Получение, условия культивирования и свойства теломеризованных клеток мезенхимального происхождения тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Молдавер, Марианна Валерьевна

• Молдавер, Марианна Валерьевна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Молдавер, Марианна Валерьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Теломеры человека.

Структура теломер.

Образование одноцепочечного 3'-конца.

Белки, связанные с теломерной ДНК.

Нарушение функции теломер.

Репликация теломер.

Теломераза человека.

Каталитический компонент теломеразы и регуляция его экспрессии.

РНК-компонент теломеразы.

Сборка теломеразы.

Теломеразная активность в клетках человека.

Теломеразная активность в соматических клетках человека.

Введение гена каталитического компонента теломеразы в клетки человека.

Клетки волосяного сосочка.

Мезенхимальные стромальные клетки из процессированного липоаспирата.

Окислительный стресс и гипоксия.

Активные формы кислорода.

Образование активных форм кислорода в митохондриях.

Антиоксидантная защита.

Образование ROS при гипероксии и гипоксии.

Старение клеток и кислород.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Получение и культивирование клеток.

Построение кривых роста.

Введение гена каталитического компонента теломеразы в клетки человека.

Радиоавтография.

Введение гена LacZ в теломеризованные фибробласты кожи.

Выявление активности р-галактозидазы в клетках.

Измерение теломеразной активности.

Определение концентрации белка в клеточных экстрактах.

Метод колониеобразования.

Колониеобразование при разных парциальных давлениях кислорода.

Добавление антиоксидантов.

Добавление кондиционированной среды.

Колониеобразование на фидерных слоях.

Индукция костной и жировой дифференцировок.

Выявление остеодифференцировки.

Выявление адиподифференцировки.

Выявление активности щелочной фосфатазы.

Выделение и очистка мРНК.

• Обратная транскрипция.

Индукция тубулогенеза кератиноцитов.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

Получение и свойства теломеризованных клеток.

1. Иммортализация фибробластов кожи, клеток волосяного сосочка и мезенхимальных стромальных клеток из процессированного липоаспирата.

1.1. Иммортализация фибробластов кожи.

1.2. Иммортализация клеток волосяного сосочка.

1.3. Иммортализация мезенхимальных стромальных клеток из процессированного липоаспирата.

1.4. Измерение теломеразной активности.

2. Влияние парциального давления кислорода на пролиферацию теломеризованных клеток.

2.1. Влияние кислорода на фибробласты кожи ФКН и ФКН-ИТЕЯТ.

2.2. Влияние кислорода на клетки волосяного сосочка БРИ и ИРМ-ИТЕЯТ.

2.3. Влияние кислорода на МСК из процессированного липоаспирата 2063 и 2063-КГЕЯТ

3. Влияние парциального давления кислорода на пролиферацию клеток, посеянных в низкой плотности.

3.1. Влияние кислорода на фибробласты кожи ФКН и ФКН-КГЕЯТ.

3.2. Влияние кислорода на клетки волосяного сосочка БРИ и БРЫ-кТЕЯТ.

3.3. Влияние кислорода на МСК из процессированного липоаспирата 2063 и 2063-НТЕЯТ.

4. Способность к дифференцировке.

4.1. Дифференцировка фибробластов кожи (ФКН и ФКН-ЬТЕЕТ).

4.2. Дифференцировка МСК из процессированного липоаспирата (2063 и 2063-ЪТЕВТ).

4.3. Дифференцировка клеток волосяного сосочка (БРИ и ВРЫ-ИТЕЯТ).

4.4. Свойства ИРЫКГЕКТ.

Особенности пролиферации теломеризованных клеток в низкой плотности.

1. Способность образовывать колонии клеток трех типов: фибробластов кожи 1608, иммортализованных с помощью введения ЬТЕЮГ фибробластов кожи Те1МС и эмбриональных фибробластов 1075.

2. Влияние кондиционированной среды на распределение колоний по размерам.

3. Влияние ближайшего окружения колоний на способность образовывать колонии.

4. Влияние парциального давления кислорода на способность образовывать колонии.

5. Влияние парциального давления кислорода на рост клеток Те1МС в массовой культуре.

6. Влияние антиоксидантов на способность образовывать колонии клеток Те1МС.

7. Влияние фидерного слоя на способность образовывать колонии.

7.1 .Получение теломеризованных фибробластов кожи, экспрессирующих¡3галактозидазу.

7.2. Способность к образованию колоний клеток Те1МС^а1.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Особенности пролиферации теломеризованных клеток в низкой плотности.

1 .Бимодальность распределения колоний теломеризованных клеток по размерам.

2.Влияние кондиционированной среды и микроокружения на распределение колоний по размерам.

3.Влияние кислорода на способность образовывать колонии.

4.Влияние антиоксидантов на способность образовывать колонии клеток Те1МС.

5.Влияние фидерного слоя на способность образовывать колонии.

Получение и свойства теломеризованных клеток.

1.Иммортализация фибробластов кожи, клеток волосяного сосочка и мезенхимальных стромальных клеток из процессированного липоаспирата.

2.Влияние кислорода на пролиферацию клеток, посеянных в низкой плотности.

3.Способность к дифференцировке теломеризованных клеток.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.:.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение, условия культивирования и свойства теломеризованных клеток мезенхимального происхождения»

Любое старение — это старение клеток (Fossel, 2003). В начале 1960х Хейфлик и его сотрудники показали, что фибробласты человека в культуре могут поделиться конечное число раз, прежде чем необратимо остановиться, то есть, клетки в культуре обладают ограниченным пролиферативным потенциалом (Hayflick and Moorhead, 1961). Что является причиной или причинами, приводящей к репликативному старению клеток -окончательной и необратимой способности клеток к делению долгое время оставалось неизвестным. В 1971 году Алексей Оловников предложил гипотезу, объясняющую причину репликативного старения клеток. Он предположил, что с каждым клеточным делением должно происходить постепенное укорочение концов хромосом — теломер, из-за невозможности полностью реплицировать отстающую цепь ДНК (Оловников, 1971). В некоторых специализированных клетках, таких как клетки зародышевого пути и стволовые, присутствует особый фермент теломераза, который способен удлинять теломеры и поддерживать их длину. Этот фермент был обнаружен в 1985 году (Greider and Blackburn, 1985). Но в соматических клетках человека теломераза не экспрессируется, поэтому с каждым клеточным делением теломеры укорачиваются.

Экспрессия введенного каталитического компонента теломеразы (hTERT) во многих случаях приводит к появлению в клетках теломеразной активности, удлинению и стабилизации их теломер, и обретению клетками способности к неограниченной пролиферации (Bodnar, el al., 1998). При этом клетки сохраняют нормальные механизмы регуляции роста (Jiang, et al., 1999, Morales, et al., 1999).

Получение теломеризованных клеток и изучение их свойств представляет большой интерес для медицины, поскольку введение hTERT может позволить получать большое количество клеток, необходимых для клеточной терапии. Например, с помощью введения гена hTERT группе исследователей удалось получить панкреатические р-клетки человека в количестве достаточном для трансплантации. Эти клетки секретировали инсулин и экспрессировали факторы транскрипции, характерные для Р-клеток. После того, как ген hTERT искусственно вырезали, клетки подсадили мышам, у которых был вызван диабет. Трансплантация клеток привела к тому, то уровень глюкозы в крови мышей сохранялся в норме в течение 30 недель (Narushima, et al., 2005). Похожие эксперименты были проведены с гепатоцитами человека и с клетками коры надпочечников (Huang, et al., 2007, Totsugawa, et al., 2007). Во многих экспериментах показано, что введении hTERT может привести к стабилизации экспрессии генов и усилению способности клеток к дифференцировке (Jun, et al., 2004, Kang, et al., 2004, Young, et al., 2003). 8

Однако, далеко не все клетки удается иммортализовать с помощью введения гена hTERT. В ряде случаев требуется специальный подбор условий. Одна группа исследователей показала, что для иммортализации эпителиальных клеток кроме теломеразы необходимо также инактивация Rb/pl6INK4A (Kiyono, et al., 1998). Другие исследователи обнаружили, что одного лишь введения гена hTERT недостаточно, чтобы иммортализовать ондотелиальные клетки и фибробласты молочной железы (O'Hare, et al., 2001). Еще одна группа исследователей сообщила, что при введении гена каталитического компонента теломеразы в эмбриональные фибробласты человека, во всех полученных клонах экспрессировалась теломераза и поддерживалась длина теломер, но способность к неограниченной пролиферации приобрели только 9 из 26 клонов (Franco, et al., 2001). Ramirez et al. иммортализовали с помощью введения hTERT эпителиальные клетки, выращивая их на фидерном слое митотически инактивированных клеток ЗТЗ (Ramirez, et al., 2001). А эмбриональные фибробласты легкого человека удается иммортализовать только после снижения парциального давления кислорода с 21% до 2-5% (Forsyth, et al., 2003). То есть, во многих случаях требуется подбор специальных условий для того, чтобы клетки смогли приобрести способность к неограниченной пролиферации. И одним из факторов, влияющих на успешность иммортализации, может быть атмосферный кислород.

Клетки культивируют при необычно высокой концентрации кислорода. Большинство клеток в организме подвергаются воздействию концентрации кислорода более близкой к 5%, чем к 21% атмосферного кислорода (Lu and Finkel, 2008). Впервые влияние атмосферного кислорода на старение клеток в культуре была показано 30 лет назад. Культивируя фибробласты WI-38, на которых Хейфлик впервые показал, что клетки могут поделиться конечное число раз, прежде чем прекратить пролиферацию, два исследователя Packer и Fuehr показали, что количество удвоений, которые может сделать клетка, не является фиксированной величиной (Packer and Fuehr, 1977). Они показали, что на количество удвоений и продолжительность жизни клеток в культуре влияет концентрация кислорода в окружающем воздухе.

Многие исследователи полагают, что существует прямая корреляция между концентрацией кислорода в окружающем воздухе и образованием активных форм кислорода (ROS) внутри клетки (Finkel, 2003, Turrens, 2003). Повышенное образование ROS может приводить к повреждению ДНК, увеличению частоты мутаций и укорочению теломер, что в конечном счете приводит к преждевременной остановке пролиферации -старению клеток под действием стресса. Даже клетки, в которых экспрессируется каталитический компонент теломеразы, могут в условиях окислительного стресса прекратить пролиферацию (Parrinello, et al., 2003, von Zglinicki, et al., 1995).

Поиск условий для получения иммортальных клеток, и изучение свойств полученных клеток может быть актуальной задачей не только клеточной терапии, но также иметь большое теоретическое значение. В работе, опубликованной еще в 80-е годы, было показано, что обычные фибробласты человека гетерогенны по своему пролиферативному потенциалу. То есть, для массовой культуры существует предел Хейфлика, но отдельные клетки могут останавливаться гораздо раньше. Причем, чем ближе возраст культуры к пределу, тем больший процент отдельных клеток имеет маленький пролиферативный потенциал. В общем, распределение фибробластов по пролиферативному потенциалу бимодально. Всегда есть клетки, которые по каким-то причинам перестают делиться и пролиферирующие клетки: два пика распределения (Smith and Whitney, 1980).

Опираясь на теломерную теорию старения, эту гетерогенность можно было бы объяснить, появлением клеток с очень короткими теломерами, которые делали невозможной дальнейшую пролиферацию. То есть, можно было ожидать, что отдельные бессмертные теломеризованные клетки не будут преждевременно прекращать пролиферацию. Это оказалось неверно. Неверным оказалось также и предположение о том, что клетки перестают делиться под действием окислительного стресса. Оказалось, что на пролиферацию клеток, посеянных в низкой плотности в значительной степени влияет наличие контактов с соседними клетками. Таким образом, именно изучение теломеризованных клеток заставляет по-другому оценить гетерогенность пролиферативного потенциала исходных клеток.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Теломеры человека

Теломеры - это комплекс ДНК и различных белков, расположенный на концах хромосом. Теломерная ДНК состоит из тандемно повторяющейся на протяжении нескольких тысяч пар оснований G-богатой последовательности длиной 6 нуклеотидов, которая заканчивается одноцепочечным участком на З'-конце (Blackburn, 2001). Структура теломерного повтора чрезвычайно консервативна, у человека, также как и у всех позвоночных, и состоит из последовательности TTAGGG (Егоров, 2001). Теломерная ДНК ничего не кодирует. Основная функция теломер заключается в защите хромосом от слияния, деградации и рекомбинации (Blackburn, 2001). Нарушение теломерной структуры активирует путь ответа на повреждение ДНК, которые в свою очередь, инициируют остановку клеточного цикла, старение или апоптоз (Deng, et al, 2008). В соматических клетках человека теломеры укорачиваются с каждым клеточным делением как in vitro, так и in vivo (HarJey and Villeponteau, 1995). Но в некоторых клетках, например, в клетках зародышевого пути и в ряде стволовых клеток длина теломер поддерживается с помощью специального фермента - теломеразы (Wright, et al., 1996). Теломераза является обратной транскриптазой и может, присоединяясь к одноцепочечному 3'- концу, удлинять теломеры и поддерживать их длину.

Структура теломер.

Теломерная ДНК обладает одной существенной для выполнения своих функций особенностью — на 3'-концах G-богатых цепей ДНК у нее имеются короткие одноцепочечные участки (Makarov, et al, 1997). Длина теломерной ДНК человека может достигать нескольких тысяч пар оснований (8-12 т.п.н.), а длина одноцепочечного участка составляет всего 100-200 пар оснований (Chai, et al., 2006, Greider, 1999). Этот одноцепочечный 3'- конец, заворачиваясь назад, вытесняет G-богатую цепь, соединяясь с С-цепью (Рис.1А). Такая структура, впервые обнаруженная с помощью электронного микроскопа, получила название t-петли. Размер t-петли может варьировать от 1 т.п.н. до 25 т.п.н. (Griffith, et al., 1999). От чего зависит размер петли — неизвестно. Не ясно также, является ли петлевая структура единственным возможным защищенным состоянием концов хромосом (de Lange, 2005). I

G-квартет

G-квадруплекс \ 3

5'

R H H iöKC 4 N. i I ira

G-квартет

Рис,1 Структура теломер. А. Петлевая структура {Егоров, 2001). Б. Схематическая иллюстрация G-квадруплекса и принципов его образования {Tang, et «/.,2008).

Кроме t-петель, in vivo обнаружена еще одна необычная структура, которую может образовать теломерная ДНК - G квадруплексы (Chang, et al, 2006, Chang, el al., 2004, Wang and Patel, 1992). Четыре теломерных повтора TTAGGG складываются, образуя четырехнитевую структуру, которая удерживается тремя квартетами гуанинов (Burge, et ai, 2006) (РисЛБ). Согласно последним данным, G-квадруплексы предпочтительно образуются на самом конце одноцепочечного З'-конца теломер. {Tang, et al., 2008). Предполагают, что квадруплексы могут существовать не только как самостоятельная структура, но также принимать участие в образовании t-петель (Xu, et al., 2007).

Образование одноцепочечного З'-конца.

Для образования t-петли необходим одно цепочечный 3'- конец на обеих цепях ДНК (отстающей и лидирующей) (Makarov, et al., 1997). Одн о цепоч е чны е 3'- концы отстающей и лидирующей цепи образуются по-разному и имеют разную длину. Длина одноцепочечного конца лидирующей цепи составляет примерно 1/3-1/2 длины одноцепочечного конца отстающей цепи (Chai, et al., 2006).

Одноцепочечный 3"- конец отстающей цепи образуется в результате концевой недорепликации, т.е. в результате разрушения последнего праймера РНК и потому, что последний фрагмент Оказаки не может располагаться на самом конце теломер (Ohki, et al.,

2001). До сих пор неизвестно, как образуется одноцепочечный 3'- конец лидирующей цепи. Предполагают, что получившиеся после репликации ДНК тупые теломерные концы подвергаются расщеплению какой-нибудь нуклеазой (Chai, et al., 2006). Этой нуклеазой может быть, например, Apollo 5'- экзонуклеаза, которая ассоциирована с белком TRF2 и

12 необходима для защиты теломер во время S фазы (Lenain, et ah, 2006, van Overbeek and de Lange, 2006). И хотя природа этой нуклеазы до сих пор неизвестна, однако несомненно, что белки, связанные с теломерной ДНК, каким-то образом регулирует ее активность (de Lange, 2005, Gilson and Geli, 2007).

Свидетельством тому, что отщепление 5'- конца тщательно регулируется, служит тот факт, что 5'-конец всегда закачивается определенной последовательностью ААТСССААТС-5', в то время как 3'- конец теломерной ДНК заканчивается произвольно на любом нуклеотиде последовательности TTAGGG (Sfeir, et ah, 2005). Регулятором может являться один из теломерных белков - РОТ1 (Loayza and de Lange, 2003). Было показано, что его ингибирование приводит к тому, что 5'-конец теряет свою однородность и может заканчиваться на любые нуклеотиды (Hockemeyer, et al., 2005). На основе этих данных возникла модель, объясняющая каким образом РОТ1 контролирует образование 5'- конца определенной последовательности. Известно, что первый участок связывания РОТ1 с ДНК расположен на одноцепочечном 3'-конце через 2 нуклеотида от конца дуплексной теломерной ДНК. И этот участок связывания является наиболее предпочтительным для РОТ1 in vitro. Таким образом, связываясь с теломерами в области перехода от двойной цепи к одноцепочечному концу, этот белок перекрывает возможную дальнейшую 5'- экзонуклеазную активность (de Lange, 2005).

