Релокация обратной транскриптазы теломеразы под действием окислительного стресса тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Буркатовский Дмитрий Сергеевич

• Буркатовский Дмитрий Сергеевич
• кандидат наук
• 2024

Оглавление диссертации кандидат наук Буркатовский Дмитрий Сергеевич

Содержание

Список сокращений

Введение

Актуальность работы

Основные цели и задачи исследования

Научная новизна

Теоретическая и практическая значимость

Положения, выносимые на защиту

Степень достоверности и апробация результатов работы

Структура диссертационной работы

Глава 1. Литературный обзор

1.1. Роль митохондрии в клетке

1.1.1. Транспорт белков в митохондрию

1.1.2. Транспорт в матрикс митохондрии

1.1.3. Посттрансляционный и котрансляционный транспорт

1.1.3.1. Посттрансляционный импорт

1.1.3.2. Котрансляционный импорт

1.2. Роль TERT в клетке

1.2.1. Реструктурирование хроматина

1.2.2. Модуляция Wnt-сигнала

1.2.3. РНК-зависимая РНК-полимеразная активность в комплексе с ЯМЯР

1.2.4. Митохондриальная локализация ТЕЯТ

1.2.5. Локализация ТЕЯТ внутри митохондрии

1.2.6. Регуляция распределения ТЕЯТ в клетке

1.2.7. Целевые последовательности ТЕЯТ

1.2.8. Регуляция распределения ТЕЯТ при окислительном стрессе

1.2.9. Роль ТЕЯТ в метаболизме митохондрий

1.2.9.1. Митохондриальный hTERT делает митохондриальную ДНК чувствительной к повреждениям

1.2.9.2. Митохондриальный hTERT защищает митохондриальную ДНК от повреждений

1.2.10. Влияние hTERT на производство активных форм кислорода

1.3. Влияние окислительного стресса на клетку

1.3.1. Производство супероксида в митохондриях

1.3.2. Восстановление кислорода КДОРН-оксидазой

2

1.3.3. Ксантиноксидаза

1.3.4. Образование перекиси водорода с участием SOD

1.3.5. Реакция фентона

1.3.6. Повреждение ДНК

1.3.7. Окисление липидов митохондрии

1.3.8. Использование перекиси для вызова окислительного стресса

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Материалы

2.1.1. Готовые реактивы и ферменты

2.1.1.1. Реактивы для генетической инженерии

2.1.1.2. Реактивы для гель-электрофореза ДНК

2.1.1.3. Ведение культур млекопитающих

2.1.2. Приготовленные буферы и среды из реактивов

2.1.3. Плазмидные векторы

2.1.4. Клеточные культуры

2.1.4.1. Культура HEK293T MTS-Dendra2

2.1.4.2. Транзиентно экспрессирующая TERT-SNAP культура

2.1.4.3. Стабильно экспрессирующая TERT-SNAP культура

2.1.5. SNAP - красители

2.1.6. Культуральный пластик

2.1.7. Пластик для микроскопии

2.2. Методы

2.2.1. Генная инженерия

2.2.1.1. Схема клонирования pcDNA MTS-SNAP

2.2.1.2. Схема клонирования pcDNA TERT-SNAP

2.2.1.3. Выделение фрагментов агарозного геля

2.2.1.4. Лигирование

2.2.1.5. Трансформация

2.2.1.6. Проверка вставки методом ПЦР

2.2.1.7. Секвенирование

2.2.1.8. Трансфекция клеток для транзиентной экспрессии TERT-SNAP

2.2.1.9. Лентивирусная трансдукция

2.2.2. Экспрессия и очистка белков

2.2.2.1. Создание продуцирующих культур

2.2.2.2. Наработка биомассы

2.2.2.3. Выделение белка из клеток

2.2.2.4. Аффинная хроматография

2.2.2.5. Анализ методом белкового электрофореза

2.2.2.6. Очистка белка от SUMO

2.2.2.7. Концентрация белка

2.2.2.8. Регенерация колонки

2.2.3. Ведение клеточных культур

2.2.3.1. Разморозка клеток

2.2.3.2. Поддержание культуры клеток

2.2.3.3. Заморозка клеток

2.2.4. Микроинжекция

2.2.4.1. Подготовка микроиголок

2.2.4.2. Инжекция

2.2.5. Оценка окислительного стресса

2.2.5.1. Методом флуоресцентной микроскопии, с помощью DCF

2.2.5.2. Методом проточной цитофлуориметрии, с помощью MitoSOX

2.2.6. Сортинг клеток

2.2.7. Вызов окислительного стресса

2.2.8. Флуоресцентная микроскопия

2.2.8.1. Получение изображений

2.2.8.2. Наблюдение за микроинжектированными белками

2.2.8.3. Наблюдение транспорта TERT в митохондрии

2.2.8.4. Наблюдение синтеза TERT в митохондрии

2.2.8.5. Наблюдение колокализации TERT-SNAP с митохондриями и лизосомами

2.2.9. Обработка изображений

2.2.9.1. Оценка колокализации TERT-SNAP с митохондриями и лизосомами в клетках HEK293 TERT-SNAP

2.2.9.2. Оценка уровня TERT-SNAP в митохондриях трансфицированных клеток HeLa

Глава 3. Результаты

3.1. Подбор флуоресцентной метки для TERT

3.1.1. Зрелые GFP-подобные белки не транспортируются в митохондрии

3.1.2. Зрелый FbFP не транспортируются в митохондрии

3.1.3. SNAP-tag как флуоресцентная метка для TERT

3.1.4. Локализация MTS-SNAP в трансфицированных клетках

3.1.5. Микроинжекция MTS-SNAP-tag

3.2. Подбор красителей для SNAP-tag

3.3. Определение используемой концентрации H2O2

3.1. Контроль с помощью DCF

3.2. Контроль с помощью MitoSOX

3.4. Транспорт TERT-SNAP в митохондрии

3.4.1. Локализация TERT-SNAP в клетках HEK293 TERT-SNAP

3.5. Синтез TERT-SNAP в митохондрии

3.5.1. Локализация TERT-SNAP в митохондриях

3.5.2. Количественная оценка локализации транспортированного и синтезированного TERT-SNAP в митохондриях

3.6. Не специфическая окраска SNAP-SiR после инкубации с перекисью

3.6.1. Количественная оценка детектируемого уровня TERT-SNAP

3.7. Синтез TERT-SNAP в митохондрии на разных временах

Глава 4. Основные выводы работы

Опубликованные работы по теме диссертации

Благодарности

Список литературы

Список сокращений

АТФ - Аденозинтрифосфат

OXPHOS - Oxidative phosphorylation, окислительное фосфорилирование NAD - Nicotinamide adenine dinucleotide, никотинамидадениндинуклеотид MTS - Mitochondrial Targeting sequence, митохондриальная целевая последовательность

TERT - Telomerase Reverse Transcriptase, обратная транскриптаза теломеразы

hTERT - Human TERT, TERT человека

RMRP - RNA component of mitochondrial RNA processing endoribonuclease TOM - Translocase of the Inner Membrane, транслоказа внутренней мембраны

TIM - Translocase of the Outer Membrane, транслоказа внешней мембраны SAM - Sorting and assembly machinery, машинерия сортировки и сборки OXA1 - Oxidative assembly protein

MIM - Mitochondrial Import Complex, комплекс импорта митохондрий GFP - Green Fluorescent Protein, зеленый флуоресцентный белок FbFP - Flavine-binding fluorescent protein, флавин-связывающий флуоресцентный белок

LSM - Laser Scanning Microscopy, лазерная сканирующая микроскопия EmGFP - Emerald GFP, изумрудный зеленый флуоресцентный белок MMP - Matrix metalloproteinase, матриксная металлопротеаза

shRNA - Short hairpin RNA, малые образующие шпильки РНК

siRNA - Small interfering RNA, малые интерферирующие РНК

XO - Xanthine Oxidase, ксантиноксидаза

8-oxoG- 8-oxo-7,8-dihydroguanine, 8-оксо-7,8-дигидрогуанин

Введение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Релокация обратной транскриптазы теломеразы под действием окислительного стресса»

Актуальность работы

Теломераза - рибонуклеопротеин эукариотической клетки, чья каноническая функция - удлинение теломер на концах хромосом [1]. Дисфункция теломеров тесно связана со старением, как на клеточном уровне, так и на уровне организма. На клеточном уровне короткие теломеры вызывают активацию клеточного ответа на повреждение ДНК и другим факторам, способствующим старению или апоптозу [2-4]. На уровне организма дисфункцию теломеров связывают с большинством возрастных заболеваний [5]. Короткие теломеры часто наблюдаются у пациентов с такими хроническими заболеваниями как ожирение [6], сахарный диабет второго типа [7], болезнь Альцгеймера [8] и ишемическая болезнь сердца [9].

Функция самой теломеразы тесно связана с ядром, в котором и находятся хромосомы клетки. Однако у белковой субъединицы теломеразы, TERT (Telomerase reverse transcriptase, обратной транскриптазы теломеразы), был открыт ряд других функций, не связанных с ядром [10]. TERT был также обнаружен в митохондриях клетки, где он проявляет активность как обратная транскриптаза [11,12], а также взаимодействует с митохондриальной ДНК [12], при этом защищая её от окислительного стресса [13-15].

Это представление о защитной роли TERT в митохондриях согласуется с тем фактом, что при воздействии окислительного стресса наблюдается его экспорт из ядра [14-16] и повышение уровня TERT в митохондриях [14,15,17]. Однако прямая связь между этими явлениями установлена не была. Остается неизвестным, как именно TERT перераспределяется в митохондрии: имеет ли место при окислительном стрессе транспорт зрелого TERT из ядра, или же синтез нового. Что тесно связано с вопросом о том, какую природу имеет транслокация: посттрансляционную или котрансляционную.

На данный момент методы, которыми ранее исследовалась транслокация TERT в митохондрии под действием окислительного стресса, фокусировались на наличии или отсутствии TERT в митохондриях в принципе, по прямым или косвенным признакам. При этом использовались такие методы как микроскопия с использованием GFP-подобных белков [18], анализ активности TERT методом TRAP (Telomeric repeat amplification protocol - протокол амплификации последовательностей теломер) [14] или вестерн-блот митохондриальных белков [13,19]. Эти методы не позволяют отличить белок, пришедший в митохондрии из ядра, от вновь синтезированного. Следует отметить, что исследование транспорта белков в митохондрии методами флуоресцентной микроскопии, служащей основным методом данного исследования, осложнено тем, что большинство GFP-подобных белков, наиболее часто применяемых в качестве меток, не транспортируются в митохондрии в зрелом виде [20].

Данная работа ставит своей целью понять природу релокации TERT в митохондрии при воздействии окислительного стресса в контексте клеточной регуляции его транспорта и синтеза. Это исследование открывает возможности для изучения ряда механизмов регуляции клеток, таких как системы клеточного ответа на окислительный стресс и митохондриальной системы белкового транспорта.

Основные цели и задачи исследования

Целью работы было установить, происходит ли в условиях окислительного стресса транслокация TERT из ядра в митохондрию или его синтез в митохондрии de novo. Для достижения этой цели требовалось решить ряд промежуточных задач:

• Во-первых, требовалось подобрать флуорофор для создания белка-химеры, при помощи которого будет исследоваться поведение TERT в живых клетках. Данный этап осложнялся тем, что, как впоследствии было установлено, большинство GFP-подобных белков не могут быть транспортированы митохондриальной транспортной системой в матрикс. Таким

образом, пронаблюдать транспорт зрелого TERT, связанного с GFP-подобным белком, при воздействии окислительного стресса на клетку было бы невозможно. Чтобы проверить способность GFP-подобных белков и SNAP-tag выступать в качестве флуоресцентной метки для TERT, требовалось решить ряд промежуточных задач:

о Создать конструкции с этими белками с присоединенным MTS на Оконце.

