Индукция соматического эмбриогенеза в культуре in vitro у гибридных семян Pinus sibirica Du Tour тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.05, кандидат наук Ворошилова, Елена Владимировна

• Ворошилова, Елена Владимировна
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Ворошилова, Елена Владимировна

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение

Глава 1. Соматический эмбриогенез хвойных в культуру in vitro

1.1. Зиготический эмбриогенез хвойных видов

1.2. История развития методов микроклонального размножения растений в XX-

XXI вв

Соматический эмбриогенез в культуре in vitro

1.2.1. Получение соматического эмбриогенеза у представителей рода Pinus

Индукция соматического эмбриогенеза

Созревание соматических эмбрионов

Прорастание соматических эмбрионов

1.2.2. Получение гаплоидных культур хвойных

1.2.3. Генетическая регуляция соматического эмбриогенеза

1.3. Гормональная регуляция в культуре in vitro

1.3.1. Гормональная регуляция зиготического эмбриогенеза, роль фитогормонов при прорастании семян

1.3.2. Фитогормоны в культуре ткани

Чувствительность тканей эксплантов как фактор, регулирующий соматический

эмбриогенез

Гормональная регуляция соматического эмбриогенеза хвойных видов

1.4. Половая репродукция кедра сибирского

1.4.1. Внутривидовая гибридизации кедра сибирского

1.4.2. Роль фитогормонов в определении пола у растений

Определение пола у хвойных видов

1.4.3. Фитогормоны и морфология шишек хвойных видов

1.4.4. Особенности половой репродукции особей кедра сибирского с

однолетним циклом развития женской шишки

Глава 2. Характеристика объектов исследования, материалы и методы

2.1. Общая характеристика кедра сибирского

2.2. Объект исследования

2.3. Растительный материал и методы исследования

2.3.1. Контролируемое опыление кедра сибирского

2.3.2. Стерилизация помещений и лабораторной посуды. Обработка растительного материала

2.3.3. Получение каллусных культур кедра сибирского

Индукция каллусообразования и соматического эмбриогенеза

Пролиферация каллусной массы

Предсозревание соматических зародышей

Созревание соматических зародышей

2

2.3.4. Цитологический анализ и статистическая обработка данных

2.4. Определение эндогенного содержания фитогормонов

2.4.1. Твердофазный иммуноферментный анализ

Экстракция, очистка и концентрирование гормонов

Проведение твердофазного иммуноферментного анализа

2.4.2.0пределение концентрации ИУК методом газожидкостной хроматографии

Фиксация образцов и экстракция гормонов

Проведение газожидкостной хроматографии

ГЛАВА 3. Соматический эмриогенез из гибридных семян, полученных в результате контролируемого и свободного опыления

3.1. Структура урожая женских шишек кедра сибирского на клоновой прививочной плантации в 2010-2013 гг

3.2. Качество семян кедра сибирского, полученных в результате контролируемого и свободного опыления (2011-2012 гг.)

3.3. Каллусогенез и индукция соматического эмбриогенеза из зиготических

зародышей семян кедра сибирского

Каллусогенез из зиготических зародышей семян свободноопыленных клонов

(2010 г.)

Каллусогенез и индукция соматического эмбриогенеза из зародышей

гибридных семян кедра сибирского в 2011 г

Пролиферация эмбрионально-суспензорной массы

Инициация соматического эмбриогенеза из зародышей гибридных семян кедра

сибирского в 2013 г

Цитологический анализ соматического эмбриогенеза из зародышей гибридных семян

3.4. Гормональный баланс в семенах и каллусных культурах кедра сибирского

Глава 4. Соматический эмбриогенез из мегагаметофитов кедра сибирского

на стадии оплодотворения

Индукция соматического эмбриогенеза из мегагаметофитов кедра сибирского

на стадии глобулярного зародыша

Пролиферация эмбрионально-суспензорной массы

Предсозревание и созревание соматических зародышей

Индукция соматического эмбриогенеза из мегагаметофитов кедра сибирского

на стадии инициации семядолей

Цитологический анализ каллусных культур мегагаметофитов кедра сибирского

Глава 5. Изучение гибридных семян кедра сибирского в условиях теплицы

Заключение

Выводы

Список литературы

Приложения

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Индукция соматического эмбриогенеза в культуре in vitro у гибридных семян Pinus sibirica Du Tour»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы диссертации. У кедра сибирского {Pinus sibirica Du Tour), произрастающего в горах Южной Сибири, систематически встречаются уникальные особи с акселерацией генеративного процесса (Ирошников, 1974; Минина, Ларионова, 1979; Третьякова, 1990). У данных особей развитие женских шишек и семян происходит в год опыления за 2,5-Змес. (вместо 1 года), однако семена формируются с развитым эндоспермом, но без зародыша. Внешне данный феномен проявлялся в локализации женских шишек на кончиках побегов, где обычно располагается озимь (Ирошников, 1974).

По данным физиолого-биохимических исследований женские шишки уникальных особей кедра сибирского характеризуются активным метаболизмом, высоким содержанием ауксинов и гиббереллинов, а также накапливают свободные аминокислоты и низкомолекулярные углеводы (Минина, Ларионова, 1979).

Для изучения репродуктивного процесса кедра сибирского и сохранения его уникальных форм наиболее перспективным направлением является проведение экспериментов по контролируемому опылению и получение хозяйственно-ценных гибридов, которые можно размножать ex situ и традиционными методами биотехнологии в культуре in vitro через соматический эмбриогенез.

В основе метода соматического эмбриогенеза лежит явление

тотипотентности - способности растительной клетки в условиях культуры in

vitro реализовывать имеющуюся у нее генетическую информацию и давать

начало целому организму (Бутенко, 1964). Этот эффективный метод

регенерации растений является модельной системой для изучения реализации

морфогенетических программ, физиологических (гормональная регуляция) и

молекулярно-генетических (изучение состояние генома) исследований в раннем

онтогенезе, а также имеет прикладное значение в современных генетико-

селекционных исследованиях, направленных на массовое тиражирование

5

улучшенных форм хвойных. С момента открытия соматического эмбриогенеза у хвойных (Hakman et al., 1985), были получены соматические эмбрионы и сеянцы для 28 представителей рода Pinus, а также успешно ведется плантационное лесовыращивание.

Первые результаты по индукции соматического эмбриогенеза из незрелых зиготических зародышей у кедра сибирского были опубликованы в 2009г (Третьякова, Ижболдина, 2009). Однако инициация каллуса происходила только у единичных эксплантов, и образование соматических зародышей в полученных каллусных культурах носило случайный характер.

Цели и задачи исследования. Цель исследования — индукция процесса соматического эмбриогенеза в культуре in vitro у гибридных семян кедра сибирского, полученных в результате контролируемого опыления, в том числе пыльцой кедров-акселератов, и испытание потомства в условиях ex situ.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

- проведение контролируемого опыления и отбор клонов кедра сибирского, экспланты которых обладают эмбриогенным потенциалом в культуре in vitro;

- инициация процесса соматического эмбриогенеза из зиготических зародышей и мегагаметофитов;

- цитологический анализ полученных каллусных культур;

- анализ гормонального баланса семян и каллусных культур кедра сибирского;

- исследование гибридного потомства клонов кедра сибирского в условиях теплицы.

Научная новизна исследования заключается в том, что впервые из

эксплантов гибридных семян кедра сибирского, полученных в результате

опыления пыльцой кедров-акселератов, были индуцированы эмбриогенный

каллус и процесс соматического эмбриогенеза. Показана перспективность

использования мегагаметофитов в качестве эксплантов для получения

эмбриогенных культур. Впервые изучено содержание эндогенных

6

фитогормонов в каллусах и семенах (зародыше и эндосперме) кедра сибирского.

Теоретическая и практическая ценность полученных результатов.

Разработанная методика индукции соматического эмбриогенеза кедра сибирского будет служить основой для создания биотехнологии получения регенерантов данного вида. Проведенные исследования по культивированию мегагаметофитов позволят подойти к проблеме размножения уникальных особей с однолетним циклом развития женских шишек. Полученные результаты лягут в основу создания орехоплодных плантаций кедра сибирского.

Защищаемые положения:

1. Реализация соматического эмбриогенеза у кедра сибирского связана с генотипом дерева-донора, а также стадией развития экспланта, используемого для ввода в культуру in vitro.

2. Уникальные генотипы кедра сибирского могут быть размножены с помощью культуры мегагаметофитов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на VII съезде общества физиологов растений России (Нижний Новгород, 2011); 2th International Conference of IUFRO «Integrating vegetative propagation, biotechnologies and genetic improvement for tree production and sustainable forest management» (Брно, Чешская республика, 2012); IV Международной школе молодых ученых «Эмбриология, генетика и биотехнология» (Пермь, 2012); Конференции молодых ученых Института леса СО РАН (Красноярск, 2013), X Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Казань 2013).

Публикации. Основное содержание диссертации представлено в 15 печатных работах, из них 3 в реферируемых журналах.

