Гибель лимфоидных клеток при воздействии окислительного стресса и генотоксических агентов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат биологических наук Коноплянников, Михаил Анатольевич

• Коноплянников, Михаил Анатольевич
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Коноплянников, Михаил Анатольевич

Введение

Гл.1. Обзор литературы И

1.1. Основные механизмы гибели клеток под действием различных химических и физических факторов

1.2. Активные формы кислорода и их роль в развитии апоптоза

1.3. Особенности клеточной гибели лимфоидных клеток

1.4. Методы регистрации клеточной гибели 34 Гл.2. Материалы и методы 40 Гл. 3. Результаты и обсуждение

3.1. ДНК-кометы как маркер клеточной гибели

3.2. Гибель мышиных лимфобластных клеток Р388 под действием окислительного стресса, вызываемого менадионом

3.3. Гибель мышиных лимфобластных клеток Р388 под действием оксида азота, индуцируемого нитропруссидом натрия

3.4. Гибель мышиных лимфобластных клеток Р388 под действием фото динамической терапии

3.5. Механизмы радиационной гибели лимфоцитов периферической крови человека

3.6. Клеточная гибель лимфоцитов периферической крови человека под действием этопозида

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Гибель лимфоидных клеток при воздействии окислительного стресса и генотоксических агентов»

Актуальность проблемы. Одной из актуальных проблем современной биологии является проблема клеточной гибели, так как клеточная пролиферация и клеточная гибель являются двумя уравновешенными процессами в целостном организме. В последние годы интенсивно развивалось одно из направлений этой проблемы, связанное с изучением механизмов программированной гибели клеток - апоптоза, который реализуется и контролируется сложной генетической программой, заложенной во все соматические клетки организма. Апоптоз, как программированная форма гибели клеток, часто противопоставляется некрозу, при котором гибель клеток обусловлена не внутренними факторами, а воздействием токсических агентов, имеющих обычно экстраклеточную природу [1, 2]. Известно, что одними из наиболее распространенных повреждающих факторов в целостном организме являются активные формы кислорода (АФК), которые приводят к развитию так называемого «окислительного стресса», конечным итогом которого может быть как апоптоз, так и некроз клеток [2].

Основные закономерности клеточной гибели в результате развития окислительного стресса до настоящего времени изучены явно недостаточно, хотя они представляют большой интерес для самых различных специалистов в области молекулярной и клеточной биологии, биохимии, биофизики, медицины, так как составляют фундамент для понимания различных физиологических и патологических процессов, протекающих в организме. Следует отметить, что основные исследования по воздействию окислительного стресса были проведены с использованием стабильных клеточных культур, т.е. в условиях, которые не могут быть полностью соотнесены с теми, в которых пребывают клетки в условиях целостного организма. Кроме того, большинство клеток в стабильных клеточных культурах по многим своим характеристикам и в частности по реакции на воздействие повреждающих агентов далеко не идентичны клеткам различных тканей целостного организма. Одним из перспективных подходов, позволяющим преодолеть эти принципиальные затруднения, является использование в экспериментах клеток лимфоидной системы, которые нетрудно выделить из крови и таким образом проводить исследования с использованием так называемых первичных культур, условия в которых позволяют наиболее адекватно отразить особенности реакции на воздействие повреждающих агентов клеток одной из важнейших систем организма. Кроме того, известно, что для клеток лимфоидной системы характерен высокий уровень клеточной пролиферации и клеточной гибели в" целостном организме [3]. Известно, что опухолевые клетки лимфоидного происхождения часто сохраняют способность к высокому уровню клеточной гибели при действии различных повреждающих агентов подобно своим неопухолевым аналогам. Вместе с тем, опухолевые клетки часто являются мутантными по гену р53, реализующему один из важнейших механизмов апоптотической гибели клеток, что создает дополнительные возможности для экспериментального изучения проявления апоптоза в мутантных клетках лимфоидной системы. Поэтому наряду с выделенными из крови лимфоцитами перспективным объектом для изучения закономерностей клеточной гибели в условиях первичных культур являются опухолевые клетки лимфоидного происхождения, которые являются мутантами по гену р53.

Наряду с изучением эффекта АФК на клетки лимфоидного происхождения перспективным является использование в таких исследованиях генотоксических агентов, повреждающее действие которых частично или полностью не связано с созданием «окислительного стресса». Это позволяет надеяться выявить некие, специфические особенности гибели лимфоцитов при действии АФК (например, касающиеся дозо-временных зависимостей клеточной гибели) или же получить сведения об отсутствии такой специфики. Среди этих генотоксических агентов особое внимание привлекают ионизирующая радиация и противоопухолевой агент - этопозид. Как известно, ионизирующая радиация наряду с продукцией большого количества окислительных радикалов может повреждать генетические структуры за счет прямого действия на биомолекулы (известно, что по грубым оценкам повреждение клеточной ДНК за счет прямого и непрямого действия соотносится примерно как 50% и 50%). Этопозид является одним из агентов, повреждающее действие которого на клетки связано не с продукцией АФК, а с тем, что данный препарат является специфическим ингибитором топоизомеразы II.

Изложенные соображения явились основанием для того, чтобы считать, что актуальной задачей является изучение закономерностей гибели клеток лимфоидного происхождения (как нормальных, так и опухолевых) при действии факторов, вызывающих окислительный стресс, в сравнении с гибелью клеток при действии генотоксических факторов, для которых повреждающее действие полностью или частично не определяется продукцией АФК. Подобные исследования и явились основной задачей данной диссертационной работы, проведенной с использованием в качестве объекта лимфоцитов периферической крови человека и мышиных лимфобластных клеток Р388. В качестве агентов, продуцирующих окислительный стресс, в данном исследовании использовали ряд различных агентов - менадион, относящийся к классу хинонов и продуцирующий в клетках супероксид-анион 02*; нитропруссид натрия, который является донором такого оксиданта, как оксид азота; и фотодинамическое воздействие, приводящее к генерации синглетного кислорода и других АФК. Наряду с этим планировалось изучить в сравнительном плане повреждающее действие на клетки лимфоидной природы ионизирующей радиации, биологическое действие которой связано как с продукцией окисляющих радикалов, так и с непосредственным повреждением генетического материала; а также другого генотоксического агента - этопозида, повреждающее действие которого не включает продукции агентов, вызывающих окислительный стресс.

Для решения поставленной задачи было решено применить достаточно адекватный методический подход, включающий регистрацию форм гибели клеток под действием ранее указанных факторов, как с использованием морфологических критериев (фазово-контрастная, флуоресцентная и электронная микроскопия), так и с использованием метода ДНК-комет и электрофореза ДНК-экстрактов.

Целью работы явилось получение новой научной информации, касающейся закономерностей клеточной гибели вследствие повреждающего действия агентов, вызывающих окислительный стресс, а также генотоксических агентов на клетки лимфоидного происхождения (лимфоциты периферической крови человека и мышиные лимфобластные клетки Р388).

В связи с этим в работе были поставлены следующие задачи: 1. Изучить с использованием биохимических и морфологических критериев повреждающее действие факторов, индуцирующих окислительный стресс (на примере использования менадиона, нитропруссида натрия и фотодинамического воздействия), на клетки лимфоидного происхождения.

2. Проанализировать характер дозо-временных зависимостей и влияние особенностей функционирования генотипа (на примере различий в гене р53 в нормальных и опухолевых клетках лимфоидной природы) в проявлении повреждающих эффектов изученных агентов.

3. В сравнительном плане оценить повреждающее действие на клетки лимфоидной природы ионизирующей радиации и этопозида, эффект которых не связан частично или полностью с продукцией АФК. Оценить роль метода ДНК-комет в выявлении ранних стадий клеточной гибели клеток лимфоидного типа при действии повреждающих агентов, а также в случаях повышенного спонтанного апоптоза.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В результате проведенных экспериментов было показано, что как факторы, индуцирующие окислительный стресс (менадион, донор оксида азота нитропруссид натрия, фотодинамическое воздействие), так и факторы, обладающие генотоксическим действием (ионизирующая радиация, ингибитор топоизомеразы II этопозид), при воздействии в условиях in vitro на клетки лимфоидного типа (лимфоциты периферической крови человека и мышиные лимфобластные клетки Р388) способны вызывать в зависимости от степени и длительности воздействия различные формы клеточной гибели - апоптоз и некроз.

При этом менадион, генерирующий образование в клетках супероксид-аниона О2 , с последующей продукцией других активных форм кислорода (АФК), в низкой концентрации (30 мкМ) приводит к преимущественному развитию апоптоза в большей части клеток Р388, по /»53-независимому механизму, связанному на начальном этапе с повреждением структуры митохондрий. Менадион, используемый в большой концентрации (100 мкМ), в ранние сроки инкубации (30 мин) приводит к появлению биохимических и морфологических признаков апоптоза, однако в более поздние сроки (120 мин) в большей части клеток наблюдается развитие процессов деструкции внутриклеточных органелл и цитолиза, характерное для морфологии некроза, что, по-видимому, отражает повреждение различных клеточных мембран, в первую очередь, митохондриальных мембран, что приводит к истощению энергетических ресурсов клеток, не позволяющих развиться полной и последовательной картине апоптоза. Таким образом, повреждение митохондриальных мембран может привести как к апоптозу, так и некрозу клеток.

