- и среднеполнотных насаждениях, когда они произрастают в условиях свободного размещения, имеют хорошо развитую крону.

У деревьев смешанного типа более широкая, ажурная крона, диаметр которой составляет 65-80 % высоты ствола. Особи женского типа имеют овальную, мужского конусовидную вершину.

Высокодоставерный фенотипический показатель полового типа деревьев кедровых сосен - протяженность плодоносящей части кроны. При свободном произрастании у женских особей кедра сибирского она занимает 80-90, у

смешанных - 50-70, у мужских 10-50 % всего генеративного яруса (Титов, 2006).

Основной половой функциональной особенностью деревьев мужского и мешанного полового типа является производство пыльцы для обеспечения надежного перекрестного опыления в изменяющихся условиях разных лет. Пыльца у них отличается повышенной жизнеспособностью и энергией прорастания (Артемов, 1981). Деревья ее продуцируют в 3-6 раз больше и более стабильно в многолетнем цикле, нежели особи женского полового типа, главная функция которых - образование семян. Потому мужская сфера у особей женского типа развита значительно слабее и пыльца менее активна.

Пыльцевая продуктивность дерева зависит, прежде всего, от количества и размеров микростробилов, числа микроспорофиллов в них. Они неодинаковы у особей различного полового типа. Среди деревьев женской сексуализации чаще встречаются мелкопыльниковые формы, у мужской и смешанной -крупнопыльниковые. Наиболее крупные микростробилы формируются в годы высокой репродуктивной активности.

Деревья разного полового типа различаются по урожаю семян. Особи женской сексуализации преимущественно - высокоурожайные генотипы, смешанного и мужского типа - соответственно средне- и низкоурожайные.

Закономерности внутривидовой гибридизации кедра сибирского, по данным Титова (Титов, 1995, 2000, 2004, 2006), характеризуются следующими особенностями:

1) При гетерозисной селекции подбирают разнокачественных партнеров по высоко генетически обусловленным признакам - типу сексуализации, урожайности и ее фенотипическим показателям, а также по происхождению.

2) Подбор родительских пар, который при комбинационной селекции для выведения высокоурожайных гибридов основан на возможности сочетания у деревьев большого количества шишек с повышенным содержанием семян в шишке или с высокой массой 1000 шт. Партнеров с максимальным значением

совместимых признаков урожая подбирают из разных географических районов или высотных поясов.

3) Семенная продуктивность «материнских» деревьев при контролируемом скрещивании изменяется в зависимости от структурных признаков урожая «материнского» генотипа, степени различий между партнерами по урожайности и типу сексуализации, стадии опыления макростробилов, интенсивности формирования генеративных органов в год гибридизации, высотного пояса.

4) Эффективность внутривидовой гибридизации выше в высокогорье, где при контролируемом опылении макростробилы развиваются при более благоприятном температурном режиме, и ниже в черневом и горно-таежном поясах, где они находятся в менее благоприятных условиях, нежели неизолированные.

5) По сравнению со свободным опылением урожай семян в высокогорье в комбинациях родителей различной семенной продуктивности повышается, при взаимодействии среднеурожайных деревьев существенно не изменяется, при переопылении высокоурожайных генотипов снижается.

6) Размеры гибридных шишек и масса 1000 шт. семян в различных комбинациях скрещивания существенно не отличаются от показателей «материнских» деревьев.

7) Выход полнозернистых гибридных семян из шишки зависит от комбинации партнеров и содержания их у «материнского» дерева. Максимально он увеличивается при опылении высокоурожайных среднесеменных и среднеурожайных многосемянных форм много- и среднесеменными особями пониженной семенной продуктивности.

8) Контролируемые внутривидовые скрещивания позволяют оценить репродуктивную способность «материнских» деревьев в комбинациях с разными опылителями. Степень реализации урожайности у опыляемого генотипа возрастает по мере усиления различий с партнерами по типу сексуализации, семенной продуктивности и происхождению. Повышенный

урожай семян в большинстве случаев формируется при взаимодействии генотипов, резко различающихся по данным показателям.

9) Высокой общей и специфической скрещиваемостью, повышенным урожаем семян отличаются высокоурожайные генотипы в большинстве комбинаций с низко- и среднеурожайными, реже - с высокоурожайными.

Таким образом, при проведении гибридизационных работ учитывают действие разнообразных факторов. Их можно условно разделить на три качественные разнородные группы. Первая группа связана с действием «материнского» растения на особенности заложения, дифференциации и роста шишек и семян. Вторая группа факторов - это условия опыления, т.е пыльцевой режим, количество и качество пыльцы. Наконец, третья группа факторов связана с взаимодействием пыльцы и семяпочки, мужских и женских гамет, с совместимостью их генотипов в процессах оплодотворения и эмбриогенеза. Признаки, использованные в настоящей работе, складываются под действием различного соотношения этих трех групп факторов (Горошкевич, 1996 а, б).

1.8 Микроклональное размножение хвойных

При проведении работ по контролируемому опылению часто возникают трудности, связанные с недоразвитием зародыша. Для преодоления проблем, связанных с незрелостью зародыша, а также массового тиражирования гибридных семян необходимо применение современной биотехнологии микроклонального размножения в культуре in vitro.

Практически любая клетка многоклеточного организма содержит полный набор генов, необходимых для формирования интактного организма. Свойство клетки реализовывать при определенных условиях имеющуюся у нее генетическую информацию и давать начало целому организму, называется ее тотипотентностью (Бутенко, 1964). Тотипотентность растительных клеток сравнительно легко реализовать, создав подходящие условия, что стало широко

использоваться в экспериментах по культуре клеток, тканей и органов в условиях культуры in vitro. В каллусной культуре можно вызвать как образование новых органов растения (корней, побегов и т.д.), так и формирование зародышей (эмбриоидов) и, в дальнейшем, растений-регенерантов. Это явление лежит в основе процессов соматического эмбриогенеза и гаплоидного эмбриогенеза растений.

Характеристика соматического эмбриогенеза хвойных.

Соматический эмбриогенез представляет собой асексуальный процесс, который ведет к формированию зародыша из соматических клеток. Соматические зародыши имеют биполярную структуру, способны к прорастанию и функционируют аналогично их зиготическим копиям (Park, 1992). Обладая признаками зиготических зародышей в сочетании с потенциальным обеспечением большого числа растений в короткий период времени, соматические зародыши являются идеальным материалом для клонального воспроизведения (Klimaszewska, Суг, 2002; Третьякова и др., 2007).

У хвойных соматический эмбриогенез может быть вызван только in vitro от семенных эксплантов (незрелые и зрелые зиготические зародыши) и, у некоторых видов, от эксплантов сеянцев (семядоли, верхушки побегов, молодые иглы, сегменты вегетативных побегов) (Lelu et al., 1994; Attree et al., 1990; Mo et al., 1991; Salajova et al., 2001; Malabadi et al., 2005). Клонирование зрелых деревьев было бы самым эффективным способом получить чистые генетические линии (Park et al., 1992), но к настоящему времени соматический зародыш получен только у Pinus patula (Malabadi et al., 2005).

Соматический эмбриогенез хвойных растений - это идеальный метод исследования процесса дифференциации, а также понимания механизмов выражения тотипотентности растительных клеток. Эмбриогенные клеточные линии поддерживают эту способность длительный период времени и дают начало генетически единообразным и нормальным растительным популяциям (Durzan, 2008). Соматические эмбриогенные системы могут также применяться

для трансформации. Протопласты, изолированные от эмбриогенного каллуса, могут продуцировать необходимые вещества для применения в генной инженерии хвойных (Tautorus et al., 1991). Соматический эмбриогенез был получен у ряда видов ели и сосны (Hakman and Fowke, 1987; Durzan and Gupta, 1987). Инициация эмбриогенного каллуса была впервые получена у Picea abies из зрелых и незрелых соматических зародышей. У видов сосны, таких как Р. taeda и Р. mañana, только незрелые зиготические зародыши на стадиях созревания или предсозревания могут быть восприимчивы к соматическому эмбриогенезу.

В настоящее время, распространение хвойных через соматический эмбриогенез требует регенерации соматических сеянцев от множества эмбриогенных чистых линий. Эти эмбриогенные чистые линии могут использоваться в различных генетико-селекционных работах и затем использоваться для массового воспроизводства (тиражирования) клоновых растений.