Содержание и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов, списка литературы и 6 приложений.

Работа изложена на 138 страницах, содержит 10 таблиц, 49 рисунков.

7

Библиографический список включает 192 наименования, из которых 150 иностранные источники.

Личный вклад соискателя. Представленные в диссертации экспериментальные данные, за исключением результатов по иммуноферментному анализу гормонального баланса семян кедра сибирского, получены непосредственно соискателем.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность научным руководителям д.б.н., проф. Третьяковой Ираиде Николаевне и д.б.н., проф. Гаевскому Николаю Александровичу за оказанную помощь и руководство в процессе выполнения работы и написания диссертации; д.б.н., заведующей лабораторией лесной генетики и селекции Института леса им. В.Н. Сукачева СО РАН Муратовой Елене Николаевне за предоставленную возможность выполнения работ по культуре ткани; Череповскому Юрию Анатольевичу за возможность проведения работ на прививочной плантации Западно-Саянского ОЛХ; д.б.н. Кудояровой Гюзели Радомесовне за предоставление данных по иммуноферментному анализу; д.б.н., проф. Медведеву Сергею Семеновичу, к.б.н. Пожванову Григорию Александровичу и к.б.н. Шаварде Алексею Леонидовичу за организацию и проведение стажировки по освоению методов газожидкостной хроматографии на кафедре физиологии и биохимии растений СПбГУ.

Глава 1. СОМАТИЧЕСКИЙ ЭМБРИОГЕНЕЗ ХВОЙНЫХ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO

1.1. Зиготический эмбриогенез хвойных видов

У хвойных растений возможны множественные пути реализации их репродуктивного потенциала: асексуальное возникновение зародыша, полиархегониальность, полиэмбриония и кливаж. Оплодотворение двух и более яйцеклеток в пределах семязачатка и последующий кливаж клеток зиготического зародыша приводит к возникновению нескольких зародышей, полученных от разных опылителей в одном мегагаметофите (иногда до 16 зародышей) (Третьякова, 1990; 2008).

Зиготический эмбриогенез хвойных после оплодотворения зиготы может быть разделен на три основные фазы: проэмбриогенез, ранний эмбриогенез и поздний эмбриогенез (Singh, 1978). Проэмбриогенез - включает все стадии до удлинения суспензора, ранний эмбриогенез - включает стадии после удлинения суспензора и до заложения меристемы корня, поздний эмбриогенез -начинается от заложения меристем корня и побега и включает все последующие события до формирования зрелого зародыша с хорошо развитыми семядолями (Singh, 1978; Третьякова, 1990).

зиготвческня эмбриогенез голосеменных (Ршасеае)

прюибрио риппйзмбриогм« поздний эмбриогенез созревши*

Рис. 1. Схема зиготического эмбриогенеза голосеменных, на примере семейства Pinaceae (по Gifford, Foster, 1989).

Проэмбриогенез. Процесс проэмбриогнеза протекает в пределах

архегония. После оплодотворения ядро яйцеклетки делится дважды,

образовавшиеся в результате деления четыре ядра опускаются в основание

9

проэмбрио, где располагаются в одной плоскости. Далее каждое ядро делится вертикально, и образовавшиеся в результате восемь ядер располагаются в два яруса (или два уровня), при этом клеточных стенок между ними не образуется. Эти два яруса получили названия «первичный верхний ярус» и «первичный эмбриональный ярус». Далее происходит формирование вторичного веретена деления, и между ядрами возникают клеточные перегородки, при этом верхний ярус остается открытым, а эмбриональный ярус становится полностью закрытым. Оба яруса делятся еще раз, формируя в общем четыре уровня: два эмбриональных, суспензорный и верхний ярус (von Aderkas et al., 1991). Образующийся 16-клеточный проэмбрио состоит из одинаковых клеток, отличающихся местом их расположения в системе проэмбрио. Однако способностью к растяжению обладают лишь клетки предпоследнего яруса, которые берут на себя функцию первичного суспензора и выталкивают эмбриональные инициали в ткань женского гаметофита (Третьякова, 2008).

Ранний эмбриогенез. Период раннего эмбриогенеза начинается с

удлинения клеток первичного суспензора (von Aderkas et al., 1991). У

представителей семейства Pinus рост первичных суспензоров (эмбриональных

трубок) идет с неодинаковой скоростью и уже на уровне инициалей начинается

кливаж зиготического зародыша на четыре самостоятельные единицы.

Эмбриональные инициали подвергаются многократному делению и формируют

четыре эмбриональных глобулы зародыша (Третьякова, 2008). Это явление,

характерное для всех хвойных растений, было названо полиэмбрионией (Singh,

1978). Gupta и Grob (1995) описали два типа полиэмбрионии: простая

полиэмбриония, которая происходит в результате оплодотворения нескольких

яйцеклеток в женском гаметофите, и кливажная полиэмбриония - процесс,

посредством которого один зародыш расщепляется и формирует несколько

генетически идентичных эмбрио. В ходе полиэмбрионии происходит

конкуренция между зародышами, в результате чего выживает только наиболее

развитый зародыш, который оказался в наилучшем физиологическом состоянии

и наиболее благоприятных условиях. Остальные зародыши, как правило,

10

дегенерируют (Gupta, Grob, 1995). Продвижение эмбриональных глобул в ткань мегагаметофита происходит за счет деления и отмирания эмбриональных трубок, сосредоточенных на базальном конце эмбриональной глобулы. При этом старая эмбриональная трубка дегенерирует, и на ее месте появляется новая. Далее в клетках, прилегающих к суспензору, появляются первые признаки гистогенеза - зародыш переходит к стадии позднего эмбриогенеза. В эмбриональной массе закладываются клетки полярных меристем корня и побега. Дальнейшее развитие зародыша связано с гистогенезом и накоплением в клетках запасных питательных веществ (Третьякова, 2008).

Поздний эмбриогенез. Процесс позднего эмбриогенеза характеризуется явлением гистогенеза - формированием различных меристем. Первой развивается меристема корня. Интеркалярная часть развивается в корневой чехлик, дистальная зона продуцирует генеративную меристему, которая в свою очередь становится корневой меристемой. Эта проксимальная часть развивается еще до появления меристемы побега. Меристема стебля имеет очень сложное происхождение. Процесс ее формирования начинается с того, что клетки периферической части эмбриональной массы делятся во всех направлениях. Поверхностные клетки вносят вклад в суспензор на краях, и позднее в корневой чехлик. Клетки средней части, в конечном счете, становятся фокальной зоной, которая дает происхождение верхушечному апексу зародыша. Цитогистологическая дифференциация начинается с формирования прокамбия и стелы промеристемы на месте будущего узла. Во время этой стадии у эмбриона развивается система секреторных элементов, которые, однако, не имеют отношения к смоляным ходам. Функция этой системы неизвестна. Далее происходит развитие семядолей и эпидермального слоя. Между семядолями формируется конус нарастания. В результате зрелый зародыш имеет семядоли, апекс побега, первичную кору, центральный цилиндр, апекс корня и корневой чехлик со сформированной внутри колонкой (von Aderkas et al., 1991).

1.2. История развития методов микроклонального размножения растений в XX-XXI вв.

Первые работы в области методов культуры изолированных тканей

растений начались в конце XIX начале XX вв. с работ немецких ученых Н. Vochting и К. Rechinger по определению минимального размера экспланта, способного образовывать каллус. В 1902 г. Н. Haberlandt впервые высказал идею о возможности культивирования in vitro изолированных клеток растений и выдвинул гипотезу о тотипотентности любой живой клетки. Н. Vochting при изучении явления полярности пришел к выводу, что она свойственна не только органам растения, но и отдельной клетке. В начале 30-х годов R. Gautheret и F. White в своих работах показали способность каллусов и тканей растительных опухолей к неограниченному росту при переносе на свежие питательные среды.

В настоящее время клеточная биотехнология включает методы, основными из которых, помимо культивирования клеток и тканей отдельных органов, являются:

- методы клонального микроразмножения, включающие индукцию органогенеза и соматического эмбриогенеза;

- методы изолирования протопластов и получения соматических гибридов;

- методы получения гаплоидных растений и производных от них дигаплоидов;

- методы генетической трансформации с последующей регенерацией модифицированных растений.

Основой методов культуры изолированных клеток и тканей растений является уникальное свойство растительных клеток - тотипотентность. Под ним подразумевается способность растительной клетки реализовать имеющуюся генетическую информацию и давать начало целому организму (Батыгина и др., 1978; Бутенко, 1964; Беккер и др., 1990).

Соматический эмбриогенез в культуре in vitro

Одним из перспективных направлений в клеточной биотехнологии является соматический эмбриогенез - асексуальный способ размножения, при котором формирование зародыша происходит из соматической клетки растения (Klimaszewska, Суг, 2002). Впервые процесс соматического эмбриогенеза был индуцирован в 1958 г. Ф. Стюардом в суспензионной культуре моркови (Steward, 1958).

