Исследование транспорта митохондриальных белков методами флуоресцентной микроскопии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Богородский Андрей Олегович

• Богородский Андрей Олегович
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Богородский Андрей Олегович

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы

Основные цели и задачи исследования

Научная новизна

Теоретическая и практическая значимость

положения, вышосимые на защиту

Вклад автора

Степень достоверности и апробация результатов работы

Структура диссертационной работы

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Механизм транспорта белков в митохондрии

1.1.1. Роль митохондрии в клетке

1.1.2. Транспорт белков в митохондрию

1.1.3. Регуляция синтеза и импорт белков в митохондрию: мРНК, рибосомы и транспорт

1.1.4. Ко- и пост-трансляционный импорт белков в митохондрии

1.1.5. Нарушения механизмов транспорта при патологиях

1.2. Методы доставки белков в клетки

1.2.1. Введение

1.2.2. Физические методы доставки

1.2.3. Функционализация белков для доставки

1.2.4. Доставка белка с помощью переносчиков

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.1.1. Готовые реактивы и ферменты

2.1.2. Приготовленные буферы и среды из реактивов

2.1.3. Клетки E. coli

2.1.4. Плазмидные векторы

2.1.5. Клеточные культуры млекопитающих

2.1.6. SNAP - красители

2.2. Методы

2.2.1. Генная инженерия

2.2.2. Экспрессия и очистка белка

2.2.3. Ведение клеточных культур HeLa и HEK293 MTS-Dendra2

2.2.4. Микроинжекция

2.2.5. Флуоресцентная микроскопия

2.2.6. Обработка данных

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Визуализация митохондрий

3.1.1. Окрашивание митохондрий

3.1.2. Исследование применимости и токсичности Mitotracker для галобактерий

3.2. Исследование свойств различных флуоресцентных белков

3.2.1. Подвижность белков вроде GCamp и других калмодулинов

3.2.2. Исследование мутантов FbFP

3.3. Оптимизация параметров микроинжекции

3.4. Инжекция белков

3.4.1. Инжекция MTS-DHFR

3.4.2. Оптимизация экспрессии и белковый N-конец

3.4.3. Инжекция MTS-EmGFP

3.4.4. Инжекция MTS-FbFP

3.4.5. Инжекция MTS-SNAP-tag

3.5. Исследование импорта SNAP-tag

3.5.1. Верификация импорта

3.5.2. Инжекция в клетки, обработанные пуромицином и циклогексимидом

3.5.3. Верификация использованных экспериментальных условий на состояния комплексов мРНК/рибосомы

3.5.4. Оценки скорости импорта

3.5.5. Количественный анализ скорости импорта в различных условиях

ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ОПУБЛИКОВАННЫЕ РАБОТЫ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование транспорта митохондриальных белков методами флуоресцентной микроскопии»

Введение Актуальность работы

Митохондрии представляют собой одну из важнейших органелл в клетке, производящих наибольшую долю энергии при аэробном дыхании. Окисление метаболитов для производства энергии в виде АТФ происходит с участием большого количества белков, работающих внутри митохондрий. Помимо белков, вовлеченных в процессы оксидативного фосфорилирования, митохондрии также имеют множество белков, контролирующих само их существование (поддержание внутреннего генома, морфологии, контроль процессов деления/слияния и т.п.). Несмотря на наличие собственного генома и трансляционной системы, 99 % митохондриальных белков производятся снаружи митохондрии в цитоплазме, используя гены ядра и клеточные рибосомы. После синтеза белок транспортируется внутрь митохондрии, используя один из нескольких механизмов транспорта. Уникальное устройство митохондрии — наличие двойной мембраны — создает необходимость в довольно сложной системе транспорта и сортировки белков по различным частям органеллы (внешняя и внутренняя мембрана, межмембранное пространство и матрикс). Нарушенные из-за генетических мутаций механизмы транспорта либо фатальны, либо приводят к тяжёлым поражениям (такие как синдром Сенгера, митохондриальная эпилептическая энцефалопатия, синдром Фанкони и др.). Кроме этого, возрастные нейродегенеративных заболевания, такие как болезнь Альцгеймера и синдром Паркинсона, могут быть отчасти вызваны нарушениями митохондриального биогенеза и, в частности, системы контроля за качеством импортируемых белков.

В настоящее время существует несколько методов изучения транспорта белков внутрь митохондрии. Часть из них изучают этот процесс либо в статичном состоянии, позволяя получить «замороженный во времени» снимок состояния клетки. К таким методам относятся: криоэлектронная микроскопия, рибосомное профилирование, локализованное РНК секвенирование и фотоактивируемый

кросс-линкинг. Кинетические методы используются для исследования транспорта белков, меченных радиоактивными метками, в изолированные митохондрии. Однако ни один из этих методов не позволяет исследовать кинетику транспорта в митохондрии внутри живых клеток. В отличии от изолированных митохондрий, в живых клетках митохондрии транспортируют белки, натурально производимые клеткой, а также участвуют в различных ее системах транспорта и сигнальных каскадах.

Основная сложность изучения транспорта в митохондрию in vivo заключается в необходимости быстро (по сравнению с характерными временами импорта для изолированных митохондрий[1]) ввести белок в клетку на старте эксперимента для возможности последующего наблюдения за процессом. Второй проблемой является неинвазивность методов наблюдения, которые ограничены флуоресцентной и рамановской микроскопией[2].

Возможность изучения транспорта in vivo, в свою очередь, открывает возможности для исследования импорта в митохондрии, такие как:

1. изучение роли сопряженного с трансляцией импорта белка в митохондрию (ко-трансляционный импорт), по сравнению с импортом окончившего трансляцию белка из цитоплазмы (пост-трансляционный);

2. влияния различных патологических состояний клетки на импорт белков в митохондрии.

Основные цели и задачи исследования

Основной целью данной работы является демонстрация и исследование пост-трансляционного импорта экзогенных флуоресцентных белков внутри живых клеток. Для достижения этой цели необходимо было решить ряд задач: Во-первых, оптимизировать метод введения белка в клетку, не вызывающей как дефектов на малых временах, связанных с разрушением внутренних структур и нарушением функционирования митохондрий; так и на больших, связанных со смертью клетки. Также метод накладывает дополнительные ограничения, которые

необходимо учитывать: клетки должны оставаться относительно неподвижными в поле зрения микроскопа, а окраска митохондрий должна быть стабильной.

Во-вторых, подобрать подходящий для исследования флуоресцентный белок и оптимизировать условия его выделения.

В-третьих, показать пост-трансляционный транспорт белка внутри живых клеток и произвести валидацию метода контрольными экспериментами. Для решения этой задачи были также параллельно решена проблема нерабочего (в условиях контрольных экспериментов) окрашивания митохондрий, а также вопрос фототоксичности используемых красителей.

В-четвертых, исследовать влияние на транспорт рибосомальных реагентов, таких как пуромицин (PUR) и циклогексимид (CHX), а также произвести численную обработку данных полученных флуоресцентных изображений.

Научная новизна

В работе впервые продемонстрирована пригодность метода микроинжекции белков для исследования их транспорта в митохондрию in vivo во времени с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии. Впервые прямо продемонстрирован пост-трансляционный транспорт в митохондрии in vivo для белка MTS-SNAP-tag. Подтверждены данные об остановке импорта in vivo при сбрасывании митохондриального потенциала. Исследована подвижность калмодулиновых флуоресцентных белков в клетке и показано, что более 40 % белков неподвижны, а также что FGCaMP до связывания с кальцием не имеет неподвижной фракции. Также показано отсутствие пост-трансляционного импорта для MTS-EmGFP. Впервые получены данные для оценки занятости комплексов TOM (translocase of outer membrane, транслоказа внешней мембраны) процессами ко- и пост- трансляционного импорта.

Теоретическая и практическая значимость

Полученный в результате данной работы метод экспрессии и микроинжекции флуоресцентных белков позволяет наблюдать транспорт в митохондрии напрямую в живых клетках, используя флуоресцентную микроскопию. Как микроинжекция, так и флуоресцентная микроскопия являются малоинвазивными методами, что позволяет исследовать импорт в митохондрии в максимально близких к реальным условиям.

Малоинвазивный метод исследования транспорта белков в митохондрии, в свою очередь, открывает новые возможности для исследования проблем патологических заболеваний, связанных с митохондриями. В число подобных патологий входят не только редкие мутации, поражающие митохондриальную функцию, но и нейродегенеративные расстройства, такие как синдром Паркинсона и болезнь Альцгеймера. Возможность исследовать транспорт внутри клеток без дополнительных воздействий позволяет использовать данный метод как на моделях данных заболеваний, так и на первичных культурах.

Используя данный подход впервые был получена экспериментальная оценка занятости комплексов транслокации TOM процессами ко-трансляционного и посттрансляционного импорта белков в клетке.

Положения, выносимые на защиту

• Способ получения белков с интактной N-терминальной митохондриальной сигнальной последовательностью, включающий этапы экспрессии и очистки белков с использованием SUMO-тага.

• Экспериментальный подход неинвазивной микроинжекции растворов белков и плазмид для адгезивных клеточных культур HeLa и HEK293.

• Способ оценки скорости пост-трансляционного импорта в митохондрии белков с использованием флуоресцентной микроскопии живых клеток.

• Способ определения доли митохондриальных TOM-комплексов, вовлеченных в ко-трансляционный импорт белков в живых клетках HEK293 MTS-Dendra2.