Кроме прикладного применения, соматический эмбриогенез представляет собой фундаментальный биологический интерес и часто рассматривается сравнительно с зиготическим эмбриогенезом, особенно с рекомендацией "нормального" развития и фенотипа соматических зародышей. За прошлое десятилетие, много информации было накоплено о требованиях, необходимых для достижения этой "нормы" через соматический эмбриогенез хвойных in vitro. Они, включают, наряду с прочими, знание эмпирического выбора экспланта, среды и окружающей среды культуры (Klimaszewska, Суг, 2002).

Стадии протекания соматического эмбриогенеза.

Соматический эмбриогенез хвойных - многоступенчатый процесс. Каждая стадия имеет определенные особенности, и они часто зависят от результата предыдущей стадии. Важно обратить внимание, что на каждой стадии соматического эмбриогенеза происходит истощение эмбриогенных линий культуры, которые переходят от одной стадии к следующей и образуют растения; это должно быть включено в стратегию планирования, когда эта

технология применяется для клонального выбора. Процесс соматического эмбриогенеза подразделяется на несколько стадий (Bonga, 1997):

Инициация - начало эмбриогенного культивирования, обычно от незрелого (все хвойные) или зрелого зиготического зародыша происходит на питательных средах, включающих цитокинин (ели) или комбинацию ауксина и цитокинина (большинство хвойных). Конец этой стадии отмечен эксплантами с видимым ростом эмбриогенной ткани, которая состоит из отдельных клеток и совокупностей клеток (глобул). Частота инициации соматического эмбриогенеза от незрелых зародышей, в дополнение к другим факторам (то есть, генетическому) сильно зависит от стадии развития. Инициация эмбриональной массы может происходить из незрелых (у большинства хвойных) (Jain et al., 1989) и зрелых зародышей (в основном у ели) (Cheliak, Klimaszewska, 1991), гипокотилей, семядолей, хвои, мегагаметофитов, сегментов вегетативных побегов на твердых и полутвердых средах (Gupta, Tiramis, 1999). Показателем успешной инициации служит формирование белого или прозрачного волокнистого эмбриогенного каллуса, состоящего из отдельных клеток, клеточных скоплений или даже ранних соматических зародышей (Klimaszewska, Суг, 2002; S. von Arnold et al., 2002). Помимо генотипа, на формирование эмбриогенного каллуса влияет также стадия развития экспланта вводимого в культуру, что особенно важно при работе с зиготическими зародышами.

Пролиферация - быстро увеличивающиеся эмбриогенные культуры с непрерывным ростом эмбрионально-суспензорной массы, требующие перевода на свежую твердую среду (все хвойные) или на жидкую среду (ели, некоторые сосны, ель Дугласа), обычно того же самого состава, как тот, что используется для инициирования. При этом гормональный состав среды либо не меняется, либо концентрация цитокининов уменьшается в два раза. Для быстрого увеличения новой массы эмбриогенной ткани недавние работы рекомендуют рассеивание эмбриогенной ткани в жидкой среде и затем культивацию эмбриогенной ткани, которая тонко распределяется на диске фильтровальной

бумаги, помещенном на поверхность среды. Пролиферация, или поддержание эмбриогенных культур проводится для накопления массы эмбриогенной ткани на полутвердых или жидких средах (ряд видов сосен, ель, псевдотсуга тиссолистная). Во время пролиферации эмбриональной массы ауксины и цитокинины, стимулируют быстрое увеличение ее объема и, напротив, подавляют формирование зародыша (Smertenko et al., 2003).

Созревание соматических зародышей - развитие незрелых (ранних) соматических зародышей через тканевую дифференциацию в зрелые зародыши происходит на питательной среде, которая содержит абсцизовую кислоту (АБК) и обеспечивает оводненность развивающихся культур. Оводненность связана с уменьшением осмотического потенциала среды (добавление осмотически активных растворов) или увеличением силы геля среды (физические средства), или комбинацией обоих методов. Развитый соматический зародыш, который морфологически и физиологически напоминает зиготический зародыш, отмечает конец этой стадии, которая длится 6-12 недель (Ruaud, 1993; Klimaszewska, 2002b).

Одним из самых важных компонентов питательной среды в этот период является абсцизовая кислота (АБК), которая обеспечивает понижение содержания воды в пролиферирующих культурах (Stasolla et al., 2002; Lelu et al., 1995). Интересно отметить, что подобное явление наблюдается и при формировании зародыша хвойных in vivo, когда происходит резкое обезвоживание семян и теряется до 90% воды (Кулаева, 1995). В этот период содержание АБК в семенах достигает максимального значения и вызывает затормаживание метаболических процессов и их переход в состояние покоя.

Соматические зародыши должны быть очень сильно обезвожены до относительной влажности 98% перед прорастанием, или высушены до низкого водного содержания в низкой относительной влажности для короткого или долгосрочного хранения, соответственно. Цель частичного высушивания соматических зародышей до прорастания состоит в том, чтобы уменьшить содержание воды в конце процесса созревания. Однако, частичная сушка не

нужна, если содержание воды в зрелых соматических зародышах достаточно низкое в конце периода созревания.

Прорастание и преобразование в растения соматических зародышей в культуре in vitro обычно проводится на полутвердых средах содержащих сахарозу и, иногда, активированный уголь. Удлинение эпикотиля и появление хвои наблюдается в течение 12-16 недель и зависит от вида растения (Misra, Green, 1991). Выращивание полученных растений-регенерантов проводится в теплицах при большей влажности воздуха для акклиматизации молодых растений (Hay, Charest, 1999).

Ранний рост выращенных соматических растений-регенерантов in vitro протекает в условиях оранжереи и теплиц. Как правило, в течение первых 2-3 недель роста обеспечивается высокая относительная влажность, чтобы облегчить акклиматизацию растений к окружающим условиям (Klimaszewska, Суг, 2002а).

Влияние компонентов среды на процесс соматического эмбриогенеза различных видов хвойных.

Работы по созреванию соматических зародышей различных видов хвойных подчеркивают важность уменьшения осмотического водного потенциала среды при возрастании концентрации сахарозы (Cheliak & Klimaszewska, 1991; Lelu et. al., 1994; Tremblay and Tremblay, 1991), или добавления в среду маннитола, сорбитола (Roberts et. al., 1990; Tremblay and Tremblay, 1991), или полиэтиленгликоля (PEG MW 4000) (Attree et. al., 1991, 1995) в присутствии абсцизовой кислоты. Для P. taeda и Abies nordmanniana Spash. добавляют комбинацию из мальтозы и PEG в среду созревания, обеспечивая наилучший отклик созревания (Li et. al., 1999; Norgaard, 1997).

Исследуется влияние азота органических нитритов на соматический эмбриогенез хвойных (Simóla and Santanen, 1990; Bozhkov et. al, 1993; Khlifi and Tremblay, 1995; Barret et. al., 1997). Глутамин, отдельно или в комбинации с гидролизатом казеина и неорганическими формами азота, обычно используется в различных фазах соматического эмбриогенеза хвойных. В исследованиях, где

глутамин добавляется отдельно, он может поддерживать созревание, например, Picea mañana Mill, соматические зародыши в отсутствие форм неорганического азота в культуре среды (Khlifi & Tremblay, 1995). У Picea glauca Voss., однако, соматические зародыши созревают в отсутствие глутамина и при наличии гидролизата казеина и неорганического азота (Barret et. al., 1997). Также для созревания соматических зародышей в среду для P. radiata добавляют раствор семи аминокислот и неорганического азота. Глутамин и глутамат - ключевые доноры азота для биосинтеза главных азотных соединений в растениях, включая другие аминокислоты, основные нуклеиновые кислоты, полиамины и хлорофиллы. Фермент глутаминсинтетаза катализирует разложение глутамата с образованием глутамина с затратой АТФ и участием фермента глутаматсинтазы, который катализирует уменьшение переноса азота на 2-ксиглутарат для образования двух молекул глутамата, одна из которых используется повторно для синтеза глутамина. Биохимия и молекулярная биология цикла глутаминсинтазы обширно изучена, потому что ключевую роль этот фермента играет в росте и развитии растений. В фотосинтезирующих тканях голосеменных глутаматсинтаза-2 и ее изоформа глутаматсинтаза, локализованная в пластидах, отвечает за ассимиляцию аммонийных остатков для уменьшения нитратов и фотодыхания. Цитозольная изоформа фермента, глутаматсинтаза-1, преобладает в корнях и в меньшей степени содержится в зеленых тканях, исключая С4-растения, которые проявляют низкую активность фотодыхания (Ireland & Lea, 1999). Глутаматсинтаза - изофермент, и его расшифрованные гены были изолированы и характеризованы у сосны, модельном дереве для молекулярных исследований хвойных. Стадии, для которых особенно важно наличие азотного компонента, особенно глутамина, это пролиферация и созревание соматических зародышей различных видов (Bozhkov et al., 1993; Khlifi & Tremblay, 1995). Кроме того, баланс содержания азота сильно влияет на метаболизм эмбриогенеза растений (Rodriguez et al., 2006).

