Разрывы ДНК, их репарация и гибель покоящихся лимфоцитов крови человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, доктор биологических наук Тронов, Виктор Александрович

• Тронов, Виктор Александрович
• доктор биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации доктор биологических наук Тронов, Виктор Александрович

Введение ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1. Актуальность проблемы

2. Цель и задачи исследования

3. Научная новизна полученных результатов

4. Научно-практическая значимость б

5. Положения, выносимые на защиту

6. Апробация работы б. Список публикаций по теме диссертации

Глава 1 ДНК-КОМЕТЫ КАК МАРКЕР КЛЕТОЧНОЙ ГИБЕЛИ

1.1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ПО ТЕМЕ

1.1.1 Клеточная гибель

1.1.2 Методы регистрации апоптоза

1.1.3 Повреждение ДНК в индивидуальных клетках. Метод ДНК-комет

1.2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.2.1. Материалы и методы

1.2.2. Результаты и обсуждение

1.2.2.1 Классификация ДНК-комет

1.2.2.2 Связь mt с количеством разрывов и фазой апоптоза (калибровка метода)

1.2.2.3 Корреляция метода ДНК-комет с морфологическими изменениями клеток в процессе гибели

1.2.2.4 Поврежденность ДНК и спонтанный апоптоз лимфоцитов больных системной красной волчанкой

1.2.2.5 Оценка повреждений ДНК в ЛКЧ при фракционированном облучении in vivo

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разрывы ДНК, их репарация и гибель покоящихся лимфоцитов крови человека»

1

1. Актуальность проблемы.

С открытием программированной клеточной смерти (апоптоза) как альтернативы некроза проблема связи первичных повреждений ДНК с гибелью клетки приобрела более конкретные очертания и формулируется как проблема связи типов повреждений ДНК с формами клеточной гибели (проблема включает в себя и механизм трансдукции первичного сигнала).

Исследования в этой области предполагают 3 варианта ответа на поставленный в проблеме вопрос

1) Апоптоз является универсальным механизмом программированной гибели; вне зависимости от вида повреждений ДНК и природы повреждающего агента, гибель клетки завершается апоптозом (высокие уровни воздействия индуцируют некротическую гибель).

2) Двунитевые разрывы ДНК (ДР), будучи главной причиной снижения колониеобразования пролиферирующих клеток, являются основным типом повреждений, запускающих апоптоз.

3) Повреждения ДНК сами по себе не являются причиной апоптоза, но запускают механизм репарации, в ходе функционирования которого создаются условия для гибели клетки, генерируется сигнал, запускающий программу гибели.

Настоящая работа находится в русле последнего представления. К этому направлению исследований тесно примыкает так же весьма интересная и пока далекая от своего решения проблема взаимоотношения механизмов репарации и апоптоза. Повреждения ДНК, с одной стороны, являются субстратом для репаративных ферментов в клетке, а с другой стороны, запускают программу клеточной гибели -апоптоз. Апоптоз проходит через этап деградации ДНК, которой также противостоят механизмы репарации. Эти два процесса конкурируют не только за субстрат, но и за энергетические ресурсы клетки, поскольку являются энергозависимыми. Результаты исследований последних лет обнаруживают связь между механизмами апоптоза и репарации ДНК [см.'обзоры Götz, Montenarh M. 1996, Oliver et al. 1999, Тронов 1999]. Однако, в некоторых исследованиях отмечается отсутствие взаимосвязи апоптоза и репарации. . Здесь примечательными являются работы [Story et al. 1994, Vrai et al. 1998] на клетках мышиной лимфомы и лимфоцитах крови человека, в которых авторы независимо приходят к выводу, что апоптоз в этих клетках определяется только начальными ДР и не зависит от репарации ДНК. Как видно, столь противоречивые данные создают предпосылку для исследований взаимосвязей звеньев цепи "повреждение ДНК репарация - клеточная гибель (апоптоз)". Эту последовательность можно представить в виде схемы:

Исследования мы проводили главным образом на покоящихся лимфоцитах крови . человека (JIK4) , и потому результаты работы касаются также проблемы гибели покоящихся клеток, индуцированной повреждением ДНК. Покоящиеся клетки формируют основной клеточный пул высших организмов и опухолей. В то же время "^отсутствует ясное представление о том, в чем состоит опасность отдельных повреждений в их нереплицирующемся геноме- Нестимулированные к делению лимфоциты представляют собой благодатный объект для изучения этой проблемы в силу своей высокой чувствительности к повреждениям ДНК. Возможно это связано с критичностью выполняемых ими функций: наиболее важная функция лимфоцитов in vivo в ответ на антигенный стимул состоит в синтезе антител илц в стимуляции пролиферации, приводящей к продукции иммунологически активных дочерних клеток. С другой стороны, как и во многих долгоживущих клетках, в покоящихся лимфоцитах in vivo отмечается заметный уровень конститутивной экспрессии BCL-2, белка, подавляющего апоптоз и увеличивающего жизнеспособность клеток [Yang, Korsmeyer 1996, Bovia et al.1998]

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Тронов, Виктор Александрович

ВЫВОДЫ

1. ДНК-кометы являются адекватным биофизическим показателем клеточной гибели. В основе его лежит двух-уровневая деградация генома в апоптотических клетках. Анализ бивариантных распределений комет позволяет выделить преимущественную форму гибели клеток в популяции. Однако для идентификации типа гибели на уровне отдельной клетки требуется привлечение морфологических показателей.