Вклад автора

Автор принимал непосредственное участие в создании генетических конструкций, экспрессии, очистке, окраске используемых белков, введениии клеточных линий, экспериментах по микроинжекции и флуоресцентной микроскопии, а также обработке данных. Автор участвовал в разработке экспериментов, обсуждении результатов и написании статей совместно с соавторами.

Степень достоверности и апробация результатов работы

Результаты работы были представлены на следующих международных и российских конференциях: Biophysical Society meeting 2021 (США (онлайн), 2021), International Conference "Biomembranes 2018" (Долгопрудный, Россия, 2018), FEBS 2017 (Иерусалим, Израиль)

По материалам работы было опубликовано 5 статей в научных журналах, индексируемых базами Scopus и Web of Science.

Структура диссертационной работы

Диссертация состоит из введения, трех глав, разделенных на подглавы, и заключения.

Первая глава - литературный обзор, состоящий из двух подчастей: обзор системы белкового импорта митохондрий и обзор методов доставки белков внутрь клетки. Первая подчасть направлена на освещение механизмов импорта белков в митохондрии, а именно: непосредственно участвующие в импорте белки, регуляция импорта, сравнение свидетельств ко- и пост-трансляционного импорта в митохондрии. Вторая подчасть обзора предлагает обзор существующих методов доставки белков в клетки, и их достоинств/недостатков.

Вторая глава - описание материалов, методов и оборудования, использованного в работе. Приведены протоколы для методов генной инженерии, экспрессии и очистки белка в клетках в E. Coli. Описаны протоколы использования клеток HeLa и HEK293. Описаны подробно условия микроинжекции и флуоресцентной микроскопии, а также метод дальнейшей обработки данных.

Третья глава - описание результатов, выносимых на защиту.

Заключение - выводы и список использованной литературы.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Механизм транспорта белков в митохондрии 1.1.1. Роль митохондрии в клетке.

Митохондрии являются основным производителем энергии (в виде АТФ) в эукариотической клетке. Митохондрии производят приблизительно в 13 раз больше АТФ при аэробном дыхании по сравнению с анаэробной ферментацией самой клетки[3]. Митохондрии состоят из двух мембран и двух водяных компартментов: внешняя/внутренняя мембрана и межмембранное пространство/матрикс, соответственно (рис. 1). Внутренняя мембрана формирует множество складок - крист, содержащих оксидативную фосфорилирущую систему (ОХРИОБ) из дыхательных комплексов 1-1У и АТФ синтазы. Белки, отвечающие за метаболизм, и метаболиты импортируются в матрикс, где они перерабатываются и превращаются в АТФ.

Рисунок 1. Схема устройства митохондрии и роли импорта белков. Митохондрия имеет две мембраны, межмембранное пространство (оранжевым) и матрикс (бледно-желтым). Внутренняя мембрана образует складки (кристы).

Цикл Кребса, окисление жирных кислот и метаболизм аминокислот и нуклеотидов в матриксе производит НАД^ который служит донором электронов для кислорода. Респираторные комплексы I-IV производят восстановление кислорода, используя в качестве промежуточного переносчика электронов убихинол, и, в результате своей работы, создают протонный градиент. F1Fo АТФ синтаза использует полученный электрохимический протонный градиент для синтеза АТФ, которая затем экспортируется в цитоплазму клетки. Белки, необходимые для этих окислительных процессов, находятся преимущественно в матриксе и внутренней мембране. Перенос метаболитов в матрикс и из матрикса осуществляется селективными белками-переносчиками внутренней мембраны. Экспорт АТФ [4] наружу (в цитоплазму) и импорт метаболитов через внешнюю мембрану митохондрии осуществляется менее селективным белками-поринами из семейства VDAC (voltage-dependent anion-selective channels - потенциал-зависимые анион-селективные каналы) [5].

Только малая доля белков кодируется непосредственно геномом самой митохондрии. Эти белки относятся к мембранным комплексам внутренней мембраны. Геном митохондрий человека имеет размер 16 тыс. пар оснований и имеет 37 генов, кодирующих всего 13 белков, 22 тРНК и 2 рРНК[6]. Существование собственного генома у митохондрии также порождает необходимость в системах трансляции и транскрипции, а соответственно и в митохондриальных рибосомах, которые отличаются от эукариотических и бактериальных. Основное отличие заключается в значительно более высоком содержании белков и укороченных рРНК, что приводит к более низким коэффициентам седиментации (55 S для большой субъединицы по сравнению с 70S у бактерий и 80S у эукариотов), при близких общих массах[7]. Митохондриальные рибосомы производят исключительно мембранные белки у млекопитающих и

поэтому находятся у поверхности внутренней мембраны митохондрии [8]. В их число входят апоцитохром б, субъединицы оксидазы цитохрома с, субъединицы АТФ-синтазы и субъединицы дегидрогеназы НАД [9].

Наличие двойной мембраны, собственного генома и системы трансляции у митохондрий обусловлено эволюционным происхождением. Согласно теории симбиогенеза, клетка а-Протеобактерии была поглощена анаэробной клеткой-предшественницей эукариотов. Резко возросшее количество доступной энергии при аэробном дыхании позволило клетке-предшественнице эукариотов адаптироваться к постепенному росту концентрации кислорода в среде, несмотря на присутствие сложных (и, как следствие, энергозатратных) систем, вроде ЭПР и ядра.

Консервативность рРНК генов митохондрий позволила исследовать филогенетические деревья и идентифицировать общего предка митохондрии с а-Протеобактерия[10,11]. Изначально предок митохондрий, по всей видимости, имел электронно-транспортную цепь, белки для Р-окисления жирных кислот, биосинтеза Бе-Б кластеров, гема, липидов и катионных транспортеров, указывая на по крайней мере частичное аэробное дыхание [12]. Эволюция протеома митохондрий привела к потере множества больше ненужных функций биосинтеза, перенаправления части оригинальных функций в другие органеллы и добавления белков клетки-хозяина. При этом митохондрии позвоночных (в том числе и человека) содержит свыше 1500 различных белков[13], таким образом более 99 % процентов белков синтезируются снаружи митохондрии в цитозоле и затем переносятся сквозь внешнюю мембрану митохондрии.

В протеоме митохондрий только 15 % белков относятся непосредственно к энергетическому метаболизму, еще 20-25 % служат для поддержания и регуляции митохондриального генома (рис. 2). Количество копий белков, вовлеченных в метаболизм, резко меняется между аэробным и анаэробным питанием у дрожжей, в то время как количество транслоказ, белков, поддерживающих

митохондриальный геном и биосинтез Fe-S кластеров, практически не зависит от условий питания.

Рисунок 2. Анализ протеома митохондрии дрожжей (Б. Cerevisiae) в условиях аэробного и анаэробного дыхания (адаптировано из [14]).

15 % вовлеченных в метаболизм белков составляют 50 % от общей белковой массы митохондрии, а если включить все белки вовлеченные в различные метаболические процессы, (оксидативное фосфорилирование, белки-переносчики метаболитов и каналы), то общая масса белков вовлеченных в биоэнергетику достигает 75 % [15]. Также стоит отметить важность консервативных белков,

формирующих морфологию митохондриальной мембраны и синтезирующих Fe-S кластеры. Они составляют всего 1 % по массе от протеома митохондрии, однако их дефекты приводят к полному коллапсу митохондриальной функции.

Множество остальных белков митохондрии связаны с сигнальными каскадами клетки и обратной связи митохондрии с клеткой (ответ на стресс, регуляция деления, смена питания, сигналы о повреждении митохондрии и т.п.). Среди сигнальных белков можно как раз найти наибольшие эволюционные различия среди эукариотов, что говорит об их более позднем происхождении. Из регуляторных белков стоит отметить белки, влияющие на слияние/деление митохондрий и осуществляющих контроль за импортом новых белков, в случае смены питания[16-19].

Примером морфологических белков митохондрий является комплекс MICOS (митохондриальный сайт контакта и организации крист), который поддерживает характерные складки внутренней мембраны внутри митохондрий, необходимые для существования крист. Также этот комплекс отвечает за локальное взаимодействие комплексов транспорта и, таким образом, упрощает транспорт белков, липидов и метаболитов[20-23].

Вышеописанные белки в большинстве своем импортируются из цитоплазмы и нуждаются в корректной сортировке по различным частям митохондрии. Сортировка и импорт белков таким образом является жизненно необходимой функцией для митохондрий и соответственно для всей клетки. В дальнейших главах будут рассмотрены составляющие этой системы импорта.

1.1.2. Транспорт белков в митохондрию 1.1.2.1. Обзор транслокационной системы митохондрий

Как было упомянуто в введении, митохондрия практически полностью зависима от клетки-хозяина, обладая лишь маленьким, неполным, геномом и небольшим количеством собственных рибосом, работающих внутри матрикса. Двойная мембрана создает 4 возможных цели (компартмента) для импортируемых белков внутри митохондрии: внешняя мембрана, межмембранное пространство, внутренняя мембрана и матрикс (рис. 3).

Рисунок 3. Общая схема импорта белков в митохондрию (у Б. Cerevisiae), показано пять известных механизмов импорта белков на данный момент: голубым - а-спиральные белки внешней мембраны,

синим - переносчики метаболитов внутренней мембраны, коричневым - межмембранные белки, зависимые от Mia/Erv1 системы, желтым - белки внутренней мембраны и матрикса, использующие Tim23, розовым - Р-бочонки внешней мембраны. Как видно из схемы, большая часть белков проходит сквозь комплекс TOM (зеленым).