Одним из наиболее важных компонентов питательной среды является введение в ее состав природных и синтетических фитогормонов и особенно цитокининов и ауксинов. Самым типичным эффектом цитокининов является индукция деления клеток. Влияние цитокинина на митотическую активность клеток зависит не только от его концентрации, но и от продолжительности действия. В условиях изолированной культуры единичные клетки и агрегаты из небольшого числа клеток более зависимы от экзогенного цитокинина, чем многоклеточные кусочки каллусной ткани. Обнаружено, что некоторые культуры, каллусы которых не нуждаются для деления клеток в экзогенном цитокинине, способны синтезировать эндогенные цитокинины. Деление клеток, как правило, не индуцируется одним цитокинином или одним ауксином, лишь определенное сочетание обоих гормонов приводит к активному делению клеток. По-видимому, начальные стадии процесса индуцируются ауксином, а затем необходимо присутствие обоих гормонов. Присутствие ауксина (наряду с цитокинином) является совершенно обязательным компонентом для индукции деления клеток. Ауксин необходим, прежде всего, для инициации репликации ДНК. Перевод клеток к митозу и цитокинезу зависит, как правило, также от присутствия цитокинина, однако высокие концентрации ауксина способны и без цитокинина вызывать митозы в соматических клетках растений (Полевой, 1982).

Формирование соматических зародышей в культуре in vitro - сложный процесс и требует разработки определенной биотехнологии. Модифицированный для каждого вида, этот процесс направлен на получение эмбрионально-суспензорной массы, ее пролиферацию, получение соматических зародышей, их вызревание, сохранение и проращивание. У сибирских видов хвойных разработкой биотехнологии соматического эмбриогенеза занимаются в лаборатории лесной генетики и селекции Института леса СО РАН (Скрипаченко, 1982; Иванова и др., 2006; Третьякова и др., 2009). Биотехнология соматического эмбриогенеза кедра сибирского до сих пор остается неразрешенным вопросом (Третьякова и др., 2006, 2007, 2008 и 2009).

Заключение диссертации по теме «Ботаника», Савельев, Станислав Сергеевич

выводы

1. Генеративные органы клонов на прививочной плантации кедра сибирского Западно-Саянского ОЛХ закладываются с 14-летнего возраста.

2. Пыльца кедра-акселерата с однолетним циклом развития женской шишки и плюсовых деревьев из естественного древостоя, используемая в контролируемом опылении, характеризуется высокой жизнеспособностью (70-85%). Пыльца, продуцируемая клоновыми деревьями кедра сибирского в 15-17-летнем возрасте, оказалась низкого качества.

3. Пыльца, используемая в контролируемом опылении, в том числе и дерева с однолетним циклом развития женской шишки, не оказала влияния на морфогенез и семенную продуктивность женских шишек.

4. При большом урожае макростробилов в одних и тех же вариантах контролируемого опыления формировались мелкие шишки с низкой семенной продуктивностью (2009 год), тогда как при низком урожае макростробилов, формировались крупные шишки с высокой семенной продуктивностью (2006-2007 гг.).

5. Контролируемое опыления клонов пыльцой дерева с однолетним циклом развития женской шишки и плюсовых деревьев оказало положительное влияние на семенную продуктивность сформировавшихся двухлетних шишек, по сравнению с вариантами свободного опыления. Выявлены комбинации родительских пар, дающие высокопродуктивное потомство: 277/22 х 106, 277/22 х 357, 277/22 х 492, самоопыление 277/22, 280/25 х 106, самоопыление 280/25, 153/13 х 106, 145/4 х 106 и самоопыление 145/4.

6. Получено интенсивно растущее потомство от контролируемого опыления пыльцой кедра-акселерата, которое является ценным материалом для изучения уникального природного явления, связанного с аномальным генеративным циклом развития в системе рода Ртиз.

7. Зиготические зародыши кедра сибирского из естественного древостоя in vitro способны формировать каллусную культуру. Активное образование каллуса происходило на среде YiLV при предварительной обработке эксплантов низкими положительными температурами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Репродуктивный потенциал кедра сибирского на клоновой прививочной плантации Западно-Саянского ОЛХ характеризуется наличием большого выбора клонов, способных с 14-летнего возраста регулярно формировать макро- и микростробилы в достаточном количестве, что создает благоприятные условия для проведения исследований по контролируемому опылению и селекции данного вида. Осуществлен отбор родительских пар для контролируемого опыления на клоновом архиве кедра сибирского, в ходе которого было показано, что наиболее перспективными для дальнейших экспериментов являются следующие варианты: самоопыление 277/22, 277/22 х 106, 277/22 х 357, 277/22 х 492, самоопыление 280/25, 280/25 х 106, 153/13 х 106, самоопыление 145/4 и 145/4 х 106. Полученное потомство обозначенных вариантов контролируемого опыления выгодно отличалось в течение ряда лет высокими показателями репродуктивного потенциала, который выражался в крупных размерах двухлетних шишек, их высокой семенной продуктивности и том, что семена таких шишек были крупными, полнозернистыми и продуцировали сеянцы с высокими показателями роста. Однако за годы исследования выявлено, что показатели структуры урожая в одном и том же варианте контролируемого опыления варьируют по годам, и самоопыление шишек не оказало влияния на структуру урожая шишек. Эксперимент по введению в культуру in vitro зиготических зародышей, полученных от плюсовых «отцовских» деревьев кедра сибирского, произрастающих в естественном древостое Западного Саяна, позволил получить быстрорастущую каллусную культуру. Показан высокий репродуктивный потенциал выращенного каллуса и перспективность использования биотехнологии соматического эмбриогенеза в культуре in vitro для кедра сибирского.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Савельев, Станислав Сергеевич, 2011 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Авров Ф.Д. Популяционная интеграция насаждений кедра сибирского в различных лесорастительных условиях / Ф.Д. Авров // Лесоведение. - 1993. - № 4. - С. 3-8.

2. Авров Ф.Д. Восстановление устойчивых лесных насаждений / Ф.Д. Авров // Лесное хозяйство. - 2000. - № 2. - С.48-52.

3. Авров Ф.Д. Генетическая устойчивость лесов / Ф.Д. Авров // Лесное хозяйство. - 2001. - № 3. - С. 46 - 47.

4. Авров Ф.Д. Посевные качества семян и фенологическое развитие деревьев припоселковых кедровников / Ф.Д. Авров // Проблемы кедра-Томск, 1989.-Вып.1.-С.113-121.

5. Авров Ф.Д. Проблемы и перспективы лесовосстановления и лесного семеноводства / Ф.Д. Авров, В.Н. Воробьев // Лесное хозяйство.-1992.-№5.-С. 39-41.

6. Андреевский Т.П. Лесоводственно-биохимические особенности \/ различных форм кедра сибирского на Урале: автореф. дис. канд. е.- х. наук.-Свердловск, 1984.-22 с.

7. Артемов В.А. Жизнеспособность пыльцы / В.А. Артемов // Эколого-биологические основы повышения продуктивности таежных лесов европейского Севера. Л.: Наука. Ленинград, отд-ние, 1981- С. 185-212.

8. Банникова В. П. Цитоэмбриология межвидовой несовместимости у растений / В.П. Банникова - Киев: Наукова думка, 1975. - 284 с.

9. Батыгина Т.Б. Эмбриогенез и морфогенез половых и соматических зародышей / Т.Б. Батыгина // Физиология растений - 1999 - Т. 46, № б,- С. 884 - 898.

10. Бех И.А. Сибирское чудо-дерево / И.А. Бех, И.В. Таран-Новосибирск: Наука, 1979 - 127 с.

11. Бутенко Р. Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений / Р.Г. Бутенко - М.: Наука, 1964. - 146 с.