Впервые продемонстрирована корреляция данных, полученных с помощью метода ДНК-комет, и результатов морфологической оценки часоты впоптоза. Прикладные возможности метода ДНК-комет продемонстрированы на J1K4 больных системной красной волчанкой и больных хроническим миелолейкозом, подвергнутых тотальному фракционированному облучению. Обнаружена повышенная частота апоптоза in vitro в ЛКЧ, выделенных из крови больных СКВ. Вероятно это отражает изменения в ЛКЧ, связанные с патогенезом заболевания.

2. Облучение ЛКЧ in vitro (доза 5 Гр, при дефиците сыворотки) индуцирует в них параллельно две формы гибели - некроз и апоптоз. Некроз завершается гибелью клеток (около 50%), приходящейся на 8-12 ч после облучения. Она сопровождается стохастической деградацией генома. Часть клеток (около 20%) гибнет по механизму апоптоза. Эта гибель происходит примерно с постоянной скоростью в течение пострадиационной инкубации клеток. Динамика развития процессов говорит о по крайней мере их частичной независимости. Предполагается, что причиной некроза является де-энергизация клетки, связанная с функционированием системы репарации повреждений ДНК (ОР и поврежденные основания). Нерепарируемые или медленно репарируемые повреждения (ДР, например) могут быть устойчивым сигналом к апоптозу.

3. ДР, индуцированные ингибитором топоизомеразы II этопозидом, сохраняются нерепарированными и запускают в покоящихся ЛКЧ апоптоз. Поскольку при этом не эксцерссируется р53, предполагается, что источником сигнала для запуска механизма апоптоза являются конформационные изменения ДНК на уровне суперспиральных доменов хроматина.

4. Однонитевые разрывы ДНК, вызванные обработкой клеток перекисью водорода, подвергаются быстрой репарации и одновременно запускают программу гибели в покоящихся лимфоцитов крови человека. Апоптозу сопутствуют характерные морфологические изменения , межнуклеосомная деградация ДНК и экспрессия р53. Параллельно значительная часть клеток (до 25 %), согласно морфологическим критериям, обнаруживала признаки некротической смерти. Никотинамид подавлял репарацию ОР в клетках и это подавление сопровождалось увеличением в 2,5 раза доли апоптотических клеток и снижением в 4,5 раза доли клеток с некротической морфологией ядра. Этот результат подтверждает предположение о том, что конкурирующие за энергетические ресурсы клетки процессы репарации и апоптоза приводят к смешанной форме гибели. Сдвиг к некротической форме гибели обусловлен энергетической необеспеченностью апоптоза. Одной из причин де-энергизации клетки в процессе репарации может быть активация поли(ADP-рибозо)полимеразы. Это понижает внутриклеточное содержание NAD+ и АТР ниже порогового уровня, при котором блокируется терминальная фаза апоптоза.

Таким образом , основной итог работы обнаружение смешанного типа гибели покоящихся ЛКЧ при действии ДНК-повреждающих агентов: на конечных стадиях апоптоза наблюдается смена формы гибели от апоптоза к некрозу. Смена форм гибели происходит из-за энергетической необеспеченности апоптоза. Важная роль в де-энергизации клетки принадлежит процессу репарации ДНК. Подавление репарации защищает клетки от некротической гибели , но не от апоптоза. Работа представляет новое направление исследований биофизику клеточной гибели.

4.2.3. Заключение.

Проведенные исследования показали, что ОР, индуцированные перекисью водорода в ЛКЧ, репарируют после удаления агента. С другой стороны, ОР запускают программу гибели клеток. Апоптоз характеризуется морфологическими изменениями, межнуклеосомной деградацией и экспрессией р53. Доля апоптотических клеток, наблюдаемых 24 ч после воздействия составляла, 15%. Параллельно до 30% клеток обнаруживали некротический тип гибели. Никотинамид подавлял репарацию ОР, и это сопровождалось 2.5-кратным увеличением частоты апоптоза и >4-кратным снижением частоты некроза. Наблюдалась так же более интенсивная межнуклеосомная деградация ДНК. Никотинамид сам не индуцировал разрывы в ДНК и не изменял морфологию клеток. Результат подтверждает предположение о том, что процесс репарации и связанная с ним активация поли(АБРрибозо)полимеразы (PARP) понижают внутриклеточное содержание NAD+ и АТР ниже порогового уровня, при котором некроз становится вероятным механизмом гибели клеток. Наблюдаемая картина смешанной гибели покоящихся лимфоцитов, индуцированной действием перекиси водорода, является следствием де-энергизации клетки за счет быстрой репарации в первые часы после удаления генотоксического агента.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Тронов, Виктор Александрович, 2000 год

1. Ager DD, Dewey WC. 1990.// Calibration of PFGK (pulse-field gel electrophoresis) for measurement of DNA double-strand breaks.// Int. J. Radiat. Biol. 58: 245-59.

2. Akagi Y, Ito K, Sawada s. 1993// Radiation-inciuced apoptosis and necrosis in MOLT-4 cells: a study of dose-response relationships and their modification.// Int. J. Radiat. Biol. 64: 47-56.

