Разработка тест-системы для выявления вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, кандидат биологических наук Найденова, Екатерина Владимировна

• Найденова, Екатерина Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Найденова, Екатерина Владимировна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯ

1.2. МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ И МОНИТОРИНГА ПРИРОДНЫХ ОЧАГОВ КРЫМСКОЙ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ

Глава 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Вирусные штаммы, используемые в работе

2.2. Сбор, учет, хранение и доставка полевого материала 33 2.2.1. Сбор доставка и хранение проб клещей

2.3. Сбор, обработка и хранение сывороток крови людей

2.4. Исследование материала методом ИФА

2.4.1. Подготовка проб для исследований

2.4.2. ИФА на выявление вирусных антигенов

2.5. Исследование материала с помощью полимеразной цепной реакции

2.5.1. Подготовка проб для исследований

2.5.2. Проведение ПЦР

2.5.3. Получение рекомбинантного положительного контрольного образца

2.6. Методы статистической обработки результатов

Глава 3. СОЗДАНИЕ И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ РНК ВИРУСА КРЫМСКОЙ-КОНГО ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ МЕТОДОМ ОТ-ПЦР

ЗЛ. Выбор олигонуклеотидных праймеров на основе анализа генома вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки

3.2. Разработка оптимальных условий ПЦР

3.3. Разработка схемы подготовки проб для ОТ-ПЦР

3.4. Создание положительного контрольного образца

3.5. Характеристика тест-системы для выявления РНК вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции

Глава 4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЦЕННОСТИ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ РНК ВИРУСА ККГЛ МЕТОДОМ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ И ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

4.1. Программа комиссионных испытаний

4.2. Лабораторных контроль серий препарата и исследование вирусных штаммов и материала, искусственно инфицированного вирусом ККГЛ

4.3. Обследование полевого материала

4.4. Исследование сывороток крови больных КГЛ

4.5. Оценка тест-системы для выявления РНК вируса ККГЛ методом ОТ-ПЦР

Глава 5. ПРИМЕНЕНИЕ РАЗРАБОТАННОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ РНК ВИРУСА ККГЛ МЕТОДОМ ОТ-ПЦР ПРИ

МОНИТОРИНГЕ ПРИРОДНЫХ ОЧАГОВ КГЛ

5.1. Апробация тест-системы в ходе мониторинга природных очагов КГЛ

5.2. Использование тест-системы для изучения циркуляции вируса ККГЛ 79 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 84 ВЫВОДЫ 88 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ гэ - геномэквивалент

БСА - бычий сывороточный альбумин

Вирус ККГЛ - вирус Крымской-Конго геморрагической лихорадки ттг 1ПТЛ 1 yiv^iv - Государственный инс 1 и 1 у 1 сшндар шпации и контроля медицинских биологических препаратов

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота кДНК -комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота дНТФ - дезоксинуклеотидфосфат

ИФА - иммуноферментный анализ

КГЛ - Крымская геморрагическая лихорадка

КРС - крупный рогатый скот

МИБП - медицинские иммунобиологические препараты

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

РА - реакция агглютинации

РСК - реакция связывания комплемента

РНГА - реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации

РНК - рибонуклеиновая кислота нбм - новорожденные белые мыши н.о. - нуклеотидные основания

ТАЕ - трис-ацетат-ЭДТА буфер

Трис - (гидроксиметил) аминометан

ЭДТА - этилендиаминтетроуксусной кислоты натриевая соль

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка тест-системы для выявления вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции»

Актуальность проблемы. В Российской Федерации в последние годы отмечается ухудшение эпидемиологической ситуации по арбовирусным природно-очаговым инфекциям, что обусловлено резкой активизацией эпизоотического процесса в природных очагах, вторжением человека в неосвоенные или малоосвоенные регионы, а также уровнем организации и эффективности эпидемиологического надзора (Онищенко Г.Г. и др., 2000, 2005).