Нитропруссид натрия, являющийся мощным донором оксида азота и применяемый в достаточно высокой концентрации, вызывал апоптоз только небольшой части опухолевых клеток Р388. Однако, при совместном воздействии нитропруссида натрия и менадиона, используемого в малой концентрации (5 мкМ), наблюдалась апоптотическая гибель большинства клеток. Этот эффект можно объяснить образованием более реакционноспособного производного оксида азота - пероксинитрита. Таким образом, разные формы АФК могут быть ранжированы по их способности приводить клетки к гибели.

Фотодинамическая терапия приводит в процессе последующей темновой инкубации к апоптозу большей части опухолевых клеток Р388, с последующим лизисом и уменьшением клеточности облученной популяции.

При гамма-облучении в дозе 5 Гр в лимфоцитах периферической крови человека индуцируются классифицируемые по методу ДНК-комет две формы клеточной гибели - апоптоз и некроз. Методом ДНК-комет были выявлены особенности процессов спонтанной апоптотической гибели необлученных лимфоцитов нормальных доноров, а при инкубации лимфоцитов больных системной красной волчанкой была обнаружена повышенная скорость развития спонтанного апоптоза по сравнению с лимфоцитами здоровых доноров.

При сравнительном изучении эффекта воздействия на лимфоциты периферической крови человека этопозида, не являющегося индуктором окислительного стресса, но обладающего генотоксическим действием, было обнаружено, что в исследуемых концентрациях (50-200 мкг/мл) инкубация клеток с препаратом в течение 3 или 24 ч индуцировала апоптоз. В отличие от индукторов окислительного стресса, при воздействии этопозида уровень апоптотической гибели мало зависел от концентрации препарата и длительности инкубации клеток.

Таким образом, сопоставление на клеточном уровне эффектов «чистых» индукторов окислительного стресса и агентов, повреждающее действие которых частично или полностью не связано с продукцией АФК, позволяет заключить, что для первых характерно появление обеих форм клеточной гибели - апоптоза и некроза, выраженность которых в значительной мере определяется дозой агента и продолжительностью действия (обычно «мягкий» окислительный стресс приводит по преимуществу к апоптозу, а «жесткий» стресс - к некрозу), в то время как для второго типа изученных агентов форма клеточной гибели и ее выраженность больше определяются спецификой действия агента, а не его дозой.

Полученные в данной работе результаты могут иметь и практическое значение при планировании использования исследованных или подобных по механизму воздействия агентов при лучевом, химиотерапевтическом, фотодинамическом или комбинированном лечении онкологических больных, когда стоит противоречивая задача усиления повреждения опухолевых клеток и ослабления в то же время повреждения клеток нормальных тканей. Практическое значение проведенных исследований по изучению механизмов действия агентов, приводящих к окислительному стрессу, связано не только с тем, что это одни из наиболее часто встречающихся факторов гибели клеток в организме, но и с тем, что познание таких механизмов важно для обоснования оптимальных схем их применения при лечении злокачественных новообразований человека. Так, данные об индукции массового апоптоза опухолевых клеток с последующим их лизисом при проведении фотодинамического воздействия обосновывает использование этого способа лечения злокачественных новообразований, если удается достичь различия в степени удержания фотосенсибилизатора между нормальными и опухолевыми клетками. Данные по способности малых доз менадиона усиливать повреждающее действие на клетки оксида азота (продуцируемого при введении нитропруссида натрия) позволяют рекомендовать применение этих двух уже известных радиосенсибилизаторов совместно при проведении лучевого или комбинированного лечения резистентных форм злокачественных новообразований. Важное значение для дальнейших исследований в области лечения больных системной красной волчанкой может иметь описанный в нашей работе феномен повышенной спонтанной апоптотической гибели лимфоцитов периферической крови, выявляемый методом ДНК-комет. Вообще, метод ДНК-комет несомненно является высокоперспективным для выявления в различных клеточных популяциях клеток, имеющих повреждения генетического аппарата, приводящие их к последующей гибели.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Коноплянников, Михаил Анатольевич

ВЫВОДЫ

1. Показано, что окислительный стресс (менадион, донор оксида азота нитропруссид, фотодинамическое воздействие) и генотоксические агенты (ионизирующая радиация, ингибитор топоизомеразы II этопозид) вызывают в клетках лимфоидного типа (лимфоцитах периферической крови человека и мышиных лимфобластных клетках Р388) в зависимости от степени и длительности воздействия различные формы клеточной гибели - апоптоз и некроз.

2. Менадион, генерирующий образование в клетках супероксид-аниона 02*~, с последующей продукцией других активных форм кислорода (АФК), в низкой концентрации (30 мкМ) приводит к преимущественному развитию апоптоза в клетках Р388 по р53-независимому механизму, связанному на начальном этапе с повреждением структуры митохондрий.

3. Менадион, используемый в большой концентрации (100 мкМ), в ранние сроки инкубации (30 мин) приводит к появлению биохимических и морфологических признаков апоптоза, однако в более поздние сроки (120 мин) в большей части клеток наблюдается развитие процессов некроза, что, по-видимому, связано с истощением энергетических ресурсов клеток, не позволяющих развиться полной и последовательной картине апоптоза.

4. Донор оксида азота нитропруссид натрия в высокой концентрации (1000 мкМ), вызывает апоптоз только небольшой части опухолевых клеток Р388. Однако, при совместном воздействии оксида азота и менадиона, используемого в малой концентрации (5 мкМ), наблюдается массовая апоптотическая гибель клеток. Этот эффект можно объяснить образованием более реакционноспособного производного оксида азота -пероксинитрита.

110

5. Фото динамическая терапия с использованием в качестве фотосенсибилизатора препарата из класса полиметинов приводит в процессе последующей темновой инкубации к апоптозу большей части опухолевых клеток Р388, с последующим лизисом и уменьшением клеточности облученной популяции. Развитие процесса апоптоза подтверждается как морфологическими, так и биохимическими критериями.

6. При гамма-облучении в дозе 5 Гр в лимфоцитах периферической крови человека индуцируются две формы клеточной гибели - апоптоз и некроз .

7. При инкубации лимфоцитов больных системной красной волчанкой обнаружена повышенная скорость развития спонтанного апоптоза по сравнению с лимфоцитами здоровых доноров.

8. Обнаружено, что этопозид, не являющийся индуктором окислительного стресса, но обладающий генотоксическим действием, в исследуемых концентрациях (50-200 мкг/мл) при инкубации в течение 3 или 24 ч индуцирует апоптоз. В отличие от индукторов окислительного стресса, при воздействии этопозида уровень апоптотической гибели мало зависит от концентрации препарата и длительности инкубации клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В предыдущем разделе диссертационной работы наряду с изложением результатов экспериментальных исследований уже проводилось обсуждение полученных данных, а в этом разделе будет сделана попытка на основе полученного материала кратко проанализировать в сравнительном аспекте основные закономерности клеточной гибели при воздействии факторов, индуцирующих окислительный стресс, и факторов, обладающих генотоксическим действием, когда эффект окислительного стресса или полностью отсутствует, или является не единственным действующим агентом. Результаты проведенных экспериментов показали, что все из изученных нами факторов обладали повреждающим действием на клеточном уровне, причем в зависимости от степени и длительности воздействия наблюдаются различные формы клеточной гибели, классифицируемые как апоптоз или как некроз. Ранее при анализе литературного материала и предварительном обсуждении результатов экспериментов в соответствующих разделах данной диссертационной работы было отмечено, что изучение закономерностей гибели клеток млекопитающих требует подбора хорошей экспериментальной модели. Такой моделью явились клетки лимфоидной природы, так как известно, что они являются одними из наиболее чувствительных к действию различных эндогенных и экзогенных повреждающих агентов [177]. Кроме того, особое место клетки лимфоидной природы занимают в экспериментальной биологии еще и потому, что их гибель в условиях in vivo и in vitro протекает однотипно [3, 180]. Это дает возможность использовать такие клетки в экспериментах, проводимых в условиях in vitro, когда значительно проще можно контролировать условия воздействия повреждающих агентов на клетки, исключая сложную гамму факторов, дополнительно действующих на лимфоидные клетки в целостном организме (в первую очередь гормоны и другие биологически активные агенты, продуцируемые при физиологических и патологических реакциях организма). Поэтому в нашей работе изучение действия агентов, вызывающих окислительный стресс, и генотоксических факторов проводили на лимфоцитах периферической крови человека и на мышиных лимфобластных клетках Р388. Исследования проводили на клеточных суспензиях in vitro, фактически являвшихся краткосрочными культурами переживающих клеток в минимальной среде с добавлением сыворотки. В таких условиях инкубация лимфоидных клеток с использованными агентами или инкубация их после воздействия таких физических факторов, как ионизирующая радиация или видимый свет на фоне введения фотосенсибилизатора (т.е. реализация фотодинамической терапии) позволяла в «чистом» виде выявить эффект данных агентов по тестам, позволяющим судить о развитии процессов апоптоза или некроза с помощью биохимических или морфологических критериев [4-6, 21, 37, 74, 177, 180,199].