12. Воробьев В.Н. Биологические основы комплексного использования кедровых лесов / В.Н. Воробьев - Новосибирск: Наука. Сиб. отд.-ние, 1983.-254 с.

13. Воробьев В.Н. Методика оценки и отбора деревьев кедра сибирского на урожайность / В.Н. Воробьев // Состояние и перспективы развития лесной генетики, селекции и семеноводства. Методы селекции древесных пород. Рига, 1974. С. 32-36.

14. Воробьев В.Н. Семена кедра сибирского / В.Н. Воробьев, H.A. Воробьева-Новосибирск: Наука. Сиб отд.-ние, 1979 - 129 с.

15. Воробьев В.Н. Рост и пол кедра сибирского / В.Н. Воробьев, H.A. Воробьева, С.Н. Горошкевич- Новосибирск, 1989 - 167 с.

16. Гилязетдинов Ш.Я. Молекулярно-генетические и биохимические основы гетерозиса у растений / Ш.Я. Гилязетдинов // Пути генетического улучшения лесных древесных растений. - М. -Наука, 1985 - С. 63- 90.

17. Голубинский И.И. Биология прорастания пыльцы / И.Н. Голубинский. - Киев: Наукова думка, 1974. - 368 с.

18. Горошкевич С. Н. Внутрипопуляционное разнообразие шишек и семян Pinus sibirica Du Tour. Сообщение 1. Уровень и характер изменчивости признаков / С.Н. Горошкевич, О.В. Хуторной // Растительные ресурсы-1996-Т. 32, Вып. 3 - С. 1-11.

19. Горошкевич С. Н. Внутрипопуляционное разнообразие шишек и семян Pinus sibirica Du Tour. Сообщение 2. Фенотипические корреляции между признаками / С.Н. Горошкевич, О.В. Хуторной // Растительные ресурсы. - 1996- Т. 32, Вып. 3 - С. 12-22.

20. Горошкевич С.Н. Динамика роста и плодоношения кедра сибирского. Уровень и характер изменчивости признаков / С.Н. Горошкевич// Экология.- 2008 - Т. 39, № 3.- С.168-175.

21. Дженсен У. Ботаническая гистохимия / У. Дженсен.- М.: Мир, 1965.-380 с.

22. Земляной А.И. Межклоновая изменчивость кедра сибирского по элементам семенной продуктивности: перспективы отбора / А.И. Земляной, Ю.Н. Ильичев, В.В. Тараканов // Хвойные бореальной зоны. - 2010 - XXVII, № 1 - 2,- С. 77-82.

23. Иванова А.И. Индукция андрогенных культур у лиственницы сибирской / А. Н. Иванова, И. Н. Третьякова, А. С. Вязовецкова // Онтогенез. -2006.-Т. 37, № 1.-С. 1-11.

24. Ирошников А.И. Изменчивость некоторых морфологических признаков и эколого-физиологических свойств кедра сибирского / А.И. Ирошников // Селекция древесных пород в Восточной Сибири - М.: Наука, 1964.-с. 44- 57

25. Ирошников А.И. Орехопродуктивность кедровников / А.И. Ирошников // Кедровые леса Сибири.- Новосибирск: Наука, 1985 - С. 132150.

26. Ирошников А.И. Плодоношение кедра сибирского в Западном Саяне / А.И. Ирошников // Плодоношение кедра сибирского в Восточной Сибири. Труды института леса и древесины СО АН СССР - М.: Наука, 1963— Т. 62.-С. 104- 120

27. Ирошников А.И. Полиморфизм популяции кедра сибирского / А.И. Ирошников // Изменчивость древесных растений Сибири. Красноярск, 1974.-С. 77-103.

28. Ирошников А.И. Биоэкологические свойства и изменчивость кедра сибирского / А.И. Ирошников // Кедровые леса Сибири. -Новосибирск: Наука, 1985.-С.8^Ю.

29. Киргизов Н.Я. Изменчивость шишек и семян кедра сибирского на Рудном Алтае / Н.Я. Киргизов // Лесные экосистемы в условиях континентального климата - Красноярск, 1987 - С. 91- 94.

30. Ковалева Л.В. Факторы роста и развития мужского гаметофита / Л. В. Ковалева, Е.В. Захарова, A.A. Добровольская, Ю.В. Минкина, В.Ю.

Ракитин // Проблемы физиологии растений Севера. - Петрозаводск (ОФР), 2004.-91с.

31. Козубов Г.М. Биология плодоношения хвойных на Севере / Г. М. Козубов. — Л.: Наука, Ленинград, отд- ние, 1974. - 136 с.

32. Козубов Г.М. Об ускоренном и надежном методе определения жизнеспособности пыльцы / Г. М. Козубов // Ботан. журн. - 1966. -Т. 50, № 6.-С. 811-813.

33. Крамер П.Д. Физиология древесных растений / П.Д. Крамер, Т.Т. Козловский. - М.: Лесн. пром-сть, 1983. - 346 с.

34. Красноборов И. М. Высокогорная флора Западного Саяна / И.М. Красноборов. - Новосибирск: Наука, 1976 - 379 с.

35. Кузичкин A.A. Особенности структуры урожая шишек и семян кедра сибирского в связи с проявлением пола / A.A. Кузичкин // Продуктивность таежных биогеоценозов. - Красноярск: Ин-т леса и древесины им. В.Н. Сукачева СО АН СССР, 1986,- 91 с.

36. Кузнецова Г. В. Особенности роста и развития кедровых сосен на лесосеменных объектах Средней Сибири: автореф. дис. канд. биол. наук / Галина Васильевна Кузнецова — Красноярск: Институт леса им В.Н. Сукачева СО РАН, 2001.-25 с.

37. Кузнецова Г. В. Семеношение и качество семян клонов кедра сибирского разного происхождения на плантации в Красноярской лесостепи / Г.В. Кузнецова // Лесоведение. - 2003. - № 6. - С. 42-48.

38. Кулаева О. Н. Восприятие и преобразование гормонального сигнала у растений. / О. Н. Кулаева // Физиология растений. - 1995. - Т. 42. -С. 661-671.

39. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин- М.: Высшая школа, 1990352 с.

40. Ларионова H.A. Ауксины, ингибиторы роста и липиды пыльцы кедра сибирского / Н. А. Ларионова, Е.Г. Минина, И.А. Кирьякова, О.Н.

Толкачев, Т.К. Митрофанова // Физиология растений - 1977 - Т. 24. Вып. 1. -С. 175-179.

41. Ларионова H.A. Гиббереллины, ауксины и фенольные соединения в пыльце сосны обыкновенной и кедра сибирского / Н. А. Ларионова // Экстрактивные вещества древесных растений. Новосибирск: Наука, 1986.- 142 с.

42. Ларионова H.A. Природные регуляторы роста в генеративных органах кедра сибирского / Н. А. Ларионова // Изменчивость древесных растений Сибири. Красноярск: Институт леса и древесины СО АН СССР, 1974.-С. 104-120.

43. Луганский H.A. К вопросу о внутривидовой изменчивости кедра сибирского на Среднем Урале / H.A. Луганский // Труды. Ин.- та биологии УФ АН СССР.- Свердловск, 1961,-Вып. 23. С. 89-96.

44. Мамаев С.А. Формы внутривидовой изменчивости древесных растений / С.А. Мамаев - М.: Наука, 1972 - 284с.

45. Матвеева Р.Н. Биоразнообразие, отбор и размножение кедровых сосен в плантационных культурах зеленой зоны Красноясрка / Р.Н. Матвеева, О.Ф. Буторова, Н.П. Братилова // Хвойные бореальные зоны. - XXIV, № 2-3, 2007 - С. 243-247.

46. Земляной А.И. Методика отбора плюсовых деревьев кедра сибирского по семенной продуктивности / А.И. Земляной, Т.П. Некрасова. -М.: ЦБНТИ Гослесхоз СССР, 1980. - 22 с.

47. Минина Е.Г. Морфогенез и проявление пола у хвойных / Е. Г. Минина, Н. А. Ларионова. - М.: Наука, 1979. - 215с.

48. Минина Е.Г. Геотропизм и пол у хвойных / Е.Г. Минина, И.Н. Третьякова. - Новосибирск: Наука, 1983. - 200 с.