Глубокие экологические трансформации (потепление климата, сокращение лесного фонда и земель сельскохозяйственного назначения, восстановление степных ландшафтов в Северо-Западном Прикаспии и т.д.), наблюдавшиеся в течение последних лет на юге России, в том числе в регионе Нижнего Поволжья, привели к изменению видового состава и удельного веса отдельных носителей и переносчиков арбовирусов (Платонов А.Е., 2006). Это послужило предпосылкой для расширения ареала возбудителей ряда арбовирусных инфекций и формирования новых природных очагов. При этом произошло особенно резкое ухудшение эпидемиологической обстановки по Крымской геморрагической лихорадке (КГЛ). Возникновение вспышек этого заболевания в 1999-2006 гг. было отмечено не только на эндемичных территориях, но и в тех районах, где циркуляция вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки (ККГЛ) ранее не наблюдалась (Волгоградская область, Республики Калмыкия, Ингушетия, Дагестан) (Бутенко A.M., Ларичев В.Ф., 2004, Онищенко Г.Г. и др., 2005). За эти годы на юге европейской части России (в Астраханской, Волгоградской, Ростовской областях, Ставропольском крае и других регионах) было зарегистрировано 769 случаев заболеваний людей КГЛ. Высокая летальность, тяжелое клиническое течение, социальная значимость болезни определяют необходимость совершенствования методов ее лабораторной диагностики и мониторинга природных очагов КГЛ.

В настоящее время для лабораторной диагностики КГЛ используются методы, отличающиеся высокой чувствительностью, специфичностью и позволяющие проводить анализ большого количества образцов за непродолжительное время (Карань Л.С. и др., 2003, Смирнова С.Е., 2003). В первую очередь это различные модификации ИФА. Существенным недостатком ИФА является необходимость исследования парных сывороток крови взятых у больного в динамике заболевания, что значительно снижает диагностическую ценность метода. Кроме этого, чувствительность и специфичность ИФА ниже, чем методов генодиагностики, и, в частности, ПЦР. Создание и практическое внедрение ПЦР-тест-системы, предназначенной для выявления РНК вируса ККГЛ, будет способствовать решению многих актуальных задач - быстрой постановке предварительного диагноза, эффективной детекции возбудителей в биологическом материале и объектах внешней среды, что позволит адекватно оценить сложившуюся эпидемиологическую ситуацию и своевременно проводить противоэпидемические мероприятия.

Цель работы - разработка и внедрение в практику эпидемиологического обследования тест-системы для выявления РНК вируса ККГЛ методом ОТ-ПЦР.

Основные задачи исследования:

1. Разработать тест-систему для выявления РНК вируса ККГЛ методом ОТ-ПЦР.

2. Провести апробацию тест-системы на полевом и клиническом материалах.

3. Разработать нормативную документацию к тест-системе (фармакопейная статья предприятия, инструкция по применению, внутренняя и внешняя маркировки, пояснительная записка).

4. Провести Государственные испытания тест-системы для выявления РНК вируса ККГЛ.

5. Сконструировать рекомбинантный положительный контрольный образец к созданной тест-системе.

6. Изучить возможность использования ПЦР-анализа при обследовании территорий с целью выявления циркуляции вируса ККГЛ и мониторинга природных очагов КГЛ.

Научная новизна работы

Впервые разработана тест-система для выявления РНК вируса ККГЛ методом ОТ-ПЦР «ГенКонго». Чувствительность тест-системы 5x103 ГЭ/мл, специфичность - 100 %, воспроизводимость результатов -100%. Проведена ее апробация на полевом и клиническом материалах, определена диагностическая ценность в сравнении с ИФА и вирусологическими методами. Продемонстрирована эффективность использования ПЦР-анализа в ходе эпизоотологического обследования природных очагов КГЛ для детекции вируса ККГЛ у основных носителей и переносчиков (клещей родов Hyalomma, Rhipicephalus, Dermacentor и др.).

Практическая значимость работы

Проведены Государственные приемочные испытания разработанной тест-системы для выявления РНК вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки методом ОТ-ПЦР. Результаты Государственных испытаний одобрены на ученом совете ГИСК им. JI.A. Тарасевича (протокол № 14 от 19.10.04). Получены рекомендации комитета МИБП о регистрации препарата «Тест-система для выявления РНК вируса Крымской- Конго геморрагической лихорадки методом ОТ-ПЦР» в Российской Федерации и внедрении его в практику здравоохранения (протокол № 5 от 28.07.05).