Всего в импорте белков участвуют около 40 различных белков, организованных в 10 комплексов [24]. Белки-транспортёры, называемые транслоказами, участвуют в импорте около тысячи белков, различного типа (водорастворимых и мембранных), и в сортировке этих белков по различным компартментам митохондрии. На настоящий момент известно 5 механизмов транспорта белков, при этом 4 из них используют канал TOM в качестве первой транслоказы (рис. 3). В дальнейшем белки сортируются по различным компартментам.

Наиболее хорошо изученным из этих пяти механизмов является сигнальный (показан желтым на рис. 3), отвечающий за импорт 2/3 митохондриальных белков[25]. Использующие этот механизм белки обладают N-концевой сигнальной последовательностью, которая распознается и транспортируется комплексом TOM через внешнюю мембрану, и далее при помощи TIM23 — через внутреннюю. Мембранные белки внутренней мембраны используют латеральное раскрытие комплекса TIM23/Mgr2[26] на стадии импорта. Белки, прошедшие сквозь внутреннюю мембрану, попадают в матрикс, где могут быть подвержены дальнейшим модификациям и/или фолдингу посредством MPP (Matrix processing peptidase - пептидаза процессинга матрикса) и гетероолигомеров из шаперонов Hsp10/60. Некоторые доставленные в матрикс таким образом мембранные белки в дальнейшем используют Oxal инсертазу митохондрий [27], которая производит ре-интернализацию этих белков со стороны матрикса.

Второй механизм транспорта (показан темно-синим на рис. 3) отвечает за доставку белков переносчиков метаболитов внутренней мембраны, обладающих не N-концевой сигнальной последовательностью, а внутренними гидрофобными сигнальными элементами. Белки такого типа в цитоплазме связываются с

шаперонами Hsp70/90. Данный комплекс распознаётся Tom70, который затем взаимодействует с порой Tom40. Белки-переносчики импортируются в межмембранное пространство, где их окружают малые TIM шапероны для предотвращения агрегации. Малые TIM шапероны сопровождают белки к TIM22, транслоказе внутренней мембраны, которая отвечает за интернализацию белков во внутреннюю мембрану [28,29].

Третий механизм транспорта (показан розовым цветом на рис. 3) используется для белков ß-бочонков внешней мембраны митохондрий. На первом этапе белки транспортируются комплексом TOM в межмембранное пространство, где связываются малыми шаперонами TIM и распознаются комплексом SAM/TOB (TOB — topogenesis of outer membrane ß-barrel proteins — топогенез внешнемембранных белков ß-бочонков) и вставляются в мембрану с внутренней стороны внешней мембраны. Таким образом N-конец белка ß-бочонка оказывается со стороны цитоплазмы.

Отдельный, четвертый, механизм импорта связан с белками, обогащенными цистеинами (показан коричневым на рис. 3), финальной точкой назначения которых является межмембранное пространство. Такие белки имеют пары мотивов CX3C или CX9C (C - цистеин, X - произвольная аминокислота). После транслокации через Tom40, цистеины окисляются и образуют двойные дисульфидные мостики, в результате чего белок формирует характерные структурные мотивы[30,31] (см. рис. 3). Окисление производят комплексы MIA (mitochondrial intermembrane space assembly - сборка в митохондриальном межмембранном пространстве), состоящие из Mia40 и Erv1[32]. Mia40 распознает фланкирующие цистеины, образует дисульфидную связь с одним из цистеинов белка-субстрата, окисляя его, и переносит эту дисульфидную связь на второй цистеин белка-субстрата. Затем восстановленная форма Mia40 окисляется белком партнером Erv1[33] и может работать дальше.

Последний (из описанных в литературе), пятый, механизм транспорта используется белками внешней мембраны, содержащих несколько

трансмембранных а-спиралей[34-36]. Данные белки используют специальный белковый комплекс внешней мембраны MIM и не привлекают весь комплекс TOM, взаимодействуя однако с одним из его компонентов Tom70.

Комплекс TOM распознает и транспортирует подавляющее большинство митохондриальных белков через внешнюю мембрану [14,37]. Комплекс состоит из семи белков — Tom40, Tom22, Tom5, Tom6, Tom7, Tom70 и Tom20[38], названных в соответствии со своей молекулярной массой. Наиболее важными из них являются Tom40, ß-бочонок, образующий пору в мембране, и Tom22, являющийся стабилизирующим партнером комплекса TOM и сайтом распознавания лидерной последовательности транспортируемого белка. Tom22 имеет как цитоплазматический домен, распознающий лидерную последовательность, так и межмембранный (рис. 4). Два дополнительных белка, Tom20 и Tom70, также распознают сигнальные последовательности белков, однако их удаление не является фатальным для нормального функционирования митохондрии [39]. Вероятно, их роль заключается в более тонком регулировании транспорта различного типа белков в митохондрию, и дублируется в некой мере Tom22. Эти белки в отличии от остальных пяти участников комплекса слабо связанны [40,41] с Tom40 и относительно свободно перемещаются по мембране. Оставшиеся три малых белка Tom5,6,7 были обнаружены в непосредственной близости к поре Tom40[42,43] и стабилизируют комплекс. Tom7 также участвует в регуляции формирования новых TOM комплексов[44].

1.1.2.2. Комплекс TOM

Tom5

тогги

Cytosol

IMS

ОМ

Detergent

Рисунок 4. Криоэлектронная структура комплекса TOM. Видно характерная димерная структура из двух наклоненных ß-бочонков Tom40 (зеленым), и находящимся между ними Tom22. Tom5,6,7 (фиолетовым, синим, желтым соответственно) опоясывают Tom40 со стороны мембраны. Рисунок адаптирован из [45]

Структура комплекса TOM[43,45] без Том20 и Том70-субъединиц была получена криоэлектронной микроскопией (рис. 4), и более подробно раскрывают взаимодействие субъединиц комплекса. Комплекс представляет собой гомодимер гетеропентамеров Tom40 c Том5, Tom6, Tom7, Tom22. Tom40 является ß-бочонком из 19 ß-листов и структурно схож с семьей потенциал-зависимых анионных каналов (VDAC)[46,47]. Все остальные белки TOM комплекса обладают одной трансмембранной а-спиралью, которой связываются с Tom40 внутри мембраны (рис. 4). В димере белки Tom40 плотно контактируют ß-листами ß1;18;19 внутри мембраны со стороны цитоплазмы, при этом ß-бочонки сильно наклонены — на 40° к нормали от мембраны. Образовавшееся клиновидное пространство со стороны межмембранного пространства заняты Tom22. Сильное взаимодействие ß1 ; ß18; ß19 делает маловероятным возможность латерального раскрытия комплекса или пропускания белков большего, чем пора размера.

Малые белки Tom взаимодействуют с Tom40 благодаря гидрофобному взаимодействию, поверхностной комплементарности боковых цепей и взаимодействию полярных аминокислот около поверхности мембраны [45]. Предположительно их роль заключается в стабилизации комплекса.

Работы с фотоактивиривуемым кросс-линкингом[42] предоставили свидетельства прохода белка непосредственно через пору Tom40 благодаря обнаруженной близости белка-прекурсора с внутренностью поры. Интересно, что два различных типа сигнальной последовательности (положительно заряженной и гидрофобной) оказались связаны с различными участками Tom40. Сам же комплекс TOM претерпевает структурные изменения во время транспорта белка[48,49].

Конкретная функциональная роль димера неясна. Возможно, такая организация помогает связыванию с активно транслирующей рибосомой, за счет локального удвоения сайтов распознавания. Остается непонятным, обе ли поры комплекса одновременно активны или же только одна из них.

Пора имеет входные отверстия размером 30 на 25 Ас обеих сторон мембраны, однако сужается до 19 на 13 А в самом узком месте канала, что позволяет проходить через канал одновременно одной а-спирали. Внутренность поверхность поры устлана отрицательно заряженными остатками, что объясняет ее селективность для катионов (соотношение проходящих ионов K+:Cl- - 8:1)[50]. Негативный заряд поверхности нужен, вероятно, для взаимодействия с положительно заряженными амфифильными сигнальными митохондриальными последовательностями [51]. Причем более отрицательно заряженные части поры находятся со стороны межмембранного пространства митохондрии, что помогает продвигать положительно заряженный сигнальный фрагмент в глубину поры.

Существуют свидетельства обратного транспорта белков сквозь комплекс TOM[52] — из межмембранного пространства в цитоплазму. Авторы исследования предполагают, что обратный транспорт позволяет регулировать белковый состав межмембранного пространства и возможно убирать неправильно сфолдированные белки для обработки более сложными цитоплазматическими системами контроля качества.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Богородский Андрей Олегович, 2022 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Schwartz M.P., Huang S., Matouschek A. The structure of precursor proteins during import into mitochondria // J. Biol. Chem. American Society for Biochemistry and Molecular Biology Inc., 1999. Vol. 274, №№ 18. P. 12759-12764.

2. Vlasov A. V. et al. Raman Scattering: From Structural Biology to Medical Applications // Crystals. 2020. Vol. 10, № 1. P. 38.

3. Boyle J. Molecular biology of the cell, 5th edition by B. Alberts, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, and P. Walter // Biochem. Mol. Biol. Educ. John Wiley & Sons, Ltd, 2008. Vol. 36, № 4. P. 317-318.

