Развитие губки Halisarca dujardini Johnston (1842) (Demospongiae, Halisarcida) из Белого моря тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.30, кандидат биологических наук Гонобоблева, Елизавета Львовна

• Гонобоблева, Елизавета Львовна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Гонобоблева, Елизавета Львовна

Введение.3

Материалы и методы.6

Обзор литературы.10

Результаты.32

Основные этапы развития.32

Эмбриональная капсула.32

Дробление - формирование бластулы.33

Дифференцировка клеток.37

Свободноплавающая личинка.40

Метаморфоз.43

Ультраструктурные особенности развития.47

Дробление.47

Дифференцировка клеток зародышей.48

Свободноплавающая личинка.67

Метаморфоз.75

Основные типы клеток дефинитивной губки.92

Обсуждение.97

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Развитие губки Halisarca dujardini Johnston (1842) (Demospongiae, Halisarcida) из Белого моря»

Эмбриональное развитие и метаморфоз губок привлекают к себе внимание ученых по нескольким причинам. Прежде всего, филогенетическое положение группы РопГега определяет значимость всех аспектов биологии этих животных в сравнительно-эволюционном плане. С развитием науки, ее методологического аппарата, возникает необходимость в проведении новых исследований этой группы организмов.

Губки занимают значительное положение в формировании морских и пресноводных биоценозов. Изучение репродукции этих животных лежит в русле такой проблемы, как защита поверхностей от макрообрастания. Губки также являются хорошим индикатором экологического состояния водных бассейнов.

В южных широтах изучение репродукции роговых губок связано с развитием искусственных плантаций по выращиванию этих животных. В последнее время все более увеличивается использование губок в фармацевтической промышленности. Из них выделены разнообразные биологически активные препараты, число работ в этом направлении неуклонно увеличивается.

Изучению эмбрионального развития и метаморфоза губок посвящено значительное количество научных работ. Однако и к настоящему времени морфологические исследования раннего онтогенеза продолжают оставаться актуальными в силу необычайного разнообразия типов морфогенетических процессов, характеризующих эти этапы у представителей различных таксонов. Кроме того, в научной литературе едва ли удастся найти более двух-трех видов губок, эмбриональное развитие, личинки и метаморфоз которых полностью описаны с использованием современных морфологических методов. Как правило, в литературе встречаются работы, посвященные отдельным этапам раннего онтогенеза вида - описание оогенеза, эмбрионального развития, ультраструктура личинки или ее метаморфоз. Развитие молекулярно-биологических исследований в области эмбриогенеза также ставит новые задачи перед морфологическими, описательными работами.

В настоящей работе выполнено комплексное морфологическое описание эмбрионального развития, плавающей личинки и ее метаморфоза одного из представителей бесскелетных губок - НаШагса (1ц)'агсИт (Ветоэрог^ае, НаПэагаёа).

Изучение этапов раннего онтогенеза этого вида представляет интерес по нескольким причинам. Во-первых, губок отряда Halisarcida долгое время относили к наиболее просто организованным представителям класса Demospongiae, их тип развития считался наиболее примитивным, а морфогенетические процессы в ходе эмбрионального развития этого вида рассматривали как исходные в эволюционном плане для п/кл Ceractinomorpha (Levi, 1956; Borojevic, 1970; Bergquist et al., 1979; Bergquist, 1980; Короткова, 1981).

Как известно, основным таксономическим признаком губок является строение минерального скелета. В систематике же бесскелетных губок важное значение принимают тонкие морфологические признаки, особенности метаболизма и морфология различных стадий эмбрионального развития (Bergquist, 1996).

Н. dujardini представляет собой оптимальный объект исследования эмбрионального развития Porifera, обитающий в морях Русского Севера. Это связано с изученностью жизненного цикла этого вида и его особенностями, о чем будет сказано ниже, удобством получения материала и его препарирования, что является исключительно важным фактором при исследовании губок вообще, и в наших широтах, в частности.

Комплексное морфологическое описание раннего онтогенеза этого вида позволит нам в дальнейшем предпринять более детальные экспериментальные исследования различных морфогенезов в русле задач современной биологии развития.

Все сказанное выше определило цели и задачи настоящего исследования:1. Изучить общий ход эмбрионального развития и метаморфоза описываемого вида, выделить основные стадии раннего онтогенеза.

2. Провести пространственный анализ этапов раннего онтогенеза. Проследить характер преемственности морфогенетических осей в этот период.

3. Описать ультраструктурные особенности клеточной дифференцировки в ходе эмбриогенеза.

4. Изучить характер клеточных взаимодействий в системе развивающегося зародыша.

5. Провести исследование биологии личинки и ее ультратонкого строения.

6. Описать ультраструктурные особенности клеточной дифференцировки и трансдифференцировки в ходе метаморфоза.

7. Провести сравнительный анализ раннего онтогенеза изучаемого вида и других представителей типа РопГега.

Решение поставленных задач позволило получить следующие результаты.

Изучен общий ход эмбрионального развития и метаморфоза НаИзагса (1ц]'аг<Ит (ОетоБрогщте, НаН5агас1а), выделены основные стадии раннего онтогенеза. Выявлен феномен морфологической вариабельности этапов эмбрионального развития, описаны морфологические типы зародышей на различных стадиях развития. Предпринято морфологическое описание формообразовательных процессов, приводящих к вариабельности развития.

Описаны различные морфотипы плавающих личинок, в том числе новый тип личинок - дисферула.

Произведено исследование ультраструктурных особенностей клеточной дифференцировки и межклеточных взаимодействий в ходе эмбриогенеза, выявлено наличие межклеточных контактов, соединяющих клетки в составе поляризованных эпителиоподобных пластов.

Выполнено описание ультраструктурных особенностей трансдифференцировки клеток личинки в некоторые дефинитивные клеточные типы в ходе метаморфоза.

Показана морфологическая и структурная преемственность переднезадней оси личинки и базоапикальной оси ювенила в ходе метаморфоза. На основании литературных данных проведен сравнительный анализ преемственности основных осей в ходе раннего онтогенеза у различных представителей типа РопГега.

На основании анализа литературных данных и результатов собственных исследований выявлена необходимость в проведении ревизии видового состава отряда НаИ5агас1а.

Материалы и методы.

Настоящее исследование проводилось на базе кафедры эмбриологии Санкт-Петербургского государственного университета, лаборатории онтогенеза биологического научно-исследовательского института СПбГУ и морской биологической станции СПбГУ на Белом море.

Материал для фиксации получали как из особей, находящихся в искусственных условиях, так и из только что собранного материала.

Губки перед выходом личинок отсаживали в отдельные кристаллизаторы. Проводили фиксации личинок, вышедших из одной материнской губки и из губок одной локальной популяции.

Для наблюдения метаморфоза личинок отсаживали в чашки Петри или небольшие кристаллизаторы. В качестве субстрата всегда использовали фрагменты таллома бурых водорослей, которые были заселены губками изучаемого вида. Мы пробовали различные субстраты для оседания личинок (агар-агар, целллоидин, стекло, различные части таллома Laminaria, эпон), однако личинки не оседали на эти субстраты. Единственным искусственным субстратом, на который оседали личинки и претерпевали метаморфоз, были стерильные стекла и пластиковые чашки Петри. Однако этот материал непригоден для изучения ввиду невозможности изготовления срезов. Снять метаморфизирующую личинку с субстрата без повреждения невозможно.

Фиксации губок с развивающимися зародышами, личинок и метаморфизирующих особей проводили ежедневно.

Для электронной микроскопии небольшие фрагменты губок ( 2 мм) фиксировали следующими методами:I.

1. Префиксация в 1 % тетраоксиде осмия 10-15 мин на 0,1 М какодилатном(фосфатном) буфере (рН 7,4).

2. Отмывка в 0,2 М какодилатном (фосфатном) буфере 2 раза по 5 мин.

3. Фиксация в 2,5 % глутаровом альдегиде на 0,1 М какодилатном буфере (рН7,4) 1,5 часа.

4. Постфиксация 1 % тетраоксидом осмия на 0,1 М какодилатном (фосфатном) буфере (рН 7,4) 1 час.

5. Отмывка в 0,2 М какодилатном (фосфатном) буфере 3 раза по 10 мин.

1. Фиксация в 1% тетраоксиде осмия на 0,1 М какодилатном буфере (рН 7,4) в течение 3 часов.

2. Отмывка в 0,2М какодилатном буфере 3 раза по 10 мин.

1. Фиксация в смеси 1% тетраоксида осмия и 2% глутарового альдегида на 0,1 М какодилатном буфере (рН 7,4)с подобранной под морскую воду тоничностью сахарозой - 2 раза по 30 минут.

2. Отмывка в 0,2М какодилатном буфере 3 раза по 10 минут.

1. Префиксация 1% тетраоксидом осмия на 0,1 М какодилатном буфере в течение 10 мин.

2. Фиксация в 2,5% глутаровом альдегиде с 1% рутениевым красным на 0,1 М какодилатном буфере (рН 7,4) 1,5 часа.

3. Отмывка в 0,2М какодилатном буфере с 1% рутениевым красным (рН7,4).

4. Постфиксация в 1% тетраоксиде осмия с 1% рутениевым красным на 0,1М какодилатном буфере в течение 1 часа.

5. Отмывка в 0,2 М какодилатном буфере 4 раза по 10 мин.

1. Префиксация 1% тетраоксидом осмия на 0,1 М какодилатном буфере в течение 10 мин.

2. Фиксация в 2,5% глутаровом альдегиде с альциановым синим (1мг/мл) на 0,1 М какодилатном буфере (рН 7,4) 1,5 часа.

3. Отмывка в 0,2М какодилатном буфере (рН7,4).

4. Постфиксация в 1% тетраоксиде осмия с альциановым синим (1 мг/мл) на 0,1М какодилатном буфере в течение 1 часа.

5. Отмывка в 0,2 М какодилатном буфере 4 раза по 10 мин.

Осмотическая молярность всех растворов подгонялась сахарозой в соответствии с осмотической молярностью морской воды, из которой получали материал для фиксации.

Наиболее адекватной фиксацией для губок изучаемого вида является второй и третий методы. Последние два типа фиксации использовались для изучения межклеточных контактов в плавающей личинке. Кроме альцианового синего и рутениевого красного для выявления и изучения межклеточных контактов было использовано азотнокислое серебро, однако эта фиксация не дала положительных результатов. Работа в полевых условиях и короткий период эмбриогенеза и личиночной жизни у Н. сЬуагеИт ограничивает наши возможности по подбору оптимальных методов фиксации материала для различных исследований.

Образцы для электронной микроскопии заливались в смесь эпона и аралдита. Ультратонкие срезы изготавливались на ультратоме ЬКВ стеклянными ножами. Контрастирование срезов проводили спиртовым растворомуранилацетата и цитратом свинца по Рейнольдсу. Ультратонкие срезы просматривались на электронном микроскопе Hitachi 100С.

Производилась пространственная реконструкция зародышей по серийным полутонким срезам (2 мкм). Для исследования полиморфизма в ходе эмбрионального развития просматривались парафиновые срезы (5мкм) большой площади.

Окраска полутонких срезов производилась метиленовым синим и толлуидиновым синим. Окраска парафиновых срезов проводилась гематоксилином по методу Маллори. Для выявления материнских клеток при окраске использовали эозин водный. Для выявления основных белков использовали окраску прочным зеленым.

Обзор литературы.

Представители типа Porifera стоят особняком от других Metazoa в филогенетических системах, что является следствием необычной организации этих животных. До сих пор остаются не выясненными взаимосвязи губок с Cnidaria, Placozoa и другими многоклеточными (Woollacott, Pinto, 1995; Maldonado, 2004). В отношении губок остается дискуссионным понятие биологической индивидуальности (Колтун, 1988; Марфенин, 1997). Уникальным для многоклеточных животных является отношение организма губок с внешней средой, заключающееся в фильтрационном способе питания через многочисленные приносящие каналы. Губки находятся на донервном уровне организации жизни, остаются невыясненными природа и характер интегративных связей у этих организмов (Gaino et al, 1995; Серавин, 1986, 1992). Спорным является вопрос об уровне организации клеточных пластов этих животных — можно ли считать их истинными тканями, аналогичными таковым других многоклеточных (Sara, 2004).

Достижения современной биологии позволяют во многом переосмыслить обобщения классической биологии. Одним из таких фундаментальных обобщений описательной и сравнительной эмбриологии является теория зародышевых листков (Kovalevsky, 1871; Дондуа, 1994). Вопрос о наличии зародышевых листков у губок дискутировался на протяжении многих лет и остается не решенным до настоящего времени (см. обзоры: Малахов, 1990; Серавин, 1992; Efremova, 1997).

Развитие - интегрированный процесс, в реализации которого участвует комплекс скоординированных морфогенезов, последовательные этапы которых включают установление паттерна организма, дифференцировку систем органов и тканей. Именно изучение процессов развития губок позволит выявить характер и степень сложности и интегрированности морфогенезов у этих животных, ибо дефинитивные организмы характеризуются удивительной пластичностью, являющейся экологической стратегией группы Porifera.

Кроме того, примитивный уровень организации этих животных позволяет изучать in vivo простейшие в эволюционном плане формообразовательные процессы, происходящие в течение эмбриональных и соматических морфогенезов.

Данные сравнительной эмбриологии использовались в таксономии губок, основателем этого подхода считается французский спонгиолог К. Леви (Levi, 1956). Особенно важными эмбриологические критерии считались для систематики представителей типа, лишенных минерального скелета, к которым относится и отряд Halisarcida (Levi, 1956; Chen, 1976; Bergquist et al., 1998).

Эмбриональное развитие губок с давних времен привлекает к себе внимание исследователей (Metschnikoff, 1874; Schulze, 1877; Minchin, 1896; Tuzet, 1947, 1948, 1970 и др.). Несмотря на это сравнительная эмбриология губок на сегодняшний день недостаточно разработана. Связано это, прежде всего, с удивительным разнообразием типов развития у представителей различных систематических групп. Разнообразие характера развития у различных представителей типа губок неоднократно привлекало к себе внимание исследователей с целью систематизации типов развития и понимания причин их разнообразия (Brien, 1967, 1972; Borojevic, 1970; Короткова, 1981; Ivanova-Kazas, 1997; Ересковский, 2002).

Недостаточная изученность Губок на морфологическом уровне обусловлена в значительной мере методологическими проблемами. Лабильность тканевой организации, малые размеры большинства эмбриологических объектов и другие особенности Губок определяют значительные затруднения при исследовании морфологических особенностей их развития.

Разнообразие типов развития определяет разнородность различных критериев, из которых складывается общая картина биологии развития таксономической группы. Это, в частности, формирование и преемственность морфогенетических осей в ходе развития, тип дробления, формирование двуслойности, тип личинок и т. д. По-этому, делая обзор литературных данных по развитию Губок, мы вынуждены чаще всего обращаться к особенностям развития таксона на уровне отряда и даже вида.

Вопрос о формировании и преемственности морфогенетических осей -один из фундаментальных вопросов биологии развития. По этому критерию губок можно разделить на две группы - известковые губки (у которых наблюдается четкая преемственность полярности яйцеклетки, зародыша и дефинитивной губки (Tuzet, 1970)) и все остальные представители типа (преемственность морфогенетических осей у которых выражена в меньшей (и в разной) степени).

Большинство демоспонгий характеризуется изолецитальными яйцами, анимально-вегетативная полярность которых не выявлена. Исключениемявляются представители отряда Poecilosclerida, имеющие телолецитальные яйца (Maas, 1894; Ересковский, 1986). Анимальным принимают тот полюс яйца, на котором располагается ядро (основываясь на традиционном определении телолецитапьных яиц (Иванова-Казас,1995)). У представителей этого отряда анимальный полюс яйца становится передним полюсом плавающей личинки.

Интересным, в отношении формирования и преемственности морфогенетических осей, является развитие яйцекладущих губок рода Tetilla (Watanabe, 1978), оплодотворенные яйца которых прикрепляются к субстрату и точка прикрепления определяет направление веретен дробления, полярный характер клеточной дифференцировки и апикобазальную полярность дефинитивной губки.

У Halisarca dujardini и Н. metschnikovi анимально-вегетативная полярность определяется по расположению направительных телец, которые удалось обнаружить нескольким исследователям (Levi, 1956; Короткова, Апалькова, 1975; Короткова, Ересковский, 1984). Основываясь на их расположении, определяется ориентация первых двух борозд дробления у этих видов (Levi, 1956), однако проследить связь полярности яйцеклетки и эмбриона не удается.

Дробление в пределах различных таксонов может быть равномерным или неравномерным, полным или неполным, неупорядоченным, имеющим черты радиальности или радиальным. У Известковых губок дробление протекает по типу табличной палинтомии (обзор - Fell, 1989; Maldonado, Bergquist, 2002).

Длительность первых циклов дробления показана на яйцекладущей губке Tetilla japónica (Watanabe, 1978) и составляет 1.5 часа для каждого из первых трех раундов дробления. Одной из необычных особенностей ранних этапов развития губок является присутствие ядрышек в ядрах бластомеров (Fell, 1969; Иванова, 1981; Короткова, Ересковский, 1984; Franzen, 1988; Sailer, 1988; Sizova, Ereskovsky, 1997).

Основываясь на данных по эмбриогенезам губок, в настоящее время выделяют три основных пути развития: дробление приводит к формированию морулы (стерреобластула в западной литературе), дробление приводит к формированию целобластулы, и эмбриогенез, свойственный только известковым губкам подкласса Calcaronea - дробление которых приводит к формированию стомобластулы (Fell, 1989; Maldonado, 2004).

Стадия морулы характерна для эмбрионального развития большинства изученных к настоящему времени представителей класса Demospongia.

Исключение составляет эмбриогенез Neocoelia crypta Vacelet 1977 (Vacelet, 1979), y которой дробление приводит к формированию целобластулы, в результате процесса униполярной иммиграции затем преобразующейся в изобластомерную морулу. У яйцекладущей губки Tethia aurantum (Hadromerida) (Levi, 1956) в результате дробления образуется зародыш типа стерробластулы, согласно отечественной терминологии, хотя в западной литературе его также называют морулой.

Стадия целобластулы, возникающей в результате дробления, характерна для эмбрионального развития известковых губок подкласса Calcinea.

Сведений о начале и характере клеточной дифференцировки в составе морулы очень мало и часто сведения о цитодифференцировке трудно сопоставимы вследствие различной детальности и различных методов, применяемых при описании развития.

У некоторых видов морулы, возникающие в результате дробления, состоят из разных по размеру клеток (гетеробластомерные морулы). Такие зародыши развиваются из тетолецитальных яиц Poecilosclerida (Ересковский, 1986; Maas, 1894), У Poecilosclerida неравномерное распределение желточных гранул и расположение ядра на одном из полюсов ооцита отражает первичную полярность этой клетки, которая принимается как анимально-вегетативная полярность (Ересковский, 2002). Телолецитальные яйца дробятся неравномерно и, таким образом, различия в судьбе бластомеров проявляются уже с первых делений дробления. Микромеры локализованы на условно-анимальном полюсе и в ходе последующего развития эта область становится передним полюсом плавающей личинки (Ересковский, 1986; Ересковский, 2002). Митотические деления клеток более активны в этой зоне, и в области переднего полюса из производных микромеров начинается дифференцировка жгутикового наружного эпителия личинки. Считается, что производные микромеров мигрируют к условно вегетативному полюсу зародыша (процесс эпиболии) и дают популяцию наружных жгутиковых клеток личинки (Короткова, 1981; Ересковский, 1986). Первым дифференцированным типом клеток являются склероциты. Эти клетки дифференцируются в периферических участках поздней морулы - вероятно, на стадии 2000 клеток.

У большинства демоспонгий в результате дробления формируется изобластомерная морула. (отряды Haplosclerida,, Halichondrida, Dendroceratida, Dictyoceratida). Некоторые авторы указывают, что дифференцировка клеток ипроявление переднезадней полярности зародыша начинается на стадии 1000 -2000 кл. У Haliclona limbata (Haplosclerida) и (Meewis, 1939) Reniera sp. (Leys, Degnan, 2002) на этом этапе появляются первые различия в размерах бластомеров, возникающие, вероятно, вследствие неравномерного митоза на 10-11 клеточных циклах. Мевис указывает, что различия в размерах обусловлены скоростью митотических делений (Meewis, 1939). Микромеры и макромеры присутствуют в всех областях морулы, за исключением небольших областей на переднем и заднем полюсе. Затем начинается миграция микромеров к периферии, где они дифференцируются в жгутиковый эпителий личинки. Согласно данным, приведенным Мевис и Лейс — дифференцировка жгутиковых клеток начинается в процессе их миграции к периферии. Более того, возникновение различных типов жгутиковых клеток, свойственных, например, для личинки Haliclona limbata, также возникают в ходе миграции микромеров.

Морфологическое проявление переднезадней полярности изобластомерных морульных зародышей совпадает с началом цитодифференцировки. Многими авторами, изучавшими эти этапы у разных видов демоспонгий, показано, что цитодифференцировка сопровождается клеточной миграцией (Ересковский, 1986; Meewis, 1939, 1941; Leys, Degnan, 2002). Вместе с тем, основываясь главным образом на детальных работах Мевис можно заключить, что установление переднезадней полярности зародышей происходит до начала клеточных перемещений и миграция клеток скоординирована относительно уже установленной полярности эмбриона (Meewis, 1939, 1941).

Формирование полярности может осуществляться разными способами. Полярность зародыша может быть обусловлена характером дифференцировки или наружного слоя клеток, или внутреннего слоя клеток, или обоих клеточных слоев.

Формирование переднезадней полярности у представителей морских Haplosclerida, Halichondrida, Dictyoceratida и Poecilosclerida проявляется в характере дифференцировки наружного слоя клеток.

У Haliclona limbata (Haplosclerida) полярность зародыша (морулы) морфологически проявляется в выделении шапочки (calotte) ядрышковых бластомеров на будущих переднем и заднем полюсах личинки на стадии 1000 -2000 кл. На этом же этапе в центральной части морулы появляются два типа клеток - микромеры и макромеры, сегрегация которых приводит к формированиюнаружного слоя жгутиковых клеток и внутренней клеточной массы (Meewis, 1939). Сходный тип развития описан у другого представителя отряда Haplosclerida - Adocia cinerea. Однако у этого вида первые признаки клеточной дифференцировки замечены на 128 клеточной стадии - т. е. после 7 клеточного цикла (Meewis, 1941). На этом этапе в периферических областях морулы появляются клетки меньших размеров - микромеры, в которых вскоре появляются признаки дифференцировки в склероциты.

О первых признаках клеточной дифференцировки на 128 кл. стадии в составе морулы упоминает А. В. Ересковский (Ересковский, 2002). У Aplysylla sultifera (Dendroceratida) на этой стадии происходит морфологическое обособление наружного слоя бластомеров, в дальнейшем дифференцирующихся в жгутиковые клетки личинки.

У представителя другого отряда демоспонгий - Halichondrida -Halichondria coalita в результате дробления также формируется изобластомерная морула. Первые признаки дифференцировки появляются на стадии поздней морулы (судя по рисункам, приведенным в статье - это 1000-2000 кл.). В первую очередь у зародышей этого вида происходит морфологическое обособление области будущего переднего полюса. Здесь появляется шапочка микромеров - более активно делящихся клеток. В этой области отмечается большее количество митозов (Meewis, 1941). Микромеры характеризуются повышенной эозинофильностью (в сравнении с другими клетками морулы). В ходе дальнейшего развития происходит постепенное выделение наружного слоя клеток - также за счет активных клеточных делений в периферической зоне морулы. В результате формируется периферический слой микромеров, дифференцирующихся в последствии в наружный жгутиковый эпителий. При этом происходит постепенное обособление конгломерата центральных амебоидных клеток.