о Экспрессировать полученные конструкции в Е.СоН и очистить белок. о Отработать процедуру внеклеточной покраски для SNAP-tag. о Отработать процедуру микроинжекции белков.

о Проанализировать способность окрашенных зрелых белков транспортироваться внутрь митохондрии после их инжекции в клетку.

• Во-вторых, когда потенциальный белок-метка был подобран, предстояло провести основной эксперимент с целью установить характер перераспределения TERT. Для этого также требовалось решить ряд промежуточных задач:

о Подобрать используемые красители для SNAP-tag с различимыми

спектром и высокой спецификой. о Создать векторы для трансфекции и трансдукции, создать стабильную

клеточную линию, экспрессирующую белок TERT-SNAP. о Отработать сортинг клеток для повышения уровня экспрессии в

стабильной линии. о Определить концентрацию перекиси водорода, которой следует

вызывать окислительный стресс. о В ходе основного эксперимента также потребовалось провести оценку локализации TERT-SNAP. Необходимо было установить его колокализацию с митохондриями и другими органеллами (в данном случае лизосомами) в клетке после инкубации с перекисью.

• В-третьих, поскольку в ходе работы оказалось, что SNAP-красители показывают значительную неспецифическую окраску, требовалось дать оценку

9

уровню этой неспецифики, и как следствие - чувствительности основного эксперимента.

Научная новизна

В работе впервые было продемонстрировано отсутствие импорта зрелых инжектируемых белков MTS-EmGFP и MTS-FbFP в митохондрии. В то же время была показана возможность импорта инжектированной в клетки метки SNAP-tag, в том числе в связанном с красителем состоянии. Как следствие, показана пригодность использования SNAP-tag в качестве метки для отслеживания для зрелых белков, транспортируемых в митохондрии. Впервые было продемонстрировано отсутствие транспорта TERT-SNAP в митохондрии в эукариотических клетках: трансфицированных HeLa и трансдуцированных НЕК293Т. Впервые обнаружен феномен не специфической окраски SNAP-красителями органелл клетки, подвергшейся инкубации с перекисью, этой не специфической окраске дана количественная оценка. Дана оценка сверху на количество синтезируемого в митохондрии TERT-SNAP в результате воздействия окислительного стресса.

Теоретическая и практическая значимость

Теоретическая значимость работы состоит в исследовании режима релокации TERT в митохондрии при окислительном стрессе. Исследование находятся в контексте научной дискуссии о природе этого явления: является ли это транспортом зрелого или синтезом нового белка в ответ на стресс? Полученные результаты в рамках конфигурации эксперимента данные исключают первый вариант - транспорт. В то же время, результаты устанавливают количественные рамки для синтеза белка - ограничения, которые не соответствуют некоторым оценкам, основанным на данных из литературы по этой теме.

Практическая значимость состоит в разработке методов микроинжекции, которые могут быть использованы для наблюдения за поведением заведомо

зрелых белков внутри клетки. Другим практическим результатом был подбор флуоресцентных меток для белка, импортируемого в митохондрии: была показана пригодность для этих целей SNAP-tag - как в предварительно окрашенном виде, так и окрашиваемом внутри живых клеток, а также непригодность EmGFP (предположительно всех GFP-подобных белков, из-за их бета-бочкообразной структуры) и FbFP. Была выявлена неспецифическая окрашиваемость клеток SNAP-tag красителями после инкубации их с перекисью водорода, что является существенным ограничением применимости SNAP-tag в микроскопии, и в то же время может иметь потенциальные применения в медицине.

Положения, выносимые на защиту

1. Неспособность MTS-EmGFP и MTS-FbFP к импорту в митохондрии в зрелом виде. Непригодность EmGFP и FbFP в качестве меток для изучения перераспределения зрелого белка в митохондрии.

2. Способность зрелого MTS-SNAP-tag к импорту в митохондрии, в том числе в связанном с красителями состоянии. Пригодность SNAP-tag в качестве флуоресцентной метки для анализа перераспределения зрелого белка, транспортируемого в матрикс митохондрий.

3. Отсутствие транспорта зрелого белка TERT-SNAP из ядра в митохондрии при инкубации клеток в 500 мкМ перекиси водорода на временах инкубации до 3 ч. Результат показан как на трансфицированных клетках HeLa, так и на стабильно экспрессирующих HEK293T.

4. Наличие не специфической окраски клеток красителем SNAP-SiR после инкубации клеток с перекисью водорода.

5. Установлена относительная верхняя граница уровня синтезированного de novo TERT-SNAP в митохондриях при инкубации клеток в 500 мкМ перекиси водорода на временах инкубации до 3 ч, составляющая % ядерной концентрации белка.

Степень достоверности и апробация результатов работы

Результаты проделанной работы опубликованы в 5 научных журналах, индексируемых в Web of Science, Scopus и РИНЦ. В одной из этих статей, опубликованной в журнале Scientific Reports, исполнитель диссертационной работы является первым автором. Также результаты были представлены на 7 научных конференциях.

Структура диссертационной работы

Диссертация состоит из введения, трех глав, разделенных на подглавы, и заключения.

Первая глава - литературный обзор, состоящий из трех подразделов: обзора роли митохондрий в клетке и транспорта белков в них; обзора роли теломеразы и её обратной транскриптазы TERT в клетке, в частности в контексте функций последней в митохондриях; и обзора принципов воздействия окислительного стресса на клетку.

Вторая глава - описание материалов, методов и оборудования, использованного в работе. Приведены протоколы и реактивы, используемые для методов генной инженерии, экспрессии и очистке белков в E.Coli, ведении клеточных культур, создании транзиентной и стабильно экспрессирующей культур HeLa и HEK293T соответственно. Приведены используемые методы микроинжекции, флуоресцентной микроскопии и методы обработки полученных данных.

Третья глава - описание результатов, выносимых на защиту. Приведены результаты экспериментов по подбору флуоресцентных меток для TERT, в частности красителей для SNAP-tag; определению подходящей концентрации перекиси для вызывания окислительного стресса; эксперименты по обнаружению транспорта и синтеза TERT в митохондрии, а также сопутствующие контроли.

Заключение - выводы работы и список опубликованной литературы.

Объем диссертации составляет 162 тыс. знаков, включая 105 библиографических ссылок, а также 51 иллюстраций и 4 таблицы.

Глава 1. Литературный обзор

1.1. Роль митохондрии в клетке

Митохондрии - органеллы эукариотической клетки, производящие АТФ. В здоровой клетке они представляют собой пронизывающую всю клетку сеть, находящуюся в процессе постоянного деления и слияния [21]. Митохондрии состоят из двух компартментов, разделенных двумя мембранами: матрикса и межмембранного пространства. Внутренняя мембрана состоит из множества складок, называемых кристами [22].

Производство АТФ в митохондриях обеспечивается

окислительно-фосфорилирующей системой (OXPHOS). В матриксе митохондрии происходит синтез NADH, метаболитами для которого выступают NAD в ходе цикла Кребса, а также жирные кислоты, аминокислоты и нуклеотиды в случае иных метаболических путей. NADH затем метаболизируется в NAD респираторными комплексами I-IV, находящимися на внутренней мембране. В ходе этого процесса комплексы транспортируют H+ из матрикса в межмембранное пространство, создавая таким образом протонный градиент на внутренней мембране митохондрии. Этот протонный градиент обеспечивает работу АТФ-синтазы - группа ферментов, находящихся на внутренней мембране. Этот белковый комплекс переносит протоны через мембрану в матрикс по градиенту, и фосфорилирует АДФ до АТФ. АТФ же транспортируется в клетку через внешнюю мембрану митохондрии, где служит основной энергетической единицей клетки [23].

Митохондрии содержат в себе кольцевую ДНК, кодирующую некоторые митохондриальные белки. Однако, большая часть белков митохондрии синтезируется не самой митохондрией, а клеткой-хозяином. Митохондрии человека содержат свыше 1500 белков, однако кодируют только 37 из них [24]. Такое состояние митохондрии объясняется теорией симбиогенеза, согласно

которой клетка протеобактерии была поглощена предком современных эукариотических клеток [25]. Эта теория подтверждается рядом черт митохондрий: двойной мембраной, которые при том имеют разный липидный состав, наличием и кольцевой формой генома митохондрии, наличием собственной рибосомы прокариотического типа, отличной от таковой в ядре эукариотической клетки.

Таким образом, митохондрия зависит от собственной системы транспорта и сортировки белков, синтезируемых в цитоплазме клетки. Подробнее эти системы будут разобраны в следующей главе.

1.1.1. Транспорт белков в митохондрию

Для белков, транспортируемых в митохондрию, существуют 4 возможных цели для транспорта: матрикс, межмембранное пространство, внешняя и внутренняя мембраны. Белки, ответственные за транспорт и сортировку называют транслоказами. Всего таких белков около 40, и они организованы в 10 белковых комплексов на внешней и внутренней мембране митохондрии [26].

На данный момент известно 5 путей, по которым белки транспортируются в митохондрию.

Первый путь предполагает транспорт белка, обладающего N-концевой сигнальной последовательностью, через внешнюю и внутреннюю мембрану митохондрии в матрикс через TOM и TIM-комплексы. В некоторых случаях после этого таргетируемый белок может встраиваться во внутреннюю мембрану митохондрии посредством взаимодействия с белком OXA1, расположенного на внутренней мембране [27]. Также возможно интернирование белка в мембрану на стадии транслокации через TIM-комплекс.

Второй путь предполагает транспорт белков на внутреннюю мембрану посредством транспорта через TOM комплекс на внешней мембране в межмембранное пространство. После этого белок интернализуется во

14

внутреннюю мембрану при помощи Т1М22-комплекса. В отличие от первого пути, сигналом в этом случае служит не N-концевая последовательность, а внутренние гидрофобные сигнальные элементы белка [28].

При транспортировке по третьему пути белок встраивается во внешнюю мембрану митохондрии. Белки, транспортируемые таким образом, имеют форму ß-бочонка. Вначале целевой белок транспортируется в межмембранное пространство через TOM-комплекс на внешней мембране. Затем белок встраивается во внешнюю мембрану посредством взаимодействия с комплексом SAM, находящимся на внешней мембране [29].

Четвертый механизм предполагает таргетирование белка в межмембранное пространство митохондрии. При этом белок транспортируется через TOM-комплекс. Сигналом для этого пути служат цистеиновые мотивы [30].

Пятый путь предполагает транспорт белков, содержащих несколько трансмембранных а-спиралей, на внешнюю мембрану митохондрии. В этом случае, в отличие от всех остальных путей, весь TOM комплекс не задействуется целиком. Целевой белок взаимодействует только с одним его белком - Tom70, а также комплексом MIM внешней мембраны митохондрии [31,32].

В контексте данной работы особый интерес представляет только путь транспортировки, при котором таргетируемый белок попадает в матрикс митохондрии, то есть первый путь. Потому его механизмы будут разобраны более подробно.