На тест-систему для выявления РНК вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки методом ОТ-ПЦР разработана нормативно-техническая документация (фармакопейная статья предприятия, инструкция по применению, внутренняя и внешняя маркировки, пояснительная записка).

В Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» (г. Саратов) депонирован генетически модифицированный штамм E.coli TGI (pCCHF), на основе которого был сконструирован положительный контрольный образец к разработанной ПЦР-тест-системе и стандартный образец предприятия (СОПк+), используемый при контроле чувствительности и специфичности диагностического препарата в условиях производства.

ПЦР-тест-система апробирована при обследовании территории Саратовской области с целью выявления циркуляции вируса ККГЛ, а также при мониторинге природных очагов КГЛ в Волгоградской и Астраханской областях.

Материалы диссертации используются при чтении лекций на курсах подготовки и усовершенствования специалистов по особо опасным инфекциям в РосНИПЧИ «Микроб» и на курсах повышения квалификации «ПЦР в диагностике инфекционных болезней и индикации патогенных микроорганизмов».

Работа выполнена в рамках Федеральной целевой научно-технической программы - «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002-2006 годы, по договорам с ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (г. Москва) «Выявление и анализ специфичных участков геномов вирусов Западного Нила и Конго-Крымской геморрагической лихорадки, создание ПЦР-тест-систем, разработка нормативной документации» и «Сертификация ОТ-ПЦР-тест-систем для выявления РНК вирусов Крымской-Конго геморрагической лихорадки и лихорадки Западного Нила. Разработка сиквенс-систем и алгоритма комплексной лабораторной диагностики Крымской геморрагической лихорадки и лихорадки Западного Нила».

Основные положения, выносимые на защиту

1. На основе праймеров Wkgl и Wkg2, фланкирующих фрагмент размером 138 н.п. гена, отвечающего за синтез белка, входящего в состав нуклеопротеина, и локализованного в области консервативного участка S-сегмента разработана тест-система для выявления РНК вируса ККГЛ методом ОТ-ПЦР.

2. Разработанная ПЦР-тест-система для выявления РНК вируса ККГЛ характеризуется чувствительностью 5х103 ГЭ/мл, специфичностью - 100 %, воспроизводимостью результатов - 100 % и позволяет детектировать возбудителя КГЛ в биологическом материале и объектах внешней среды.

3. На основе рекомбинантной плазмиды pCCHF штамма Е. coli TGI (pCCHF) разработан положительный контроль к тест-системе и стандартный образец предприятия (СОПк+).

4. ПЦР-анализ может быть использован при эпидемиологическом обследовании территорий с целью изучения ареалов вируса ККГЛ и для мониторинга природных очагов КГЛ.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены и обсуждены на ежегодных

1. - - - ТЛ . Т ТТ ГТ-ГТТТ Ж 1 f ^ /П ЛАПЛ ЛЛЛ1 лллл ллл л научных конференциях гишшпи «микрии» (^apaiuts, zuuu, zuui, zvvz, zuut, 2005, 2006 гг.) и на научно-практической конференции «Арбовирусы и арбовирусные инфекции» - Астрахань, 2006 г., а также представлены на 1-й Всероссийской научно-практической конференции «Генная диагностика особо опасных инфекций», Саратов, 2000 г.; научно-практической конференции «Актуальные аспекты природноочаговых болезней», посвященной 80 - летаю Омского НИИПИ.- Омск, 2001.; Юбилейной научно-практической конференции «Эпидемиологическая безопасность на Кавказе. Итоги и перспективы», посвященной 50-летию Ставропольского НИПЧИ. - Ставрополь, 2002.; VIII съезде Всесоюзного общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - Москва, 2002 г.; 5-ой Всероссийской научно - практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней». - Москва, 2004 г.; VI Межгосударственной научно - практической конференции государств -участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств - участников содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях». - Волгоград, 2005 г.; VII Российском съезде инфекционистов «Итоги и перспективы диагностики и лечения инфекционных больных». - Нижний Новгород, 2006 г.