49. Минина Е.Г. Физиологическая характеристика пыльцевого зерна / Е. Г. Минина // Экология семенного размножения хвойных Сибири. Красноярск: Институт леса и древесины СО АН СССР, 1984. - С. 80-87.

50. Минина Е.Г. Физиологические предпосылки гибридизации хвойных / Е.Г. Минина, Ф. Н. Кудашова, Н.А. Ларионова, Г.В. Осетров // Состояние и перспективы развития лесной генетики, селекции, семеноводства и интродукции. - Рига, 1974. - С. 205-208.

51. Молотков П.И. Селекция лесных пород / П.И. Молотков, И.Н. Патлай, Н.И. Давыдова. - М.: Лесн. пром-сть, 1982. - 224 с.

52. Молотковский Г.Х. Механизм полярности процесса оплодотворения при прямом и обратном скрещивании у растений / Г.Х. Молотковский // Цитология и генетика.- 1968 - Т.2, № 2 - С. 127-132.

53. Некрасова Т.П. Биологические основы семеношения кедра сибирского / Т.П. Некрасова. - Новосибирск: Наука, 1972 - 274 с.

54. Некрасова Т.П. Влияние температуры воздуха на формообразование пыльцы хвойных пород / Т.П. Некрасова // Лесоведение. -1976.-№ 6.-С. 37-43.

55. Некрасова Т.П. Мейоз в материнских клетках пыльцы кедра сибирского / Т.П. Некрасова // Изв. СО АН СССР. - 1973. - № 15, Вып. 3.- С. 120-126.

56. Некрасова Т.П. Пыльца и пыльцевой режим хвойных Сибири / Т.П. Некрасова. - Новосибирск: Наука, 1983- 169 с.

57. Николаева М.Г. Биология семян / М.Г. Николаева, И.В. Лянгузова, Л.М. Поздова.- СПб.: Изд-во НИИ химии СПбГУ, 1999.-232 с.

58. Николаева А.Н. Жизнеспособность пыльцы кедра сибирского Западного Саяна / А. Н. Николаева // Лесоведение. 1974 - № 3- С. 59-63.

59. Николаева А.Н. Изменчивость пыльцы кедра сибирского / А.Н. Николаева // Изменчивость древесных растений Сибири - Красноярск, 1974-С. 120-132.

60. Новоселова Н.В. Закономерности эмбриогенеза и формирование семян сосны сибирской (Pinus sibirica Du Tour) in vivo и в культуре in vitro : автореф. дис. канд. биол. наук / Наталья Владимировна Новоселова-Красноярск: Институт леса им В.Н. Сукачева СО РАН, 2003. - 20 с.

61. Новоселова Н.В. Особенности эмбрионального развития сосны кедровой сибирской с однолетним циклом развития женских шишек in vivo и в культуре in vitro / Н.В. Новоселова, С.С. Савельев // Материалы Школы молодых ученых "Эмбриология и биотехнология", СПб, 2005 - С. 48.

62. Осетрова Г.В. Углеводный и аминокислотный состав пыльцы кедра сибирского и сосны обыкновенной / Г.В. Осетрова, Ф.Н. Кудашова // Материалы конференции па физиологии и биохимии растений. - Красноярск: ИЛиД, 1972. -С. 41-46.

63. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений / 3. П. Паушева. -М.: Колос, 1980.-340с.

64. Поддубная-Арнольди B.JI. Цитоэмбриология покрытосеменных растений / В. JI. Поддубная-Арнольди. - М.: Наука, 1976. - 508с.

65. Полевой В.В. Фитогормоны / В.В. Полевой. - JL: Изд-во Ленинградского университета, 1982. - 248 с.

66. Поликарпов Н. П. Климат и горные леса Южной Сибири / Н.П. Поликарпов, Н.М. Чебакова, Д.И. Назимова.- Новосибирск: Наука- 1986226 с.

67. Попов П.П. Изменчивость морфологических признаков деревьев в припоселковом кедровнике / П.П. Попов, С.П. Арефьев, М.И. Танеева // Леса и лесное хозяйство Западной Сибири - М., 1985 - С. 53-62.

68. Правдин Л.Ф. Ближайшие задачи научных исследований и практика по лесной генетике и селекции Сибири / Л.Ф. Правдин // Селекция древесных пород в Восточной Сибири - М.: Наука, 1964 - С. 5-19.

69. Правдин Л.Ф. Итоги работ по изучению плодоношения кедра сибирского / Л.Ф. Правдин // Труды института леса и древесины СО АН СССР.-Красноярск, 1963.-Т. 62.-С. 174-189.

70. Правдин Л.Ф. Селекция и семеноводство кедра сибирского / Л.Ф. Правдин // Плодоношение кедра сибирского в Восточной Сибири. - М.: АН СССР, 1963.-С. 5-21.

71. Размологов В.П. Гистохимическая характеристика

физиологической эволюции пыльцы Gymnospermae / В. П. Размологов, Н.В. Цингер // Биохимия и филогения растений. - М.: Наука, 1972. - С. 198-212.

72. Размологов В.П. О методике проращивания и некоторых морфологических свойствах пыльцы голосеменных растений / В. П. Размологов // Бюлл. ГБС. - 1964. - вып. 54. - С. 63-69.

73. Райт, Дж. В. Введение в лесную генетику /Дж. В. Райт. -М.: Лесн. пром-сть, 1978-470с.

74. Роберте Е.Х. Влияние условий хранения семян на их жизнеспособность / Е.Х. Роберте // Жизнеспособность семян- М.: Колос, 1978,-С. 22-62.

75. Сабинин Д.А. Влияние минерального питания на качество урожая яровой пшеницы / Д.А. Сабинин // Избранные труды по минеральному питанию растений.- М., 1971- С. 483- 494.

76. Савельев С.С. Индукция эмбриогенного каллуса у гибридов сосны сибирской / С.С. Савельев // Материалы II Международной Школы молодых ученых «Эмбриология, генетика и биотехнология», 3-7 декабря, Уфа, 2007-С. 103-104.

77. Савельев С.С. Инициация соматического эмбриогенеза у Pinus sibirica / С.С. Савельев // Материалы конференции молодых ученых «Исследования компонентов лесных экосистем», выпуск 7, ИЛ СО РАН, Красноярск, 2006 - С.72-74.

78. Савельев С.С. Качество пыльцы кедра сибирского (Pinus sibirica (Pinaceae) на клоновой прививочной плантации в Западно-Саянском опытном лесном хозяйстве / С.С. Савельев, И.Н. Третьякова, Е.В. Ворошилова, Ю.А. Череповский // Хвойные бореальные зоны - XXV, № 3- 4, 2008 - С.295-299.

79. Савельев С.С. Особенности формирования соматических зародышей гибридных семян сосны кедровой сибирской в культуре in vitro / С.С. Савельев, A.B. Лукина, И.Н. Третьякова // Материалы Четвертого съезда

общества биотехнологов России им. Ю.А Овчинникова, Пущино 6-7 декабря, 2006 — С.222-223.

80. Савельев С.С. Получение соматических зародышей Pinus sibirica в культуре in vitro / С.С. Савельев, A.B. Лукина, И.Н. Третьякова // Материалы I (IX) Международной Конференция молодых ботаников, СПб, 2006.-С. 194.

81. Савельев С.С. Репродуктивный потенциал сосны сибирской на клоновой плантации и в естественном древостое in vivo и в культуре in vitro / С.С. Савельев, A.B. Лукина, М.В. Ижболдина // Материалы конференции молодых ученых «Исследования компонентов лесных экосистем», выпуск 8, ИЛ СО РАН, 2007. - С.73-75.

82. Савельев С.С. Характеристика пыльцы кедра сибирского (Pinus sibirica (Pinaceae) на клоновой прививочной плантации в Западно-Саянском опытном лесном хозяйстве / С.С. Савельев, Е.В. Ворошилова // Материалы III Международной школы молодых ученых «Эмбриология, генетика и биотехнология», 29 июня- 3 июля, Саратов, 2009. - С.88-91.

83. Савельев С.С. Характеристика пыльцы кедра сибирского (Pinus sibirica (Pinaceae) на клоновой прививочной плантации в Западно-Саянском опытном лесном хозяйстве / С.С. Савельев, Е.В. Ворошилова // Материалы конференции молодых ученых «Исследования компонентов лесных экосистем Сибири», выпуск 10, ИЛ СО РАН, 2009. - С.49-52.