1.1.2. Транспорт в матрикс митохондрии

Как было описано выше, белки, транспортируемые по первому пути, обладают N-концевой сигнальной последовательностью. Эта последовательность распознаётся TOM-комплексом на внешней мембране митохондрии. Распознанный белок переносится через TOM-комплекс в межмембранное пространство. Затем он транслоцируется через комплекс TIM23 через

15

внутреннюю мембрану. На этом этапе белок, таргетируемый на внутреннюю мембрану, может быть перенесен на мембрану путем латерального раскрытия комплекса TIM23/Mgr2 [33]. Возможен также другой путь транспорта белка на внутреннюю мембрану. Белок, транспортированный в матрикс, встраивается в мембрану с помощью инсертазы OXA1 [27]. Однако в контексте данной работы интерес представляет транспорт именно внутрь матрикса митохондрии.

1.1.3. Посттрансляционный и котрансляционный транспорт

Транспорт белков в матрикс митохондрии возможен двумя способами: посттрансляционным и котрансляционным. В первом случае белок вначале полностью синтезируется внутри цитозоли клетки, а затем транспортируется через TOM/TIM комплексы на внешней и внутренней мембранах соответственно. Во втором случае белок проходит через TOM/TIM комплексы ещё на стадии синтеза полипептидной цепи [34]. Белок во время синтеза при таком транспорте частично находится внутри митохондрии, в то время как рибосома, синтезирующая его, находится в цитоплазме. Механизмы, задействованные при данных видах импорта, будут разобраны более подробно.

1.1.3.1. Посттрансляционный импорт

Ранее весь импорт белков в митохондрии считался посттрансляционным, поскольку большинство исследований in vitro показали, что белок способен импортироваться в изолированные митохондрии. Эти исследования заложили основу для представления о том, что большинство митохондриальных белков импортируется после трансляции, требуя помощи различных цитозольных факторов и шаперонов, чтобы поддерживать белки в состоянии, пригодном для импорта [35].

Несколько исследований in vivo подтвердили механизм посттрансляционного импорта. Например, восстановление мембранного потенциала митохондрий после его диссипации с помощью разобщающих агентов, таких как CCCP, позволило импортировать накопившиеся в цитозоле

предшественники белков, демонстрируя, что процесс импорта может возобновиться посттрансляционно, как только будут восстановлены соответствующие условия [36].

Белки, транспортируемые в митохондрии, обычно синтезируются в цитозоле и требуют специальных шаперонов, таких как Hsp70/Hsc70 и Hsp90, чтобы поддерживать их в несвернутом, пригодном для импорта состоянии [37]. Это является необходимым условием для дальнейшего транспорта белков митохондриальной транспортной машинерией.

Такие белки распознаются специальными импортными рецепторами на поверхности митохондрий. Эти рецепторы, такие как Mas70p в дрожжах, связываются с сигнальными последовательностями белков, которые обычно расположены на амин-концевом участке. Рецепторы облегчают начальную посадку предшественников на поверхность митохондрий, подготавливая их к транслокации через внешнюю и внутреннюю мембраны. После чего белки транслоцируются через TOM/TIM комплекс, расходуя АТФ [36,38].

Далее путь белка зависит от того, в какую именно часть митохондрии он транспортируется. При импорте белков в матрикс митохондриальный Hsp70 (mHsp70) также взаимодействует с белками, предотвращая их возврат назад и обеспечивая окончательный импорт в матрикс. Это взаимодействие сопровождается гидролизом АТФ, способствуя высвобождению и последующему сворачиванию таких белков в матриксе [36].

1.1.3.2. Котрансляционный импорт

Известны два гипотетических механизма котрансляционного импорта белка в митохондрии. Первый предполагает регуляцию транспорта на уровне незрелой, не полностью синтезированной полипептидной цепи. Второй - ещё до синтеза полипептидной цепи, на уровне мРНК.

В первом случае трансляцинный комплекс, состоящий из мРНК, рибосомы и синтезируемого белка, связывается с TIM/TOM комплексом, и белок синтезируется вовнутрь митохондрии. Сигналом для этого служит полипептидная

митохондриальная целевая последовательность (MTS - mitochondrial targeting sequence). Исследования показывают, что MTS узнается на внешней мембране митохондрии рецепторами Tom20 и Tom22 [39], являющимися частью TOM-комплекса. Затем MTS переносится TOM-комплексом на другую сторону мембраны, где взаимодействует вначале с белком Tom40, а затем с TIM23 -транслоказой внутренней мембраны [40].

Считается, что ключевые роли в процессе транспорта по этому пути играют комплекс NAC (Nascent Polypeptide-Associated Complex), а также шапероны Hsc70 (Heat Shock Cognate) и MSF (Mitochondrial Import Stimulating Factor). NAC выполняет защитную функцию для синтезируемого рибосомой полипептида, предотвращая его взаимодействие с другими цитозольными белками [34]. Hsc70 обеспечивает нахождение белка до транспортировки в митохондрию в развернутой конформации. Роль MSF в этом процессе не вполне ясна, однако установлено, что он связывается с синтезируемым белком и остается связанным с ним, пока пептид не начнет взаимодействовать с митохондриальным транспортным аппаратом [41].

Другой механизм предполагает регуляцию котрансляционного транспорта на стадии мРНК. Сигналом в этом случае служит не полипептидная цепь белка, а мРНК, на основе котрой он синтезируется. Сигнальные мРНК последовательности, называемые ZIP-кодами, не обладают каким-либо сходством в их последовательности рибонуклетоидом. Считается, что определяющим фактором для них является вторичная структура мРНК, конкретно то, что она образует шпильку [42-44]. Также установлено, что данный ZIP-сигнал обычно лежит в 3'-нетранслируемой области мРНК [45].

Белки, которые обеспечивают узнавание и транспорт РНК к митохондриям, известны не все. Однако был идентифицирован один такой белок - Staufen, необходимый для митохондриальной локализации РНК в Drosophila [46].

Поскольку было показано, что ингибиторы цитоскелета блокируют локализацию мРНК, считается, что механизм её транспорта выглядит следующим образом [47,48]. Вначале формируется мРНК-белковый комплекс. При этом

18

мРНК-ассоциированные белк связываются с ZIP-сигналами на мРНК. Затем этот комплекс связывается с цитоскелетом и транспортируется по ним к цели. После чего он связывается с локлаьными белками на поверхности органеллы [34].

Точный механизм связывания транскриптома с митохондрией на данный момент неизвестен. Показано, что с 3'UTR-фрагментом мРНК могут связываться белки семейства Puf. Puf1p и Puf2p взаимодействуют с мРНК, кодирующей белки, ассоциированные с мембранами. Puf3p связывается с мРНК митохондриальных белков. Puf4p - с мРНК, кодирующей ядерный транскрипционные рибосомальные факторы. Puf5p - с мРНК, кодирующей модификаторы хроматина [49]. Было установлено, что из белков этого семейства только Puf3p сам локализован на цитозольной стороне внешней мембраны митохондрии [50]. При том уровень этого белка в митохондриях меняется в зависимости от метаболизма в них, потому можно предположить наличие у него функции как регулятора транспорта в митохондрии [50].

1.2. Роль TERT в клетке

Теломераза - это фермент эукариотической клетки, основной функцией которого является удлинение структур хромосомы, называемых теломерами. Теломеры - это концевые участки хромосом, состоящие из коротких повторяющихся участков ДНК. При каждом делении клетки хромосома укорачивается на концах. Таким образом, клетки начинают умирать после определенного количества делений, называемого пределом Хейфлика [51]. Некоторые клетки - например половые или раковые - способны обходить это ограничение за счет ферментативной активности теломеразы в ядре, поддерживающей длину теломер.

Теломераза - это рибонуклеопротеин, состоящий из двух основных субъединиц: белковой - TERT, и РНК-субъединицы - TERC. Ген TERT кодирует белковую субъединицу, обратную транскриптазу теломеразы (Telomerase reverse transcriptase - TERT). Она является каталитической субъединицой теломеразы.

Тем не менее, ряд работ показывает, что удлинение хромосом является не единственной функцией TERT. Ряд экспериментов указывает на то, что TERT участвует в сигнальном пути Wnt, регулирующим эмбриогенез и дифференцировку клеток [52]. При том имеет место двусторонее влияние TERT и белков Wnt-пути: TERT активирует Wnt-зависимые репортеры, взаимодействуя с SMARCA4 - белком комплекса SWI/SNF, ремоделирующего хроматин. В то же время, экспрессия TERT регулируется белком Wnt-пути бета-катенином [53], что в совокупности указывает на тесную связь TERT с Wnt-сигнальным путем в целом. Также установлено, что TERT способен взаимодействовать с митохондриальной эндорибонуклеазой ЯМЯР [11]. При определенных концентрациях металлических ионов TERT может проявлять ферментативную активность вообще без использования РНК в качестве шаблона. Показано, что при высокой концентрации ионов магния TERT проявляет активность терминальной ДНК-трансферазы [54], хотя значимость этой активности в клетке пока неизвестна.

Как следует из приведенных выше примеров, TERT может присутствовать не только в ядре клетки, но и в митохондриях. Кроме активности, связанной с ЯМЯР, TERT выполняет в митохондриях ряд других функций. При определенных условиях TERT локализуется в матриксе, где связывается с митохондриальной ДНК и защищает её от от повреждений, вызванных окислительным стрессом [13,55]. Предположительно, TERT перераспределяется из ядра в митохондрии в ответ на окислительный стресс [14,15].

1.2.1. Реструктурирование хроматина

Кроме функции по поддержанию длины теломер хромосомы, теломераза также выполняет функции по её реструктурированию. Было показано, что подавление экспрессии hTERT лишает клетку способности реагировать на двойной разрыв цепи ДНК. Потеря hTERT не приводит к потере целостности хромосомы, однако в долгосрочной перспективе приводит к нарушениям

структуры хроматина. Клетки с нокаутированным TERT становятся более восприимчивыми к радиационным повреждениям, имеют пониженную способность к репарации ДНК и фрагментированные хромосомы [56].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Буркатовский Дмитрий Сергеевич, 2024 год

- r J -

0-% X

я i 1 'л

V

Щ к. щ' 1 V/ у

а *■»' Щ

*

Рисунок 34. Транспорт в митохондрии инжектированного MTS-SNAP-tag, окрашенного SNAP Atto-549. Atto-549 обозначен циановым, MitoTracker обозначен маджентой.

о го

о чо

МТ5-5ИАР 1^014 МКоТгаскег

МТБ-БМАР КЬо14

M¡toTracker

* "ч

г к

¡4 —Ч г * 1 т /

Зркг-эг

Рисунок 35. Транспорт в митохондрии инжектированного MTS-SNAP-tag, окрашенного Rho14. Rho14 обозначен циановым, MitoTracker обозначен маджентой.

т о

Л"

in

<4

J" Ln

MTS-SNAP TMR-Star MitoTracker

MTS-SNAP TMR-Star

MitoTracker

Vr'W w- / '* AT т . ... i ^МУЦ^-^ v % Шу/ / ■ /*-.< > J ■t ■ z*^' *r~. 'Л ■ " Я,3' i

Mi ч Ч i' Л^«-« % Л'* / п-чНУЖйшг! ^рнр . '' ч x. ^ ■ у У 'й. J • ' ;;' J, " -^if :

- . у ; V .

- •«fiiM.'^U ф,^ ? - ' 'V^irl j. if , " i x* / -Ч-. - £?- - ■ I ^ v - «i*v ■ н 4 -» ' 7 1 'Ь- £> Л ¿¿rW ■■ - .. liiS* / ■"■*•*• > '»A.1 .%v >», ft--

Рисунок 36. Транспорт в митохондрии инжектированного MTS-SNAP-tag, окрашенного SNAP TMR-Star. TMR-Star обозначен циановым, MitoTracker обозначен маджентой.