Публикации

Основные положения диссертации отражены в 8 опубликованных научных работах, в том числе в 2 изданиях, рекомендованных ВАК Российской Федерации и 4 - в сборниках материалов Международных и Всероссийских конференций.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 110 отечественных и 45 зарубежных источников. Общий объем работы составляет 112 страниц компьютерного текста, иллюстрированного 9 таблицами и 8 рисунками.

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Найденова, Екатерина Владимировна

ВЫВОДЫ

1. На основе праймеров Wkgl и Wkg2 сконструирована тест-система для выявления РНК вируса ККГЛ методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции «ГенКонго». Оптимизированы параметры ПЦР и состав реакционной смеси, определена методика выделения РНК, обеспечивающие высокую специфичность, чувствительность реакции при детекции РНК вируса ККГЛ.

2. Разработана нормативная документация на тест-систему для выявления РНК вируса Крымской - Конго геморрагической лихорадки методом ОТ - ПЦР: фармакопейная статья предприятия, экспериментально-производственный регламент и инструкция по применению. Получен паспорт на сконструированный стандартный образец предприятия (СОПк+).

3. Проведенные Государственные комиссионные испытания подтвердили диагностическую ценность тест-системы для выявления РНК вируса ККГЛ методом л

ОТ - ПЦР: чувствительность 5x10 ГЭ/мл, специфичность - 100 %, воспроизводимость результатов - 100 % при исследовании штаммов вируса, а также инфицированного материала и проб, доставленных с эндемичных по КГЛ территорий. Предложенная тест-система сохраняет чувствительность и специфичность в течение 6 месяцев хранения.

4. Показано, что ПЦР - анализ может быть использован при проведении эпидемиологического обследования эндемичных территорий с целью изучения циркуляции вируса ККГЛ и мониторинга природных очагов КГЛ. Продемонстрирована эффективность разработанной ПЦР-тест-системы при исследовании материала, собранного на территориях Саратовской, Волгоградской и Астраханской областей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одним из актуальных направлений современной вирусологии в последние годы является изучение возникающих и вновь возвращающихся вирусных инфекций человека (emerging infection diseases). Крымская геморрагическая лихорадка (КГЛ) -это острое вирусное природноочаговое лихорадочное заболевание человека, характеризующееся общей интоксикацией, наличием выраженного геморрагического синдрома и высокой летальностью - от 10 до 50% (в зависимости от пути передачи возбудителя).

Активизация природных очагов КГЛ (Ставропольский край, Ростовская и Астраханская области), распространение инфекции на новые территории (Волгоградская область, Республики Калмыкия, Дагестан и Ингушетия) (Бутенко A.M., Ларичев В.Ф., 2004, Онищенко Г.Г., 2005) определяют необходимость разработки высокочувствительных и специфичных средств лабораторной диагностики данного заболевания.

В последнее время для выявления вирусных геномов наиболее широко применяется полимеразная цепная реакция (ПЦР). Данный метод позволяет выявлять нуклеиновые кислоты вирусов в клиническом материале в первые дни болезни, когда, по причине отсутствия специфических антител, серологические методы диагностики оказываются не достоверными. Доказана эффективность ПЦР для выявления РНК вируса в полевом материале и идентификации выделенных вирусных штаммов.

С помощью компьютерной программы Vector NTI 9.0.0. и алгоритма BLAST на основе нуклеотидных последовательностей различных штаммов вируса ККГЛ, представленных в базе данных GenBank и в соответствии с требованиями, предъявляемыми к олигонуклеотидным затравкам, были выбраны праймеры Wkgl и

Wkg2, фланкирующие фрагмент размером 138 н.п. гена, отвечающего за синтез белка, входящего в состав нуклеопротеина, и локализованного в области консервативного участка S-сегмента РНК вируса ККГЛ. На основе этих праймеров была разработана ПЦР-тест-система «ГенКонго» для выявления РНК вируса ККГЛ методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР), проведена оценка ее чувствительности, специфичности и воспроизводимое ш, оптимизированы параметры ПЦР и состав реакционной смеси, определена методика выделения РНК.