У пресноводных Haplosclerida (Spongilla lacustris, Ephydatia fluviatilis) первые деления дробления неравномерные, однако на поздних этапах дробления размеры бластомеров выравниваются и формируется изобластомерная морула (Brien, Meewis, 1938; Salier, Weissenfeis, 1985; Salier, 1988). Таким образом, морфологические исследования не позволяют определить преемственность морфогенетических осей в ходе эмбрионального развития этих видов Переднезадняя полярность зародыша проявляется на стадии 4000 кл., когда во внутренней области зародыша появляется образованная пинакоцитами полость.

Она всегда располагается ацентрально - ближе к переднему полюсу зародыша. У пресноводных Гаплосклерид дифференцировка клеток начинается на стадии 1000-2000 кл. (Sailer, Weissenfels, 1985). Периферические клетки морулы (по всей ее окружности) начинают уплащиваться, образуя структурно обособленный клеточный слой. Затем производные этих клеток дадут жгутиковые клетки личинки. В этот же период начинается дифференцировка склероцитов во внутренней клеточной массе морулы.

У отрядов Haplosclerida, Halichondrida, Dictyoceratida и Poecilosclerida в результате эмбрионального развития формируются паренхимульные личинки. У некоторых видов демоспонгий, имеющих в своем развитии морульные зародыши, происходит формирование целобластульных личинок. Такой тип развития характерен для яйцекладущих губок Chondrosia reniformis (Levi, Levi, 1976) и Polimastia robusta (Borogevic, 1967). Процессы преобразования морулы в целобластульную личинку значительно различаются у этих двух видов. У Ch. reniformis осуществляется центробежная миграция клеток морулы, причем она сопровождается массовой миграцией внутрь зародыша материнских клеток, так что полость личинки оказывается заполненной плотным конгломератом материнских клеток. Собственно же личиночными клетками является лишь покровный слой жгутиковых клеток. Формирование полярности зародыша не прослежено, однако личинка имеет переднезаднюю полярность, морфологически выраженную в структуре пласта жгутиковых клеток (Levi, Levi, 1976). У Р. robusta зародыши имеют сплющенную, плакулообразную форму. Личинка состоит из 100-150 клеток и наружный жгутиковый монослой формируется за счет процесса клеточной интеркаляции (Borojevic, 1967).

В группе (п/кл) Homoscleromorpha в результате дробления также формируется изобластомерная морула. У Гомосклероморф в ходе эмбрионального развития также' происходит преобразование морулы в целобластульную личинку (цинктобластулу). Происходит это вследствие центробежной миграции клеток, постепенно образующих монослой жгутиковых клеток. Характерно, что дифференцировка жгутиковых клеток Oscarella lobularis и О. imperialis начинается в процессе миграции или «перед началом миграции» (Ересковский, 2001). Первичная клеточная дифференцировка начинается на стадии 64 клеток. На этом этапе развития происходит структурное обособление клеток, находящихся на периферии морулы. Они претерпевают более активные митотические деления. (Ereskovsky, Boury-Esnault, 2002). Полярность личинкипроявляется в различных морфологических типах жгутиковых клеток, образующих три области относительно переднезадней оси личинки.

У Halisarca (Oscarella) lobularis формирование переднезадней полярности зародыша происходит в период появления многочисленных инвагинаций наружного слоя жгутиковых клеток. В этот период происходит уплотнение слоя наружных жгутиковых клеток - из кубических они преобразуются в плотный слой высоко цилиндрических клеток. Этот процесс начинается на будущем переднем полюсе личинки. Клетки заднего полюса некоторое время сохраняют свои кубические очертания. Именно на этом этапе развития появляются морфологические различия жгутиковых клеток, находящихся на переднем и заднем полюсах зародыша. Уплотнение зародыша (condensation prélarvaire de la blastula) не сопровождается активными митотическими делениями и увеличением числа клеток (Meewis, 1938).

У известковых губок выделяют несколько типов развития (Короткова, 1981, Borojevic, 1969). При развитии амфибластульных личинок наблюдается четкая преемственность морфогенетических осей яйца и зародыша (Tuzet, 1970). Дифференцировка клеток начинается на ранних этапах эмбриогенеза, причем возможно проследить проспективную судьбу каждого из бластомеров дробящегося зародыша (Anakina, 1997). Жгутиковые клетки передней полусферы личинки и клетки заднего полюса различаются морфологически и формируют различные структуры при метаморфозе личинки (Amano, Hori, 1992,1994).

В подклассе Calcinea происходит развитие целобластульной личинки, возникающей в результате радиального дробления (Borojevic, 1969). Плавающие личинки имеют переднезаднюю полярность, однако ее формирование в ходе эмбрионального развития не прослежено (Borojevic, 1969; Amano, Hori, 2001). Экспериментами по разделению целобластульных личинок на переднюю и заднюю половины показано, что они способны превращаться в нормально функционирующих губок. Таким образом, все клетки целобластульных личинок Calcinea представляются эквипотентными (Borojevic, 1969).

Для губок характерно не только разнообразие типов эмбриогенезов, но и разнообразие типов плавающих личинок. Эта стадия жизненного цикла присутствует у подавляющего большинства типа Porifera. В последней сводке Бергквист и Мальдонадо (Bergquist, Maldonado, 2002) выделяют девять основных типов плавающих личинок у губок — петрозидная личинка (паренхимула?),паренхимула, цинктобластула, хоплитомелла, клавабластула, дисферула, трихимелла, амфибластула и кальцибластула.

В литературе морфологическим исследованиям именно этой стадии жизненного цикла губок уделено особенно большое внимание (обзор — Maldonado, Bergquist, 2002).

Все типы плавающих личинок можно подразделить на две основные группы. Личинки паренхимульного типа состоят из покровного жгутикового эпителия, окружающего более или менее обширную внутреннюю полость. В составе внутренней полости присутствуют амебоидные клетки, которые у личинок различных видов представлены разнообразными дифференцированными клеточными элементами и стволовыми (недифференцированными) клетками -ядрышковыми амебоцитами. Вторая группа личинок - целобластульного типа. Эти личинки состоят из слоя наружных жгутиковых клеток, окружающих внутреннюю полость. В составе полости могут присутствовать материнские клетки, симбиотические бактерии и межклеточный матрикс.

Личинки паренхимульного типа развиваются в классе Demospongiae. Все они имеют выраженную переднезаднюю полярность. Морфологически она может выражаться в структуре пласта наружных жгутиковых клеток, в структуре внутренней полости, в распределении спикул.

У пресноводных представителей отряда Haplosclerida (сем. Spongillida, Lubomirsciida, Potamolepida) переднезадняя полярность морфологически выражена в строении внутренней полости. У большинства видов клетки внутренней полости пресноводных губок представлены практически всеми типами, характерными для взрослой губки (Ефремова, Ефремов, 1980; Суходольская, Иванова, 1988; Иванова, 1997 (a); Brien, Meewis, 1938; Sailer, Weissenfels, 1985; Sailer, 1988). Все личинки имеют три обособленных слоя клеток: наружные жгутиковые клетки, промежуточный слой колленцитов и внутренние клетки, в составе которых присутствуют хоаноциты, образующие хоаноцитные камеры (их нет у африканских пресноводных губок сем. Potamolepidae (Brien, 1967а, b; 1970)), эндопинакоциты, гранулярные клетки, склетоциты, ядрышковые амебоциты. Эти клеточные компоненты структурно организованы вдоль переднезадней оси личинки.

У морских представителей отряда Haplosclerida (сем. Haliclonida, Renierida) переднезадняя полярность морфологически выражается в структуре пласта наружных клеток и в структуре внутренней полости (Meewis, 1939; Woollacott,1993; Amano, Hori, 1994; Leys, Degnan, 2002). Как и у представителей пресноводных гаплосклерид, в составе личинок выделяют три структурно обособленных клеточных слоя - наружные клетки, промежуточный слой колленцитов и конгломерат внутренних амебоидных клеток. У Haliclona tubifera (Woollacott, 1993) слой промежуточных клеток (субепидермальных - subepidermal) не ассоциирован с коллагеном.

Заметим, что именно на примере личинок Гаплосклеридных губок были впервые исследованы такие аспекты их биологии, как полиморфизм (Evans, 1899; Ivanova, 1997а, b) и цитологические основы фоторецепции (Leys, Degnan, 2001).

Паренхимулы отрядов Poecilosclerida имеют выраженную переднезаднюю полярность. Морфологически она выражается в структуре пласта наружных клеток и в распределении клеток внутренней клеточной массы. Как и личинки гаплосклерид, паренхимулы этого отряда имеют три структурно выраженные зоны - наружный эпителий, промежуточный слой колленцитов и конгломерат внутренних клеток (Levi, 1964; Borojevic, 1966; Boury-Esnault, 1976). У Crambe crambe не отмечено наличия колленцитов во внутренней клеточной массе. Между тем, фибриллярный коллаген присутствует во внутренней полости личинки (Uriz et al, 2001).

Представители отряда Halichondrida также характеризуются паренхимульными личинками. Они имеют переднезаднюю полярность, которая морфологически выражается в структуре наружного пласта клеток. У этих личинок отсутствует слой переходных клеток, подстилающих наружный эпителий (Meewis, 1941; Evans, 1977; Woollacott, 1990; Иванова, 1981). Клеточный состав внутренней полости различен у личинок разных видов. Некоторые крупные личинки халихондрид не способны плавать и перед метаморфозом ведут ползающий образ жизни - Ulosa sp., Halichondria sp. (Bergquist et al, 1979).

Паренхимульные личинки развиваются также в пределах отрядов Dictyoceratida и Dendroceratida (Levi, 1956; Woollacott, Hadfield, 1989; Kaye, 1990; Kaye, Reiswig, 1991; Ересковский, 2002; Ereskovsky, Tokina, 2004). Переднезадняя полярность мофологически выражается в структуре пласта наружных жгутиковых клеток. У Ircinia oros (Ereskovsky, Tokina, 2004) личинка имеет промежуточный слой веретеновидных клеток, окруженных тяжами коллагена. Амебоциты внутренней полости представлены небольшим количеством дифференцированных клеточных элементов.

Целобластульные личинки характерны для представителей подкласса Homoscleromorpha, известковых губок п/кл Calcinea и для некоторых яйцекладущих губок. Все личинки имеют выраженную переднезаднюю полярность, но у этого типа она выражается только в структуре пласта наружных клеток. Жгутиковые клетки с различной морфологией образуют три различные зоны у личинок Homoscleromorpha, благодаря чему они были названы цинктобластулами («личинка с поясом» (Meewis, 1938; Levi, Porte, 1962; Boury-Esnault, Rützler, 1997; Boury-Esnault et al, 1999). У Яйцекладущих губок целобластулы развиваются в отряде Hadromerida - Polymastia robusta (Borojevic, 1967), Chondrosia reniformis (отр. Chondrosida) (Levi, Levi, 1976).

Амфибластульные личинки подкласса Calcaronea известковых губок имеют незначительную внутреннюю полость (Franzen, 1988; Amano, Hon, 1992). Передняя полусфера образована жгутиковыми клетками, а задняя - крупными безжгутиковыми гранулярными клетками. Опыты по разделению личинок на переднюю и заднюю половину, содержащие соответственно жгутиковые или гранулярные клетки показывают, что жгутиковые клетки не способны формировать функционирующую губку, в то время как гранулярные клетки способны трансформироваться во все типы дефинитивной губки и формировать жизнеспособный дефинитивный организм (Maas, 1906). С точки зрения П. П. Иванова это свидетельствует об ограниченной потенции жгутиковых клеток амфибластулы, способных трансформироваться только в хоаноциты взрослой губки (Иванов, 1937). Как показали более поздние исследования, в ходе нормального метаморфоза именно жгутиковые клетки амфибластулы трансформируются в клетки мезохила и хоаноциты, а гранулярные клетки формируют покровные структуры ювенила (Duboscq, Tuzet, 1937; Amano, Hori, 1993). Опыты Мааса, видимо, свидетельствуют о существенной роли целостности личинки для успешного протекания метаморфоза и реализации потенций жгутиковых клеток.

Свободноплавающие личинки губок претерпевают катастрофический метаморфоз. Метаморфоз губок был (и до сих пор является) одним из самых интригующих этапов раннего онтогенеза губок. Судьба покровных жгутиковых клеток и трактовка их роли при метаморфозе в свете теории зародышевых листков — вопрос, не решенный до настоящего времени (Гуреева, 1976; Maldonado, 2004). Основная трудность в решении этого вопроса заключается вразнообразии типов личинок и разных морфогенетических процессах, имеющих место в ходе их метаморфоза.

Большинство личинок губок оседают на субстрат передним полюсом или в области переднего полюса (Fell, 1989). Три основных морфогенетических типа процессов при метаморфозе можно выделить у изученных личинок губок. В первом случае — основная формообразовательная роль принадлежит внутренним амебоидным клеткам личинки. Жгутиковые клетки при этом не принимают участия в метаморфозе, или их вклад в формообразовательные процессы незначителен. Жгутиковые клетки могут фагоцитироваться в процессе метаморфоза и таким образом служить дополнительным энергетическим резервом. Такой тип метаморфоза характерен для большинства паренхимульных личинок Демоспонгий - Ephydatia fluviatilis, Baikalospongia bacilli/era, Haliclona limbatci (Haplosclerida); Microciona proliféra, M rubens (Poecilosclerida); Halichondria sp., Ulosa sp. (Halichondrida); Spongia barbara, S. gramínea, Ircinia sp. (Dictyoceratida) (Wielspütz, Sailer, 1990; Meewis, 1939; Misevic, Burger, 1982; Ефремова, Ефремов, 1980; Misevic et al, 1985; Kaltenbach et al, 1999; Bergquist, Green, 1977; Kaye, Reiswig, 1991).

Вторым типом можно считать метаморфоз, при котором и внутренние клетки личинки и наружные жгутиковые клетки принимают участие в формообразовательных процессах. Степень их участия может отличаться у разных видов. Такой тип метаморфоза претерпевают личинки Hamigera hamigera, Mycale contarenii (Poecilosclerida); E, muelleri, Spongilla lacustris, Eunapius fragilis, Reniera sp.,Haliclona permollis (Haplosclerida); Ircinia sp. (Dictyoceratida) (Boury-Esnault, 1976; Borojevic, Levi, 1965; Ivanova, 1997b; Leys, Degnan, 2002; Amano, Hori, 1996; Ересковский, 2002). К этому типу можно отнести и метаморфоз изучаемого вида - Halisarca dujardini (Halisarcida).

Третий тип метаморфоза характерен для целобластульных личинок и амфибластул. У таких личинок основная формообразовательная роль принадлежит жгутиковым клеткам личинки.

Анализируя морфогенезы, которые имеют место при метаморфозе, мы возьмем за основу указанную выше типизацию. Она в значительной мере условна, так как, как явствует из вышеизложенного, виды одного рода могут различаться по признаку участия жгутиковых клеток в метаморфозе. Между тем, морфогенетические события в ходе метаморфоза у них в целом сходны.

Судьба жгутиковых клеток, не принимающих участия в метаморфозе, различна по данным разных авторов. Они могут фагоцитироваться, как это происходит, например у Haliclona limbata (Haplosclerida) (Meewis, 1939), у Ephydatla ftuviatilis (Haplosclerida) (по данным Wielspütz, Sailer, 1990), Microciona proliféra (Poecilosclerida) (Misevic et al, 1985) или сбрасываться (слущиваться), как это происходит у Halichondria moorei, Ulosa sp. (Halichondrida) и Microciona rubens (Poecilosclerida) (Bergquist, Green, 1977).

У личинок некоторых видов Гаплосклерид, как морских, так и пресноводных, на цитологическом уровне показаны изменения, происходящие в них в процессе плавания. Эти изменения связывают с подготовкой к метаморфозу у Haliclona limbata (Meewis, 1939) Spongilla lacustris (Sailer, Weissenfels, 1985), S. lacustris, Ephidatia muelleri, Eunapius fragilis (Ivanova, 1997b). У личинок в период свободного плавания происходят изменения в структуре покровного эпителия: размер, форма и организация клеток в составе пласта изменяются. Одновременно происходит миграция к поверхности амебоидных клеток, которые, по мнению некоторых авторов, фагоцитируют поверхностные жгутиковые клетки (Brien, Meewis, 1938; Meewis, 1939; Sailer, Weissenfels, 1985). Л. В. Иванова (Ivanova, 1997b) отмечает различия в судьбе наружных жгутиковых клеток у личинок различных морфотипов. Интересно, что у Haliclona limbata (Meewis, 1939), плавающая личинка которой имеет три морфологически различающиеся зоны наружных клеток - передний полюс, задний полюс и латеральные поверхности (можно выделить еще переходную зону, отделяющую клетки заднего полюса от латеральных), миграция внутренних клеток в период свободного плавания имеет особенности, связанные с переднезадней полярностью личинки.

Первыми структурами, которые формируются в ходе метаморфоза, являются покровы ювенила - пинакодерма. Отмечено, что морфогенетические преобразования у некоторых видов начинаются в области адгезии переднего полюса личинки к субстрату (Haliclona limbata - Meewis, 1939) и распространяются по направлению к заднему полюсу. У личинок первого типа (по нашей классификации) происходит замещение жгутиковых клеток амебоцитами (археоцитами или колленцитами) (Meewis, 1939; Bergquist, Green, 1977; Evans; 1977; Misevic et al, 1985; Kaye, Reiswig, 1991). На апикальной поверхности ювенила они дифференцируются в экзопинакоциты, а в базальной части эти клетки синтезируют фибриллярный межклеточный матрикс (коллаген) и постепенно формируют базопинакодерму. Бергквист и Грин (1977) отмечают,что у личинок изученных ими видов первыми дифференцируются экзопинакоциты. Они начинают продуцировать слизистый покров ювенила (surface coat).

У паренхимульных личинок в процессе метаморфоза описана направленная миграция нескольких типов клеток. Во-первых, часть археоцитов мигрирует к периферии, формируя покровные структуры. На периферии они дифференцируются согласно своему положению - в экзопинакоциты или базопинакоциты (Meewis, 1939; Bergquist, Green, 1977; Evans; 1977; Misevic et al, 1985; Ivanova, 1997b). Во-вторых, отмечена направленная миграция поверхностных жгутиковых клеток внутрь осевшей личинки (Meewis, 1939; Bergquist, Green, 1977; Evans; 1977; Misevic et al, 1985; Amano, Hori, 1996; Ivanova, 1997b; Leys, Degnan, 2002). В дальнейшем они могут фагоцитироваться археоцитами, или же формировать кластеры клеток во внутренней части осевшей личинки, в дальнейшем дифференцируясь в хоаноциты (Borojevic, Levi, 1965; Amano, Hori, 1996; Leys, Degnan, 2002). Мевис (Meewis, 1939) отмечала, что в периферических областях внутреннего клеточного конгломерата ювенила Haliclona limbata присутствуют замкнутые камеры или трубочки, образованные поверхностными жгутиковыми клетками. Однако она рассматривала эти образования как временные, образующиеся в ходе дезинтеграции наружного жгутикового эпителия. Жгутиковые клетки могут дифференцироваться в амебоидные клетки мезохила - например серые клетки Hamigera /zamigera (Poecilosclerida) (Boury-Esnault, 1976). Жгутиковые клетки могут также давать колленцито-подобные амебоидные клетки, как это отмечено у некоторых представителей спонгиллид (Ivanova, 1997b). Оставаясь на поверхности осевшей личинки, эти клетки могут трансформироваться в пинакоциты (Ivanova, 1997b).

В формировании хоаноцитных камер у всех изученных паренхимульных личинок принимают участие археоциты. Они образуются вследствие формирования кластеров археоцитов, которые поляризуются и постепенно дифференцируются в хоаноциты. Дифференцировка сопровождается митотическими делениями (Brien, Meewis, 1938; Meewis, 1939; Bergquist, Green, 1977).

Отмечено, что формирование водоносной системы начинается с появления лакун, которые затем выстилаются эндопинакоцитами (Brien, Meewis, 1938; Meewis, 1939; Salier, Weissenfeis, 1985). На электрономикроскопическом уровне показано, что первым признаком появления системы каналов является синтезархеоцитами тяжей коллагена, организованных в кольцо (appearance of a fine collagen fibril rings secreted by archeocytes) (Bergquist, Green, 1977). Затем археоциты образуют филоподии, постепенно уплащиваются и организуют слой клеток - эндопинакоцитов, используя синтезированный ими коллаген как субстрат клеточной дифференцировки и поляризации. Существование коллагеновых колец синтезируемых археоцитами в период, предшествующий формированию каналов, было отмечено у двух представителей отряда Dictyoceratida (Кауе, Reiswig, 1991).

У личинок пресноводных губок, у большинства из которых имеются хорошо развитые системы хоаноцитных камер и каналов, эти структуры преобразуются в водоносную систему ювенила (Brian, Meewis, 1938; Wielspütz, Sailer, 1990; Ivanova, 1997b).

У целобластульных личинок, единственным или существенно превалирующим в количественном отношении типом клеток являются наружные жгутиковые клетки, метаморфоз связан с миграцией и/или трансдифференцировкой жгутиковых клеток.

У представителей демоспонгий из подкласса Homoscleromorpha метаморфоз реализуется эпителиальными морфогенезами и эпителио-мезенхимной трансформацией (Meewis, 1938; Ересковский, 2002). Пинакодерма и водоносная система (хоаноцитные камеры и водоносные каналы) формируются путем эпителиальных морфогенезов — инвагинации и смыкания эпителиальных пластов. Это обусловлено строением жгутикового эпителия личинки, который имеет межклеточные контакты и базальную мембрану (Boury-Esnault et al, 2003).

Описания морфогенезов при метаморфозе у гомосклероморф отличаются в некоторых существенных деталях по данным разных авторов (Meewis, 1938; Ересковский, 2002). Оба автора описывают, что личинка оседает на субстрат передним полюсом. Мевис описывает один тип метаморфоза у вида Halisarca (Oscarella) lobularis. А. В. Ересковский описывает несколько типов морфогенезов, свойственных разным видам в пределах подкласса. Обобщая данные этих двух авторов можно сказать, что формирование покровных структур и водоносных каналов происходит без разрушения эпителиальной организации жгутиковых клеток личинки. Формирование клеточных элементов мезохила происходит в следствие эпителио-мезенхимной трансформации. Источником покровных структур и водоносных каналов у разных видов служат разные области жгутикового эпителия личинки. Мевис (Meewis, 1938) указывает на лизисзначительного количество жгутиковых клеток личинки в процессе метаморфоза Halisarca (Oscarella) lobularis.

Целобластульные личинки известковых губок подкласса Calcinea, по данным разных авторов (Borojevic, 1969; Amano, Hori, 2001), оседают на субстрат передним полюсом. Еще у плавающей личинки начинается выселение внутренних клеток в полость (Borojevic, 1969). После оседания происходит дезинтеграция эпителиального слоя личинки, и в массе дедифференцированных клеток происходит дифференцировка структур взрослой губки, определяемая положением клеток в составе конгломерата (Fell, 1989). В экспериментах по разделению целобластульных личинок на переднюю и заднюю половинки (Ascandra falcaía, (Borojevic, 1967)) было показано, что они развиваются в нормальные губки маленьких размеров, что демонстрирует отсутствие строгой детерминации клеток в составе целобластул.