Выделяют два пути соматического эмбриогенеза. Первый путь — прямой соматический эмбриогенез, когда зародыши образуются непосредственно из клеток эксплантата без этапа каллусообразования. В этом случае соматические зародыши формируются из «проэмбриогенных детерминированных клеток», которые уже работают на развитие эмбриоида и нуждаются только в освобождении. Второй — непрямой, или косвенный, эмбриогенез, когда пролиферация каллуса является необходимым этапом. В непрямом соматическом эмбриогенезе задействованы «индуцированные эмбриогенные детерминированные клетки» (Sharp et al., 1980). Наряду с первичным соматическим эмбриогенезом происходит вторичный эмбриогенез, когда на поверхности сформировавшихся соматических зародышей образуются добавочные эмбриоиды (Митрофанова, 2009).

В 1978 г. Т.Б. Батыгиной в качестве новой категории вегетативного размножения растений было введено понятие «эмбриоидогения» - это один из типов гомофазной репродукции цветковых растений ex situ, in vivo и in vitro, элементарной структурной единицей которой является эмбриоид — новый индивидуум, формирующийся в семени или на вегетативных органах. Эмбриоид имеет биполярную организацию с апексами побега и корня и новой полярной осью, так же, как у полового зародыша. Для эмбриоида, как и для зародыша, характерно образование собственной оси, соединяющей полярно формирующиеся апексы побега и корня. Как правило, он не имеет общей васкулярной системы с материнским организмом (закрытый радикулярный полюс) (Батыгина, Бабро, 2012). При выделении эмбриоидогении в особый тип

репродукции и размножения использовались два критерия: онтогенетический и морфологический. Кроме того, в зависимости от происхождения и положения соматических зародышей на материнском растении были выделены две основные формы «эмбриоидогении»: репродуктивная, или фл оральная (образование проэмбрио в цветке и семени), и вегетативная (формирование адвентивных зародышей на листьях, побегах и корнях) (Батыгина, Васильева, 2002; Митрофанова, 2009).

Исследования по соматическому эмбриогенезу хвойных начались в 70-е гг. прошлого века, и впервые данный процесс был индуцирован в 1985 г. у Picea glauca из зиготических зародышей (Hakman et al., 1985) и у Larix decidua из мегагаметофитов (Nagmani, Bonga, 1985). Соматические зародыши являются аналогами зиготических, они способны к прорастанию и формированию растений-регенерантов (Lelu et al., 1994).

Соматический эмбриогенез является моделью для исследования процессов дифференцировки и дедифференцировки растительных клеток, физиологических и молекулярно-генетических процессов (von Arnold et al., 2002). В настоящее время данная биотехнология направлена на получение и распространение генетически ценных деревьев, и повышение продуктивности лесов в результате насаждения полученных клоновых элитных сеянцев, отличающихся улучшенным качеством древесины (Pullman, Bucalo, 2010).

Зарубежными учеными активно проводятся работы по исследованию и оптимизации процесса соматического эмбриогенеза для различных видов хвойных. В ряде стран (США, Канада, Франция) этот метод считается одним из наиболее перспективных для плантационного лесовыращивания. На основе данной биотехнологии была разработана программа Multy-Varietal Forestry (MVF) (Канада), позволяющая решать основные современные проблемы плантационного лесовыращивания, как то: повышение продуктивности семенных плантаций; устойчивость к вредителям; адаптация деревьев в связи с изменениями климата; восстановление исчезающих видов (Park, Bonga, 2010).

клоновых семейных плаитапий

Рис. 2. Классические методы плантационного лесовыращивания, дополненные программой MVF (по Park, Bonga, 2010).

1.2.1. Получение соматического эмбриогенеза у представителей рода Pin us

К настоящему времени процесс соматического эмбриогенеза описан для 28 видов рода Pinus (Pullman, Bucalo, 2010; Lara-Chavez et al., 2011). Для всех видов был получен эмбриогенный каллус и более чем для половины из них проведена оптимизация условий культивирования, обеспечивающих регенерацию из соматических зародышей полноценных растений.

Соматический эмбриогенез хвойных проходит через четыре стадии: индукция, пролиферация, созревание и прорастание.

Индукция соматического эмбриогенеза

Предполагается, что каллусная ткань частично сохраняет профиль генной активности, характерный для исходных тканей, поэтому образование эмбриогенной ткани у хвойных находится в строгой зависимости от выбора экспланта. В отличие от цветковых растений, у которых процесс эмбриогенеза часто индуцируется из зрелых эксплантов, у хвойных эмбриогенная ткань

обычно образуются из ювенальных тканей. Как правило, в культуре хвойных для индукции соматического эмбриогенеза в качестве экспланта используют незрелые мегагаметофиты (на стадии кливажа) и рассеченные зиготические зародыши {Pinus strobes (Finer et al., 1989), P. pinaster (Bercatche, Paques, 1995; Lelu et al., 1999), P. sylvestris (Lelu et al., 1999; Haggman et al., 1998), P. caribaea (Laine, David, 1990), P. montícola (Persy et al., 2000)), зрелые зиготические зародыши (P. garadiana (Malabadi, Nataraja, 2007а), P. kesiya (Malabadi et al., 2002), P. horaiensis (Bozhkov et al., 1997), P. strobes (Garin et al., 1998), P. taeda (Tang et al., 2001)), а также кончики корней взрослых деревьев (P. kesiya, Р. patula, P. roxburghii (Malabadi et al., 2004, 2005, 2007), P. sylvestris (Aronen et al., 2008)). Более эффективно процесс соматического эмбриогенеза проходит при введении в культуру in vitro незрелых мегагаметофитов вместе с зародышами. После поверхностной стерилизации семян, фертильные мегагаметофиты, рассекают и помещают на индукционную среду для образования экструзий в области микропилярного конца (Pullman, Bucalo, 2010). Строгое требование ювенальных эксплантов, часто эмбрионального происхождения, указывает на то, что у представителей рода Pinus сложно достигнуть перенаправления программы развития в культуре in vitro (Stasolla, Yeung, 2003).

После нескольких недель культивирования в темноте, в зависимости от вида и генотипа, у эксплантов наблюдается образование эмбриогенной ткани. В отличие от неэмбриогенной ткани, которая часто темного цвета, эмбриогенную ткань можно охарактеризовать как полупрозрачную массу, состоящую из незрелых соматических зародышей. В растущей эмбриональной массе, основываясь на морфологии, выделяют два различных типа клеток: маленькие клетки с плотной цитоплазмой, которые образуют головку эмбриона, и удлиненные клетки с огромными вакуолями, формирующие суспензорный аппарат. Механизм формирования и роста эмбриональной ткани в культуре остается неясным (Stasolla, Yeung, 2003). Предложены различные механизмы, среди которых выделяют:

- полиэмбриональный кливаж путем размножения «эмбриональных головок» соматических зародышей (Von Aderkas et al., 1991);

- формирование соматических эмбрионов из делящихся меристематических клеток, локализованных в суспензоре (Stasolla, Yeung, 2003);

- формирование соматических эмбрионов путем асимметричного деления отдельных клеток (von Arnold, Hakman, 1988).

У сосновых рост эмбриональной массы в культуре in vitro происходит в основном почкованием и кливажом (Timmis, 1998). Полиэмбриональный кливаж, наблюдаемый на ранних стадиях развития зиготического эмбриогенеза у хвойных, проходит одинаковым путем и в культуре in vitro (Stasolla et al., 2003).

Выбор питательной среды, используемой для индукции соматического эмбриогенеза, является видоспецифичным (Gupta, Grob, 1995; Pullman, Bucalo, 2010). Как правило, эмбриогенная ткань образуется на среде, содержащей низкие концентрации ауксинов, обычно 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) и/или нафтилуксусной кислоты (НУК) и цитокининов - N6-бензиламинопурина (6-БАП) и/или кинетина. Также в некоторых случаях применяют низкие концентрации брассиностероидов (Pullman, Bucalo, 2010).

Основные среды, используемые для индукции соматического эмбриогенеза у Pinus - это различные модификации среды LV (Litvay et al., 1985), MS (Murashige, Skoog, 1962), DCR и др.

Модифицированную среду LV используют для культивирования таких видов как Р. koraiensis (Bozkov et al., 1997), P. mounticola (Percy et al., 2000), P. pinaster (Lelu et al., 1999), P. banksiana (Park et al., 1999), P. sylvestris (Haggman et al., 1998) и P. oocarpa (Lara-Chavez et al., 2011), с различными сочетаниями концентраций 2,4-Д и 6-БАП, от 2,2цМ и 1,1 цМ (P. pinaster) до lOjiM и 5juM (Р. koraiensis) соответственно.

Среды MS и MSG применяют для индукции соматического эмбриогенеза

у P. kesiya (Jain et al., 1989), P. palustris (Nagmani et al., 1993), P. geradiana

17

(Malabadi, Nataraja, 2007a), P. serótina (Becwar et al., 1988), P. silvestris (Lelu et al., 1999), P. wallichiana (Malabadi, Nataraja 2007b), P. taeda (Pullman et al., 2008). Регуляторы роста 2,4-Д и 6-БАП добавляют в концентрациях от 2цМ и l|iM (Р. serótina) до 22,6цМ и 8,87jiM (P. kesiya) соответственно.