Для обеспечения максимальной безопасности при работе с тест-системой был разработан положительный контроль, представленный рекомбинантной плазмидой, содержащей специфичный фрагмент кДНК вируса ККГЛ. Использование такого контрольного препарата позволяет исключить вирусологическую часть работы при производстве тест-системы и повышает ее стабильность при хранении.

На основе полученной рекомбинантной плазмиды pCCHF был разработан стандартный образец предприятия (СОПк+), который применяется для контроля чувствительности и специфичности выпускаемого диагностического препарата в условиях производства.

Полученный генетически модифицированный штамм Е. coli TGI (pCCHF) депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб».

Таким образом, в результате работы была предложена «Тест-система для выявления РНК вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции «ГенКонго», состоящая из 4 комплектов реагентов: для выделения РНК; для постановки реакции обратной транскрипции; для постановки ПЦР; для проведения электрофоретической детекции продуктов ПЦР.

Для определения диагностической ценности тест-системы были проведены Государственные приемочные испытания.

Оценку разработанной тест-системы осуществляли по следующим параметрам: -чувствительность (минимальное количество геномэквивалентов (ГЭ) вируса ККГЛ, выявляемых в ПЦР с помощью испытуемой тест-системы);

-специфичность (процент (%) неспецифических реакций при исследовании проб искусственно контаминированных гетерологичными штаммами);

-продолжительность анализа по времени (в часах, с учетом всех этапов подготовки);

- воспроизводимость (процент (%) совпадений результатов, полученных при постановке анализа с 10 положительными и 10 отрицательными пробами, приготовленными в разное время и разными исполнителями).

В связи с тем, что в качестве исследуемого материала в работе предполагалось использование вирусов, относящихся ко II группе патогенности, Государственные испытания и лабораторный контроль серий представленной тест-системы объединили и провели на базе лаборатории биологии и индикации арбовирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, РАМН.

В ходе Государственных испытаний была установлена высокая чувствительность

5x10 ГЭ/мл и специфичность препарата, что послужило основанием для рекомендаций Комитета МИБП внедрить тест-систему в практику здравоохранения и ее сертификацию.

В ходе ряда экспериментов было показано, что разработанная тест-система для выявления РНК вируса ККГЛ методом ОТ-ПЦР обеспечивает высокий уровень диагностических исследований и может быть использована для проведения эпизоотологического мониторинга природных очагов КГЛ.

Отчет о проведенных Государственных приемочных испытаниях рассмотрен на Ученом Совете ГйСК им. Тарасевича (протокол jNVi4 от 19.10.04) и утвержден Комитетом МИБП (протокол №5 от 28.07.05).

В результате проделанной работы доказано, что одним из преимуществ тест-системы по сравнению с вирусологическими методами является скорость получения результатов при исследовании вируссодержащего материала. Продолжительность ПЦР-анализа составила 6 часов при работе с вирусными штаммами и 10 часов для проб биологического материала.

Диагностическую ценность тест-системы «ГенКонго» определяли при исследовании полевого и клинического материала, собранного на территории Астраханской и Волгоградской областей, эндемичных по КГЛ, а также в южных районах Саратовской области.

Полученные в результате этой работы данные указывают, что сконструированная ПЦР-тест-система для выявления РНК вируса ККГЛ обладает высокой надежностью, специфичностью и чувствительностью. Установлена целесообразность использования генодиагностического препарата «ГенКонго» на практике, в качестве эффективного теста при проведении эпизоотологического мониторинга природных очагов КГЛ.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Найденова, Екатерина Владимировна, 2007 год

1. Аристова В.А., Колобухина Л.В. Щелканов М.Ю., Львов Д.К. Экология вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки и особенности ее клиники на территории России и сопредельных стран Текст.// Вопр. вирусологии 2001 -№4-С. 7-15.

2. Асваров Б.М. Совершенствование эпиднадзора по арбовирусным инфекциям в Республике Дагестан Текст.// ЖМЭИ. 2005. -№ 4 (приложение). -С.62-64.