Результаты проведенных экспериментов показали, что при воздействии менадиона большая часть мышиных лимфобластных клеток Р388 в условиях «мягкого» окислительного стресса (концентрация препарата 10 или 30 мкМ) гибнет по механизму апоптоза, а в условиях «жесткого» окислительного стресса (100 мкМ) в ранние сроки инкубации (0,5 ч) часть клеток подвергалась апоптозу, а другая часть клеток -некрозу; в поздние сроки такой инкубации (2 ч) наблюдался массовый некроз клеток. Механизм апоптоза в данном случае является р53-независимым, поскольку, как уже указывалось ранее, клетки Р388 являются дефектными по гену р53. Результаты нашей работы, обнаружившие повреждение митохондрий в ранние сроки инкубации с менадионом, позволяют заключить, что именно повреждение митохондрий является главным индуктором />53-независимого апоптоза клеток Р388 под действием окислительного стресса. Весьма вероятно, что повреждение митохондрий привело к освобождению из них таких индукторов апоптоза, как AIF и цитохром С, активирующих каспазы [3335, 41, 74]. Также можно предположить, что при достаточно большой концентрации менадиона (100 мкМ) вызываемый этим препаратом «жесткий» окислительный стресс приводит к резкому истощению внутриклеточного пула восстановленного глутатиона и других естественных антиоксидантов, а также к большему по сравнению с «мягким» окислительным стрессом повреждению ДНК и других клеточных структур. Вот почему в итоге большая часть клеток Р388 при «жестком» окислительном стрессе подвергается некрозу, а при «мягком» окислительном стрессе - апоптозу. Этот наш вывод хорошо согласуется с данными, полученными независимо двумя группами исследователей (группа Leist и группа Eguchi) на разных линиях клеток, о том, что понижение уровня внутриклеточного АТФ до 20-30% от исходного достаточно для того, чтобы механизм клеточной гибели «переключился» с апоптоза на некроз.

Нитропруссид натрия, являющийся мощным донором оксида азота и применяемый в достаточно высокой концентрации (1000 мкМ), вызывал апоптоз только небольшой части опухолевых клеток Р388. Однако, при совместном воздействии оксида азота и менадиона, используемого в малой концентрации (5 мкМ), через 2 ч инкубации наблюдалась апоптотическая гибель почти всех клеток. Этот эффект можно объяснить образованием более реакционноспособного производного оксида азота пероксинитрита. Пероксинитрит может диффундировать через мембраны и вызывать повреждения на некотором расстоянии от места своего образования. Пероксинитрит является индуктором образования различных повреждений ДНК (множественных форм модификации оснований, одноцепочечных и двухцепочечных разрывов ДНК) [110]. Как правило, множественные двухцепочечные разрывы ДНК приводят к апоптозу.

Основным выводом данной части нашей работы является заключение о том, что факторы, вызывающие окислительный стресс, могут быть ранжированы по степени индукции апоптоза, причем оксид азота N0 и супероксид-анион Ог~ вызывают апоптоз в значительно меньшем числе клеток, чем пероксинитрит ОЖЮ~~.

Фотодинамическая терапия с использованием в качестве фотосенсибилизатора препарата из класса полиметинов приводит в процессе последующей темновой инкубации к апоптозу большей части опухолевых клеток Р388, с последующим лизисом и уменьшением клеточности облученной популяции. Развитие процесса апоптоза подтверждается как морфологическим, так и биохимическим критериями. При этом общая морфологическая картина и динамика развития апоптотических изменений была аналогичной изменениям, наблюдаемым при инкубации клеток Р388 с менадионом. Можно предположить, что при фотодинамической гибели клеток, как и в случае действия менадиона, первоначальной мишенью действия активных форм кислорода являются митохондрии клеток. К аналогичному выводу о механизмах развития апоптоза при фотодинамическом воздействии на клетки лимфоидного типа пришли авторы недавней работы [238]. «Митохондриальный» вариант реализации апоптоза в наших опытах наиболее вероятен еще и потому, что клетки мышиной лимфобластной опухоли Р388 относятся к варианту новообразования с мутантной формой гена р53. В работе [233] сравнивали эффект фотодинамической гибели двух штаммов опухолевых клеток человека, происходящих из клеток прямой кишки, причем один из штаммов имел ген р53 дикого типа, а другой - ген р53 мутантного типа. Было показано, что в последнем случае клетки становятся более резистентными к фотодинамическому воздействию, хотя тип гибели остается тем же самым.

При гамма-облучении в дозе 5 Гр в лимфоцитах периферической крови человека индуцируются классифицируемые по методу ДНК-комет две формы клеточной гибели - апоптоз и некроз. Жизнеспособные лимфоциты дают симметричные или слегка асимметричные нуклеоиды, объединенные в классы комет СО и С1; некротические клетки дают кометы класса С4. Кометы промежуточного типа С2/СЗ отражают продвижение клеток к апоптозу. Недавно Пэйн и соавт. [240] пришли к аналогичному выводу о смешанном характере гибели лимфоцитов при гамма-облучении, показав, что спустя 16 ч после облучения в диапазоне доз 2-20 Гр в популяции клеток наблюдались морфологически идентифицируемые некроз и апоптоз лимфоцитов. Широко обсуждаемый в последние годы механизм радиационной гибели лимфоидных клеток остается не до конца выясненным. Существенную роль в развитии радиационного апоптоза играет активация возникающими разрывами ДНК экспрессии гена р53 [6-8], что может индуцировать каспазу-3 и каспазу-9 [15, 33-35]. Известно, что мутанты по гену р53 характеризуются повышенной резистентностью к радиационному воздействию [7, 9]. Кроме того, имеются данные о том, что при радиационном апоптозе лимфоидных клеток имеют место такие запускающие апоптоз события, как СБ95 лиганд/рецепторное взаимодействие [9], а также СБ95-независимая активация каспазы-8 (сазразе-8) [15, 19]. Имеются также данные об участии в процессе радиационного апоптоза церамида [28].

В научных исследованиях последних лет метод ДНК-комет рассматривается как один из наиболее перспективных при анализе клеточной гибели под действием различных агентов. Радиационный апоптоз изучали методом ДНК-комет в работах Олив и других исследователей [199, 217]. В нашей работе впервые была показана корреляция данных, полученных с помощью метода ДНК-комет, и данных, полученных при морфологической оценке частоты апоптоза при спонтанной апоптотической гибели необлученных лимфоцитов. При инкубации лимфоцитов больных системной красной волчанкой обнаружена повышенная скорость развития спонтанного апоптоза по сравнению с лимфоцитами здоровых доноров.

Был изучен эффект воздействия на лимфоциты периферической крови человека ингибитора топоизомеразы II этопозида, не являющегося индуктором окислительного стресса, но обладающего генотоксическим действием. Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что в использованных концентрациях (50-200 мкг/мл) инкубация с этопозидом в течение 3 или 24 ч индуцировала апоптоз лимфоцитов периферической крови человека. Этопозид вызывал в лимфоцитах формирование разрывов ДНК, часть которых (главным образом однонитевые разрывы) репарировала вскоре после удаления агента. Наличие апоптотической гибели подтверждается данными морфологического исследования и двумя биохимическими критериями. В отличие от индукторов окислительного стресса, при воздействии этопозида уровень апоптотической гибели мало зависит от концентрации препарата и длительности инкубации клеток.

Подводя итоги анализа экспериментальных данных, надо отметить, что основным выводом данной работы является то, что при изучении влияния факторов, индуцирующих окислительный стресс (менадиона,

108 донора оксида азота нитропруссида, фотодинамического воздействия) или обладающих генотоксическим действием (ионизирующая радиация, ингибитор топоизомеразы II этопозид), на клетки лимфоидного типа (лимфоциты периферической крови человека и мышиные лимфобластные клетки Р388) показана их способность вызывать различные формы клеточной гибели, классифицируемые как апоптоз и некроз. При этом при воздействии факторов, индуцирующих окислительный стресс, форма гибели зависит главным образом от степени и длительности воздействия. «Мягкое» воздействие (при низкой концентрации АФК) вызывает апоптоз, «жесткое» (при высокой концентрации АФК и при достаточной длительности воздействия) - некроз. В отличие от этого, при действии генотоксических агентов форма и уровень гибели в меньшей степени зависят от концентрации препарата и длительности воздействия, а в основном определяется спецификой повреждения ДНК. Медленно репарируемые двунитевые разрывы ДНК, индуцируемые гамма-облучением и этопозидом, индуцируют апоптоз как кинетически медленный процесс. Этот кинетически медленный апоптоз отличается от кинетически быстрого апоптоза, индуцируемого факторами, вызывающими окислительный стресс.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Коноплянников, Михаил Анатольевич, 2000 год

1. Программированная клеточная гибель / Под ред. проф. B.C. Новикова. СПб., Наука, 1996, 276 стр.

2. Buttke Т., Sandstrom P. Oxidative stress as a mediator of apoptosis // Immunol. Today, 1994, 15 (1), 7-10.

3. Линг Н.Г. Стимуляция лимфоцитов / M., Медицина, 1971, 288 стр.

4. Cell death in biology and pathology / Eds I.D.Bowen, R.A.Lockshin. London, 1981.

5. Majno G., Joris I. Apoptosis, oncosis and necrosis. An overview of cell death //Amer. J. Pathol., 1995, 146 (1), 3-15.

6. Уманский С.P. Апоптоз: молекулярные и клеточные механизмы // Молекулярная биология, 1996, 30 (3), 487-502.

7. Kuerbitz S.J., Plunkett B.S., Walsh W.V., Kastan M.B. Wild-type p53 is a cell cycle check point determinant following irradiation // Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1992, 89 (16), 7491-7495.

8. Zhen W., Denault C.M., Loviscek K., GengL., Vaughan A.T. The relative radiosensitivity of TK-6 and WI-L2-NS lymphoblastoid cells derived from a common source is primarily determined by their p53 mutational status // Mutat. Res., 1995, 346 (2), 85-92.