У P. lambertiana (Gupta, Grob, 1995), P. massoniana (Huang et al., 1995), P. nigra (Slajova et al., 2005), P. palustris (Nagmani et al., 1993), P. patula (Ford et al., 2000), P. banksiana (Park et al., 1999), P. brutia (Yildrim et al., 2006), P. roxburghil (Mathur et al, 2003), P. serótina (Becwar et al., 1988), P. strobus (Garin et al., 2000) и P. thunbergii (Maruyama et al., 2005) индукция соматического эмбриогенеза была получена на модифицированных средах DCR с применением гормонов 2,4-Д и 6-БАП в концентрациях от 2цМ и 0,5jiM (P. nigra) до 10p.M и 5}iM (Р. roxburghií) соответственно.

Частота инициации соматического эмбриогенеза у большинства изученных видов рода Pinus сильно варьирует в зависимости от генотипа дерева-донора. Так у P. taeda она может колебаться от 2% (Becwar et al., 1990) до 25% (МасКау et al., 2006), у P. strobus от 52,9% (Finer et al., 1989) до 76% (Klimaszewska et al., 2001), y P. pinea от 0,5 до 7,2% (Carnerous et al., 2009), y P. pinaster в пределах 15% (Bercetche, Pagues, 1995), y P. banksiana от 0,4 до 3,9% (Park, Lelu-Walter, 2006). Было установлено, что инициация эмбриогенного каллуса и образование соматических зародышей у Р. strobus (Garin et al., 1998; Klimaszewska et al., 2001), P. montícola (Persy et al., 2000), P. taeda (МасКау et al., 2006), P. sylvestris (Niskanen et al., 2004; Lelu-Walter et al., 2008), происходит под строгим генетическим контролем.

В последние годы исследования ученых направлены на повышение

частоты инициации эмбриогенной ткани. Эти работы включают в себя

оптимизацию минерального состава сред и концентраций ауксинов и

цитокининов (Pullman, Johnson, 2002), использование абсцизовой кислоты

(АБК) (Pullman et al., 2003), брассиностероидов, полиаминов (Malabadi,

Nataraja, 2007), ингибиторов этилена, витаминов В12, Е, фолиевой кислоты и

pH буферного агента 2(п-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES),

18

органических кислот (Pullman et al., 2003, 2005, 2006). Для P. radiata и P. taeda (Pullman, Bucalo, 2010) было показано положительное влияние предварительной холодовой обработки семян на частоту инициации, однако такой эффект не был обнаружен для Р. sylvestris (Niskanen et al., 2004). Также частота инициации зависит от используемых желирующих агентов, значения pH, адсорбентов и уровня нитратов (Tautorus et al., 1991). Pullman и Johnson отмечали увеличение скорости роста эмбриональной ткани на ранних стадиях инициации у P. taeda на модифицированной среде Р6, при добавлении в среду сульфатов меди и цинка, в концентрациях 2,5 и 28,8мг/л соответственно. Добавление в среду низких концентраций активированного угля (50-100мг/л) увеличивало скорость образования экструзий при культивировании зрелых эксплантов (Pullman, Johnson, 2002). Также для P. taeda было показано, что использование для инициации соматического эмбриогенеза жидкой питательной среды с пониженным содержанием ауксина и желирующего агента приводит к 6-10% увеличению уровня инициации эмбриогенной ткани (Pullman, Skryabina, 2007).

Пролиферация эмбрионально-суспензорной массы (ЭСМ)

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Ворошилова, Елена Владимировна, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Авров Ф.Д. Посевные качества семян и фенологическое развитие припоселковых кедровников // Проблемы кедра / Томск, 1989. Вып. 1. С. 113121.

Батыгина Т.Б., Васильева В.Е., Маметьева Т.Б. Проблемы морфогенеза in vivo и in vitro. Эмбриогенез у покрытосеменных растений // Ботанический журнал. 1978. Т. 63. № 1. С. 87-111.

Батыгина Т.Б., Васильева В.Е. Размножение растений: Учебник. СПб.: Изд. СПб. ун-та, 2002. 232 с.

Батыгина Т.Б., Бабро A.A. Тотипотентность. Феномент эмбриогении, эмбриоидогении, гемморизогении, каллусогении // Материалы IV Международной школы для молодых ученых «Эмбриология, генетика и биотехнология» / Пермь, 2012. С. 205-210.

БеккерМ.Е., Лиепиныш Т.К., Райпулис Е.П. Биотехнология. М.: Агропромиздат, 1990. 333 с.

Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М.: Наука, 1964. 146 с.

Горошкевич С.Н. http://kedr.forest.ru

Ирошников А.И. Полиморфизм популяций кедра сибирского // Изменчивость древесных растений Сибири. Красноярск: Ин-т леса СО РАН, 1974. С. 73-103.

Кислин E.H., Богданов В.А., Щелоков P.A., Кефели В.И. Абсцизовая и инд олил-3-уксусная кислота в культуре корней гороха. Газохроматографический и хромато-масс-спектрометрический анализ // Физиол. растений. 1983. Т. 30. № 1. С. 187-194.

Кислин E.H. Определение природных фитогормонов с помощью хроматографических методов. Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2004. 32 с.

Кунах В.А. Геномная изменчивость соматических клеток растений. Изменчивость и отбор в процессе адаптации к условиям выращивания in vitro II Биополимеры и клетка. 2000. Т. 16. №3. С. 159-185.

Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1973. 343 с.

Лутова Л.А., Ежова Т.А., Додуева И.Е., Осипова М.А. Генетика развития растений. СПб.: Издательство Н-Л. 2010. 432 с.

Минина Е.Г. Биологические основы цветения и плодоношения дуба // Труды Института леса АН СССР / Красноярск, 1954. Вып. 17. С. 5-97.

Минина Е.Г., Полозова Л.Я. Действие минеральных удобрений на биологию цветения и плодоношения дуба черешчатого // Труды Института леса АН СССР / Красноярск, 1960. Т. 47. Вып. 2. С. 38-50.

Минина Е.Г. Пол у сосны обыкновенной // Вопросы физиологии половой репродукции хвойных / Красноярск: ИЛиД, 1975. С. 68-89.

Минина Е.Г., Ларионова H.A. Строение и физиологические особенности аномальных женских шишек Pinus sibirica Du Tour II Ботан. Жур. 1976. T. 61. №4. С. 526-533.

Минина Е.Г., Ларионова H.A. Морфогенез и проявление пола у хвойных. М.: Наука, 1979.216 с.

Минина Е.Г., Третьякова И.Н., Ларионова H.A., Кудашева Ф.Н., Осетрова Г.В. Изучение геотропической чувствительности и пола у узкопирамидальной Pinns sylvestris L. II Физиология растений. 1981. T. 28. С. 206-209.

Минина Е.Г., Третьякова И.Н. Геотропизм и рост хвойных / Под. ред. Реймерса Ф.Э. Новосибирск: Наука, 1983. 200 с.

Митрофанова И.В. Соматический эмбриогенез как система in vitro размножения культурных растений // Физиология и биохимия культурных растений. 2009. Т. 41. №6. С. 496-509.

Молотковский Г.Х. Механизм полярности процесса оплодотворения при прямом и обратном скрещивании у растений // Цитология и генетика. 1968. Т. 2. №2. С. 127-132.

Некрасова Т.П. Рост и плодоношение сосны обыкновенной // Изв. СО АН СССР. Сер. биол. наук. 1972. Вып. 3. С. 45-52.

Обручева Н.В. Переход от гормональной к гормональной регуляции на примере выхода семян из покоя и запуска прорастания // Физиология растений. 2012. Т. 59. №4. С. 591-600.

Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. М.: Колос, 1980. 340 с.

Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика. Минск: «Высшая школа», 1973.

320 с.

Сабинин Д.А. Физиология развития растений. М.: АН СССР, 1963. С. 128129.

Сидорский А.Г. Изменение направленности процесса половой дифференциации растений под влиянием физиологически активных веществ // Успехи соврем, биологии. 1978. Т. 85. Вып. 1. С. 111-124.

Тахтаджян A.JI. Высшие растения. M.-JL, 1956. Т. 1.

Титов Е.В. Возможность гетерозиса при скрещивании деревьев кедра сибирского различного полового типа // Лесоведение. 1988. №4. С. 89-84.

Титов. Е.В. Гибридизация кедра сибирского: учеб. пособие. / Воронеж: Воронеж, гос. лесотехн. акад., 2006. - 127 с.

Третьякова И.Н. Эмбриология хвойных: физиологические аспекты. Новосибирск, Наука, 1990. 157 с.

Третьякова И.Н., Новоселова Н.В., Череповский Ю.А. Особенности эмбрионального развития у кедра сибирского {Pinus sibirica Du Tour) с однолетним циклом развития женской шишки в горах Западного Саяна // Физиология растений. 2004. Т. 51. №1. С. 134-141.