Другим регулятором длины одноцепочечного конца является белок TRF2. Ингибирование TRF2 и РОТ1 приводит к сокращению длины одноцепочечного участка на 30% - 50% (Hockemeyer, et al., 2005, van Steensel, et al., 1998). В случае ингибирования TRF2 потеря одноцепочечной теломерной ДНК происходит с участием эндонуклеазы ERCC1/XPF1, которая отщепляет одноцепочечный 3' конец, действуя внутри соседнего двуцепочечного участка (Zhu, et al., 2003). Таким образом, t-петля защищает одноцепочечную ДНК от расщепления нуклеазами и деградации. (Lei, et ah, 2005, Yang, et ah, 2005).

Белки, связанные с теломерной ДНК.

С теломерной ДНК связаны различные белки, которые регулируют ее конформацию и контролируют различные аспекты поддержания теломер. Белки TRF1 и TRF2 (telomeric repeat binding factor 1, 2) вместе с белками РОТ 1 (protection of telomeres 1), TIN2 (TRF1-interacting protein), TPP1 (TIN2-POT1 organizing protein) и Rapl (transcriptional repressor/activator protein) образуют особый белковый комплекс - шелтерин, который связывается только с теломерной ДНК (Рис.2). Первые три белка узнают последовательность теломер пятью ДНК-связывающими доменами (по два у TRF1 и TRF2 и один у РОТ1) и связываются с тремя другими белками (de Lange, 2005). Белки комплекса шелтерин обладают высокой специфичностью к теломерной последовательности, и чувствительны к заменам даже одного нуклеотида (Court, et al., 2005). шелтерин

Рис. 2 Белки, связанные с теломерной ДНК. Белок НР1 (heterochromatin protein I) является маркером гетерохроматина. Толстая красная линия представляет двухцепочечную ДНК, тонкая красная линия -одноцелочечный З'-конец.

In vitro удалось показать важную роль в образовании t-петель человека двух белков -TRF1 и TRF2. Белок TRF2 может превращать искусственные теломерные субстраты в петли (Griffith, et al., 1999, Stansel, et al., 2001). TRF1 тоже способен in vitro изгибать ДНК и соединять теломерные повторы, благодаря очень гибким доменам связывания с ДНК (Bianchi, et al., 1999).

TRF2 взаимодействует с различными ферментами, которые могут участвовать в образовании одноцепочечного 3'- конца (с нуклеазой ERCC1/XPF1, комплексом MRE11-RAD50-NBS1, хеликазой WRN и 5-экзоиуклеазой Apollo). Активностью этих ферментов, по крайней мере, отчасти, можно объяснить события, которые следуют либо за ингибированием TRF2 (например, слияние концов хромосом), либо за его повышенной экспрессией (например, быстрая потеря теломерной ДНК) (de Lange and Petrin!, 2000, Gilson and Geli, 2007). TRF1 взаимодействует с различными белками, такими как РОТ1, которые модулируют теломеразную активность. Эти взаимодействия могут объяснять укорочение теломер, которое следует за повышенной экспрессией TRF1 (Gilson and Geli, 2007).

Различные необычные структуры, которые может образовать теломерная ДНК, затрудняют движение репликационной вилки, так что она может остановиться. Ее остановка может привести к укорочению теломер или рекомбинации. Белки, связанные с теломерной ДНК, играют важную роль в координации движения репликационной вилки (Verdun and Karlseder, 2006). TRF2 и РОТ! могут участвовать в раскрытии t-петли благодаря свой способности активировать RecQ хеликазы, такие как WRN и BLM

Opresko, et al., 2005). POT1 также способен раскрывать G-квадруплексы (Zaug, et al., 2005).

Связанные с теломерной ДНК белки регулируют длину теломер с помощью механизма отрицательной обратной связи (Marcand, et al., 1997). Эти белки регулируют доступ теломеразы к теломерам после каждого раунда репликации (Marcand, et al, 1999). Как следствие, вероятность того, что теломераза будет удлинять более короткие теломеры, чем более длинные выше (Teixeira, et al, 2004).

Белок РОТ1, который может связываться как с одноцепочечным 3'- концом, так и с двухцепочечной ДНК в комплексе с белками TRF1 и TRF2, играет двоякую роль в регуляции доступа теломеразы к теломерам (Smogorzewska and de Lange, 2004). В зависимости от положения относительно 3'-конца этот белок может ингибировать действие теломеразы, или, наоборот, формировать субстрат для ее действия (Kelleher, et al., 2005, Lei, et al., 2005). Доступ белка РОТ1 к теломерам в свою очередь регулирует недавно обнаруженный белок ТРР1, с которым они образуют гетеродимеры (Liu, et al., 2004). Кроме того, показано, что ТРР1 ассоциирован с теломеразой, и может осуществлять физическую связь между теломеразой и другими компонентами теломер (Wang, et al., 2007, Xin, et al., 2007).

Нарушение функции теломер.

Функция теломер заключается в защите концов хромосом от возможности быть воспринятыми клеткой, как повреждение двухцепочечной ДНК (de Lange, 2002, van Steensel, et al., 1998). Это может происходить в двух случаях: либо теломеры теряют связанные с ними белки, либо достигают критической длины (de Lange, 2005) (Рис.3). Важно отметить, что очень короткие теломеры, которые приводят к старению клетки, при этом остаются защищены белковыми комплексами от слияния и гомологичной рекомбинации. И наоборот, поврежденная теломерная ДНК оказывается полностью лишена белковой защиты, поэтому одновременно могут возникать случаи рекомбинационной репарации и активироваться контрольные точки клеточного цикла (Bae and Baumann, 2007) .

Что именно является причиной потери теломерной последовательностью защищающих ее белков неизвестно. Но если это произошло, то либо сразу же включается ATM или ATR путь ответа на повреждение ДНК, либо может произойти рекомбинационная репарация (слияние концов хромосом или негомологичная рекомбинация) (Gilson and Geli, 2007). Например, потеря TRF2 активирует ATM киназу, что приводит к повышенной экспрессии р53 и остановку клеточного цикла при переходе от фазы Gl к фазе S, индуцированную белком р21. Повреждение теломер вызывает либо старение, либо апоптоз, это зависит от типа клеток, так например, фибробласты подвергаются старению, а лимфоциты и эпителиальные клетки - апоптозу (Karlseder, et al., 1999).

Слияние концов хромосом - это наиболее заметный признак нарушения нормальной функции теломер. Слияние может происходить тогда, когда теломеры становятся слишком короткими и нарушается образование t-петли. В этом случае, между С-цепью одной теломеры и G-цепью другой образуется ковалентная связь (Smogorzewska and de Lange, 2002). Обычно соединяются концы двух различных хромосом. С помощью комплекса ДНК-РК образуется структура, активирующая нуклеазу ERCC1/XPF, которая отщепляет одноцепочечный 3'-конец, а затем слияние концов осуществляет ДНК лигаза IV. Получившиеся дицентрические хромосомы могут оставаться прикрепленными к разным полюсам веретена деления, что, в свою очередь, приводит к проблемам сегрегации хромосом в анафазе. Для анафазных клеток с дицентрическими хромосомами характерно появление хроматиновых мостиков. От негомологичного слияния концов хромосом теломеры защищает белковый комплекс шелтерин, который способствует формированию t-петли (de Lange, 2005).

Укорочение теломер

Потеря теломерных белков ds break J (ATM)

I I л и break J (АТС) 1 i

JM. A

Crip «ни*

Ало irr о» 1 .

Стар «ни» АлвПТО!

Рис.3 Укорочение теломер и незащищенная белками теломерная ДНК инициируют пути ответа на повреждение ДНК (Deng, el al., 2008).

Другая угроза целостности хромосом - гомологичная рекомбинация. Известны три типа гомологичной рекомбинации. Первый тип, гомологичная рекомбинация между теломерами сестринских хроматид (T-SCE), может быть опасен появлением очень коротких теломер. В результате рекомбинации одна теломера сестринской хроматиды может удлиниться за счет другой, а другая наоборот приобрести критическую длину. В нормальных клетках человека такая рекомбинация случается редко, но очень часто наблюдается в клетках, у которых по каким-то причинам появился механизм удлинения теломер - ALT (Bailey, et al, 2004, Bechter, et al, 2004). Второй тип гомологичной рекомбинации, который может угрожать теломерам, касается рекомбинации t-петли (Wang, et al., 2004). Если 5'-конец гомологично спаривается с вытесненной D-петлей, может образоваться структура Холлидея. Миграция ветви по направлению к центромере может привести к появлению второй структуры Холлидея. Их разделение в результате кроссинговера может полностью удалить петлю, в результате, на конце хромосомы останется очень короткая теломера, а в клетке будет присутствовать кольцевая теломерная ДНК (de Lange, 2005). Этот тип гомологичной рекомбинации также редко обнаруживается в нормальных клетках, но в ALT (alternative lengthing of telomeres) клетках кольцевая теломерная ДНК встречается часто (Cesare and Griffith, 2004). Третий тип гомологичной рекомбинации, который может нанести разрушительный ущерб клетке - это рекомбинация теломер и теломерной ДНК, находящейся внутри хромосомы. В клетках человека внутренняя теломерная ДНК не частое явление, однако такие последовательности широко встречаются у других позвоночных, например, у мышей. Рекомбинация теломер и внутренних теломерных элементов может привести к делеции конца хромосомы, инверсиям, транслокациям и появлении экстрахромосомных элементов (Zhu, etal., 2003).

Репликация теломер.

Недавно было показано, что репликация теломер происходит в два этапа, первый этап репликации в S-фазе, второй в G2-M (Verdun and Karlseder, 2006). Такая поздняя репликация теломерных участков может быть важна для координации функций теломер и различных событий клеточного цикла (Marcand, et al, 2000). Например, последний этап репликации теломер - образование одноцепочечного З'-конца требует участия циклин-зависимой киназы Cdkl (Gilson and Geli, 2007). Интересно, что репликация теломер гомологичных хромосом в S-фазе происходит скоординировано, и теломеры отдельных хромосом имеют свое характерное время репликации (Zou, et al, 2004). Относительная длина отдельных теломер хромосом строго сохраняется (Graakjaer, et al, 2004).

Теломераза человека

Теломераза - это особый фермент, способный удлинять теломеры и поддерживать их длину. Теломераза является обратной транскриптазой, РНК-белковым комплексом, который содержит матрицу для синтеза теломер и специфично узнает концы хромосом как субстрат. Размер теломеразы - около 650-670 кДа. Активный ферментативный комплекс теломеразы образуют РНК-компонент hTR (153 кД) и два белковых компонента, каталитический компонента hTERT (127 кД) и дискерин (57 кД). Еще около 32 различных белков могут связываться с теломеразой, но точный состав белков, которые входят в состав активного комплекса, все еще не определен. Общая масса hTERT, hTR и дискерина составляет примерно половину массы теломеразы. Это служит свидетельством того, что теломераза функционирует в виде димера: комплекса двух молекул, каждая из которых содержит hTERT, hTR и дискерин. Остальные белки, которые связываются с теломеразой, вероятно участвуют в ее биогенезе, перемещении, присоединении к теломерам и деградации (Cohen, et al., 2007). Мутации в основных компонентах теломеразы, hTR, hTERT и дискерине, вызывают тяжелые наследственные заболевания - врожденный дискератоз, недостаточность костного мозга и идиопатический легочный фиброз (Garcia, et al., 2007).

Каталитический компонент теломеразы и регуляция его экспрессии.

Ген hTERT длиной 35 т.п.н. состоит из 16 экзонов и 15 интронов (Cong, et al., 1999). Ген картирован на коротком плече 5-й хромосомы 5ql5.33 (Bryce, et al., 2000). Во многих опухолевых клетках происходит амплификация гена hTERT{Saretzki, et al., 2002, Zhang, et al., 2000). Экспрессия hTERT является фактором, лимитирующим активность теломеразы. Поэтому регуляция экспрессии этого гена играет ключевую роль в регуляции теломеразной активности (Kyo and Inoue, 2002). Обилие участков связывания с потенциальными регуляторными белками внутри минимального промотора hTERT, вызывает предположение, что экспрессия этого гена находится под многочисленными уровнями контроля, и регулируется разнообразными факторами в различном клеточном контексте (Cong, et al., 1999).

Первый уровень регуляции экспрессии hTERT - регуляция транскрипции. Регуляторная область 5'-hTERT содержит многочисленные участки связывания факторов транскрипции. В частности, промотор содержит несколько участков связывания онкогена с-Мус (Е-боксы) и пять участков связывания фактора Spl. (Cong, et al., 1999, Horikawa, et al., 1999, Takakura, et al, 1999). с-Мус связывается с Е-боксами, образуя гетеродимер с белками Мах, и активирует транскрипцию hTERT (Greenberg, et al., 1999, Wu, et al, 1999). Белки

18

Mad являются антагонистами с-Мус, они тоже связываются с белками Мах, комплексы Mad/Max вытесняют комплексы Мус/Мах, и экспрессия hTERT снижается (Gunes, et al., 2000, Oh, et al, 2000). Фактор Spl также активирует транскрипцию hTERT. Хотя известно, что этот фактор широко распространен, было показано, что его уровень повышен в печени, половых и гематопоэтических клетках на ранних стадиях онтогенеза, то есть в тех тканях, в которых отмечен повышенный уровень теломеразной активности (Takakura, et al, 1999). Для полной активации промотора необходимо кооперативное действие с-Мус и Spl(Kyo, et al., 2000). В различных типах опухолей часто наблюдают повышенную экспрессию этих факторов, что может , служить объяснением появлением в них теломеразной активности. Тем не менее, есть опухоли, в которых обнаружена теломеразная активность, а повышенная экспрессия Мус отсутствует (Kyo and Inoue, 2002). К другим активаторам транскрипции относится эстроген, который активирует теломеразу в клетках, экспрессирующих рецептор эстрогена (Kyo, et al, 1999, Misiti, et al., 2000). В области промотора hTERT есть участок, который связывает рецептор эстрогена, и реагирует на стимуляцию эстрогеном (Kyo and Inoue, 2002). Андроген также может активировать ген hTERT (Guo, et al, 2003). Онкобелок E6 вируса папилломы человека активирует теломеразу в кератиноцитах и эпителиальных клетках молочной железы (Klingelhutz, et al, 1996). При определенных условиях HIF-1, белок саркомы Эвинга (Юинга) EWS/ETS и участники сигнального пути Ras могут индуцировать теломеразную активность (Goueli and Janknecht, 2004, Takahashi, et al, 2003, Yatabe, et al, 2004).

Кроме белков Mad, были найдены и другие транскрипционные репрессоры, взаимодействующие с промотором hTERT. Повышенная экспрессия MZF-2 (myeloid-specific zinc finger protein) подавляет активность промотора. (Fujimoto, et al, 2000). Другие описанные репрессоры hTERT - SIP1 и Менин (Lin and Elledge, 2003). Супрессии Менина достаточно, чтобы индуцировать теломеразную активность и иммортализовать фибробласты человека (Dong, et al., 2005). Другой охарактеризованный репрессор hTERT -ген-супрессор опухоли Вильмса WT1, который может подавлять экспрессию hTERT в некоторых типах клеток (Oh, el al, 1999). Повышенная экспрессия р53 в некоторых опухолевых клетках приводит к образованию комплексов p53-Spl, что ингибирует связывание Spl с промотором, и подавляет экспрессию hTERT {Kanaya, et al, 2000, Xu, et al, 2000). Недавно обнаружили, что фактор CTCF связывается с регуляторной областью гена в тех клетках, в которых теломераза не экспрессируется. Возможно, CTCF является транскрипционным регулятором hTERT в нормальных клетках. Однако, механизмы, которые препятствуют связыванию этого фактора с геном hTERT в теломеразно-положительных клетках, не определены (Renaud, et al, 2007).

19

У высших эукариот регуляция генной экспрессии, тканеспецифичная или зависящая от стадии эмбриогенеза, часто подразумевает альтернативный сплайсинг мРНК (Cong, et al.,

1999). Описано, по крайней мере, шесть транскриптов hTERT, которые экспрессируются в различных клетках или на разных стадиях эмбрионального развития, однако их биологическое значение и функциональные отличия до сих пор не известны (Ulaner, et al.,

2000).

Тот факт, что промотор hTERT находится внутри островка CpG, дает основания для предположения, что транскрипция гена может регулироваться метилированием ДНК. Первые исследования показали, что промотор гиперметилирован в большинстве теломеразно-положительных опухолей и гипометилирован в теломеразно-негативных нормальных тканях (Dessain, et al., 2000, Devereux, et al., 1999).

Фосфорилирование белка hTERT может быть еще одним механизмом его активации. Протеинкиназы Atk и С фосфорилируют hTERT и вызывают появление теломеразной активности (Kang, et al., 1999, Li, et al., 1998). При активации теломеразы в Т-лимфоцитах происходит фосфорилирование hTERT и его перемещение из цитозоля в ядро (Liu, et al., 2001).

Еще один механизм регуляции hTERT - взаимодействие с шаперонами. Комплекс шаперонов, который включает в себя Hsp90, Hsp70 и р23, функционально связан с теломеразой (Holt, et al., 1999). Известно, что Hsp90 способствует сворачиванию нескольких обратных транскриптаз. Его добавление к клеточным экстрактам значительно увеличивает теломеразную активность (Akalin, et al., 2001).

Понимание того, как регулируется hTERT все еще неполное и для создания целостной картины требуются дальнейшие исследования.

РНК-компонент теломеразы.

РНК-компонент теломеразы содержит матрицу для синтеза теломерпой ДНК (Greider and Blackburn, 1989). В отличие от каталитического компонента теломеразы, hTR экспрессируется во многих тканях (Feng, et al., 1995). Единственная копия гена hTR локализована на длинном плече 3 хромосомы 3q26.3. Также как и hTERT ген hTR часто бывает амплифицирован в опухолевых клетках (Heselmeyer-Haddad, et al., 2005, Soder, et al., 1997, Yokoi, et al., 2003). Ген hTR транскрибируется РНК-полимеразой II, его зрелый транскрипт имеет длину 451 нуклеотид (Feng, etal., 1995).