Таким образом, SNAP-tag является белком, который можно использовать в качестве флуоресцентной метки для TERT, поскольку он может быть транспортирован внутрь митохондрии, в том числе с флуоресцентной меткой, при том как в зрелом виде, так и будучи синтезирован клеткой de novo.

3.2. Подбор красителей для SNAP-tag

Для проведения экспериментов с покраской клеток, производящих белок со SNAP-tag, необходимо было подобрать красители, подходящие для эксперимента. Основными требованиями, предъявляемыми к красителям, являлись:

• Мембранная проницаемость

• Высокий сигнал специфической покраски

• Низкая способность неспецифического связывания в клетке

• Различимые спектры для двух красителей

Были проведены тесты на клетках HEK293T, экспрессирующих MTS-SNAP-tag. Специфичность покраски оценивалась по яркости митохондрий и цитозоли. Эксперимент был проведен для следующих мембранно проницаемых красителей: SNAP-SiR 647, SNAP-TMR-Star, SNAP-430, SNAP-505 и SNAP-Oregon Green (Рисунок 37). Из всего списка лучшие результаты показали SNAP-SiR 647, SNAP-505 и TMR-Star. SNAP-430 имел неприемлемо высокий уровень не специфического окрашивания. Уровень неспецифики Oregon Green был ниже, но и специфическая окраска митохондрий оказалась слабой. SNAP-505 показал результаты лучше TMR-Star и по специфичности, и по уровню фона, однако митохондрии в окрашенных клетках были более раздробленными, что свидетельствует о том, что клетки находятся в стрессе. Предположительно, этот краситель сильнее влияет на здоровье клеток, потому в ранних в экспериментах было отдано предпочтение TMR-Star.

Рисунок 37. Тесты красителей для SNAP-tag на клетках HEK293T, трансфицированных pcDNA MTS-SNAP. Оценивались красители SNAP-SiR 647, SNAP-TMR-Star, SNAP-430, SNAP-505 и SNAP-Oregon Green.

3.3. Определение используемой концентрации H2O2

Наиболее часто в работах, посвященных транспорту TERT в митохондрии, окислительный стресс вызывается инкубацией клеток в среде, содержащей перекись в концентрации 200-500 uM [85]. Однако концентрация перекиси в среде и в клетках может отличаться. Чтобы убедиться, что на данных концентрациях окислительный стресс действительно имеет место, был проведен ряд контрольных экспериментов с использованием DCF (2',7'-dichlorofluorescein) и MitoSOX Red.

3.1. Контроль с помощью DCF

DCF - клеточный маркер окислительного стресса. Это соединение обретает флуоресцентные свойства при последовательном выполнении двух условий: расщеплении клеточными эстеразами липофильных блокирующих групп и окислении. Первое условие обеспечивает то, что DCF не будет активирован окисляющими агентами в среде до попадания в клетку. К тому же, расщепление сопровождается появлением у молекулы DCF заряда, что мешает её проникновению через клеточные мембраны. Как следствие, DCF остается в том же клеточном компартменте, в котором был расщеплен [103-105].

В первом эксперименте клетки, высаженные в лунки 8-луночного планшета, были инкубированы с DCF, а затем с перекисью в различных концентрациях. Через 30 минут и через 2 часа клетки были отсняты на микроскопе в режиме LSM.

Результаты эксперимента подтверждают, что на концентрациях около 200-500 uM клетки находятся под воздействием окислительного стресса (Рисунок 38). Дальнейший рост концентрации перекиси не ведет к значительному повышению сигнала DCF внутри клеток, вплоть до 5 мкМ. Однако такая концентрация уже смертельна для клеток.

Рисунок 38. Сигнал DCF при различных концентрациях перекиси. Яркость сигнала в клетках соответствует активности процессов окисления в клетке.

3.2. Контроль с помощью MitoSOX

Результаты эксперимента были подтверждены методом проточной цитометрии. Для этого открепленные клетки инкубировались 30 минут в средах с различной концентрацией перекиси, а затем, после отмывки с помощью PBS, инкубировались 30 минут с MitoSOX. MitoSOX - это специфический к митохондриям маркер окислительного стресса, высоко специфичный к супероксиду (O2-).

Результаты эксперимента согласуются с экспериментом с DCF. Поскольку этот эксперимент проводился на значительно меньших концентрациях перекиси, был обнаружен следующий эффект. При росте концентрации от 0 до 500 uM рост среднего сигнала MitoSOX достигается во многом за счет повышения процента популяции клеток, излучающих значительно сильнее контрольной популяции (0 uM H2O2). Иначе говоря, не все клетки при концентрациях ниже 500 uM, затронуты окислительным стрессом, и их доля в популяции растет с ростом концентрации перекиси (Рисунок 39).

1.1000 цМ Н2О2

2. 500 цМ Н2О2

3. 200 цМ Н2О2

4.100 цМ Н2О2

5. 50 (JM Н2О2

6. 0 цМ Н2О2

7. Без MitoSOX

Создано при помощи онлайн-инструмента: https://floreda.io/

FL-2

Рисунок 39. Контрольный эксперимент с MitoSOX Red.

Можно также отметить, что яркость затронутых окислительным стрессом клеток также растет по мере увеличения концентрации перекиси, что свидетельствует о повышении уровня окислительного стресса в них. Хотя выводы о его количественном изменении сделать не представляется возможным ввиду возможной нелинейности отклика сигнала MitoSOX на супероксид.

Таким образом, для дальнейших экспериментов была использована концентрация 500 мкМ, поскольку все клетки в контрольном эксперименте затронуты окислительным стрессом, а также потому что в литературе на ней показано повышение активности TERT в митохондриях [14].

3.4. Транспорт TERT-SNAP в митохондрии

Для наблюдения перехода TERT в митохондрии методом флуоресцентной микроскопии в клетках был использован белок TERT-SNAP. Это химерный белок на основе TERT, к которому с C-конца через линкер длиной в 5 аминокислот прикреплен SNAP-tag (Рисунок 40).

hTERT-SNAP (3960 bp)

CAAGACCATCCTGGACAAGCTTCCGGTCGACATGGACAAAGACTGCGAAATG GTTCTGGTAGGACCTGTTCGAAGGCCAGCTGTACCTGTTTCTGACGCTTTAC 1128 1130 1132 1134 1136 1138 1140 1142 1144 KTILDKLPVDMDKDCEM

hTEKT > Spacer I SNAP

I I I I I I I I I I

3,385 3,330 3,395 3,400 3,405 3,410 3,415 3,420 3,425 3,430

1 500 1 " ,000 1 1 1,500 2.000 1 2,500 3,600 : \ ,500

hTERT-SNAP >

hTERT .1 SNAP у

Рисунок 40. Схема гена TERT-SNAP, используемого в работе. Ген TERT человека и SNAP-tag соединены последовательностью, кодирующий 5-аминокислотный линкер.

Первый эксперимент был проведен на клетках HeLa, транзиентно экспрессирующих TERT-SNAP. Для наблюдения за TERT-SNAP использовался метод лазерной сканирующей флуоресцентной микроскопии. Ожидалось, что если имеет место транспорт TERT в митохондрии при окислительном стрессе, то митохондрии также окрасятся SNAP-SiR после добавления перекиси (Рисунок 41 А). Были проведены наблюдения за перемещением TERT-SNAP при добавлении перекиси по схеме, представленной на рисунке 41 Б.

Рисунок 41. Схема эксперимента по визуализации транспорта TERT-SNAP из ядра в митохондрии при воздействии окислительного стресса. А. Концепция эксперимента: TERT-SNAP изначально находится в ядре клетки, где он помечается специфической к SNAP-tag краской (синяя звезда). После инкубации с 500 мкМ перекиси возможны два сценария: левый, при котором присутствует транспорт зрелого TERT-SNAP, что приводит к окраске митохондрий, и правый, при котором транспорта нет, и при котором митохондрии не окрашиваются. Б. Процедура эксперимента: 1) Покраска SNAP-специфическим красителем. 2) Отмывка. 3) Первая съемка. 4) Добавление перекиси. 5) Вторая съемка.

Эксперимент показал, что TERT-SNAP остается в ядре клетки спустя 3 часа инкубации с перекисью (Рисунок 42 А). При этом часть клеток открепилась в ходе эксперимента, можно связать со стрессом, который они претерпевали в ходе

трансфекции, покраски и инкубации с перекисью. Для того, чтобы исключить первый из этих факторов, было решено провести аналогичный эксперимент на клеточной культуре, стабильно экспрессирующей TERT-SNAP.

На основе HEK293T была создана культура HEK293T TERT-SNAP, стабильно экспрессирующих белок TERT-SNAP. Клетки были окрашены красителем 505-Star и отсняты перед добавлением перекиси, а также спустя 3 часа инкубации. В результате на всех изображениях клеток HEK293 TERT-SNAP, в отличие от трансфицированных HeLa, наблюдалась окраска неких органелл в клетках помимо ядра (Рисунок 42 Б). При том на контрольном эксперименте на обычных HEK293T окраски таких органелл не наблюдалось (Рисунок 42 В). Природа этих органелл была непонятна, потому было решено провести отдельный эксперимент, чтобы понять, чем эти структуры являются.

Оч

Зч

Оч

Зч

4 S Щ ¡0Ш- • • <ifëv а ' ' V i

» W С Йь- Vt--H ■ * 20 |М

% 1-1 20 рм В. 1-1 20 |Ш

Рисунок 42. Результаты эксперимента по визуализации транспорта TERT-SNAP из ядра в митохондрии при воздействии окислительного стресса. А. Эксперимент на транзиентно трансфицированных клетках HeLa: Клетки окрашены SNAP-SiR (циановый), к среде добавлена перекись до концентрации 500 мкМ. Изображения получены до (слева) и после 3 часов инкубации. Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии транспорта через 3 часа после добавления перекиси. Б. Эксперимент на стабильно экспрессирующих белок TERT-SNAP клетках HEK293T: Клетки были окрашены 505-Star (циановый), к среде добавлена перекись до концентрации 500 мкМ. Изображения, полученные до (слева) и после 3 часов инкубации свидетельствуют об отсутствии транспорта через 3 часа после добавления перекиси. В. Контрольная покраска на клетках HEK293T. Параметры эксперимента совпадают с таковыми в (Г). Изображения слева и справа соответствуют одной позиции, но слева представлено изображение во флуоресцентном канале, справа - в широкопольном.

3.4.1. Локализация TERT-SNAP в клетках HEK293 TERT-SNAP

Целью нового эксперимента было установить колокализацию внеядерных

структур, в которых находится TERT-SNAP в культуре HEK293 TERT-SNAP. Для

этого клетки HEK293 TERT-SNAP были окрашены красителем 505-Star, а также

99

красителями для митохондрий и лизосом - MitoTracker DeepRed и LysoTracker Red DND-99. Методом лазерной сканирующей микроскопии были получены изображения клеток перед добавлением перекиси, а также спустя 2 часа инкубации (Рисунок 43). По этим изображениям рассчитывалась степень колокализации TERT-SNAP с MitoTracker и LysoTracker методом подсчета коэффициента корреляции Пирсона между яркостью каналов. Коэффициент корреляции Пирсона для TERT-SNAP с MitoTracker составил -0,01 перед добавлением перекиси и 0,05 через 2 ч инкубации, а для TERT-SNAP с LysoTracker - 0,46 перед добавлением перекиси и 0,47 через 2 ч инкубации. Таким образом, TERT-SNAP был колокализован с лизосомами, но не с митохондриями как сразу после добавления перекиси, так и спустя 2 часа инкубации.