9. Henderson S., Huen D., Rowe M., Dawson C., Johnson G., Rickinson A. Epstein-Barr virus-coded BHRF1 protein, a viral homologue of Bcl-2, protects human В cells from programmed cell death // Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1993, 90 (18), 8479-8483.

10. Kozopas K.M., Yang T., Buchan H.L., Zhou P., Craig R.W. MCL1, a gene expressed in programmed myeloid cell differentiation, has sequence similarity to BCL2 // Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1993, 90 (8), 3516-3520.

11. Boise L.H., Gonzales-Garcia M., Postema C.E., Ding L., Lindsten T., Turka L.A., Mao X., Nunez G., Thompson C.B. Bcl-x, a bcl-2-related gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death // Cell, 1993, 74 (4), 597-608.

12. Oltvay Z.N., Milliman C.L., Korsmeyer S.J. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog, Bax, that accelerates programmed cell death //Cell, 1993, 74 (4), 609-619.

13. Kiefer M.C., Brauer M.J., Powers V.C., Wu J.J., Umansky S.R., Tomei L.D., Barr P.J. Modulation of apoptosis by the widely distributed Bcl-2 homologue Bak // Nature, 1995, 374 (6524), 736-739.

14. Zhivotovsky B. Caspases: their intracellular localization and translocation during apoptosis // Cell Death Differ., 1999, 6 (7), 644-651.

15. Gaziev A.I., Kutsyi M.P. Gamma-irradiated DNA activates histone Hl-specific proteinase of rat liver nuclei // Int. J. Radiat. Biol., 1992, 61 (2), 169-174.

16. Kutsyi M.P., Gaziev A.I Gamma-irradiation or hydrocortisone treatment of rats increases the proteinase activity associated with histones of thymus nuclei // Radiat Res., 1994,140 (2), 221-229.

17. Davie J.R. The nonhistone chromosomal protein, H2A-specific protease, is selectively associated with nucleosomes containing histone HI // J. Biol. Chem., 1986, 261 (22), 10410-10416.

18. Weaver V.M., Carson C.E., Walker P.R., Chaly N., Lach B., Raymond Y., Brown D.L., Sikorska M. Degradation of nuclear matrix and DNA cleavage in apoptotic thymocytes // J. Cell Sci., 1996, 109 (1), 45-56.

19. Збарский И.Б. Организация клеточного ядра / М., Наука, 1988, 368 стр.

20. Filipski J., Leblane J., Youndale Т., Sikorska M., Walker P.R. Periodicity of DNA folding in higher order chromatin // EMBO J., 1990, 9 (4), 13191327.

21. Amin C., Wagner A.G., Hay N. Sequence specific transcriptional activation by Мус and repression by Max // Mol. Cell. Biol., 1993, 13 (1), 383-390.

22. Kokileva L. Multistep chromatin degradation in apoptosis: DNA breakdown in apoptosis // Intern. Arch. Allergy Immunol., 1994,105 (4), 339-343.

23. Iovcheva C., Mladenova I., Dessev G. Removal of histone HI exposes linker DNA in chromatin to DNAse I // Mol. Biol. Rep., 1984, 10 (1), 9-12.

24. Газиев А.И., Куцый М.П. Протеиназа, специфичная к гистону HI, ассоциирована с ядерным матриксом и активируется ДНК, содержащей разрывы или денатурированные участки. Докл. АН СССР, 1988, 299 (1), 240-242.

25. Нага S., Halicka H.D., Bruno S., Gong J., Traganos F., Darzynkiewicz Z. Effect of protease inhibitors on early events of apoptosis // Exp. Cell Res., 1996, 223 (2), 372-384.

26. Szumiel I. Ionizing radiation-induced cell death // Int. J. Radiat. Biol., 1994, 66(4), 329-41.

27. Gaido M.L., Cidlowsky J.A. Identification, purification, and characterization of a calcium-dependent endonuclease (NUC18) from apoptotic rat thymocytes. NUC18 is not histone H2B // J. Biol. Chem., 1991, 266(28), 18580-18585.

28. Nikonova L.V., Nelipovich P.A., Umansky S.R. The involvement of nuclear nucleases in rat thymocyte DNA degradation after gamma-irradiation // Biochim. Biophys. Acta, 1982,699 (3), 281-289.

29. Mannherz H.G., Peitsch M.C., Zanotti S., Paddenberg R., Polzar B. A new function for an old enzyme: the role of DNase I in apoptosis // Curr. Top. Microbiol. Immunol., 1995, 198,161-174.

30. Enari M., Sakahira H., Yokoyama H., Okawa K., Iwamatsu A., Nagata S. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD // Nature, 1998,391 (6662), 43-50.

31. Cohen G.M. Caspases: the executioners of apoptosis // Biochem J., 326 (1), 1-16.

32. Nunez G., Benedict M.A., Hu Y., Inohara N. Caspases: the protease of the pathway // Oncogene, 1998, 17 (25), 3237-3245.

33. Friesen C., Herr I., Krammer P.H., Debatin K.M. Involvement of the CD95 (APO-l/Fas) receptor/ligand system in drug-indused apoptosis in leukemia cells //Nat. Med., 1996,2 (5), 574-577.

34. Thompson C.B. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease // Science, 1995, 267 (5203), 1456-1462.

35. Marchetti P., Susin S.A., Decaudin D., Garnen S., Castedo M., Hirsch T., Zamzami N., Naval J., Senik A., Kroemer G. Apoptosis-associated derangement of mitochondrial function in cells lacking mitochondrial DNA // Cancer Res., 1996, 56 (9), 2033-2038.

36. Zamzami N., Susin S.A., Marchetti P., Gomez-Monterrey I, CastedoM., Kroemer G. Mitochondrial control of nuclear apoptosis // J. Exp. Med., 1996, 183 (4), 1533-1544.

37. Susin S.A., Zamzami N., Castedo M., Hirsch T., Marchetti P., Macho A., Daugas E., Geuskens M., Kroemer G. Bcl-2 inhibits the mitochondrial release of an apoptogenic protease // J. Exp. Med., 184 (4), 1331-1341.

38. ICroemer G., Zamzami N., Susin S.A. Mitochondrial control of apoptosis // Immunol. Today, 1997, 18, 44-52.

39. Yang J., Liu X., Bhalla K., Kim C.N., Ibrado A.M., Cai J., Peng T.I., Jones

40. D.P., Wang X. Prevention of apoptosis by bcl-2: release of cytochrome C from mitochondria blocked // Science, 1997, 275 (5303), 1129-1132.

41. Kluck R.M., Bossy-Wetzel E., Green D.R., Newmeyer D.D. The release of cytochrome C from mitohondria: a primary site for bcl-2regulation of apoptosis // Science, 1997,275 (5303), 1132-1136.

42. Nicholson D.W. Identification and inhibition of the ICE/CED-3protease necessary for mammalian apoptosis // Nature, 1995, 376 (6535), 37-43.

43. Zou H., Henzel W.J., Liu X., Lutschg A., Wang X. Apaf-1, a human protein homologous to C. elegans ced-4, participates in cytochrome C-dependent activation of caspase-3 // Cell, 1997,90 (3), 405-413.

44. Li P., Nijhawan D., Budihardjo I., Srinivasula S.M., Ahmad M., Alnemri

45. E.S., Wang X. Cytochrome C and dATP-dependent formation of Apaf-l/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade // Cell, 1997, 91 (4), 479-489.

46. Chinnaiyan A.M., CTRourke K., Lane B.R., Dixit V.M. Interaction of ced-4 with ced-3 ced-9: a molecular framework for cell death // Science, 1997, 275 (5303), 1122-1126.

47. Wu D., Wallen H.D., Nunez G. Interaction and regulation of subcellular localization of ced-4 by ced-9 // Science, 1997, 275 (5303), 1126-1129.

48. Leist M., Single В., Castoldi A.F., Kuhnle S., Nicotera P. Intracellular adenosine triphosphate (ATP) copncentration: a switch in the decision У between apoptosis and necrosis // J. Exp. Med., 1997, 185 (8), 1484-1486.

49. Eguchi Y., Shimuzu S., Tsujimoto Y. Intracellular ATP levels determine cell death fate by apoptosis or necrosis // Cancer Res., 1997, 57 (10), 18351840.

50. Lieberthal W., Menza S.A., Levine J.S. Graded ATP depletion can cause necrosis or apoptosis of cultured mouse proximal tubular cells // Am. J. Physiol, 1998, 274 (2 Pt 2), F315-F327.

51. Липская Л.А. Зависимая от ионов кальция и магния эндонуклеаза 37 кДа активируется при индуцированном колхицином апоптозе в клетках HL-60// Цитология, 1994, 36 (3), 303-309.

52. Adebodun F. Role of intracellular free Ca and Zn in dexametazone-induced apoptosis and dexametazone resistance in human leukemic СЕМ cell lines // J. Cell. Physiol., 1995, 163 (1), 80-86.

53. Franclin J.L. Chronic depolarization prevents programmed death of sympathetic neurons in vitro but does not support growth: requirement for Ca2+ influx but not Trk activation // J. Neurosci., 1995,15 (2), 643-664.

54. Takei N., Endo Y. Ca ionophore-induced apoptosis on cultured embryonic rat cortical neurons // Brain Res., 1994, 652 (1), 65-70.