Третьякова И.Н. Сходства и различия зиготического и соматического эмбриогенеза сибирских видов хвойных // Материалы XII съезда Русского ботанического общества «Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века», Петрозаводск, 22-27 сентября 2008. Ч. 1. С. 298-300.

Третьякова И.Н., Ижболдина М.С. Индукция соматического эмбриогенеза

у кедра сибирского // Лесоведение. 2009. Т. 5. С. 41-47.

109

Третьякова И.Н., Садыкова B.C., Носкова Н.Е., Бондарь П.Н., Гаидашева И.И., Громовых Т.И., Иваницкая А.С., Ижболдина М.С., Барсукова А.В. Ростостимулирующая активность штаммов рода Streptomyces и Trichoderma, и перспективы их использования для микроклонального размножения хвойных // Биотехнология. 2009. №1. С. 39-44.

Третьякова И.Н. Контролируемое опыление сосны сибирской на клоновой прививочной плантации // Лесоведение. 2012.

Флора СССР // под ред. Комарова В.Л. Изд-во АН СССР. Л., 1934. Т. 1. 163с.

Хрянин В.Н. Дифференциация пола у растений // Вестник Башкирского университета. Пенза. 2001. Т. 2. №1. С. 170-173.

Чавчавадзе Е.С., Яценко-Хмелевский А.А. Порядок сосновые (Pinales) // Жизнь растений в шести томах. Т.4 / Под ред. Грушвицкого И.В. М.: Просвещение, 1978. С. 350-354.

Чайлахян М.Х., Хрянин В.Н. Пол растений и его гормональная регуляция. М.: Наука, 1982. 176 с.

Aronen Т., Pehkonen Т., Malabadi R., Ryynanen L. Somatic embryogenesis of Scots pine - advances in pine tissue culture at metla // In: Proceedings of the Nordic meeting on vegetative propagation of conifers for enhancing landscaping and tree breeding / Punkaharju, Finland, 10-11 Sept. 2008. P. 68-71.

Attree S.M., Pomeroy M.K., Fowke L.C. Manipulation of conditions for the culture of somatic embryos of white spruce for improved triacylglycerol biosynthesis and desiccation tolerance// Planta. 1992. V. 187. P. 395-404.

Attree S.M., Fowke L.C. Embryogeny of gymnosperms: advances in synthetic seed technology of conifers // Plant Cell Tiss. Organ Cult. 1993. V. 35. P. 1-35.

Bais H.P., Ravishankar G.A. Role of polyamines in the ontogeny of plants and their biotechnological applications // Plant Cell Tiss. Org. Cult. 2002. V. 69. P. 1-34.

Becwar M.R., Wann S.R., Johnson M.A., Verhagen S.A., Feirer R.P., Nagmani R. Development and characterization of in vitro embryogenic systems in conifers //

In: Ahuja MR (ed) Somatic cell genetics of woody plant / Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 1988. P. 1-18.

Becwar M.R., Nagmani R., Wann S.R. Initiation of embryogenic cultures and somatic embryo development in loblolly pine {Pinus taeda) II Can. J. For Res. 1990. V. 20. P. 810-817.

Bell L.M., Trigiano R.N., Conger B.V. Relationship of abscisic acid to somatic embryogenesis in Dactylis glomerata. Environ. // Exp. Bot. 1993. V. 33. P. 495^99.

Bercetche J., Paques M. Somatic embryogenesis in Maritime pine {Pinus pinaster) somatic embryogenesis in woody plants // Dordrecht: Kluwer Academic Publishers. 1995. P. 269-285.

Bewley J., Black M. Seeds: physiology of development and germination // New York: Plenum Press. 1994. 128 p.

Bhaskaran S., Smith R.H. Regeneration in cereal tissue culture: a review // Crop. Sci. 1990. V. 30. P. 1328-1337.

Bhojwani S.S., Dantu P.K. Somatic embryogenesis // Plant Tiss. Culture. 2013. V. 7. P. 75-92.

Bogre L., Stefanov I., Abraham M., Somogyi I., Dudits D. Differences in

response to 2,4-dichlorophenoxy acetic acid (2,4-D) treatment between E and NE

lines of alfalfa // Progress in Plant Cellular and Molecular Biology. Kluwer Academic

Publishers, Dordrecht. 1990. P. 427^36.

Bozhkov P.Y., Ahn I.S., Park Y.-A. Two alternative pathways of somatic

embryo origin from polyembryonic mature stored seeds of Pinus koriensis II Can. J.

Bot. 1997. V. 85. P. 509-512.

Bozhkov P.V., Filonova L.H., von Arnold S. A key developmental switch

during Norway spruce somatic embryogenesis is induced by withdrawal of growth

regulators and is associated with cell death and extracellular acidification //

Biotechnol. Bioeng. 2002. V. 77. P. 658-667.

Carneros E., Celestino C., Klimaszewska K., Park Y.-S., Toribio M., Bonga

J.M. Plant regeneration in stone pine {Pinus pinea L.) by somatic embryogenesis //

Plant Cell Tiss. Organ Cult. 2009. V. 98. P. 165-178.

Ill

Gazzarrini S., McCourt P. Cross-talk in plant hormone signaling: what arabidopsis mutants are telling us // Ann. Bot. 2003. V. 91. P. 605-612.

Centeno M.L., Rodriguez R., Berros B., Rodriguez A. Endogenous hormonal content and somatic embryogenic capacity of Corylus avellana L. Cotyledons // Plant Cell Rep. 1997. V. 17. P. 139-144.

Chapman A., Blervacq A.S., Vasseur J., Hilbert J.L. Arabinogalactan proyeins in Cichorium somatic embryogenesis: effect of beta-glycosyl Yariv reagent and epitop localization during embryo development // Planta. 2000. V. 211. №3. P. 305314.

Chiwocha S., von Aderkas P. Endogenous levels of free and conjugated forms of auxin, cytokinins and abscisic acid during seed development in Douglas fir // Plant Growth Regul. 2002. V. 36. P. 191-200.

Choudhury H., Kumaria S., Tamon P. Induction and maturation of somatic embryos from intact megagametophyte explants in Khasi pine (Pinus kesiya Royle ex. Gord.) // Curr. Sci. 2008. V. 95. P. 1433-1438.

Cooke T.J., Racusen R.H., Cohen J.D. The Role of auxin in plant embryogenesis // Plant Cell. 1993. V. 5. P. 1494-1495.

Dong J.-Z., Dunstan D.I. Characterization of three heat-shock-protein genes and their developmental regulation during somatic embryogenesis in white spruce {Picea glauca (Moench) Voss) // Planta. 1996. V. 200. P. 85-91.

Dong J.-Z., Perras M.R., Abrams S.R., Dunstan D.I. Gene expression patterns, and uptake and fate of fed ABA in white spruce somatic embryo tissue during maturation // J. Exp. Bot. 1997. V. 48. P. 277-287.

Dunstan D.I., Dong J-Z, Carrier D.J., Abrams S. Events following ABA treatment of spruce somatic embryos // In Vitro Cell Dev. Biol.-Plant. 1998. V. 34. P. 159-168.

Dos Santos A.L.W., Silveira V., Steiner N., Vidor M., Guerra M.P. Somatic embryogenesis in Parana pine (Araucaria angustifolia (Bert.) // O. Kuntze. Braz. Arch. Biol. Tec. 2002. V. 45. P. 97-106.

Feher A., Pasternak T., Otvos K., Miskolczi P., Dudits D. Induction of embryogenic competence in somatic plant cells: a review // Biologia, Bratislava. 2002. V. 57. P. 5-12.

Feher A., Pasternak T.P., Dudits D. Transition of somatic plant cells to an embryogenic state // Plant Cell Tiss. Org. Cult. 2003. V. 74. P. 201-228.

Feirer R.P., Simon P.W. Biochemical differences between carrot inbreds differing in plant regeneration potential II Plant Cell Rep. 1991. V. 10 P. 152-155.

Finer J.J., Kriebel H.B., Becwar M.R. Initiation of embryogenic callus and suspension cultures of eastern white pine (.Pinus strobus L.) // Plant Cell Rep. 1989. V. 8. P. 203-206.

Filonova L.H., Bozhkov P.V., von Arnold S. Developmental pathway of somatic embryogenesis in Picea abies as revealed by time-lapse tracking // J. Exp. Bot. 2000. V. 51. P. 249-264.

Fischer C., Neuhaus G. Influence of auxin on the establishment of bilateral symmetry in monocots // Plant J. 1996. V. 9. P. 659-669.

Ford C.S., Jones N.B., Van Staden J. Cry ©preservation and plant regeneration from somatic embryos of Pinus patula II Plant Cell Rep. 2000. V. 19. P. 610-615.

Garin E., Isabel N., Plourde A. Screening of large numbers of seed families of Pinus strobus L. for somatic embryogenesis from immature zygotic embryos // Plant Cell Rep. 1998. V. 18. P. 37-43.