Сборка теломеразы.

Для образования каталитически активного фермента теломеразы недостаточно очищенного каталитического компонента и РНК-компонента (Weinrich, et al., 1997). Первичный транскрипт hTR подвергается кэпированию, - к 5'-концу присоединяется триметилгуанозин (TMG). С консервативным участком Н/АСА связывают различные белки, которые направляют процессинг З'-конца и обеспечивают стабильность hTR (Collins, 2006). Исследования in vivo показали, что для сборки РНК - белкового комплекса необходимы три белка - дискерин, NH2 и NOPIO, с последующим присоединением четвертого белка - GARl (Meier, 2005) (рис. 4).

Для сборки РНК-белкового комплекса важна шпилька на З'-конце, которая предположительно взаимодействует с фактором, участвующем в биогенезе комплекса (Рис.5) (Mitchell, et al, 1999а). Эта шпилька играет двоякую роль: с одной стороны она участвует в биогенезе комплекса, с другой стороны она локализует комплекс в особых компартментах, которые называются тельца Кахаля (Fu and Collins, 2003, Jady, et al., 2004). Локализация в тельцах Кахаля не требуется ни для биогенеза, ни для каталитической активности комплекса, и ее роль еще предстоит выяснить (Jady, et al., 2004).

РНК-компонент и каталитический компонент перемещаются и локализуются в клетке нескоординированно (Collins, 2006). Их соединение, сборку и разборку фермента Рис.4 Этапы сборки теломеразы (Collins, 2006). регулируют шапероны (Forsythe, et al., 2001). hTR может локализоваться не только в тельцах Кахаля, но и в ядрышках и около теломер в S-фазе. Рекомбинантный hTERT обнаруживается в нуклеоплазме, ядрышках и тельцах Кахаля, эндогенный hTERT - в нуклеоплазме, ядрышках и около теломер (Tomlinson, et al., 2006). Локализация hTERT может меняться в ответ на повреждение ДНК или экспрессию онкогенов (Wong, et al., 2002). Перемещение hTERT из цитоплазмы в ядро

Kmieeci

Первичный к сборка hTR

Pot!

5*-юиц8 Э'юнца коррелирует с активацией теломеразы, клеточным стрессом и/или фосфорилированием белка (Haendeler, et al, 2003а, Liu, et al., 2001).

Собранный фермент должен присоединиться к субстрату - теломерам и синтезировать новый теломерный повтор. Какие белки принимают участие в присоединении теломеразы к теломерам еще неизвестно (Collins, 2008).

Теломеразная активность в клетках человека

Теломеразная активность в соматических клетках человека.

Первые исследования показали, что в соматических клетках человека теломеразная активность отсутствует, хотя она детектируется в ряде клеток зародышевого пути (Kim, et al, 1994). Высокий уровень теломеразной активности обнаруживается на стадии бластоцисты, и обнаруживается практически во всех тканях в течение первого триместра беременности (в печени, почках, легких, кишечнике, коже, мышцах и т.д.). После 16 недели гестации теломеразная активность исчезает в мозге и костях, хотя в этих тканях продолжается активное деление клеток. Со временем теломеразная активность перестает детектироваться во всех тканях эмбриона (Wright, et al, 1996).

Позднее оказалось, что теломеразная активность присутствует в некоторых тканях взрослого человека. Например, переменная активность теломеразы была обнаружена в нормальном костном мозге и лейкоцитах периферической крови (Broccoli, et al, 1995, Counter, et al., 1995, Hiyama, et al, 1995). При этом наблюдалось значительное вю >

We]

LH/ACA мотив

Рис.5 РНК-компонент теломеразы (Collins, 2008) перекрывание теломеразной активности лейкоцитов крови больных лейкемией и здоровых людей (Broccoli, et al., 1995). Регулируемая активность теломеразы обнаружена в нормальных зрелых Т и В клетках (Buchkovich and Greider, 1996, Hiyama, et al., 1995). Белок hTERT присутствует на одинаковом уровне как в тимоцитах, обладающих теломеразной активностью, так и в клетках периферической крови, в которых теломеразная активность отсутствует, но локализован в ядре и цитоплазме соответственно. Перед активацией периферических Т-клеток, hTERT перемещается из цитоплазмы в ядро, благодаря фосфорилированию. Для лимфоцитов может требоваться механизм быстрой индукции теломеразной активности, поэтому может быть более выгодным постоянное поддержание определенного уровня транскриптов hTR и hTERT, с посттрансляционной регуляцией ферментативной активности (Forsyth, et al., 2002, Liu, et al, 1999a). Теломеразную активность обнаруживают в базальном слое эпидермиса, содержащем активно пролиферирующие клетки, и включающем стволовые клетки (Harle-Bachor and Boukamp, 1996). Теломеразная активность, найденная в волосяном фолликуле, пропорциональна митотической активности каждого сегмента фолликула, и детектируется только во время ростовой фазы среди частично дифференцированных быстро делящихся клеток (Ramirez, et al., 1997). Теломеразная активность в этих клетках выше, чем в медленно делящихся стволовых клетках. (Forsyth, et al., 2002, Rubin, 2002). Также теломеразная активность обнаружена в нижней трети кишечных крипт, содержащей стволовые клетки, и не детектируется в верхней половине кишечных крипт, где расположены их дифференцировавшиеся потомки. Высокий пролиферативный потенциал в этих тканях влечет за собой особую необходимость наличия теломеразы для поддержания теломер и генетической стабильности (Collins and Mitchell, 2002, Forsyth, et al., 2002).

Нарушенная работа теломеразы непосредственно связана с такими заболеваниями человека, как врожденный дискератоз, недостаточность костного мозга и идиопатический легочный фиброз (Garcia, et al., 2007). Например, врожденный дискератоз является мультисистемным заболеванием, связанным с недостаточной пролиферацией, затрагивающим такие ткани, как кожа, кишечник и костный мозг, которые требуют постоянного обновления, и в норме высоко регенеративные (Cong, et al., 2002).

Молекулярный дефект, вызывающий врожденный дискератоз, - дисфункция теломеразы, причиной которой служат мутации либо в hTR, либо в связанном с теломеразной РНК белке дискерине (Mitchell, et al., 1999b, Theimer, et al., 2003, Vulliamy, et al., 2001).

Страдающие этим заболеванием пациенты обладают заметно более короткими теломерами чем здоровые люди. Врожденный дискератоз является прямым

23 свидетельством важности теломеразы в нормальном росте и развитии человека (Garcia, et al., 2007).

Дефекты теломеразы приводят к генетической нестабильности, возрастанию случаев рака кожи, как было показано на поздних поколениях животных, у которых отсутствовала теломераза и р53 (Blasco, et al., 1997, Lee, et al., 1998). Клетки в быстро делящихся тканях, обычно экспрессирующих теломеразу, должны страдать в наибольшей мере. При таких заболеваниях быстрое прогрессирующее укорочение теломер с каждым клеточным делением приводит к хромосомной нестабильности, особенно в коже, подверженной солнечному воздействию, в которой часто возникают мутации р53. И действительно, хромосомные слияния обнаружены при врожденном дискератозе, а также в поздних поколениях мышей, лишенных теломеразы (Artandi and DePinho, 2000, Dokal, 2001).

Большинство типов нормальных соматических клеток человека, однако, теломеразо-негативны и обладают ограниченным пролиферативным потенциалом (Hayflick, 1965, Shay and Wright, 2000). Что происходит с клетками по мере укорочения теломер? Двое американских исследователей Shay и Wright предложили гипотезу того, как связаны длина теломер, старение клеток и их способность к иммортализации. Согласно этой гипотезе, теломеры укорачиваются до критического уровня и вызывают остановку клеточного роста, состояние, которое называют репликативным старением или пределом Хейфлика (стадия Ml - mortality stage 1). Клетки, избежавшие репликативного старения в результате инактивации pRb/pl6 или р53, продолжают делиться, и теряют теломерную последовательность до тех пор, пока не достигнут второго пролиферативного барьера, кризиса (стадии М2), характеризующегося массовой клеточной гибелью, вызванной чрезвычайно короткими теломерами. Редкие выжившие клетки оказываются способными поддерживать длину теломер, в большинстве случаев благодаря активации теломеразы, что приводит к неограниченным пролиферативным возможностям, то есть клеточной иммортализации (Cong, et al., 2002).

Введение гена каталитического компонента теломеразы в клетки человека.

Введение в клетки человека гена каталитического компонента теломеразы приводит к восстановлению в этих клетках теломеразной активности, и в большинстве случаев, клетки приобретают способность к неограниченной пролиферации. Впервые в 1998 году с помощью введения hTERT удалось иммортализовать фибробласты, клетки эндотелия и пигментного эпителия сетчатки (Bodnar, et al., 1998, Counter, et al., 1998). Поскольку активность теломеразы обнаружена в 90% образцов биопсии 12 типов рака, существовала опасность, что введение гена- hTERT может способствовать их злокачественному перерождению (Bryan, et al., 1995, Harley and Villeponteau, 1995, Rubin, 2002). Ho последующие исследования показали, что приобретение неограниченного пролиферативного потенциала не сопровождается изменениями клеток, типичными для злокачественных трансформаций (Morales, et al., 1999). Затем с помощью введения hTERT были успешно иммортализованы и другие клетки - эпителиальные клетки, клетки надпочечников, меланоциты, стромальные клетки костного мозга, некоторые стволовые клетки и их предшественники (Bandyopadhyay, et al., 2001, Mihara, et al., 2003, Ramirez, et al., 2001, Thomas, et al., 2000).

Во многих случаях введение в клетки гена hTERT вызывало не только увеличение длины теломер и появление теломеразной активности, но также изменение экспрессии ряда генов. Так, например, эктопическая экспрессия каталитического компонента теломеразы в эпителиальных клетках приводит к уменьшению необходимости наличия экзогенных митогенов и коррелирует с теломеразо-зависимой индукцией генов -факторов роста. Ингибирование одного из таких факторов - EGFR приостанавливала усиленную пролиферацию (Smith, et al., 2003). В другом случае иммортализация фибробластов сопровождалось повышенной экспрессией эпирегулина, потенциального ростового фактора. Блокада эпирегулина снижала рост клеток и их способность образовывать колонии, а его ингибирование в иммортальных клетках запускало программу старения (Lindvall, et al., 2003). Также было показано, что в теломеризованных фибробластах повышается уровень экспрессии фактора роста кератиноцитов (KGF) и инсулин-подобного фактора роста II (IGF-II) до уровня, характерного для этих клеток на ранних пассажах (Kanzaki, et al., 2002).

Недавние исследования показывают, что эктопическая экспрессия hTERT может способствовать пролиферации клеток, независимо от увеличения длины теломер и стимуляции экспрессии различных факторов роста. Активность р53 вносит вклад в остановку клеточного цикла в результате недостатка ростовых факторов в среде (Itahana, et al., 2002). Повреждение ДНК и дисфункция теломер характеризуются появлением участков, содержащих фосфорилированные гистоны ШАХ и белок, связанный с р53 (53ВР1), которое сопровождается повышение активности р53 (Rogakou, et al., 1998, Schultz, et al., 2000, Takai, et al., 2003). Оказалось, что эктопическая экспрессия hTERT снижает число таких участков и уровень активного р53, таким образом, уменьшая чувствительность к истощению ростовых факторов в среде (Beliveau, et al., 2007).

Экспрессия hTERT не только способствует пролиферации клеток, но также приводит к биохимическим изменениям, характерным для более молодых клеток. В стареющих клетках эндотелия происходит снижение активности NO-синтазы и уменьшение

25 образования NO и увеличению адгезивности для моноцитов. Введение hTERT в эндотелиальные клетки человека приводило к восстановлению фенотипа, свойственного более молодым клеткам (Matsushita, et al., 2001). Также экспрессия hTERT-в фибробластах приводит к стабилизации активности 5-метилтрансферазы I ДНК (DNMT1), что позволяет сохранить клеткам уровень метилирования ДНК, характерного для молодых клеток, (Young, et al., 2003).

В некоторых случаях введение hTERТ позволяет усилить свойства, присущие исходным клеткам, например экспрессия этого гена в предшественниках эндотелиальных клеток повышала их способность к регенерации (Murasawa, et al., 2002). Введение hTERT в стромальные клетки костного мозга усиливало их способность к остеогенной дифференцировке (Shi, et al., 2002). При трансплантации таких клеток образование кости происходило быстрее, чем при трансплантации исходных клеток (Gronthos, et al., 2003). Теломеризованные стромальные клетки костного мозга поддерживали гемопоэз значительно лучше исходных клеток (Kawano, et al., 2003, Mihara, et al., 2003).

Однако, несмотря на изменения, способствующие пролиферации, не все клетки удается иммортализовать с помощью введения hTERT (Di Donna, et al., 2003, Forsyth, et al., 2003). Объяснением этому может служить необходимость более тщательно подбирать условия культивирования. Выяснилось, что повышенная концентрация кислорода, может вызывать повреждения ДНК, укорочение геломер и ингибировать пролиферацию в том числе и теломеризованных клеток (Oikawa and Kawanishi, 1999, von Zglinicki, et al., 1995).

Еще одна, недавно обнаруженная особенность гена каталитического компонента теломеразы - это способность локализоваться на митохондриях (Santos, et al., 2004).

Успешная иммортализация клеток привела к мысли, что теломеризованные клетки могут быть использованы в клеточной терапии. С помощью введения гена hTERT группе исследователей удалось получить панкреатические р-клетки человека в количестве достаточном для трансплантации. Эти клетки секретировали инсулин и экспрессировали факторы транскрипции, характерные для Р-клеток. Ген hTERT вырезали, и клетки подсадили мышам, у которых был вызван диабет. Трансплантация клеток привела к тому, то уровень глюкозы в крови мышей сохранялся в норме в течение 30 недель (Narushima, et al., 2005). Похожие эксперименты были проведены с гепатоцитами человека и с клетками коры надпочечников (Huang, et al., 2007, Totsugawa, et al., 2007).

Тщательное исследование свойств теломеризованных клеток и подбор условий, способствующих получению доброкачественных неограниченно пролиферирующих клеток, может позволить использовать в дальнейшем эти клетки в клеточной терапии.

Клетки волосяного сосочка.

Клетки волосяного сосочка — это клетки мезенхимального происхождения, расположенные в основании волосяного фолликула, которые регулируют его рост, экспрессируя и секретируя различные цитокины {Lu, et ai, 2006b). Структура зрелого волосяного фолликула чрезвычайно сложна (Rendí, et ai, 2005) (рис.6). Быстро пролиферирующие клетки матрикса, расположенные в волосяной луковице, образуют стержень волоса. Пигментную окраску волосяного стержня определяют меланоциты, рассеянные среди клеток матрикса. Когда клетки матрикса дифференцируются и продвигаются вверх, они сжимаются и принимают свою окончательную форму, образуя внутреннюю оболочку стержня. Клетки волосяного сосочка, расположенные в основании волосяного фолликула, определяют количество клеток матрикса и, следовательно, размер волоса (Paus and Cotsarelis, 1999).

Наружная оболочка стержня

Вн утреня я оболочка стержня клетки лрекортекса железа мышца следующий

Сальная АнЗГвН

Bulge

Дермальная оболочка

Волосяная луковица

Тел ore«

Цикл роста

Анаген

Катаген

Рис.б Схема строения волосяного фолликула (А) и цикл роста волоса (В), Волосяной фолликул проходит периодическую смену фаз роста: анаген (образование волоса), катаген (регрессия волоса) и телоген (покой). Во время анагена клетки волосяного сосочка DP находятся в волосяной луковицы, а область bulge - около сальной железы. При смене фаз цикла роста волоса, близость клеток DP к области bulge изменяется, наиболее тесный их контакт происходит в телогене, в результате запускается новый цикл роста волоса (Alonso and Fuchs, 2003).

Морфогенез

Стержень волоса

Роговой слои кожи

Каждый волосяной фолликул постоянно проходит через три стадии: стадию активного роста (анаген), стадию регрессии волоса или его инволюции (катаген) и стадию покоя (телоген) (Alonso and Fuchs, 2003, Paus and Cotsarelis, 1999). Во время анагена клетки матрикса быстро пролиферируют и передвигаются вверх. По мере продвижения наверх они выходят из клеточного цикла и дифференцируются, образуя внутреннюю оболочку стержня и сам стержень. Во время катагена клетки, в нижней части фолликула подвергаются апоптозу, и клетки волосяного сосочка DP передвигаются вверх до тех пор, пока не оказываются в непосредственной близости от области bulge, рядом с которой они располагаются в течение телогена. В области bulge расположены эпителиальные стволовые клетки кожи (Alonso and Fuchs, 2003). Клетки волосяного сосочка DP стимулируют стволовые клетки из области bulge к пролиферации и дифференцировке, и тем самым, восстановление фолликула, хотя для активации стволовый клеток только сигналов от клеток волосяного сосочка недостаточно (Cotsarelis, et al, 1990, Kong, et al., 2002, Li, et al, 2001, Panteleyev, étal., 1999).

Другая особенность клеток волосяного сосочка — это их способность к дифференцировке в различные типы клеток, показанная в ряде исследований (Jahoda, et al, 2003, Richardson, et al, 2005, Rufaut, et al., 2006). Было показано, что клетки волосяного сосочка человека способны к адипогенной и остеогенной дифференцировке, хотя разные клоны клеток обладали этой способностью в разной степени (Jahoda, et al, 2003). Пластичность клеток волосяного сосочка делает их чрезвычайно привлекательными для использования в клеточной терапии и биотехнологии. Но, как и другие соматические клетки человека, клетки волосяного сосочка обладают ограниченным пролиферативным потенциалом, и кроме того, их индуктивная способность и способность к дифференцировке падает с каждым пассажем в культуре (McElwee, et al, 2003, Rendl, et al, 2008, Weinberg étal., 1993).