У амфибластульных личинок известковых губок подкласса Calcaronea личинки оседают на субстрат передним полюсом. Безжгутиковые гранулярные клетки заднего полюса личинки дифференцируются в экзопинакоциты, а жгутиковые клетки переднего полушария дают внутренние структуры ювенила. Кроме того, гранулярные клетки могут принимать участие в формировании спикул (Duboscq, Tuzet, 1937; Amano, Hori, 1993).

Формирование экзопинакодермы происходит за счет процесса эпиболии гранулярными клетками жгутиковых клеток передней полусферы (Fell, 1989). Регионализация внутреннего клеточного конгломерата проявляется в формировании лакун в периферическом слое, где постепенно появляются фибриллы коллагена, спонгина и монаксонные спикулы. В центральной части конгломерата происходит дифференцировка хоаноцитных камер (Amano, Hori, 1993).

Губки семейства Halisarcidae были выделены в отдельный отряд Halisarcida австралийским спонгиологом Патрисией Бергквист (Bergquist, 1996). Ранее семейство Halisarcidae входило в отряд Dendroceratida, однако по многим морфологическим критериям и особенностям метаболизма представители этого семейства перевели в ранг отряда, содержащего один род Halisarca. Систематика этих губок и филогенетическое положение их в классе Demospongiae до настоящего времени неопределенно (Bergquist, 1996; Maldonado, Bergquist, 2002; Maldonado, 2004). Это связано с отсутствием у Halisarca минерального и фибриллярного скелета. Кроме того, им свойственна значительнаявариабельность формы тела, цвета, зависящего от условий обитания, сезона и фазы жизненного цикла (Chen, 1974, 1976). Поэтому описание видов в пределах этого рода в значительной степени затруднено и до сих пор нет четких морфологических критериев, позволяющих отделять самостоятельные виды Halisarca от популяций. Лишь два вида Halisarca описаны с использованием электронномикроскопических исследований соматических тканей — Halisarca ectofibrosa и Н. coerula (Vacelet, et al, 1976; Vacelet, Donadey, 1987). В связи с этим особенности половой репродукции и эмбриологические критерии привлекались для выделения и описания видов в пределах этого отряда. Так, главным образом на основании некоторых особенностей половой репродукции, были выделены виды Н. metschnikovi (Levi, 1956) и Н. nahantensis (Chen, 1976).

Развитие бесскелетных губок привлекало к себе внимание также в связи с выяснением филогенетических взаимоотношений не только различных групп губок, но и многоклеточных вообще, и с поисками прототипа развития многоклеточных. И. И. Мечников в своих спонгиологических исследованиях (Metschnikoff, 1879 (по: Мечников, 1955)) уделил значительное внимание развитию Halisarca и отметил "общепризнанное значение бесскелетных губок для всей морфологии низших животных". Французский исследователь К. Леви, применявший эмбриологические критерии в систематике и филогении губок, ставил Halisarca в основании филогенетического древа и считал тип развития этих губок исходным, или наиболее примитивным среди Ceractinomorpha (Levi, 1957). Новые данные, полученные нами о развитии представителей этого отряда (Ereskovsky, Gonobobleva, 2000; Gonobobleva, Ereskovsky, 2004a, b) заставили некоторых исследователей сделать предположение, что Halisarca могут быть отнесены, напротив, к наиболее эволюционно продвинутой группе в составе Ceractinomorpha (Maldonado, Bergquist, 2002; Maldonado, 2004).

Изучение раннего онтогенеза Halisarca насчитывает более чем столетнюю историю (Giard, 1873; Barrois, 1876; Shulze, 1877; Metschnikoff, 1879; Levi, 1956; Chen, 1976; Bergquist, 1996; Sizova, Ereskovsky, 1997; Короткова, Апалькова, 1975; Айзенштадт, Короткова, 1976а, б; Короткова, Ермолина, 1982; Короткова, Ересковский, 1984; Короткова, Ермолина, 1986; Ересковский, 2002). Из этих многочисленных работ, посвященных эмбриональному развитию, на электронномикроскопическом уровне выполнены работы, касающиеся оогенеза (Айзенштадт, Короткова, 1976а, б), ультраструктуры наружных жгутиковых клеток зародыша на поздних этапах эмбриогенеза и материнских клеток,проникающих в развивающийся зародыш (Короткова, Ермолина, 1982, 1986) и некоторые ультраструктурные особенности дробления (Sizova, Ereskovsky, 1997).

Дробление Halisarca полное, равномерное и асинхронное. У Я, metschnikovi первые две борозды дробления, по данным Леви (Levi, 1956), проходят в экваториальных плоскостях, а у H. dujardini — в меридиональных, взаимно перпендикулярных областях (Borrois, 1876; Levi, 1956). Эти данные основаны на положении направительных телец, которые, по данным Леви, располагаются на одном из полюсов длинной оси яйца (Levi, 1956, стр. 59).

Дробление у Н. dujardini, H metschnikovi и H. nahantensis описывается как радиальное (Giard, 1873; Schulze, 1877; Levi, 1956; Chen, 1976). Ha 8 бластомерной стадии бластомеры (на поперечных срезах) образуют форму венца (se disposent en couronne) (Levi, 1956). На 16 бластомерной стадии появляется полость дробления. По данным Коротковой и Ересковского (Короткова, Ересковский, 1984) расположение бластомеров в ходе первых трех клеточных циклов может варьировать у разных зародышей в пределах одной материнской особи. Эти авторы также описывают появление полости дробления на 16 клеточной стадии. Большинство исследователей, изучавших дробление Halisarca, сходятся в том, что на 16 клеточной стадии бластомеры имеют клиновидную форму и формируют единый клеточный слой.

Сведения по дальнейшему развитию достаточно противоречивы. По данным И. И. Мечникова (Metschnikov, 1879), который изучал развитие Н. dujardini на биологической станции в Неаполе, полость зародыша появляется на поздних этапах эмбриогенеза. Наружные клетки бластулы, по его данным, мигрируют в полость зародыша, где образуют плотный конгломерат «розетковидных клеток». По наблюдениям И. И. Мечникова в результате эмбрионального развития формируется паренхимульная личинка, переднезадняя полярность которой морфологически выражена в структуре пласта наружных жгутиковых клеток. На основании данных по эмбриогенезу, структуре личинки и области обитания И. И. Мечников сделал предположение, что Halisarca, которая была объектом его исследований, относится к новому виду и назвал его предварительно - Halisarca pontica.

Как уже говорилось выше, два новых вида Halisarca были выделены на основании характера половой репродукции - Halisarca metschnokovi (Levi, 1956) и Н. nahantensis (Chen, 1976). Эти виды были признаны новыми на основании сравнения характера их репродукции с таковой у Я. dujardini. Заметим, что внешне губки указанных видов практически неразличимы, что подчеркивали оба исследователя, выделивших эти виды (Levi, 1956; Chen, 1976). Они имеют разные области обитания - Я dujardini является глубоководным видом (5 - 20 м), Я nahantensis - литоральный вид, а Н. metschnikovi обитает в эстуарных условиях. Я dujardini и Н. nahantensis из Наханта (Атлантическое побережье Северной Америки) и Я dujardini и Я. metschnikovi из Роскоффа (атлантическое побережье Европы) репродуктивно изолированы (Levi, 1956; Chen, 1976) (таблица 1).Table 4. Biological differences among members of genus HalisarcaCharacteristic H. dujardini H. metschnikovi Jrt. nahantensis compared Johnston 1842Lgvi 1953Chen 1974Habitat Marine subtidal Estuary Marine intertidal"Cellules Equal cytoplas- With one large Equal cytoplasspheruleuses" mic Inclusions cytoplasmic mic inclusionsinclusionMonoecious Monoecious Asynchronous; Asynchronous; short period short period ? Lemon-shapedhead30 22120 120 to 130Posterior pole Completely not flagellated flagellated 130 150Folded FoldedChoanocyte- Choanocytechamber chamberbranching branchingТаблица 1. Из статьи В. Чена 1976.Sexuality Dioecious (?)Spermato- Synchronous;genesis long periodSperm Disc-shapedheadHaploid chromo- ? some number Egg size (pm 90 in diameter)Larva CompletelyflagellatedLarval size (vim in diameter) Larval cavity Simple Rhagon SimpleНиже мы проанализируем основные особенности развития, которые характеризуют каждый из указанных видов.

По данным К. Леви (Levi, 1956) в ходе развития у изучаемых им Halisarca происходит формирование типичной морулы. (Он изучал Halisarca в районе Роскоффа (Roscoff - Finistère)) Она формируется, по данным этого автора, в результате лизиса базальной части бластомеров стерробластулы и последующим их неупорядоченным делением. По данным К. Леви, формирование слоянаружных жгутиковых клеток и внутренних клеток зародышей Я metschnikovi происходит вследствие процесса сегрегации клеток морулы. Периферические клетки претерпевают более активные митотические деления и дают линию жгутиковых клеток, а разница в скорости делений клеток на периферии обуславливает формирование переднезадней полярности личинки (Levi, 1956). Этот процесс, по мнению К. Леви, аналогичен процессу сегрегации наружных клеток в моруле Ephydalia fluvialilis (Brien, Meewis, 1938).

Эмбриогенез H. dujardini из Роскоффа описан на светооптическом уровне К. Леви. По его данным, в результате дробления происходит формирование морулы, которая затем трансформируется в стерробластулу. Сравнивая эмбриогенез H. dujardini и H. metschnikovi К. Леви подчеркивает, что гистогенез у H. dujardini происходит по более упрощенной схеме. В составе стерробластульного зародыша присутствует только слой наружных клеток, который постепенно дифференцируется в жгутиковый эпителий личинки. Центральная часть зародыша заполнена клеточными фрагментами, находящимися в состоянии переваривания (reserves deutoplasmatiques en cours de digestion).

В области будущего заднего полюса Леви описывает процесс униполярной иммиграции, в результате которого в полости зародыша появляются внутренние амебоидные клетки. Судя по рисункам, приведенным в статье, этот процесс происходит на стадии 1000 - 2000 клеток. Во внутренней полости эти клетки могут организовываться в эпителий, формирую замкнутую внутреннюю камеру. Леви подчеркивает, что клетки, составляющие камеру, не являются хоаноцитами и камера не является функциональным образованием (Levi, 1956, р. 67-68).

В результате дробления у H. nahantensis формируется изобластомерная стерробластула, клиновидные, радиально расположенные бластомеры которой окружают небольшой бластоцель (Chen, 1976). Этот исследователь был первым, кто обратил внимание, что инвагинации наружного слоя жгутиковых клеток зародышей могут отшнуровываться, формируя в полости замкнутые жгутиковые камеры. В. Чен (Chen, 1976) также первым описал проникновение материнских гранулярных амебоцитов в развивающийся зародыш и считал, что они выполняют трофическую функцию. (К. Леви также отмечал присутствие гранулярных клеток в зародышах на поздних этапах эмбриогенеза и в составе личинок Н. metschnikovi, но считал, что они происходят в результате дифференцировки клеток зародыша.)Плавающая личинка Н. metschnikovi имеет выраженную переднезаднюю полярность. Леви описывает у этого вида типичную паренхимулу (Levi, 1956).

Однако он замечает, что в некоторых случаях удаются наблюдать присутствие внутренней личиночной полости, ограниченной группой небольших ядрышковых клеток. Он выделяет три типа клеток в плавающей личинке: фуксинофильные (ацидофильные) амебоциты, которые по его описанию дифференцируются во внутренней полости во время эмбриогенеза; небольшие ядрышковые амебоциты с более светлой цитоплазмой и крупные ядрышковые амебоциты, цитоплазма которых заполнена желточными включениями.

Плавающая личинка Н. dujardini, по данным К. Леви, также является паренхимулой. В отличие от личинки Н. metschnikovi в ней отсутствуют фуксинофильные (ацидофильные) клетки, а клетки заднего полюса являются жгутиковыми. Г. П. Короткова и Н. О. Ермолина (Короткова, Ермолина, 1982; Н. dujardini из Белого моря) описали присутствие фуксинофильных (эозинофильных) клеток в личинке и показали, что они проникают в развивающийся зародыш в ходе эмбриогенеза из материнских тканей, а не являются собственно клетками зародыша, как это утверждал Леви. Г. П. Короткова и Н. О. Ермолина полагали, что плавающая личинка Н. dujardini имеет бластульную организацию. Единственными клетками в составе внутренней полости они считали материнские гранулярные амебоциты (Короткова, Ермолина, 1982). Внутренние жгутиковые камеры, которые исследователи обнаруживали на срезах зародышей на поздних этапов эмбриогенеза, принимались ими за глубокие инвагинации наружного эпителия. Необходимо заметить, что в работе Г. П. Коротковой и Н. О. Ермолиной фотографии плавающей личинки отсутствуют: исследование проводилось над зародышами на поздних этапах эмбриогенеза, находящихся в составе материнских тканей.

Личинки Н. nahantensis кратко описаны в статье Чена (Chen, 1976). Главным отличием их является присутствие внутренней жгутиковой камеры, которая произошла в результате инвагинации наружного слоя клеток зародыша в ходе эмбриогенеза.

Метаморфоз описан на светооптическом уровне К. Леви (Levi, 1956) у двух видов - Н. metschnikovi и Н. dujardini из Роскоффа. Прикрепление личинок к субстрату осуществляется передним полюсом. Основные этапы метаморфоза у этих двух видов сходны. К. Леви выполнено детальное и точное описание процессов формирования внутреннего конгломерата куколки, дифференцировки клеток и органогенеза, которое во многих деталях подтверждается электрономикроскопическими исследованиями. Автор подчеркивает, чтожгутиковые клетки принимают участие в формировании структур ювенила. Главным отличием процессов метаморфоза двух видов является форма хоаноцитной камеры. У Я. metschnikovi формируется единственная древовидно ветвящаяся камера, в то время как у Я dujardini происходит формирование единственной округлой камеры. Кроме того, метаморфоз Я. dujardini завершается значительно быстрее, чем у Я metschnikovi. За 24 часа после прикрепления личинки Я. dujardini достигается та же стадии развития, что формируется у Я. metschnikovi через 2-3 дня после прикрепления (Levi, 1956).

В завершение обзора кратко остановимся на изучении губок Halisarca в Белом море. Впервые губки этого рода были описаны К. С. Мережковским, который внес значительный вклад в изучение спонгиофауны Белого моря (Мережковский, 1979). Свои исследования К. С. Мережковский производил на островах Соловецкого архипелага. К моменту выхода его работы самым авторитетным исследованием губок рода Halisarca была работа Ф. Шульце (Schulze, 1877), который признавал существование только двух видов - Я dujardini и Я. lobularis (заметим, что последняя сейчас относится к п/кл Homoscleromorpha = Oscarella lobularis). На основании изучения гистологии нерепродуцирующих губок К. С. Мережковский выделяет новый вид - Halisarca fschulzii, обитающий в Белом море. В 1911 г. JI. JI. Брейтфус публикует дополнения к спонгиофауне Кольского залива (по сборам К. М. Дерюгина) и в перечне видов указывает вид Я. fschulzii для этого региона Белого моря (Брейтфус, 1911).

Более поздние работы, посвященные описанию спонгиофауны северных морей, в том числе Белого и Баренцова морей, (П. Д. Резвой, 1931, В. М. Колтун, 1964, Ересковский А. В., 1993) указывают на присутствие одного вида Halisarca — Я. dujardini, а Я. schulzii (начиная с исследования П. Д. Резвого) принимается синонимом Я. dujardini.

Во всех исследованиях различных аспектов биологии беломорский и баренцевоморский Halisarca, которые проводились на кафедре эмбриологии СПбГУ начиная с 70-х годов прошлого века, губки определены как Halisarca dujardini Johnston 1842. (Короткова, Апалькова, 1975; Айзенштадт, Короткова, 1976а.б; Короткова, Ермолина, 1982; Короткова, Ересковский, 1984; Короткова, Ермолина, 1986; Ересковский, 2002 и др.).

Результаты работы.

Эмбриональная капсула.

Зародыши НаИаагса с1щаЫт\ в ходе всего эмбрионального развития пространственно ограничены от мезохила материнской губки эмбриональной капсулой. Она состоит из одного слоя уплощенных клеток, генезис и некоторые детали ультраструктурного строения которых ранее описаны в литературе (Айзенштадт, Короткова, 1976; 81гоуа, ЕгеэкоУБку, 1997). Эти клетки, вероятно, играют значительную роль в ходе эмбрионального развития благодаря следующим своим характеристикам (Рис. 1 - 3).

1. Клетки эмбриональной капсулы образуют между собой постоянные адгезивные межклеточные взаимодействий (контакты) (Рис. 3).

2. Клетки зародыша на протяжении всего развития вступают в тесные взаимодействия с клетками эмбриональной капсулы (Рис. 2) за счет обширных областей прилегания поверхностных мембран.

3. В ходе всего эмбрионального развития на наружной поверхности клеток происходит образование коллагеновых фибрилл (Рис. 1).

4. Через клетки эмбриональной капсулы в зародыш проникают материнские гранулярные амебоциты (Рис. 2В; рис. 37).

5. Выход сформировавшихся личинок осуществляется благодаря слиянию клеток эмбриональной капсулы с системой выносящих каналов.

Клетки эмбриональной капсулы характеризуются морфологически выраженной апикобазальной полярностью. Базальная поверхность клеток обращена в мезохил материнской губки, а апикальная - в замкнутое пространство, где развивается зародыш.

На поперечных срезах клетки имеют веретеновидную форму, ядро и клеточные органеллы присутствуют в расширенной центральной части. На базальной поверхностной мембране клеток эмбриональной капсулы происходит образование и сборка волокон коллагена (Рис. 1). Под поверхностной мембраной в цитоплазме клетки присутствует электроноплотный материал, находящийся в свободном состоянии в цитозоле, не заключённый в мембрану и не оформленный в какие либо структурированные включения. Этот материал примыкает к базальной поверхностной мембране, на которой происходит сборка коллагеновых фибрилл. Свободные фибриллы коллагена ориентируются параллельно клеточной поверхности, образуя рыхлый слой, ширина которого варьирует в пределах 1-3цт. Трудно оценить точно максимальную длину фибриллы. По нашим данным она составляет около 0,5 мкм. Диаметр фибрилл составляет 0,01 мкм. В свободном состоянии фибриллы коллагена ассоциированы с гранулярными частицами, размер которых варьирует в пределах 0,02 - 0,04 мкм (Рис. 1Б). Они могут находиться непосредственно на поверхностной клеточной мембране, коллагеновых фибриллах или же быть в свободном состоянии между фибрилл в составе коллагенового слоя, окружающего эмбриональную капсулу.

Образование коллагена происходит на всей базальной клеточной поверхности в течение всего эмбрионального развития.

На наружных базальных мембранах клеток присутствуют филоподии (0,1 -1,2 мкм), их многочисленные срезы обнаруживаются в слое коллагена (Рис. 1Б).

Апикальный компартмент наружной мембраны клеток капсулы образует обширные области прилегания с апикальными компартментами наружных мембран клеток развивающихся зародышей на всех этапах эмбриогенеза. Минимальное расстояние между мембранами составляет 0,012 мкм. О некоторых особенностях этих взаимодействий мы будем говорить в разделах, посвященных отдельным стадиям эмбрионального развития.

Между клетками эмбриональной капсулы имеются зоны опоясывающей адгезии (Рис. 3). Длина области контакта различна, часто она значительно увеличивается за счёт интердигитаций мембран соседних клеток в этой области (Рис. 3). Мембраны клеток в зоне опоясывающих контактов строго параллельны. Расстояние между мембранами составляет 12-15нм. В межмембранном пространстве имеется тонкофибриллярный материал. Со стороны цитоплазмы к внутренней клеточной мембране подходит электроноплотный фибриллярный материал.

Эмбриональное развитие.

1. Дробление — формирование бластулы.

Дробление Н. dujardini описывается как полное, практически равномерное, асинхронное. Расположение бластомеров при прохождении 2-3 клеточных циклов варьирует (Короткова, Ересковский, 1984). Большинство исследователей, изучавших развитие этого вида, сходятся в своих наблюдениях, что полость зародыша формируется на 16 бластомерной стадии (Schulze, 1877; Levi, 1956; Chen, 1976; Короткова, Ересковский, 1984).

Наши наблюдения показывают, что на 16 бластомерной стадии и в ходе последующего эмбрионального развития зародыши, развивающиеся в одном материнском организме, характеризуются морфологической вариабельностью.

На 16 бластомерной стадии в мезохиле одной материнской губки присутствуют зародыши со следующими морфологическими характеристиками (Рис. 4А, Б; сх. 1). Часть зародышей состоит из бластомеров клиновидной формы (Рис. 4 А; сх. 1А). Они образуют интегрированный ряд клеток, ограничивающий внутреннюю полость. Размеры полости зародышей могут варьировать в пределах 22 — 27 мкм.

Схема 1. Стадия развития 16 бластомеров.

У таких клиновидных бластомеров можно выделить три мембранных компартмента — апикальный, обращенный к эмбриональной капсуле, базальный, обращенный в полость зародыша и латеральный, в области которого осуществляется прилегание соседних бластомеров.

На этой стадии встречаются зародыши, (Рис. 4Б, сх. 1Б) бластомеры которых не формируют интегрированного клеточного пласта, однако большая их часть образует один ряд (слой) клеток, ограничивающий полость зародыша. Форма и размеры полости различны у разных зародышей. Отдельные бластомеры смещены в полость зародыша (или менее интегрированы с клетками условно наружного ряда). Форма и размеры бластомеров, а также площадь их взаимных контактов в составе таких зародышей варьируют. Ядра чаще всего локализованы в центральной части цитоплазмы, в некоторых случаях они обнаруживаются в базальной области. Веретена митотических делений наружных клеток ориентированы параллельно поверхности у всех исследованных нами эмбрионов.полостьмитотичесверетенРазмер апикобазальной оси бластомеров на этой стадии составляет 50-53 мкм, ширина в районе ядра -64-76 мкм.

На -32 клеточной стадии сохраняется характер вариабельности, присущий зародышам на 16 клеточной стадии развития. Кроме того, мы обнаруживаем на этом этапе эмбрионы, состоящие из наружного интегрированного слоя, в полости у которых присутствуют единичные бластомеры. (Рис. 4В-Е). По сравнению с 16 бл. стадией развития площадь прилегания латеральных мембран соседних бластомеров увеличиваются и составляет порядка 40 — 43 мкм.

Размер апикобазальной оси бластомеров на этой стадии составляет 50 — 51 мкм, ширина в районе ядра - 34 - 36 мкм. Ядра располагаются в центральной части цитоплазмы, в них присутствуют базофильные ядрышки. Веретена митотических делений наружных бластомеров ориентированы параллельно поверхности зародыша. Размер внутренней полости варьирует у разных эмбрионов в пределах 50 - 60 мкм.

Внутренние бластомеры характеризуются округлой формой. Ядра могут локализоваться в различных частях цитоплазмы и содержат ядрышки.

Основной объем цитоплазмы как наружных, так и внутренних клеток заполнен большим количеством желточных включений.

На 64 клеточной стадии (6 д. д.) большинство зародышей состоит из наружного слоя бластомеров, окружающих внутреннюю полость. Ядра наружных клеток располагаются ближе к апикальной области цитоплазмы и содержат ядрышки. Веретена митотических делений наружных клеток ориентированы параллельно поверхности зародыша. У части зародышей в полости присутствуют внутренние клетки, у других зародышей клеточная составляющая в полости отсутствует.

Число внутренних клеток варьирует у разных зародышей. Ядра этих клеток могут локализоваться в различных частях цитоплазмы и все они содержат ядрышки.

Основной объем цитоплазмы наружных и внутренних клеток заполнен желточными включениями. В наружном слое обнаруживаются единичные клетки, ядра которых располагаются в базальной части цитоплазмы.