55. Zhivotovsky В., Cedervall В., Jiang S., Nicotera P. Involvement of Ca2+ in the formation of high molecular weight DNA fragments in thymocyte apoptosis //Biochem. Biophys. Res. Communs., 1994, 202 (1), 120-127.

56. Болдырев A.A. Карнозин / M., Изд-во МГУ, 1998, 320 стр.

57. Mello Filho A.C., Hoffmann M.E., Meneghini R. Cell killing and DNA damage by hydrogen peroxide are mediated by intracellular iron // Biochem. J., 1984,218(1), 273-275.

58. Lennon S.V., Martin S.J., Cotter T.G. Dose-dependent induction of apoptosis in human tumour cell lines by widely diverging stimuli // Cell Prolif, 1991, 24 (2), 203-214.

59. Duvall E., Wyllie A.H., Morris R.G. // Macrophage recognition of cells undergoing programmed cell death (apoptosis) // Immunology, 1985, 56 (2), 351-358.

60. Albina J.E., Cui S., Mateo R. B., Reichner J.S. Nitric oxide-mediated apoptosis in murine peritoneal macrophages // J. Immunol., 1993, 150(11), 5080-5085.

61. Benchekroun M.N., Pourquier P., Schott B., Robert J. Doxorubicin-induced lipid peroxidation and glutathioneperoxidase activity in tumor cell lines selected for resistance to doxorubicin // Eur. J. Biochem., 1993, 211 (1-2), 141-146.

62. Wagner B.A., Buettner G.R., Burns C.P. Increased generation of lipid-derived and ascorbate free radicals by L1210 cells exposed to the ether lipid edelfosine//Cancer Res., 1993, 53 (4), 711-713.

63. Muller I., Jenner A., Bruchelt G., Niethammer D., Halliwell B. Effect of concentration on the cytotoxic mechanism of doxorubicin-appoptosis and oxidative DNA damage // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1977, 230 (2), 254-257.

64. Zhong L.T., Sarafian T., Kane DJ., Charles A.C., Mah S.P., Edwards R.H., Bredesen D.E. Bcl-2 inhibits death of central neural cells induced by multiple agents //Proc. Nat Acad. Sci. USA, 1993,90 (10), 4533-4537.

65. Brune В., Hartzell P., Nicotera P., Orrenius S. Spermine prevents endonuclease activation and apoptosis in thymocytes // Exp. Cell Res., 1991, 195 (2), 323-329.

66. Galli G. Activation of apoptosis by serum deprivation in a teratocarcinoma cell line: inhibition by L-acetylcarnitine // Exp. Cell Res., 1993, 204 (1), 5460.

67. Bray T.M., Bettger W.J. The physiological role of zinc as an antioxidant // Free Rad. Biol. Med., 1990, 8 (3), 281-291.

68. Sandstrom P.A., Mannie M.D., Buttke T.M. Inhibition of activation-induced death in T cell hybridomas by thiol antioxidants: oxidative stress as a mediator of apoptosis. J. Leukocyte Biol., 1994, 55 (2), 221-226.

69. Кулинский В.И. Активные формы кислорода и оксидативная модификация макромолекул: польза, вред и защита // Соросовский Образовательный Журнал, 1999, 1, 2-7.

70. Saran М., Bors W. Radical reaction in vivo an overview // Radiat. Environ. Biophys., 1990, 29 (4), 249-262.

71. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / М., Наука, 1972,208 стр.

72. Schwartzman R.A., Cidlowki J.A. Apoptosis: the biochemistry and molecular biology of programmed cell death // Endocrine Rev., 1993, 14 (2), 133-151.

73. Maltzman W., Czyzyk L. UV irradiation stimulates levels of p53 cellular tumor antigen in nontransformed mouse cells // Mol. Cell. Biol., 1984, 4 (9), 1689-1694.

74. Halliwell В., Gutteridge J.M.C. Role of free radicals and catalytic metal ions in human disease: an overview // Methods Enzymol., 1990,186, 1-85.

75. Halliwell B. Drug antioxidant effects. A basis for drug selection? // Drugs, 1991,42(4), 569-605.

76. Christ M., Luu B., Mejia J.E., Moosbrugger I., Bischoff P. Apoptosis induced by oxysterols in murine lymphoma cells and in normal thymocytes. // Immunology, 1993, 78 (3), 455-460.

77. Sandstrom P.A., Tebbey P.W., Van Cleave S., Buttke T.M. Lipid hydroperoxides induce apoptosis in T cells displaying a HIV-associated glutathione peroxidase deficiency // J. Biol. Chem., 1994, 269 (2), 798-801.

78. Larrick J.W., Wright S.C. Cytotoxic mechanism of tumor necrosis factor-alpha // FASEB J., 1990, 4(14), 3215-3223.

79. Mattews N., Neale M., Jackson S.K., Stark J.M. Tumour cell killing by tumour necrosis factor: inhibition by anaerobic conditions, free-radical scavengers and inhibitors of arachidonate metabolism // Immunology, 1987, 62(1), 153-155.

80. Chang D.J., Ringold G.M., Heller R.A. Cell killing and induction of manganous superoxide dismutase by tumor necrosis factor-alpha is mediated by lipoxygenase metabolites of arachidonic acid // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1992, 188 (2), 538-546.

81. Renard D.C., Seitz M.B., Thomas A.P. Oxidized glutathione causes sensitization of calcium release to inositol 1,4,5-trisphosphate in permeabilized hepatocytes // Biochem J., 1992,284 (Pt 2), 507-512.

82. Sandstrom P.A., Roberts B., Folks T.M., Buttke T.M. HIV gene expression enhances T cell susceptibility to hydrogen peroxide-induced apoptosis // AIDS Res.Hum. Retroviruses, 1993, 9(11), 1107-13.

83. Akbar A.N. A possible role for bcl-2 in regulating T-cell memory- a 'balancing act' between cell death and survival // Immunol. Today, 1993, 14 (11), 526-532.

84. Hockenbery D.M., Oltvay Z.N., Milliman C.L., Kotmeyer S.J. Bcl-2 functions in an antioxidant pathway to prevent apoptosis // Cell, 1993, 75 (2), 241-251.

85. Allsopp T.E. Wyatt S., Paterson H.F., Davies A.M. The proto-oncogene bcl-2 can selectively rescue neurotrophic factor-dependent neurons from apoptosis // Cell, 1993, 73 (2), 295-307.

86. Sato N., Iwata S., Nahamura K., Hori T., Mori K., Yodoi J. Thiol-mediated redox regulation of apoptosis. Possible roles of cellular thiols other than glutatione on T cell apoptosis // J. Immunol., 1995, 154 (7), 3194-3203.

87. Mayer H., Noble M. N-Acetyl-L-cysteine is a pluropotent protector against cell death and enhancer of trophic factor mediated cell survival in vitro // Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1994, 91 (16), 7496-7500.

88. Ferrari G., Yan C.Y., Green L.A. N-Acetylcysteine (D- and L-stereoisomers) prevents apoptotic death of neuronal cells // J. Neurosci., 1995, 15 (4), 2857-2866.

89. Troy C.M., Shelanski M.L. Down-regulation of cooper/zink superoxide dismutase causes apoptotic death in PC 12 neuronal cells // Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1994, 91 (14), 6384-6387.

90. Greenlund L.J., Deckwerth T.L., Johnson T.V. Jr. Superoxide dismutase delays neuronal apoptosis: a role for reactive oxygen species in programmed neuronal death//Neuron, 1995,14 (2), 303-315.

91. Nathan C. Nitric oxide as a secretory product of mammalian cells // FASEB J., 1992,6(12), 3051-3064.

92. Mayer В., Hemmens B. Biosynthesis and action of nitric oxide in mammalian cells // Trends Biochem. Sci., 1997, 22 (12), 477-481.

93. Knowles R.G., Moncada S. Nitric oxide synthases in mammals // Biochem. J., 1994, 298 (Pt2), 249-258.

94. Nathan C., Xie Q.-W. Regulation of biosynthesis of nitric oxide // J. Biol. Chem., 1994, 269 (19), 13725-13728.

95. Moncada S., Palmer R.M., Higgs E.A. Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology // Pharmacol Rev., 1991, 43 (2), 109142.

96. Gross S.S., Wolin M.S. Nitric oxide: pathophysiological mechanisms // Annu. Rev. Physiol., 1995, 57, 737-769.

97. Xie Q.-W., Nathan C. The high-output nitric oxide path-way: role and regulation // J. Leukocyte Biol., 1994, 56 (5), 576-582.

98. Kronke K.-D., Fehsel K., Kolb-Bachofen V. Nitric oxide: cytotoxicity versus cytoprotection, how, why, when and where? // Nitric Oxide, 1997, 1 (2), 107-120.

99. Murphy M.E., Noack E. Nitric oxide assay using hemoglobin method // Methods Enzymol., 1994, 233,240-250.

100. Ванин А.Ф. К вопросу о стабильности динитрозильного комплекса железа с цистеином как кандидата на роль эндотелиального фактора релаксации кровеносных сосудов // Биохимия, 1995, 60 (2), 308-314.

101. Boese М., Mordvintcev P.I., Vanin A.F., Busse R., Mulsch A. S-nitrosation of serum albumin by dinitrosyl-iron complex // J. Biol. Chem., 1995, 270 (49), 29244-29249.

102. Stamler J.S. Redox signalling: nitrosylation and related target interactions of nitric oxide // Cell, 1994, 78 (6), 931-936.