TERT-SNAP (505-Star)

MitoTracker Deep Red

TERT-SNAP (505-Star)

LysoTrackcî 3ed DND-S9

TERT-SNAP (505-Star) MitoTracker Deep Red

,4'äh r V-t'. **

Рисунок 43. Колокализация TERT-SNAP с MitoTracker и LysoTracker до и после 2 часов инкубации с перекисью. Клетки HEK293T TERT-SNAP были окрашены 505-Star (циановый), LysoTracker (желтый) и MitoTracker (магента). Приведены изображения с различными сочетаниями каналов этих красителей. Для TERT-SNAP (505-Star) с Lyso- и MitoTracker также приведены профили распределения яркости на соответствующих двухканальных изображениях: TERT-SNAP с LysoTracker (2я колонка) и TERT-SNAP с MitoTracker (3я колонка). Профили получены при помощи плагина ColocThreshold, FIJI. На профилях ось абсцисс отражает яркость канала 505-Star, ось ординат - яркость канала LysoTracker и MitoTracker соответственно. Цветовая кодировка отражает количество пикселей с соответствующим сочетанием яркостей. Масштаб по оси абсцисс был увеличен в 4 раза для улучшения визуального восприятия.

3.5. Синтез TERT-SNAP в митохондрии

Чтобы понять, синтезируется ли TERT в митохондрии ne novo в ответ на окислительный стресс, были проведены эксперименты с дополнительным шагом покраски TERT-SNAP после инкубации с перекисью (Рисунок 44). В этих экспериментах клетки, экспрессирующие TERT-SNAP (как стабильно, так и транзиентно) были покрашены как до инкубации с перекисью - чтобы также

иметь возможность отслеживать старый TERT - так и после инкубации с H2O2 -чтобы окрасить TERT, синтезируемый в результате воздействия окислительного стресса на клетку. Дополнительно, весь не окрасившийся SNAP-tag после первой покраски был заблокирован при помощи SNAP-Block. Вторая окраска производилась при помощи отличной по спектру от первой краски.

Аналогично описанным выше экспериментам, если зрелый TERT транспортируется в митохондрии, флуоресцентный сигнал в митохондриях от первого красителя (конкретно использовались TMR-Star для транзиентно трансфицированных HeLa, и 505-Star для стабильно экспрессирующих HEK293T TERT-SNAP), добавленного перед инкубацией с перекисью, увеличится. Если митохондриальный TERT экспрессируется de novo в ответ на окислительный стресс, в митохондриях будет детектироваться сигнал от второго красителя (SNAP-SiR), поскольку новый синтезируемый TERT-SNAP имел бы свободный, незаблокированный SNAP-tag, способный связаться с красителем.

Рисунок 44. Схема эксперимента по визуализации синтеза TERT-SNAP в митохондрии при воздействии окислительного стресса. А. Концепция эксперимента: до воздействия окислительного стресса TERT-SNAP находится в ядре клетки, где он помечается первым красителем для SNAP-tag (синяя звезда). Оставшийся SNAP-tag блокируется при помощи SNAP-block. Затем клетки инкубируются в среде с 500 мкМ перекиси. Изображены два потенциальных исхода: слева случай, в котором TERT-SNAP транспортируется в митохондрии, что приводит к наличию в них белка с первым красителем и соответствующей их окраске; справа - в котором TERT-SNAP синтезируется de novo, и потому зрелый, окрашенный первым красителем TERT-SNAP в них не перемещается. А новый синтезированный TERT-SNAP на заблокирован и способен окраситься 2м красителем, потому и митохондрии обретают соответствующий ему цвет. Б. Процедура эксперимента: 1) Покраска 1м красителем. 2) Обработка клеток SNAP-Block. 3) Отмывка. 4) Первая съемка. 5) Добавление перекиси. 6) Покраска 2м красителем после инкубации. 7) Отмывка. 8) Вторая съемка.

Как и в экспериментах с одним красителем, изначально TERT преимущественно локализован в ядре, и при инкубации с перекисью старый TERT из ядра в митохондрии не перемещается. Также в обоих экспериментах после инкубации (3 часа для HeLa и 4 часа для НЕК293Т TERT-SNAP) вторым красителем окрашиваются цитозоль и органеллы клетки. Однако эта окраска в одинаковой степени затрагивает как клетки, продуцирующие TERT-SNAP (подвергшиеся окраске первым красителем), так и не продуцирующие (Рисунок 45). Визуально на её фоне не наблюдается появления второго красителя в митохондриях.

А. 1 Б.

Оч 3 ч 0ч 4ч

Тт^аг Тт^аг 505-51аг 505-Б1аг

, \JjHl ф

<

3 ч 3 ч 4ч 4ч

БМАР-БН? Тт^аг 5ЫАР-51К 505-Б1аг

БМАР-БШ БМАР-51В

I ... 1 1

1 20 рм 1 1 20 рм

Рисунок 45. Схема эксперимента по визуализации синтеза TERT-SNAP в митохондрии при воздействии окислительного стресса. А. Эксперимент на транзиентно трансфицированных HeLa. Б. Эксперимент на клетках НЕК293Т, стабильно экспрессирующих TERT-SNAP.

Результаты данных экспериментов поднимают вопросы о природе полученных данных. Во-первых, необходимо было количественно подтвердить отсутствие локализации TERT-SNAP в митохондриях - как транспортированного, так и синтезированного. Во-вторых, требовалось понять, действительно ли пониженная специфичность покраски в экспериментах является закономерным последствием инкубации клеток с перекисью, а также дать количественную оценку меры этой неспецифичности.

3.5.1. Локализация TERT-SNAP в митохондриях

Чтобы убедиться в том, что TERT-SNAP не локализуется в митохондриях ни при первой, ни при второй покраске, эксперимент был повторен на трансфицированных клетках HeLa, с дополнительным шагом окраски митохондрий при помощи MitoTracker Orange (Рисунок 46). Клетки HeLa были выбраны намеренно, поскольку они не имели явной локализации TERT-SNAP в митохондриях. Для мечения TERT-SNAP до и после инкубации с перекисью были использованы красители SNAP-505 и SNAP-SiR соответственно.

ш

о о го т

о

го т

со

Рисунок 46. Визуализация синтеза TERT-SNAP в митохондрии при воздействии окислительного стресса. Клетки дополнительно окрашены MitoTracker Orange.

Результаты эксперимента хорошо согласуются с предыдущими: не видно какой-либо значительной колокализации SNAP-505 или SNAP-SiR с МйоТгаскег. Чтобы подтвердить эти наблюдения, их локализация была измерена количественно.

3.5.2. Количественная оценка локализации транспортированного и синтезированного TERT-SNAP в митохондриях

Для количественной оценки уровня красителей в клеточных компартментах в предыдущем эксперименте использовалась процедура, представленная на рисунке 47. Для каждой клетки в моменты 0 и 3 часа выделялась область митохондрий, выбираемая путем выделения участка с ярким сигналом МйоТгаскег. В этой области измерялся средний сигнал от красителей. Для каждой высчитывалось соотношение сигнала в митохондриях к сигналу в цитозоли.

Рисунок 47. Визуальная схема принципа обработки изображений для количественной оценки уровня TERT-SNAP в митохондриях до и после окислительного стресса.

Соотношение сигналов митохондрии к цитозоли для красителя SNAP-505 сравнивалось в момент 0 и 3 часа. В среднем по клеткам это значение меняется незначительно (Таблица 3). Хотя абсолютное значение сигналов в митохондриях и цитозоли значительно снижается, это можно связать с выгоранием красителя или оборотом белка в клетке. Таким образом, количественная оценка подтверждает тезис об отсутствии транспорта зрелого TERT-SNAP в митохондрии.

До инкубации После инкубации

Митохондрии Цитозогь Митохондрии/ цитоэоль Митохондрии Цитоэоль Митохондрии/ цитоэоль Соотношение до инкубации/ Соотношение после инкубации

#1 36,77 27,33 1,35 8,72 5,76 1,51 1,13

#2 40,58 32,20 1,26 17,91 14,57 1,23 0,98

#3 15,04 10,54 1,43 11,86 8,60 1,38 0,97

#4 41,08 27,55 1,49 17,87 14,09 1,27 0,85

#5 29,95 23,01 1,30 15,32 12,27 1,25 0,96

Среднее изменение соотношения (до инкубации/после инкубации): 0,98

Среднеквадратическое отклонение изменения соотношения (до инкубации/после инкубации): 0,10

Таблица 3. Изменение сигнала SNAP-505 после инкубации клеток с перекисью.

Соотношение сигналов митохондрии к цитозоли для красителя SNAP-SiR также было рассчитано, и оказалось значительно больше единицы (вне пределов отклонения). Однако сравнить его с таким же соотношением в другой момент времени для тех же клеток принципиально невозможно, поскольку каждая новая покраска требует новых клеток. Потому вместо этого было проведено сравнение с не экспрессирующими TERT-SNAP клетками, чтобы понять, вызвана ли специфичность сигнала к митохондриям наличием TERT-SNAP в них, или же специфичностью самого красителя SNAP-SiR (Таблица 4).

Трансфицированные клетки, экс премирующие ТЕР,Т-$МАР

Митохондрии Цитозоль Митохондрии/ Цитозоль

#1 54,6 41,9 1,30

#2 57.3 44,4 1,29

#3 70,0 56,3 1,24

#4 56,3 494 1,14

#5 51,9 45,2 1,15

Среднее соотношение сигналов митохондрии к цитозоли: 1,23

Среднеквадратичесгое отклонение сигнала митохондрий к цитозоли: 0,08

Нетрансфицированные клетки

Митохондрии Цитозоль Митохондрии/ Цитозоль

#1 20,1 15,6 1,29

#2 19.1 14,9 1,28

#3 23,6 17,7 1,34

#4 137,4 67,3 2,04

#5 19,6 16,1 1,22

#6 32,2 19,0 1,70

#7 17,1 11,3 1,51

#8 24,9 21,7 1,15

#9 17,0 14,7 1,16

#10 22,3 18,0 1,24

#11 23,3 22,2 1,05

#12 14,7 10,9 1,36

#13 25,9 154 1,68

#14 23,7 21,2 1,12

#15 27,3 22,9 1,19

#16 34,2 24,1 1,42

#17 11,8 8,3 1,34

Среднее соотношение сигналов митохондрий к цитозоли: 1.36

Среднеквадратическое отклонение сигнала митохондрий к цитозоли: 0,25

Таблица 4. Сравнение специфичности сигнала SNAP-SiR к митохондриям в эксперименте на клетках HeLa, экспрессирующих TERT-SNAP, с обычными HeLa.

Сравнение показывает, что специфичность сигнала SNAP-SiR к митохондриям находится в пределах разброса специфичности красителя. Таким образом, TERT-SNAP в митохондриях в детектируемом количестве обнаружить не удалось.

3.6. Не специфическая окраска SNAP-SiR после инкубации с перекисью

Эксперименты с двойной покраской показали, что инкубация с перекисью

влияет на специфичность окраски SNAP-tag. Чтобы определить предельный

уровень TERT-SNAP, который невозможно обнаружить в митохондриях, сначала

109

необходимо оценить характер этой неспецифической окраски и дать ей количественную оценку.