Мезснхимальные стромальные клетки из процессированного липоаспирата.

Клетки из процессированного липоаспирата получают в результате процедуры липэктомии (Zuk, et al, 2001). Культура клеток процессированного липоаспирата представляет собой чрезвычайно гетерогенную популяцию клеток, которая включает в себя эндотелиальные клетки, фибробласты, гладкомьпнечные клетки и преадипоциты (Pettersson, et al, 1984). Большую часть популяции составляют клетки мезенхимального происхождения (Mizuno and Hyakusoku, 2003). Эти клетки обладают способностью к дифференцировке жировую, костную, хрящевую и мышечную ткань (Mizuno and Hyakusoku, 2003, Zuk, et al, 2002). Сравнительно легкая доступность МСК из липоаспирата по сравнению с другими стволовыми клетками, делает их многообещающим источником клеток для использования в клеточной терапии (Zuk, et al, 2002). Но, как и многие соматические клетки человека, МСК из липоаспирата обладают ограниченным пролиферативным потенциалом (Serakinci, et al., 2008).

Окислительный стресс и гипоксия

Активные формы кислорода.

Окислительный стресс вызывает различные разрушительные процессы, которые возникают в результате нарушения баланса между избыточным образованием активных форм кислорода (ROS) и/или активных форм азота (R.NS) и недостаточной антиоксидантной защитой (Turrens, 2003) (Рис.7). Небольшие флуктуации концентраций этих оксидантов активируют сигнальные каскады, изменяют экспрессию многих генов и играют регуляторную роль во многих внутриклеточных процессах (Droge, 2002, Hancock, et ai, 2001).

Рис. 7 Потенциальные мишени ROS в клетке. Образовавшиеся в митохондриях ROS могут повреждать митохондриальную ДНК и другие компоненты митохондрий. Окснданты могут повреждать ядерную ДНК, вызывая активацию р53 и другие пути ответа на повреждение ДНК. В цитоплазме в ответ на окислительный стресс могут запускаться кнназы JNK н р38. Наконец, прямая модификация белков может быть результатом действия ROS (Balaban, et al., 2005).

Активные формы кислорода - это различные молекулы и свободные радикалы, которые являются производными молекулярного кислорода. Молекулярный кислород имеет два неспаренных электрона на внешней оболочке. Восстановление кислорода приводит к образованию стабильного радикала - супероксида.

02 + е —> Ог' (супероксид) 2 02"' + 2Н+ —> Н202 + 02

Супероксид является предшественником большинства активных форм кислорода и медиатором окислительных реакций. Дисмутация супероксида, спонтанная или катализируемая супероксид дисмутазой, приводит к образованию перекиси водорода

Н2О2, которая, в свою очередь может быть полностью восстановлена до воды и гидроксильного радикала ОН", одного из сильнейших радикалов в природе (Turrens, 2003). Образование ОН" катализируют восстановленные переходные металлы, которые, в свою очередь, могут быть заново восстановлены супероксидом, и процесс может непрерывно продолжаться (Liochev and Fridovich, 1999). Кроме того, супероксид может реагировать с другими радикалами, включая оксид азота N0". Продукт такой реакции - пероксинитрит, также очень мощный оксидант (Radi, et al., 2002).

In vivo супероксид образуется в многочисленных компартментах клетки разнообразными ферментами. Источником супероксида может являться большое семейство NADPH оксидаз, расположенных в клеточной мембране полиморфноядерных клеток, макрофагов и эндотелиальных клеток (Babior, 2000, Lambeth, 2004). Супероксид может образовываться в результате метаболизма липидов внутри пероксисом, а также активности различных ферментов в цитозоле, таких как циклооксигеназы, например, цитохром Р45о-зависимая оксигеназа (Balaban, et al., 2005, Coon, et al., 1992, Vignais, 2002). Но большую часть активных форм кислорода (около 90%) производят митохондрии (Balaban, et al., 2005).

Образование активных форм кислорода в митохондриях.

Супероксид в качестве побочного продукта образуется в дыхательной цепи передачи электронов. Супероксид образуется в митохондриях в двух местах цепи передачи электрона: в комплексе I (NADH дегидрогеназа) и в комплексе III (убихинон-цитохром с редуктаза). В обычных условиях, комплекс III является основным источником ROS (Turrens, 1997). Комплекс I состоит примерно из 46 различных белков и содержит, по крайней мере, один связанный мононуклеотид флавина (FMN) и восемь групп Fe-S, которые принимают участие в образовании ROS (Genova, et al., 2001, Liu, et al., 2002). Образование супероксида в комплексе III связано с циклом превращений кофермента Q. Электрон от комплексов I или II передается коферменту Q (также называемому убихинон). Затем кофермент QH2 подвергается двум последовательным реакциям восстановления, с участием окисленных и восстановленных форм цитохрома b и цитохрома с. Нестабильный промежуточный радикал Q- может привести к образованию супероксида, передав электрон молекулярному кислороду (Finkel and Holbrook, 2000) (Рис. 8). sc®

Цитоплазма

Рис.8 Схематическая модель образования ROS в митохондриях. CAT — каталазы, GPx — глутатион-пероксидазы, SOD — супероксид дисмутаза.

Антиоксидантная защита.

Разрушительному действию ROS в значительной степени противостоят различные антиоксидантные системы. Супероксид превращается в Н2О2 семейством супероксид дисмутаз (SOD) (Fridovich, 1995). Супероксид может также спонтанно превращаться в Н2О2 и Ог, и роль SOD заключается в ускорении этой реакции.

Митохондриальный матрикс содержит особую форму SOD, у которой в активном центре находится марганец (Fridovich, 1995). Мп SOD удаляет Ог*' из матрикса и с внутренней стороны внутренней мембраны митохондрий. Экспрессия Mn SOD в результате окислительного стресса повышается благодаря активации фактора транскрипции NFkB (Murley, et al., 2001). Концентрация супероксида в межмембранном пространстве контролируется тремя различными механизмами. Во-первых, этот компартмент содержит другой изозим SOD, у которого в активном центре не марганец, а медь и цинк - CuZn SOD (Okado-Matsumoto and Fridovich, 2001). CuZn SOD также обнаружен в цитоплазме эукариотических клеток. Во-вторых, в межмембранном пространстве находится цитохром с, который может быть восстановлен Ог'', при этом образуется кислород. В-третьих, может происходить спонтанная дисмутация супероксида, благодаря утечке К1" через мембрану, создающей низкий pH в этом компартменте (Guidot et al., 1995). Перекись водорода устраняют глутатион пероксидаза и каталаза (Finkel and Holbrook, 2000).

Хотя при нормальных условиях между образованием ROS и антиоксидантной защитой существует баланс, в некоторых условиях антиоксидантной защиты становится недостаточно, и окислительный стресс приводит к апоптозу и клеточной смерти (Kroemer, et al., 1998). Усиленной образование ROS в митохондриях приводит к повышению проницаемости наружной мембраны митохондрий и раскрытию пор. Этому способствует окисление внутриклеточного глутатиона (Chernyak, 1997). В результате, цитохром с из межмембранного пространства перемещается в цитоплазму клетки, где соединяется с фактором Apaf-1 (Li, et al., 1997, Liu, et al., 1996). В присутствии АТФ этот комплекс полимеризуется в олигомер, известный как апоптосома. Апоптосома активирует каспазу-9, которая в свою очередь активирует каспазу-3. Каскад протеолитических реакций также активирует ДНКазы, и наступает клеточная смерть (Li, et al., 1997). В нормальных условиях, различные анти-апоптотические факторы (включая Bcl-xL), препятствуют проницаемости митохондрий, связываясь с их наружной мембраной. Эти факторы конкурируют с другими факторами семейства Вс1-2, например, Вах, которые способствуют апоптозу (Finucane, et al., 1999).

Образование ROS при гипероксии и гипоксии.

Предполагают, что образование супероксид-аниона возрастает при повышении концентрации кислорода из-за повышения потребления кислорода (Turrens, 2003). Первоначальные исследования показали, что in vitro, в супероксид-анион превращается 1 -2% потребляемого кислорода (Balaban, et al, 2005, Turrens, 2003). Последующие исследования в условиях более близких к физиологическим показали, что in vivo, особенно в тканях, которые подвержены воздействию атмосферного кислорода, доля кислорода, превратившегося в супероксид, по-видимому, гораздо меньше, и составляет около 0,2% кислорода (St-Pierre, et al., 2002, Staniek and Nohl, 2000).

Ряд исследователей полагает, что образование ROS является функцией концентрации кислорода окружающего воздуха, поэтому естественно было ожидать, что при гипоксии образование ROS будет снижаться (Balaban, et al., 2005, Turrens, 2003). Различные группы сообщают о парадоксальном повышении окислительного стресса в условиях умеренной гипоксии (Schumacker, 2002). Предполагают, что увеличение образования ROS при гипоксии может модулировать активацию одного или нескольких факторов HIF (hypoxia-inducible factors), группы белков, которые регулируют экспрессию генов, участвующих в адаптации к условиям гипоксии. В присутствии кислорода остатки пролина 402 и 564 HIF-1а гидроксилируются, что приводит к убиквитинированию и деградации этого фактора, что препятствует индукции ответа на гипоксический стресс (Semenza, 2002).

Предполагают, что для стабилизации HIF в условиях гипоксии необходимы активные формы кислорода, образующиеся в митохондриях, а гидроксилирование пролинов происходит в ответ на условия аноксии (Schroedl, et al, 2002).

Повышение уровня ROS при гипоксии трудно объяснить. Возможно, здесь играют роль два фактора. Даже в условиях гипоксии могут образовывать низкие концентрации N0' (Alvarez, et al., 2003). Оксид азота может связываться с цитохром оксидазой и ингибировать ее, что приводит к восстановлению переносчиков электронов и благоприятствует образованию супероксида при низких концентрациях кислорода (Cooper and Davies, 2000).

Старение клеток и кислород.

Каким образом образование активных форм кислорода внутри клеток связано со старением клеток? Многие исследователи показывают, что увеличение внутриклеточных оксидантов в результате изменения концентрации кислорода окружающего воздуха или снижение антиоксидантной защиты может ускорить начало процесса старения, в то же время понижение концентрации кислорода окружающего воздуха или повышение антиоксидантной защиты, наоборот откладывало начало старения (Colavitti and Finkel, 2005, Lu and Finkel, 2008). Подтверждением существования взаимосвязи между внутриклеточными ROS и старением клеток стали эксперименты, в которых клетки обрабатывали пероксидом водорода, что вызывало быструю остановку пролиферации клеток (Chen, et al., 1998, Frippiat, et al, 2000). Добавление суб-летальных концентраций пероксида водорода вызывало биохимические изменения в клетках - повышение уровня р53 и индукцию р21, ведущую к остановке клеточного цикла (Chen, et al, 1998). Тот факт, что экзогенный пероксид водорода может инициировать старение, и возрастающее понимание того, что и другие активные формы кислорода могут действовать как внутриклеточные сигнальные молекулы, регулирующие старение клеток, привели к переосмыслению роли кислорода окружающего воздуха и его влияния на деление клеток (Finkel, 2003).

Обычно клетки культивируют при необычно высокой концентрации кислорода. Большинство клеток в организме подвергаются воздействию концентрации кислорода более близкой к 5%, чем к 21% атмосферного кислорода (Lu and Finkel, 2008). Впервые влияние атмосферного кислорода на старение клеток в культуре была показано 30 лет назад. Культивируя фибробласты WI-38, на которых Хейфлик впервые показал, что клетки могут поделиться конечное число раз, прежде чем прекратить пролиферацию, два исследователя Packer и Fuehr показали, что количество удвоений, которые может сделать клетка, не является фиксированной величиной. Они показали, что на количество удвоений и продолжительность жизни клеток в культуре влияет концентрация кислорода в окружающем воздухе. По сравнению с клетками, которые они культивировали при 20% кислорода, клетки, находившиеся при 10% сделали в среднем на 20-30% больше удвоений, прежде чем остановиться. При этом клетки, которые они культивировали при 50% кислорода, наоборот, прекратили пролиферацию раньше, чем клетки, находившиеся при 20% кислорода (Packer and Fuehr, 1977).

Что происходит с клетками, когда они находятся в условиях атмосферного кислорода? Частота мутаций и геномных перестроек ДНК в эмбриональных фибробластах мыши (MEF) при 20% кислорода выше, чем при 3% (Busuttil, et al2003). Дополнительные эксперименты также продемонстрировали, что у эмбриональных фибробластов мыши, выращиваемых при атмосферном кислороде 20%, в 3-4 раза выше уровень повреждения ДНК, чем у клеток, которые культивировали при 3% (Parrinello, et al., 2003). Интересно, что мышиные клетки в 20% кислорода постарели, в то время как клетки, которые поддерживались при 3% кислорода - нет. Более того, у мышиных клеток при 20% кислорода было больше повреждений, чем у клеток человека в тех же условиях (Parrinello, et al., 2003). Другое важное отличие мышиных клеток от клеток человека — это длина их теломер. У мыши они существенно длиннее, поэтому их укорочение не ограничивает деление клеток, в то время как в клетках человека укорочение теломер приводит к репликативному старению клеток. В этой связи важно отметить, что на укорочение теломер также влияет концентрация кислорода в окружающем воздухе. Последовательность из трех гуанинов, является наиболее частой мишенью кислорода при окислительном стрессе (Oikawa and Kawanishi, 1999). Кроме того, было показано, что, если в обычных условиях с каждым клеточным делением клетка теряет около 90 п.о. теломерной ДНК, то при сильном окислительном стрессе (40% кислорода) теломеры укорачиваются со скоростью 500 п.о. за одно деление (von Zglinicki, et al., 1995).

Другая связь между активными формами кислорода, концентрацией кислорода и старением клеток возникает из исследований роли антиоксидантов в старении клеток. Так, например, добавление в культуральную среду антиоксиданта а-феншИ-бутилнитрона (PNB) продлевало продолжительность жизни фибробластов человека в культуре (Chen, et al., 1995). Точно также, повышенная экспрессия супероксид дисмутазы приводила к увеличению продолжительности жизни клеток человека в условия нормоксии и гипероксии, предположительно за счет уменьшения скорости укорочения теломер (Serra, et al., 2003). А нокдаун SOD1 приводил к остановке клеточного цикла и старению клеток (Blander, et al., 2003).

В последнее время в ряде исследований обнаружилась любопытная связь между каталитическим компонентом теломеразы hTERT и образованием активных форм кислорода. Santos et al. обнаружили, что hTERT обладает N-концевой лидерной последовательностью длиной 20 аминокислот, которая локализует его на митохондриях. Эти авторы показывают, что локализация hTERT на митохондриях приводит к увеличению повреждений митохондриальной ДНК и апоптозу после воздействия на клетки Н2О2 (Santos, et al, 2004, Santos, et al., 2006). Другая группа исследователей показала, что hTERT перемещается из ядра в цитоплазму и локализуется на митохондриях в ответ на окислительный стресс (Haendeler, et al., 2003а). Если обработать клетки антиоксидантами, то они не только уменьшат содержание ROS, но также ингибируют перемещение hTERT из ядра в цитоплазму (Haendeler, et ai, 2004). Ahmed et al., наоборот, в своей работе показывают, что перемещение hTERT из ядра в цитоплазму под действием окислительного стресса и локализация на митохондриях приводит к снижению образования ROS и повышению мембранного потенциала митохондрий (Ahmed, et al., 2008). Защита митохондриальной ДНК от повреждений может, таким образом, важной внетеломерной функцией теломеразы, способствующей выживанию клеток и увеличению продолжительности их жизни в культуре.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение и культивирование клеток.

Фибробласты кожи человека 1608 и ФКН, эмбриональные фибробласты 1075, клетки волосяного сосочка DPN, мезенхимальные стромальные клетки из процессированного липоаспирата 2063 были любезно предоставлены С.М. Тереховым (МГНЦ РАМН). Штамм 1608 получен из биоптата кожи здорового донора, штамм 1075 - из кожи 10-недельного плода. Клетки ФКН, DPN и 2063 получены от одного донора. ФКН - по стандартной методике из биоптата верхней стороны предплечья, DPN - по методике (Wu, et al, 2005), и 2063 - по методике (Zuk, et al, 2002) соответственно. Клетки TelMC были получены в результате введения гена каталитического компонента теломеразы {hTERT) в фибробласты кожи 1608 как описано в (Егоров, и др., 2002) и клонированы.

Все клетки культивировали в среде DMEM ("ПанЭко", Россия), содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки ("HyClone", США) и 40 ед./мл гентамицина ("ПанЭко", Россия) при 37°С, в атмосфере 5% С02, 21% 02 или 3% 02 (С02-ипкубатор Thermo Forma, США). По достижении клетками монослоя их рассевали, используя растворы Версена и трипсин - Версена (1:1).

Клетки наблюдали в инвертированный фазово-контрастный микроскоп Diaphot (Nikon, Япония). Фотографии делали с помощью цифровой камеры (Nikon D70, Япония).

Построение кривых роста.

Число удвоений популяции, которые клетки совершили между пересевами, рассчитывали как логарифм по основанию два от числа N, где N - количество клеток, которое оставляли в результате пересева. По оси абсцисс откладывали время (в днях), которое прошло между пересевами, по оси ординат — число удвоений популяции.

Введение геиа каталитического компонента теломеразы в клетки человека.