3. Amersham Life Science Products. Catalogue 98' . Amersham pharmacia biotech 1998.

4. Andree HAM, Reutelingsperger CPM, Hauptman R, Hemker HC, Hermens WT, Willems GM, 1990. // Binding of vascular anticoagulant a (VACa) to planar phospholipid bilayers.// J. Biol. Chenu 265: 4823-26.

5. Arends MJ, Morris RG, WyLlie AH, 1990// Apoptosis: the role of endonucleases. //J. Am. Pathol. 1^6: 593-608.

6. Arends MJ, Wyllie AH, 1991.//Apoptosis: mechanisms and role in pathology.//Int. Rev. Exp. Pathol. 32: 223-38.

7. Barr PJ, Tomei LD1994. // Apoptosis and its role in human disease. // BioTechnology. 12: 487-93.

8. Bayle JH, Elenbaas B, Levine AJ, 1995//The carboxyl-terminated domain of the p53 protein regulates sequence specific DNA binding through its nonspecific nucleic acid-binding activity.//Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 92:5729-33.

9. Belka C, Marini P, Budach W, Schulze-Osthoff K, Lang F, Gulbins E, Banberg M, 1998.// Radiation-induced apoptosis in human lymphocytes and lymphoma cells critically relies on the up-regulation of CD95/Fas/APO-l ligand.// Radiat. Res. 149:588-95.

10. Bennett GB, Lewis AL, Baldwin KK, Resnick MA, 1993.//Lethality induced by a single site-specificdouble-strand break in dispensable yeast plasmid.//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 5613-17.

11. Bennett M, Macdonald K, Chan SW, Lussio JP, Simari R, Weissberg P, 1998.//Cell surface trafficing of Fas: a rapid mechanism ofp53-mediated apoptosis.// Science. 282:290-3.

12. Bertrand R, Sarang M, Jenkin J, Kerrigan D, Pommier Y, 1991.//Differential induction of secondary DNA fragmentation by topoisomerase II inhibitors in human tumor cell lines with amplified c-myc expression.//Cancer. Res. 51: 6280-5.

13. Bicknell GR, Cohen GM, 1995//Cleavage of DNA to large kilobase pair fragments occurs in some forms of necrosis as well as apoptosis.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 207: 40-47.

14. Boreham DR, Dolling JA, Maves SR, Morris DP, Mitchel REJ, 1997.// Heat-induced thermal tolerance and radiation resistance to apoptosis in human lymphocytes.//Biochem. Cell. Biol. 75:393-7.

15. Boreham DR, Dolling JA, Maves SR, Morris DP, Mitchel REJ, 1997// Heat-induced thermal tolerance and radiation resistance to apoptosis in human lymphocites//Biochem.Cell.Biol.75:393-7.

16. Borek C, Oug A, Morgan WF, Cleaver JE, 1991.// Morphological transformation of 10T1/2 mouse embryo cells can be initiated by DNA double strand breaks alone.// Mol. Carcinogen. 4: 243-7.

17. Bortner CD, Oldenburg NBE, Cidlovski JA, 1995.// The role of DNA fragmentation in apoptosis.// Trends in Cell Biol. 5: 21-6.

18. Bortner CD, Oldenburg NBE, Cidlovski JA, 1995. // The role of DNA fragmentation in apoptosis// Trends in Cell. Biol. 5: 21-6.

19. Bovia F, Nabili-Tehrani AC, Werner-Favre C, Barnet M, Kindler V, Zubler RH, 1998.// Quiescent memory B cells in human peripheral blood co-express bcl-2 and bcl-x(L) anti-apoptotic proteins at high levels.// Eur. J. Immunol. 28:4418-23 .

20. Bovia F, Nabili-Tehrani AC, Werner-Favre C, Barnet M, Kindler V, Zubler RH. 1998// Quiescent memory B cells in human peripheral blood co-express bcl-2 and bcl-x(L) anti-apoptotic proteins at high levels.// Eur. J. Immunol. 28: 4418-23 .

21. Bryant PE, Finnegan CF, Swaffield L, Mozdarani H, 1998.// G2 chromatid breaks in murine SCID cells.// Mutagenesis 13: 481-5.

22. Buja LM, Eigenbrodt ML, Eigebrodt EH, 1993//

23. Apoptosis and necrosis: basic types and mechanisms of cell death// Arch. Pathol. Lab. Med. 117: 120814 .

24. Cantoni 0, Murray D, Meyn RE, 1986.// Effect of 3-aminobenzamide on DNA strand break rejoining and cytotoxicity in CHO cells treated with hydroperoxide.// Biochem. Biophys. Acta. 867: 13543.

25. Cantoni 0, Sestili P, Guidarelli A, Palomba L, Brambilla L, Cattabeni F, 1996.//Cytotoxic impact of DNA single vs double strand breaks in oxidatively enjured cells.// Arch. Toxicol. Suppl. 18: 223-35.

26. Carson DA, Seto S, Wasson DB, Carrera CJ, 1986// DNA strand breaks, NAD-metabolism, and programmed cell death//Exp.Cell Res. 161:273-81.

27. Catchpoole DR, Stewart BW, 1995.//Formation of apoptotic bodies is assiciated with intrnucleosomal fragmentation during drug-inducedapoptosis.// Exp. Cell Res. 216: P160-77.

28. Cheng J, Zhow T, Liu C, Shapiro JP, Brauer MJ, Kiefer MC, Barr PJ, Mountz JD, 1994.//A soluble form of the Fasmolecule protects cells from Fas mediated apoptosis//Science 263:1759-62.