84. Савельев С.С. Особенности половой репродукции клоновой прививочной плантации кедра сибирского в Западно-Саянском ОЛХ / С.С. Савельев, И.Н. Третьякова // Вестник КрасГАУ.- № 8, 2011. - С. 109-111.

85. Самсонова А.Е. Биохимическая характеристика пыльцы некоторых видов орехоплодных сосен / А. Е. Самсонова, Е. В. Титов // Генетика, селекция, семеноводство и интродукция лесных пород. - Воронеж: ЦНИЛГиС, Гос. ком. лес, 1978. - С. 91-96.

86. Сидорский А.Г. Современное представление о вероятных эволюционных причинах появления раздельнополых форм у

покрытосеменных растений / А. Г. Сидорский // Успехи соврем, биологии. 1979,- Т. 38, вып. 3, № 6. - С. 445-456.

87. Скриначенко В. В. Выращивание in vitro тканей проростков трех видов сосны / В. В. Скрипаченко //Физиология растений - 1982, Т. 29, № 1С. 205-211.

88. Сунцов А.В. Микроспорогенез и качество пыльцы у сосны обыкновенной в Центральной Туве / А. В. Сунцов // Плодоношение лесных пород Сибири. - Новосибирск: Наука, 1982. - С. 60-69.

89. Таланцев Н.К. Кедровые леса / Н.К. Таланцев, А.Н. Пряжников, Н.П. Мишуков.- М.: Лесная промышленность, 1978 - 176 с.

90. Тахтаджян А.Л. Высшие растения. Том четвертый. Мхи, плауны, хвощи, папоротники, голосемянные растения / А.Л. Тахтаджян // М.: Просвещение, 1978-447 с.

91. Терехин Э.С. Закономерности эволюционных преобразований эмбриональных и репродуктивных структур паразитных Angiospermae: автореф. дис. д-ра биол. наук. - Л., 1973- 42 с.

92. Титов Е.В. Гибридизация кедра сибирского: учеб. пособие / Е.В. Титов. - Воронеж: Воронеж, гос. лесотехн. акад., 2006 - 127 с.

93. Титов Е.В. Клоновое испытание кедровых сосен / Е.В. Титов // Лесное хозяйство - 1995 - № 6. - С. 25-26.

94. Титов Е.В. Межвидовая гибридизация кедровых сосен / Е.В. Титов // Гибридизация лесных древесных пород. - Воронеж, 1988. - С. 76-84.

95. Титов Е.В. Селекция кедровых сосен : учеб. пособие/ Е.В. Титов. - Воронеж; ВГЛТА, 1999. - 58 с.

96. Титов Е.В. Селекция сосны кедровой сибирской на семенную продуктивность: автореф. дис. докт. е.- х. наук. / Евгений Владимирович Титов-Брянск, 1995.-43 с.

97. Титов Е. В. Морфобиометрические и электрофизиологические особенности быстрорастущих гибридов сосны кедровой сибирской / Е.В.

Титов, Р.Г. Шевериожук // Интеграция фундаментальной науки и высшего лесотехнического образования. - Воронеж: ВГЛТА, 2000, Т. 1- С. 329-332.

98. Титов Е.В. Возможность гетерозиса при скрещивании деревьев кедра сибирского различного полового типа / Е.В. Титов // Лесоведение.-1988.-№4.- С. 89-94.

99. Титов Е.В. Методы получения репродуктивного гетерозиса у кедровых сосен / Е.В. Титов // Лесоведение - 1980 - № 1. - С. 80-86.

100. Титов Е.В. Опыт скрещивания кедра сибирского с другими соснами в условиях Северо-Восточного Алтая / Е.В. Титов //Лесоведение. -1977. -№ 4.- С. 81-87.

101. Титов Е.В. Плантационное лесовыращивание кедровых сосен: учеб. пособие / Е.В. Титов. - Воронеж: ВГЛТА, 2004. -165 с.

102. Титов Е.В. Реализация селекционой программы кедра сибирского на семенную продуктивность Горном Алтае / Е.В. Титов // Хвойные бореальной зоны. - 2010 - XXVII, № 1 - 2.- С. 194-198.

103. Тренин В.В. Введение в цитоэмбриологию хвойных /В.В. Тренин- Петрозаводск- Карельский филиал АН СССР, Институт леса, 1988.- 152 с.

104. Третьякова И.Н. Биотехнология микроклонального размножения сибирских видов хвойных в культуре in vitro / И.Н. Третьякова, A.C. Белоруссова, A.B. Лукина, С.С. Савельев // Материалы докладов международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем», Т. 3, 2007, Сыктывкар - С. 212-214.

105. Третьякова И.Н. Биотехнология получения эмбрионально-суспензорной массы и соматических зародышей лиственницы сибирской (Larix sibirica) и сосны сибирской (Pinus sibirica) в культуре in vitro / И.Н. Третьякова, A.C. Белоруссова, С.С. Савельев, A.B. Лукина, М.В. Ижболдина // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова, Т. 2, № 4, 2006 - С. 58-59.

106. Третьякова И.Н. Регуляция морфогенеза клеток при образовании соматических зародышей у сибирских видов хвойных / И.Н. Третьякова, A.C. Иваницкая, Н.Е. Носкова, С.С. Савельев, A.B. Барсукова, М.В. Ижболдина // Сборник научных трудов III Международной научной конференции «Теоретические и прикладные аспекты биохимии и биотехнологии растений», 14-16 мая 2008, Минск, 2008 - С. 328-332.

107. Третьякова И.Н. Сочетание классической селекции и применения современных методов биотехнологии для сохранения генофонда хвойных видов Сибири / И.Н. Третьякова, A.B. Барсукова, С.С. Савельев, A.C. Сиренко // Актуальные проблемы прикладной генетики, селекции и биотехнологии растений, сборник научных трудов, Т. 131, Ялта, 2009. - С.5-9.

108. Третьякова И.Н. Сочетание классической селекции и применения современных методов биотехнологии для сохранения генофонда хвойных видов Сибири / И.Н. Третьякова, A.B. Барсукова, С.С. Савельев // Материалы международной научной конференции, посвященной 200- летию Ч. Дарвина и 200-летию Никитского ботанического сада «Актуальные проблемы прикладной генетики, селекции и биотехнологии растений», 3-6 ноября, Ялта, 2009.-С. 165.

109. Третьякова И.Н., Новоселова Н.В. Особенности развития мегагаметофитов и зародышей сосны кедровой сибирской в культуре in vitro / И.Н. Третьякова, Н.В Новоселова // Онтогенез - Т. 34, № 4 - 2003.- С. 282291.

110. Третьякова И.Н. Биотехнология получения эмбрионально-суспензорной массы и соматических зародышей лиственницы сибирской и сосны сибирской в культуре in vitro / И.Н. Третьякова, A.C. Белоруссова, С.С. Савельев, A.B. Лукина, М.В. Ижболдина // Материалы Четвертого съезда общества биотехнологов России им. Ю.А Овчинникова, Пущино 6-7 декабря, 2006. - С.264-266.

111. Третьякова И.Н. Особенности формирования эмбриональных клеток и соматических зародышей лиственницы сибирской и сосны сибирской в культуре in vitro / И.Н. Третьякова, A.C. Белоруссова, С.С. Савельев, Н.В. Новоселова, A.B. Лукина // Материалы Четвертой Российской конференции «Флора и растительность Сибири и Дальнего Востока», Т. 2, Красноярск, 2006. - С. 259-263.

112. Третьякова, И.Н. Особенности эмбрионального развития у кедра сибирского {Pinus sibirica Du Tour) с однолетним циклом развития женской шишки в горах Западного Саяна / И. Н. Третьякова, Н.В. Новоселова, Ю.А. Череповский // Физиология растений.- Т. 51, № 1, 2003- С. 134-141.

113. Третьякова, И.Н. Перспективы плантационного лесовыращивания хвойных при помощи современных методов селекции и биотехнологии (соматического эмбриогенеза)/ И.Н. Третьякова, A.C. Иваницкая, A.B. Барсукова, С.С. Савельев, A.C. Сиренко // Материалы Всероссийской конференции с участием иностранных ученых «Эколого-географические аспекты лесообразовательного процесса», 23- 25 сентября, Красноярск, 2009. - С. 219-222.