В клетки, которые культивировали при 3% кислорода, ФКН (на 6УП), 2063 (на 6УП) и DPN (на 2УП), вводили лентивирусную конструкцию, содержащую ген hTERT: pLA-CMV-hTERT, любезно предоставленную П.М. Чумаковым (ИМБ, РАН) (Рис.9).

У клеток, достигших 50% монослоя, удаляли культуральную среду и добавляли среду, содержащую вирусные частицы (400 мкл с титром 108/мл), разведенную средой с сывороткой в соотношении 1:5. Эта смесь содержала также 5 мкг/мл полибрена. Инкубировали ночь, затем меняли среду на обычную.

Рис. 9 Лентивирусная конструкция, несущая ген И ТЕНТ.

Радиоавтография.

Чтобы определить долю реплицирующих ДНК клеток, их инкубировали с среде, содержащей 3Н-тимидин (0,5-1 мкКи/мл; 2,5 Ки/моль) в течение 24 или 48ч. Клетки фиксировали 96% этанолом. Препараты клеток покрывали фотоэмульсией типа «М» ("Фотос", Россия), экспонировали 4-5 дней и проявляли амидоловым проявителем. Клетки окрашивали специально разработанным красителем на основе смеси метиленового и толуидинового синего. Клетки, включившие 3Н-тимидин определяли по наличию в них зерен серебра.

Введение гена ЬлсХ в теломершованныс фибробласты кожи.

Теломеризованные фибробласты Те1МС были трансфицированы лентивирусной конструкцией рЬА-СМ\г2С-Ьас2-Н4-риго (любезно предоставлена П.М.Чумаковым), содержащей ген ЬасХ и ген устойчивости к пуромицину (рис. 10). У клеток, достигших 50% монослоя, удаляли культуральную среду и добавляли среду, содержащую вирусные о частицы (600 мкл с титром 10 /мл), разведенный свежей культуральной средой в соотношении 1:3. Эта смесь содержала также 5 мкг/мл полибрена. Инкубировали ночь, после чего меняли среду на обычную. Селекцию клонов клеток, содержащих ген Ьас2, проводили в среде, содержащей 1 мкг/мл пуромицина, в течение 2 недель. Был получен один клон Те1МС |3§а1.

RSVLTRmvLTR

Рис. 10 Лентивирусная конструкция, несущая ген LacZ,

Выявление активности р-галактозидазм в клетках.

Для выявления р-галактозидазной активности клетки фиксировали 5 минут в 0,5% глутаровом альдегиде, приготовленном на PBS рН 7,4, содержащем 2 шМ MgCh. Дважды по 10 минут промывали в PBS рН 7,4, содержащем 2 mM MgCh, при 4°С. Затем добавляли окрашивающий раствор, следующего состава: 5тМ желтой кровяной соли K4[Fe(CN)é]-ЗН2О, 5 шМ красной кровяной соли Кз[Не (CN)e], PBS рН 7,4, содержащий 2 mM MgCh, и 1мг/мл X-Gal ("Serva", Германия). Фиксированные клетки инкубировали 18 часов при 37°С. Затем 3 раза промывали в PBS (до исчезновения желтизны раствора).

Измерение теломеразной активности.

Измерение теломеразной активности состоит из двух этапов. На первом этапе теломераза из клеточного экстракта добавляет GGTTAG повторы к 3'- концу специального олигонуклеотида из набора для измерения теломеразной активности. На втором этапе получившиеся о л и го н у к л е от ид ы амплифицируют с помощью ПЦР, используя специальные праймеры из набора. В результате ПЦР получается набор олигонуклеотидов, различающихся по длине на 6 пар оснований, начиная с длины 50 нуклеотидов: 50, 56, 62, 68 и т.д. В контрольных клетках, в которых теломераза не экспрессируется, такого набора продуктов не будет. Единственный нуклеотид, длиной 36 п.о., который получается в результате ПЦР, содержащей экстракты контрольных клеток, является внутренним контролем из смеси для проведения ПЦР.

Для измерения теломеразной активности использовали специальный набор TRAPeze ("Millipore", США). Клетки, достигшие плотности примерно 70% монослоя (105-106 клеток), переводили в суспензию с помощью растворов Версена и трипсина-Версена. Затем клетки промывали раствором PBS, осаждали центрифугированием, тщательно устраняли остатки PB S и замораживали при -70°С.

Перед измерением теломеразной активности клетки размораживали во льду и добавляли по 200 мкл лизирующего буфера (из набора TRAPeze) на 105-10б клеток. Суспензию клеток инкубировали на льду 30 мин, затем центрифугировали 20 мин при 12000 g при 4°С. Для измерения теломеразной активности использовали 2 мкл клеточного экстракта, остальной объем замораживали и хранили при -70°С.

Готовили смесь для проведения ПЦР с использованием реагентов из набора (Буфер, смесь нуклеотидов, смесь праймеров) и Taq-полимеразы ("Fermentas", Литва) , в соответствии с инструкцией, приложенной к набору. В качестве положительного контроля использовали клеточный экстракт, поставляемый вместе с набором. В качестве отрицательного контроля — смесь для проведения ПЦР.

Пробирки со смесью для ПЦР и анализируемыми образцами помещали в термоблок для проведения ПЦР ("Терцик", Россия) и инкубировали при 30°С 30 мин. Затем проводили ПЦР:

94°С ЗОсек

59°С 30 сек ^=—33 цикла

72°С 1 мин

Продукты, полученные после проведения ПЦР, помещали в лунки 10% полиакриламидного геля, приготовленного на 0.5х TBE . Электрофорез продолжался 40 мин при 40В/см. Затем гель окрашивали 30 мин в бромистом этидии (концентрация 1 мкг/мл) и 20 мин отмывали в воде. После чего гель фотографировали на приборе BioRad (США).

Определение концентрации белка в клеточных экстрактах.

Концентрацию белка определяли по Брэдфорду. Для этого готовили стандартные разведения BSA в лизирующем буфере, использовавшемся для получения клеточных экстрактов. Оптическую плотность измеряли OD595 на спектрофотометре. Концентрацию белка определяли по кривой зависимости OD595 от количества мкг В SA. Концентрация белка в 2 мкл клеточного экстракта представлена в таблице 1.

Таблица 1. Концентрации белка в 2 мкл клеточного экстракта.

Тип клеток ФКН ФКН hTERT DPN DPN hTERT 2063 2063 hTERT

Кол-во белка на дорожку геля, мкг 5 9 5 9 5,5 9,5

Метод колониеобразования.

Пролиферацию клеток в низкой плотности оценивали по способности образовывать колонии. По 200 клеток каждого типа (подсчет производился в камере Горяева) высевали в 10-см. чашки Петри ("Coming", США). Через 6, 7, 10, 12 или 14 дней клетки фиксировали и окрашивали (70% этанол, 0,1% метиленовый синий). Затем производился подсчет колоний и количества клеток в колониях при помощи лупы МБС-9 (СССР). Количество подсчитанных клеток фиксировали по разрядам двоичной системы. Если группа клеток состояла из 3 или 4 клеток, то мы считали ее колонией из 4 клеток; если в группе было от 5 до 8 клеток, то ее считали колонией из 8 клеток; если в группу входило от 65 до 128 клеток, то мы считали ее колонией из 128 клеток и т.д.

Во время опыта клетки культивировали в среде DMEM ("ПанЭко", Россия), содержащей 20% эмбриональной телячьей сыворотки ("HyClone", США) и 40 ед./мл гентамицина ("ПанЭко", Россия).

Колониеобразование при разных парциальных давлениях кислорода.

Опыты по изучению влияния кислорода на способность образовывать колонии ставили следующим образом: массовую культуру клеток, которая находилась при 3% (или 5%) кислорода делили на две части, одну часть клеток переводили в условия атмосферного кислорода (в 21%>), другую оставляли в прежних условиях, и в течение 4 недель клетки культивировали при различных концентрациях кислорода. Затем ставили опыт: по 3 чашки оставляли в тех условиях, в которых росла массовая культура, и по 3 чашки переносили из 3% (или 5%) кислорода в 21%> и, наоборот, из 21% кислорода в 3% (или 5%). Через 6 дней производили подсчет колоний и количества клеток в колониях.

Добавление антиоксидантов.

Для определения влияния антиоксидантов на способность образовывать колонии клеток TelMC использовали два антиоксиданта: карнозин (20 гпМ раствор в воде, профильтрован через фильтр, с размером пор 0.22 мкм) и N-ацетилцистеин (0.1 шМ в спирте). Антиоксиданты добавляли в культуральную среду в самом начале эксперимента. Опыты с карпозином проводили при 21% и при 5% кислорода, опыты с NAC только при 21% кислорода.

Добавление кондиционированной среды

Для определения влияния кондиционированной среды на способность образовывать колонии клеток, среду, полученную от активно пролиферирующих клеток, фильтровали через фильтры с размером пор 0.22 мкм и замораживали при -70°С. Замороженную КС хранили не дольше 3 месяцев. Размороженную среду добавляли в обычную среду для изучения колониеобразования в концентрации 20%, 50% и 100%.

Колониеобразование на фидерных слоях

Влияние фидерного слоя изучали следующим образом: клетки TelMC, использовавшиеся в качестве фидерного слоя, суспендировали, подсчитывали в камере Горяева и высевали в 10-см чашки Петри в различной концентрации. Концентрации клеток фидерного слоя были следующими: 200, 10 тыс., 20 тыс., 80 тыс., 200 тыс., и 2 млн. в обычной среде для культивирования клеток. Через 16 часов высевали по 200 клеток TelMCPgal, экспрессирующих р-галактозидазу. Опыт проводили в 3% кислорода. Через 6 дней клетки фиксировали и выявляли Р-галактозидазу как описано выше. А затем производили подсчет колоний и количества клеток в колониях.

Индукция костной и жировой дифференцировок

Клетки волосяного сосочка (DPN и DPN-hTERT) и мезенхимальные стромальные клетки из процессированного липоаспирата (2063 и 2063-hTERT) культивировали в 3% кислорода. По 250 тыс. клеток высевали на стекла в 6-луночные планшеты ("Corning", США) в обычной ростовой среде и переводили в условия атмосферного кислорода (21% Ог). На следующий день меняли обычную ростовую среду на среду для дифференцировки. Дифференцировочную среду меняли раз в 3-4 дня. Опыты длились 30-40 дней. В момент остановки эксперимента стекло и лунку промывали PBS и фиксировали в 4% формальдегиде ("Рапгеас", США) в течение 10 минут, затем снова промывали PBS.

Состав среды для индукции остеодифференцировки:

DMEM, 15% FBS

0,1 рМ дексаметазона

100 цМ аскорбиновой кислоты ("Sigma", США)

ЮтМ Р-глицерофосфата ("Sigma", США).

Состав среды для индукции адиподифференцировки:

DMEM, 15% FBS,

1 |хМ дексаметазона,

1 мкг/мл инсулина,

0,5 гпМ изобутилметилксантина (IBMX)

Выявление остеодифференцировки.

Для того чтобы убедиться в том, что дифференцировка произошла, стекла с клетками, сразу же после фиксации переносили в чистый планшет и окрашивали 2% водным раствором ализаринового красного (рН 4.1-4.2 доводили 10% гидроксидом аммония). Ализариновый красный используется для выявления минерализованного матрикса в тканях, с которым этот краситель формирует комплекс. Продолжительность окрашивания составляла 10 минут.

Выявление адиподифференцировки.

Для выявления липофильных включений использовали Судан IV. Непосредственно после фиксации стекла с клетками промывали PBS и переносили в чистый планшет, затем добавляли раствор Судана IV. Раствор готовили следующим образом: 50 мг Судана IV растворяли в 50 мл 60% изопропилового спирта. Через 10 мин. краситель убирали и промывали водой. Стекла с клетками хранили в холодильнике при +4°С в воде.

Выявление активности щелочной фосфатазы.

Клетки DPN и DPN-hTERT 5 минут фиксировали в 0.5% глутаровом альдегиде, затем 5 минут промывали в PBS. В течение 10 минут клетки находились в буфере, следующего состава: 100 mM Tris-HCl, рН 9.5; 100 тМ NaCl; 50 тМ MgCl2 . Затем в буфер были добавлены X-Phos ("Sigma", США) и NBT ("Sigma", США) (50мкл 100х X-Phos, ЮОмкл 50х NBT на 5 мл буфера). Клетки инкубировали 12 часов в темноте при комнатной температуре.

Выделение и очистка мРНК.

Для определения экспрессии гена - маркера остеогенной дифференцировки из клеток выделяли мРНК, затем переводили мРНК в кДНК при помощи реакции обратной транскрипции с poly-A праймерами, и затем проводили ПЦР интересующего гена по заданным специфическим праймерам.

Для выделения РНК использовали специальный набор (#Z3101, "Promega", США). Выделение и очистку проводили согласно инструкции производителя набора. РНК

42 выделяли из клеток, которые в течение Зх недель культивировали в дифференцировочной среде (примерно 106 клеток). Клетки промывали PBS и осаждали центрифугированием в течение 10 мин на 1000 об/мин. Отмывку в PBS повторяли дважды. Супернатант удаляли. Затем клетки лизировали с помощью буферов, поставляемых в наборе, и выделяли РНК из лизата, осаждая ее на колонках, согласно инструкции производителя.

Выделенную мРНК осаждали этанолом. Концентрацию соли доводили 0,2М NaCl, добавляли 2,5 объема 96% этанола (свободного от РНКаз). Инкубировали 1 час при -20°С, центрифугировали 50 мин 14000g. Ополаскивали осадок 70% этанолом и разводили в 20 мкл воды (свободной от РНКаз). Выделенную РНК хранили при -70°С. Концентрацию РНК определяли на спектрофотометре.

Обратная транскрипция.

Обратную транскрипцию мРНК осуществляли с помощью набора для синтеза первой цепи кДНК (олиго(ёТ)15) ("Силекс", Россия). Для синтеза кДНК смешивали в пробирке

1)1 мкг мРНК (в объеме 2 мкл),

2) 0,5 нг(1 мкл) 15 - членных праймеров олиго(сГГ)

3)18 мкл воды

Смесь перемешивали и осаждали кратковременным центрифугированием. Инкубировали 5 мин при 70°С, затем переносили пробирку в лед и добавляли следующие компоненты:

1) 2,5 мкл 10х буфера для обратной транскрипции ("Fermentas", Литва)

2) 4 мкл смеси 1,5мМ dNTP ("Fermentas", Литва)

3) 0,5 мкл обратной транскриптазы M-MLV ("Fermentas", Литва).

Смесь инкубировали 1 час при 37°С. Реакцию останавливали прогреванием в течение 10 мин при 70°С. кДНК хранили при -70°С.

ПЦР.

Для проведения ПЦР использовали набор JumpStart Taq Ready Mix (#D7440, "Sigma", США). На одну реакцию ПЦР смешивали в пробирке:

25 мкл 2х раствора JumpStart Taq Ready Mix

25 мМ MgCl2

0,2 мкМ прямого праймера

0,2 мкМ обратного праймера

2 мкл кДНК.

Тщательно перемешивали, добавляли минеральное масло и проводили ПЦР в термоблоке "Терцик" (Россия):

1)94°С -15 сек ^

2)50°С -1 мин 30 циклов

3)72°С - 1 мин J Последовательность праймеров:

GAPDH (Human glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) (PrimerBank ID: 7669492a2):

5'-TGT TGC CAT CAA TGA CCC CTT-3', (прямой)

5'-CTC CAC GAC GTA CTC AGC G-3' (обратный)

CBFA (Core binding factor alfa) (PrimerBank ID: 735898al)

5'- ACC AGA TGG GAC TGT GGT TAC -3' (прямой)

5'- CGT TGA ACC TTG СТА CTT GGT TT -3' (обратный)

Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в 2% агарозном геле. Гель фотографировали с помощью прибора BioRad. Фотографии обрабатывали в программе ImageJ.

Индукция тубулогенеза кератиноцитов. проводили совместно с Э.Чермных и Е. Воротеляк в ИБР РАН )

Для индукции тубулогенеза (модель волосяного фолликула), первичные кератиноциты помещали в специальные «колодцы» коллагенового геля, объемом 100 мкл. Для формирования колодца заливали коллагеновый гель двумя слоями. После жслатинизации первого слоя на него устанавливали пластиковое кольцо, приготовленное из утолщенной части наконечника для автоматической пипетки, затем заливали второй слой, так чтобы гель не попал в будущий колодец. Суспензия кератиноцитов помещалась в колодец. После прикрепления клеток (через 20-30 мин) пластиковое кольцо удаляли и добавляли среду DMEM:F12 (1:1), с содержанием 10% сыворотки плода коровы, L-глутамина, инсулина, изопротеренола и EGF, и кондиционированную среду в соотношении 1:1, и инкубировали при 37°С в С02-инкубаторе.

Для приготовления коллагенового геля готовили смесь: стерильный 0,34М раствор NaOH объединяли с концентрированной (х10) питательной средой Игла или 199 в соотношении 1:2 и на каждые 100 мл смеси добавляли 100 мг глутамина и 9 мл 7,5% бикарбоната натрия. Полученную смесь соединяли с охлажденным раствором коллагена в уксусной кислоте в соотношении 1:4, после чего помещали на лед для предотвращения быстрой желатинизации.