На 128 клеточной стадии (7 д. д.) все зародыши имеют наружный слой клеток, ограничивающий внутреннюю полость (Рис. 5А, Б; сх. 2). Как и на предыдущей стадии развития, в полости у части зародышей присутствуют клеткиамебоидной формы, число которых варьирует (Рис. 5Б). В полости некоторых эмбрионов клетки отсутствуют (Рис. 5 А).

Наружные клетки зародышей имеют клиновидную форму и выраженную апикобазальную полярность. Длина апикобазальной оси составляет 40 мкм, ширина в районе ядра 15 мкм. Ядра располагаются в апикальной части клеток, все они содержат ядрышки. Веретена митотических делений ориентированыполостьнаружные клеткиверетено деленияядраСхема 2. Стадия развития 128 бластомеров.параллельно поверхности зародыша. В составе наружного пласта встречаются единичные клетки, ядра которых локализованы в базальных частях цитоплазмы (сх. 2).

Внутренние клетки характеризуются амебоидной формой, их ядра с ядрышками могут быть локализованы в различных частях цитоплазмы.

Основной объем цитоплазмы наружных и внутренних клеток заполнен желточными включениями.

На всех описанных выше стадиях зародыши имеют округлую или эллиптическую форму. Размеры зародышей не претерпевают изменений в ходе дробления и варьируют в пределах 120 — 130 мкм. Полярность эмбрионов в ходе дробления морфологически не выражена.

2. Дифференцировка клеток.

В составе двухслойных зародышей продолжаются митотические деления клеток и начинается постепенная их дифференцировка. Наружные клетки дифференцируются в жгутиковые клетки личинки, внутренние клетки приобретают ультраструктурные характеристики ядрышковых амебоцитов. Параллельно с дифференцировкой клеток зародыша происходит формирование морфологически выраженной переднезадней полярности. Она проявляется в структуре пласта наружных жгутиковых клеток. На ранних этапах дифференцировки (500 кл.) в составе наружного пласта выявляется участок клеток, апикобазальная ось которых (-27 мкм) короче в сравнении с остальными наружными клетками (-32 мкм) (сх. 3). Более четкие размерные различия между клетками заднего полюса и передней полусферы зародыша проявляются на поздних этапах развития.заднииполостьвнутренние клеткинаружные жгутиковые клеткиСхема 3. Стадия развития -500 клеток.

На этих этапах эмбрионального развития сохраняется вариабельность в морфологическом строении зародышей, присущая им на 64 — 128 кл. стадиях. На 256 - 512 клеточной стадии (8 - 9 к. ц.) в мезохиле одной материнской особи (Рис. 6В, Г) мы можем увидеть эмбрионы со следующими морфологическими характеристиками (Рис. 5В - Е; сх. 3). Наружные клетки зародышей поляризованы в апикобазальном направлении и составляют единый интегрированный клеточный пласт. Ядра располагаются в апикальных частях клеток. В наружном клеточном слое присутствуют единичные клетки, ядра которых расположены в центральной или базальной области цитоплазмы. Длинаапикобазальной оси наружных клеток составляет 32 мкм. Зародыши имеют округлую или эллипсовидную на срезах форму. Размеры полости варьируют в пределах 50x50 - 68x25 мкм. У части зародышей в ее составе имеются амебоидные клетки, которые образуют более или менее плотный конгломерат. Ядра их располагаются в различных частях цитоплазмы, содержат ядрышки. У некоторых зародышей клетки в полости отсутствуют.

Наружные клетки, приступающие к митотическому делению, принимают округлую форму и располагаются в апикальной части клеточного пласта (Рис. 5В, Г; 6Г; сх. 3). Веретена митотических делений наружных клеток ориентированы параллельно поверхности зародыша.

В процессе дифференцировки клеток имеют место различные морфогенетические события. Во-первых, начиная со стадии 1000 клеток (10 клет. цикл) начинается проникновение материнских гранулярных амебоцитов в состав зародышей (Рис. 37 - 39). В составе нерепродуцирующих особей и на ранних этапах репродукции эти клетки локализуются под кортикальным слоем губки и возле хоаноцитных камер. На описываемых этапах наблюдается скопление гранулярных амебоцитов в непосредственной близости от развивающихся зародышей. Они видны между клетками эмбриональной капсулы и поверхностными клетками зародыша, в межклеточных пространствах наружных жгутиковых клеток и амебоцитов внутренней полости. Гранулы этих клеток связывают такие красители, как фуксин, эозин, прочный зеленый.

Начиная со стадии 1000 кл. наружный пласт клеток начинает изгибаться, формируя многочисленные более или менее глубокие инвагинации на поверхности зародыша (Рис. 7; сх. 4). Локализация инвагинаций и их глубина различны. У части зародышей одна из инвагинаций может отшнуровываться во внутренней полости зародыша, формируя замкнутую камеру, наличие которой мы определяли по серийным срезам. Форма и размер камер различаются у разных зародышей. Вывод об их происхождении из наружного слоя клеток мы делаем исходя из одинаковой ультраструктуры наружных и внутренних клеток и отсутствием каких-либо морфологических картин, позволяющих рассматривать их как процесс дифференцировки клеток камеры автономно во внутренней полости зародыша (см. ниже).

Проникновение материнских клеток в состав зародышей и формирование инвагинаций имеет место в течение всего последующего эмбрионального развития.

Процесс мультиполярной иммиграции также имеет место в течение всего последующего развития (Рис. 6А, Б). Мы делаем этот вывод на основании следующих морфологических картин. Во-первых, среди поляризованных наружных жгутиковых клеток можно увидеть клетки веретеновидной формы, ядра которых локализованы в центральной или базальной массе цитоплазмы. Ультраструктура цитоплазмы и в некоторых случаях присутствие базального аппарата жгутика позволяют делать вывод, что эти клетки являются производными наружных жгутиковых клеток. Непосредственно под слоем наружных жгутиковых клеток, во внутренней полости зародышей, также можно видеть амебоидные клетки, сохраняющие некоторые ультраструктурные особенности (см. ниже), не оставляющие сомнения в их происхождении из наружных жгутиковых клеток зародыша. Такие клетки мы наблюдаем в полости зародышей на всех этапах эмбрионального развития - начиная со стадии, на которой появляются аксонемы жгутиков (500 кл.) и кончая плавающей личинкой (Рис. 34; 42А, Б).

Зародыш на завершающих этапах эмбриогенеза мы называем предличинкой. Она состоит из слоя наружных жгутиковых клеток, окружающих внутреннюю полость. Предличинки имеют морфологически выраженную переднезаднюю полярность (Рис. 7А).

Апикобазальная ось наружных клеток передней полусферы составляет 27 - 35 мкм, ширина в районе ядра 2.6 - 3 мкм. Они имеют цилиндрическую форму и характеризуются выраженной апикобазальной полярностью. Ядра с ядрышками располагаются а апикальной части цитоплазмы, желточные гранулы занимают среднюю и базальную части клетки. Жгутиковые клетки заднего полюса характеризуются клиновидной или кубовидной формой, длина апикобазальной оси составляет -15 - 20 мкм. Ядра (4 мкм) их имеют округлую форму, располагаются в апикальной части цитоплазмы, содержат ядрышки.

Морфологические различия зародышей (помимо формы) выражаются в клеточном составе внутренней полости. У некоторых зародышей внутренние амебоциты формируют плотный клеточный конгломерат (Рис. 7А). У других - в полости присутствуют немногочисленные амебоидные клетки, локализованные главным образом в периферических участках полости. Часть зародышей содержит внутренние жгутиковые замкнутые камеры, размер и форма которых также различаются.

Под эмбриональной капсулой, между наружными жгутиковыми клетками и в полости присутствуют многочисленные гранулярные клетки материнского происхождения. Они интенсивно окрашиваются эозином и прочным зеленым.

На стадии предличинки пласт наружных жгутиковых клеток также образует более или менее глубокие инвагинации, форма и расположение которых различны у разных зародышей в пределах мезохила одной материнской особи. (Рис. 7Б, В). наружныеСхема 4. Предличинка. Инвагинация наружного слоя клеток.

На завершающих этапах эмбриогенеза предличинки начинают вращаться в пределах эмбриональной капсулы. По завершении развития эмбриональные капсулы интегрируются с системой выносящих каналов. Сформированные личинки выходят по выносящим каналам, через оскулярные отверстия, во внешнюю среду.

Свободноплавающие личинки.

Выход личинок из материнской губки происходит в течение 1-2 суток. В аквариумах вышедшие личинки сначала опускаются на дно, через несколько секунд начинается работа жгутиков и личинки переходят с плавающему образу жизни. Личинки Я. сЬуагсНт способны плавать в различных направлениях, перемещаясь в вертикальной и горизонтальной плоскостях. Траектория движения представляет собой правозакрученную спираль, личинки вращаются вокруг переднезадней оси по часовой стрелке. Иногда они совершают кульбитирующие движения. В процессе плавания личинки вступают в контакт с различнымиклеткиматерин» клеткзадний полюсРЭССйЙСКЛЯ ЦЙЕЙКОТЕКЛтвердыми субстратами и поверхностной пленкой воды. Контакт осуществляется передним полюсом.

По нашим наблюдениям, в искусственных условиях личинки способны плавать от 1 до 4 суток, после чего претерпевают метаморфоз или погибают.

В процессе плавания личинки осуществляют «исследования» твердых субстратов для оседания и метаморфоза. В точке контакта с твердой поверхностью или поверхностной пленкой воды личинки вращаются вокруг своей переднезадней оси от нескольких секунд до 20-30 минут. В дальнейшем они могут претерпевать метаморфоз или вновь возвращаться к свободному плаванию. Из испробованных искусственных и натуральных субстратов (предметные стекла, стерильные чашки Петри, целлоидиновая пленка, агар-агар, кусочки фукусов из разных участков таллома) личинки оседали и претерпевали метаморфоз только на стерильной поверхности пластиковой чашки Петри, стерильных покровных стеклах и кусочках фукуса, взятых с таллома, ранее заселенного этим видом губок.

Личинки изучаемого вида характеризуются морфологической вариабельностью (Рис. 8; сх. 5). Размеры их варьируют от 120 до 130 мкм. Они состоят из слоя наружных жгутиковых клеток, окружающих внутреннюю полость. Переднезадняя ось личинки морфологически выражена в структуре пласта наружных жгутиковых клеток. На передней полусфере клетки имеют вытянутую цилиндрическую форму, длина апикобазальной оси варьирует в пределах 25 - 35 мкм, ширина в районе ядра-2,6 - 3 мкм. Задний полюс образован пластом клиновидных или кубических клеток, длина апикобазальной оси составляет 14-20 мкм, ширина в районе ядра-4 - 7 мкм. Кольцо переходных по форме клеток отделяет пласт клеток заднего полюса от клеток передней полусферы. Пласт клеток на заднем полюсе личинок характеризуется неустойчивой формой (Рис. 8, 9). У разных личинок, вне зависимости от морфотипа, число клеток в составе пласта и их форма варьируют. Вероятно, форма пласта заднего полюса может изменяться в процессе плавания личинки и при контактах личинок с субстратом. Большая часть материнских клеток, находящихся в составе плавающей личинки, концентрируется во внутренней полости в районе, непосредственно прилегающем к наружным клеткам заднего полюса.

При помещении личинок в бескальциевую морскую воду, искусственно стимулирующую разрушение пласта наружных клеток, в первую очередь нарушаются связи клеток на заднем полюсе личинки, после чего пласт наружныхВСхема 5. Основные морфологические типы плавающих личинок Н. скуагсИт. А - паренхимуло-подобная, Б — целобластуло-подобная, В — дисферула. П - 3 - переднезадний полюс.жгутиковых клеток может отделяться от внутренней клеточной массы и некоторое время в нем сохраняется биение жгутиков.

В полости присутствуют амебоидные клетки, количество их варьирует у различных личинок. Они могут образовывать конгломераты различной плотности, у части личинок незначительное количество амебоидных клеток располагается по периферии внутренней полости.

В составе внутренней полости некоторых личинок находится сферическая камера, образованная жгутиковыми клетками. Редко встречаются личинки с двумя жгутиковыми камерами (Рис. 8Г). Размеры камер и число клеток в их составе варьируют. Соответственно отличается и форма клеток в составе пласта внутренней камеры.

На основании клеточного состава внутренней полости мы выделяем три морфологических типа личинок - паренхимуло-подобные личинки, целобластуло-подобные личинки и дисферульные личинки (сх. 5).

Метаморфоз.

1. Оседание личинки.

Метаморфоз начинается в момент контакта плавающей личинки с подходящим субстратом. Контакт осуществляется передним полюсом. После этого вращение личинки вокруг переднезадней оси продолжается около 40 минут. В течение этого периода происходит постепенное сокращение переднезадней оси личинки; пласт наружных жгутиковых клеток передней полусферы распластывается по поверхности субстрата.

Личинки всех трех морфотипов способны к оседанию и проходят начальные этапы метаморфоза. После образования конгломерата - стадии куколки - различия между морфотипами морфологически не выявляются.

Наибольший аффинитет личинки проявляют к субстратам, уже заселенным губками данного вида. В присутствии такого субстрата личинки оседают на него уже через 7-10 часов после выхода из материнской губки. При этом наблюдается большая плотность осевших личинок на единице площади субстрата и несколько осевших рядом личинок могут сливаться (Рис. 11В). Прижизненные наблюдения показывают, что у таких слившихся личинок на завершающих этапах метаморфоза образуется единая хоаноцитная камера, что3/А " \ жгутиковаяСхема 6. Оседание накамерасубстрат личинки Н. с1ы]'аг(1ш. П-3 — переднезадняя ось; А-Б — апикобазальная ось.преэкзопинакоциты \П/Бвнутренние клеткиговорит, видимо, о полной взаимной интеграции слившихся организмов. 2. Основные этапы метаморфоза.

Жгутиковые клетки задней полусферы плавающей личинки, в т. ч. клетки заднего полюса, формируют наружный покров куколки - экзопинакодерму. (Рис. 10А - В; сх. 6, 7). Формирование экзопинакодермы начинается при контакте личинки с субстратом и завершается после полного прикрепления к субстрату (40мин.-1 час). Экзопинакоциты образуются за счет трансдифференцировки жгутиковых клеток задней полусферы личинки. Трансдифференцировка осуществляется без разрушения клеточного пласта. В результате этого процесса слой жгутиковых клеток личинки преобразуется в слой Т-образных экзопинакоцитов. Формирование экзопинакодермы начинается на заднем полюсе приступившей к метаморфозу личинки и распространяется по направлению к субстрату. О деталях этого процесса будет сказано ниже.

Жгутиковые клетки передней полусферы, контактирующие с субстратом,дедифференцируются. Под покровом экзопинакодермы они формируют плотныйконгломерат амебоидных клеток (Рис. 10В; сх. 7). Формирование конгломератаосуществляется в первые 4-6 часов и обуславливает полное прикреплениеличинки к субстрату.преэкзопинакоцитыСхема 7. Начальные этап метаморфоза. Завершение прикрепления личинки. А - Б - апикобазальная ось.

Внутренние клетки личинки входят в состав конгломерата. Пласт внутренних жгутиковых клеток (внутренняя жгутиковая камера) полностью анархизируется (Рис. ЮГ; сх. 8).экзопинакоцитыСхема 8. Стадия куколки. Слой Т-образных экзопинакоцитов покрывает плотный конгломерат амебоидных клеток.

В ходе метаморфоза клетки конгломерата дифференциуются в хоаноциты, эндопинакоциты и в клетки мезохила. Начальные этапы дифференцировки сопровождаются регионализацией конгломерата амебоидных клеток: основная масса клеток локализуется в центральной части куколки, где формируется крупная хоаноцитная камера. Небольшое число амебоидных клеток присутствуют в поверхностной и базальной частях куколки, где происходит формирование мезохила и системы водоносных каналов (сх. 9. 10).эксубстратСхема 9. Регионализация внутреннего конгломерата куколки.

В ходе метаморфоза мы не наблюдали наличия митотически делящихсяклеток.

Процесс метаморфоза завершается образованием оскулюма и началом функционирования ирригационной системы. У изучаемого вида метаморфоз завершается на 3-4 сутки. Основной объем сформированной губки занимает хоаноцитная камера. Первичная хоаноцитная камера имеет округлую форму, затем происходит формирование лопастей, число которых варьирует от 3 до 5 (Рис. 60). В мезохиле присутствуют единичные амебоидные клетки и происходит активная секреция фибриллярного и слизистого межклеточного матрикса.кластеры прехоаноцитовСхема 10. Завершение метаморфоза.

Ультраструктурные особенности эмбрионального развития, личинки и метаморфоза Н. dujardinLДробление.

Основной объем цитоплазмы бластомеров в ходе дробления заполнен желточными включениями (Рис. 4 А — Г). Максимальный диаметр их на этом этапе составляет 4 - 4,5 мкм. Их содержимое на электронограммах имеет гетерогенную структуру, отражающую их фагоцитарное происхождение (Рис. 14 А, Б)Ядра бластомеров имеют в разной степени выраженную лопастную форму и локализованы в центральной области цитоплазмы (Рис. 4 А, Б; Рис. 12 А - В). Их диаметр составляет 8 мкм. Хроматин в интерфазном ядре имеет гранулярную и фибриллярную составляющие, в нем не наблюдается присутствия конденсированного гетерохроматина (Рис. 13 А - Г). В ядрах присутствует ядрышки (Рис. 12 В). Их диаметр составляет2 мкм. Ядрышко в период дробления на электронограммах интерфазных ядер имеет плотную фибриллярную структуру. Поверхность ядрышка ровная (Рис. 12Д).

Незначительный объем околоядерной цитоплазмы свободен от желточных включений (Рис. 12А - В). В этом пространстве присутствуют мембранные пузырьки с электронопрозрачным содержимым и вакуоли неправильной формы (Рис. 13В, Г). В околоядерном пространстве обнаруживается центриоль, диаметр которой составляет 0,2мкм, высота 0,3 мкм. (Рис. 12А, Б; Рйс. 13А). Аппарат Гольджи также находится в околоядерной цитоплазме (Рис. 13Б, В). Он состоит из 4-7 цистерн, размер которых составляет 0,4 мкм. Комплексы аппарата Гольджи локализованы в различных зонах околоядерной цитоплазмы и не имеют видимой ассоциации с центриолями. Часто в околоядерной цитоплазме встречаются комплексы 2-4 цистерн, организованных в кольцевую структуру, и большое количество вложенных друг в друга мембранных структур и вакуолей из двойных мембран (Рис. 13В, Г). Нередко наблюдается взаимосвязь мембранных структур с наружной ядерной мембраной (Рис. 13 Г).

Весь объем цитоплазмы заполнен значительным количеством митохондрий (Рис. 12Б, 13Д). Они располагаются между желточными гранулами, часто непосредственно прилегают к их поверхности. Их размер составляет -0,5 мкм. Матрикс митохондрий имеет тонкофибриллярную структуру.

В цитоплазме бластомеров присутствуют симбиотические бактерии в составе вакуолей, структура которых остается интактной (Рис. 12Б - Г).

Пространство между зародышем и клетками эмбриональной капсулы заполнено матриксом, который на электронограммах выглядит как неструктурированные, аморфные, неправильной формы глобулы (Рис. 14Б). Межклеточный матрикс такой же структуры присутствует и в межбластомерном пространстве и в образующейся полости зародыша (Рис. 14А). Исходя из этих данных мы предполагаем, что синтез и экскреция этого матрикса осуществляется клетками зародыша.

Взаимодействие бластомеров друг с другом и с клетками эмбриональной капсулы осуществляется с помощью филоподий и локальных зон прилегания поверхностных мембран (Рис. 14А, В). Расстояние между мембранами в области прилегания составляет 12 -15 нм.

Дифферен цировка клеток зародышей. 1. Зародыши на стадии 64—128 клеток.

После формирования двуслойной структуры зародыша — 64 - 128 бл. стадия наружные клетки дифференцируются в жгутиковые клетки личинки. Постепенно происходит формирование поляризованной структуры цитоплазмы клеток. В результате митотических делений выравнивается ядерно-цитоплазматическое соотношение. Внутренние клетки митотически делятся, в них морфологически не выявляется признаков специфической дифференцировки.

Первые признаки дифференцировки наружных клеток явственно проявляются на 64 клеточной стадии (Рис. 15, 16).

Ядра (длинная ось 7 мкм) наружных клеток располагаются в апикальной области цитоплазмы (Рис. 15А, Б). Они имеют округлую или бобовидную форму, причем длинная ось ориентированна параллельно поверхности зародыша. Хроматин имеет гранулярную и фибриллярную составляющие, его плотность выше чем на предшествующих этапах дробления.центриольаппаратаппарат Гольджижелточные гранулыбазальное телоконтакт ядрышко Баппарат Гольджимитохондриижгутикядромитохондрииаппарат ольджиядробазальное телокорешкибазальноежелточные гранулы--- телоо.о • | корешкидСхема 11. Дифференцировка наружных жгутиковых клеток. А. Дробление. Б. Зародыш -64-128 кл. В. Зародыш -128 - 256 кл. Г. Зародыш -500-1000 кл. Д. Предличинка. Е. Плавающая личинка.

Ядра содержат ядрышки (1,5 мкм.), их поверхность становится неровной, от нее в нуклеоплазму отходит тонкофибриллярный материал. (Рис. 15).

Центриоли (диаметром 0,2 мкм) располагаются в околоядерной цитоплазме и локализованы между ядром и апикальной наружной клеточной мембраной. Иногда можно наблюдать структурную взаимосвязь центриоли с ядерной и наружной мембранами (рис. 16А, Б). Апикальная наружная клеточная мембрана образует неглубокое впячивание, направленное внутрь клетки, центром которого является область ее взаимодействия с центриолью (Рис. 15А, 16В; сх. 11 Б).

Аппарат Гольджи также расположен в околоядерной цитоплазме и может локализоваться в различных ее областях. Комплексы Гольджи состоят из 5-6 цистерн, часть из которых имеет электроноплотное содержимое. Они могут иметь различную ориентацию относительно поверхности ядра, иногда образуя подковообразные структуры (Рис. 16 В, Г).

Митохондрии в значительном количестве присутствуют во всех частях цитоплазмы бластомеров. Основной объем цитоплазмы оккупирован желточными гранулами. Их размер на этой стадии может достигать 3,5 мкм, содержимое их гетерогенно по составу и характеризуется высокой электронной плотностью (Рис. 15).

Развивающийся зародыш вступает в тесные контактные взаимодействия с клетками эмбриональной капсулы (Рис. 15, 17А, Б). Обширные зоны прилегания можно наблюдать между апикальной клеточной мембраной наружных бластомеров и наружной мембраной клеток эмбриональной капсулы. Апикальная мембрана наружных клеток зародыша покрыта гликокаликсом, высота слоя которого составляет-0,14 мкм (Рис. 17В).

Взаимодействие между клетками зародыша опосредовано, во-первых, филоподиями, которые образуются на базальных и латеральных областях клеточных мембран наружных бластомеров и, во-вторых, опоясывающими зонами адгезии, которые связывают наружные клетки в апикальных частях латеральных мембран (рис. 17). Наружные мембраны соседних бластомеров в этой области ориентированы строго параллельно, межмембранное пространство составляет —12 нм. Со стороны цитоплазмы к мембранам подходит тонкофибриллярный материал, в межклеточном пространстве также можно обнаружить присутствие электроноплотного материала. Какой-либо закономерности в его расположении не наблюдается.