114. Третьякова И.Н. Перспективы применения методов биотехнологии для размножения генетически ценных форм лесных древесных видов хвойных/ И.Н. Третьякова, A.C. Белоруссова, Н.Е. Носкова, С.С. Савельев, Н.В. Лукина, A.B. Барсукова, М.В. Ижболдина, Ю.А. Череповский // Хвойные бореальные зоны.- XXIV, № 2- 3, 2007. - С.309-317.

115. Третьякова И.Н. Соматический эмбриогенез у сибирских видов хвойных в культуре in vitro / И.Н. Третьякова, A.C. Белоруссова, Н.Е. Носкова, С.С. Савельев, A.B. Лукина // Материалы конференции «Досягнення i проблеми генетики, селекци та бютехнологи», посвященная 120-летию со дня рождения академика HAH Украины Н.И. Вавилова, Кшв, Логос, 2007 - С. 580-584.

116. Третьякова И.Н. Цитоэмбриологическое исследование эмбрионально-суспензорной массы и соматических зародышей у сибирских

видов хвойных в культуре in vitro / И.Н. Третьякова, A.C. Белоруссова, С.С. Савельев, A.B. Лукина // Сборник научно-популярных статей «Современные микроскопические исследования в биологии и медицине», М.: Лабора, 2006. -С. 31-33.

117. Третьякова И.Н. Половая репродукция кедра сибирского при контролируемом опылении и его регенерационный потенциал в культуре in vitro / И.Н. Третьякова, С.С. Савельев, A.B. Лукина, Ю.А. Череповский // Материалы третьего международного совещания, посвященного международному году лесов, «Сохранение лесных генетических ресурсов Сибири», 23-29 августа, Красноярск, 2011. - С. 138-139.

118. Третьякова И.Н. Эмбриология хвойных (Физиологические аспекты) / И.Н. Третьякова-Новосибирск: Наука, 1990 - 157 с.

119. Хагман М. Барьеры при межвидовой гибридизации в роде Pinus / М. Хагман // Доклады международного симпозиума по селекции, генетике и лесному семеноводству хвойных пород. — Пушкино, 1972-С. 13.

120. Хазова И. И. Цитоэмбриологические барьеры невесомости при межвидовой гибридизации сосен / И.И. Хазова // Гибридизация лесных древесных пород: сб. науч. тр. - Воронеж ЦНИИЛ-ГиС, 1988 - С. 93-101.

121. Хазова И.И. Отбор опылителей в природных популяциях и на клоновых плантациях сосны по качеству пыльцы / И. И. Хазова, B.C. Свинцова, Н.М. Ковешникова // Состояние и перспективы лесной генетики, селекции и семеноводства. Рига: Госком лесного хоз- ва Совета Министров СССР, 1974.-С. 256-262.

122. Щерба И.П. Анализ семеношения кедра сибирского различного происхождения на гибридно-семенной плантации / И.П. Щерба, A.B. Водин, A.A. Коротков // Плодоводство, семеноводство, интродукция древесных растений - Красноярск, 1998. С. 26- 29.

123. Щерба Н.П. Экологические плантационные культуры сосны кедровой в условиях интродукции / Н.П. Щерба, A.B. Калинин //

Плодоводство, семеноводство, интродукция древесных растений. -Красноярск, 1999,-С. 68-69.

124. Яковлев А.В. О влиянии низких температур на микроспорогенез сосны обыкновенной / А. В. Яковлев // Лесоведение, 1978, № 6. - С. 51-55.

125. Aderkas P., Bonga J.M., Klimaszewska К., Owens J. Comparison of larch embryogeny in vivo and in vitro / P. Aderkas, J.M. Bonga, K. Klimaszewska, J. Owens 11 Woody Plants Biotechnology. Series A: Life Science. V. 210, 1991-P. 139- 155.

126. Attree S. M. Development of white spruce (Picea glauca (Moench) Voss) somatic embryos during culture with abscise acid and osmotic, and there tolerance to drying and frozen storage / S. M. Attree, M. K. Pomeroy, L. C. Fowke // J. Exp. - 1995. - Bot. 46- P. 433 - 439.

127. Attree S. M. Micropropagation through somatic embryogenesis in conifers / S. M. Attree, L. C. Fowke // Bajaj YPS (ed) Biotechnology in agriculture and forestery. vol. 17: High-tech and micropropagation I. Springer. Verlag Berlin Heidelberg New York. - 1991. - P. 53 - 70.

128. Attree S. M. Somatic embryogenesis and plantlet regeneration from cultured shoots and cotyledons of seedlings from stored seeds of black and white spruce (Picea mariana and Picea glauca) / S. M. Attree, S. Budimir, L. C. Fowke // Can. J. Bot. - 1990. - V. 68. - P. 30-34.

129. Barrett J. D. The effectiveness of various nitrogen sources in white spruce (Picea glauca (Moench) Voss) somatic embryogenesis / J. D. Barrett, Y. S. Park, J. M. Bonga // Plant Cell Rep. - 1997. - V. 16. - P. 411-415.

130. Benito M. In situ seed production after pollination with in vitro -matured isolated pollen / M. Benito, R.N. Macke, A. Alwen, E. Heberle- Bors // Planta. - 1988. - V. 176, № 2. - P. 145-148.

131. Bonga J. M. The effect of collection date and frozen storage on the formation of embryo- like structures and elongating shoots from explants from mature Larix deciduas and L. eurolepis / J. M. Bonga // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. - 1997. - P. 195 - 200.

132. Bozhkov P. V. Influence of nitrogen balance of culture medium on Norway spruce (Picea abies (L.) Karst.) somatic polyembryogenesis: High frequency establishment of embryonal-suspensor mass lines from mature zygotic embryos / P.V. Bozhkov, S.B. Mikhlina, G.A. Shiryaeva, L.A. Lebedenko // J. Plant Physiol. - 1993. - P. 735 - 741.

133. Cheliak W. M. Genetic variation in somatic embryogenic response in open-pollinated families of black spruce / W. M. Cheliak, K. Klimazsewska // Theor. Appl. Genet. - 1991. - V. 82. - P. 185-190.

134. Ching T.M. Rapid viability tests and aging study of some coniferous pollen / T.M. Ching, K.K. Ching // Gan. J. Forest. - 1976. - V.6. - P. 516-522.

135. Chira E. Reasons for species non-hybridisation in genus Pinus / E. Chira, F. Berta // Biologin. - 1965. - V. 20, № 8. - P. 600-609.

136. Critchfield W.B. Crossafility and relationships of the closed-cone pines / W.B. Critchfield // Silvae Genetica.- 1967. - Vol. 16, № 3. - P. 68- 74.

137. Durzan D. J. Monozygotic cleavage polyembryogenesis and conifer tree improvement / D. J. Durzan // Cytology and Genetics - 2008 - Vol. 42, No. 3.-P. 159-173.

138. Durzan D. J. Somatic embryogenesis and polyembryogenesis in Douglas-fir cell suspension cultures / D. J. Durzan, P. K. Gupta // Plant Science. -1987.-V. 52.-P. 229-235.

139. Ekberg J. Meiosis in pollen mother cells of Pinus contorta / J. Ekberg, G. Eriksson, A. Jonson I I Hereditus . - 1972. - V.71, № 2. - P. 313- 324.

140. Feirer R. P. The biochemistry of conifer embryo development: amino acids, polyamines and storage proteins / R. P. Feirer // Somatic Embryogenesis in Woody Plants. Kluwer Academic Publishers, protein accumulation Dordrecht. The Netherlands. - 1995. - V. 1. - P. 317-336.

141. Gupta P. K. Conifer embryo production from liquid medium / P. K. Gupta, R. Timmis // Plant Biotechnology and in vitro Biology in the 21st Century. Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, The Netherlands. - 1999. - P. 49-52.

142. Hakman I. The development of somatic embryos in tissue cultures initiated from immature embryos of Picea abies (Norway spruce) /1. Hakman, L. C. Fowke, S. Von Arnold, T. Eriksson // Plant Sci. - 1987. - V. 38. - P. 53-59.

143. Hay E. I. Somatic embryo germination and desiccation tolerance in conifers / E. I. Hay, P. J. Charest // Somatic Embryogenesis in Woody Plants. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, the Netherlands. - 1999. - V. 4. - P. 6169.

144. Heslop-Harisson J. Sexuality of angiosperm / J. Heslop-Harisson // Plant physiol. / Ed. Sterward P.C.N.Y.; London: Acad. Press. 1972. - P. 134-289.