103. Schmidt H.H.H.W., Walter U. NO at work // Cell, 1994, 78 (6), 919- 925.

104. Kerwin J.F., Lancaster J.R., Feldman P.L. Nitric oxide: a new paradigm for second messengers // J. Med. Chem., 1995, 38 (22), 4343-4362.

105. Butler A.R., Flitney F.W., Williams D.L.H. NO, nitrosonium ions, nitroxide ions, nitrosothiols and iron nitrosyls inbiology: a chemist's perspective//TrendsPharmacol. Sci., 1995, 16(1), 18-22.

106. Beckman J.S., Koppenol W.H. Nitric oxide, superoxide, and peroxynitrite: the good, the bad and the ugly // Am. J. Physiol., 1996, 271 (5Ptl), CI424-C1437.

107. Hausladen A., Fridovich I. Superoxide and peroxynitrite inactivate aconitases, nitric oxide does not // J. Biol. Chem., 1994, 269 (47), 2940529408.

108. Jia L., Bonaventura C., Bonaventura J., Stamler J.S. S-Nitrosohaemoglobin: a dynamic activity of blood involved invascular control//Nature, 1996, 380 (6571), 221-226.

109. Stamler J.S., Jaraki O., Osborne J., Simon D.J., Keaney J., Vita J., Singel D. Nitric oxide circulates in mammalian plasma primarily as an S-nitroso adduct of serum albumin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89 (16), 76747677.

110. Wink D.A., Miranda K.M., Espey M.G. Effects of oxidative and nitrosative stress in cytotoxity // Semin. Perinatol., 2000, 24 (1), 20-23.

111. Liu X., Gillespie J.S., Martin W. Non-adrenergic, non-cholinergic relaxation of the bovine retractor penis muscle: role of S-nitrosothiols // Br. J. Pharmacol., 1994, 111 (4), 1287-1295.

112. Stamler J.S., Singel D.J., Loscalzo J. Biochemistry of nitric oxide and its redox activated forms // Science, 1992, 258 (5090), 1898-1902.

113. Stamler J.S., Hausladen A. Oxidative modifications in nitrosative stress // Nature Struct. Biol., 1998, 5 (4), 247-249.

114. Meyer M., Schreck R., Baeuerle P.A. H202 and antioxidants have opposite effects on activation of NF-kappa B and AP-1 in intact cells : AP-1 as secondary antioxidant-responsive factor // EMBO J., 1993, 12 (5), 20052015.

115. Tabuchi A., Sano K., Oh E., Tsuchiya T., Tsuda M. Modulation of AP-1 activity by nitric oxide in vitro // FEBS Lett., 1994, 351 (1), 123-127.

116. Lander H.M., Sehajpal P.K., Novogrodsyk A. Nitric oxide signalling: a possible role for G-proteins // J. Immunol, 1993,151 (12), 7182-7187.

117. Fukuto J.M., Wink D.A. Nitric oxide (NO): formation and biological roles in mammalian systems // Met. Ions Biol. Syst., 1999, 36, 547-595.

118. Lander H.M., Ogiste J.S., Pearce S.F., Levi R., Novogrodsky A. Nitric oxide signalling: a possible role for G-proteins // J. Biol. Chem., 1995, 270 (13), 7017-7020.

119. Gopalakrishna R., Chen Z.H., Gundimeda U. Nitric oxide and nitric oxide generating agents induce a reversible inactivation of protein kinase C // J. Biol. Chem., 1993, 268 (36), 27180-27185.

120. Murphy M.P., Paker M.A., Scarlett J.L., Martin S.W. Peroxynitrite: a biologically significant oxidant // Gen. Pharmacol., 1998, 31 (2), 179-186.

121. Maria S.S., Lee J., Groves J.T. Peroxynitrite rapidly permeates phospholipid bilayers // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94 (26), 1424314248.

122. Liu X., Miller M.J.S., Joshi M.S., Thomas D.D., Lancaster J.R. Jr. Accelerated reaction of nitric oxide with oxygen within the hydrophobic interior of biological membranes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95 (5), 2175-2179.

123. Wink D.A., Mitchell J.B. Chemical biology of nitric oxide: Insights into regulatory, cytotoxic, and cytopropective mechanisms of nitric oxide //Free Radic. Biol. Med., 1998, 25 (4-5), 434-456.

124. Ioannidis I., de Groot H. Cytotoxicity of nitric oxide in FU5 hepatoma cells : evidence for cooperative action with hydrogen peroxide // Biochem. J.,1993, 296 (Pt2), 341-345.

125. Wolosker H., Panizzutti R., Engelender S. Inhibition of creatine kinase by S-nitrosoglutathione // FEBS Lett., 1996, 392 (3), 274-276.

126. Konorev E.A., Kalyanaraman B. Rapid and irreversible inhibition of creatine kinase by peroxynitrite // FEBS Lett., 1998, 427 (2), 171-174.

127. Brown G.C., Cooper C.E. Nanomolar concentrations of nitric oxide reversibly inhibit synaptosomal respiration by competing with oxygen at cytochrome oxidase // FEBS Lett., 1994,356 (2-3), 295-298.

128. Richter C., Gogvadze V., Schlapbach R., Schweizer M., Schlegel J. Nitric oxide kills hepatocytes by mobilizing mitochondrial calcium // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1994, 205 (2), 1143-1150.

129. Schweizer M., Richter C. Nitric oxide potently and reversibly deenergizes mitochondria at low oxygen tension // Biochem. Biophys. Res. Commun.,1994, 204(1), 169-175.

130. Cleeter M.W.J., Cooper J.M., Darley-Usmar V.M., Moncada S., Schapira A.H.V. Reversible inhibition of cytochromec oxidase, the terminal enzyme of mitochondrial respiratorychain, by nitric oxide // FEBS Lett., 1994, 345 (1), 50-54.

131. Brown G.C. Nitric oxide regulates mitochondrial respiration and cell functions by inhibiting cytochrome oxidase // FEBS Lett., 1995, 369 (2-3), 136-139.

132. Packer M.A., Porteous C.M., Murphy M.P. Mitochondrial superoxide production in the presence of nitric oxide leads to the formation of peroxynitrite // Biochem. Mol. Biol. Int., 1996, 40 (3), 527-534.

133. MacMillan-Crow L.A., Crow J.P., Kerby J.D., Beckman J.S., Thompson J.A. Nitration and inactivation of manganese superoxide dismutase in chronic rejection of human renal allografts // Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1996, 93 (21), 11853-11858.

134. Packer M.A., Scarlett J.L., Martin S.W., Murphy M.P. Induction of the mitochondrial permeability transition by peroxynitrite // Biochem. Soc. Trans., 1997, 25 (3), 831-836.

135. Hausladen A., Fridovich I. Superoxide and peroxynitriteinactivate aconitases, nitric oxide does not // J. Biol. Chem., 1994, 269 (47), 2940529408.

136. Lizasoain I., Moro M.A., Knowles R.G., Darley-Usmar V., Moncada S. Nitric oxide and peroxynitrite exert distinct effects on mitochondrial respiration which are differentially blocked by glutathione or glucose // Biochem. J., 1996, 314 (Pt3), 877-880.

137. Cassina A., Radi R. Differential inhibitory action of nitricoxide and peroxynitrite on mitochondrial electron transport // Arch. Biochem. Biophys., 1996, 328 (2), 309-316.

138. Radi R., Rodriguez M., Castro L., Telleri R. Inhibition of mitochondrial electron transport by peroxynitrite // Arch. Biochem. Biophys., 1994, 308 (1), 89-95.

139. Rubbo H., Denicola A., Radi R. Peroxynitrite inactivatesthiol-containing Trypanosoma cruzi energetic metabolismand inhibits cell respiration // Arch. Biochem. Biophys., 1994, 308 (1), 96-102.

140. Szabo C., Salzman A.L. Endogenous peroxynitrite is involved in the inhibition of mitochondrial respiration in immuno-stimulated J774.2 macrophages //Biochem. Biophys. Res. Commun., 1995,209 (2), 739-743.

141. Gunter T.E., Gunter K.K., Sheu S.-S., Gavin C.E. Mitochondrial calcium transport: physiology and pathological relevance // Am. J. Physiol., 1994, 267 (2Ptl), C313-C339.

142. Nicotera P., Ankarcrona M., Bonfoco E., Orrenius S., Lipton S.A. Neuronal necrosis and apoptosis: two distinct events induced by exposure to glutamate or oxidative stress // Adv. Neurol., 1997, 72, 95-101.

143. Nicotera P., Orrenius S. Ca2+ and cell death // Ann. NY Acad. Sci., 1992, 648, 17-27.

144. Ichas F., Jouaville L.S., Mazat J.-P. Mitochondria are excitable organnelles capable of generating and conveying electrical and calcium signals // Cell, 1997,89(7), 1145-1153.

145. Salgo M.G., Stone K., Squadrito G.L., Battista J.R., Pryor W.A. Peroxynitrite causes apoptosis in rat thymocytes // Biochem. Biophys. Res. Commun, 1995, 210 (3), 1025-1030.

146. Lautier D., Lagueux J., Thibodeau J., Menard L., Poirier G.G. Molecular and biochemical features of poly(ADP- ribose) metabolism // Mol. Cell. Biochem., 1993,122 (2), 171-193.

147. Zhang J., Dawson V.L., Dawson T.M., Snyder S.H. Nitric oxide activation of poly(ADP-ribose) synthase in neurotoxicity // Science, 1994, 263 (5147), 687-689.