29. Cohen-Jonatan E, Bernhard EJ, Mckenna WG//How does radiation kill cells?//Curr. Opin. Chem. Biol. 1999. 3: 77-83.

30. Cohen JJ, 1991.//Programmed cell death in the immune system//Adv. Immunol. 50: 55-85.

31. Cohen PL, 1992.//Eisenberg R.A. The lpr and gld genes in systemic autoimmunity life and death in the Fas lane.//Immunol. Today. 13: 427-28.

32. Darzynkiewicz Z, Bedner E, Traganos F, Murakami T, 1998// Critical Aspects in the analysis of apoptosis and necrosis.// Human cell. 11: 3-12.

33. Darzynkiewicz Z, Bruno S, Del Bino G, Gorczyca W,

34. Hotz M, Lassota P, Traganos F, 1992// Features of apoptotic cells measured by flow cytometry.// Cytometry. 13: 795-808.

35. Dickman, 1997//First p53 relative may be a new tumor suppressor.//Science. 277:1605-06

36. Dive C, Gregory CD, Phipps DJ, Evans DL, Milner AE, Wyllie AH, 1992.// Analisys and discrimination of necrosis and apoptosis (programmed cell death) by multiparameter flow cytometry//Biochim. Biophys. Acta. 1133:275-85.

37. Donehower LA, Harvey M, Slagle BA, McArthur MJ, Montgomery CA,Butel JS, BRAdly A, 1992//Mice deficient for p53 are developmentally normal but susceptible to spontaneous tumor.//Nature. 356: 215-21.

38. Earnshaw WC, 1995.// Nuclear changes in apoptosis. //Curr. Opinion in Cell. Biol. 7: 337-43.

39. Earnshaw WC, 1995.// Nuclear changes in apoptosis.// Curr. Opinion Cell Biol. 7: 337-343.

40. Eguchi Y, Shimizu S, Tsujimoto Y, 1997.// Intracellular ATP levels determine cell death fate by apoptosis or necrosis.//Cancer Res. 57:1835-40.el-Deiry WS, Tokino T, Vasculescu VE, Levy DB,; :* ' . .j: iJi^iTrKa^Mf ^* «p^»

41. Parsons R, Trent JM, Lin D, Merser WE, Kinzler KW, Vogelstein B. 1993// WAF-1, a potential mediator of p53 tumor suppression.// Cell. 75:84952 .

42. Elia MC, DeLuca JG, Bradly MO, 1991// Significance and measurement of DNA double strand breaks in mammalian cells.// Pharmacol. Ther. 51: 291-327.

43. Ellis H, Horvitz HR, 1986// Genetic control of programmed cell death in the nematode C.elegans.// Cell. 44: 817-29.

44. Emlen W, Niebur J, Kadera R, 1995.// Accelerated in vitro apoptosis of lymphocytes from patients with systemic lupus erythematosus.//J. Immunol. 152: 3685-92.

45. Fadok VA, Voelker DR, Cambell PA, Cohen JJ, Bratton DL, Henson PM. 1992.// Exposure of phosphstidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes trigers the specific recognition and removial by macrophages.// J. Immunol. 148: 220716.

46. Fairbairn DW, Olive PL, O'Neill KL. 1995. // The comprehensive review.// Mutat. Res. 339: 37-59.

47. Fairbairn DW, Walburger DK, Fairbairn JJ, O'Neillr . - - >~> * - - ^ v:

48. KL. 1996. // Key morphologic changes and DNA strand breaks in human lymphoid cells: discriminating apoptosis from necrosis.// Scanning. 18: 407-16.

49. Fairbairn JJ, Khan MW, Ward KJ, Loveridge BW, Fairbairn DW, O'Neill KL. 1995.// Induction of apoptotic cell DNA fragmentation in human cells after treatment with hyperthermia.// Cancer Lett. 89: 183-8.

50. Filippovich IV, Sorokina N1, Robillard N, Lisbona A. Chatal J.-F, 1998// Radiation-induced apoptosis in human tumor cell lines: adaptive response and split dose-effect.// Int. J. Cancer.77: 76-81.

51. Filipski J, Leblan J, Youdale T, Sikorska M, Walker PR, 1990.// Periodicity of DNA folding in higher order chromatin structures.// EMBO J. 9: 1319-27.

52. Fritsch M, Haessler C, Braudner G, 1993// Induction of nuclear accumulation of the tumor suppressor protein p53 by DNA damaging agents.//Oncogene. 8:307-18.

53. Fu L, Minden MD, Benchimol S, 1996//Translation regulation of p53 expression.//EMBO J. 15:4395401.

54. Gorczyca W, Gong J,Darzykiewicz Z, 1993.// Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays.// Cancer Res. 53: 1945-51.

55. Götz C, Montenarh M. 1996// p53: DNA damage, DNA repair, and apoptosis.// Rev Physiol Biochem Pharmacol.// 127: 65-95

56. Gromkowski SH, Brown TC, Cerutti P, Cerottini JC// DNA of human Raji target cells is damaged upon lymphocyte-mediated lysis.// J. Immunol. 1986. 136: 752-6.

57. Hall PA, McKee PH, Menage HP, Dover N, Lane DP, 1993//High levels of p53 protein in UV-irradiated normal human skin.//Oncogene. 8:203-7.