На стадии -128 клеток (7 д. д.) ядро наружных клеток располагается в апикальной части цитоплазмы. Оно имеет округлую или овальную форму (Рис. 18Б, В). Его диаметр составляет 6 мкм. В интерфазе хроматин содержит фибриллярную и гранулярную составляющие, его плотность выше, чем в предшествующий период развития. Ядра содержат ядрышки, диаметр которых составляет 1,5 мкм. На этой стадии в ядрышках появляются поры (hole), число, размер и форма их сильно варьирует (Рис. 18Б, Г; ex. 11В). Границы ядрышка на этой стадии неправильны, в нуклеоплазму от его поверхности отходит тонкофибриллярный материал.

Центриоли располагаются между ядром и апикальной наружной клеточной мембраной (Рис. 18В, 19). На этой стадии начинается дифференцировка базального аппарата жгутика. Одна из центриолей ориентируется перпендикулярно ядерной и наружной мембранам (Рис. 19). Она структурно связана с наружной клеточной мембраной и с наружной ядерной мембраной. Морфологически эта взаимосвязь выглядит как непосредственное прилегание центриолярного материала к мембранам. Целостность ядерной и плазматической мембран, по нашим наблюдениям, не нарушается (Рис. 19В). В области контакта с наружной мембраной формируется слой переходных фибрилл, диаметр которого составляет 0,6 мкм. На латеральной поверхности центриоли образуется перпендикулярно отходящая базальная ножка, длина которой составляет -0,2 мкм (Рис. 19А - В). Наружная мембрана некоторых бластомеров образует впячивание, направленное во внутрь зародыша, и центром этого впячивания является область контакта с формирующимся базальным телом (Рис. 18Б). Глубина этого впячивания может быть выражена в разной степени. Над основной центриолью иногда можно обнаружить образование выпячивания наружной мембраны в пространство между зародышем и эмбриональной капсулой. Эта структура может маркировать область формирования аксонемы жгутика (Рис. 19А, В; ex. 11В). В пространстве между зародышем и эмбриональной капсулой аксонемы жгутов отсутствуют.

Аппарат Гольджи на этой стадии локализован в околоядерной цитоплазме, и чаще всего, обнаруживается выше «ядерного экватора», недалеко от апикальной наружной мембраны (Рис. 18Б, В; Рис. 19Б, Г). Встречается он также и в более глубоких частях околоядерной цитоплазмы. Он состоит из 5-6 цистерн, часть из которых имеет электроноплотное содержимое. Часто можно наблюдать подковообразные цистерны аппарата Гольджи (Рис. 19Б). Комплексов Гольджиможет быть несколько - на срезе можно увидеть до 3-4х. В околоядерной мембране присутствует незначительное число мембранных пузырьков, имеющих содержимое разной электронной плотности. Также единичные пузырьки присутствуют в непосредственной близости от аппаратов Гольджи. Преимущественно они локализованы в околоядерной цитоплазме, прилегающей к наружной апикальной мембране клеток.

Округлые митохондрии (-0,5 мкм) присутствуют во всех областях цитоплазмы наружных клеток бластул. Матрикс митохондрий имеет тонкофибриллярную структуру. Часто митохондрии непосредственно прилегают к желточным гранулам (Рис. 18А, В; Рис. 19Б).

В околоядерной цитоплазме выявляется гранулярный эндоплазматический ретикулум.

Вся цитоплазма клетки заполнена желточными включениями. Их диаметр составляет 2,5 - 3 мкм. Они имеют гетерогенное содержимое и, в отличие от стадии дробления, на поверхности многих гранул не удается выявить мембраны (Рис. 18)Поверхностная мембрана наружных клеток на описываемой стадии имеет три компартмента - апикальный, латеральный и базальный. Апикальный компартмент обращен к клеткам эмбриональной капсулы. Здесь образуются обширные области прилегания между апикальными мембранами клеток эмбриональной капсулы и апикальными компартментами наружных клеток зародыша (Рис. 18). В области контакта расстояние между мембранами составляет -12 — 15 нм. На апикальной наружной мембране клеток зародыша имеется гликокаликс, высота слоя которого составляет 0,1 мкм. В области, находящейся над формирующимся базальным телом гликокаликс характеризуется более высокой плотностью (Рис. 19А, В).

Латеральные мембраны соседних клеток примыкают друг к другу. В верхней зоне латерального компартмента присутствует область протяженностью -0,5 мкм, для которой характерна строгая параллельная ориентация мембран соседних клеток, межмембранное пространство имеет постоянную ширину, составляющую -12 нм. В цитоплазме, прилегающей к наружной мембране в этой области, наблюдается присутствие электроноплотного материала. Эти области плотного прилегания опоясывают верхнелатеральные районы всех наружных клеток бластулы (Рис. 20А).

Ниже расположенные латеральные мембраны клеток не имеют строго параллельной ориентации по всей своей протяженности, ширина межмембранного пространства варьирует (Рис. 20В).

Базальные части клеток обращены в полость бластулы. Базальная мембрана (характерная для эпителиев) и какой-либо фибриллярный материал отсутствует в полости зародышей. Наружная базальная (обращенная в полость бластулы) мембрана клеток образует многочисленные длинные филоподии, которые формируют сложную сеть в полости бластулы (Рис. 20Б).

Внутренние клетки бластулы (если таковые присутствуют), характеризуются амебоидной формой. Как правило, ядра их локализованы в периферических участках цитоплазмы. Они имеют округлую форму, размер составляет -бмкм. В ядрах присутствует ядрышко, его диаметр составляет —1,5 мкм. Пара центриолей находится в околоядерной цитоплазме. Их взаимная ориентация может варьировать (Рис. 20Г). В околоядерной цитоплазме находится аппарат Гольджи. Он состоит из 4-5 цистерн, часть из которых заполнена электроноплотным содержимым. Вокруг аппарата Гольджи присутствует значительное количество мембранных пузырьков, имеющих содержимое различной электронной плотности.

Митохондрии округлой и вытянутой формы можно обнаружить во всех участках цитоплазмы. Их матрикс имеет тонкофибриллярную структуру.

Цитоплазма клеток заполнена желточными гранулами. Их диаметр составляет 2-3 мкм. Они имеют гетерогенное, электроноплотное содержимое. У значительного числа гранул отсутствует поверхностная мембрана.

Наружная мембрана внутренних клеток формирует филоподии, диаметр которых варьирует 0,05 - 0,1 мкм. Наружные мембраны внутренних клеток образуют локальные зоны прилегания, протяженность которых варьирует.

В цитоплазме клеток в составе вакуолей присутствуют симбионтные бактерии (Рис. 18А - вставка) Их структура в составе вакуолей остается интактной. Они также присутствуют в пространстве между зародышем и эмбриональной капсулой и в полости зародыша. Эти бактерии принадлежат к одному морфологическому типу.

2. Зародыши, состоящие из 500-1000 кл. Два типа клеток имеется в составе зародышей на этой стадии: наружные жгутиковые клетки и внутренние амебоидные клетки. У части зародышей последние могут отсутствовать.

Цитоплазма наружных клеток разделена на два компартмента - апикальная цитоплазма, в которой локализовано ядро, базальный аппарат жгутика и аппарат Гольджи и остальная цитоплазма клеток (средняя и базальная ее части), заполненная желточными гранулами.

Ядро наружных клеток, диаметр которого на этой стадии составляет 3 мкм, имеет округлую или каплевидную форму. Хроматин в интерфазном ядре имеет тонкогранулярную и фибриллярную составляющие, его плотность выше, чем на предшествующих этапах развития (Рис. 21 А, Б). В его составе наблюдается присутствие незначительно выраженных районов конденсированного хроматина, локализованного у ядерной мембраны (Рис. 21 Б). Ядрышко (—1,2 мкм.) имеет неровную поверхность (Рис. 21 А). На этой стадии развития в ядрышках также присутствуют поры (hole), однако число и размеры их меньше, чем на стадии 128 клеток. В составе ядрышка выявляется также фибриллярная и гранулярная компоненты.

Над ядром, в апикальной части цитоплазмы клеток находится базальное тело жгутика и добавочная центриоль (Рис. 21; Рис. 22А). Диаметр базального тела составляет 0,2 мкм, высота - 0,3 мкм. Взаиморасположение основной и добавочной центриолей варьирует. На описываемой стадии эмбрионального развития наружные клетки имеют сформированные аксонемы жгутиков, срезы которых присутствуют в пространстве между поверхностью зародыша и эмбриональной капсулой (Рис. 21).

Проксимальная часть жгутиковый кинетосомы (базального тела) связана с наружной мембраной клетки переходными фибриллами (диаметр кольца которых -0,6 мкм). От центральной части жгутиковой кинетосомы отходит базальная ножка (basal foot) (Рис. 21В, 22А). Ее длина составляет -0,1 мкм.

Поверхностная апикальная мембрана клетки образует вокруг основания жгутика карманообразное выпячивание. Его глубина и форма варьирует. Поверхностная мембрана аксонемы в области жгутикового кармана покрыта гликокаликсом, высота слоя которого составляет -0,13 мкм. Поверхностнаямембрана наружных клеток, обращенная в полость эмбриональной капсулы, также покрыта гликокаликсом (Рис. 21,22А).

Аппарат Гольджи находится в околоядерной цитоплазме, локализуясь выше зоны «экватора ядра». Он состоит из 5-6 цистерн, часть из которых имеет электроноплотное содержимое. Цистерны аппарата Гольджи могут быть ориентированы параллельно ядерной мембране или образуют кольцевидно закрученные фигуры. Вокруг аппарата Гольджи, под апикальной поверхностной мембраной и в цитоплазме жгутиковых карманов присутствует большое количество мембранных пузырьков с содержимым разной электронной плотности (Рис. 21 Б, В).

Многочисленные митохондрии обнаруживаются во всех участках цитоплазмы наружных клеток. Они округлой формы, их матрикс имеет тонкофибриллярную структуру (Рис. 21 Б).

В цитоплазме, между желточными гранулами присутствуют свободные рибосомы и цистерны гранулярного эндоплазматического ретикулума (Рис. 21 А, Б). Образование их происходит на наружной ядерной мембране.

Желточные гранулы (2 мкм) по-прежнему многочисленны. По сравнению с предыдущими этапами развития они характеризуются менее выраженной структурированностью содержимого. Многие желточные гранулы не имеют наружной поверхностной мембраны.

Поверхностная мембрана наружных клеток подразделена на три морфофункциональных компартмента: апикальный, латеральный и базальный.

Наружные жгутиковые клетки связаны между собой опоясывающей зоной адгезии (Рис. 21 А; 22В, Г), находящейся в апико-латеральных областях клеток, в основании формирующегося жгутикового кармана. Наружные мембраны соседних клеток в этой зоне характеризуются строго параллельной ориентацией, расстояние между мембранами соседних клеток составляет 12 нм. Протяженность (длина) области адгезии составляет -0,5 мкм. К внутренним поверхностям наружных мембран в зоне адгезии подходит электроноплотный тонкофибриллярный материал. В межмембранном пространстве также обнаруживается присутствие электроноплотного материала, иногда образующего поперечные мостики между мембранами соседних клеток. Какой-либо закономерности в их расположении не выявлено.

Ниже зоны адгезии мембраны соседних клеток имеют более или менее выраженные неровные очертания.

Базальные концы клеток обращены в полость зародыша, их очертания неровные. На базальных концах наружных клеток имеются многочисленные филоподии, срезы которых обнаруживаются на электронограммах. Филоподии контактируют друг с другом и с наружными мембранами внутренних клеток зародыша (Рис. 22Б).

Апикальная клеточная мембрана, покрывающая жгутиковый карман, образует зоны прилегания с апикальной мембраной клеток эмбриональной капсулы. В цитоплазме клеток зародыша в этих областях часто можно наблюдать большие скопления мембранных пузырьков диаметром 0,05 - 0,1 мкм. Расстояние между мембранами клеток зародыша и эмбриональной капсулы в этих областях составляет 12 - 15 нм (Рис. 2Б).

Внутренние клетки бластул имеют амебоидную форму (Рис. 23). Ядро (3 мкм.) занимает различное положение в клетке. В ядре присутствует единственное ядрышко. В нем выявляются гранулярная компонента и фибриллярная компонента, присутствуют небольшие поры (hole). Хроматин гранулярный, у ядерной мембраны имеются зоны конденсированного гетерохроматина (Рис. 23).

Аппарат Гольджи располагается в околоядерной цитоплазме. Он состоит из 5-6 цистерн, часть из которых имеет электроноплотное содержимое. Вокруг аппарата Гольджи обнаруживается большое количество мембранных пузырьков (0,05 - 0,1 мкм в диаметре), имеющих содержимое различной электронной плотности.

В цитоплазме присутствуют свободные рибосомы и цистерны гранулярного эндоплазматического ретикулума, образование которых происходит на наружной ядерной мембране.

Округлые и вытянутые митохондрии присутствуют в значительном количестве в различных районах цитоплазмы. Их матрикс имеет тонкофибриллярную структуру. Диаметр митохондрий в среднем составляет 0,5 мкм (Рис. 23).

Околоядерная цитоплазма свободна от желточных включений, остальной же объем цитоплазмы заполнен ими. Максимальный диаметр их на этой стадии составляет 2 мкм. Содержимое желточных гранул менее структурировано, чем на предыдущих этапах развития, часть из них содержит значительные области гомогенного электроноплотного материала. У значительного числа желточных гранул отсутствует наружная мембрана.

Во внутренней полости зародышей на этой стадии встречаются амебоидные клетки, ядро которых располагается в периферической области цитоплазмы и которые имеют аксонему жгутика. В полости бластулы между внутренними амебоидными клетками встречаются срезы жгутиковых аксонем (Рис 23А; 24). Цитоплазматические компоненты этих клеток сходны с описанными выше для ядрышковых амебоцитов.

Внутренние амебоидные клетки образуют многочисленные филоподии, срезы которых обнаруживаются на электронограммах. Соседние амебоидные клетки контактируют друг с другом, образуя зоны мембранного прилегания. Расстояние между мембранами соседних клеток в этих областях составляет 12-15 нм. В полости зародышей и в составе вакуолей в клеточной цитоплазме присутствуют симбиотические бактерии (Рис. 24) 3. Зародыши, состоящие из 1000 - 2000 клеток.

Ультраструктурные особенности цитоплазмы наружных клеток на этой стадии остаются без значительных изменений. На этом этапе развития более выражена структура жгутикового кармана, окружающего основание аксонемы. Его форма может быть различной, глубина варьирует от 0,5 до 3 мкм (Рис. 25).

Как и на предыдущей стадии развития, от базального тела жгутика отходит пара поперечно исчерченных корешков, аппарат Гольджи располагается в околоядерной цитоплазме, ориентируясь параллельно поверхности ядра. Цистерны аппарата Гольджи расположены в непосредственной близости от корешков, отходящих от базального тела жгутика (Рис. 25,26).

В средней и базальной частях наружных клеток обнаруживается значительное число цистерн гранулярного эндоплазматического ретикулума. Его образование происходит на наружной ядерной мембране (Рис. 27Б).

Характер взаимодействия между клетками зародыша сохраняется: наружные клетки связаны опоясывающей зоной адгезии, находящейся в их апикальных частях и контактируют с внутренними клетками с помощью многочисленных филоподий, присутствующих на их базальных частях (Рис. 27А).

В полости зародышей, как и на предыдущем этапе развития, присутствуют ядрышковые амебоциты и амебоидные клетки со жгутиковыми аксонемами (Рис. 28).

Наружный слой клеток на этой стадии способен образовывать инвагинации (более или менее глубокие), направленные внутрь зародыша. На этой же стадии мы можем обнаружить в составе некоторых зародышей замкнутые камеры,образованные жгутиковыми клетками (Рис. 29А). Цитоплазма этих клеток поляризована, в апикальной ее части, направленной в полость камеры, расположено ядро округлой или каплевидной формы. Хроматин имеет гранулярную и фибриллярную составляющие, в периферической области ядра имеются участки конденсированного гетерохроматина. Ядрышко неправильной формы, на электронном уровне выявляется гранулярная компонента и фибриллярная компонента.

Над ядром расположена жгутиковая и безжгутиковая кинетосомы. От жгутиковой кинетосомы отходит аксонема жгута. В зоне контакта базального тела и поверхностной клеточной мембраны имеется слой переходных фибрилл, диаметр которого составляет -0,6 мкм. Аппарат Гольджи располагается в околоядерной цитоплазме (выше «ядерного экватора»), его цистерны ориентированы параллельно поверхности ядра. Комплекс состоит из 5-6 цистерн, часть из которых заполнена электроноплотным содержимым. Основание жгутика погружено в жгутиковый карман. В цитоплазме жгутикового кармана локализовано большое количество мембранных пузырьков с содержимым различной электронной плотности. Поверхностная мембрана жгутикового кармана покрыта гликокаликсом. Мембрана жгутика в области цитоплазматического кармана также покрыта гликокаликсом, высота слоя которого составляет -0,1 мкм (Рис. 29).

Цитоплазма клеток, расположенная базальнее ядра заполнена желточными гранулами. Их диаметр составляет в среднем 1 -2 мкм. Желточные гранулы имеют электроноплотное содержимое, значительная часть которого гомогенна. У значительного числа гранул отсутствует наружная мембрана (Рис. 29А).

Округлые митохондрии (-0,5 мкм) расположены во всех частях цитоплазмы клеток. Их матрикс имеет тонкофибриллярную структуру.

В цитоплазме, главным образом между желточными гранулами, встречаются свободные рибосомы и цистерны гранулярного эндоплазматического ретикулума.

Жгутиковые клетки внутренних камер имеют опоясывающую зону адгезии в апико-латеральных частях клеток (Рис. 29Б). Базальные концы клеток имеют неровные очертания, обращены в полость зародыша, специализированная базальная мембрана и какой-либо фибриллярный межклеточный матрикс отсутствует. Базальные части клеток жгутиковой камеры могут вееровидно расходиться.

Симбиотические бактерии одного морфологического типа присутствуют в полости зародыша, в пространстве между зародышем и эмбриональной капсулой и в вакуолях в цитоплазме клеток, причем эти вакуоли обнаруживаются во всех участках цитоплазмы и структура бактерий в них сохраняется интактной (Рис. 28).

4. Предличинка.

Следующая стадия развития, на описании ультраструктуры которой мы остановимся - предличинка.

Предличинки имеют переднезаднюю полярность, которая морфологически выражена в структуре пласта наружных жгутиковых клеток. Жгутиковые клетки заднего полюса отличаются по размерам и форме, ультраструктурных отличий компонентов их цитоплазмы (в сравнении с остальными наружными клетками) нами не выявлено.

Наружные клетки имеют выраженную апикобазальную полярность. В апикальной цитоплазме клеток располагается ядро. Оно имеет каплевидную форму, его размеры составляют -2,7x7,6 мкм. Хроматин имеет гранулярную и фибриллярную составляющие. В интерфазном ядре присутствуют участки конденсированного гетерохроматина, в том числе у ядерной мембраны (Рис. 30). В ядрах имеется ядрышко, встречаются единичные клетки, ядра которых содержат два ядрышка. Ядрышки имеют неровную поверхность, в них присутствуют поры (hole), число и размер которых незначительны. В составе ядрышек выявляется гранулярная компонента и электроноплотная фибриллярная компонента.

Основание жгутика погружено в карманообразное впячивание цитоплазмы (Рис. 30). В цитоплазме этой части клетки не содержится каких-либо цитоплазматических органелл. Мембранные пузырьки, присутствующие в цитоплазме жгутикового кармана, отличаются большим размером (0.2 — 0,3 мкм), чем в области аппарата Гольджи. Они могут быть округлой или неправильной формы, часть из них имеет электронопрозрачное содержимое, в составе некоторых присутствует тонкофибриллярная компонента (Рис. 30).

Форма жгутикового кармана неправильная, часто его наружная мембрана контактирует с наружной мембраной клеток эмбриональной капсулы. Аппарат Гольджи представлен двумя комплексами, расположенными в околоядерной цитоплазме. Они локализованы выше «ядерного экватора», в непосредственной близости от корешков, отходящих от базального тела жгутика. Цистерны его ориентированы параллельно ядерной мембране. Аппарат Гольджи состоит из 6-7 цистерн. Длина их составляет 1,5 — 2 мкм. Часть цистерн имеет электроноплотное содержимое. В цитоплазме, окружающей аппарат Гольджи содержится большое количество мембранных пузырьков с содержимым различной электронной плотности. Пузырьки сконцентрированы вокруг аппарата Гольджи, и плотность их резко падает на границе с цитоплазмой жгутикового кармана (Рис. 30; 31В).

Митохондрии многочисленны и локализованы во всех частях клеточной цитоплазмы. Их можно обнаружить в околоядерной цитоплазме и между желточными гранулами. Они округлой или вытянутой формы, матрикс имеет тонкофибриллярную структуру (Рис. 30).

Многочисленные цистерны гранулярного эндоплазматического ретикулума располагаются в средней и базальной частях цитоплазмы клеток. Образование гЭПР происходит на наружной ядерной мембране.

Цитоплазма, располагающаяся под ядром, заполнена желточными гранулами. Их диаметр составляет 0,5 — 1 мкм. Содержимое большинства гранул на этой стадии отличается низкой структурированностью. Компоненты, входящие в состав гранул, незначительно отличаются по своей электронной плотности. Участи гранул не выявляется наружная мембрана. От их поверхности отходит тонковолокнистый электроноплотный материал.

В пространстве между зародышем и эмбриональной капсулой обнаруживаются многочисленные поперечные срезы жгутиковых аксонем. Наружная мембрана жгутика в области жгутикового кармана покрыта слоем гликокаликса, высота которого составляет -0,13 мкм. Гликокаликсом также покрыта поверхностная мембрана жгутикового кармана (Рис. 30, 32).

Поверхностная мембрана наружных клеток имеет три компартмента: апикальная поверхностная мембрана, покрывающая жгутиковый карман и аксонему жгутика, латеральная мембрана клеток и базальный компартмент наружной клеточной мембраны.

Как уже говорилось выше, апикальная мембрана покрыта гликокаликсом. Она осуществляет взаимодействие с клетками эмбриональной капсулы и первая вступает в контакт с материнскими гранулярными амебоцитами. Площадь контакта зародыша с эмбриональной капсулой значительно сокращается в сравнении с предыдущими этапами развития. Минимальная ширина межмембранного пространства составляет -13 нм (Рис. 32). (Часто в межмембранном пространстве можно видеть поперечные электроноплотные мостики, образованные, вероятно, гликокаликсом поверхностной мембраны наружных клеток зародыша. )Латеральный мембранный компартмент осуществляет взаимодействие наружных клеток зародыша. Каждая наружная клетка контактирует с шестью соседними клетками (гексагональные поперечные срезы). В апикальной части латеральные мембраны образуют опоясывающую область адгезии (Рис. ЗЗА). Ее протяженность может увеличиваться за счет интердигитаций мембран соседних клеток в этой области. Мембраны соседних клеток в зоне адгезии имеют строго параллельную ориентацию. Ширина межмембранного пространства составляет —12-15 нм. Со стороны цитоплазмы к внутренней мембране подходит электроноплотный фибриллярный материал. В межклеточном пространстве в зоне опоясывающей адгезии присутствует электроноплотный материал, иногда на электронограммах можно видеть электроноплотные мостики, перпендикулярные клеточным мембранам. Стабильной картины их положения, периодичности в их распределении, не выявлено.

Ниже зоны адгезии латеральные мембраны могут иметь более или менее выраженные неровные очертания (Рис. ЗЗБ, В).

Наружная мембрана базального клеточного компартмента обращена в полость зародыша. Она образует многочисленные филоподии, диаметр которых составляет в среднем 0,1 мкм (Рис. ЗЗБ, В).