4. Crompton M., Virji S., Ward J.M. Cyclophilin-D binds strongly to complexes of the voltage-dependent anion channel and the adenine nucleotide translocase to form the permeability transition pore. // Eur. J. Biochem. England, 1998. Vol. 258, № 2. P. 729-735.

5. Ellenrieder L. et al. Dual Role of Mitochondrial Porin in Metabolite Transport across the Outer Membrane and Protein Transfer to the Inner Membrane // Mol. Cell. Cell Press, 2019. Vol. 73, № 5. P. 1056-1065.e7.

6. Anderson S. et al. Sequence and organization of the human mitochondrial genome // Nature. Nature Publishing Group, 1981. Vol. 290, № 5806. P. 457-465.

7. O'Brien T. Properties of Human Mitochondrial Ribosomes // IUBMB Life (International Union Biochem. Mol. Biol. Life). 2003. Vol. 55, № 9. P. 505-513.

8. Liu M., Spremulli L. Interaction of mammalian mitochondrial ribosomes with the inner membrane // J. Biol. Chem. JBC Papers in Press, 2000. Vol. 275, № 38. P. 29400-29406.

9. Breton S. et al. A resourceful genome: Updating the functional repertoire and evolutionary role of animal mitochondrial DNAs // Trends in Genetics. Elsevier Ltd, 2014. Vol. 30, № 12. P. 555-564.

10. Yang D. et al. Mitochondrial origins // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1985. Vol. 82, № 13. P. 4443-4447.

11. Gray M.W. Rickettsia, typhus and the mitochondrial connection // Nature. 1998. Vol. 396, № 6707. P. 109-110.

12. Szklarczyk R., Huynen M.A. Mosaic origin of the mitochondrial proteome // Proteomics. 2010. Vol. 10, № 22. P. 4012-4024.

13. Richly E., Chinnery P.F., Leister D. Evolutionary diversification of mitochondrial proteomes: Implications for human disease // Trends in Genetics. Elsevier Ltd, 2003. Vol. 19, № 7. P. 356-362.

14. Pfanner N., Warscheid B., Wiedemann N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2019. Vol. 20, № 5. P. 267284.

15. Morgenstern M. et al. Definition of a High-Confidence Mitochondrial Proteome at Quantitative Scale // Cell Rep. Elsevier B.V., 2017. Vol. 19, № 13. P. 2836-2852.

16. Harbauer A.B. et al. Cell cycle-dependent regulation of mitochondrial preprotein translocase // Science (80-. ). American Association for the Advancement of Science, 2014. Vol. 346, № 6213. P. 1109-1113.

17. Gerbeth C. et al. Glucose-induced regulation of protein import receptor tom22 by cytosolic and mitochondria-bound kinases // Cell Metab. Cell Press, 2013. Vol. 18, № 4. P. 578-587.

18. Rao S. et al. Biogenesis of the preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane: Protein kinase A phosphorylates the precursor of Tom40 and impairs its import // Mol. Biol. Cell. American Society for Cell Biology, 2012. Vol. 23, № 9. P. 1618-1627.

19. Schmidt O. et al. Regulation of mitochondrial protein import by cytosolic kinases // Cell. 2011. Vol. 144, № 2. P. 227-239.

20. von der Malsburg K. et al. Dual Role of Mitofilin in Mitochondrial Membrane Organization and Protein Biogenesis // Dev. Cell. 2011. Vol. 21, № 4. P. 694-707.

21. Ott C. et al. Sam50 Functions in Mitochondrial Intermembrane Space Bridging and Biogenesis of Respiratory Complexes // Mol. Cell. Biol. American Society for Microbiology, 2012. Vol. 32, № 6. P. 1173-1188.

22. Harner M. et al. The mitochondrial contact site complex, a determinant of mitochondrial architecture // EMBO J. 2011. Vol. 30, № 21. P. 4356-4370.

23. Aaltonen M.J. et al. MIC OS and phospholipid transfer by Ups2-Mdm35 organize membrane lipid synthesis in mitochondria // J. Cell Biol. Rockefeller University Press, 2016. Vol. 213, № 5. P. 525-534.

24. Neupert W. A perspective on transport of proteins into mitochondria: A myriad of open questions // J. Mol. Biol. Academic Press, 2015. Vol. 427, № 6. P. 11351158.

25. Chacinska A. et al. Importing Mitochondrial Proteins: Machineries and Mechanisms // Cell. 2009. Vol. 138, № 4. P. 628-644.

26. leva R. et al. Mgr2 functions as lateral gatekeeper for preprotein sorting in the mitochondrial inner membrane // Mol. Cell. Cell Press, 2014. Vol. 56, № 5. P. 641652.

27. Stiller S.B. et al. Mitochondrial OXA Translocase Plays a Major Role in Biogenesis of Inner-Membrane Proteins // Cell Metab. Cell Press, 2016. Vol. 23, № 5. P. 901-908.

28. Sickmann A. et al. The proteome of Saccharomyces cerevisiae mitochondria. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003. Vol. 100, № 23. P. 13207-13212.

29. Sirrenberg C. et al. Import of carrier proteins into the mitochondrial inner membrane mediated by Tim22 // Nature. 1996. Vol. 384, № 6609. P. 582-585.

30. Neal S.E. et al. Mia40 protein serves as an electron sink in the Mia40-Erv1 import pathway // J. Biol. Chem. American Society for Biochemistry and Molecular Biology Inc., 2015. Vol. 290, № 34. P. 20804-20814.

31. Kojer K. et al. Kinetic control by limiting glutaredoxin amounts enables thiol oxidation in the reducing mitochondrial intermembrane space // Mol. Biol. Cell. American Society for Cell Biology, 2015. Vol. 26, № 2. P. 195-204.

32. Chacinska A. et al. Essential role of Mia40 in import and assembly of mitochondrial intermembrane space proteins // EMBO J. 2004. Vol. 23, № 19. P. 3735-3746.

33. Mesecke N. et al. A disulfide relay system in the intermembrane space of mitochondria that mediates protein import // Cell. 2005. Vol. 121, № 7. P. 10591069.

34. Becker T. et al. The mitochondrial import protein Miml promotes biogenesis of multispanning outer membrane proteins // J. Cell Biol. 2011. Vol. 194, № 3. P. 387-395.

35. Papic D. et al. Multispan mitochondrial outer membrane protein Ugo1 follows a unique Miml -dependent import pathway // J. Cell Biol. The Rockefeller University Press, 2011. Vol. 194, № 3. P. 397-405.

36. Popov-Celeketic J., Waizenegger T., Rapaport D. Mim1 Functions in an Oligomeric Form to Facilitate the Integration of Tom20 into the Mitochondrial Outer Membrane // J. Mol. Biol. Academic Press, 2008. Vol. 376, № 3. P. 671680.

37. Wiedemann N., Pfanner N. Mitochondrial Machineries for Protein Import and Assembly // Annu. Rev. Biochem. Annual Reviews, 2017. Vol. 86, № 1. P. 685714.

38. Pfanner N. et al. Uniform nomenclature for the protein transport machinery of the mitochondrial membranes // Trends Biochem. Sci. 1996. Vol. 21, № 2. P. 51-52.

39. Lithgow T. et al. The mitochondrial outer membrane protein Mas22p is essential for protein import and viability of yeast // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994. Vol. 91, № 25. P. 11973-11977.

40. Dekker P.J.T. et al. Preprotein Translocase of the Outer Mitochondrial Membrane: Molecular Dissection and Assembly of the General Import Pore Complex // Mol. Cell. Biol. American Society for Microbiology, 1998. Vol. 18, № 11. P. 65156524.

41. Ahting U. et al. The TOM core complex: The general protein import pore of the outer membrane of mitochondria // J. Cell Biol. The Rockefeller University Press, 1999. Vol. 147, № 5. P. 959-968.

42. Shiota T. et al. Molecular architecture of the active mitochondrial protein gate //

Science (80-. ). American Association for the Advancement of Science, 2015. Vol. 349, № 6255. P. 1544-1548.

43. Araiso Y. et al. Structure of the mitochondrial import gate reveals distinct preprotein paths // Nature. Nature Publishing Group, 2019. Vol. 575, № 7782. P. 395-401.

44. Yamano K., Tanaka-Yamano S., Endo T. Tom7 regulates Mdm10-mediated assembly of the mitochondrial import channel protein TOM40 // J. Biol. Chem. American Society for Biochemistry and Molecular Biology, 2010. Vol. 285, № 53. P. 41222-41231.

45. Tucker K., Park E. Cryo-EM structure of the mitochondrial protein-import channel TOM complex at near-atomic resolution // Nat. Struct. Mol. Biol. Nature Research, 2019. Vol. 26, № 12. P. 1158-1166.

46. Bayrhuber M. et al. Structure of the human voltage-dependent anion channel // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2008. Vol. 105, № 40. P. 15370-15375.

47. Lackey S.W.K. et al. Evidence supporting the 19 ß-strand model for Tom40 from cysteine scanning and protease site accessibility studies // J. Biol. Chem. American Society for Biochemistry and Molecular Biology Inc., 2014. Vol. 289, № 31. P. 21640-21650.

48. Rapaport D. et al. Dynamics of the TOM Complex of Mitochondria during Binding and Translocation of Preproteins // Mol. Cell. Biol. American Society for Microbiology, 1998. Vol. 18, № 9. P. 5256-5262.