58. Hallan E, Blomhoff HK, Smeland EB, Lomo J, 1997.// Involvement of ICE (Caspase) family in gamma-radiation-induced apoptosis of normal Blymphocytes// Scand. J. Immunol. 46: 601-8

59. Hampton MB, Arrenius S, 1997. //Dual regulation of caspase activity by hydrogene peroxide: implications for apoptosis.//FEBS Lett. 414: 55256.

60. Hampton MB, Kettle AJ, Winterbourn CC, 1998// Inside the neutrophil phagosome: oxidants, mieloperoxidase and bacterial killing. Blood. 92: 3007-17.

61. Hannun YA, Obeid LM, 1995// Ceramide: an intracellular, signal for apoptosis.//Trends Biochem. Sei. 20:72-7.

62. Hansen R, Oren M, 1997//P53; from inductive signal to cellular effect.//Curr. Opin. Genet. Develop. 7: 46-51.

63. Hara S, Halicka HD, Bruno S, Gong J, Traganos F, Darzynkiewicz Z, 1996// Effects of protease inhibitors on early events of apoptosis.// Exp. Cell Res. 223: 372-84.

64. Heck MMS, Earnshaw WC, 1986.// Topoisomerase II: a specific marker for cell proliferation.// J. Cell Biol. 103: 2569-81.

65. Hermann M, Lorenz H-M, Voll R, Grunke M, Woith W,

66. Kalden JR. 1994.// A rapid and simple method for isolation of apoptotic DNA fragments.// Nucl. Acids Res. 22: 5506-7.

67. Hickman MJ, Samson LD, 1999. // Role of DNA mismatch repair and p53 in signaling induction of apoptosis by alkylating agents.// Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 96: 10764-9.

68. Hochstrasser M, 1998//There is the rub: a novel ubiquitin-like modification linked to cell cycle regulation.//Genes Develop. 12:901-7.

69. Holley WR, Chatterjee A. 1996.// Clusters of DNA induced by ionizing radiation: formation of short DNA fragments. I. Theoretical modeling.// Radiat. Res. 145: 188-99.

70. Holmberg K, Meijer AE, Harms-Ringdahl M, Lambert B, 1998.// Chromosomal instability in human lymphocytes after low dose rate gamma-irradiation and delayed mitogen stimulation//Int. J. Radiat. Biol. 73: 21-34 .

71. Hsang YH, Liu LF.// Identification of mammalian DNA topoisomerase I as an intracellular target of the anticancer drug camptothecin.// Cancer Res. 1988. 48: 1792-1796.

72. Huang L-C, Clarkin KC, Wahl GM, 1996.// Sensitivity and selictivity of the DNA damage sensor responsible for activating p53-dependent Gl arrest.//Proc Natl.Acad.Sei. USA. 93:4827-32.

73. Husain A, He G, Venkatraman ES, Spriggs DR, 1998.// BRCA-1 up-regulation is associated with repair-mediated resistance to cis-diamminedichloroplatinum (II).//Cancer Res. 58: 1120-23.

74. Jarovaia OV, Lagarkova MA, Razin SV, 1995// Specificity of human lymphocyte nucleolar longrange fragmentation by topoll and exogenouse Bal 31 nuclease depends on cell proliferation status.// Biochemistry 34: 4131-38.

75. Jaxel C, Tandon G, Portemer C, Mirambean G, Panijel J, Duguet M, 1988.//Topoisomerase inhibitors induce irreversible fragmentation of replicated DNA in Con A stimulated splenocites.// Biochemistry 27: 95-9.

76. Johnson RE, Glover MK, Marshall SK,1971.// Results of radiation therapy and implications for the clinical staging of Hodgkin's disease.// Cancer Res. 31:1834-7

77. Johnstone AP,1984//Rejoining of DNA strand breaks is an early nuclear event during the stimulation of quiescent lymphocytes// Eur. J. Biochem. 140: 401-6.

78. Kerr JFR, 1971//Shrinkage necrosis: a distinct model of cellular death//J. Pathol. 105: 13-20.

79. Kerr JFR, Wyllie AH, Currie AR. 1972// Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging application in tissue kinetics.// Br. J. Cancer 26: 239-57.

80. Khodarev NN, Sokolova IA, Vaughan AT, 1999.// Fdortive apoptosis as an initiator of chromosomal translocations// Med. Hypotheses. 52: 373-6.

81. Knippschild U, Oren M, Deppert W, 1996// Abrogation of wild-type p53 protein impair the Gl checkpoint after DNA damage.//Mol.Cell.Biol. 16:1126-37.

82. Major GN, Brady M, Notarianni GB, Collier JD, Douglas MS,1997//Evidence for ubiquitin-mediated degradation of the DNA repair enzyme for 06-methykguanine in non-tumor derived human cell and tissue extracts.//Biochem.Soc.Trans. 25:359S.

83. Marini M, Frabetti F, Musiani D, Franceschi C, 1997.// Oxygen radicals induce stress proteins and tolerance to oxidative stress in human lymphocytes.//Int. J. Radiat. Biol. 70: 337-50.

84. Marini M, Munsiami D, Sestili P, Cantoni 0,i- • ' ' -«if1. JL1996.// Apoptosis of human lymphocytes in the absence or presence of internucleosomal DNA cleavage.//Biochem. Biophys. Res. Commun. 229: 910-15.