Garin E., Bernier-Cardou M., Isabel N., Klimaszewska K., Plourde A. Effect of sugars, amino acids, and culture technique on maturation of somatic embryos of Pinus strobus on medium with two gellan gum concentrations // Plant Cell Tiss. Organ Cult. 2000. V. 62. P. 27-37.

Gaj M.D. Factors influencing somatic embryogenesis induction and plant regeneration with particular reference to Arabidopsis thaliana (L.) // Heynh. Plant Growth Regulat. 2004. V. 43. P. 27^7.

Carneros E., Celestino C., Klimaszewska K., Park Y.-S., Toribio M., Bonga J.M. Plant regeneration in Stone pine {Pinus pinea L.) by somatic embryogenesis //

Plant Cell Tiss. Organ Cult. 2009. V. 98. P. 165-178.

113

Gazzarrini S., McCourt P. Cross-talk in plant hormone signaling: what arabidopsis mutants are telling us. // Ann. Bot. 2003. V. 91. P. 605-612.

Gifford E.M., Foster A.S. Morphology and evolution of vascular plants / W.H. Freeman and Company. New York, 1989. 327 p.

Guerriero G., Martin N., Golovko A., Sundstrom J.F., Rask L., Ezcurra I. The RY/Sph element mediates transcriptional repression of maturation genes from late maturation to early seedling growth // New Phytologist. 2009. V. 184. P. 552-565.

Guerra M.P., Silveira V., Santos A.L.W., Astarita L.V., Nodari R.O. Somatic embiyogenesis in Araucaria angustifolia (Bert) O. Kuntze. In: Jain S.M., Gupta P.K. and Newton R.J. (eds) // Somatic Embiyogenesis in Woody Plants, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 2000. V. 6. P. 457^78.

Gupta P.K., Grob J.A. Somatic embiyogenesis in conifers // In: Jain S., Gupta P., Newton R. (eds) Somatic embryogenesis in woody plants / Kluwer Academic Publishers. Dordrecht, 1995. V. 1. P. 81-98.

Gupta P.K., Holmstrom D.G., Larson B., Zucati J. Development and stratification of pine somatic embryos using a liquid system: Patent 20050026281 (US)//3 Feb. 2005.

Gyorgyey J., Gatner A. Alfalfa heat shock genes are differentially expressed during somatic embryogenesis // Plant Mol. Biol. 1991. V. 16. P. 999-1007.

Haggman H., Ryynanen L.A., Aronen T.S., Krajnakova J. Cryopreservation of embryogenic cultures of Scots pine // Plant Cell Tissue Organ Cult. 1998. V. 54. P. 45-53.

Haggman H., Vuosku J., Kestila J., Suorsa M., Ruottinen M., Neubauer P., Laara E., Sarjala T. The role of spermidine and spermine in cell function and pattern formation in Scots pine embryogenesis // Proceedings IUFRO Working Party 2.09.02 Somatic Embiyogenesis of Forest Trees Conference «Advances in Somatic embryogenesis of Trees and Its Application for the Future Forests and Plantations» August 19-21, 2010, Suwon, Republic of Korea. P. 119.

HakmanL, Fowke L.C., von Arnold S. The Development of somatic embryos in tissue cultures initiated from immature embryos of Picea abies (Norway spruce) // Plant Sci. 1985. V. 38. P. 53-59.

Hakman I. Embryology in Norway spruce {Picea abies). An analysis of the composition of seed storage proteins and deposition of storage reserves during seed development and somatic embryogenesis // Physiol. Plantarum. 1993. V. 87. P. 148— 159.

Hay E.I., Charest P.J. Somatic embryo germination and desiccation tolerance in conifers // Somatic embryogenesis in woody plants. Dordrecht, The Netherlands: Kluwer Academic Publishers. 1999. V. 4. P. 61-69.

Helmersson A., von Arnold S., Burg K., Bozhkov P.V. High stability of nuclear microsatellite loci during the early stages of somatic embryogenesis in Norway spruce // Tree Physiology. 2004. V. 24. P. 1181-1186.

Huang J.-Q., Wei Z.-M., Xu Z.-H. Somatic embryogenesis and plantlet regeneration from callus of mature zygotic embryos of masson pine // Acta. Bot. Sin. 1995. V. 37. P. 289-294.

Hutchinson M.J., KrishnaRaj S., Saxena P.K. Inhibitory effect of GA3 on the development of thidiazuroninduced somatic embryogenesis in geranium (Pelargonium Hortorum Bailey) hypocotyl cultures // Plant Cell Rep. 1997. V. 16. P. 435-438.

Jain M., Dong N., Newton R.J. Somatic embryogenesis in slash pine {Pinus elliottii) from immature embryos cultured in vitro II Plant Sci. 1989. V. 65. P. 233241.

Jimenez V.M., Bangerth F. Relationship between endogenous hormone levels in grapevine callus cultures and their morphogenetic behaviour // Vitis. 2000. V. 39. P. 151-157.

Jimenez V.M., Bangerth F. Endogenous hormone levels in explants and in embryogenic and non-embryogenic cultures of carrot // Physiol. Plant. 2001. V. 111. P. 389-395.

Jimenez V.M. Involvement of plant hormones and plant growth regulators on in vitro somatic embryogenesis // Plant Growth Regulation. 2005. V. 47. P. 91-110.

Joy IV R.W., Kumar P.P., Thorpe T.A. Long-term storage of somatic embryogenic white spruce tissue at ambient temperature // Plant Cell Tiss. Organ Cult. 1991a. V. 25. P. 53-60.

Joy IV R.W., Yeung E.-C., Kong L., Thorpe T.A. Development of white spruce somatic embryos: I. Storage product deposition // In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant 1991b. V. 27. P. 32-41.

Kapik N.H., Dinus R.J., Dean J.F.D. Abscisic acid and zygotic embryogenesis in Pinus taeda II Tree Physiology. 1995. V. 15. P. 485-490.

Kermode A.R., Dumbroff E.B., Bewley J.D. The role of maturation drying in the transition from seed development to germination. VII. Effects of partial and complete desiccation on abscisic acid levels and sensitivity in Ricinus communis L. seeds // J. Exp. Bot. 1989. V. 40. P. 303-313.

Klimaszewska K., Bernier-Cardou M., Cyr D.R., Sutton B.C.S. Influence of gelling agents on culture medium gel strength, water availability, tissue water potential, and maturation response in embryogenic cultures of Pinus strobus L. // In Vitro Cell Dev. Biol. Plant. 2000. V. 36. P. 279-286.

Klimaszewska K., Park Y.-S., Overton C., MacEacheron I., Bonga J.M. Optimized somatic embryogenesis in Pinus strobus L. in vitro cell // Dev. Biol. Plant. 2001. V. 37. P. 392-399.

Klimaszewska K., Cyr D.R. Conifer somatic embryogenesis: I. Development // Dendrobiology. 2002. V. 48. P. 31-39.

Kong L., Yeung E.-C. Effects of ethylene and ethylene inhibitors on white spruce somatic embryo maturation // Plant Sci. 1994. V. 104. P. 71-80.

Kong L., Yeung E.-C. Effects of silver nitrate and poly ethylene glycol on white spruce (Picea glauca) somatic embryo development: enhancing cotyledonary embryo formation and endogenous ABA content // Physiol. Plant. 1995. V. 93. P. 298-304.

Kong L., Attree S.M., Fowke L.C. Changes of endogenous hormone levels in developing seeds, zygotic embryos and megagametophytes in Picea glauca II Physiol. Plantarum. 1997. V. 101. P. 23-30.

Kong L., Attree S.M., Fowke L.C. Effects of polyethylene glycol and methylglyoxal bis (guanylhydrazone) on endogenous polyamine levels and somatic embiyo maturation in white spruce {Picea glauca ) // Plant Sci. 1998. V. 133. P. 211220.

Kong L., Attree S.M., Evans D.E., Binarova P., Yeung E.-C., Fowke L.C. Somatic embryogenesis in white spruce: studies of embryo development and cell biology // In: Mohan J.S., Gupta P.K., Newton R.J. (eds) Somatic embryogenesis in woody plants / Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 1999. V. 4. P. 1-28.

Kumar P.P., Joy R.W. IV, Thorpe T.A. Ethylene and carbon dioxide accumulation, and growth of cell suspension cultures of Picea glauca (white spruce). //Plant Physiol. 1989. V. 135. P. 592-596.

Laine E., David D. Somatic embryogenesis in immature embryos and protoplasts of Pinus caribaea I I Plant Sci. 1990. V. 69. P. 215-224.

Lara-Chavez A., Flinn B.S., Egertsdotter U. Initiation of somatic embryogenesis from immature zygotic embryos of Oocarpa pine (Pine oocarpa Schiede ex Schiectendal) // Tree Physiology. 2011. V. 31. P. 539-554.

Lelu M.-A., Bastien C., Klimaszewska K., Charest P.J. An improved method for somatic plantlet production in hybrid larch (Larix x leptoeuropaea): Part 2. Control for germination and plantlet development // Plant Cell Tiss. Org. Cult. 1994. V. 36. P. 117-127.