49. Shiota T. et al. In vivo protein-interaction mapping of a mitochondrial translocator protein Tom22 at work // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2011. Vol. 108, № 37. P. 15179-15183.

50. Hill K. et al. Tom40 forms the hydrophilic channel of the mitochondrial import pore for preproteins // Nature. Nature Publishing Group, 1998. Vol. 395, № 6701. P. 516-521.

51. Da Cruz S. et al. Proteomic Analysis of the Mouse Liver Mitochondrial Inner Membrane // J. Biol. Chem. American Society for Biochemistry and Molecular

Biology, 2003. Vol. 278, № 42. P. 41566-41571.

52. Bragoszewski P. et al. Retro-translocation of mitochondrial intermembrane space proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. National Academy of Sciences, 2015. Vol. 112, № 25. P. 7713-7718.

53. Bolliger L. et al. Acidic receptor domains on both sides of the outer membrane mediate translocation of precursor proteins into yeast mitochondria. // EMBO J. Wiley, 1995. Vol. 14, № 24. P. 6318-6326.

54. Moczko M. et al. The intermembrane space domain of mitochondrial Tom22 functions as a trans binding site for preproteins with N-terminal targeting sequences. // Mol. Cell. Biol. American Society for Microbiology, 1997. Vol. 17, № 11. P. 6574-6584.

55. Waegemann K. et al. Cooperation of TOM and TIM23 complexes during translocation of proteins into mitochondria // J. Mol. Biol. Academic Press, 2015. Vol. 427, № 5. P. 1075-1084.

56. Young J.C., Hoogenraad N.J., Hartl F.U. Molecular chaperones Hsp90 and Hsp70 deliver preproteins to the mitochondrial import receptor Tom70 // Cell. Cell Press, 2003. Vol. 112, № 1. P. 41-50.

57. Wu Y., Sha B. Crystal structure of yeast mitochondrial outer membrane translocon member Tom70p // Nat. Struct. Mol. Biol. 2006. Vol. 13, № 7. P. 589-593.

58. Kozjak-Pavlovic V. et al. Neisserial Omp85 protein is selectively recognized and assembled into functional complexes in the outer membrane of human mitochondria // J. Biol. Chem. American Society for Biochemistry and Molecular Biology, 2011. Vol. 286, № 30. P. 27019-27026.

59. Ulrich T. et al. Evolutionary conservation in biogenesis of ß-barrel proteins allows mitochondria to assemble a functional bacterial trimeric autotransporter protein // J. Biol. Chem. American Society for Biochemistry and Molecular Biology Inc., 2014. Vol. 289, № 43. P. 29457-29470.

60. Kutik S. et al. Dissecting Membrane Insertion of Mitochondrial ß-Barrel Proteins // Cell. Cell Press, 2008. Vol. 132, № 6. P. 1011-1024.

61. Qiu J. et al. Coupling of mitochondrial import and export translocases by receptor-mediated supercomplex formation // Cell. 2013. Vol. 154, № 3. P. 596-608.

62. Wenz L.S. et al. Sam37 is crucial for formation of the mitochondrial TOM-SAM supercomplex, thereby promoting ß-barrel biogenesis // J. Cell Biol. Rockefeller University Press, 2015. Vol. 210, № 7. P. 1047-1054.

63. Meisinger C. et al. The mitochondrial morphology protein Mdm10 functions in assembly of the preprotein translocase of the outer membrane // Dev. Cell. 2004. Vol. 7, № 1. P. 61-71.

64. Meisinger C. et al. Mitochondrial protein sorting: Differentiation of ß-barrel assembly by Tom7-mediated segregation of Mdm10 // J. Biol. Chem. 2006. Vol. 281, № 32. P. 22819-22826.

65. Model K. et al. Multistep assembly of the protein import channel of the mitochondrial outer membrane // Nat. Struct. Biol. Nature Publishing Group, 2001. Vol. 8, № 4. P. 361-370.

66. Ellenrieder L., Märtensson C.U., Becker T. Biogenesis of mitochondrial outer membrane proteins, problems and diseases // Biological Chemistry. Walter de Gruyter GmbH, 2015. Vol. 396, № 11. P. 1199-1213.

67. Dimmer K.S. et al. A crucial role for Mim2 in the biogenesis of mitochondrial outer membrane proteins // J. Cell Sci. 2012. Vol. 125, № 14. P. 3464-3473.

68. Setoguchi K., Otera H., Mihara K. Cytosolic factor- and TOM-independent import of C-tail-anchored mitochondrial outer membrane proteins // EMBO J. European Molecular Biology Organization, 2006. Vol. 25, № 24. P. 5635-5647.

69. Kemper C. et al. Integration of tail-anchored proteins into the mitochondrial outer membrane does not require any known import components // J. Cell Sci. The Company of Biologists Ltd, 2008. Vol. 121, № 12. P. 1990-1998.

70. Song J. et al. A novel import route for an N-anchor mitochondrial outer membrane protein aided by the TIM23 complex // EMBO Rep. Nature Publishing Group, 2014. Vol. 15, № 6. P. 670-677.

71. Chacinska A. et al. Mitochondrial presequence translocase: Switching between

TOM tethering and motor recruitment involves Tim21 and Tim17 // Cell. Cell Press, 2005. Vol. 120, № 6. P. 817-829.

72. Dekker P.J.T. et al. The Tim core complex defines the number of mitochondrial translocation contact sites and can hold arrested preproteins in the absence of matrix Hsp70-Tim44 // EMBO J. 1997. Vol. 16, № 17. P. 5408-5419.

73. Gold V.A.M. et al. Visualizing active membrane protein complexes by electron cryotomography // Nat. Commun. Nature Publishing Group, 2014. Vol. 5.

74. Chacinska A. et al. Distinct Forms of Mitochondrial TOM-TIM Supercomplexes Define Signal-Dependent States of Preprotein Sorting // Mol. Cell. Biol. American Society for Microbiology, 2010. Vol. 30, № 1. P. 307-318.

75. van der Laan M. et al. A Role for Tim21 in Membrane-Potential-Dependent Preprotein Sorting in Mitochondria // Curr. Biol. 2006. Vol. 16, № 22. P. 22712276.

76. Lytovchenko O. et al. Signal recognition initiates reorganization of the presequence translocase during protein import // EMBO J. 2013. Vol. 32, № 6. P. 886-898.

77. Sinha D. et al. Unraveling the Intricate Organization of Mammalian Mitochondrial Presequence Translocases: Existence of Multiple Translocases for Maintenance of Mitochondrial Function // Mol. Cell. Biol. American Society for Microbiology, 2014. Vol. 34, № 10. P. 1757-1775.

78. Mick D.U. et al. MITRAC links mitochondrial protein translocation to respiratory-chain assembly and translational regulation // Cell. 2012. Vol. 151, № 7. P. 15281541.

79. Meinecke M. et al. Tim50 maintains the permeability barrier of the mitochondrial inner membrane // Science (80-. ). 2006. Vol. 312, № 5779. P. 1523-1526.

80. Bauer M.F. et al. Role of Tim23 as voltage sensor and presequence receptor in protein import into mitochondria // Cell. Cell Press, 1996. Vol. 87, № 1. P. 33-41.

81. Martin J., Mahlke K., Pfanner N. Role of an energized inner membrane in mitochondrial protein import: AY drives the movement of presequences // J. Biol.

Chem. 1991. Vol. 266, № 27. P. 18051-18057.

82. Denkert N. et al. Cation selectivity of the presequence translocase channel Tim23 is crucial for efficient protein import // Elife. eLife Sciences Publications Ltd, 2017. Vol. 6.

83. Marom M. et al. Direct interaction of mitochondrial targeting presequences with purified components of the TIM23 protein complex // J. Biol. Chem. 2011. Vol. 286, № 51. P. 43809-43815.

84. Kang P.J. et al. Requirement for hsp70 in the mitochondrial matrix for translocation and folding of precursor proteins // Nature. 1990. Vol. 348, № 6297. P. 137-143.

85. De Los Rios P. et al. Hsp70 chaperones accelerate protein translocation and the unfolding of stable protein aggregates by entropic pulling // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2006. Vol. 103, № 16. P. 6166-6171.

86. Ostermann J. et al. Protein folding in mitochondria requires complex formation with hsp60 and ATP hydrolysis // Nature. 1989. Vol. 341, № 6238. P. 125-130.

87. Schendzielorz A.B. et al. Motor recruitment to the TIM23 channel's lateral gate restricts polypeptide release into the inner membrane // Nat. Commun. Nature Publishing Group, 2018. Vol. 9, № 1.

88. Lee S. et al. The Mgr2 subunit of the TIM23 complex regulates membrane insertion of marginal stop-transfer signals in the mitochondrial inner membrane // FEBS Lett. Wiley Blackwell, 2020. Vol. 594, № 6. P. 1081-1087.

89. Hawlitschek G. et al. Mitochondrial protein import: Identification of processing peptidase and of PEP, a processing enhancing protein // Cell. 1988. Vol. 53, № 5. P. 795-806.

90. Mossmann D., Meisinger C., Vögtle F.N. Processing of mitochondrial presequences // Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. 2012. Vol. 1819, № 9-10. P. 1098-1106.