В эксперименте с применением клеток ОРИ-ЬТЕКТ клетки добавляли в гель. Для получения коллагенового геля с клетками БРИ-ЫЕИТ не застывший коллагеновый гель смешивали с клеточной суспензией в концентрации 300 тыс. клеток/мл геля. Затем заливали гель, как описано выше. Через 20-30 минут, после удаления пластикового кольца на удалённую от колодца поверхность геля наливали среду ОМЕМ:Р12 (1:1) с добавлением 10% сыворотки плода коровы, Ь-глутамина, инсулина, изопротеренола и ЕСР, и инкубировали при 37°С в СОг-инкубаторе.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Получение и свойства теломеризованных клеток

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Молдавер, Марианна Валерьевна

выводы

1. С помощью введения гена каталитического компонента теломеразы (ЬТЕЯТ) в условиях сниженного парциального давления кислорода (3%) иммортализованы три штамма клеток, полученных от одного донора: фибробласты кожи (ФКН), клетки волосяного сосочка (ВРЫ) и мезенхимальные стромальные клетки из липоаспирата (2063).

2. Значительная доля посеянных в низкой плотности иммортализованных с помощью введения ЬТЕКГ фибробластов, также как и исходных клеток, переходит в длительное не делящееся состояние.

3. Клетки 2063-ЬТЕ11Т после длительной пролиферации сохраняют способность к адипогенной дифференцировке и остеогенной дифференцировке.

4. В условиях атмосферного (21%) кислорода клетки 2063-ЬТЕКТ, в отличие от ФКН-ЬТЕЯТ и БРЫ-ЬТЕЯТ, не способны к продолжительной пролиферации.

5. Высокая гетерогенность пролиферативного потенциала фибробластов, в том числе и теломеризованных, отражает несовершенство культуральных условий, а не потенциальную способность клеток к пролиферации.

6. Клетки БРН-ЬТЕЮГ, в отличие от клеток при длительном культивировании сохраняют способность секретировать в среду факторы, индуцирующие тубулогенез кератиноцитов в геле (модель образования волосяного фолликула).

БЛАГОДАРНОСТИ

Я хочу выразить глубочайшую благодарность всем, кто помогал мне и внес вклад в эту диссертационную работу.

Я благодарю своего научного руководителя Егора Евгеньевича Егорова за предложенную тему работы, за все, чему я научилась и смогла достичь, за постоянную поддержку и понимание, терпение и снисходительность.

Я благодарю Александра Владимировича Зеленина за неизменную поддержку и заботу, за предоставленную возможность выполнить диссертационную работу в лаборатории, в которой им была создана высоконаучная и благожелательная атмосфера.

Я благодарю за сотрудничество Э.Чермных и Е.А. Воротеляк (Институт биологии развития РАН), С. М. Терехова (Медико-генетический центр РАМН), любезно предоставившего нам клеточные культуры, и П.М. Чумакова, любезно предоставившего генетические конструкции.

Я благодарю весь коллектив лаборатории молекулярной кариологии и основ клеточной терапии за моральную поддержку и помощь в работе.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Молдавер, Марианна Валерьевна, 2008 год

1. Егоров, Е. Е. Теломеры, теломерная ДНК, хромосомы. Биологические мембраны, 2001, 18 249-256.

2. Оловников, А. М. Принцип маргинотомии в матричном синтезе полинуклеотидов. Доклады Академии Паук, 1971,201 (6), 1496-1499.

3. Alonso, L. and Fuchs, E. Stem cells in the skin: waste not, Wnt not. Genes Dev, 2003, 17 (10), 1189-1200.

4. Alvarez, S., Valdez, L. B., Zaobornyj, T. and Boveris, A. Oxygen dependence of mitochondrial nitric oxide synthase activity. Biochem Biophys Res Commun, 2003, 305 (3), 771-775.

5. Artandi, S. E. and DePinho, R. A. Mice without telomerase: what can they teach us about human cancer? Nat Med, 2000, 6 (8), 852-855.

6. Babior, B. M. The NADPH oxidase of endothelial cells. IUBMB Life, 2000, 50 (4-5), 267-269.

7. Bae, N. S. and Baumann, P. A RAP1/TRF2 complex inhibits nonhomologous end-joining at human telomeric DNA ends. Mol Cell, 2007, 26 (3), 323-334.

8. Bailey, S. M., Brenneman, M. A. and Goodwin, E. H. Frequent recombination in telomeric DNA may extend the proliferative life of telomerase-negative cells. Nucleic Acids Res, 2004, 32 (12), 3743-3751.

9. Baird, D. M., Rowson, J., Wynford-Thomas, D. and Kipling, D. Extensive allelic variation and ultrashort telomeres in senescent human cells. Nat Genet, 2003, 33 (2), 203207.

10. Balaban, R. S., Nemoto, S. and Finkel, T. Mitochondria, oxidants, and aging. Cell, 2005, 120 (4), 483-495.

11. Bechter, O. E., Zou, Y., Walker, W., Wright, W. E. and Shay, J. W. Telomeric recombination in mismatch repair deficient human colon cancer cells after telomerase inhibition. Cancer Res, 2004, 64 (10), 3444-3451.

12. Beliveau, A., Bassett, E., Lo, A. T., Garbe, J., Rubio, M. A., Bissell, M. J., Campisi, J. and Yaswen, P. p53-dependent integration of telomere and growth factor deprivation signals. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104 (11), 4431-4436.

13. Bianchi, A., Stansel, R. M., Fairall, L., Griffith, J. D., Rhodes, D. and de Lange, T. TRP1 binds a bipartite telomeric site with extreme spatial flexibility. EMBO J, 1999, 18 (20), 5735-5744.

14. Blackburn, E. H. Switching and signaling at the telomere. Cell, 2001, 106 (6), 661-673.

15. Blander, G., de Oliveira, R. M., Conboy, C. M., Haigis, M. and Guarente, L. Superoxide dismutase 1 knock-down induces senescence in human fibroblasts. J Biol Chem, 2003, 278 (40), 38966-38969.

16. Blasco, M. A., Lee, H. W., Hande, M. P., Samper, E., Lansdorp, P. M., DePinho, R. A. and Greider, C. W. Telomere shortening and tumor formation by mouse cells lacking telomerase RNA. Cell, 1997, 91 (1), 25-34.

17. Boldyrev, A. A., Dupin, A. M., Pindel, E. V. and Severin, S. E. Antioxidative properties of histidine-containing dipeptides from skeletal muscles of vertebrates. Comp Biochem Physiol B, 1988, 89 (2), 245-250.

18. Broccoli, D., Young, J. W. and de Lange, T. Telomerase activity in normal and malignant hematopoietic cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92 (20), 9082-9086.

19. Bryan, T. M., Englezou, A., Gupta, J., Bacchetti, S. and Reddel, R. R. Telomere elongation in immortal human cells without detectable telomerase activity. EMBO J, 1995, 14(17), 4240-4248.

20. Bryce, L. A., Morrison, N., Hoare, S. F., Muir, S. and Keith, W. N. Mapping of the gene for the human telomerase reverse transcriptase, hTERT, to chromosome 5pl5.33 by fluorescence in situ hybridization. Neoplasia, 2000, 2 (3), 197-201.

21. Buchkovich, K. J. and Greider, C. W. Telomerase regulation during entry into the cell cycle in normal human T cells. Mol Biol Cell, 1996, 7 (9), 1443-1454.

22. Burge, S., Parkinson, G. N., Hazel, P., Todd, A. K. and Neidle, S. Quadruplex DNA: sequence, topology and structure. Nucleic Acids Res, 2006, 34 (19), 5402-5415.

23. Busuttil, R. A., Rubio, M., Dolle, M. E., Campisi, J. and Vijg, J. Oxygen accelerates the accumulation of mutations during the senescence and immortalization of murine cells in culture. Aging Cell, 2003, 2 (6), 287-294.

24. Cesare, A. J. and Griffith, J. D. Telomeric DNA in ALT cells is characterized by free telomeric circles and heterogeneous t-loops. Mol Cell Biol, 2004, 24 (22), 9948-9957.

25. Chai, W., Du, Q., Shay, J. W. and Wright, W. E. Human telomeres have different overhang sizes at leading versus lagging strands. Mol Cell, 2006, 21 (3), 427-435.

26. Chandel, N. S. and Schumacker, P. T. Cellular oxygen sensing by mitochondria: old questions, new insight. J Appl Physiol, 2000, 88 (5), 1880-1889.

27. Chang, C. C., Kuo, I. C., Ling, I. F., Chen, C. T., Chen, H. C., Lou, P. J., Lin, J. J. and Chang, T. C. Detection of quadruplex DNA structures in human telomeres by a fluorescent carbazole derivative. Anal Chem, 2004, 76 (15), 4490-4494.

28. Chen, Q., Fischer, A., Reagan, J. D., Yan, L. J. and Ames, B. N. Oxidative DNA damage and senescence of human diploid fibroblast cells. Proc Nail Acad Sci USA, 1995, 92 (10), 4337-4341.

29. Chernyak, B. V. Redox regulation of the mitochondrial permeability transition pore. BiosciRep, 1997, 17 (3), 293-302.

30. Chuang, C. H. and Hu, M. L. L-carnosine inhibits metastasis of SK-Hep-1 cells by inhibition of matrix metaoproteinase-9 expression and induction of an antimetastatic gene, nm23-Hl. Nutr Cancer, 2008, 60 (4), 526-533.

31. Cohen, S. B., Graham, M. E., Lovrecz, G. O., Bache, N., Robinson, P. J. and Reddel, R. R. Protein composition of catalytically active human telomerase from immortal cells. Science, 2007, 315 (5820), 1850-1853.

32. Colavitti, R. and Finkel, T. Reactive oxygen species as mediators of cellular senescence. IUBMB Life, 2005, 57 (4-5), 277-281.

33. Collins, K. The biogenesis and regulation of telomerase holoenzymes. Nat Rev Mol Cell Biol, 2006, 7 (7), 484-494.

34. Collins, K. Physiological assembly and activity of human telomerase complexes. Mech Ageing Dev, 2008,129 (1-2), 91-98.

35. Collins, K. and Mitchell, J. R. Telomerase in the human organism. Oncogene, 2002, 21 (4), 564-579.

36. Cong, Y. S., Wen, J. and Bacchetti, S. The human telomerase catalytic subunit hTERT: organization of the gene and characterization of the promoter. Hum Mol Genet, 1999, 8 (1), 137-142.

37. Cong, Y. S., Wright, W. E. and Shay, J. W. Human telomerase and its regulation. Microbiol Mol Biol Rev, 2002, 66 (3), 407-425, table of contents.

38. Coon, M. J., Ding, X. X., Pernecky, S. J. and Yaz, A. D. Cytochrome P450: progress and predictions. FASEBJ, 1992, 6 (2), 669-673.

39. Cooper, C. E. and Davies, N. A. Effects of nitric oxide and peroxynitrite on the cytochrome oxidase K(m) for oxygen: implications for mitochondrial pathology. Biochim Biophys Acta, 2000, 1459 (2-3), 390-396.

40. Cotsarelis, G., Sun, T. T. and Lavker, R. M. Label-retaining cells reside in the bulge area of pilosebaceous unit: implications for follicular stem cells, hair cycle, and skin carcinogenesis. Cell, 1990, 61 (7), 1329-1337.

41. Counter, C. M., Gupta, J., Harley, C. B., Leber, B. and Bacchetti, S. Telomerase activity in normal leukocytes and in hematologic malignancies. Blood, 1995, 85 (9), 2315-2320.

42. Court, R., Chapman, L., Fairall, L. and Rhodes, D. How the human telomeric proteins TRF1 and TRF2 recognize telomeric DNA: a view from high-resolution crystal structures. EMBO Rep, 2005, 6 (1), 39-45.

43. Deng, Y., Chan, S. S. and Chang, S. Telomere dysfunction and tumour suppression: the senescence connection. Nat Rev Cancer, 2008, 8 (6), 450-458.

44. Dessain, S. K., Yu, H., Reddel, R. R., Beijersbergen, R. L. and Weinberg, R. A. Methylation of the human telomerase gene CpG island. Cancer Res, 2000, 60 (3), 537-541.

45. Devereux, T. R., Horikawa, I., Anna, C. H., Annab, L. A., Afshari, C. A. and Barrett, J. C. DNA methylation analysis of the promoter region of the human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene. Cancer Res, 1999, 59 (24), 6087-6090.

46. Dokal, I. Dyskeratosis congenita. A disease of premature ageing. Lancet, 2001, 358 Suppl S27.

47. Dong, C. K., Masutomi, K. and Hahn, W. C. Telomerase: regulation, function and transformation. Crit Rev Oncol Hematol, 2005, 54 (2), 85-93.

48. Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol Rev, 2002, 82 (1), 47-95.

49. Ehmann, U. K. Feeder cells impart a growth stimulus to recipient epithelial cells by direct contact. Exp Cell Res, 1992, 199 (2), 314-322.

50. Ehmann, U. K., Stevenson, M. A., Calderwood, S. K. and DeVries, J. T. Physical connections between feeder cells and recipient normal mammary epithelial cells. Exp Cell Res, 1998, 243 (1), 76-86.

51. Feldser, D., Agani, F., Iyer, N. V., Pak, B., Ferreira, G. and Semenza, G. L. Reciprocal positive regulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha and insulin-like growth factor 2. Cancer Res, 1999, 59 (16), 3915-3918.

52. Feng, J., Funk, W. D., Wang, S. S., Weinrich, S. L., Avilion, A. A., Chiu, C. P., Adams, R. R., Chang, E., Allsopp, R. C., Yu, J. and et al. The RNA component of human telomerase. Science, 1995, 269 (5228), 1236-1241.

53. Finkel, T. Oxidant signals and oxidative stress. Curr Opin Cell Biol, 2003, 15 (2), 247254.

54. Finkel, T. and Holbrook, N. J. Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing. Nature, 2000, 408 (6809), 239-247.

55. Finucane, D. M., Bossy-Wetzel, E., Waterhouse, N. J., Cotter, T. G. and Green, D. R. Bax-induced caspase activation and apoptosis via cytochrome c release from mitochondria is inhibitable by Bcl-xL. J Biol Chem, 1999, 274 (4), 2225-2233.

56. Forsyth, N. R., Evans, A. P., Shay, J. W. and Wright, W. E. Developmental differences in the immortalization of lung fibroblasts by telomerase. Aging Cell, 2003, 2 (5), 235-243.

57. Forsyth, N. R., Wright, W. E. and Shay, J. W. Telomerase and differentiation in multicellular organisms: turn it off, turn it on, and turn it off again. Differentiation, 2002, 69(4-5), 188-197.

58. Forsythe, H. L., Jarvis, J. L., Turner, J. W., Elmore, L. W. and Holt, S. E. Stable association of hsp90 and p23, but Not hsp70, with active human telomerase. J Biol Chem, 2001,276(19), 15571-15574.

59. Fossel, M. Cells, ageing and human disease. Oxford University Press, 2003, 613.

60. Fridovich, I. Superoxide radical and superoxide dismutases. Annu Rev Biochem, 1995, 64 97-112.

61. Fu, D. and Collins, K. Distinct biogenesis pathways for human telomerase RNA and H/ACA small nucleolar RNAs. Mol Cell, 2003, 11 (5), 1361-1372.

62. Garcia, C. K., Wright, W. E. and Shay, J. W. Human diseases of telomerase dysfunction: insights into tissue aging. Nucleic Acids Res, 2007, 35 (22), 7406-7416.

63. Gilson, E. and Geli, V. How telomeres are replicated. Nat Rev Mol Cell Biol, 2007, 8 (10), 825-838.

64. Gorbunova, V., Seluanov, A. and Pereira-Smith, O. M. Evidence that high telomerase activity may induce a senescent-like growth arrest in human fibroblasts. J Biol Chem, 2003, 278 (9), 7692-7698.

65. Goueli, B. S. and Janknecht, R. Upregulation of the Catalytic Telomerase Subunit by the Transcription Factor ER81 and Oncogenic HER2/Neu, Ras, or Raf. Mol Cell Biol, 2004, 24 (1), 25-35.

66. Greider, C. W. Telomeres do D-loop-T-loop. Cell, 1999, 97 (4), 419-422.

67. Greider, C. W. and Blackburn, E. H. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. Cell, 1985, 43 (2 Pt 1), 405-413.

68. Greider, C. W. and Blackburn, E. H. A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis. Nature, 1989, 337 (6205), 331-337.

69. Griffith, J. D., Comeau, L., Rosenfield, S., Stansel, R. M., Bianchi, A., Moss, H. and de Lange, T. Mammalian telomeres end in a large duplex loop. Cell, 1999, 97 (4), 503-514.

70. Gronthos, S., Chen, S., Wang, C. Y., Robey, P. G. and Shi, S. Telomerase accelerates osteogenesis of bone marrow stromal stem cells by upregulation of CBFA1, osterix, and osteocalcin. J Bone Miner Res, 2003, 18 (4), 716-722.

71. Guidot, D. M., Repine, J. E., Kitlowski, A. D., Flores, S. C., Nelson, S. K., Wright, R. M. and McCord, J. M. Mitochondrial respiration scavenges extramitochondrial superoxide anion via a nonenzymatic mechanism. J Clin Invest, 1995, 96 (2), 1131-1136.

72. Gunes, C., Lichtsteiner, S., Vasserot, A. P. and Englert, C. Expression of the hTERT gene is regulated at the level of transcriptional initiation and repressed by Madl. Cancer Res, 2000, 60 (8), 2116-2121.

73. Guo, C., Armbruster, B. N., Price, D. T. and Counter, C. M. In vivo regulation of hTERT expression and telomerase activity by androgen. J Urol, 2003, 170 (2 Pt 1), 615618.

74. Haendeler, J., Hoffmann, J., Rahman, S., Zeiher, A. M. and Dimmeler, S. Regulation of telomerase activity and anti-apoptotic function by protein-protein interaction and phosphorylation. FEBS Lett, 2003b, 536 (1-3), 180-186.

75. Hancock, J. T., Desikan, R. and Neill, S. J. Role of reactive oxygen species in cell signalling pathways. Biochem Soc Trans, 2001, 29 (Pt 2), 345-350.