Инкубация с перекисью может влиять на окраску SNAP-красителями двумя способами: вызывать не специфическую окраску клеток SNAP-красителями или предотвращать специфическое связывание SNAP-tag с красителем, модифицируя его активный центр. Для проверки первого способа были взяты два пула клеток HEK293T без SNAP-tag. Один пул был просто окрашен SNAP-SiR, а другой предварительно инкубировался в 500 мкМ перекиси перед окрашиванием SNAP-SiR. Для проверки влияния перекиси на специфическую окраску были проведены аналогичные эксперименты с клетками, продуцирующими TERT-SNAP (HEK293T TERT-SNAP). Результаты показали, что инкубация с перекисью существенно усиливает не специфическую окраску цитозоли в клетках HEK293T (Рисунок 48 А, Б), но не влияет на специфическую окраску ядер в клетках HEK293T TERT-SNAP (Рисунок 48 В, Г).

Рисунок 48. Влияние инкубации клеток с перекисью на специфическую окраску SNAP-красителем. На изображении представлены клетки с разных чашек, каждая из которых была окрашена SNAP-SiR непосредственно перед получением конфокальных изображений. Верхние изображения (А, Б) показывают обычные клетки HEK293T, не продуцирующие TERT-SNAP. Нижние изображения (В, Г) показывают клетки культуры HEK293T TERT-SNAP, часть клеток которой продуцируют TERT-SNAP в ядро (выделены красным пунктиром). Клетки, изображенные слева (А, В), не подвергались влиянию перекиси, в то время как изображенные справа (Б, Г) были инкубированы перед покраской 3 часа в 500 мкМ перекиси.

Чтобы поставить результаты работы в научный контекст, требовалось дать оценку на концентрацию белка TERT-SNAP в митохондриях после воздействия окислительного стресса на клетку. Для этих целей целесообразно сделать её количественное сравнение с таковой в ядре.

3.6.1. Количественная оценка детектируемого уровня TERT-SNAP

Численная оценка соотношения концентрации TERT-SNAP в митохондриях и ядре вычислялась из следующих предпосылок. Во-первых, что сигнал от флуоресцентной метки линейно зависит от концентрации TERT-SNAP. Следовательно, соотношение сигналов равно соотношению концентраций специфически меченного белка TERT-SNAP. Во-вторых, что на фоне сигнала мощностью X от не специфической окраски цитозоли невозможно обнаружить специфический сигнал такой же мощности X от митохондрий. Возможно, что реальный порог несколько меньше, но этого достаточно для оценки. Из этих двух предпосылок следует, что пороговое значение отношения митохондриальной концентрации TERT-SNAP к ядерной равно отношению яркости неспецифически окрашенной цитозоли к яркости специфически окрашенного ядра.

Для вычисления этого значения был проведен эксперимент на большом количестве клеток. Были окрашены и отсняты методом LSM 137 клеток, в 4 биологических повторах, от 28 до 39 клеток в каждом. У каждой из этих клеток вычислялись средние интенсивности сигналов в цитозоли и ядре, высчитывалось их соотношение. В результате в среднем эта величина по всем клеткам составила 0,50 (± 0,26 среднеквадратическое отклонение). Таким образом, оценка сверху на соотношение концентраций TERT-SNAP в митохондрии к концентрации в ядре составляет 0,5.

3.7. Синтез TERT-SNAP в митохондрии на разных временах

Для валидации результатов экспериментов с двойной покраской был проведен дополнительный эксперимент. Его схема, представленная на рисунке 49, схожа с экспериментом с двойной покраской, с одним важным отличием: получение конфокальных изображений клеток проводилась каждые 30 минут, от 0,5 до 3 ч после добавления перекиси. Также, вторичная покраска совмещалась с покраской митохондрий при помощи МйоТгаскег RED-DND99, чтобы дополнительно удостовериться в отсутствии колокализации сигналов красителей с митохондриями. Исходя из этого, результаты для разных времен представлены клетками с разных чашек. Эксперимент проводился только на клетках НЕК293Т TERT-SNAP.

Съемка каждые 30 минут

Рисунок 49. Схема эксперимента по перераспределению TERT в митохондрии на разных временах. 6 чашек с клетками HEK293T TERT-SNAP окрашиваются первым красителем SNAP-505 (циановая звезда), остатки SNAP-tag блокируются SNAP-Block. К клеткам добавляется перекись до концентрации 500 мкМ. Каждые 30 минут одна из чашек забирается, среда с перекисью убирается, производится покраска вначале SNAP-SiR (магентовые звезды), затем MitoTracker RED-DND99 (желтые звезды), производится съемка клеток.

Эксперимент полностью подтверждает результаты предыдущих опытов с двойной покраской клеток, теперь уже на временах от 0,5 до 3 часов (Рисунок 50). Дополнительно, покраска М^^аскет позволила убедиться, что ни первый, ни второй краситель в митохондриях не локализован. Таким образом, ни транспорта, ни синтеза в митохондрии не наблюдается на временах до 3х часов.

30 мин 60 мин 90 мин 120 мин 150 мин 180 мин

Рисунок 50. Изображения клеток, прошедших двойную покраску: до и после инкубации с перекисью. 1я покраска - 505^аг, 2я покраска - SNAP-SiR. Сверху обозначено время инкубации с перекисью. Изображения представлены в 4х сочетаниях каналов для визуализации колокализации красителей SNAP-505 и SNAP-SiR с М^^аскет RED-DND99. На разных временах представлены изображения с разных чашек.

Глава 4. Основные выводы работы

Было установлено, что белки MTS-EmGFP, MTS-Dendra2 и MTS-FbFP не транспортируются в митохондрии при их инжекции в клетки, поскольку находятся в зрелом виде. При том что аналогичные конструкции, будучи экспрессированы в тех же клетках, локализуются в митохондриях, что можно связать с котрансляционным транспортом этих белков. SNAP-tag также оказался способен проникать в митохондрии, как будучи экспрессирован в клетке, так и инжектирован в зрелом виде, в том числе в связанном с красителем состоянии. Следует отметить, что GFP-подобные белки (включая EmGFP и Dendra2), обладают высокой стабильностью, поскольку имеют структуру бета-бочонка. Это позволяет предположить, что возможность транспорта белков-меток в зрелом виде связана с их общей стабильностью.

Кроме того, показано, что TERT-SNAP не транспортируется в митохондрии в результате добавления перекиси водорода к клеточной среде как в транзиентно трансфицированных HeLa, так и в стабильно экспрессирующей линии HEK293T. Поскольку в ходе работы проявился феномен неспецифической окраски клеток красителем для SNAP-tag после их инкубации с Н202, определенных выводов о наличии или отсутствии синтезированного TERT-SNAP в митохондриях сделать не удалось. Однако была дана оценка сверху на его концентрацию, составившая % от ядерной. Этот результат не вполне согласуется с литературой по теме. Это может быть связано с тем, что в данной модели концентрация TERT в митохондриях действительно ниже той, что возможно обнаружить на фоне неспецифической окраски. Однако стоит также рассмотреть гипотезу, что регуляция локализации TERT осуществляется не на уровне белка, а на более раннем этапе: например, на уровне альтернативного сплайсинга.

Опубликованные работы по теме диссертации

Материалы диссертации опубликованы автором в следующих в журналах из Web of Science, Scopus, РИНЦ:

1) Andrey Bogorodskiy, Ivan Okhrimenko, Ivan Maslov, Nina Maliar, Dmitrii Burkatovskii, Florian von Ameln, Alexey Schulga, Philipp Jakobs, Joachim Altschmied, Judith Haendeler, Alexandros Katranidis, Ivan Sorokin, Alexey Mishin, Valentin Gordeliy, Georg Büldt, Wolfgang Voos, Thomas Gensch, Valentin Borshchevskiy. Accessing Mitochondrial Protein Import in Living Cells by Protein Microinjection. Front Cell Dev Biol. 2021 Jul 7:9:698658. doi: 10.3389/fcell.2021.698658. eCollection 2021.

2) Andrey Bogorodskiy, Ivan Okhrimenko, Dmitrii Burkatovskii, Philipp Jakobs, Ivan Maslov, Valentin Gordeliy, Norbert A Dencher, Thomas Gensch, Wolfgang Voos, Joachim Altschmied, Judith Haendeler, Valentin Borshchevskiy. Role of Mitochondrial Protein Import in Age-Related Neurodegenerative and Cardiovascular Diseases. Cells. 2021 Dec 14;10(12):3528. doi: 10.3390/cells10123528.

3) Dmitrii Burkatovskii, Andrey Bogorodskiy, Ivan Maslov, Olga Moiseeva, Roman Netochin, Ekaterina Smirnova, Nikolay Ilyinsky, Alexey Mishin, Valentin Ivanovich, Sergey Leonov, Joachim Altschmied, Judith Haendeler, Georg Bueldt, Thomas Gensch, Valentin Borschevskiy. Examining Transfer of TERT to Mitochondria under Oxidative Stress. Sci Rep. 2024;14: 24185. doi:10.1038/s41598-024-75127-4

4) Leonid Kaluzhskiy, Evgeniy Yablokov, Oksana Gnedenko, Dmitrii Burkatovskii, Ivan Maslov, Andrey Bogorodskiy, Pavel Ershov, Tatsiana Tsybruk, Elena Zelepuga, Tatyana Rutckova, Emma Kozlovskaya, Pavel Dmitrenok, Andrei Gilep, Valentin Borshchevskiy, Natallia Strushkevich, Alexis Ivanov. The effect of membrane composition on the interaction between human CYP51 and its flavonoid inhibitor - luteolin 7,3'-disulfate. Biochim Biophys Acta Biomembr. 2024 Mar; 1866(3): 184286. doi: 10.1016/j.bbamem.2024.184286.

5) Elnara R. Zhiganshina, Maxim V. Arsenyev, Dmytro A. Chubich, Danila A. Kolymagin, Anastasia V. Pisarenko, Dmitry S. Burkatovsky, Evgeny V. Baranov,

Alexei G. Vitukhnovsky, Andrew N. Lobanov, Rilond P. Matital, Diana Ya. Aleynik, Sergey A. Chesnokov. Tetramethacrylic benzylidene cyclopentanone dye for one- and two-photon photopolymerization. Polymers (Basel). 2021 Dec 18;13(24):4445. doi: 10.3390/polym13244445.

По материалам работы были сделаны доклады на следующих научных конференциях:

1) Исследование динамики митохондриальной сети при помощи фотоконвертируемого белка Dendra2 (Д.С. Буркатовский, И.В. Маслов, А.О. Богородский, В.И. Борщевский), 62 конференция МФТИ, Долгопрудный, Россия, 2019

2) Исследование транспорта субъединицы теломеразы TERT в митохондрию (Буркатовский Д.С., Богородский А.О., Охрименко И.С., Маслов И.В., Борщевский В.И.), «Ломоносов - 2021», Москва, Россия, 2021

3) Роль митохондриального импорта в возрастных нейродегенеративных и сердечно-сосудистых болезнях (Буркатовский Д.С., Богородский А.О., Охрименко И.С., Маслов И.В., Борщевский В.И.), «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, Россия, 2022

4) Исследование транспорта субъединицы теломеразы TERT в митохондрии (Буркатовский Д.С., Маслов И.В., Богородский А.О.), «Биология -наука XXI века», Пущино, Россия, 2022

5) Исследование транспорта субъединицы теломеразы TERT в митохондрии (Д.С. Буркатовский, И.В. Маслов, А.О. Богородский, В.И. Борщевский), 65 конференция МФТИ, Долгопрудный, Россия, 2023

6) Исследование транспорта субъединицы теломеразы TERT в митохондрии (Д.С. Буркатовский, И.В. Маслов, А.О. Богородский, В.И. Борщевский), 66 конференция МФТИ, Долгопрудный, Россия, 2024

7) Исследование внутриклеточного транспорта TERT методом флуоресцентной микроскопии (Буркатовский Д.С., Маслов И.В., Богородский А.О.), «Флуоресценция для биомедицины», Нижний Новгород, Россия, 2024

Благодарности

Хочу выразить свою благодарность соавторам публикаций, в которых я являлся участником за продуктивную совместную работу, а также сотрудникам Центра исследования молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний МФТИ за помощь в проведении и планировании экспериментов, советы и переданный мне практический опыт работы. Я благодарю А. Богородского, И. Маслова, О. Моисееву, И. Охрименко, Е. Смирнову, Н. Ильинского, Р. Неточина, С. Леонова, А. Мишина, В. Горделия, Н. Маляр, А. Шульгу, J. Altschmied, J. Haendeler, P. Jakobs, N. A. Dencher, T. Gensch, A. Katranidis, G. Büldt, W. Voos.