91. Glick B.S. et al. Cytochromes c1 and b2 are sorted to the intermembrane space of yeast mitochondria by a stop-transfer mechanism // Cell. 1992. Vol. 69, № 5. P. 809-822.

92. Hell K., Neupert W., Stuart R.A. Oxa1p acts as a general membrane insertion machinery for proteins encoded by mitochondrial DNA // EMBO J. Oxford University Press, 2001. Vol. 20, № 6. P. 1281-1288.

93. Pfeffer S. et al. Organization of the mitochondrial translation machinery studied in situ by cryoelectron tomography // Nat. Commun. Nature Publishing Group, 2015. Vol. 6.

94. Park K. et al. Dissecting stop transfer versus conservative sorting pathways for mitochondrial inner membrane proteins in vivo // J. Biol. Chem. 2013. Vol. 288, № 3. P. 1521-1532.

95. Gebert N. et al. Assembly of the three small Tim proteins precedes docking to the mitochondrial carrier translocase // EMBO Rep. John Wiley & Sons, Ltd, 2008. Vol. 9, № 6. P. 548-554.

96. Wagner K. et al. The assembly pathway of the mitochondrial carrier translocase involves four preprotein translocases. // Mol. Cell. Biol. 2008. Vol. 28, № 13. P. 4251-4260.

97. Gebert N. et al. Dual function of Sdh3 in the respiratory chain and TIM22 protein translocase of the mitochondrial inner membrane. // Mol. Cell. United States, 2011. Vol. 44, № 5. P. 811-818.

98. Reddy A.B. et al. Circadian Orchestration of the Hepatic Proteome // Curr. Biol. 2006. Vol. 16, № 11. P. 1107-1115.

99. Benegiamo G. et al. The RNA-Binding Protein NONO Coordinates Hepatic Adaptation to Feeding // Cell Metab. Cell Press, 2018. Vol. 27, № 2. P. 404-418.e7.

100. Miller M.T., Higgin J.J., Tanaka Hall T.M. Basis of altered RNA-binding specificity by PUF proteins revealed by crystal structures of yeast Puf4p // Nat. Struct. Mol. Biol. 2008. Vol. 15, № 4. P. 397-402.

101. Zhu D. et al. A 5' cytosine binding pocket in Puf3p specifies regulation of mitochondrial mRNAs // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. National Academy of Sciences, 2009. Vol. 106, № 48. P. 20192-20197.

102. Saint-Georges Y. et al. Yeast Mitochondrial Biogenesis: A Role for the PUF RNA-

Binding Protein Puf3p in mRNA Localization // PLoS One / ed. Bähler J. Public Library of Science, 2008. Vol. 3, № 6. P. e2293.

103. Gerber A.P., Herschlag D., Brown P.O. Extensive association of functionally and cytotopically related mRNAs with Puf family RNA-binding proteins in yeast // PLoS Biol. 2004. Vol. 2, № 3.

104. Saint-Georges Y. et al. Yeast mitochondrial biogenesis: A role for the PUF RNA-binding protein puf3p in mRNA localization // PLoS One. 2008. Vol. 3, № 6.

105. Lapointe C.P. et al. Multi-omics Reveal Specific Targets of the RNA-Binding Protein Puf3p and Its Orchestration of Mitochondrial Biogenesis // Cell Syst. Cell Press, 2018. Vol. 6, № 1. P. 125-135.e6.

106. Olivas W. The Puf3 protein is a transcript-specific regulator of mRNA degradation in yeast // EMBO J. Wiley, 2000. Vol. 19, № 23. P. 6602-6611.

107. Lee D. et al. PUF3 acceleration of deadenylation in vivo can operate independently of CCR4 activity, possibly involving effects on the PAB1-mRNP structure // J. Mol. Biol. 2010. Vol. 399, № 4. P. 562-575.

108. Rowe W. et al. Puf3p induces translational repression of genes linked to oxidative stress // Nucleic Acids Res. 2014. Vol. 42, № 2. P. 1026-1041.

109. Kershaw C.J. et al. Integrated multi-omics analyses reveal the pleiotropic nature of the control of gene expression by Puf3p // Sci. Rep. Nature Publishing Group, 2015. Vol. 5.

110. Wang Z. et al. Novel insights into global translational regulation through Pumilio family RNA-binding protein Puf3p revealed by ribosomal profiling // Curr. Genet. Springer Verlag, 2019. Vol. 65, № 1. P. 201-212.

111. Foat B.C. et al. Profiling condition-specific, genome-wide regulation of mRNA stability in yeast // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005. Vol. 102, № 49. P. 1767517680.

112. Garcia-Rodriguez L.J., Gay A.C., Pon L.A. Puf3p, a Pumilio family RNA binding protein, localizes to mitochondria and regulates mitochondrial biogenesis and motility in budding yeast // J. Cell Biol. 2007. Vol. 176, № 2. P. 197-207.

113. Eliyahu E. et al. Tom20 mediates localization of mRNAs to mitochondria in a translation-dependent manner. // Mol. Cell. Biol. 2010. Vol. 30, № 1. P. 284-294.

114. Bohn J.A. et al. Identification of diverse target RNAs that are functionally regulated by human pumilio proteins // Nucleic Acids Res. Oxford University Press, 2018. Vol. 46, № 1. P. 362-386.

115. Gehrke S. et al. PINK1 and parkin control localized translation of respiratory chain component mRNAs on mitochondria outer membrane // Cell Metab. Cell Press,

2015. Vol. 21, № 1. P. 95-108.

116. Zhu Q. et al. The cluA- mutant of Dictyostelium identifies a novel class of proteins required for dispersion of mitochondria // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997. Vol. 94, № 14. P. 7308-7313.

117. Gao J. et al. CLUH regulates mitochondrial biogenesis by binding mRNAs of nuclear-encoded mitochondrial proteins // J. Cell Biol. Rockefeller University Press, 2014. Vol. 207, № 2. P. 213-223.

118. Wakim J. et al. CLUH couples mitochondrial distribution to the energetic and metabolic status // J. Cell Sci. Company of Biologists Ltd, 2017. Vol. 130, № 11. P. 1940-1951.

119. Schatton D. et al. CLUH regulates mitochondrial metabolism by controlling translation and decay of target mRNAs // J. Cell Biol. 2017. Vol. 216, № 3. P. 675693.

120. Sen A., Cox R.T. Clueless is a conserved ribonucleoprotein that binds the ribosome at the mitochondrial outer membrane // Biol. Open. Company of Biologists Ltd,

2016. Vol. 5, № 2. P. 195-203.

121. Cox R.T., Spradling A.C. Clueless, a conserved Drosophila gene required for mitochondrial subcellular localization, interacts genetically with parkin // DMM Dis. Model. Mech. 2009. Vol. 2, № 9-10. P. 490-499.

122. Fazal F.M. et al. Atlas of Subcellular RNA Localization Revealed by APEX-Seq // Cell. Cell Press, 2019. Vol. 178, № 2. P. 473-490.e26.

123. Segev N., Gerst J.E. Specialized ribosomes and specific ribosomal protein paralogs

control translation of mitochondrial proteins // J. Cell Biol. Rockefeller University Press, 2018. Vol. 217, № 1. P. 117-126.

124. Richter J.D., Coller J. Pausing on Polyribosomes: Make Way for Elongation in Translational Control // Cell. Cell Press, 2015. Vol. 163, № 2. P. 292-300.

125. Wilson D.N., Nierhaus K.H. The E-site story: The importance of maintaining two tRNAs on the ribosome during protein synthesis // Cellular and Molecular Life Sciences. 2006. Vol. 63, № 23. P. 2725-2737.

126. Letzring D.P. et al. Translation of CGA codon repeats in yeast involves quality control components and ribosomal protein L1 // RNA. 2013. Vol. 19, № 9. P. 1208-1217.

127. del Alamo M. et al. Defining the specificity of cotranslationally acting chaperones by systematic analysis of mRNAs associated with ribosome-nascent chain complexes // PLoS Biol. 2011. Vol. 9, № 7.

128. George R. et al. The nascent polypeptide-associated complex (NAC) promotes interaction of ribosomes with the mitochondrial surface in vivo // FEBS Lett. 2002. Vol. 516, № 1-3. P. 213-216.

129. Lesnik C. et al. OM14 is a mitochondrial receptor for cytosolic ribosomes that supports co-translational import into mitochondria // Nat. Commun. Nature Publishing Group, 2014. Vol. 5.

130. Kellems R.E., Allison V.F., Butow R.A. Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. II. Evidence for the association of cytoplasmic ribosomes with the outer mitochondrial membrane in situ // J. Biol. Chem. 1974. Vol. 249, № 10. P. 3297-3303.

131. Kellems R.E., Allison V.F., Butow R.A. Cytoplasmic type 80s ribosomes associated with yeast mitochondria: IV. Attachment of ribosomes to the outer: Membrane of isolated mitochondria // J. Cell Biol. 1975. Vol. 65, № 1. P. 1-14.

132. Knox C. et al. Import into mitochondria, folding and retrograde movement of fumarase in yeast // J. Biol. Chem. American Society for Biochemistry and Molecular Biology, 1998. Vol. 273, № 40. P. 25587-25593.

133. Egea G. et al. MRNA encoding the ß-subunit of the mitochondrial F1-ATPase complex is a localized mRNA in rat hepatocytes // Biochem. J. Portland Press Ltd, 1997. Vol. 322, № 2. P. 557-565.