85. Martin DS, Schwartz GK,1997//Chemotherapeutically induced DNA damage, ATP depletion, and the apoptotic biochemical cascade//Oncol. Res.9: 1-5.

86. Marx J, 1994.// New link found between p53 and DNA repair.//Science. 266:1321-22.

87. McConkey MD, Zhyvotovsky B,Orrenius S. 1996// Apoptosis molecular mechanisms and biochemical implications.// Mol.Aspects of Med. 17:1-10.

88. Meijer AE, Kronqvist US, Lewensohn R, HarmsRingdahl M, 1998.// RBE for the induction of apoptosis in human peripheral lymphocytes exposed in vitro to high-LET radiation generated by accelerated nitrogen ions// Int. J. Radiat. Biol. 73:169-77.

89. Meikrantz W, Bergom MA, Memisoglu A, Samson L, 1998. // 06-alkylguanine DNA lesions trigger apoptosis.// Carcinogenesis. 19: 369-72.

90. Meng H, Terado T, Kimura H,1998// Apoptosis induced by x-ray and chemical agents in murine fibroblastic cell lines with defect in repair of DNA double-strand breaks.// Int. J. Radiat. Biol. 73: 503-10.

91. Mengubas K, Fahey AA, Lewin J, Mehta AB, Hoffbrand AV, Wickremasinghe RG, 1999.//Killing of T lymphocytes by synthetic ceramide is by a nonapoptotic mechanism and is abrogated following mitogenic activation//Exp.Cell.Res. 249:116-22.

92. Messam CA, Pittman RN, 1998.// Asynchrony and commitment to die during apoptosis.// Exp. Cell Res. 238: 389-98.

93. Minato K, Kanzawa F, Nashio K, Fujiwara Y, Saijo N, 1990.// Characterization of etoposide-resistant human small-cell lung cancer cell line.// Cancer Chemother. Pharmacol. 26:313-17.

94. Morton NE. 1991.//Parameters of the human genome.//Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 88:7474-6.

95. Mundle SD, Gregory SA, Preisle HD, Raza A, 1996.// Enzymatic programming of apoptotic cell deathreview).// Pathobiology. 64: 161-70.

96. Muzio M, Salvesen GS, Dixit VM, 1997//FLICE induced apoptosis in a cell-free system. Cleavage of caspase zymogens.// J Biol Chem 272:2952-6.

97. Nagata S, Goldstein P, 1995.//The Fas death factor.// Science. 267:1449-55.

98. Nakano H, Shinohara K, 1994// X-ray-induced cell death: apoptosis and necrosis// Radiat. Res. 140: 1-9.

99. Nelson WG, Kastan MB, 1999.// DNA strand breaks: the DNA template alterations trigger p53-dependent DNA-damage response pathways.// Mol. Cell. Biol. 14: 1815-23.

100. Nicotera P, Leist M,1997//Energy supply and the shape of death in neurons and lymphoid cells//Cell Death Differ. 4:435-42.

101. Okamoto M, Kawai K, Reznikoff CA, Oyasu R, 1996.

102. Transformation in vitro of a tumorigenic rat urothelial cell line by hydrogen peroxide.//Cancer Res. 56: 4649-53.

103. Olive PL, Banath JP, Durand RE. 1990.// Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumour and normal cells measured using the 'comet' assay.// Radiat.Res. 122: 69-72.

104. Olive PL, Frazer G, Banath JP. 1993.// Radiation-induced apoptosis measured in TK6 human B lymphoblast cells using the comet assay.// Radiat. Res. 136: 130-6.

105. Olive PL, Johnston PJ, Banath JP, Durand RE, 1998//The comet assay: a new method to examine heterogeneity associated with solid tumors.// Nature Med. 4: 103-5.

106. Olive PL. 1999. //DNA damage and repair in individual cells: applications of the comet assay in radiobiology.// Int. J. Rad. Biol. 75: 395-405.

107. Olive PL.1995// Detection of hypoxia by measurement of DNA damage in individual cells from spheroids and murine tumours exposed to bioreductive drugs. I. Tirapazamine.// British J. Cancer.// 71: 529-36.

108. Oliver FJ, Menissier-de Murcia J, de Murcia G.1999//Poly(ADP-ribose) polymerase in the cellular response to DNA damage, apoptosis, and disease.// Am J Hum Genet. 64: 1282-8 .

109. Op den Kamp JAF. 1979.// Lipid asymmetry in membranes.// Ann. Rev. Biochem. 49: 47-59.

110. Oshita F, Saijo N, 1994.// Rapid polymerase chain reaction assay to detect variation in the extent of gene-specific damage between cisplatin- or VP-16-resistant and sensitive lung cancer cell lines.// Jpn. J. Cancer Res. 85: 669-73.

111. Ostling 0, Johanson KJ. 1984//

112. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damage in individual mammalian cells// Biochem. Biophys. Research Commun. 123: 2 91-8.

113. Ostling 0, Johanson KJ. 1987.// Bleomycin, in contrast to gamma irradiation, induces extreme variation of DNA strand breakage fron cell to cell.// Int. J. Radiat. Biol. 52: 683-91.

114. Pardee AB. 1974.// A restriction point for control of normal animal cell proliferation.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71: 1286-90.