Отдельную благодарность хочу выразить своему научному руководителю Валентину Борщевскому за руководство проектом, обсуждение результатов, наставление в написании статей и моральную поддержку в доведении работы до конца. Андрею Богородскому за переданный мне неоценимый практический опыт, содержательное обсуждение результатов экспериментов и помощь в их проведении. Ивану Маслову за переданный опыт работы на микроскопе и труд по вычитке и написанию совместных статей. Ольге Моисеевой за практическую помощь и рекомендации в работе по трансдукции. Анне Юденко, Екатерине Смирновой, Анатолию Михайлову и Сергею Бухаловичу за практические советы в области генетической инженерии. Полине Хорн за поддержание коллекции ферментов и дисциплины их использования сотрудниками лаборатории. Светлане Устиновой за порядок в лаборатории.

Выражаю благодарность нашим коллабораторам из Лаборатории разработки инновационных лекарственных средств и агробиотехнологий Роману Чупрову-Неточину и Леонову Сергею Викторовичу за возможность воспользоваться цитофлуориметрическим оборудованием, позволившим значительно упростить работу с культурой, а также помощью в его освоении.

Я благодарен нашим зарубежным коллабораторам по проекту Prof. Dr. Joachim Altschmied и Prof. Dr. Judith Haendeler за помощь в части генетической

инженерии и обсуждение результатов и Prof. Dr. Wolfgang Voss за предоставление упростивших работу экспериментальных данных о Dednra2.

Также я благодарю своих родителей и учителей, воспитавших во мне любовь к науке: Буркатовским Диане Рафиковне и Сергею Борисовичу, Выродову Евгению Александровичу, Сергееву Петру Валентиновичу и Мишиной Вере Юльевне. За поддержку на протяжении всего проекта благодарю свою супругу Алёну Дробязко.

Список литературы

1. Greider C.W., Blackburn E.H. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts // Cell. 1985. T. 43, № 2 Pt 1. C. 405-413.

2. Meier A. h gp. Spreading of mammalian DNA-damage response factors studied by ChIP-chip at damaged telomeres // EMBO J. 2007. T. 26, № 11. C. 2707-2718.

3. Karlseder J. h gp. p53- and ATM-dependent apoptosis induced by telomeres lacking TRF2 // Science. 1999. T. 283, № 5406. C. 1321-1325.

4. d'Adda di Fagagna F. h gp. A DNA damage checkpoint response in telomere-initiated senescence //Nature. 2003. T. 426, № 6963. C. 194-198.

5. Rossiello F. h gp. Telomere dysfunction in ageing and age-related diseases // Nat. Cell Biol. 2022. T. 24, № 2. C. 135-147.

6. Mundstock E. h gp. Effect of obesity on telomere length: Systematic review and meta-analysis // Obesity . 2015. T. 23, № 11. C. 2165-2174.

7. Wang J. h gp. Association between telomere length and diabetes mellitus: A meta-analysis // J. Int. Med. Res. 2016. T. 44, № 6. C. 1156-1173.

8. Forero D.A. h gp. Meta-analysis of Telomere Length in Alzheimer's Disease // J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 2016. T. 71, № 8. C. 1069-1073.

9. Haycock P.C. h gp. Leucocyte telomere length and risk of cardiovascular disease: systematic review and meta-analysis // BMJ. 2014. T. 349. C. g4227.

10. Denham J. Canonical and extra-telomeric functions of telomerase: Implications for healthy ageing conferred by endurance training // Aging Cell. 2023. T. 22, № 6. C. e13836.

11. Maida Y. h gp. An RNA-dependent RNA polymerase formed by TERT and the RMRP RNA // Nature. 2009. T. 461, № 7261. C. 230-235.

12. Sharma N.K. h gp. Human telomerase acts as a hTR-independent reverse transcriptase in mitochondria//Nucleic Acids Res. 2012. T. 40, № 2. C. 712-725.

13. Haendeler J. h gp. Mitochondrial telomerase reverse transcriptase binds to and protects mitochondrial DNA and function from damage // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2009. T. 29, № 6. C. 929-935.

14. Ahmed S. h gp. Telomerase does not counteract telomere shortening but protects mitochondrial function under oxidative stress // J. Cell Sci. 2008. T. 121, № Pt 7. C. 1046-1053.

15. Singhapol C. h gp. Mitochondrial telomerase protects cancer cells from nuclear DNA damage and apoptosis // PLoS One. 2013. T. 8, № 1. C. e52989.

16. Haendeler J. h gp. Hydrogen peroxide triggers nuclear export of telomerase reverse transcriptase via Src kinase family-dependent phosphorylation of tyrosine 707 // Mol. Cell. Biol. 2003. T. 23, № 13. C. 4598-4610.

17. Marinaccio J. h gp. TERT Extra-Telomeric Roles: Antioxidant Activity and Mitochondrial Protection // Int. J. Mol. Sci. 2023. T. 24, № 5.

18. Santos J.H. h gp. Mitochondrial hTERT exacerbates free-radical-mediated mtDNA damage // Aging Cell. 2004. T. 3, № 6. C. 399-411.

19. Büchner N. h gp. Downregulation of mitochondrial telomerase reverse transcriptase induced by H2O2 is Src kinase dependent // Exp. Gerontol. 2010. T. 45, № 7-8. C. 558-562.

20. Bogorodskiy A. h gp. Accessing Mitochondrial Protein Import in Living Cells by Protein Microinjection // Front Cell Dev Biol. 2021. T. 9. C. 698658.

21. van der Bliek A.M., Shen Q., Kawajiri S. Mechanisms of mitochondrial fission and fusion // Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2013. T. 5, № 6.

22. Logan D C. The mitochondrial compartment // J. Exp. Bot. 2006. T. 57, № 6. C. 1225-1243.

23. Marin-Garcia J. Mechanisms of Bioenergy Production in Mitochondria // Mitochondria and Their Role in Cardiovascular Disease / nog peg. Marin-Garcia J. Boston, MA: Springer US, 2013. C. 99-121.

24. Taanman J.W. The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication // Biochim. Biophys. Acta. 1999. T. 1410, № 2. C. 103-123.

25. Keyhani E. The locked-cell hypothesis. On the origin of mitochondria and the transition from prokaryotic to eukaryotic cells // Ann. N. Y. Acad. Sci. Wiley, 1981. T. 361, № 1 Origins and E. C. 376-396.

26. Neupert W. A perspective on transport of proteins into mitochondria: a myriad of open questions // J. Mol. Biol. 2015. T. 427, № 6 Pt A. C. 1135-1158.

27. Stiller S.B. h gp. Mitochondrial OXA Translocase Plays a Major Role in Biogenesis of Inner-Membrane Proteins // Cell Metab. 2016. T. 23, № 5. C. 901-908.

28. Sirrenberg C. h gp. Import of carrier proteins into the mitochondrial inner membrane mediated by Tim22 //Nature. 1996. T. 384, № 6609. C. 582-585.

29. Kutik S. h gp. Dissecting membrane insertion of mitochondrial beta-barrel proteins // Cell. 2008. T. 132, № 6. C. 1011-1024.

30. Habich M., Salscheider S.L., Riemer J. Cysteine residues in mitochondrial intermembrane space proteins: more than just import //Br. J. Pharmacol. 2019. T. 176, № 4. C. 514-531.

31. Becker T. h gp. The mitochondrial import protein Mim 1 promotes biogenesis of multispanning outer membrane proteins // J. Cell Biol. 2011. T. 194, № 3. C. 387-395.

32. Papic D. h gp. Multispan mitochondrial outer membrane protein Ugo1 follows a unique Mim1-dependent import pathway // J. Cell Biol. 2011. T. 194, № 3. C. 397-405.

33. leva R. h gp. Mgr2 functions as lateral gatekeeper for preprotein sorting in the mitochondrial inner membrane // Mol. Cell. 2014. T. 56, № 5. C. 641-652.

34. Ahmed A.U., Fisher P.R. Import of nuclear-encoded mitochondrial proteins: a cotranslational perspective // Int. Rev. Cell Mol. Biol. 2009. T. 273. C. 49-68.

35. Stojanovski D., Pfanner N., Wiedemann N. Import of Proteins into Mitochondria // Methods in Cell Biology. Academic Press, 2007. T. 80. C. 783-806.

36. Verner K. Co-translational protein import into mitochondria: an alternative view // Trends Biochem. Sci. 1993. T. 18, № 10. C. 366-371.

37. Fan A.C.Y., Young J.C. Function of cytosolic chaperones in Tom70-mediated mitochondrial import//Protein Pept. Lett. 2011. T. 18, № 2. C. 122-131.

38. Hines V. h gp. Protein import into yeast mitochondria is accelerated by the outer membrane protein MAS70 // EMBO J. 1990. T. 9, № 10. C. 3191-3200.

39. Rimmer K.A. h gp. Recognition of mitochondrial targeting sequences by the import receptors Tom20 and Tom22 // J. Mol. Biol. 2011. T. 405, № 3. C. 804-818.

40. Stan T. h gp. Mitochondrial protein import: recognition of internal import signals of BCS1 by the TOM complex // Mol. Cell. Biol. 2003. T. 23, № 7. C. 2239-2250.

41. Komiya T. h gp. Recognition of mitochondria-targeting signals by a cytosolic import stimulation factor, MSF // J. Biol. Chem. Elsevier BV, 1994. T. 269, № 49. C. 30893-30897.

42. Chartrand P. h gp. Structural elements required for the localization of ASH1 mRNA and of a green fluorescent protein reporter particle in vivo // Curr. Biol. 1999. T. 9, № 6. C. 333-336.

43. Gonzalez I. h gp. ASH1 mRNA localization in yeast involves multiple secondary structural elements and Ash1 protein translation // Curr. Biol. 1999. T. 9, № 6. C. 337-340.

44. Serano T.L., Cohen R.S. A small predicted stem-loop structure mediates oocyte localization of Drosophila K10 mRNA // Development. 1995. T. 121, № 11. C. 3809-3818.

45. Singer R.H. RNA zipcodes for cytoplasmic addresses // Curr. Biol. 1993. T. 3, № 10. C. 719-721.

46. St Johnston D., Beuchle D., Nüsslein-Volhard C. Staufen, a gene required to localize maternal RNAs in the Drosophila egg//Cell. 1991.T.66,№ 1.C.51-63.

47. Bassell G.J., Oleynikov Y., Singer R.H. The travels of mRNAs through all cells large and small // FASEB J. 1999. T. 13, № 3. C. 447-454.