134. Ricart J. et al. Subcellular structure containing mRNA for ß subunit of mitochondrial H+-ATP synthase in rat hepatocytes is translationally active // Biochem. J. Portland Press Ltd, 1997. Vol. 324, № 2. P. 635-643.

135. Marc P. et al. Genome-wide analysis of mRNAs targeted to yeast mitochondria // EMBO Rep. European Molecular Biology Organization, 2002. Vol. 3, № 2. P. 159.

136. Sylvestre J. et al. Long mRNAs coding for yeast mitochondrial proteins of prokaryotic origin preferentially localize to the vicinity of mitochondria. // Genome Biol. BioMed Central, 2003. Vol. 4, № 7. P. R44.

137. Johansson H.E., Liljas L., Uhlenbeck O.C. RNA recognition by the MS2 phage coat protein // Semin. Virol. Academic Press Inc., 1997. Vol. 8, № 3. P. 176-185.

138. Haim L. et al. A genomic integration method to visualize localization of endogenous mRNAs in living yeast // Nat. Methods. 2007. Vol. 4, № 5. P. 409412.

139. Gadir N. et al. Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae // RNA. 2011. Vol. 17, № 8. P. 1551-1565.

140. Garcia M. et al. Mitochondria-associated yeast mRNAs and the biogenesis of molecular complexes // Mol. Biol. Cell. American Society for Cell Biology, 2007. Vol. 18, № 2. P. 362-368.

141. Williams C.C., Jan C.H., Weissman J.S. Targeting and plasticity of mitochondrial proteins revealed by proximity-specific ribosome profiling // Science (80-. ). American Association for the Advancement of Science, 2014. Vol. 346, № 6210. P. 748-751.

142. Juszkiewicz S., Hegde R.S. Quality Control of Orphaned Proteins // Molecular Cell. Cell Press, 2018. Vol. 71, № 3. P. 443-457.

143. Lam S.S. et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling // Nat. Methods. Nature Publishing Group, 2014. Vol. 12, № 1.

P. 51-54.

144. Corral-Debrinski M., Blugeon C., Jacq C. In Yeast, the 3' Untranslated Region or the Presequence ofATM1 Is Required for the Exclusive Localization of Its mRNA to the Vicinity of Mitochondria // Mol. Cell. Biol. American Society for Microbiology, 2000. Vol. 20, № 21. P. 7881-7892.

145. Eliyahu E. et al. Tom20 Mediates Localization of mRNAs to Mitochondria in a Translation-Dependent Manner // Mol. Cell. Biol. American Society for Microbiology, 2010. Vol. 30, № 1. P. 284-294.

146. Kaltimbacher V. et al. mRNA localization to the mitochondrial surface allows the efficient translocation inside the organelle of a nuclear recoded ATP6 protein // RNA. 2006. Vol. 12, № 7. P. 1408-1417.

147. Gautschi M. et al. RAC, a stable ribosome-associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs Ssz1p and zuotin // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. National Academy of Sciences, 2001. Vol. 98, № 7. P. 3762-3767.

148. Sheffield WP, Shore GC, Randall SK. Mitochondrial precursor protein. Effects of 70-kilodalton heat shock protein on polypeptide folding, aggregation, and import competence. - PubMed - NCBI // J Biol Chem. 1990. Vol. 265, № 19. P. 1106911076.

149. Schmidt O. et al. Regulation of mitochondrial protein import by cytosolic kinases // Cell. Cell Press, 2011. Vol. 144, № 2. P. 227-239.

150. Fan A.C.Y., Bhangoo M.K., Young J.C. Hsp90 functions in the targeting and outer membrane translocation steps of Tom70-mediated mitochondrial import // J. Biol. Chem. 2006. Vol. 281, № 44. P. 33313-33324.

151. Faou P., Hoogenraad N.J. Tom34: A cytosolic cochaperone of the Hsp90/Hsp70 protein complex involved in mitochondrial protein import // Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. Elsevier, 2012. Vol. 1823, № 2. P. 348-357.

152. Opalinski L. et al. Recruitment of Cytosolic J-Proteins by TOM Receptors Promotes Mitochondrial Protein Biogenesis // Cell Rep. Elsevier B.V., 2018. Vol. 25, № 8. P. 2036-2043.e5.

153. Hoseini H. et al. The cytosolic cochaperone Sti1 is relevant for mitochondrial biogenesis and morphology // FEBS J. Blackwell Publishing Ltd, 2016. Vol. 283, № 18. P. 3338-3352.

154. Jores T. et al. Cytosolic Hsp70 and Hsp40 chaperones enable the biogenesis of mitochondrial ß-barrel proteins // J. Cell Biol. Rockefeller University Press, 2018. Vol. 217, № 9. P. 3091-3108.

155. Papic D. et al. The Role of Djp1 in Import of the Mitochondrial Protein Mim1 Demonstrates Specificity between a Cochaperone and Its Substrate Protein // Mol. Cell. Biol. American Society for Microbiology, 2013. Vol. 33, № 20. P. 40834094.

156. Sahi C. et al. Sequential duplications of an ancient member of the DnaJ-family expanded the functional chaperone network in the eukaryotic cytosol. // Mol. Biol. Evol. 2013. Vol. 30, № 5. P. 985-998.

157. Jores T. et al. Characterization of the targeting signal in mitochondrial ß-barrel proteins // Nat. Commun. Nature Publishing Group, 2016. Vol. 7.

158. Kampinga H.H., Craig E.A. The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2010. Vol. 11, № 8. P. 579592.

159. Zara V. et al. Mitochondrial carrier protein biogenesis: role of the chaperones Hsc70 and Hsp90. // Biochem. J. 2009. Vol. 419, № 2. P. 369-375.

160. Pickrell A.M., Youle R.J. The roles of PINK1, Parkin, and mitochondrial fidelity in parkinson's disease // Neuron. Cell Press, 2015. Vol. 85, № 2. P. 257-273.

161. Zhang Y. et al. APP processing in Alzheimer's disease. // Mol. Brain. 2011. Vol. 4. P. 3.

162. Mawuenyega K.G. et al. Decreased clearance of CNS beta-amyloid in Alzheimer's disease. // Science. 2010. Vol. 330, № 6012. P. 1774.

163. Wirths O., Bayer T.A. Intraneuronal Aß accumulation and neurodegeneration: lessons from transgenic models. // Life Sci. Netherlands, 2012. Vol. 91, № 23-24. P. 1148-1152.

164. Cenini G. et al. Amyloid ß-peptides interfere with mitochondrial preprotein import competence by a coaggregation process // Mol. Biol. Cell / ed. Gilmore R. American Society for Cell Biology, 2016. Vol. 27, № 21. P. 3257-3272.

165. Stewart M.P. et al. In vitro and ex vivo strategies for intracellular delivery. // Nature. England, 2016. Vol. 538, № 7624. P. 183-192.

166. Bar-Sagi D., Feramisco J.R. Microinjection of the ras oncogene protein into PC12 cells induces morphological differentiation // Cell. Elsevier, 1985. Vol. 42, № 3. P. 841-848.

167. Derfus A.M., Chan W.C.W., Bhatia S.N. Intracellular delivery of quantum dots for live cell labeling and organelle tracking // Adv. Mater. John Wiley & Sons, Ltd, 2004. Vol. 16, № 12. P. 961-966.

168. Dange T. et al. Autonomy and robustness of translocation through the nuclear pore complex: a single-molecule study // J. Cell Biol. 2008. Vol. 183, № 1. P. 77-86.

169. Sakon J.J., Weninger K.R. Detecting the conformation of individual proteins in live cells // Nat. Methods. 2010. Vol. 7, № 3. P. 203-205.

170. Soman P. et al. Femtosecond laser-assisted optoporation for drug and gene delivery into single mammalian cells // J. Biomed. Nanotechnol. 2011. Vol. 7, № 3. P. 334341.

171. Alex A. et al. Electroporated recombinant proteins as tools for in vivo functional complementation, imaging and chemical biology // Elife. eLife Sciences Publications Ltd, 2019. Vol. 8.

172. Duchardt F. et al. A comprehensive model for the cellular uptake of cationic cell-penetrating peptides. // Traffic. England, 2007. Vol. 8, № 7. P. 848-866.

173. Madani F. et al. Mechanisms of cellular uptake of cell-penetrating peptides. // J. Biophys. 2011. Vol. 2011. P. 414729.

174. Brock R. The uptake of arginine-rich cell-penetrating peptides: Putting the puzzle together // Bioconjugate Chemistry. American Chemical Society, 2014. Vol. 25, № 5. P. 863-868.

175. Kaczmarczyk S.J. et al. Protein delivery using engineered virus-like particles //

Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. National Academy of Sciences, 2011. Vol. 108, № 41. P. 16998-17003.

176. Thompson D.B., Cronican J.J., Liu D.R. Engineering and identifying supercharged proteins for macromolecule delivery into mammalian cells // Methods in Enzymology. Academic Press Inc., 2012. Vol. 503. P. 293-319.

177. McNaughton B.R. et al. Mammalian cell penetration, siRNA transfection, and DNA transfection by supercharged proteins. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2009. Vol. 106, № 15. P. 6111-6116.

178. Shete H.K., Prabhu R.H., Patravale V.B. Endosomal escape: A bottleneck in intracellular delivery // Journal of Nanoscience and Nanotechnology. J Nanosci Nanotechnol, 2014. Vol. 14, № 1. P. 460-474.