На электронограммах наружного слоя жгутиковых клеток иногда можно обнаружить клетки, ядра которых располагаются в средней или базальной части пласта (Рис. 34). Хроматин имеет тонкогранулярную структуру. Ядра (2,5x6 мкм) содержат ядрышки (1,2 мкм). В околоядерной цитоплазме находится аппарат Гольджи, представленный двумя комплексами. Локализация их относительно апикобазальной оси клетки различна, но, как правило, они находятся на противоположных сторонах ядра, чуть ниже его заостренного участка. Цистерны аппарата Гольджи ориентированы параллельно ядерной мембране, состоят из 6-7 цистерн, часть из которых имеет электроноплотное содержимое. Сами клетки имеют вытянутую цилиндрическую или веретеновидную форму, длинная ось клетки параллельна длинной оси наружных жгутиковых клеток. Основной объём цитоплазмы заполнен желточными гранулами, размер которых составляет 1 — 2 мкм. Их содержимое структурировано в той же степени, что и содержимое желточных гранул наружных жгутиковых клеток. В цитоплазме между желточными гранулами присутствует гранулярный эндоплазматический ретикулум и митохондрии (Рис. 34).

Внутренние амебоидные клетки зародыша на этой стадии представлены двумя типами: это ядрышковые амебоциты и частично дедифференцированные жгутиковые клетки (Рис. ЗЗБ, 34,35).

Ядрышковые амебоциты имеют ядро с ядрышком. Ядро округлой, овальной или слабо выраженной лопастной формы. Диаметр его составляет 3 — 4 мкм. Оно может находиться в различных частях цитоплазмы (чаще в центральной её части). Хроматин имеет тонкогранулярную структуру. Поверхность ядрышка имеет неровные очертания, в нем присутствуют поры. В ядрышках выявляется гранулярная и фибриллярная компоненты. Диаметр его составляет 1,3 мкм. Аппарат Гольджи находится в околоядерной цитоплазме, состоит из 6-7 цистерн, ориентированных параллельно ядерной поверхности. Часть из них заполнена электроноплотным содержимым. Вокруг него локализовано большое количество мембранных пузырьков с содержимым различной электронной плотности (Рис. ЗЗБ, 35А).

В цитоплазме присутствует значительное количество митохондрий. Они округлой формы, имеют тонкофибриллярный матрикс. Диаметр их составляет -0,5 мкм.

Цистерны гранулярного эндоплазматического ретикулума обнаруживаются во всех районах цитоплазмы.

Желточные гранулы структурированы слабее, чем на начальных этапах эмбрионального развития. Часть гранул имеет гомогенное электроноплотное содержимое.

Частично дедифференцированные жгутиковые клетки имеют амебоидную формой и обнаруживаются, в основном, в основании наружных клеток и вблизи внутренней жгутиковой камеры (если таковая имеется). Отличительной особенностью этих клеток, в сравнении с ядрышковыми амебоцитами, является распределение цитоплазматических компонентов, которое характеризует эти клетки как поляризованные. Ядро локализовано под поверхностной мембраной. Как правило, оно имеет каплевидную форму, причем его заостренный конец может изгибаться под различными углами. Ядро в расширенной части имеет диаметр 3 мкм, содержит ядрышко. Хроматин тонкогранулярной структуры. Поверхность ядрышка неровная. В нем выявляется гранулярная и электроноплотная фибриллярная компоненты (Рис. 34, 35Б, В).

Над заостренным участком ядра располагается центриоль, имеющая некоторые морфологические характеристики, свойственные жгутиковой центриоли наружных клеток зародыша. Диаметр составляет 0,2 мкм, высота -0,35 мкм. Под поверхностной мембраной находится слой переходных фибрилл 0.6 мкм в диаметре. Часто в полости зародыша можно найти клетки, у которых присутствует жгутиковая аксонема. Иногда морфологически выражен жгутиковый карман, окружающий основание жгутика.

Аппарат Гольджи представлен двумя комплексами, располагающимися в околоядерной цитоплазме. Как правило, он располагаются ниже заостренного ядерного выступа. В составе комплексов насчитывается 6-7 цистерн, часть из которых заполнена электроноплотным содержимым. Вокруг комплексов Гольджи сосредоточено значительное количество мембранных пузырьков, имеющих содержимое разной электронной плотности (Рис. 35В).

Митохондрии довольно многочисленны и локализованы во всех частях цитоплазмы. Они округлой формы (0,5 мкм.), имеют тонкофибриллярный матрикс.

Основная часть желточных гранул располагается в цитоплазме клетки, противоположной местонахождению ядра.

Во внутренней полости некоторых зародышей присутствуют замкнутые камеры, образованные жгутиковыми клетками и более или менее глубокие инвагинации наружного жгутикового слоя зародыша (Рис. 36). Жгутиковые клетки камер поляризованы в апикобазальном направлении, апикальная их часть направлена в полость камеры, а базальная — в полость зародыша. Форма клеток, и соответственно их размеры могут варьировать. Пласт клеток, составляющий камеру, может иметь признаки анархизации: часть клеток теряет цилиндрическую форму, принимая амебоидную форму. Часть клеток может выходить из состава пласта и погружаться в полость зародыша.

Жгутиковые клетки внутренних камер имеют ядро с ядрышком, расположенное в апикальной части цитоплазмы. Форма ядер варьирует у клеток в составе одной камеры. Они могут иметь каплевидную форму, заостренный участок ядра может занимать различное положение. Ядра могут образовывать незначительные лопасти, длинная ось части ядер направлена перпендикулярно апикобазальной оси клеток (Рис. 36).

Хроматин в ядре имеет тонкогранулярную структуру. Участки конденсированного гетерохроматина присутствуют в различных частях ядра, в т. ч. и у внутренней ядерной мембраны. Ядрышко (1,3 мкм.) имеет неровную поверхность, в нем обнаруживается гранулярная и электроноплотная фибриллярная компоненты. Над заостренной частью ядра находится базальное тело жгутика. От него в полость камеры отходит жгутик (Рис. 36). Аппарат Гольджи представлен двумя комплексами, располагающимися в околоядерной цитоплазме. Они состоят из 6-7 цистерн, ориентированных параллельно ядерной поверхности. Часть из них имеет электроноплотное содержимое. В цитоплазме, окружающей аппарат Гольджи, локализовано большое количество мембранных пузырьков, имеющих содержимое различной электронной плотности.

Апикальная часть клетки образует цитоплазмэтический карман, окружающий основание жгутика. Очертания мембранных лопастей могут быть неровными, глубина кармана варьирует. Наружная мембрана жгутикового кармана, и мембрана жгутика покрыта гликокаликсом. Высота его слоя на жгутиковой мембране составляет 0,1 мкм, а на мембране жгутикового кармана 0,13 мкм.

Многочисленные митохондрии можно обнаружить во всех участках цитоплазмы, за исключением цитоплазмы жгутикового кармана. Они округлой формы и имеют тонкофибриллярный матрикс.

В цитоплазме клеток ниже ядра располагается большое количество желточных гранул. Их размеры составляют 1 - 2 мкм. Их содержимое менее структурировано, чем на начальных этапах эмбриогенеза, часть гранул имеет гомогенное электроноплотное содержимое (Рис. 36).

В цитоплазме между желточными гранулами присутствует гранулярный эндоплазматический ретикулум.

В полости камеры видны многочисленные срезы жгутиков, встречаются единичные симбиотические бактерии (Рис. 36).

Жгутиковые клетки в составе камеры имеют три различающихся компартмента наружной мембраны. Апикальный компартмент, о котором говорилось выше, покрывает аксонему жгутика и жгутиковый карман. Латеральный компартмент реализует связь соседних клеток в составе камеры. В апикальной части латерального компартмента часто обнаруживается опоясывающая зона адгезии. Она отсутствует при выраженной анархизации пласта жгутиковых клеток. Базальнее зоны опоясывающей адгезии мембраны имеют неровные очертания.

Базальный компартмент наружной мембраны обращен в полость зародыша. Мембрана здесь имеет неровные очертания, образует лобоподии. В этой области осуществляется непосредственный контакт с амебоидными клетками внутренней полости зародыша путём образования значительных областей мембранного прилегания. Минимальное расстояние между мембранами в этом случае составляет 12 нм.

В полости зародыша, в межклеточном пространстве, присутствует большое количество симбиотических бактерий одного морфологического типа. Бактерии присутствуют также в составе вакуолей, которые можно обнаружить в различных частях цитоплазмы зародышевых клеток.

В полости предличинок не выявлено наличие какого-либо фибриллярного межклеточного матрикса.

В составе предличинок, помимо собственно клеток зародыша, присутствуют амебоидные клетки материнского происхождения — гранулярные амебоциты. На электронограммах можно видеть, что они проникают в зародыш между клетками эмбриональной капсулы (Рис. 37Б). На стадии 1000 кл.обнаруживается незначительное число этих клеток в составе зародышей. В ходе дальнейшего эмбрионального развития число материнских клеток в составе зародышей возрастает. Они обнаруживаются непосредственно под клетками эмбриональной капсулы, между наружными жгутиковыми клетками зародыша и во внутренней полости, где материнские клетки находятся среди амебоидных клеток внутренней полости (Рис. 37, 38, 39).

На основании ультраструктурных особенностей мы выделяем две категории материнских гранулярных амебоцитов, находящихся в составе зародышей.

1. Клетки имеют амебоидную форму (Рис. 37А, 38). Ядро округлое, его размер составляет -2,6 мкм. Хроматин гранулярный, характеризуется высокой плотностью в ядре. В ядре имеется ядрышко (-1,5 мкм), его поверхность неровная, в нем выявляется гранулярная и фибриллярная компоненты.

Значительное количество митохондрий присутствует во всех участках цитоплазмы этих клеток. Они округлой или вытянутой формы, их размер варьирует в пределах 0,5 - 0,7 мкм. Матрикс имеет тонкофибриллярную структуру. В цитоплазме присутствуют цистерны гранулярного эндоплазматического ретикулума. Аппарат Гольджи локализован в околоядерной цитоплазме клеток. Он состоит из 5-6 цистерн, заполненных электроноплотным содержимым. Во всех частях цитоплазмы обнаруживается большое количество мембранных пузырьков различной формы с содержимым разной электронной плотности.

Несколько типов специфических включений в цитоплазме характерно для эозинофильных амебоцитов. Первый тип: округлые или эллипсовидные электроноплотные гранулы, размер которых варьирует в пределах 0,5 — 1,3 мкм, окруженные одиночной мембраной (вакуолярные включения). В пределах одной вакуоли чаще всего находится одна гранула, реже несколько (до десяти). Гранулы имеют нечеткие очертания, в полость вакуоли от них отходит более или менее выраженный тонкофибриллярный и мелкогранулярный материал. Расстояние между электроноплотным материалом гранул и мембраной вакуоли варьирует в пределах 0,1 — 1 мкм. Второй тип гранул характеризуется электроноллотными мелкогранулярными включениями, равномерно распределенными по всему объему вакуоли. Диаметр вакуолей с такого рода включениями может варьировать в пределах 1,5 — 2 мкм. Для третьего типа характерны включения электроноплотного тонкогранулярного материала не окруженного мембраной. Ихформа может быть различной. Размер составляет 0,7 — 1 мкм. В одной клетке одновременно могут находиться все три типа включений (Рис. 37А, 38). Клетки описанной категории присутствуют в мезохиле материнской губки (окружающем зародыш мезохиле), под эмбриональной капсулой и в различных частях самого зародыша.

2. Вторая категория материнских амебоцитов имеет следующие ультраструктурные характеристики (Рис. 39). Ядро клеток округлое, хроматин ядра сильно конденсирован. В электронопрозрачной нуклеоплазме хроматин присутствует в виде плотных электроноплотных гранул. Цитоплазма клетки сильно вакуолизирована и характеризуется высокой электронной плотностью. В ней не удаётся обнаружить каких-либо цитоплазматических органелл. Специфические включения трёх типов, присутствующие у клеток первой категории также имеются в цитоплазме клеток второй (описываемой) категории. Электроноплотные гранулы (тип 1) уменьшаются в размерах, вакуолизируются или распадаются на фрагменты. В некоторых клетках такого рода гранулы в вакуолях отсутствуют (Рис. 39Б).

Клетки этой категории обнаруживаются в мезохиле материнской губки (в окружающем зародыш мезохиле), под эмбриональной капсулой, и в составе зародыша, в различных его частях.

Материнские эозинофильные амебоциты контактируют с клетками зародыша и с клетками эмбриональной капсулы. Они образуют обширные зоны мембранного прилегания. Расстояние между наружными мембранами материнских амебоцитов и клеток зародыша и эмбриональной капсулы в зонах прилегания составляет -12 — 15 нм (Рис. 39В).

Свободноплавающая личинка.

Личинки НаШагса (IгдагсИт состоят из наружных жгутиковых клеток, окружающих полость. Три типа наружных жгутиковых клеток составляют поверхностный слой: клетки передней полусферы личинки, клетки на заднем полюсе и переходные клетки, расположенные на границе первых двух типов. В полости личинки присутствуют три типа амебоидных клеток 6 ядрышковые амебоциты, частично дедифференцированные жгутиковые клетки и гранулярные амебоциты материнского происхождения. Последние могут располагаться не только в полости, но и между наружными жгутиковыми клетками. Удисферульных личинок в полости присутствует замкнутая камера, образованная жгутиковыми клетками.

Поверхностные жгутиковые клетки передней полусферы личинки имеют почти цилиндрическую форму и характеризуются четкой апикобазальной полярностью, которая выражается в локализации клеточных органелл и желточных гранул (Рис. 40А). Длина клеток составляет от 35 до 45 мкм, ширина в зоне ядра 2,6 - 3 мкм. В верхней части клетки располагается вытянутое ядро с заостренной апикальной частью (2,4 х 6,6 мкм). В ядрах жгутиковых клеток обычно содержится одно, реже два ядрышка. Хроматин имеет тонкогранулярную и фибриллярную составляющие, в его составе выявляются районы конденсированного гетерохроматина, В верхней части околоядерной цитоплазмы локализован аппарат Гольджи, состоящий из 6-7 цистерн, ориентированных параллельно ядерной мембране. Вокруг аппарата Гольджи локализованы многочисленные пузырьки с содержимым различной электронной плотности. Большое количество пузырьков (0,12 - 0,2 мкм диаметром) локализовано в области цитоплазмы, находящейся между аппаратом Гольджи и основанием жгутикового кармана (Рис. 40Б, В). Непосредственно над апикальной частью ядра расположено базальное тело жгутика. Жгутиковая центриоль имеет длину 0,4 мкм, диаметр 0,2 мкм. Рядом локализована добавочная (безжгутиковая) центриоль. От жгутиковой центриоли отходит пара корешков, состоящих из плотного тонкофибриллярного материала. Их длина составляет 3 мкм. Поперечной исчерченности не выявляется (Рис. 40Б). Они опускаются параллельно наружной поверхности ядра. В проксимальной части жгутиковой центриоли, под поверхностной мембраной, находится слой переходных фибрилл, диаметр кольца которых составляет 0,6 мкм. (Рис. 40В). Основание жгутика погружено в карманообразное впячивание апикальной цитоплазмы (жгутиковый карман) диаметром около 1,1 мкм и глубиной около 10 мкм. Наружная мембрана жгутика в этой зоне покрыта слоем гликокаликса, высота слоя которого составляет 0,13 мкм (Рис. 40В). Поверхностная мембрана жгутикового кармана также покрыта гликокаликсом.

Цитоплазма, входящая в состав жгутикового кармана, не содержит клеточных органелл. В ней локализовано лишь небольшое количество пузырьков с электронопрозрачнымым или тонкофибриллярным содержимым (от 0,08 до 0,39 мкм диаметром) (Рис. 40А-В).

Многочисленные митохондрии с тонкофибриллярным матриксом обнаруживаются в различных участках цитоплазмы клетки. Они имеют округлую или вытянутую форму, диаметр их составляет 0,5 мкм.

В средней и базальной частях жгутиковых клеток присутствуют желточные гранулы, максимальный размер которых достигает 2 мкм (Рис. 40Г). Большая часть желточных гранул имеет малоструктурированное (практически гомогенное) электроноплотное содержимое. В этой области цитоплазмы, между желточными гранулами, можно видеть многочисленные цистерны гЭПР (рис. 40А). Они часто располагаются концентрическими кругами вокруг желточных гранул, что можно видеть на поперечных срезах жгутиковых клеток.

Поверхностная мембрана наружных клеток имеет три различающихся компартмента. Апикальный мембранный компартмент входит в состав жгутикового кармана и покрывает аксонему жгутика. У плавающей личинки эта часть поверхностной мембраны осуществляет взаимодействие с окружающей средой. Латеральный компартмент ответственен за взаимодействие клеток в составе пласта. Каждая клетка вступает в непосредственный контакт с шестью соседними клетками (Рис. 41 Б). Апикальные части латеральных мембран наружных клеток связывает опоясывающая зона адгезии (Рис. 41 А). Её длина может существенно варьировать за счет интердигитаций мембран соседних клеток в этой области. Глубина интердигитаций варьирует от 0,5 до 1,8 мкм, а диаметр в основании 0,2 - 0,5 мкм. Мембраны соседних клеток в этой области ориентированы строго параллельно друг другу. Ширина межмембранного пространства составляет 12 нм. К внутренней стороне мембраны в этой области подходит электроноплотный тонкофибриллярный материал. В межмембранном пространстве присутствуют поперечные электроноплотные мостики, ориентированные перпендикулярно мембранам клеток (Рис. 41 А). Материал в межклеточном пространстве зоны адгезии связывает рутениевый красный и альциановый синий - специфические красители кислых мукополисахаридов, выполняющие также роль электроноплотных трейсеров.

Латеральные мембраны ниже зоны адгезии могут проходить параллельно или иметь неровные очертания. В межклеточном пространстве выявляется присутствие редкого тонкофибриллярного электроноплотного материала (Рис. 41 А, В).

Базальные части наружных жгутиковых клеток имеют неровные очертания, мембрана формирует многочисленные филоподии (Рис. 41В). Подслоем наружных жгутиковых клеток обнаруживается большое количество клеточных фрагментов - заключенные в мембрану фрагменты цитоплазмы с желточными гранулами.

Фибриллярного внеклеточного матрикса у личинок изучаемого вида не обнаружено.

Между покровными клетками личинки, образующими переднюю и латеральную поверхности, встречаются веретеновидные или цилиндрические клетки, ядро которых может располагаться на разных уровнях относительно апикобазальной оси наружных жгутиковых клеток (Рис. 42Б). Ядра этих клеток (2,5Х6,5 мкм.) имеют каплевидную форму, заостренный выступ может изгибаться под различными углами к поверхности ядра. В ядре содержится ядрышко (1,3 мкм.), хроматин имеет тонкогранулярную структуру, присутствуют гетерохроматиновые районы. Поверхность ядрышка имеет неровные очертания, в его составе выявляется гранулярная и электроноплотная фибриллярная компоненты.

В околоядерной цитоплазме локализован аппарат Гольджи, представленный двумя комплексами, располагающимися несколько ниже заостренного выступа ядра. Комплексы состоят из 6-7 цистерн, ориентированных параллельно ядерной мембране. Часть из них имеет электроноплотное содержимое.

В цитоплазме этих клеток присутствуют многочисленные митохондрии округлой формы. Их размер составляет 0,5 мкм. Желточные гранулы занимают остальной объём цитоплазмы. Содержимое желточных гранул мало структурировано, некоторые гранулы имеют гомогенное электроноплотное содержимое.

В цитоплазме между желточными гранулами присутствуют цистерныгЭПР.

Переходные жгутиковые клетки (Рис. 42Г) по ультраструктуре сходны с описанными выше жгутиковыми клетками передней полусферы личинки. Будучи локализованными в различных участках переходной зоны эти клетки могут отличаться длиной апикобазальной оси (30 - 20 мкм), шириной в районе ядра (4 — 7 мкм.). У переходных клеток, располагающихся в непосредственной близости к клеткам заднего полюса, как и у клеток заднего полюса, может быть менее выражено карманообразное впячивание цитоплазмы, окружающее основание жгута, чем у жгутиковых клеток передней полусферы. Его глубина составляет 1 —2 мкм. На продольном срезе количество переходных клеток не превышает 4-5 справа и слева от клеток заднего полюса.

Жгутиковые клетки заднего полюса (Рис. 42В) отличаются по форме у разных личинок (Рис. 9). Они могут иметь клиновидную или кубическую форму. Длина их составляет около 6 — 10 мкм, ширина в районе ядра - 6-7 мкм. Ядро округлой или каплевидной формы, около 5,3x4,2ц в диаметре с небольшим апикальным заостренным выступом; хроматин имеет гранулярную и фибриллярную составляющие, имеется ядрышко (около 1,6ц диаметром). В ядрышке выявляется гранулярная и фибриллярная компоненты. Над заострённым ядерным выступом находится базальное тело жгутика. От него в глубь клетки отходит пара корешков, лежащих параллельно ядерной мембране. Их длина составляет 2 мкм. Они состоят из плотного тонкофибриллярного материала. Поперечной исчерченности не выявляется. В апикальной части жгутиковой кинетосомы, под поверхностной мембраной находится слой переходных фибрилл. Жгутик несколько длиннее, чем у антеро-латеральных клеток и составляет около 14мкм.

Карманообразное впячивание (жгутиковый карман), окружающее основание жгутика значительно меньше по глубине, чем у жгутиковых клеток передней полусферы личинки, и составляет 1 - 2 мкм.

Аппарат Гольджи состоит из 5-6 цистерн, располагающихся в околоядерной цитоплазме и ориентированных параллельно ядерной поверхности. Часть цистерн имеет электроноплотное содержимое. Большое количество мембранных пузырьков с содержимым различной электронной плотности содержится в цитоплазме, окружающей аппарат Гольджи.

Округлые или вытянутые митохондрии с тонкофибриллярным матриксом располагаются в различных частях цитоплазмы. В клетках присутствует большое количество цистерн гранулярного эндоплазматического ретикулума.

В цитоплазме этих клеток содержится значительное количество желточных гранул, максимальный диаметр которых составляет 2 мкм. Их содержимое мало структурировано, часть гранул имеют гомогенную электроноплотную структуру. Чаще всего не удаётся выявить поверхностной мембраны желточных гранул.

Наружная мембрана клеток заднего полюса, также как и у клеток передней полусферы, имеет три компартмента. Зоны опоясывающей адгезии связывают апикальные части латеральных мембран (Рис. 46А, В) Особенностью клеток заднего полюса является формирование на апикальной мембране микроворсинок,длина которых может достигать 1 мкм (Рис. 46В). Замечено, что их формирование происходит непосредственно перед оседанием личинки, в то время как она начинает исследовать субстрат, на котором претерпевает метаморфоз. Жгутиковые клетки, составляющие внутреннюю камеру личинки. Форма этих клеток различна у разных личинок и зависит от их числа в составе камеры и от формы самой жгутиковой камеры. Они характеризуются или клиновидной формой с расширенной базальной частью, или цилиндрической формой, как и наружные жгутиковые клетки передней полусферы. Апикальная часть клеток направлена в просвет камеры, базальная часть — во внутреннюю полость личинки. Длина клеток варьирует от 13,8 до 17,2 мкм, ширина - от 3,4 мкм в апикальной части до 5,7 мкм в базальной.

В районе апикальной части цитоплазмы располагается ядро каплевидной формы. Его размеры составляют —2,7x6,7 мкм. Хроматин имеет тонкогранулярную и фибриллярную составляющие, в его составе присутствуют участки конденсированного гетерохроматина. В ядре имеется ядрышко, размеры которого составляют -1,3 мкм. Оно имеет неровную поверхность, в нем выделяется гранулярная и фибриллярная компоненты (Рис. 43 А).