48. Wilhelm J.E., Vale R.D. RNA on the move: the mRNA localization pathway // J. Cell Biol. 1993. T. 123, №2. C. 269-274.

49. Gerber A.P., Herschlag D., Brown P.O. Extensive association of functionally and cytotopically related mRNAs with Puf family RNA-binding proteins in yeast // PLoS Biol. 2004. T. 2, № 3. C. E79.

50. García-Rodríguez L.J., Gay A.C., Pon L.A. Puf3p, a Pumilio family RNA binding protein, localizes to mitochondria and regulates mitochondrial biogenesis and motility in budding yeast // J. Cell Biol. 2007. T. 176, № 2. C. 197-207.

51. Zvereva M.I., Shcherbakova D.M., Dontsova O.A. Telomerase: structure, functions, and activity regulation // Biochemistry . 2010. T. 75, № 13. C. 1563-1583.

52. Park J.-I. h gp. Telomerase modulates Wnt signalling by association with target gene chromatin //Nature. 2009. T. 460, № 7251. C. 66-72.

53. Hoffmeyer K. h gp. Wnt/ß-catenin signaling regulates telomerase in stem cells and cancer cells // Science. 2012. T. 336, № 6088. C. 1549-1554.

54. Lue N.F. h gp. Telomerase can act as a template- and RNA-independent terminal transferase // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005. T. 102, № 28. C. 9778-9783.

55. Chiodi I., Mondello C. Telomere-independent functions of telomerase in nuclei, cytoplasm, and mitochondria//Front. Oncol. 2012. T. 2. C. 133.

56. Masutomi K. h gp. The telomerase reverse transcriptase regulates chromatin state and DNA damage responses // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005. T. 102, № 23. C. 8222-8227.

57. Del Bufalo D. h gp. Involvement of hTERT in apoptosis induced by interference with Bcl-2 expression and function // Cell Death Differ. 2005. T. 12, № 11. C. 1429-1438.

58. Yogev O., Pines O. Dual targeting of mitochondrial proteins: mechanism, regulation and function // Biochim. Biophys. Acta. 2011. T. 1808, № 3. C. 1012-1020.

59. Seimiya H. h gp. Involvement of 14-3-3 proteins in nuclear localization of telomerase // EMBO J. 2000. T. 19, № 11. C. 2652-2661.

60. Kovalenko O.A. h gp. A mutant telomerase defective in nuclear-cytoplasmic shuttling fails to immortalize cells and is associated with mitochondrial dysfunction // Aging Cell. 2010. T. 9, № 2. C. 203-219.

61. Chung J., Khadka P., Chung I.K. Nuclear import of hTERT requires a bipartite nuclear localization signal and Akt-mediated phosphorylation // J. Cell Sci. 2012. T. 125, № Pt 11. C. 2684-2697.

62. Plyasova A.A., Zhdanov D.D. Alternative Splicing of Human Telomerase Reverse Transcriptase (hTERT) and Its Implications in Physiological and Pathological Processes // Biomedicines. 2021. T. 9, № 5.

63. Jakob S. h gp. Nuclear protein tyrosine phosphatase Shp-2 is one important negative regulator of nuclear export of telomerase reverse transcriptase // J. Biol. Chem. 2008. T. 283, № 48. C. 33155-33161.

64. Santos J.H., Meyer J.N., Van Houten B. Mitochondrial localization of telomerase as a determinant for hydrogen peroxide-induced mitochondrial DNA damage and apoptosis // Hum. Mol. Genet. 2006. T. 15, № 11. C. 1757-1768.

65. Valko M. h gp. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2007. T. 39, № 1. C. 44-84.

66. Kussmaul L., Hirst J. The mechanism of superoxide production by NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from bovine heart mitochondria // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2006. T. 103, № 20. C. 7607-7612.

67. Muller F.L., Liu Y., Van Remmen H. Complex III releases superoxide to both sides of the inner mitochondrial membrane // J. Biol. Chem. 2004. T. 279, № 47. C. 49064-49073.

68. Muller F., Crofts A.R., Kramer D.M. Multiple Q-cycle bypass reactions at the Qo site of the cytochrome bc1 complex // Biochemistry. 2002. T. 41, № 25. C. 7866-7874.

69. Panday A. h gp. NADPH oxidases: an overview from structure to innate immunity-associated pathologies // Cell. Mol. Immunol. 2015. T. 12, № 1. C. 5-23.

70. Ameziane-El-Hassani R. h gp. Dual oxidase-2 has an intrinsic Ca2+-dependent H2O2-generating activity // J. Biol. Chem. 2005. T. 280, № 34. C. 30046-30054.

71. Xanthine Oxidase // Encyclopedia of Cancer. Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg, 2008. C.3215-3215.

72. Harris C.M., Massey V. The reaction of reduced xanthine dehydrogenase with molecular oxygen. Reaction kinetics and measurement of superoxide radical // J. Biol. Chem. 1997. T. 272, № 13. C. 8370-8379.

73. Nedeva T. h gp. Purification and partial characterization of Cu/Zn superoxide dismutase from Kluyveromyces marxianus yeast // J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2009. T. 877, № 29. C. 3529-3536.

74. Weisiger R.A., Fridovich I. Mitochondrial superoxide dismutase // J. Biol. Chem. Elsevier BV, 1973. T. 248, № 13. C. 4793-4796.

75. Crapo J.D. h gp. Copper,zinc superoxide dismutase is primarily a cytosolic protein in human cells // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1992. T. 89, № 21. C. 10405-10409.

76. Fenton H.J.H. LXXIII.—Oxidation of tartaric acid in presence of iron // J. Chem. Soc., Trans. The Royal Society of Chemistry, 1894. T. 65, № 0. C. 899-910.

77. Liu Y., Wang J. Multivalent metal catalysts in Fenton/Fenton-like oxidation system: A critical review // Chem. Eng. J. Elsevier BV, 2023. T. 466, № 143147. C. 143147.

78. Poetsch A.R. The genomics of oxidative DNA damage, repair, and resulting mutagenesis // Comput. Struct. Biotechnol. J. 2020. T. 18. C. 207-219.

79. Shibutani S., Takeshita M., Grollman A.P. Insertion of specific bases during DNA synthesis past the oxidation-damaged base 8-oxodG//Nature. 1991. T. 349, № 6308. C. 431-434.

80. Hollensworth S.B. h gp. Glial cell type-specific responses to menadione-induced oxidative stress // Free Radic. Biol. Med. 2000. T. 28, № 8. C. 1161-1174.

81. Guo C. и др. Oxidative stress, mitochondrial damage and neurodegenerative diseases // Neural Regeneration Res. 2013. Т. 8, № 21. С. 2003-2014.

82. Rickborn B. The Retro-Diels-Alder Reaction Part I. CDC Dienophiles // Organic Reactions. Hoboken, NJ, USA: John Wiley & Sons, Inc., 1998. С. 1-393.

83. Rickborn B. The retro-Diels-alder reaction part II. Dienophiles with one or more heteroatom // Organic Reactions. Hoboken, NJ, USA: John Wiley & Sons, Inc., 1998. С. 223-629.

84. Venkatachalam H., Nayak Y., Jayashree B.S. Evaluation of the antioxidant activity of novel synthetic chalcones and flavonols // International Journal of Chemical Engineering and Applications. IACSIT Press, 2012. Т. 3,№ 3. С. 216.

85. Ransy C. и др. Use of H2O2 to Cause Oxidative Stress, the Catalase Issue // Int. J. Mol. Sci. 2020. Т. 21, №23.

86. Hirai D.M. и др. Skeletal muscle interstitial O2 pressures: bridging the gap between the capillary and myocyte // Microcirculation. 2019. Т. 26, № 5. С. e12497.

87. New England Biolabs. SNAP-Cell® TMR-Star [Электронный ресурс]. URL: https://www.neb.com/en/products/s9105-snap-cell-tmr-star (дата обращения: 21.08.2024).

88. New England Biolabs. SNAP-Cell® 505-Star [Электронный ресурс]. URL: https://www.neb.com/en/products/s9103-snap-cell-505 (дата обращения: 21.08.2024).

89. New England Biolabs. SNAP-Cell® 647-SiR [Электронный ресурс]. URL: https://www.neb.com/en/products/s9102-snap-cell-647-sir (дата обращения: 21.08.2024).

90. New England Biolabs. SNAP-Cell® 430 [Электронный ресурс]. URL: https://www.neb.com/en/products/s9109-snap-cell-430 (дата обращения: 21.08.2024).

91. New England Biolabs. SNAP-Cell® Oregon Green® [Электронный ресурс]. URL: https://www.neb.com/en/products/s9104-snap-cell-oregon-green (дата обращения: 21.08.2024).

92. ATTO 594 [Электронный ресурс] // ATTO-TEC GmbH. URL: https://www.atto-tec.com/ATTO-594.html?language=de (дата обращения: 22.08.2024).

93. ATTO Rho14 [Электронный ресурс] // ATTO-TEC GmbH. URL: https://www.atto-tec.com/ATTO-Rho14.html?language=en (дата обращения: 22.08.2024).

94. Lambert T. Dendra2 [Электронный ресурс] // FPbase. URL: https://www.fpbase.org/protein/dendra2/ (дата обращения: 22.08.2024).

95. Bomer U. и др. Separation of structural and dynamic functions of the mitochondrial translocase: Tim44 is crucial for the inner membrane import sites in translocation of tightly folded domains, but not of loosely folded preproteins // EMBO J. 1998. Т. 17, № 15. С. 4226-4237.

96. Stepanenko O.V. и др. Beta-barrel scaffold of fluorescent proteins: folding, stability and role in chromophore formation // Int. Rev. Cell Mol. Biol. 2013. Т. 302. С. 221-278.

97. Adam V. и др. Structural basis of enhanced photoconversion yield in green fluorescent protein-like protein Dendra2 // Biochemistry. 2009. Т. 48, № 22. С. 4905-4915.

98. Gessmann D. и др. Structural elements of the mitochondrial preprotein-conducting channel Tom40 dissolved by bioinformatics and mass spectrometry // Biochim. Biophys. Acta. 2011. Т. 1807, № 12. С. 1647-1657.

99. Muro C. и др. Comparison of the TIM and TOM channel activities of the mitochondrial protein import complexes // Biophys. J. 2003. Т. 84, № 5. С. 2981-2989.

100. Hill K. и др. Tom40 forms the hydrophilic channel of the mitochondrial import pore for preproteins [see comment] //Nature. 1998. Т. 395, № 6701. С. 516-521.

101. Cole N.B. Site-specific protein labeling with SNAP-tags // Curr. Protoc. Protein Sci. 2013. Т. 73. С. 30.1.1-30.1.16.

102. Keppler A. и др. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo //Nat. Biotechnol. 2003. Т. 21, № 1. С. 86-89.

103. Brandt R., Keston A S. SYNTHESIS OF DIACETYLDICHLOROFLUORESCIN: A STABLE REAGENT FOR FLUOROMETRIC ANALYSIS // Anal. Biochem. 1965. Т. 11. С. 6-9.

104. Keston A S., Brandt R. THE FLUOROMETRIC ANALYSIS OF ULTRAMICRO QUANTITIES OF HYDROGEN PEROXIDE//Anal. Biochem. 1965. Т. 11. С. 1-5.

105. Jakubowski W., Bartosz G. 2,7-dichlorofluorescin oxidation and reactive oxygen species: what does it measure? // Cell Biol. Int. 2000. Т. 24, № 10. С. 757-760.