3. Атшабар Б.Б., Айкимбаев A.M., Матаков М.И. Экологические аспекты существования эндемии Конго-Крымской геморрагической лихорадки на юге республики Казахстан Текст.// Пробл. особо опасн, инфекций. Саратов, 2002. -Вып. 84.-С.48-53.

4. Беклемишев В.Н. К изучению зараженности клещей переносчиков энцефалита методом биопробы Текст.// Вопр. вирусол. - 1963. - №2. - С. 240243.

5. Бутенко A.M. Материалы по изучению этиологии, лабораторной диагностики и иммунологии КГЛ: вопросы экологии вируса возбудителя Текст. Автореф. дис. докт. биол. наук.- М. 1970 г., 24 с.

6. Бутенко A.M. Циркуляция арбовирусов в Республике Гвинея Текст.// Мед. паразитол. 1996. - №2. - С. 40-45.

7. Бутенко A.M., Лещинская Е.В., Львов Д.К. Крымская геморрагическая лихорадка. Текст.// Вестник РАЕН.-2002.-№ 2.- С.41-49.

8. Василенко Н.Ф. Изучение распространения возбудителя Крымской геморрагической лихорадки в отдельных регионах юга России Текст.// ЖМЭИ. 2005. -№ 4 (приложение). - С. 23-27.

9. Василенко Н.Ф. Опыт применения ИФА и ОТ-ПЦР в диагностике Крымской геморрагической лихорадки в Ставропольском крае в 2002 г. Текст.// ЖМЭИ. 2005. 4 (приложение). -С.90-93.

10. Василенко Н.Ф., Афанасьев Е.Н., Тюменцева И.С., Ефременко В.И., Вышемирский О.И., Марков В.И., Евченко Ю.М., Бейер А.П. Лабораторная диагностика вспышки Крымской геморрагической лихорадки на юге России Текст.// ЖМЭИ. 2001. - №6 (приложение). - С.95-97.

11. Водяницкая С.Ю. Крымская геморрагическая лихорадка в современный период (на примере Ростовской области) Текст. Автореф. дис. . канд. мед. наук: Саратов, 2005 г., 26 с.

12. Вышемирский О.И. Анализ антигенной структуры штаммов вируса ККГЛ с помощью моноканальных антител Текст. Автореф. дис. . канд. мед. наук., Москва, 1993 г., 22 с.

13. Галимзянов Х.М., Малеев В.В., Черенов И.В., Аршба Т.Е., Черенова Л.П. Дифференциальная диагностика Крымской геморрагической лихорадки иастраханской риккетсиозной лихорадки Текст.// Инфекционные болезни 2006 -т. 14. - №1 - с.67-70.

14. Галкина И.В. Распространение арбовирусов в Поволжье Текст. Автореф. дис. . канд. мед. наук, Москва, 1991г., 23 с.

15. Гмыль Л.В. Молекулярно-биологическая характеристика вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки Текст. Автореф. дис. . канд. биол. наук, Москва 2003 г., 23 с.

16. Давидович В.Ф. Экологические факторы природной очаговости туляремии в Саратовской области Текст. Автореф. дис. . канд. биол. наук, Саратов, 1968., 25 с.

17. Денисов А.А., Савченко С.Т., Лазоренко В.В., Лобанов А.Н., Фролова Г.И., Фролов А.Ю., Русакова Н.В. Носители и переносчики Крымской геморрагической лихорадки в Волгоградской области Текст. // ЖМЭИ. 2005. -№ 4 (приложение). - С. 119 - 121.

18. Евченко Ю.М., Григорьев М.П., Грижебовский Г.М., Ефременко В.И., Бейер

19. Евченко Ю.М., Львов Д.Л., Сысолятина Г.В., Громашевский В.Л., Ефременко

20. Еременко Е.И., Афанасьев Е.Н., Солодовников Б.В., Василенко Н.Ф. Диагностика методом ОТ-ПЦР Крымской геморрагической лихорадки в

21. Г-У --------- ------ Л Л А1 1ПЛ1 ГТли лтлл/Г^Т/Г лллс \Г™ Лшьршшлыжим крас в xuui-^uu^ и. licavij// /ivm^i. — ^kjvj. -г