115. Payne CM, Bjore CG, Schuttz DA,1992.//Change in the frequency of apoptosis after low and high dose of X-irradiation of human lymphocytes//J. Leuk.k. , V « «U, 4. «.'iwd »! «*>*<»-If. «rfUM'O- -» • -"uxor,* .iff»-»1. Biol. 52:433-40.

116. Peitsch MC, Muller C, Tschopp J, 1993.// DNA fragmentation during apoptosis is caused by frequent single-strand cutts.// Nucl. Acids Res. 21: 4206-9.

117. Piacentini M, Fesus L, Farrace MG, Ghibelli L, Pirredda L, Melino G. 1991.// The expression of "tissue" transglutaminase in two human cancer cell lines is related with the programmed cell death (apoptosis).// Eur. J. Cell. Biol. 54: 5870-78.

118. Piperakis S, Visvardis EE, Tassiou AM. 1999. // Comet assay for nuclear DNA damage.// Methods- in Enzymol. 300: 184-94.

119. Razin SV, Gromova II, Iarovaia OV, 1995.// Specificity and functional significance of DNA interaction with yhe nuclear Matrix: New approaches to clarify theold questions.// Int. Review Cytol. 162B: 405-448.

120. Richter C, Schweizer M, Cossarizza A, Franceschi C, 1996.// Control of apoptosis by cellular ATP level.// FEBS Lett. 378: -107-110.

121. Rosenberg SA, Boiron M, DeVita VT Jr, Johnson RE, Lee BJ, Ultmann JE, Viamonte M Jr, 1971.//Report of the Committee on Hodgkin's Disease Staging

122. Procedures.//Cancer Res. 31:1862-3

123. Rossing L, Fichtlscherer B, Breitschopf K, Haendeler J, Zeiher AM, Mulsch A, Dimmeler S, 1999.// Nitric oxide inhibits caspase-3 by S-nitrosation in vivo. J. Biol. Chem. 274: 6823-826.

124. Salvesen GS, Dixit VM. 1997//Caspases: intracellular signaling by proteolysis//Cell. 91: 443-6.

125. Salvesen GS,Dixit VM 1999// Caspase activation: theinduced proximity model// Proc.Natl.Acad.Sci. USA 96:10964-7.

126. Sandstrom BE, Marklund SL, 1990.//Effects of variation in glutatione peroxidase activity on DNA damage and cell survival in human cells exposed to hydrogen peroxide and tert-butyl hydroperoxide// Biochem. J. 271: 17-23.

127. Saraste A, 1999.// Morphologic criteria and detection of apoptosis.// Hertz 24: 189-95

128. Seki H, Kanegane H, Iwwai K, Konno A, Ohta K, Yachie A, Taniguchi N, Miyawaki T, 1994.// Ionizing radiation induces apoptotic cell death in human TcR-g/d+ T and natural killer cells without detectable p53 protein// Eur. J. Immunol. 24: 2914-17.

129. Selvakumaran M, Lin HK, Miyashita T, Wang HG, Krajewski S, Reed JC, Hoffman B, Liebermann D, 1994.// Immediate early up-regulation of bax expression by p53 but not TGF beta 1: a paradigm for distinct apoptotic pathways.//Oncogene. 9: 1791-8.

130. Shaw P, Freeman J, Bovey R, Iggo R, 1996//Regulation of specific DNA-binding by p53: evidence for a role for O-glycosylation and charged residues at the carboxyl-terminus.//Oncogene. 12:921-30.

131. Singh NP, McCoy MT, Tice RR, Schneider EL. 1988.//

132. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.// Exp. Cell Res. 175: 184-91.

133. Singh NP, Stephens RE. 1997.//Microgel electrophoresis: sensitivity, mechanisms, and DNA electrostretching.// Mutat.Res.383:167-7 5.

134. Singh NP, Stephens RE. 1998.//X-ray induced DNA double-strand breaks in human sperm.// Mutagenesis 13:75-9

135. Story MD, Voehringer DW, Malone CG, Hobbs ML, Meyn RE. 1994// Radiation-induced apoptosis in sensitive and resistant cells isolated from a mouse lymphoma.// Int. J. Radiat.Biol. 66: 659-68.

136. Sun A-M, Cohen GM, 1994. // Mg+2-dependent cleavage of DNA into kilobase pair fragmentsis reasonable for the initial degradation of DNA in apoptosis.// J. Biol. Chem. 269: 14857-60.

137. Swat W, Ignatowicz L, Kisielow P, 1991// Detection of apoptosis of immature CD4+8+ thymocytes by flow cytometry.// J. Immunol. Methods. 137: 79-87.

138. Thornberry NA, Lazebnik Y, 1998// Caspases: enemies within//Science 281: 1312-6.

139. Tomei LD, Shapiro JP, Cope FO. 1993. //Apoptosis in CH3/10T1/2 mouse embryonic cells:evidence of internucleosomal DNA modification in the absence of double strand cleavage.// Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 90: 853-7.

140. Tounekti O, Belehradek J, Mir LM, 1995.// Relationships between DNA fragmentation, chromatincondesation and changes in flow cytometry profiles detected during apoptosis.// Exp. Cell Res. 217: 506-12 .

141. Tounekti 0, Pron G, Belehradek J Jr, Mir LM, 1993.//Bleomycin, an apoptosis-mimetic drug that induces two types of cell death depending on the number of molecules internalized.// Cancer Res 53: 5462-9.