145. Ireland R.J. The enzymes of glutamine, glutamate and aspartate metabolism / R.J. Ireland, P.J. Lea // Plant amino acid. Biochemistry and biotechnology. - 1999. - P. 365-397.

146. Jain S. M. Somatic embryogenesis in slash pine (Pinus elliottii) from immature embryos cultured in vitro / S.M. Jain, N. Dong, RJ. Newton // Plant Sci. - 1989.-V. 65.-P. 233-241.

147. Khlifi S. Maturation of black spruce somatic embryos. Part I. Effect of L-glutamine on the number and germinability of somatic embryos / S. Khlifi, F.M. Tremblay // Plant Cell Tiss. Org. Cult. - 1995. - V. 41. - P. 23-32.

148. Klimaszewska K. Conifer somatic embryogenesis: I. Development / K. Klimaszewska, D.R. Cyr // Dendrobiology. - 2002. - V. 48. - P. 31-39.

149. Klimaszewska K. Conifer somatic embryogenesis: II. Application / K. Klimaszewska, D.R. Cyr // Dendrobiology. - 2002. - V. 48. - P. 39-50.

150. Kopcewicz J. The dynamics of growth substances during the development of the pine inflorescences. Male inflorescences / J. Kopcewicz // Roczn. Nauk rol. A.-1969.-V. 95, № l.-P. 105-112.

151. Lelu M.-A. Effect of maturation duration on desiccation tolerance in hybrid larch (Larix x leptoeuropaea Dengler) somatic embryos / M.- A. Lelu, K. Klimaszewska, G. Pflaum, C. Bastien // In Vitro Cell. Dev. Boil. - 1995. - V. 31. -P. 15-20.

152. Lelu M.-A. Somatic embryogenesis from immature and mature zygotic embryos and from cotyledons and needles of somatic plantlets of Larix / M.- A. Lelu, K. Klimaszewska, P. J. Charest // Can. J. For. Res. - 1994. - V. 24. № 1. - P. 100-106.

153. Li X. Y. Polyethylene glycol and maltose enhance somatic embryo maturation in loblolly pine (Pinus taeda L.) / X. Y. Li, F. H. Huang, J. B. Murphy, Jr. E. E. Gbur // In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant - 1999. - V. 34. - P. 22 - 26.

154. Litvay J.D. Influence of loblolly pine {Pinus taeda L.) culture medium and its components on growth and somatic embryogeneis of the wild carrot {Daucus carota L.) / J.D. Litvay, D.C. Verma, M.A. Johnson // Plant Cell. - 1985. -Rep. 4.-P. 325-328.

155. Malabadi R. B. Somatic embryogenesis from vegetative shoot apices of mature trees of Pinus patula / R. B. Malabadi, J. Van Staden // Tree Physiology. -2005.-V. 25.-P. 11-16.

156. Mehra P.D. Embryology of Pinaceae I. Proembryology / P.D. Mehra, P.D. Dogra // Proc. Indian. Nat. Sci. Acad.- V. 41, № 5.- 1976.- P. 486^197.

157. Michalski L. Growth regulators in the pollen of pine {Pinus sylvestris L.) / L. Michalski // Acta. Soc. Bot. Pol. - 1967. - V. 36, № 3. - P. 475-481.

158. Misra S. Developmental gene expression in conifer embryogenesis and germination. II. Crystalloid protein synthesis in the developing embryo and megagametophyte of white spruce {Picea glauca (Moench) Voss) / S. Misra, M. J. Green // Plant Sci. - 1991. - V. 78. - P. 61-71.

159. Mo L.H. Origin and development of embryogenic cultures from seedlings of Norway spruce {Picea abies) / L.H. Mo, S. Von Arnold // Journal of Plant Physiology -1991.- V. 138.- P. 223 - 230.

160. Murashige T. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures / T. Murashige, F. Skoog // Physiol. Plant. - 1962. - V. 15. -№4.-p. 473-497.

161. Norgaard J. V. Somatic embryo maturation and plant regeneration in Abies nordmanniana / J. V. Norgaard // Lk. Plant Sci. - 1997. - P. 211 - 221.

162. Nygaard P. Studies in germination of pine pollen in vitro. Growth condition and effects pH and temperature on germination, tube growth and respiration / P. Nygaard // Physiol, plant. - 1969. - V. 22, № 3. - P. 338-346.

163. Park Y.S. Conifer micropropagation its function in tree improvement programs /Y.S. Park, J.M. Bonga // Micropropagation of Woody Plants. Ahuja M.R. (ed.). Kluwer Academic, Dordrecht. - 1992. - P. 457^70.

164. Price R.A. Phylogeny and systematic of Pinus / R.A. Price, A. Liston, S.H. Strauss // Richardson, D.M. (ed.), Ecology and Biogeography of Pinus. -Cambridge University Press, 1998. - P.49-68.

165. Roberts D. R. Abscisic acid and indole-3-butyric acid regulation of maturation and accumulation of storage proteins in somatic embryos of interior spruce / D. R. Roberts, B. S. Flinn, D. T. Webb, F. B. Webster, B.C.S. Sutton // Physiol. Plant. - 1990. - P. 355 - 360.

166. Rodriguezuez, M. P. Expression patterns of two glutamine synthetase genes in zygotic and somatic pine embryos support specific roles in nitrogen metabolism during embryogenesis / M. P. Rodriguezuez // New Phytologist. -2006.-P. 35^4.

167. Ruaud J.-N. Maturation and conversion into plantlets of somatic embryos derived from needles and cotyledons of 7- 56- day- old Picea abies / J.-N. Ruaud // Plant science. - 1993. - V. 92. P. 213-220.

168. Saito M. Germinations test of Abies veitchii pollen / M. Saito, M. Itoo // J. of Japanese Forestry Society. - 1983. - V. 65, № 9. - P. 339-341.

169. Salajova T. Somatic embryogenesis and plantlet regeneration from cotyledon explants isolated from amblings and seedlings of hybrid firs / T. Salajova, J. Salaj // Journal of Plant Physiology. - 2001. - P. 747 - 755.

170. Simola L. K. Improvement of nutrient medium for growth and embryogenesis of megagametophyte and embryo callus lines of Picea abies / L. K. Simola, A. Santanen // Physiol. Plant. - 1990. - V. 80. - P. 27-35.

171. Singh H., Johri B.M. Development of gymnosperms seeds / H. Singh,

B.M. Johri // Seed biology Ed T.T. Kozlowski. Academic Press.- V. 1, 1972.- P. 21-75.

172. Singh H. Embryology of gymnosperms. / H. Singh // Gebrüder. Berlin. Stuttgart, 1978. - 302 p.

173. Smertenko A.P. Re-organization of the cytoskeleton during developmental programmed cell death in Picea abies embryos / A. P. Smertenko, P. V. Bozhkov, L. H. Filonova, S. Von Arnold, P. Hussey // Plant J. - 2003. - V. 33.-P. 813-824.

174. Stanley R.G. Pollen. Biology Biochemistry management. / R.G. Stanley, H.F. Linskens // Berlin; Heidelberg; New York: Springer - Verlag, 1974. -307 p.

175. Stasolla C. Maturation of somatic embryos in conifers: morphogenesis, physiology, biochemistry and molecular biology / C. Stasolla, L. Kong, E. C. Yeung, T. A. Thorpe // In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant. - 2002. - V. 38.-P. 93-105.

176. Tanaka K. The pollen germination and pollen tube development in Pinus densiflora Sieb., et Zuce III. The growth inhibiting substances in the either extract from Pinus pollen grains. / K. Tanaka // Sei. Repts tokoku Univ.- 1958 - V. 24, № l.-P. 45-54.

177. Tautorus T. E. Somatic embryogenesis in conifers / T. E. Tautorus, L.

C. Fowke, D. I. Dunstan // Can. J. Bot. - 1991. - V. 69. - P. 1873-1899.

178. Tremblay L. Effects of gelling agents, ammonium nitrate, and light on the development of Picea mariana (Mill.) B.S.P. (black spruce) and Picea rubens Sarg, (red spruce) somatic embryos / L. Tremblay, F.M. Tremblay // Plant Sei. -1991.-V. 77.-P. 233-242.

179. Von Arnold S. Developmental pathways of somatic embryogenesis / S. Von Arnold, I. Sabala, Bozhkov P. // Plant Cell, Tissue Organ Cult. - 2002. - V. 69.-P. 233-249.