148. Levine A.J. p53, the cellular gatekeeper for growth and division // Cell, 1997, 88(3), 323-331.

149. Hale A.J., Smith C.A., Sutherland L.C., Stoneman V.E.A., Longthorne V.L., Culhane A.C., Williams G.T. Apoptosis: molecular regulation of cell death // Eur. J. Biochem., 1996, 236 (1), 1 -26.

150. Leist M., Nicotera P. The shape of cell death // Biochem. Biophys. Res. Commun, 1997,236 (1), 1-9.

151. Albina J.E, Cui S, Mateo R.B, Reichner J.S. Nitric oxide-mediated apoptosis in murine peritoneal macrophages. J. Immunol, 1993, 150 (11), 5080-5085.

152. Messmer U.K., Lapetina E.G., Brune B. Nitric oxide-induced apoptosis in RAW 264.7 macrophages is antagonized by protein kinase C- and protein kinase A-activating compounds // Mol. Pharmacol., 1995, 47 (4), 757-765.

153. Kaneto H., Fujii J., Seo H.G., Suzuki K., Matsuoka T., Nakamura M., Tatsumi H., Yamasaki Y., Kamada T., Taniguchi N. Apoptotic cell death triggered by nitric oxide in pancreatic beta-cells // Diabetes, 1995, 44 (7), 733-738.

154. Ankarcrona M., Dypbukt J.M., Brune B., Nicotera P. Interleukin-1 beta-induced nitric oxide production activates apoptosis in pancreatic RINm5F cells//Exp. Cell Res., 1994, 213 (1), 172-177.

155. Fehsel K., Kroncke K.-D., Meyer K.L., Huber H., Wahn V., Kolb-Bachofen V. // J. Immunol., 1995,155 (6), 2858-2865.

156. Sandau K., Brune B. The dual role of S-nitroglutathione (GSNO) during apoptosis // Cell. Signal., 1996, 8 (3), 173-177.

157. Blanco F.J., Ochs R.L., Schwarz H., Lotz M. Chondrocyte apoptosis induced by nitric oxide // Am. J. Pathol., 1995,146 (1), 75-85.

158. Muhl H., Nitsch D., Sandau K., Brune B., Varga Z., Pfeilschifter J. Apoptosis is triggered by the cyclic AMP signaling pathway in renal mesangial cells // FEBS Lett., 1996, 382 (3), 271-275.

159. Messmer U.K., Ankarcrona M., Nicotera P., Brune B. p53 expression in nitric oxide-induced apoptosis // FEBS Lett., 1994, 355 (1), 23-26.

160. Messmer U.K., Reimer D.M., Reed J., Brune B. Nitric oxide induced poly(ADP-ribose) polymerase cleavage in RAW 264.7 macrophage apoptosis is blocked by Bcl-2 // FEBS Lett., 1996, 384 (2), 162-166.

161. Beauvais F., Michel L., Dubertret L. The nitric oxide donors, acide and hidroxylamine, inhibit the programmed cell death of cytokine-deprived human eosinophils //FEBS Lett., 1995, 361 (2-3), 229-232.

162. Liepe В.A., Stone С., Koistinaho J., Copenhagen D.R. Nitric oxide synthase in Muller cells and neurons of salamander and fish retina // J. Neurosci., 1994,14 (12), 7641-7654.

163. Terenzi F., Diaz-Guerra M.S., Casado M. et al. Bacterial lipopeptides induced nitric oxide synthase and promote apoptosis through nitric oxide-independent pathways in rat macrophages // J. Biol. Chem., 1995, 270 (11), 6017-6021.

164. Kim Y.-M., Bergonia H., Lancaster J.R. Jr. Nitric oxide-induced autoprotection in isolated rat hepatocytes // FEBS Lett., 1995, 374 (2), 228232.

165. Kim Y.-M., deVera M.E., Watkins S.C., Billiar T.R. Nitric oxide protects cultured rat hepatocytes from tumor necrosis factor-a-induced apoptosis by inducing heat shock protein 70 expression // J. Biol. Chem., 1997, 272 (2), 1402-1411.

166. Bellmann K., Jaattela M., Wissing D., Burkart V., Kolb H. Heat shock protein Hsp70 overexpression confers resistance against nitric oxide // FEBS Lett., 1996,391 (1-2), 185-188.

167. Хэм А., Кормак Д. Гистология / M., изд. «Мир», 1983, т.2, гл.13, «Лимфоидная ткань», стр. 191-252.

168. Lewin В. Genes / Oxford, NY, Tokyo; Oxford University Press, 1997, 1260 pp.

169. Сунгуров А.Ю. Радиобиология клеточной поверхности / М., изд. ВИНИТИ, 1988, 180 стр.

170. Методы исследований в иммунологии / Лефковитс И., Пернис Б. (ред.), М., изд. «Мир», 1981, 488 стр.

171. Пальцев М.А., Иванов А.А. Межклеточные взаимодействия / М., Медицина, 1995,224 стр.

172. Lu L., Lejtenyi D., Osmond D.G. Regulation of cell survival during B lympophopoiesis: suppressed apoptosis of pro-B cells in p53-deficient mouse bone marrow // Eur. J. Immunology, 1999, 29 (8), 2484-2490.

173. Haks M.C. Pre-TCR signaling and inactivation of p53 induces crucial cell survival pathways in pre-T cells // Immunity, 1999,11(1), 91-101.

174. Ling Y.H., el-Naggar A.K., Priebe W., Perez-Soler R. Cell cycle-dependent cytotoxicity, G2/M phase arrest, and disruption of p34cdc2/cyclin B1 activity induced by doxorubicin in synchronized P388 cells // Mol. Pharmacology, 1996, 49 (5), 832-841.

175. Hong M., Lai M.D., Lin Y.S., Lai M.Z. Antagonism of p53-dependent apoptosis by mitogen signals // Cancer Res., 1999, 59 (12), 2847-2852.

176. Cherbonnel-Lasserre C., Dosanjh M.K. Suppression of apoptosis by overexpression of Bcl-2 or Bcl-xL promotes survival and mutagenesis after oxidative damage // Biochimie, 1997, 79 (9-10), 613-617.

177. Matter A. Microcinematographic and electron micrographic analysis of target cell lysis induced by cytotoxic T-lymphocytes // Immunology, 1979, 36 (2), 179-190.

178. Russel S.W., Rosenau W., Lee J.C. Cytolysis induced by human lymphotoxin. Carcinographic and electron microscopic observation // Amer. J. Pathol., 1972, 69 (1), 103-118.

179. Bursch W.C., Paff B., Putz G., Schulte-Hermann R. Determination of the length of the histological stages of apoptosis in normal liver and in altered hepatic foci of rats // Carcinogenesis, 1990,11 (5), 847-853.

180. Akagi Y., Ito K., Sawada S. Radiation-induced apoptosis and necrosis in MOLT-4 cells: a study of dose-response relationships and their modification // Int. J. Radiat. Biol., 1993, 64 (1), 47-56.

181. Sun A.-M., Cohen G.M. Mg+2-dependent cleavage of DNA into kilobase pair fragmentsis reasonable for the initial degradation of DNA in apoptosis // J. Biol. Chem., 1994, 269 (21), 14857-14860.

182. Darzynkiewicz Z., Bruno S., Del Bino G., Gorczyca W., Hotz M., Lassota P., Traganos F. Features of apoptotic cells measured by flow cytometry // Cytometry, 1992, 13 (8), 795-808.

183. Dive C., Gregory C.D., Phipps D.J., Evans D.L., Milner A.E., Wyllie A.H. Analysis and discrimination of necrosis and apoptosis (programmed cell death) by multiparameter flow cytometry // Biochim. Biophys. Acta, 1992, 1133 (3), 275-285.

184. Swat W., Ignatowicz L., Kisielow P. Detection of apoptosis of immature CD4+8+ thymocytes by flow cytometry // J. Immunol. Methods, 1991, 137 (1), 79-87.

185. Hara S., Halicka H.D., Bruno S., Gong J., Traganos F., Darzynkiewicz Z. Effects of protease inhibitors on early events of apoptosis // Exp. Cell Res., 1996, 223 (2), 372-384.

186. Fairbairn D.W., Olive P.L., O'Neill K.L. The comet assay: a comprehensive review // Mutation Res., 1995, 339 (1), 37-51.

187. Тронов В.А., Пелевина И.И. Метод ДНК-комет для индивидуальных клеток. Обоснование и применение метода // Цитология, 1996, 38 (4-5), 427-439.

188. Ostling O., Johanson K.J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1984, 123 (1), 291-298.

189. Singh N.P., Stephens R.E. Microgel electrophoresis: sensitivity, mechanisms, and DNA electrostretching//Mutation Res., 1997, 383 (2), 167175.

190. Olive P.L., Banath J.P. Induction and rejoining of radiation-induced DNA single-strand breaks: "tail moment" as a function of position in the cell cycle // Mutation Res., 1993,294 (3), 275-283.

191. Olive P.L., Wlodek D., Durand R.E., Banath J.P. Factors influencing DNA migration from individual cells subjected to gel electrophoresis // Exp. Cell Res., 1992, 198 (2), 259-67.

192. Ostling O., Johanson K.J., Blomquist E., Hagelquist E. DNA damage in clinical radiation therapy studied by microelectrophoresis in single tumor cells // Acta Oncologics 1987,26 (1), 45-48.