76. Harle-Bachor, C. and Boukamp, P. Telomerase activity in the regenerative basal layer of the epidermis inhuman skin and in immortal and carcinoma-derived skin keratinocytes. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93 (13), 6476-6481.

77. Harley, C. B. and Villeponteau, B. Telomeres and telomerase in aging and cancer. Curr Opin Genet Dev, 1995, 5 (2), 249-255.

78. Hayflick, L. The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res, 1965,37 614-636.

79. Hayflick, L. and Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp Cell Res, 1961, 25 585-621.

80. Heit, I., Wieser, R. J., Herget, T., Faust, D., Borchert-Stuhltrager, M., Oesch, F. and Dietrich, C. Involvement of protein kinase Cdelta in contact-dependent inhibition of growth inhuman and murine fibroblasts. Oncogene, 2001, 20 (37), 5143-5154.102

81. Heng, B. C., Liu, H. and Cao, T. Feeder cell density—a key parameter in human embryonic stem cell culture. In Vitro Cell Dev Biol Anim, 2004, 40 (8-9), 255-257.

82. Hiyama, K., Hirai, Y., Kyoizumi, S., Akiyama, M., Hiyama, E., Piatyszek, M. A., Shay, J. W., Ishioka, S. and Yamakido, M. Activation of telomerase in human lymphocytes and hematopoietic progenitor cells. J Immunol, 1995, 155 (8), 3711-3715.

83. Hockemeyer, D., Sfeir, A. J., Shay, J. W., Wright, W. E. and de Lange, T. POT1 protects telomeres from a transient DNA damage response and determines how human chromosomes end. EMBOJ, 2005, 24 (14), 2667-2678.

84. Holliday, R. and Kirkwood, T. B. Predictions of the somatic mutation and mortalization theories of cellular ageing are contrary to experimental observations. J Theor Biol, 1981, 93 (3), 627-642.

85. Horikawa, I., Cable, P. L., Afshari, C. and Barrett, J. C. Cloning and characterization of the promoter region of human telomerase reverse transcriptase gene. Cancer Res, 1999, 59 (4), 826-830.

86. Huang, Q., Chen, M., Liang, S., Acha, V., Liu, D., Yuan, F., Hawks, C. L. and Hornsby, P. J. Improving cell therapy—experiments using transplanted telomerasc-immortalized cells in immunodeficient mice. Mech Ageing Dev, 2007, 128 (1), 25-30.

87. Itahana, K., Dimri, G. P., Hara, E., Itahana, Y., Zou, Y., Desprez, P. Y. and Campisi, J. A role for p53 in maintaining and establishing the quiescence growth arrest in human cells. J Biol Chem, 2002, 277 (20), 18206-18214.

88. Ito, A., Kiyohara, T., Kawabe, Y., Ijima, H. and Kamihira, M. Enhancement of cell function through heterotypic cell-cell interactions using E-cadherin-expressing NIH3T3 cells. J Biosci Bioeng, 2008, 105 (6), 679-682.

89. Jady, B. E., Bertrand, E. and Kiss, T. Human telomerase RNA and box H/ACA scaRNAs share a common Cajal body-specific localization signal. J Cell Biol, 2004, 164 (5), 647-652.

90. Jahoda, C. A., Whitehouse, J., Reynolds, A. J. and Hole, N. Hair follicle dermal cells differentiate into adipogenic and osteogenic lineages. Exp Dermatol, 2003, 12 (6), 849859.

91. Jiang, B. H., Semenza, G. L., Bauer, C. and Marti, H. H. Hypoxia-inducible factor 1 levels vary exponentially over a physiologically relevant range of 02 tension. Am J Physiol, 1996, 271 (4 Pt 1), CI 172-1180.

92. Jun, E. S., Lee, T. II., Cho, H. H., Suh, S. Y. and Jung, J. S. Expression of telomerase extends longevity and enhances differentiation in human adipose tissue-derived stromal cells. Cell Physiol Biochem, 2004, 14 (4-6), 261-268.

93. Kang, S. K., Putnam, L., Dufour, J., Ylostalo, J., Jung, J. S. and Bunnell, B. A. Expression of telomerase extends the lifespan and enhances osteogenic differentiation of adipose tissue-derived stromal cells. Stem Cells, 2004, 22 (7), 1356-1372.

94. Kang, S. S., Kwon, T., Kwon, D. Y. and Do, S. I. Akt protein kinase enhances human telomerase activity through phosphorylation of telomerase reverse transcriptase subunit. J Biol Chem, 1999, 274 (19), 13085-13090.

95. Kanzaki, Y., Onoue, F., Ishikawa, F. and Ide, T. Telomerase rescues the expression levels of keratinocyte growth factor and insulin-like growth factor-II in senescent human fibroblasts. Exp Cell Res, 2002, 279 (2), 321-329.

96. Karlseder, J., Broccoli, D., Dai, Y., Hardy, S. and de Lange, T. p53- and ATM-dependent apoptosis induced by telomeres lacking TRF2. Science, 1999, 283 (5406), 13211325.

97. Kiyono, T., Foster, S. A., Koop, J. I., McDougall, J. K., Galloway, D. A. and Klingelhutz, A. J. Both Rb/pl6INK4a inactivation and telomerase activity are required to immortalize human epithelial cells. Nature, 1998, 396 (6706), 84-88.

98. Klingelhutz, A. J., Foster, S. A. and McDougall, J. K. Telomerase activation by the E6 gene product of human papillomavirus type 16. Nature, 1996, 380 (6569), 79-82.

99. Kourie, J. I. Interaction of reactive oxygen species with ion transport mechanisms. Am J Physiol, 1998, 275 (1 Pt 1), CI-24.

100. Kroemer, G., Dallaporta, B. and Resche-Rigon, M. The mitochondrial death/life regulator in apoptosis and necrosis. Annu Rev Physiol, 1998, 60 619-642.

101. Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y. and Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proc Natl Acad Sei USA, 2001, 98 (21), 12072-12077.

102. Kyo, S. and Inoue, M. Complex regulatory mechanisms of telomerase activity in normal and cancer cells: how can we apply them for cancer therapy? Oncogene, 2002, 21 (4), 688697.

103. Kyo, S., Takakura, M., Kanaya, T., Zhuo, W., Fujimoto, K., Nishio, Y., Orimo, A. and Inoue, M. Estrogen activates telomerase. Cancer Res, 1999, 59 (23), 5917-5921.

104. Kyo, S., Takakura, M., Taira, T., Kanaya, T., Itoh, H., Yutsudo, M., Ariga, H. and Inoue, M. Spl cooperates with c-Myc to activate transcription of the human telomerase reverse transcriptase gene (hTERT). Nucleic Acids Res, 2000, 28 (3), 669-677.

105. Lambeth, J. D. NOX enzymes and the biology of reactive oxygen. Nat Rev Immunol, 2004,4(3), 181-189.

106. Lansdorp, P. M., Verwoerd, N. P., van de Rijke, F. M., Dragowska, V., Little, M. T., Dirks, R. W., Raap, A. K. and Tanke, H. J. Heterogeneity in telomere length of human chromosomes. Hum Mol Genet, 1996, 5 (5), 685-691.

107. Laskey, J., Webb, I., Schulman, H. M. and Ponka, P. Evidence that transferrin supports cell proliferation by supplying iron for DNA synthesis. Exp Cell Res, 1988, 176 (1), 87-95.

108. Lee, H. W., Blasco, M. A., Gottlieb, G. J., Horner, J. W., 2nd, Greider, C. W. and DePinho, R. A. Essential role of mouse telomerase in highly proliferative organs. Nature, 1998,392 (6676), 569-574.

109. Lei, M., Zaug, A. J., Podell, E. R. and Cech, T. R. Switching human telomerase on and off with hPOTl protein in vitro. J Biol Chem, 2005, 280 (21), 20449-20456.

110. Lenain, C., Bauwens, S., Amiard, S., Brunori, M., Giraud-Panis, M. J. and Gilson, E. The Apollo 5' exonuclease functions together with TRF2 to protect telomeres from DNA repair. CurrBiol, 2006, 16 (13), 1303-1310.

111. Li, H., Zhao, L., Yang, Z., Funder, J. W. and Liu, J. P. Telomerase is controlled by protein kinase Calpha in human breast cancer cells. J Biol Chem, 1998, 273 (50), 3343633442.

112. Li, M., Chiba, H., Warot, X., Messaddeq, N., Gerard, C., Chambon, P. and Metzger, D. RXR-alpha ablation in skin keratinocytes results in alopecia and epidermal alterations. Development, 2001, 128 (5), 675-688.

113. Li, P., Nijhawan, D., Budihardjo, I., Srinivasula, S. M., Ahmad, M., Alnemri, E. S. and Wang, X. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-l/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell, 1997, 91 (4), 479-489.

114. Lin, S. Y. and Elledge, S. J. Multiple tumor suppressor pathways negatively regulate telomerase. Cell, 2003, 113 (7), 881-889.

115. Lin, T. M., Tsai, J. L., Lin, S. D., Lai, C. S. and Chang, C. C. Accelerated growth and prolonged lifespan of adipose tissue-derived human mesenchymal stem cells in a medium using reduced calcium and antioxidants. Stem Cells Dev, 2005, 14 (1), 92-102.

116. Liochev, S. I. and Fridovich, I. Superoxide and iron: partners in crime. IUBMB Life, 1999, 48 (2), 157-161.

117. Liu, D., Safari, A., O'Connor, M. S., Chan, D. W., Laegeler, A., Qin, J. and Songyang, Z. PTOP interacts with POT1 and regulates its localization to telomeres. Nat Cell Biol, 2004, 6 (7), 673-680.

118. Liu, K., Schoonmaker, M. M., Levine, B. L., June, C. H., Hodes, R. J. and Weng, N. P. Constitutive and regulated expression of telomerase reverse transcriptase (hTERT) in human lymphocytes. Proc Natl Acad Sci USA, 1999a, 96 (9), 5147-5152.

119. Liu, M., Wikonkal, N. M. and Brash, D. E. Induction of cyclin-depcndent kinase inhibitors and G(l) prolongation by the chemopreventive agent N-acetylcysteine. Carcinogenesis, 1999b, 20 (9), 1869-1872.

120. Liu, W. H., Liu, T. C. and Yin, M. C. Beneficial effects of histidine and carnosine on ethanol-induced chronic liver injury. Food Chem Toxicol, 2008, 46 (5), 1503-1509.

121. Liu, X., Kim, C. N., Yang, J., Jemmerson, R. and Wang, X. Induction of apoptotic program in cell-free extracts: requirement for dATP and cytochrome c. Cell, 1996, 86 (1), 147-157.

122. Liu, Y., Fiskum, G. and Schubert, D. Generation of reactive oxygen species by the mitochondrial electron transport chain. JNeurochem, 2002, 80 (5), 780-787.

123. Loayza, D. and de Lange, T. POT1 as a terminal transducer of TRF1 telomere length control. Nature, 2003, 423 (6943), 1013-1018.

124. Londono-Vallejo, J. A., DerSarkissian, H., Cazes, L. and Thomas, G. Differences in telomere length between homologous chromosomes in humans. Nucleic Acids Res, 2001, 29 (15), 3164-3171.

125. Lu, J., Hou, R., Booth, C. J., Yang, S. H. and Snyder, M. Defined culture conditions of human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA, 2006a, 103 (15), 5688-5693.

126. Lu, T. and Finkel, T. Free radicals and senescence. Exp Cell Res, 2008, 314 (9), 19181922.

127. Lu, Z. F., Cai, S. Q., Wu, J. J. and Zheng, M. Biological characterization of cultured dermal papilla cells and hair follicle regeneration in vitro and in vivo. Chin Med J (Engl), 2006b, 119(4), 275-281.

128. Makarov, V. L., Hirose, Y. and Langmore, J. P. Long G tails at both ends of human chromosomes suggest a C strand degradation mechanism for telomere shortening. Cell, 1997, 88(5), 657-666.

129. Marcand, S., Brevet, V. and Gilson, E. Progressive cis-inhibition of telomerase upon telomere elongation. EMBOJ, 1999, 18 (12), 3509-3519.

130. Marcand, S., Brevet, V., Mann, C. and Gilson, E. Cell cycle restriction of telomere elongation. Curr Biol, 2000, 10 (8), 487-490.

131. Marcand, S., Gilson, E. and Shore, D. A protein-counting mechanism for telomere length regulation in yeast. Science, 1997, 275 (5302), 986-990.

132. Martens, U. M., Zijlmans, J. M., Poon, S. S., Dragowska, W., Yui, J., Chavez, E. A., Ward, R. K. and Lansdorp, P. M. Short telomeres on human chromosome 17p. Nat Genet, 1998, 18 (1), 76-80.

133. Massard, C., Zermati, Y., Pauleau, A. L., Larochctte, N., Metivier, D., Sabatier, L., Kroemer, G. and Soria, J. C. hTERT: a novel endogenous inhibitor of the mitochondrial cell death pathway. Oncogene, 2006, 25 (33), 4505-4514.

134. Matsushita, H., Chang, E., Glassford, A. J., Cooke, J. P., Chiu, C. P. and Tsao, P. S. eNOS activity is reduced in senescent human endothelial cells: Preservation by hTERT immortalization. Circ Res, 2001, 89 (9), 793-798.

135. McElwee, K. J., Kissling, S., Wenzel, E., Huth, A. and Hoffmann, R. Cultured peribulbar dermal sheath cells can induce hair follicle development and contribute to the dermal sheath and dermal papilla. J Invest Dermatol, 2003, 121 (6), 1267-1275.

136. Meier, U. T. The many facets of H/ACA ribonucleoproteins. Chromosoma, 2005, 114 (1), 1-14.

137. Mitchell, J. R., Cheng, J. and Collins, K. A box H/ACA small nucleolar RNA-like domain at the human telomerase RNA 3' end. Mol Cell Biol, 1999a, 19 (1), 567-576.

138. Mitchell, J. R., Wood, E. and Collins, K. A telomerase component is defective in the human disease dyskeratosis congenita. Nature, 1999b, 402 (6761), 551-555.

139. Mizuno, H. and Hyakusoku, H. Mesengenic potential and future clinical perspective of human processed lipoaspirate cells. J Nippon Med Sch, 2003, 70 (4), 300-306.

140. Morales, C. P., Holt, S. E., Ouellette, M., Kaur, K. J., Yan, Y., Wilson, K. S„ White, M. A., Wright, W. E. and Shay, J. W. Absence of cancer-associated changes in human fibroblasts immortalized with telomerase. Nat Genet, 1999, 21 (1), 115-118.

141. Morrone, G., Corbo, L., Turco, M. C., Pizzano, R., De Felice, M., Bridges, S. and Venuta, S. Transferrin-like autocrine growth factor, derived from T-lymphoma cells, that inhibits normal T-cell proliferation. Cancer Res, 1988, 48 (12), 3425-3429.

142. Murley, J. S., Kataoka, Y., Hallahan, D. E., Roberts, J. C. and Grdina, D. J. Activation of NFkappaB and MnSOD gene expression by free radical scavengers in human microvascular endothelial cells. Free Radio Biol Med, 2001, 30 (12), 1426-1439.

143. Nelson, C. M. and Chen, C. S. Cell-cell signaling by direct contact increases cell proliferation via a PI3K-dependent signal. FEES Lett, 2002, 514 (2-3), 238-242.

144. Nishi, H., Nakada, T., Kyo, S., Inoue, M., Shay, J. W. and Isaka, K. Hypoxia-inducible factor 1 mediates upregulation of telomerase (hTERT). Mol Cell Biol, 2004, 24 (13), 60766083.

145. Oh, S., Song, Y., Yim, J. and Kim, T. K. The Wilms' tumor 1 tumor suppressor gene represses transcription of the human telomerase reverse transcriptase gene. J Biol Chem, 1999, 274 (52), 37473-37478.

146. Oh, S., Song, Y. IL, Yim, J. and Kim, T. K. Identification of Mad as a repressor of the human telomerase (hTERT) gene. Oncogene, 2000, 19 (11), 1485-1490.

147. Ohki, R., Tsurimoto, T. and Ishikawa, F. In vitro reconstitution of the end replication problem. Mol Cell Biol, 2001, 21 (17), 5753-5766.

148. Oikawa, S. and Kawanishi, S. Site-specific DNA damage at GGG sequence by oxidative stress may accelerate telomere shortening. FEBSLett, 1999, 453 (3), 365-368.

149. Okado-Matsumoto, A. and Fridovich, I. Subcellular distribution of superoxide dismutases (SOD) in rat liver: Cu,Zn-SOD in mitochondria. J Biol Chem, 2001, 276 (42), 38388-38393.

150. Opresko, P. L., Mason, P. A., Podell, E. R., Lei, M., Hickson, I. D., Cech, T. R. and Bohr, V. A. POT1 stimulates RecQ helicases WRN and BLM to unwind telomeric DNA substrates. J Biol Chem, 2005, 280 (37), 32069-32080.

151. Packer, L. and Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature, 1977, 267 (5610), 423-425.

152. Padoin, A. V., Braga-Silva, J., Martins, P., Rezende, K., Rezende, A. R., Grechi, B., Gehlen, D. and Machado, D. C. Sources of processed lipoaspirate cells: influence of donor site on cell concentration. Plast Reconstr Surg, 2008, 122 (2), 614-618.

153. Panteleyev, A. A., Botchkareva, N. V., Sundbcrg, J. P., Christiano, A. M. and Paus, R. The role of the hairless (hr) gene in the regulation of hair follicle catagen transformation. Am J Pathol, 1999, 155 (1), 159-171.