Lelu M.-A., Bastien C., Drugeault A., Gouez M.L., Klimaszewska K. Somatic embryogenesis and plantlet development in Pinus sylvestris and Pinus pinaster on medium with and without plant growth regulators // Physiol. Plant. 1999. V. 105. P. 719-728.

Lelu-Walter M-.A., Bernier-Cardou M., Klimaszewska K. Clonal Plant Production from self- and cross-pollinated seed families of Pinus sylvestris (L.)

through somatic embryogenesis // Plant Cell Tiss. Organ Cult. 2008. V. 92. P. 31-45.

117

Litvay J.D., Verma D.C., Johmson M.A. Influence of loblolly pine (Pinus taeda L.). Culture medium and its components on growth and somatic embryogenesis of the wild carrot (Daucus carota L.) // Plant Cell Rep. 1985. V. 4. P. 325-328.

Liu G., Bao M. Adventitious shoot regeneration from in vitro cultured leaves of London plane tree (Platanus acerifolia Willd.) II Plant Cell Rep. 1993. V. 21. P. 640644.

Lotan T., Ohto M., Yee K.M., West M.A., Lo R., Kwong R.W., Yamagishi K., Fischer R.L., Goldberg R.B., Harada J.J. Arabidopsis LEAFY COTYLEDON 1 is sufficient to induce embryo development in vegetative cells // Cell. 1998. V. 93. P. 1195-1205.

MacKay J.J., Becwar M.R., Park Y.-S., Corderro J.P., Pullman G.S. Genetic control of somatic embryogenesis initiation in Loblolly pine and implications for breeding // Tree Genet Genom. 2006. V. 2. P. 1-9.

Malabadi R.B., Choudhury H., Tandon P. Plant regeneration via somatic embryogenesis in Pinus kesiya (Royle ex. Grod.) // Appl Biol Res. 2002. V. 4. P. 110.

Malabadi R.B., Choudhury H., Tandon P. Initiation, maintenance and maturation of somatic embryos from thin apical dome sections in Pinus kesiya (Royle ex. Gord) promoted by partial desiccation and gellan gum // Sci. Hort. 2004. V. 102. P. 449-459.

Malabadi R.B., Van Staden J. Somatic embryogenesis from vegetative shoot apices of mature trees of Pinus patula II Tree Physiology. 2005. V. 25. P. 11-16.

Malabadi R.B., Nataraja K. Putrescine influences somatic embryogenesis and plant regeneration in Pinus geradiana Wall //Am J. Plant Physiol. 2007a. V. 2. P. 107-114.

Malabadi R.B., Nataraja K. 24-Epibrassinolide induces somatic embryogenesis in Pinus wallichiana A.B. Jacks 11 J. Plant Sci. 2007b. V. 2. P. 171-178.

Maruyama E., Hosoi Y., Ishii K. Propagation of japanese red pine (.Pinus densiflora Zieb. et. Zucc.) via somatic embryogenesis 11 Prop. Ornam. Plants. 2005. V. 5. P. 199-204.

Mathur G., Alkutkar V.A., Nadgauda R.S. Cryopreservation of embryogenic culture of Pinus roxburghii// Biol. Plant. 2003. V. 46. P. 205-210.

Maheshwari P., Singh H. The female gametophyte of gymnosperms // Biological Reviews. 1967. V. 42 №1. P. 88-129.

McCabe P.F., Valentine T.A., Forsberg L.S., Pennell R.I. Soluble signal from cells indentified at the cell wall establish a developmental pathway in carrot // Plant cell. 1997. V. 9. №12. P. 2225-2241.

Merkle S.A., Montello P.M., Xia X., Upchurch B.L., Smith D.R. Light Quality treatments enhance somatic seedling production in three southern pine species // Tree Physiol. 2006. V. 26. P. 187-194.

Michalczuk L., Cooke T.J., Cohen J.D. Auxin levels at different stages of carrot embryogenesis//Phytochemistry. 1992. V. 31. P. 1097-1103.

Miguel C., Goncalves S., Tereso S., Marum L., Maroco J., Oliveria M.M. Somatic embryogenesis from 20 open-pollinated families of Portuguese plus trees of maritime pine // Plant Cell Tissue Organ Cult. 2004. V. 76. P. 121-130.

Millar A.A., Jacobson J.V., Ross J.J., Helliwell C.A., Poole A.T., Scofield G., Reid J.B., Gubler F. Seed dormancy and ABA metabolism in Arabidopsis and barley: role of ABA 8'-hydroxylase // Plant J. 2006. V. 45. P. 942-954.

Minocha R., Dale R.S., Cathie R., Steele K.D., Minocha S.C. Polyamine levels during the development of zygotic and somatic embryos of Pinus radiate II Physiol. Plantarum. 1999. V. 105. P. 155-164.

Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. 1962. V. 15. №4. P. 473-497.

Nagmani R., Bonga J.M. Embryogenesis in subcultured callus of Larix decidua II Can. J. For. Res. 1985. V. 15. P. 1088-1091.

Nagmani R., Diner A.M., Sharma G.C. Somatic embryogenesis in longleaf pine {Pinus palustris) // Can J For Res. 1993.V. 23. P. 873-876.

Niema K., Haggman H. Pisolithus tinctorius promotes germination and forms mycorrhizal structures in Scots pine somatic embryos in vitro //Mycorrhiza. 2002. V. 12. P. 263-267.

Niskanen A.-M., Lu J., Seitz S., Keinonen K., Von Weissenberg K., Pappinen A. Effect of parent genotype on somatic embryogenesis in scots pine {Pinus sylvestris) // Tree Physiology. 2004. V. 24. P. 1259-1265.

Nissen P., Minocha S.C. Inhibition by 2,4-D of somatic embryogenesis in carrot as explored by its reversal by difluoromethylornithine // Physiol. Plant. 1993. V. 89. P. 673-680.

Osuga K., Masuda H., Komamine A. Synchronization of somatic embryogenesis at high frequency using carrot suspension cultures: model systems and application in plant development // Meth. Cell Sci. 1999. V. 21. P. 129-140.

Padmanabhan K., Cantliffe D.J., Koch K.E. Auxinregulated gene expression and embryogenic competence in callus cultures of sweet potato, Ipomoea batatas (L.) Lam. // Plant Cell Rep. 2001. V. 20. P. 187-192.

Park Y.-S., Bonga J.M., Cameron S.I., Barrett J.D., Forbes K., De Verno L.L., Klimaszewska K. Somatic embryogenesis in jack pine {Pinus banksiana Lamb) // In: Jain S., Gupta P., Newton R. (eds) Somatic embryogenesis in woody plants / Kluwer Academic Publishers. Dordrecht, 1999. V. 4. P. 491-504.

Park Y.-S., Lelu-Walter M.-A. Initiation of somatic embryogenesis in Pinus banksiana, P. strobus, P. pinaster and P. sylvestris at three laboratories in Canada and France // Plant cell organ Cult. 2006. V. 86. P. 87-101.

Park Y.-S., Bonga J. Application of somatic embryogenesis in forest // Management and research IUFRO working party 2.09.02 Somatic embryogenesis of forest trees conference advances in somatic embryogenesis of trees and its application for the future forests and plantations / Suwon, Republic of Korea. August 19-21, 2010. P. 3-8.

Pasternak T.P., Prinsen E., Ayaydin F., Miskolczi P., Potters G., Asard H., Van Onckelen H.A., Dudits D., Feher A. The role of auxin, pH, and stress in the activation of embryogenic cell division in leaf protoplast-derived cells of alfalfa // Plant Physiol. 2002. V. 129. P. 1807-1819.

Persy R.E., Klimaszewska K., Cyr D.R. Evaluation of somatic embryogenesis for clonal propagation of western white pine // Can J. For Res. 2000. V. 30. P. 18671876.

Pesek B., Eliasova K., Vagner M., Vondrakova Z. The biochemical characteristics of the physiological activity of beech and spruce embryos // Proceedings of the IUFRO Working Party 2.09.02 conference "Integrating vegetative propagation, biotechnologies and genetic improvement for tree production and sustainable forest management" June 25-28, 2012. Brno, Czech Republic. P. 175179.

Petrasek J., Frilm J. Auxin transport routes in plant development // Development. 2009. V. 136. P. 2675-2688.

Pintos B., Martin J.P., Centeno M.L., Villalobos N., Guerra H., Martin L. Endogenous cytokinin levels in embryogenic and non-embryogenic calli of Medicago arborea L. // Plant Sci. 2002. V. 163. P. 955-960.

Pullman G.S. Osmotic measurements of whole ovules during loblolly pine embryo development // In: TAPPI biological sciences symposium / San Francisco, CA, 19-23 Oct. 1997. P. 41-48.

(Pullman G.S., Johnson S. Somatic embryogenesis in loblolly pine {Pinus taeda L.): improving culture initiation rates // Ann For Sci. 2002. V. 59. P. 663-668.