Над заостренным ядерным выступом находится базальное тело жгутика, от которого отходит пара фибриллярных корешков (Рис. 43Б). Его диаметр составляет 0,2 мкм, высота -0,4 мкм. В проксимальной его части, под поверхностной мембраной, имеется слой переходных фибрилл. От базального тела отходит аксонема жгутика. В полости камеры видны многочисленные срезы жгутиков. Основание жгутика погружено в карманообразное впячивание цитоплазмы — жгутиковый карман, глубина и форма которого существенно варьируют.

Аппарат Гольджи представлен двумя комплексами, расположенными в околоядерной цитоплазме ниже заостренного ядерного выступа. Комплексы состоят из 5-6 цистерн, ориентированных параллельно ядерной мембране. Часть цистерн имеет электроноплотное содержимое. В цитоплазме, окружающей аппарат Гольджи содержится большое количество мембранных пузырьков (0,05 — 0,1 мкм в диаметре), имеющих содержимое различной электронной плотности. В отличие от наружных жгутиковых клеток, достаточно большое количество пузырьков располагается в цитоплазме жгутикового кармана (нет четкой границы между цитоплазмой жгутикового кармана, электронопрозрачной с незначительным количеством крупных пузырьков и нижележащей цитоплазмой, свысокой плотностью мембранных пузырьков, окружающих аппарат Гольджи, как это наблюдается у наружных жгутиковых клеток).

Митохондрии округлой или вытянутой формы с тонкофибриллярным матриксом располагаются во всех участках цитоплазмы клеток, в том числе и в цитоплазме жгутикового кармана.

В цитоплазме, расположенной под ядром, присутствуют желточные гранулы, максимальный размер которых составляет 2 мкм. Они слабо структурированы, часто имеют практически гомогенное электроноплотное содержимое. У большинства гранул нам не удаётся выявить наружной мембраны. Большое число гранул имеют неровную поверхность.

Цитоплазма между гранулами заполнена большим количеством рибосом игЭПР.

Наружная мембрана жгутиковых клеток внутренней камеры имеет три компартмента. Апикальная мембрана входит в состав жгутикового кармана и покрывает аксонему жгутика. Наружная мембрана жгутика в области жгутикового кармана покрыта слоем гликокаликса (Рис. 43Б).

В апикальной зоне латерального мембранного компартмента опоясывающую зону адгезии удаётся выявить не у всех клеток. Часто в этой области наблюдается неглубокие интердигитации мембран соседних клеток. Ниже лежащие области латеральных мембран имеют неровные, извилистые очертания. Базальные концы клеток имеют неровные очертания и образуют лобоподии. Они контактируют с амебоидными клетками внутренней полости личинки, большие число которых имеет морфологические признаки частично дедифференцированных жгутиковых клеток (Рис. 43А).

В полости присутствует неструктурированный рыхлый материал средней электронной плотности (Рис. 43Б). Кроме того, в полости внутренней жгутиковой камеры могут находиться единичные симбиотические бактерии. У некоторых личинок в полости камеры можно увидеть одну, редко - две, амебоидные клетки. Ультраструктурные картины показывают, что это могут быть в одних случаях материнские гранулярные амебоциты, в других случаях ультраструктура этих клеток аналогична ядрышковым амебоцитам (дедифференцированным жгутиковым клеткам).

Амебоидные клетки в полости плавающей личинки.

Среди амебоидных клеток, находящихся в полости плавающей личинки мы выделяем две категории собственно личиночных клеток - частичнодедифференцированные жгутиковые клетки и ядрышковые амебоциты. Кроме них в полости присутствует значительное количество материнских гранулярных амебоцитов (Рис. 44).

Форма и ультраструктура частично дедифференцированных жгутиковых клеток несколько различаются, что зависит от степени их дедифференцировки. У некоторых внутренних клеток личинки ядро (Зх5мкм) имеет каплевидную форму (Рис. 44В, Г). Заостренный выступ ядра может изгибаться под различным углом к поверхности ядра. Хроматин имеет гранулярную и фибриллярную составляющие, в нём присутствуют участки конденсированного герерохроматина. В ядре присутствует ядрышко (1,3 мкм.). Оно имеет неровную поверхность, в нем выявляется гранулярная и фибриллярная компоненты. Непосредственно над заостренным ядерным выступом (связанные с ним) локализуются центриоли, одна из которых может сохранять некоторые структуры, характерные для базального тела. Иногда она сохраняет связь с наружной мембраной, и тогда на электронограммах мы видим слой переходных фибрилл, и отходящую от базального тела аксонему жгутика. На наружной мембране клетки и жгутика может присутствовать гликокаликс, высота слоя которого составляет 0,1 мкм. В межклеточных пространствах обнаруживаются срезы жгутиковых аксонем. Аксонемы жгутиков могут быть втянутыми в клетку, образуя глубокие впячивания цитоплазмы, ограниченные наружной клеточной мембраной.

В околоядерной цитоплазме локализован аппарат Гольджи, представленный двумя комплексами цистерн. Они локализованы под заострённым выступом ядра, ориентированы параллельно ядерной мембране. Комплексы состоят из 5-6 цистерн, часть из которых содержит электроноплотный материал.

В цитоплазме этих клеток присутствуют немногочисленные желточные гранулы, содержимое которых низко структурировано или гомогенно. У желточных гранул не выявляется наружная мембрана, часто они могут иметь неровную поверхность.

Многочисленные рибосомы и гЭПР присутствуют во всех районах цитоплазмы.

Митохондрии округлой или овальной формы многочисленны и распределены по всему объему цитоплазмы.

Вторая категория внутренних клеток - ядрышковые амебоциты (Рис. 44А). Это клетки амебоидной формы, имеют округлое ядро диаметром около 3 мкм,содержащее ядрышко (1,4 мкм). Хроматин имеет гранулярную и фибриллярную составляющие. В его составе выявляются участки конденсированного гетерохроматина, в т. ч. у внутренней ядерной мембраны. Поверхность ядрышка имеет неровные очертания. На электронограммах в нём выявляется гранулярная и фибриллярная компоненты.

В околоядерной цитоплазме присутствует аппарат Гольджи. Он состоит из 5-6 цистерн, ориентированных параллельно ядерной мембране. Часть цистерн имеет электроноплотное содержимое. Вокруг аппарата Гольджи находятся мембранные пузырьки с содержимым различной электронной плотности.

В цитоплазме клеток присутствуют цистерны гЭПР и свободные рибосомы.

Митохондрии округлой или овальной формы присутствуют во всех участках цитоплазмы.

В различных частях ядрышковых амебоцитов локализованы желточные гранулы (1,5 - 2 мкм), содержимое которых мало структурировано. Часто гранулы имеют практически гомогенную электроноплотную структуру, у них не выявляется поверхностная мембрана, многие гранулы характеризуются неправильной формой.

Материнские гранулярные амебоциты (Рис. 44Г).

Гранулярные амебоциты можно наблюдать в различных частях плавающей личинки, как между наружными жгутиковыми клетками, так и среди внутренних клеток личинки. Часто скопление этих клеток обнаруживается у заднего полюса личинки.

Ультраструктурные особенности материнских гранулярных амебоцитов аналогичны описанным нами выше на стадии предличинки. Так же, как и в предличинке, в составе плавающей личинки присутствует две категории этих клеток.

В полости плавающей личинки отсутствует фибриллярный межклеточный матрикс коллагеновой природы. Значительное число симбиотических бактерий спиралевидной формы, относящихся к одному морфологическому типу, присутствует в межклеточных пространствах полости и в вакуолях внутренних и наружных клеток (причем структура их в составе вакуолей остается интактной) (Рис. 44А, Б).

Метаморфоз.

1. Субстрат. В настоящей работе исследование метаморфоза производилось на натуральном субстрате - бурой водоросли Fucus vesiculosus, талломы которой уже были заселены губками изучаемого вида. На поверхности таллома присутствует бактериальная пленка, с которой входят в непосредственный контакт клетки личинки при прикреплении и клетки, расположенные в основании конгломерата куколки (Рис. ИВ; 51Б; 59Б, Г). Картины с трансмиссионного и сканирующего режима электронного микроскопа показывают, что толщина пленки варьирует в пределах 1-5 мкм. В составе пленки доминируют бактерии одного морфологического типа (-40 мкм.), имеющие форму эллипсоида. Реже встречаются палочковидные бактерии. На поверхности плёнки (границе фаз) выявляется электроноплотная «мембрана».

2. Оседание личинки. Ультраструктурное исследование этой стадии проводилось на личинках через 15-25 минут после контакта с субстратом. Часть личинок в этот период удаётся фиксировать вместе с субстратом, хотя адгезия к субстрату очень низкая и подавляющее большинство личинок при переносе в фиксатор теряют связь с субстратом (отрываются от него).

Жгутиковые клетки переднего полюса личинки вступают в контакт с субстратом первыми. Контакт осуществляется наружными мембранами жгутикового кармана. Жгутиковый карман деформируется, происходит распластывание покрывающих его мембран по поверхности субстрата. Латеральные мембраны наружных клеток, контактирующих с субстратом, имеют неровные, волнистые очертания. В апикальных частях клеток обнаруживаются опоясывающие контакты. От личиночных зон адгезии их отличает то, что мембраны обеих клеток, по-прежнему сохраняющие строго параллельную взаимную ориентацию в этой области, могут иметь волнистые очертания. В этих зонах также обнаруживаются интердигитации мембран соседних клеток. Наружные клетки на начальных этапах прикрепления сохраняют жгутики (Рис. 10А, Б; рис. 45).

Наружные клетки заднего полюса занимают противоположную от субстрата позицию. На электронограммах видно, что апикальные части клеток изменяют свою форму. Они растягиваются параллельно поверхности личинки, на них появляются нерегулярные микроворсинки —1 мкм высотой (Рис. 46В). Жгутиковый карман практически исчезает, в этой области может сохранятьсянезначительное углубление цитоплазмы глубиной до 1 - 0,5 мкм. Клетки на этом этапе имеют жгутики (Рис. 10А, Б; Рис. 46).

В апикальных частях латеральных мембран клеток заднего полюса имеется опоясывающая зона адгезии, в которой происходит связывание альцианового синего и рутениевого красного. Её протяженность составляет 0,5 — 0,7 мкм. Ультраструктурная характеристика этих зон соответствует таковой у плавающих личинок (Рис. 46А, В). Над клетками заднего полюса обнаруживается слой внеклеточного материала, вероятно слизистой природы, толщина которого составляет -0,01 мкм (Рис. 11 А; рис. 46Б).

Наружные жгутиковые клетки латеральной поверхности оседающей (прикрепляющейся) личинки сохраняют свои характеристики, свойственные для них у плавающей личинки.

3. Формирование экзопинакодермы и дифференцировка экзопинакоцитов.

Первые клетки, морфологическую дифференцировку которых можно наблюдать после оседания личинки, являются экзопинакоциты. Через 40 минут -1 час после начала прикрепления личинки к субстрату (в момент, когда вращение личинки вокруг переднезадней оси заканчивается) её поверхность оказывается покрыта первичными экзопинакоцитами. Эти клетки подразделяются на три морфологических и функциональных компартмента. Тело клетки, в котором содержится ядро, находится во внутренней части осевшей личинки, первичная апикальная пластинка, и цитоплазматический стебелек, соединяющий первые две части. Экзопинакоциты возникают в результате трансдифференцировки наружных жгутиковых клеток задней полусферы личинки. Формирование экзопинакодермы начинается на заднем полюсе личинки (апикальная часть ювенила) и распространяется по направлению к субстрату (Рис. 46А, В). Трансдифференцировка заключается в перераспределении клеточных органелл и изменении формы самих клеток. При этом клетки остаются связанными опоясывающими зонами адгезии. Ядро опускается в базальную цитоплазму клетки, апикальная часть жгутиковых клеток формирует пластинку Т-образного экзопинакоцита (сх. 12). В составе пласта формирующихся покровных структур ювенила мы встречаем клетки со следующими ультраструктурными характеристиками (Рис. 47А, 48А).базаль тел(аппарат ГольджиСхема 12. Трансдифференцировка жгутиковых клеток личинки в экзопинакоциты.

Клетки подразделены на три морфофункциональных компартмента — апикальная пластинка, стебелек и тело клетки. Ядра располагаются в базальной части клеток - «теле» экзопинакоцита. Они имеет каплевидную форму. Размер их составляет -2,5x6 мкм. Заостренный выступ может изгибаться под различными углами к поверхности ядра. Хроматин имеет гранулярную и фибриллярную составляющие. Ядра содержат ядрышки, размер их составляет -1.3 мкм. Поверхность ядрышек неровная. В них выявляется гранулярная и фибриллярная компоненты.

Аппарат Гольджи присутствует в околоядерной цитоплазме и представлен двумя комплексами цистерн, размер которых составляет 1 — 1.5 мкм. Они локализованы в области цитоплазмы около заостренного ядерного выступа. Часть цистерн имеет электроноплотное содержимое. В цитоплазме, окружающей комплексы цистерн находятся мембранные пузырьки с содержимым различной электронной плотности.

Тело клетки содержит довольно значительное число округлых митохондрий -0,5 мкм в диаметре. В их матриксе содержится рыхлый тонкофибриллярный материал.

На наружной ядерной мембране происходит формирование гранулярного эндоплазматического ретикулума. Значительное число его цистерн имеется в цитоплазме клеток.

Над заостренным выступом ядра (связанные с ним) присутствуют центриоли. Одна из них может иметь связь между мембраной заостренного ядерного выступа и наружной плазматической мембраной. На апикальном конце этой центриоли, под плазматической мембраной, в этом случае имеется слой переходных фибрилл, диаметр кольца которых составляет 0,6 мкм.

В цитоплазме первичных экзопинакоцитов обнаруживаются остатки желточных гранул. Они имеют неправильную форму, наружная мембрана в большинстве случаев не выявляется. Они имеют электроноплотное, практически гомогенное содержимое. В цитоплазме ядросодержащей части клеток имеются крупные (до 3 мкм в диаметре) автофагальные вакуоли. Они окружены одиночной мембраной и содержат или множество клеточных фрагментов, или фрагменты материнских гранулярных амебоцитов. В составе фагосом не выявлено каких-либо признаков присутствия фрагментов ядер, жгутиков или их базального аппарата.

В цитоплазме также присутствуют вакуоли (0,15 мкм) с рыхлым тонкогранулярным содержимым и значительное количество мембранных пузырьков, которые имеют или электронопрозрачное содержимое или тонкофибриллярное содержимое средней электронной плотности.

Цитоплазма клеточного стебелька практически не содержит каких-либо клеточных включений и органелл. Диаметр стебелька варьирует у разных клеток в зависимости от степени их дифференцировки от 1 до 1,8 мкм. В нем присутствует большое количество мембранных пузырьков (0,05 — 0,1 мкм), содержимое которых электронопрозрачно или имеет тонкофибриллярную структуру. В этой области клетки можно встретить единичные цистерны гЭПР (главным образом в основании стебелька), небольшие округлые электроноплотные включения, заключенные в мембрану.

Цитоплазма апикальной пластинки также как правило, не содержит каких-либо клеточных органелл. В ней содержатся мембранные пузырьки с электронопрозрачным или тонкофибриллярным содержимым. Основное количество пузырьков находится в базальной части цитопплазмы апикальной пластинки. Заметим, что компоненты цитоплазмы могут в незначительной степени варьировать в разных клетках.

Между первичными экзопинакоцитами имеются опоясывающие зоны адгезии. Они соединяют клетки в латеральных областях апикальных пластинок Протяженность зоны контакта на этой стадии дифференцировки варьирует в пределах 0,5 - 1 мкм. Эти зоны маркируются альциановым синим, который оседает в области контакта и не проникает внутрь осевшей личинки. Мембраны соседних клеток в зоне контакта ориентированны строго параллельно. Расстояние между мембранами составляет 12нм. Со стороны цитоплазмы к внутренним мембранам подходит электроноплотный тонкофибриллярный материал (Рис. 48А).

Над апикальными пластинками экзопинакоцитов находится слизистая кутикула, покрывающая осевшую личинку. На фотографиях сканирующего режима электронного микроскопа он выглядит как сплошная плёнка, толщина которой составляет 0,01 мкм (Рис. 11 А). В составе этого слизистого слоя могут встречаться единичные срезы филоподий, бактерии (отличающиеся от симбиотических бактерий исследуемого вида), и единичные мелкие клеточные фрагменты.

Дальнейшая дифференцировка экзопинакоцитов морфологически проявляется в увеличении площади апикальной пластинки и в значительном уменьшении её толщины. Диаметр стебелька также значительно уменьшается, длина его увеличивается. Ядросодержащая часть клетки видоизменяется, принимает звездчатую форму, происходит перестройка компонентов цитоплазмы, и к завершению метаморфоза поверхностный слой губки оказывается сформированным Т-образными экзопинакоцитами, аналогичными таковым у дефинитивной особи.

4. Формирование конгломерата амебоидных клеток.

В процессе прикрепления личинки жгутиковые клетки ее передней полусферы распластываются параллельно поверхности субстрата (рис. 10А-В; рис. 47). В пространстве между субстратом и клетками личинки присутствуют срезы жгутиковых аксонем, частицы дебриса и внеклеточный матрикс. Пласт жгутиковых клеток имеет морфологические признаки анархизации (Рис. 47, 48Б, В). Ядра клеток располагаются на разных уровнях относительно апикобазальной оси личиночного жгутикового эпителия. Они имеют каплевидную форму, заостренный выступ ядра может изгибаться под различным углом к поверхности ядра. В большинстве случаев ориентация ядра в клетках соответствует таковой в личиночных клетках (полюс ядра, на котором локализован заостренный выступ,направлен к апикальной части клетки). Хроматин плотный, на электронограммах имеет гранулярную и фибриллярную составляющие. Ядра содержат ядрышки Поверхность ядрышек неровная, в них выделяется гранулярная и фибриллярная компоненты.

Аппарат Гольджи представлен двумя комплексами цистерн, расположенных в околоядерной цитоплазме в районе заостренного ядерного выступа. Часть цистерн имеет электроноплотное содержимое. Вокруг аппарата Гольджи локализованы мембранные пузырьки, размер которых колеблется в пределах 0,05 -.0,1 мкм. Они имеют содержимое различной электронной плотности.

В цитоплазме клеток содержится значительное количество митохондрий округлой формы. Многочисленные цистерны гЭПР присутствуют в различных частях цитоплазмы.

Остатки желточных гранул присутствуют в цитоплазме клеток передней полусферы осевшей личинки. Их размер составляет 1-1,5 мкм. Локализация их у разных клеток различна и зависит от положения ядра. Если ядро расположено в апикальной части клеток, желточные гранулы локализованы в базальной части, как это имело место в клетках плавающей личинки. Если же ядро смещается в базальную часть клеток, желточные гранулы перемещаются в среднюю (апикальную) часть цитоплазмы. Помимо желточных гранул в цитоплазме клеток присутствует довольно значительное число фагосом, размер которых может достигать 3 - 3.5 мкм. Они окружены одиночной мембраной и содержат множество мелких клеточных фрагментов. В некоторых фагосомах присутствуют фрагменты материнских гранулярных амебоцитов.

Апикальные части клеток, которые у личиночных жгутиковых клеток формировали жгутиковый карман, теряют свою морфологическую структуру. Клеточная поверхность в этой области образует многочисленные неправильные выросты и инвагинации. Цитоплазма в этой области не содержит каких-либо цитоплазматических органелл. В ней присутствует большое количество мембранных пузырьков, имеющих электронопрозрачное или тонкофибриллярное содержимое (Рис. 48Б).

Латеральные мембраны клеток имеют неровные, волнистые очертания. Использование альцианового синего как электроноплотного трейсера показало, что опоясывающие зоны адгезии теряют свою барьерную функцию. Частицы трейсера проникают глубоко в межклеточные пространства, достигая базальной части пласта (Рис. 47Б).

5. Дифференцировка клеток внутреннего конгломерата. 5.1. Ранний конгломерат.

Заключение диссертации по теме «Биология развития, эмбриология», Гонобоблева, Елизавета Львовна

выводы.

1. Изучение эмбрионального развития НаНзагса йщагйгт (Оетозрог^ае, НаНэагаёа) показало вариабельный характер морфогенезов, составляющих процесс развития. К ним следует отнести процесс дробления, мультиполярной иммиграции клеток и инвагинации с последующей отшнуровкой наружного слоя клеток.

2. Морфологические различия проявляются на всех стадиях эмбриогенеза. Зародыши с различными морфологическими характеристиками развиваются в одном материнском организме. Вариабельный характер эмбриональных морфогенезов приводит к различиям в клеточном составе внутренней полости зародышей и личинок.

3. Наружный слой клеток зародыша сегрегируется на 64 - 128 клеточной стадии. На последующих этапах наружные клетки дифференцируются в жгутиковые клетки личинки, внутренние клетки становятся ядрышковыми амебоцитами.

4. Интеграция эмбриональных морфогенезов осуществляется за счет постоянных межклеточных контактов, которые связывают клетки в составе поляризованных пластов, и временных межклеточных взаимодействий, которые играют основную роль при дифференцировке конгломерата амебоидных клеток во время метаморфоза.

5. В ходе метаморфоза переднезадняя ось личинки становится базоапикальной осью ювенила. Морфогенетическая преемственность осей выражается в судьбе слоя наружных жгутиковых клеток личинки: клетки задней полусферы формируют покровы ювенила - экзопинакодерму, клетки передней полусферы принимают участие в формировании внутренних структур губки.

6. Жгутиковые клетки личинки Н. йщагйгт мультипотентны и являются основным клеточным источником структур ювенила.

7. Морфогенезы, характерные для развития изучаемого вида, включают типичные для других многоклеточных клеточные механизмы.

Считаю своим приятным долгом выразить сердечную благодарность моему научному руководителю Александру Вадимовичу Ересковскому за постоянное внимание к моей работе и многостороннюю помощь.

Выражаю глубокую признательность моим учителям — преподавателям кафедры эмбриологии, лекции которых сформировали мои знания и представления о биологии развития: профессору А. К. Дондуа, доценту Д. Г. Полтевой, доценту Т. Ф. Андреевой, доценту В. И. Ефремову, ст. преподавателю В. В. Донакову.

Значительная помощь, внимание и поддержка в работе была оказана мне зав. лабораторией онтогенеза БИНИИ СПбГУ С. М. Ефремовой и сотрудниками ее лаборатории.

Большое содействие работе было оказано зав. кафедрой эмбриологии профессором А. П. Перевозчиковым и доцентом, секретарем каф. эмбриологии Р. П. Костюченко.

Выражаю глубокую признательность доценту Педагогического университета им. А. И. Герцена JT. В. Ивановой за ценные научные советы и обсуждение результатов исследования.

Особую признательность хочу выразить зав. лабораторией электронной микроскопии ГОИ Ю. В. Воронину, который приводил в надлежащее техническое состояние электронный микроскоп JEM 7 каф. эмбриологии и учил меня основам работы на нем.

Неоценимая помощь в работе была мне оказана к.б.н. Виктором Васильевичем Семеновым, который посвящал меня в секреты высокого мастерства электронной микроскопии и предоставил возможность работать на хорошем электронном микроскопе.