142. Ucker DS, Obermiller PS, Eckhart W, Apgar JR, Berger NA, Meyers J, 1992// Genome digestion is a dispensable consequence of physiological cell death mediated by cytotoxic T lymphocytes// Mol. Cell. Biol. 12: 3060-69.

143. Vral A, Cornelissen M, Thierens H, Lonagie H, Philippe J, Strijckmans K, De Ridder L. 1998// Apoptosis induced by fast neutrons versus 60Co grays in human peripheral blood lymphocytes.// Int.J.Radiat.Biol. 73: 289-95.

144. Walker PR, Smith C, Youdale T, Leblanc J, Whitfield JF, Sikorska M,1991// Topoisomerase II-reactive chemotherapeutic drugs induce apoptosis in thymocytes.// Cancer. Res. 51: 1078-85.

145. Wang JC, 1985.//DNA topoisomerases.// Ann. Rev. Biochem. 54: 665-97.

146. Ward JF, Blakely WF, Joner EI, 1985// Mammalian cells are not killed by DNA single strand breaks caused by hydroxyl radicals from hydrogen peroxide.// Radiat. Res. 103: 383-92.

147. Ward JF, Evans CL, Limoli CL, Calabro-Jones PM, 1987. // Radiation and hydrogen peroxide induced free radical damage to DNA.// Brit. J. Cancer. 55: 105-12.

148. Ward KJ. 1988.// DNA damage produced by ionizing radiation in mammalian cells: indication of mechanisms of formation and reparability.// Progr. Nucl. Acid Res. Mol. Biol. 35: 95-125.

149. Woessner RD, Mattern MR, Mirabelli CK, Johnson RK, Drake FH, 1991.// Proliferation- and cell cycle-dependent differences in expression of the 170 kDa forms of topoisomerase II in NIH-3T3 cells.// Cell Growth Differ. 2: 209-14.

150. Wyllie AH. 1980// Glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associated with of endogenious endonucclease activation.// Nature 284: 555-6.

151. Yang E, Korsmeyer SJ, 1996.// Molecular tanatopsis: a discourse on the BCL2 family and cell death.// Blood. 88: 386-401.

152. Yoshida A, Ueda T, Wano Y, Nakamura T, 1993.// DNA damage and cell killing by camptothecin and its derivative in human leukemia HL-60 cells.//Jpn. J. Cancer Res. 84: 566-73.

153. Yuan J, Shahman S, Ledoux S, Ellis H, Horvitz HR. 1993. // The C. elegans cell death gene ced3 encodes a protein similar to mammalian interleukin-lb-converting enzyme.// Cell. 75: 64152.

154. Zhou PK, Sproston AR, Marples B, West CM, Margison GP, Hendry JH, 1998// The radiosensitivity of human fibroblast cell lines correlates with residual level of DNA double strand breaks.// Radiother. Oncol. 47: 271-6.

155. Zini N, Santi S et al.// Discrete localization of different DNA topoisomerases in HeLa and K562 cell nuclei and subnuclear fractions.// Exp. Cell Res. 1994. 210: 336-8.

156. Белум A. 1980. Выделение лимфоцитов, гранулоцитов и макрофагов. В кн. "ЛимфоцитыЖ выделение. фракционирование, характеристика." Ред. Натвиг ДБ,

157. Перлман П, Визгелль X. Медицина. М.

158. Лисицына ТА, Тронов ВА, Коноплянников МА, Дурнев АД, Иванова ММ, 1998.//Исследование поврежденности ДНК мононуклеарных клеток крови больных системной красной волчанкой методом ДНК-комет// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 125: 73-8.

159. Разин СВ, Юдинкова ЕЮ, 1998.// Крупномасштабная фрагментация ДНК при апоптозе: разрезается ли геном по границам топологических доменов?// Известия РАН. Сер. Биол. 2: 167-71.

160. Тронов ВА, Гринько ЕВ, Бериташвили ДР, Филиппович ИВ. 1991//Микроэлектрофорез ДНК индивидуальных интактных и гамма-облученных тимоцитов.// Цитология 33: 94-102.

161. Тронов ВА, Гринько ЕВ, Кончаловский МВ, Данилова НБ, Терещенко ДГ, Филиппович ИВ,1993.// Остаточные повреждения ДНК в периферических лимфоцитах после тотального облучения человека// Медицинская радиология. 2:38-41.

162. Тронов ВА, Коноплянников МА, Никольская ТА, Константинов ЕМ,1999// Разрывы ДНК и апоптоз, индуцированные ингибитором топоизомеразы II этопозидом (УР—16).// Биохимия. 64: 412-420.

163. Тронов ВА, Коноплянников МА, Никольская ТА,175

164. Константинов ЕМ. 1999. // Апоптознестимулированных лимфоцитов человека и разрывы ДНК, индуцированные ингибитором топоизомеразы II этопозидом.// Биохимия 64: 412-20.

165. Тронов ВА, Пелевина ИИ. 1996.// Метод ДНК-комет индивидуальных клеток. Прицип и применение метода.//Цитология 38:427-39.

166. Тронов ВА, Терещенко ДГ, Коноплянников МА, 1998. // Механизм радиационной гибели лимфоцитов периферической крови человека, оцениваемой методом ДНК-комет.// Биофизика. 43: 115-24.

167. Тронов ВА. 1999.// Репарация ДНК и апоптоз.// Цитология. 41: 405-11.