154. Park, J. H., Kim, S. J., Oh, E. J., Moon, S. Y., Roh, S. I., Kim, C. G. and Yoon, H. S. Establishment and maintenance of human embryonic stem cells on STO, a permanently growing cell line. Biol Reprod, 2003, 69 (6), 2007-2014.

155. Park, S. P., Lee, Y. J., Lee, K. S„ Ah Shin, H., Cho, H. Y„ Chung, K. S., Kim, E. Y. and Lim, J. H. Establishment of human embryonic stem cell lines from frozen-thawed blastocysts using STO cell feeder layers. Hum Reprod, 2004, 19 (3), 676-684.

156. Parrinello, S., Samper, E., Krtolica, A., Goldstein, J., Melov, S. and Campisi, J. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts. Nat Cell Biol, 2003, 5 (8), 741-747.

157. Paus, R. and Cotsarelis, G. The biology of hair follicles. N Engl J Med, 1999, 341 (7), 491-497.

158. Pettersson, P., Cigolini, M., Sjostrom, L., Smith, U. and Bjorntorp, P. Cells in human adipose tissue developing into adipocytes. Acta Med Scand, 1984, 215 (5), 447-451.

159. Prockop, D. J., Gregory, C. A. and Spees, J. L. One strategy for cell and gene therapy: harnessing the power of adult stem cells to repair tissues. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100 Suppl 1 11917-11923.

160. Pugh, C. W. and Rateliffe, P. J. Regulation of angiogenesis by hypoxia: role of the HIF system. Nat Med, 2003, 9 (6), 677-684.

161. Radi, R., Cassina, A. and Hodara, R. Nitric oxide and peroxynitrite interactions with mitochondria. Biol Chem, 2002, 383 (3-4), 401-409.

162. Ramirez, R. D., Morales, C. P., Herbert, B. S., Rohde, J. M., Passons, C., Shay, J. W. and Wright, W. E. Putative telomere-independent mechanisms of replicative aging reflect inadequate growth conditions. Genes Dev, 2001, 15 (4), 398-403.

163. Ramirez, R. D., Wright, W. E., Shay, J. W. and Taylor, R. S. Telomerase activity concentrates in the mitotically active segments of human hair follicles. J Invest Dermatol, 1997, 108 (1), 113-117.

164. Rendl, M., Lewis, L. and Fuchs, E. Molecular dissection of mesenchymal-epithelial interactions in the hair follicle. PLoS Biol, 2005, 3 (11), e331.

165. Rendl, M., Polak, L. and Fuchs, E. BMP signaling in dermal papilla cells is required for their hair follicle-inductive properties. Genes Dev, 2008, 22 (4), 543-557.114

166. Richards, M., Tan, S., Fong, C. Y., Biswas, A., Chan, W. K. and Bongso, A. Comparative evaluation of various human feeders for prolonged undifferentiated growth of human embryonic stem cells. Stem Cells, 2003, 21 (5), 546-556.

167. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S. and Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem, 1998,273 (10), 5858-5868.

168. Rolfs, A., Kvietikova, I., Gassmann, M. and Wenger, R. H. Oxygen-regulated transferrin expression is mediated by hypoxia-inducible factor-1. J Biol Chem, 1997, 272 (32), 20055-20062.

169. Rubin, H. The disparity between human cell senescence in vitro and lifelong replication in vivo. Nat Biotechnol, 2002, 20 (7), 675-681.

170. Rufaut, N. W., Goldthorpe, N. T., Wildermoth, J. E. and Wallace, O. A. Myogenic differentiation of dermal papilla cells from bovine skin. J Cell Physiol, 2006, 209 (3), 959966.

171. Safford, K. M., Hicok, K. C., Safford, S. D., Halvorsen, Y. D., Wilkison, W. O., Gimble, J. M. and Rice, H. E. Neurogenic differentiation of murine and human adipose-derived stromal cells. Biochem Biophys Res Commun, 2002, 294 (2), 371-379.

172. Santos, J. H., Meyer, J. N., Skorvaga, M., Annab, L. A. and Van Houten, B. Mitochondrial hTERT exacerbates free-radical-mediated mtDNA damage. Aging Cell, 2004, 3 (6), 399-411.

173. Santos, J. H., Meyer, J. N. and Van Houten, B. Mitochondrial localization of telomerase as a determinant for hydrogen peroxide-induced mitochondrial DNA damage and apoptosis. Hum Mol Genet, 2006, 15 (11), 1757-1768.

174. Saretzki, G., Petersen, S., Petersen, I., Kolble, K. and von Zglinicki, T. hTERT gene dosage correlates with telomerase activity in human lung cancer cell lines. Cancer Lett, 2002, 176(1), 81-91.

175. Schroedl, C., McClintock, D. S., Budinger, G. R. and Chandel, N. S. Hypoxic but not anoxic stabilization of HIF-1 alpha requires mitochondrial reactive oxygen species. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2002, 283 (5), L922-931.

176. Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A. and Halazonctis, T. D. p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks. J Cell Biol, 2000, 151 (7), 1381-1390.

177. Schumackcr, P. T. Hypoxia, anoxia, and 02 sensing: the search continues. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2002, 283 (5), L918-921.

178. Schumm, M. A., Castellanos, D. A., Frydel, B. R. and Sagen, J. Direct cell-cell contact required for neurotrophic effect of chromaffin cells on neural progenitor cells. Brain Res Dev Brain Res, 2003, 146 (1-2), 1-13.

179. Semenza, G. Signal transduction to hypoxia-inducible factor 1. Biochem Pharmacol, 2002, 64 (5-6), 993-998.

180. Semenza, G. L. Regulation of mammalian 02 homeostasis by hypoxia-inducible factor 1. Annu Rev Cell Dev Biol, 1999, 15 551-578.

181. Semenza, G. L. I-IIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. JAppl Physiol, 2000, 88 (4), 1474-1480.

182. Serakinci, N., Graakjaer, J. and Kolvraa, S. Telomere stability and telomerase in mesenchymal stem cells. Biochimie, 2008, 90 (1), 33-40.

183. Serra, V., von Zglinicki, T., Lorenz, M. and Saretzki, G. Extracellular superoxide dismutase is a major antioxidant in human fibroblasts and slows telomere shortening. J Biol Chem, 2003, 278 (9), 6824-6830.

184. Sfeir, A. J., Chai, W., Shay, J. W. and Wright, W. E. Telomere-end processing the terminal nucleotides of human chromosomes. Mol Cell, 2005, 18 (1), 131-138.

185. Shay, J. W. and Wright, W. E. Hayflick, his limit, and cellular ageing. Nat Rev Mol Cell Biol, 2000, 1 (1), 72-76.

186. Shi, S., Gronthos, S., Chen, S., Reddi, A., Counter, C. M., Robey, P. G. and Wang, C. Y. Bone formation by human postnatal bone marrow stromal stem cells is enhanced by telomerase expression. Nat Biotechnol, 2002, 20 (6), 587-591.

187. Skibinski, G., Elborn, J. S. and Ennis, M. Bronchial epithelial cell growth regulation in fibroblast cocultures: the role of hepatocyte growth factor. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2007, 293 (1), L69-76.

188. Slijepcevic, P. Telomere length and telomere-centromere relationships? Mutat Res, 1998, 404 (1-2), 215-220.

189. Smith, J. R. and Whitney, R. G. Intraclonal variation in proliferative potential of human diploid fibroblasts: stochastic mechanism for cellular aging. Science, 1980, 207 (4426), 8284.

190. Smith, L. L., Coller, H. A. and Roberts, J. M. Telomerase modulates expression of growth-controlling genes and enhances cell proliferation. Nat Cell Biol, 2003, 5 (5), 474479.

191. Smogorzewska, A. and de Lange, T. Different telomere damage signaling pathways in human and mouse cells. EMBOJ, 2002, 21 (16), 4338-4348.

192. Smogorzewska, A. and de Lange, T. Regulation of telomerase by telomeric proteins. Annu Rev Biochem, 2004, 73 177-208.

193. Soder, A. I., Iioare, S. F., Muir, S., Going, J. J., Parkinson, E. K. and Keith, W. N. Amplification, increased dosage and in situ expression of the telomerase RNA gene in human cancer. Oncogene, 1997, 14 (9), 1013-1021.

194. Sohal, R. S., Arnold, L. A. and Sohal, B. H. Age-related changes in antioxidant enzymes and prooxidant generation in tissues of the rat with special reference to parameters in two insect species. Free Radic Biol Med, 1990, 9 (6), 495-500.

195. Sozou, P. D. and Kirkwood, T. B. A stochastic model of cell replicative senescence based on telomere shortening, oxidative stress, and somatic mutations in nuclear and mitochondrial DNA. J Theor Biol, 2001, 213 (4), 573-586.

196. St-Pierre, J., Buckingham, J. A., Roebuck, S. J. and Brand, M. D. Topology of superoxide production from different sites in the mitochondrial electron transport chain. J Biol Chem, 2002, 277 (47), 44784-44790.

197. Staniek, K. and Nohl, H. Are mitochondria a permanent source of reactive oxygen species? Biochim Biophys Acta, 2000, 1460 (2-3), 268-275.

198. Stansel, R. M., de Lange, T. and Griffith, J. D. T-loop assembly in vitro involves binding of TRF2 near the 3' telomeric overhang. EMBOJ, 2001, 20 (19), 5532-5540.

199. Suda, T., Fujiyama, A., Takimoto, M., Igarashi, M., Kuroiwa, T., Waguri, N., Kawai, H., Mita, Y. and Aoyagi, Y. Interchromosomal telomere length variation. Biochem Biophys Res Commun, 2002, 291 (2), 210-214.

200. Tacchini, L., Bianchi, L., Bernelli-Zazzera, A. and Cairo, G. Transferrin receptor induction by hypoxia. HIF-1 -mediated transcriptional activation and cell-specific post-transcriptional regulation. J Biol Chem, 1999, 274 (34), 24142-24146.118

201. Takai, H., Smogorzewska, A. and de Lange, T. DNA damage foci at dysfunctional telomeres. Curr Biol, 2003, 13 (17), 1549-1556.

202. Tang, J., Kan, Z. Y., Yao, Y., Wang, Q., Hao, Y. H. and Tan, Z. G-quadruplex preferentially forms at the very 3' end of vertebrate telomeric DNA. Nucleic Acids Res, 2008,36(4), 1200-1208.

203. Tanoguchi, H., Tachibana, M. and Murai, M. Autocrine growth induced by transferrin-like substance in bladder carcinoma cells. Br J Cancer, 1997, 76 (10), 1262-1270.

204. Teixeira, M. T., Arneric, M., Sperisen, P. and Lingner, J. Telomere length homeostasis is achieved via a switch between telomerase- extendible and -nonextendible states. Cell, 2004, 117(3), 323-335.

205. Theimer, C. A., Finger, L. D., Trantirek, L. and Feigon, J. Mutations linked to dyskeratosis congenita cause changes in the structural equilibrium in telomerase RNA. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100 (2), 449-454.

206. Thomas, M., Yang, L. and Hornsby, P. J. Formation of functional tissue from transplanted adrenocortical cells expressing telomerase reverse transcriptase. Nat Biotechnol, 2000, 18 (1), 39-42.

207. Tomlinson, R. L., Ziegler, T. D., Supakorndej, T., Terns, R. M. and Terns, M. P. Cell cycle-regulated trafficking of human telomerase to telomeres. Mol Biol Cell, 2006, 17 (2), 955-965.

208. Turrens, J. F. Superoxide production by the mitochondrial respiratory chain. Biosci Rep, 1997, 17(1), 3-8.

209. Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol, 2003, 552 (Pt 2), 335-344.

210. Vaziri, H. and Benchimol, S. Reconstilution of telomerase activity in normal human cells leads to elongation of telomeres and extended replicative life span. Curr Biol, 1998, 8 (5), 279-282.

211. Verdun, R. E. and Karlseder, J. The DNA damage machinery and homologous recombination pathway act consecutively to protect human telomeres. Cell, 2006, 127 (4), 709-720.

212. Vignais, P. V. The superoxide-generating NADPH oxidase: structural aspects and activation mechanism. Cell Mol Life Sci, 2002, 59 (9), 1428-1459.

213. Vostrejs, M., Moran, P. L. and Seligman, P. A. Transferrin synthesis by small cell lung cancer cells acts as an autocrine regulator of cellular proliferation. J Clin Invest, 1988, 82 (1), 331-339.

214. Vulliamy, T., Marrone, A., Goldman, F., Dearlove, A., Bessler, M., Mason, P. J. and Dokal, I. The RNA component of telomerase is mutated in autosomal dominant dyskeratosis congenita. Nature, 2001, 413 (6854), 432-435.

215. Wang, F., Podell, E. R., Zaug, A. J., Yang, Y., Baciu, P., Cech, T. R. and Lei, M. The POT1-TPP1 telomere complex is a telomerase processivity factor. Nature, 2007, 445 (7127), 506-510.

216. Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A. and Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular 02 tension. Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92 (12), 5510-5514.

217. Wang, R. C., Smogorzewska, A. and de Lange, T. Homologous recombination generates T-loop-sized deletions at human telomeres. Cell, 2004, 119 (3), 355-368.

218. Wang, Y. and Patel, D. J. Guanine residues in d(T2AG3) and d(T2G4) form parallel-stranded potassium cation stabilized G-quadruplexes with anti glycosidic torsion angles in solution .Biochemistry, 1992, 31 (35), 8112-8119.

219. Wenger, R. H. Cellular adaptation to hypoxia: 02-sensing protein hydroxylases, hypoxia-inducible transcription factors, and 02-regulated gene expression. FASEB J, 2002, 16(10), 1151-1162.

220. Wong, J. M., Kusdra, L. and Collins, K. Subnuclear shuttling of human telomerase induced by transformation and DNA damage. Nat Cell Biol, 2002, 4 (9), 731-736.

221. Wright, W. E., Piatyszek, M. A., Rainey, W. E., Byrd, W. and Shay, J. W. Telomerase activity in human germline and embryonic tissues and cells. Dev Genet, 1996, 18 (2), 173179.

222. Wright, W. E. and Shay, J. W. Cellular senescence as a tumor-protection mechanism: the essential role of counting. Curr Opin Genet Dev, 2001, 11 (1), 98-103.

223. Wu, J. J., Liu, R. Q., Lu, Y. G., Zhu, T. Y., Cheng, B. and Men, X. Enzyme digestion to isolate and culture human scalp dermal papilla cells: a more efficient method. Arch Dermatol Res, 2005, 297 (2), 60-67.

224. Wu, K. J., Grandori, C., Amacker, M., Simon-Vermot, N., Polack, A., Lingner, J. and Dalla-Favera, R. Direct activation of TERT transcription by c-MYC. Nat Genet, 1999, 21 (2), 220-224.

225. Xin, II., Liu, D., Wan, M., Safari, A., Kim, H., Sun, W., O'Connor, M. S. and Songyang, Z. TPP1 is a homologue of ciliate TEBP-beta and interacts with POT1 to recruit telomerase. Nature, 2007, 445 (7127), 559-562.

226. Xu, Y., Sato, H., Shinohara, K., Komiyama, M. and Sugiyama, H. T-loop formation by human telomeric G-quadruplex. Nucleic Acids Symp Ser (OxJ), 2007, (51), 243-244.

227. Yang, J., Chang, E., Cherry, A. M., Bangs, C. D., Oei, Y., Bodnar, A., Bronstein, A., Chiu, C. P. and Herron, G. S. Human endothelial cell life extension by telomerase expression. J Biol Chem, 1999, 274 (37), 26141-26148.

228. Yang, Q., Zheng, Y. L. and Harris, C. C. POT1 and TRF2 cooperate to maintain telomeric integrity. Mol Cell Biol, 2005, 25 (3), 1070-1080.

229. Yatabe, N., Kyo, S., Maida, Y., Nishi, H., Nakamura, M., Kanaya, T., Tanaka, M., Isaka, K., Ogawa, S. and Inoue, M. HIF-1-mediated activation of telomerase in cervical cancer cells. Oncogene, 2004, 23 (20), 3708-3715.

230. Yokoi, S., Yasui, K., Iizasa, T., Imoto, I., Fujisawa, T. and Inazawa, J. TERC identified as a probable target within the 3q26 amplicon that is detected frequently in non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res, 2003, 9 (13), 4705-4713.

231. Young, J. I., Sedivy, J. M. and Smith, J. R. Telomerase expression in normal human fibroblasts stabilizes DNA 5-methylcytosine transferase I. J Biol Chem, 2003, 278 (22), 19904-19908.

232. Zaug, A. J., Podell, E. R. and Cech, T. R. Human P0T1 disrupts telomeric G-quadruplcxes allowing telomerase extension in vitro. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102 (31), 10864-10869.

233. Zhang, P., Chan, S. L., Fu, W., Mendoza, M. and Mattson, M. P. TERT suppresses apoptotis at a premitochondrial step by a mechanism requiring reverse transcriptase activity and 14-3-3 protein-binding ability. FASEB./, 2003, 17 (6), 767-769.

234. Zou, Y., Gryaznov, S. M., Shay, J. W., Wright, W. E. and Cornforth, M. N. Asynchronous replication timing of telomeres at opposite arms of mammalian chromosomes. Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101 (35), 12928-12933.

235. Zuk, P. A., Zhu, M., Ashjian, P., De Ugarte, D. A., Huang, J. I., Mizuno, H., Alfonso, Z. C., Fraser, J. K., Benhaim, P. and Hedrick, M. H. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol Biol Cell, 2002, 13 (12), 4279-4295.

236. Zuk, P. A., Zhu, M., Mizuno, H., Huang, J., Futrell, J. W., Katz, A. J., Benhaim, P., Lorenz, H. P. and Hedrick, M. H. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng, 2001, 7 (2), 211-228.