В завершение хочу выразить искреннюю благодарность А. А. Родимову, зав. хозяйством каф. эмбриологии, который всегда отзывался на все просьбы о помощи - начиная с лодочной гребли и кончая переводами со старонемецкого.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Гонобоблева, Елизавета Львовна, 2005 год

1. Айзенштадт Т. Б., Короткова Г. П. Исследование оогенеза у морской губки Halisarca dujardini. II. Фагоцитарная активность ооцитов и вителлогенез. Цитология. 1976. Т. 18. С. 818-823.

2. Алексеева Н. П. Организация паренхимулы эндемичной байкальской губки Swartchewskia papyracea (Dyb.). Архив анат. Гистол. Эмбриол. 1980. Т. 79. № 12. С. 74-80.

3. Анакина Р. П. Эмбриональное развитие баренцевоморской губки Leucosolenia complicata (Mont.). Морфогенезы у губок. Д.: Изд-во ЛГУ. 1981. С. 52-58.

4. Волкова М. А., Золотарева Г. А. Развитие Halisarca dujardini Johnston из конгломератов соматических клеток. Морфогенезы у губок. Л.: Изд-во ЛГУ. 1981. С. 74-93.

5. Гуреева М. А. Эмбриональное развитие и зародышевые листки у губок. Труды Ленингр. о-ва естествоисп. 1976. Т. 84(1). С. 10-25.

6. Гуреева М. А., Мамкаев Ю. В. Морфологическая характеристика дробления у бескишечных турбеллярий Acoela. I. О вариантах дробления у рода Convoluta. Зоол. Ж. 1985а. Т. 64. Вып. 11. С. 1621 1631.

7. Гуреева М. А., Мамкаев Ю. В. Морфологическая характеристика дробления у бескишечных турбеллярий Acoela. 2. О вариантах дробления у Oxyposthia praedator. Зоол. Ж. 19856. Т. 64. Вып. 12. С. 1621 1631.

8. Дондуа А. К. Теория зародышевых листков: дискуссионные аспекты. Онтогенез. 1994. Т. 25(6). С. 68 76.

9. Ересковский А. В. Формирование личинки Iophon piceus (Demospongiae, Poecilosclerida). Зоол. Журн. 1986. Т. 65. С. 1614 1621.

10. Ересковский А. В. Сравнительно-эмбриологический анализ Демоспонгий и его значение для разработки теоретических аспектов эволюции и филогенетических взаимоотношений губок. Диссертация на соискание уч. степ, доктора биол. наук. СПб. 2001.

11. Ересковский А. В. Полиаксиальное дробление губок (Porifera) новый тип дробления многоклеточных животных. Докл. Акад. Наук. Т. 386. №. 5. С. 712 -714. 2002.

12. Ересковский А. В., Сизова Н. А. Некоторые особенности раннего эмбриогенеза беломорской губки Halisarca dujardini (Demospongiae, Dendroceratida). Вестн. СПбГУ. 1996. Сер. 3. Вып. 3. С. 103.

13. Ефремова С. М. Строение и эмбриональное развитие байкальской губки Lubomirskia baikalensis (Pallas) и связи любомирскиид с другими губками. Морфогенезы у губок. Л.: ЛГУ. 1981. С. 93 107.

14. Иванова-Казас О. М. Эволюционная эмбриология животных. СПб: Наука.1995.

15. Исаева В. В. Клетки в морфогенезе. М: Наука, 1994. Карпов С. А. Система протистов. 1990. Омск.

16. Колтун В. М. Развитие индивидуальности и становление индивида у губок. Губки и книдарии. Современное состояние и перспективы исследований. Л. Зоол. Ин-т АН СССР. 1988. С. 24 34.

17. Колтун В. М. Parazoa как антиподы Eumetazoa. Вест. СПбГУ. 1996. Сер. 3. Биол. Вып. 3. С. 11106-107.

18. Короткова Г. П. Половой эмбриогенез губок и закономерности его эволюции. Морфогенезы у губок. Л.: Изд-во ЛГУ. 1981. С. 108 136.

19. Короткова Г. П., Апалькова Л. В. Оогенез баренцевоморской губки Halisarca dujardini Johnston. Вопр. сравнительной и экспериментальной морфологии морских организмов. Апатиты. 1975. С. 26.

20. Короткова Г. П., Айзенштадт Т. Б. Исследование оогенеза у морской губки Halisarca dujardini. I. Происхождение оогониев и ранние стадии развития ооцитов. Цитология. 1976. Т. 18. С. 549 — 555.

21. Короткова Г. П., Ересковский А. В. Особенности дробления яйца беломорской губки Halisarca dujardini Johnston. Вестн. ЛГУ. 1984. № 21. С. 36 -42.

22. Короткова Г. П., Ермолина Н. О. Период развития личинки Halisarca dujardini (Demospongia). Зоол. Журн. 1982. Т. 61. Вып. 10. С. 1472 1479.

23. Короткова Г. П., Ермолина Н. О. Деструкция зародышей в репродуктивный период у беломорской губки Halisarca dujardini Johnston (Demospongiae). Вестн. ЛГУ. 1986. Сер. 3. Вып. 4. С. 104 106.

24. Короткова Г. П., Мовчан Н. А. Особенности защитно-регенерационных процессов у губки Halisarca diujardini Johnston. Вестн. ЛГУ. 1973. № 22. С. 16 -26.

25. Короткова Г. П., Суходольская А. Н., Красюкевич Т. Н. Особенности морфогенеза при развитии Halisarca dujardini Johnston из небольшого фрагмента тела. Вестн. ЛГУ. № 9. С. 41 46.

26. Мережковский К. С. Исследования о губках Белого моря. III. О строении новой Halisarca и особенно о ее железистой системе. Труды СПб. о-ва естествоисп. 1879. Т. 7. С. 43 56.

27. Родимов А. А. История эмбрионального развития Bougainvillia superciliaris. Вестник СПбГУ. 2000. Вып. 2. Серия «Биология». С. 122 126.

28. Серавин Л. Н. Своеобразие организации и эмбрионального развития губок (Spongia). Вестн. СПбГУ. 1992. Сер. 3. Вып. 2. № 10. С. 13-28.

29. Суходольская А. Н., Иванова Л. В. Электронно-микроскопическое исследование плавающих личинок пресноводной губки Spongilla lacustris. Цитология. 1988. Т.30.№ 12. С. 1409- 1417.

30. Ашапо, S. and Hori, I. Metamorphosis of calcareous sponges. I. Ultrastructure of free-swimming larvae. Invert. Reprod. and Dev. 1992. V. 21. P. 81-90.

31. Amano S. and Hori I. Metamorphosis of calcareous sponges. II. Cell rearrangement and differentiation in metamorphosis. Invertebr. Reprod. Dev. 1993. V. 24. P. 13-26.

32. Amano, S. and Hori, I. Metamorphosis of a demosponge. I. Cells and structure of swimming larva. Invert. Reprod. and Dev. 1994. V. 25. P. 193-204.

33. Amano, S. and Hori, I. Transdifferentiation of larval flagellated cells to choanocytes in the metamorphosis of the Demosponge Haliclona permolis. Biol. Bull. 1996. V. 190. P. 161-172.

34. Amano, S. and Hori, I. Metamorphosis of coeloblastula performed by multipotential larval flagellated cells in the calcareous sponge Leucosolenia laxa. Biol. Bull. 2001. V. 200. P. 20-32.

35. Anakina R. P. The cleavage of Barents Sea Sponge Leucosolenia complicata. In: Modern problems of Poriferan biology. Eds. A. V. Ereskovsky, H. Keupp and R. Kohring. Frei Universität. Berlin. 1997. P. 45 53.

36. Bergquist P. R. A revision of the supraspecific classification of the orders Dictyoceratida, Dendroceratida, and Verongida (class Demospongiae). N. Z. Journal of Zoology. 1980. V. 7. P. 443 503.

37. Bergquist P. R. The marine fauna of New Zeland: Porifera, Class Demospongiae, Part 5. Dendroceratida and Halisarcida. NZ Oceanogr. Inst. Mem. 1996. V. 107. P. 1-53.

38. Bergquist P. R., Glasgow K. Developmental potential of ciliated cell of ceractinomorph sponge larvae. Exp. Biol. 1986. V. 45. P. 111 122.

39. Bergquist P. R., Green C. G. An ultrastructural study of settlement and metamorphosis in sponge larvae. Cah. Biol. Mar. 1977. V. 18. P. 289 302.

40. Bergquist P. R., Sinclair M. R. The morphology and behaviour of larvae of some intertidal sponges. N. Z. J. mar. freshwater Res. 1968. V. 3. P. 426 437.

41. Borojevic R. Etude expérimentale de la différenciation des cellules de l'éponge au cours de son développement. Dev. Biol. 1966. V. 14. N. 1. P. 130 — 153.

42. Borojevic, R. La ponte et le développement de Polymastia robusta (Demosponges). Cah. Biol. Mar. 1967. V. 8. P. 1-6.

43. Borojevic, R. Etude du développement et de la differentiation cellulaire d'épongés calcaires Calcinées (genres Clathrina et Ascandra). Ann. Embryol. Morphol. 1969. V.2.P. 15-36.

44. Borojevic R. Différenciation cellulaires dans l'embryogenèse et la morphogenèse ches les Spongiaires. In: the biology of the Porifera. Symp. Zool. Soc. Ed. Fry W. G. London. 1970. V. 25. P. 267-290.

45. Borojevic R., Lévi C. Morphogenese experimentale d'une eponge a partir de cellules de la larve negeante dissociee. Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 1965. V. 68. P. 57 -69.

46. Boury-Esnault N. Ultrastructure de la larve parenchymella d'Hamigera hamigera (Shmidt) (Démosponge, Poecilosclerida). Origine des cellules grises. Cah. Biol. Mar. 1976. V. 17. P. 9-20.

47. Boury-Esnault N. and Vacelet J. P. Preliminary studies on the organisation and development of a hexactinellid sponge fron a Mediterranean cave, Oopsacas minuta. In:

48. Soest, van R., Kempen, van T., Braekman, J.-C. (Eds) Sponges in Time and Space. 1994. P. 407-415. A.A. Balkema Press Rotterdam.

49. Boury-Esnault, N., Efremova, S., Bézac, C. and Vacelet J. Reproduction of a hexactinellid sponde: first description of gastrulation by cellular delamination in the Porifera. Invert. Reprod. And Develop. 1999. V. 35. P. 187-201.

50. Boury-Esnault N., Ereskovsky A., Bézac C., Tokina D. Larval development in the Homoscleromorpha (Porifera, Demospongiae). Inv. Biol. 2003. V. 122. N. 3. P. 187 -202.

51. Boury-Esnault N., Rützler K. (eds). Thesaurus of sponge morphology. Smithsonian contribution to Zoology. 1997. V. 596. P. 1 -55.

52. Brien P., Meewis H. Contribution à l'étude de l'embryogenèse des Spongillidae. Archives de Biologie de Liège. 1938. V. 49. P. 177 250.

53. Byrne M., Cerra A. Cellular events of the wrinkled blastula formation and the influence of the fertilization envelope on wrinkling in the seastar Patriella exigua. Acta Zoologica. 1995. V. 76. P. 155 165.

54. Chen, W-T. Reproduction and speciation in Halisarca. In: Harrison, F. W. and Cowden, R. R. (Eds), Aspects of sponge biology. 1976. P. 113-139. Academic Press, N.Y., San Francisco, London.

55. Delage Y. Embryogenese des épongés silicieus. Arch. Z. Exp. Gen. 1892. T. 10. P. 345-498.

56. Duboscq O., Tuzet O. L'ovogenèse, la fecundation et les premiers stades du développement des éponges calcaires. Arch. Zool. Exp. Gen. 1937. V. 79. P. 157-316.

57. Efremova S. M. Once more on the position among Metazoa Gastrulation and germinal layers of sponges. In: Modern problems of the Poriferan biology. Eds. Ereskovsky A., Keupp H., Kohring R. Freire Universität. Berlin. 1997. P. 7 - 15.

58. Efremova S. M., Efremov V. I. Proliferation cellulaire dans l'embryogenese de Baikalospongia bacillifera. In: Biologie des Spongiaires. Eds. :Lévi C., Boury-Esnault N. Coll. Internat. C. N. R. S. Paris. 1979. N 291. P. 59-65.

59. Ereskovsky, A. V. Type of development of Haplosclerid sponges (Demospongiae, Ceractinomorpha). Russian Journal of Marine Biology. 1999. V. 25: P. 333-343.

60. Ereskovsky A. V. Reproduction cycles and strategies of cold-water sponges Halisarca dujardini (Demospongiae, Dendroceratida), Myxilla incrustans and Iophon piceus (Demospongiae, Poecilosclerida) from the White Sea. Biol. Bull. 2000. V. 98. P. 77-87.

61. Ereskovsky A. V. and Korotkova G. P. On the reasons of ontogenesis peculiarity in Sponges. Jurnal Obshej Biologii. 1999. V. 60. P. 318-332.

62. Ereskovsky A. V. and Gonobobleva E. L. 1999. The development of Halisarca dujardini Johnston, 1842 from the egg to the free larvae (Porifera, Ceractinomorpha, Halisarcida). Mem. Quens. Mus. V. 42. P. 160.

63. Ereskovsky A.V. and Gonobobleva E. L. New data on embryonic development of Halisarca dujardini Johnston, 1842 (Demospongiae: Halisarcida) Zoosystema. 2000. V. 22. P. 355-368.

64. Ereskovsky A. V. and Boury-Esnault N. Cleavage pattern in Oscarella species (Porifera, Demospongiae, Homoscleromorpha), transmission of maternal cells and symbiotic bacteria. Journal of Natural History. 2002. V. 36. P. 1761 1775.

65. Evans C. W. The ultrastructure of larvae from the marine sponge Halichortdria moorei Bergqist (Porifera, Demospongiae). Cah. Biol. Mar. 1977. T. 18. P. 427-433.

66. Fell P. E. The involvement of nurse cells in oogenesis and embryonic development in the marine sponge Haliclona ecbasis. Morphology. 1969. V. 127. N 2. P. 133- 150.

67. Fell, P. E. Porifera. In: Adiyodi, K. G. and Adiyodi, R. G. (Eds): Reproductive biology of Invertebrates 1989. V. 1. Fertilisation and larval development, pp. 1-41. Ltd.; Chichester: John Wiley and Sons.

68. Franzen, W. Oogenesis and larval development of Scypha ciliata (Porifera, Calcarea). Zoomorphology (Berlin). 1988. V. 107. P. 349-357.

69. Gaino E., Manconi R., Prozanto R. Organizational plasticity as a successful conservative tactics in sponges. Anim. Biol. 1995. V. 4. P. 31 43.

70. Gaino E., Rebora M., Carallini C., Lancioni T. The life-cycle of the sponge Ephydatia Jluviatilis (L.) living on the reed Phragnites aystralis in an artificially regulated lake. Hydrobiologia. 2003. V. 495. P. 127- 142.

71. Gallissian M.-F. and Vacelet J. 1992. Ultrastructure of the oocyte and embryo of the calcified sponge, Petrobiona massiliana (Porifera, Calcarea). Zoomorphology. V. 112. P.133-141.

72. Gilbert S. F. Developmental biology. Sinauer Assaciates, Inc. Publishers. Sunderland. Massachusetts. 1997.

73. Gonobobleva E. , Ereskovsky A. Polymorphism in free-swimming larvae of Halisarca dujardini (Demospongiae, Halisarcida). Boll. Mus. 1st. Biol. Univ. Genova. V. 68. P. 349-356. 2004.

74. Gonobobleva E., Ereskovsky A. Metamorphosis of the larva of Halisarca dujardini (Demospongiae, Halisarcida). Bullet. Inst. Sei. Natur. De Belgique. V. 74. P. 101 115. 2004.

75. Green C.R., Bergquist P. R. 1979. Cell membrane specialisations in the Porifera. In: C. Levi and N. Boury-Esnault (Eds): Biologie des Spongiaures. Coll. Internat. C.N.R.S. N 291, pp. 153-158. Paris.

76. Harrison F. W., Copwden R. R. Cytochemical observations of the larval development in Eunapius fragilis (Leidy): Porifera; Spongillidae. J. Morphol. 1975. V. 145. P. 125-142.

77. Johnson M. F. Gametogenesis and embryonic development in the calcareous sponges Clathrina coriacea and C. blanca from Santa Catalina Island, California. Bull. 1979. Southern California Acad. Sei. V. 78. P. 183-191.

78. Kaye H. R. Reproduction in the West Indian commercial sponges: oogenesis, larval development and behaviour. In: New perspectives in Sponge biology. Ed. Rutzler K. Smithsonian Inst. Press. Washington. 1990. P. 161 169.

79. Kaye H. R. Sexual reproduction in four Carribean commercial sponges. II. Oogenesis and transfer of bacterial symbionts. Inv. Rep rod. Dev. 1991. V. 19. P. 13 -24.

80. Maldonado M. Choanoflagellates, choanocytes, and animal multicellularity. Inv. Biol. 2004. V. 123. N l.P. 1-22.

81. Mariani S., Uriz M. J., Turton X. Larval bloom of the oviparous sponge Cliona viridis: coupling of the abundance and adult distribution. Mar. Biol. 2000. V. 137. P. 783 790.

82. Meewis H. Contribution à l'étude de l'embryogénése des Myxospongiae: Halisarca lobularis (Schmidt). Arch. Biol. Liege. 1938. V. 59. P. 1-66.

83. Meewis H. Contribution a l'étude de l'embryogénése de Chalinulidae: Haliclona limbata. Ann. Soc. Roy. Zool. Belg. 1939. V. 70. P. 201 243.

84. Meewis H. Contribution a l'étude de l'embryogénése des épongés siliceuse. Ann Soc. Roy. Zool. Belg. 1941. V. 72. P. 126-149.

85. Metschnikoff, E. Spongiologische Studien. Z. wiss. Zool. 1879. V. 32. P. 349387.

86. Mizevic G. N., Schlup V., Burger M. M. Larval metamorphosis of Microciona proliféra', evidens against the reversal of layers. In: New perspectives in Sponge Biology, Smithsonian Inst. Press, Washington, DC. 1990. P. 182 187.

87. Morris P. The development role of the extracellular matrix suggests a monophyletic origin of the kingdom Animalia. Evolution. 1995. V. 47. P. 152 165.

88. Reiger R.M. Evolution of the "lower" Metazoa. In: Bengston, S. (ed.). Early Lyfe on Earth, Nobel Symp. 1994. V. 84. P. 475-488. Columbia University Press, New York.

89. Ruthmann, A., Behrendt G. and Wahl R. The ventral epithelium of Trihoplax adherens (Placozoa): Cytoskeletal structures, cell contacts and endocytosis. Zoomorphologie. 1986. V. 106: P. 115-122.

90. Sailer U. Oogenesis and larval development of Ephydalia fluviatilis (Porifera, Spongillidae). Zoomorphology. 1988. V. 108. N 1. P. 23-28.

91. Sailer U., Weissenfels N. The development of Spongilla lacustris from the oocyte to the free larva (Porifera, SpongilIidae).Zoomorphology. 1985. V. 105. P. 367 -374.

92. Schulze F. E. 1877. Untersuchungen über den bau und Entwicklung der Spongien. Die Gattung Halisarca. Z.wiss. Zool. V. 28. P. 1-48.

93. Simpson T. L. The cell biology of Sponges. 1984. Springer-Verlag, New York.

94. Staehelin L.A. Structure and function of intercellular junctions. Int. Rev. Cytol. 1974. V. 39. P. 191-283.

95. Tuzet 0. La polarité de l'oeuf et la symétrie de la larve des Éponges Calcaires. In: W. G. Fry (Ed.). The biology of the Porifera. 1970. P. 437-447. Academic Press. London.

96. Vacelet J. Quelques stades de la reproduction sexuée d'une éponge sphinctozoaire actuelle. In: C. Lévi, and N. Boury-Esnault, (Eds.): Biologie des Spongiaures. 1979. P. 95-111. Coll. Internat. C.N.R.S. Paris. N 291.

97. Vacelet J., Vasseur P., Levi C. Spongiaires de la pente externe des récifs corallines de Tuléar (sud-ouest de Madagascar). Mém. Mus. Natn. Hist. Nat. 1976. Paris. A. Zool., V. 49. P. 1 116.

98. Wapstra M. and Soest van, R. W. M. Sexual reproduction, larval morphology and bechaviour in Demosponges from the southwest of the Netherlands. In: N. Boury-Esnault and J. Vacelet (Eds): Taxonomy of Porifera 1987. P. 281-307. NATO ASI Ser. V.13.

99. Watanabe Y. The development of two species of Tetilla (Demosponge). Natur. Sei. Rep. Ochanomizu Univ. 1978. V. 29. P. 71 106.

100. Watanabe Y., Masuda Y. Structure of fiber bundles in the egg of Tetilla japonica and their possible function in development. In: New Perspectives in Sponge Biology. Ed. Rutzier K. Smithsonian Inst. Press. Washington. 1990. P. 193 199.

101. Weissenfels N. Biologie und microscopishe Anayomie der Susswassershwamme (Spongillidae). 1989. Fisher, Studgardt, New York. 110p.

102. Wielspütz C., Salier U. The metamorphosis of the parenchymula-larva of Ephydatia fluviatilis (Porifera, Spongillidae). Zoomorphology. 1990. V. 109. P. 173 — 177.

103. Woollacott R. M. Structure and swimming behavior of the larva of of Halichondria melanadocia (Porifera, Demospongiae). J. Morphol. 1990. V. 205. P. 135-145.

104. Woollacott R. M. Structure and swimming behavior of the larva of Haliclona tubifera (Porifera: Demospongiae). J. Morph. 1993. V. 218. P. 301-321.

105. ВК внутренняя клетка зародыша1. Г гликокаликс1. ГР гранулы

106. ДЦ добавочная центриоль Ж - жгутик

107. ЖГ желточная гранула ЖК - жгутиковый карман 3 - зародыш ЗП - задний полюс ИН - инвагинация К - коллаген

108. КК клетки конгломерата куколки КЛ - полость выносящего канала КМ - жгутиковая камера КО - кортекс КР - корешки М - наружная мембрана МВ - микровилли хоаноцита МЗ - мезохил

109. МК материнский гранулярный амебоцит

110. МР межбластомерный матрикс1. МА матрикс1. МХ митохондрия

111. НК наружные клетки зародышей1. П полость

112. ЭК эмбриональная капсула ЭП - экзопинакодерма

113. ЭР гранулярный эндоплазматический ретикулум ЭПЦ - экзопинакоцит Я - ядро ЯШ - ядрышко

114. Характеристики эмбриогенеза Halisarca metschnikovi Роскофф (Levi, 1956) Halisarca dujardini Роскофф (Levi, 1956) НаШагса Ли}агйШ Белое море (собственные данные) Halisarca dujardini Нахант (Chen, 1976) Halisarca nahantensis Нахант (Chen, 1976)

115. Диаметр яйца 120 цт 90 цт 120-130 цт 120-130 цт

116. Первое деление дробления экваториальное меридиональное меридиональное

117. Второе деление дробления экваториальное Меридиональное варьирует Радиальное дробоение в 2-х бластомерной стадии

118. Полость дробления 16 клеточная стадия 16 клеточная стадия 16 клеточная стадия 16 клеточная стадия

119. Бластула Морула; лизис центральной части морулы Стерробластула; лизис центральной части стерробластулы Стерробластула, в полости которой могут присутствовать клетки Стерробластула с маленькой полостью

120. Типы внутренних клеток три два три

121. Размер личинки 130 \хт 90 цт 130 цт 90 (im 150 цт

122. Время выхода личинок Июнь (13 °С) Сентябрь (15°С) Июль (10-12 °С) Февраль (2-3°С) Май-июнь (10-15°С)

123. Условия обитания эстуарий глубоководная литораль глубоководная литораль