179. Furuhata M. et al. Intracellular delivery of proteins in complexes with oligoarginine-modified liposomes and the effect of oligoarginine length // Bioconjug. Chem. Bioconjug Chem, 2006. Vol. 17, № 4. P. 935-942.

180. Li P., Nielsen H.M., Mullertz A. Oral delivery of peptides and proteins using lipid-based drug delivery systems. // Expert Opin. Drug Deliv. England, 2012. Vol. 9, № 10. P. 1289-1304.

181. Tian L., Kang H.C., Bae Y.H. Endosomolytic Reducible Polymeric Electrolytes for Cytosolic Protein Delivery // Biomacromolecules. American Chemical Society, 2013. Vol. 14, № 8. P. 2570-2581.

182. Tripathi S.K. et al. Hydrophobic and membrane permeable polyethylenimine nanoparticles efficiently deliver nucleic acids in vitro and in vivo // J. Mater. Chem. B. The Royal Society of Chemistry, 2013. Vol. 1, № 19. P. 2515-2524.

183. Tang R. et al. Direct Delivery of Functional Proteins and Enzymes to the Cytosol Using Nanoparticle-Stabilized Nanocapsules // ACS Nano. American Chemical Society, 2013. Vol. 7, № 8. P. 6667-6673.

184. Kopeina G.S. et al. Step-wise formation of eukaryotic double-row polyribosomes and circular translation of polysomal mRNA. // Nucleic Acids Res. 2008. Vol. 36, № 8. P. 2476-2488.

185. Heilemann M. et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. // Angew. Chemie. 2008. Vol. 47 33. P. 6172 -6176.

186. Schindelin J. et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis // Nature Methods. Nature Publishing Group, 2012. Vol. 9, № 7. P. 676-682.

187. Ovesny M. et al. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging // Bioinformatics. 2014. Vol. 30, № 16. P. 2389-2390.

188. Minamikawa T. et al. Chloromethyl-X-rosamine (MitoTracker Red) photosensitises mitochondria and induces apoptosis in intact human cells. // J. Cell Sci. England, 1999. Vol. 112 ( Pt 1. P. 2419-2430.

189. Vreeland R. et al. Isolation of Live Cretaceous (121-112 Million Years Old) Halophilic Archaea from Primary Salt Crystals // Geomicrobiology. 2007. Vol. 24. P. 275-282.

190. Radax C., Gruber C., Stan-Lotter H. Novel haloarchaeal 16S rRNA gene sequences from Alpine Permo-Triassic rock salt // Extremophiles. 2001. Vol. 5, № 4. P. 221228.

191. Vreeland R., Rosenzweig W., Powers D. Isolation of a 250 million-year-old halotolerant bacterium from a primary salt crystal // Nature. 2000. Vol. 407. P. 897-900.

192. Pendergrass W., Wolf N., Poot M. Efficacy of MitoTracker Green™ and CMXrosamine to measure changes in mitochondrial membrane potentials in living cells and tissues // Cytom. Part A. John Wiley & Sons, Ltd, 2004. Vol. 61A, № 2. P. 162-169.

193. Cubitt A.B., Woollenweber L.A., Heim R. Understanding structure - Function relationships in the Aequorea victoria green fluorescent protein // Methods Cell Biol. Academic Press, 1999. Vol. 58, № 58. P. 19-30.

194. Gurskaya N.G. et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light // Nat. Biotechnol. 2006. Vol. 24, № 4. P.

461-465.

195. Stepanenko O. V. et al. Beta-Barrel Scaffold of Fluorescent Proteins. Folding, Stability and Role in Chromophore Formation. // International Review of Cell and Molecular Biology. Elsevier Inc., 2013. Vol. 302. P. 221-278.

196. Wingen M. et al. The photophysics of LOV-based fluorescent proteins--new tools for cell biology. // Photochem. Photobiol. Sci. Off. J. Eur. Photochem. Assoc. Eur. Soc. Photobiol. England, 2014. Vol. 13, № 6. P. 875-883.

197. Juillerat A. et al. Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for efficient labeling of fusion proteins with small molecules in vivo // Chem. Biol. Elsevier Ltd, 2003. Vol. 10, № 4. P. 313-317.

198. Barykina N. V. et al. Green fluorescent genetically encoded calcium indicator based on calmodulin/M13-peptide from fungi // PLoS One / ed. Permyakov E.A. 2017. Vol. 12, № 8. P. e0183757.

199. Palmer A.E. et al. Ca2+ Indicators Based on Computationally Redesigned Calmodulin-Peptide Pairs // Chem. Biol. 2006. Vol. 13, № 5. P. 521-530.

200. Chapman S. et al. The photoreversible fluorescent protein iLOV outperforms GFP as a reporter of plant virus infection // Proc. Natl. Acad. Sci. National Academy of Sciences, 2008. Vol. 105, № 50. P. 20038-20043.

201. Walter J. et al. Flavin mononucleotide-based fluorescent proteins function in mammalian cells without oxygen requirement. // PLoS One. 2012. Vol. 7, № 9. P. e43921.

202. Tsien R.Y. The green fluorescent protein. // Annu. Rev. Biochem. Annual Reviews 4139 El Camino Way, P.O. Box 10139, Palo Alto, CA 94303-0139, USA, 1998. Vol. 67. P. 509-544.

203. Shaner N.C., Patterson G.H., Davidson M.W. Advances in fluorescent protein technology // J. Cell Sci. The Company of Biologists Ltd, 2007. Vol. 120, № 24. P. 4247-4260.

204. Drepper T. et al. Reporter proteins for in vivo fluorescence without oxygen. // Nat. Biotechnol. United States, 2007. Vol. 25, № 4. P. 443-445.

205. Nazarenko V. V et al. A thermostable flavin-based fluorescent protein from Chloroflexus aggregans: a framework for ultra-high resolution structural studies // Photochem. Photobiol. Sci. Royal Society of Chemistry, 2019. Vol. 18, № 7. P. 1793-1805.

206. Davari M.D. et al. Photophysics of the LOV-based fluorescent protein variant iLOV-Q489K determined by simulation and experiment // J. Phys. Chem. B. ACS Publications, 2016. Vol. 120, № 13. P. 3344-3352.

207. Rassow J. et al. Polypeptides traverse the mitochondrial envelope in an extended state // FEBS Lett. FEBS Lett, 1990. Vol. 275, № 1-2. P. 190-194.

208. Cenini G. et al. Amyloid ß-peptides interfere with mitochondrial preprotein import competence by a coaggregation process // Mol. Biol. Cell. American Society for Cell Biology, 2016. Vol. 27, № 21. P. 3257-3272.

209. Gonzales T., Robert-Baudouy J. Bacterial aminopeptidases: Properties and functions // FEMS Microbiol. Rev. Oxford University Press (OUP), 1996. Vol. 18, № 4. P. 319-344.

210. Gottesman S. Proteases and their targets in Escherichia coli // Annu. Rev. Genet. Annual Reviews 4139 El Camino Way, PO Box 10139, Palo Alto, CA 94303-0139, USA, 1996. Vol. 30, № 1. P. 465-506.

211. Malakhov M.P. et al. SUMO fusions and SUMO-specific protease for efficient expression and purification of proteins // J. Struct. Funct. Genomics. J Struct Funct Genomics, 2004. Vol. 5, № 1-2. P. 75-86.

212. Panavas T., Sanders C., Butt T.R. SUMO fusion technology for enhanced protein production in prokaryotic and eukaryotic expression systems // Methods Mol. Biol. Humana Press, Totowa, NJ, 2009. Vol. 497. P. 303-317.

213. Wingen M. et al. Novel Thermostable Flavin-binding Fluorescent Proteins from Thermophilic Organisms // Photochem. Photobiol. John Wiley & Sons, Ltd, 2017. Vol. 93, № 3. P. 849-856.

214. Stephan T. et al. Live-cell STED nanoscopy of mitochondrial cristae // Sci. Rep. Nature Publishing Group, 2019. Vol. 9, № 1.

215. Martin et al. Fluorescence-mediated analysis of mitochondrial preprotein import in vitro // Anal. Biochem. Academic Press Inc., 2006. Vol. 355, № 1. P. 81-89.

216. Bergamin G. et al. Zebrafish Tg(hb9:MTS-Kaede): a new in vivo tool for studying the axonal movement of mitochondria // Biochim. Biophys. Acta - Gen. Subj. 2016. Vol. 1860, № 6. P. 1247-1255.

217. Miyazono Y. et al. Uncoupled mitochondria quickly shorten along their long axis to form indented spheroids, instead of rings, in a fission-independent manner // Sci. Rep. 2018. Vol. 8, № 1. P. 350.

218. Mârtensson C.U. et al. Mitochondrial protein translocation-associated degradation // Nature. Nature Publishing Group, 2019. Vol. 569, № 7758. P. 679-683.

219. Itzhak D.N. et al. Global, quantitative and dynamic mapping of protein subcellular localization // Elife. eLife Sciences Publications Ltd, 2016. Vol. 5, № JUN2016.

220. Gillen C.M., Forbush B. Functional interaction of the K-Cl cotransporter (KCC1) with the Na-K-Cl cotransporter in HEK-293 cells // Am. J. Physiol. Physiol. American Physiological Society, 1999. Vol. 276, № 2. P. C328-C336.

221. Wilcox A.J. et al. Effect of protein structure on mitochondrial import. 2005.