Pullman G.S., Johnson S., Peter G., Cairney J., Xu N. Improving loblolly pine somatic embryo maturation: comparison of somatic and zygotic embryo morphology, germination, and gene expression // Plant Cell Rep. 2003. V. 21. P. 747—758.

Pullman G.S., Gupta P.K., Timmis R., Carpenter C., Kreitinger M., Welty E. Improved Norway spruce somatic embryo development through the use of abscisic acid combined with activated carbon // Plant Cell Rep. 2005. V. 24. P. 271-279.

Pullman G.S., Peter G. Methods for increasing conifer somatic embryo initiation, capture, and multiplication: Patent 20060051868 (US) // 9 March 2006.

Pullman G.S., Skryabina A. Liquid medium and liquid overlays improve embryogenic tissue initiation in conifers // Plant Cell Rep. 2007. V. 26. P. 873-887.

Pullman G.S., Chase K.M., Skryabina A., Bucalo K. Conifer embryogenic tissue initiation: improvements by supplementation of medium with d-c/z/ro-inositol and d-xylose // Tree Physiol. 2008. V. 29. P. 147-156.

Pullman G.S., Johnson S. Osmotic measurements in whole megagametophytes and embryos of loblolly pine {Pinus taeda L.) during embryo and seed development 11 Tree Physiology. 2009. V. 29. P. 819-827.

Pullman G.S., Bucalo K. Pine somatic embryogenesis using zygotic embryos as explants // Plant Embryo Culture: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. 2010. V. 710. P. 267-291.

Rajasekaran K., Hein M.B., Vasil I.K. Endogenous abscisic acid and indole-3-acetic acid and somatic embryogenesis in cultured leaf explants of Pennisetum purpureum Schum. // Plant Physiol. 1987. V. 84. P. 47-51.

Richard D., Lescot M., Inzer D., De Veylder L. Effect of auxin, cytokinin, and sucrose on cell cycle gene expression in Arabidopsis thaliana cell suspension cultures //Plant Cell Tiss. Org. Cult. 2002. V. 69. P. 167-176.

Rock C.D., Quatrano R.S. The role of hormones during seed development // Plant Hormones. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 1995. P. 671- 697.

Samaj J., Braun M., Baluska F., Ensikat H.J., Tsumaraya Y., Volkmann D. Specific localization of arabinogalactan-protein epitopes at the surface of maize root hairs // Plant and Cell Physiology. 1999. V. 40. P. 874-883.

Schiavone F.M., Cooke T.J. Unusual patterns of somatic embryogenesis in the domesticated carrot: developmental effects of exogenous auxins and auxin transport inhibitors // Cell Differ. 1987. V. 21. P. 53-62.

Sharp W.R., Sondahl M.R., Caldas L.S., Marraffa S.B. The physiology of in vitro asexual embryogenesis // Hort. Rev. 1980. V. 2. P. 268-310.

Silveira V., Steiner N., dos Santos A.L.W., Nodari R.O., Guerra M.P. Biotechnology tolls in Araucaria angustifolia conservation and improvement: inductive factors affecting somatic embryogenesis // Crop Breeding Appl. Biotechnol. 2002. V. 3. P. 463-470.

Silveira V., Balbuena T.S., Santa-Catarina C., Floh E.I.S., Guerra M.P., Handro W. Biochemical changes during seed development in Pinus taeda L. // Plant Growth Regulation. 2004. V. 44. P. 147-156.

Slajova T., Jasik J., Kormutak A. Somatic embryogenesis in Pinus nigra Arn. Somatic embryogenesis in woody plants 11 Dordrecht: Kluwer Academic Publishers. 1995. P. 207-220.

Simóla L.K., Santanen A. Improvement of nutrient medium for growth and embryogenesis of megagametophyte and embryo callus lines of Picea abies II Physiol. Plant. 1990. V. 80. P. 27-35.

Somleva M.M., Kapchina V., Alexieva V., Golovinsky E. Anticytokinin Effects on in vitro response of embryogenic and non-embryogenic genotypes of Dactylis glomerata L. I I Plant Growth Regulat. 1995. V. 16. P. 109-112.

Singh H. Embryology of Gymnosperms. Berlin: Gebruder Borntraeger. 1978. 302 p.

Stals H., Inze D. When plant cells decide to divide // Trends Plant Sci. 200l.V. 8. P. 359-364.

Stasolla C., Yeung E.-C. Ascorbic acid improves conversion of white spruce somatic embryos // In Vitro Cell Dev. Biol. Plant. 1999. V. 35. P. 316-319.

Stasolla C., Kong L., Yeung E.-C., Thorpe T.A. Maturation of somatic embryos in conifers: morphogenesis, physiology, biochemistry and molecular biology // In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant. 2002. V. 38. P. 93-105.

Stasolla C., Yeung E.-C. Recent advances in conifer somatic embryogenesis: improving somatic embryo quality // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2003. V. 74. P. 15-35.

Steward F.C. Growth and development of cultivated cells. III. Interpretations of the growth from free cell to carrot plant II Amer. J. Bot. 1958. V. 45. P. 709-713.

Tang W., Guo Z., Ouyang F. Plant regeneration from embryogenic cultures initiated from mature loblolly pine zygotic embryos // In Vitro Cell Dev. Biol. Plant. 2001. V. 37. P. 558-563.

Tautorus T.E., Fowke L.C., Dunstan D.I. Somatic embryogenesis in conifers. Can J Bot. 1991. V. 69. P. 1873-1899.

Thomas C., Bronner R., Molinier J., Prinsen E., Van Onckelen H., Hahne G. Immuno-cytochemical localization of indole-3-acetic acid during induction of somatic embryogenesis in cultured sunflower embryos // Planta. 2002. V. 215. P. 577-583.

Timmis R. Bioprocessing for tree production in the forest industry: conifer somatic embryogenesis//Biotechnol. Prog. 1998. V. 14. P. 156-166.

Tompsett P.B. Studies of growth and flowering in Picea sitchensis (Bong.) Carr. 1. Initiation and development of male, female, and vegetative buds // Ann. Bot. 1978. V. 42. P. 889-900.

Trewavas A. How do plant growth substances work? // Plant Cell Environ. 1981. V. 4. P. 203-228.

Vagner M., Vondrakova Z., Spackova J., Cvikrova M., Eder J., Lipavska H., Albrechtova J., Svobodova H., Machackova I. Norway spruce somatic embryogenesis: endogenous levels of phytohormones during somatic embryo development // Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21st Century, Kluwer Academic Publishers, Netherlands, 1999. P. 93-96.

Vagner M., Elisova K., Pesek B., Malbeck J., Martincova O., Travnikova A., Cvikrova M., Vondarakova Z. The key role of phytohormones in somatic embryogenesis of Norway spruce // 2th International Conference of the IUFRO WORKING PARTY 2.09.02 / Brno, Czech Republic, 2012. S4-4.

Veselov S.Y., Kudoyarova G.R., Egutkin N.L., Gyuli-Zade V.Z., Mustafina A.R., Kof E.M. Modified solvent partitioning scheme providing increased specificity and rapidity of immunoassay for indole-3-acetic acid // Physiol. Plant. 1992. V. 86. P. 93-96.

Von Aderkas P., Bonga J.M. Formation of embryoids of Larix decidua: early embryogenesis // Amer. J. Bot. 1988. V. 75 (5). P. 690-700.

Von Aderkas P., Bonga J., Klimaszewska K., Owens J. Comparison of larch embryogeny in vivo and in vitro II Woody plant biotechnology / New York: Plenum press. 1991. P. 139-155.

Von Aderkas P., Lelu M-A., Label P. Plant growth regulator levels during maturation of larch somatic embryos // Plant Physiol. Biochem. 2001. V. 39. P. 495502.

Von Arnold S., Egertsdotter U., Ekberg I., Gupta P.K., Mo H. Somatic embryogenesis in Norway spruce {Picea abies) I I Somatic Embryogenesis in Woody Plants, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 1995. V. 3. P. 17-36.

Von Arnold S., Hakman I. Regulation of somatic embryo development in Picea abies by abscisic acid (ABA) // J. Plant Physiol. 1988. V. 132. P. 164-169.

Von Arnold S., Sabala I., Bozhkov P., Kyachok J., Filonova L. Developmental pathways of somatic embryogenesis // Plant Cell Tiss. Org. Cult. 2002. V. 69. P. 233-249.

Yeung E.-C., Stasolla C., Kong L. Apical meristem formation during zygotic embryo development of white spruce // Can. J. Bot. 1998. V. 76. P. 751-761.

Yeung E.-C., Stasolla C. Somatic embryogenesis-apical meristem formation and conversion // Korean J. Plant Tiss. Cult. 2000. V. 27. P. 253-258.

Yildrim T., Kaya Z., Isik K. Induction of embryogenic tissue and maturation of somatic embryos in Pinus brutia TEN // Plant Cell Tissue Organ Cult. 2006. V. 87. P. 67-76.