193. Carson D.A., Ribeiro J. Apoptosis and desease // Lancet, 1993, 341 (8855), 1251-1254.

194. Eastman A. Apoptosis: a product of programmed and unprogrammed cell death//Toxicol. Appl. Pharmacol., 1993,121 (1), 160-164.

195. Humphrey C.D., Pittman F.E. A simple methylene blue azure II - basic fuchsin stain for epoxy embedded tissue sections // Stain Technol., 1974, 49 (1), 9-14.

196. Kerr J.F.R, Winterford C.M., Harmon B.V. Apoptosis: its significance in cancer and cancer therapy // Cancer, 1994, 73 (8), 2013-2026.

197. McConkey D.J, Zhivotovsky B, Orrenius S. Apoptosis molecular mechanisms and biomedical implications // Molec. Aspects Med, 1996, 171., i-iio.

198. Ormerod M.G. Apoptosis, flow cytometric studies // Microsc. & Anal,1993, 22 (1), 27-29.

199. Sarraf C.E, Bowen I.D. Kinetic studies on a murine sarcoma and analysis of apoptosis // Br. J. Cancer, 1986, 54 (6), 989-998.

200. Schwartz L.M, Osborne B.A. Programmed cell death, apoptosis and killer genes //Immunol. Today, 1993,14 (12), 582-590.

201. Willie A.H. Cell death // Int. Rev. Cytol, 1987, 17, 755-785.

202. Willie A.H. Apoptosis //Atlas of Sci.: Immunol, 1988, 1 (3-4), 192-196.

203. Hermann M, Lorenz H.-M, Voll R, Grunke M, Woith W, Kalden J.R. A rapid and simple method for isolation of apoptotic DNA fragments // Nucl. Acids Res, 1994, 22, 5506-5507.

204. Olive P.L, Wlodek D, Banath J.P. DNA double-strand breaks measured in individual cell subjected to gel electrophoresis // Cancer Res, 1991, 51, 4671-4676.

205. Урбах В.JI. Биометрические методы / М, Наука, 1964, 416 стр.

206. Elmen W, Niebur J, Kadera R. Accelerated in vitro apoptosis of lymphocytes from patients with systemic lupus erythematosus // J. Immunol,1994, 152 (7), 3685-3692.

207. Лисицына T.A, Тронов B.A, Коноплянников M.A, Дурнев А.Д, Иванова M.M. Исследование поврежденности ДНК мононуклеарных клеток крови больных системной красной волчанкой методом ДНК-комет // Бюлл. Эксп. Биол. и Мед, 1998, 125 (1), 75-78.

208. Halliwell B.H., Gutteridge J.M.C. Free Radicals in Biology and Medicine / Oxford University Press, Oxford, 1989.

209. Sun Y.L., Zhao Y., Hong X., Zhai Z.H. Cytochrome C release and caspase activation during menadione-induced apoptosis in plants // FEBS Lett., 1999, 462(3), 317-321.

210. Castilho R.F., Ward M.W., Nicholls D.G. Oxidative stress, mitochondrial function, and acute glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells//J. Neurochem., 1999, 72 (4), 1394-1401.

211. Parekh H., Chavan S., Chitnis M. Modulation of thiol pools by vitamin K3 and its effect on survival of sensitive and resistant murine tumor cells // Anticancer Drugs, 1991, 2 (2), 159-168.

212. Ross D., Thor H., Threadgill M.D., Sandy M.S., Smith M.T., Moldeus P., Orrenius S. The role of oxidative processes in the cytotoxicity of substituted 1,4-naphthoquinones in isolated hepatocytes // Arch. Biochem. Biophys., 1986, 248 (2), 460-466.

213. Caricchio R., Kovalenko D., Kaufmann W.K., Cohen P.L. Apoptosis provoked by the oxidative stress inducer menadione (Vitamin K(3)) is mediated by the Fas/Fas ligand system // Clin. Immunol., 1999, 93 (1), 65-74.

214. Franke W. Molecular biological methods motors of progress in cancer research / In: «Deusches Krebsforschungszentrum. Current cancer research, 1986», Springer, NY, 1986, pp. 26-28.

215. Takeda Y., Tashima M., Takahashi A., Uchiyama T., Okazaki T. Ceramide generation in nitric oxide-induced apoptosis. Activation of magnesium-dependent neutral sphingomyelinase via caspase-3 // J. Biol. Chem., 1999, 274(15), 10654-10660.

216. Wang H., Keiser J.A. Molecular characterization of rabbit CPP32 and its function in vascular smooth muscle cell apoptosis // Am. J. Physiol., 1998, 274 (4 Pt 2), HI 132-1140.

217. Vincent A.M., Maiese K. Nitric oxide induction of neuronal endonuclease activity in programmed cell death // Exp. Cell Res., 1999, 246 (2), 290-300.

218. Agarwal M.L., Clay M.E., Harvey E.J., Evans H.H., Antunez A.R., Oleinick N.L. Photodynamic therapy induces rapid cell death by apoptosis in L5178Y mouselymphoma cells // Cancer Res., 1991, 51 (21), 5993-5996.

219. He X.-Y., Sikes R., Thomsen S., Chung L.W.K. and Jacques S.L. Photodynamictherapy with photofrin II induces programmed cell death in carcinoma cell lines // Photochem. Photobiol., 1994, 59 (4), 468-473.

220. Luo Y., Chang C.K. and Kessel D. Rapid initiation of apoptosis by Western blots for cytochrome с and photodynamic therapy // Photochem. Photobiol., 1996, 63 (4), 528-534.

221. Granville D.J., Levy J.G. and Hunt D.W.C. Photodynamic therapy induces caspase-3 activation in HL-60 cells // Cell Death Differ., 1997, 4, 623-628.

222. He J., Whitacre C.M., Xue L.Y., Berger N.A., Oleinick N.L. Proteaseactivation and cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase: an integral part of apoptosis response to photodynamic therapy // Cancer Res., 1998, 58 (5), 940-946.

223. Luo Y., Kessel D. Initiation of apoptosis vs. necrosis by photodynamictherapy with chloroaluminum phthalocyanine // Photochem. Photobiol., 1997, 66 (4), 479-483.

224. Kessel D., Luo Y. Mitochondrial photodamage and PDT-induced apoptosis // J. Photochem. Photobiol., B: Biology, 1998,42 (1), 89-95.

225. Тронов В.А., Гринько E.B., Кончаловский M.B., Данилова Н.Б., Терещенко Д.Г., Филиппович И.В. Остаточные повреждения ДНК впериферических лимфоцитах после тотального облучения человека // Медицинская радиология. 1993, 39 (2), 38-41.

226. Payne С.М., Bjore C.G., Scultz D.A. Change of the frequency of apoptosis after low- and high-dose X-irradiation of human lymphocytes // J. Leukoc. Biol., 1992, 52 (4), 433-440.

227. Johnstone A.P. Rejoining of DNA strand breaks is an early nuclear event during the stimulation of quiescent lymphocytes // Eur. J. Biochem., 1984, 140, 401-406.

228. Walker P.R., Weaver V.M., Lach В., Leblanch J., Sikorska M. Endonucleas activities associated with high molecular weight and internucleosomal DNA fragmentation in apoptosis // Exp. Cell Res., 1994, 213,100-106.

229. Etoposide (VP-16), current status and new developments / Eds. Issel B.F., Muggia F.M., Carter S.K. Academic Press, New York, 1984, 346 pp.

230. Fournel S., Genestier L., Rouault J.P., Lizard G., Flacher M., Assossou O., Revillard J.P. Apoptosis without decrease of cell DNA content // FEBS Lett., 1995,367(2), 188-192.

231. Lagarkova M.A., Iarovaia O.V., Razin S.V. Large-scale fragmentation of mammalian DNA in the course of apoptosis proceeds via excision of chromosomal DNA loops and their oligomers // J. Biol. Chem., 1995, 270 (35), 20239-20241.

232. Long B.H., Musial S.T., Brattain M.G. DNA breakage in human lung carcinoma cells and nuclei that are naturally sensitive or resistant to etoposide and teniposide // Cancer Res., 1986,46 (8), 3809-3816.

233. Wang J.C. DNA topoisomerases // Annu. Rev. Biochem., 1985, 54, 665697.

234. Heck M.M., Earnshaw W.C. Topoisomerase II: A specific marker for cell proliferation // J. Cell Biol., 1986,103 (6 Pt 2), 2569-2581.

235. Jaxel C., Taudou G., Portemer C., Mirambeau G., Panijel J., Duguet M. Topoisomerase inhibitors induce irreversible fragmentation of replicated DNA in concanavalin A stimulated splenocytes // Biochemistry, 1988, 27 (1), 95-99.

236. Hsiang Y.H., Liu L.F. Identification of mammalian DNA topoisomerase I as an intracellular target of the anticancer drug camptothecin // Cancer Res., 1988,48 (7), 1722-1726.

237. Oshita F., Saijo N. Rapid polymerase chain reaction assay to detect variation in the extent of gene-specific damage between cisplatin- or VP-16-resistant and sensitive lung cancer cell lines // Jpn. J. Cancer Res., 1994, 85 (7),669-673.

238. Sun X.M., Cohen G.M. Mg(2+)-dependent cleavage of DNA into kilobase pair fragments is responsible for the initial degradation of DNA in apoptosis // J. Biol. Chem, 1994, 269 (21), 14857-14860.138