Разработка технологии глубинного способа культивирования микроорганизмов B. subtilis и B. licheniformis для производства пробиотиков тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Лиморенко, Анатолий Петрович

• Лиморенко, Анатолий Петрович
• кандидат биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Лиморенко, Анатолий Петрович

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.II

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Выбор направления исследований.

2.2. Материалы и методы исследований.

2.2.1. Микроорганизмы.

2.2.2. Питательные среды, растворы и реактивы.

2.2.3. Методы исследований.

2.3. Результаты исследований.

2.3.1. Разработка технологии глубинного способа культивирования микроорганизмов В. subtilis №3 и В. licheniformis №31.

2.3.1.1. Разработка состава питательных сред.

2.3.1.2. Отработка условий глубинного выращивания бацилл в ферментерах различного объема.

2.3.1.3. Стандартизация качества жидких питательных сред для глубинного культивирования В. subtilis №3 и В. Н-cheniformis №31.

2.3.1.4. Оптимизация условий приготовления и параметров оценки качества посевных рабочих культур В. subtilis № и В. licheniformis №31.

2.3.1.5. Оценка эффективности оптимизации состава питательных сред № 4 и № 7 при глубинном выращивании В. subtilis №3 и В. licheniformis №31 в ферментерах. IG

2.3.1.6. Воспроизводимость результатов выращивания культур В. subtilis №3 и В. licheniformis №31 по новой технологии. Ю

2.3.2. Сравнительная характеристика препарата биоспори-на, полученного по разработанной и существующей технологиям.

3. ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

5. ВЫВОДЫ.

6. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка технологии глубинного способа культивирования микроорганизмов B. subtilis и B. licheniformis для производства пробиотиков»

Разработка и внедрение в практику здравоохранения и ветере-нарии новых высокоэффективных препаратов для лечения и профилактики острых кишечных инфекций (ОКИ) и дисбактериозов представляет собой задачу, актуальность которой не вызывает сомнений.

Это объясняется ростом заболеваемости людей, в том числе военнослужащих, ОКИ, несвоевременной их диагностикой в условиях ухудшающейся эпизоотической, эпидемической и экологической обстановки, а также недостаточной эффективностью существующих лечебно-профилактических средств /56/.

Разработанный сотрудниками ИМВ АН Украины и внедренный в практику здравоохранения высокоэффективный лечебно-профилактический препарат «Биоспорин» /55, 57, 58/ выгодно отличается от известных аналогов на основе вегетативных бактерий («Бифидумбактерин», «Лактобактерин» и «Колибактерин» и споровых форм «Бактисубтил») /72, 82, 108/. Это объясняется комплексным механизмом действия препарата «Биоспорин» за счет сочетания в нем композиции спор и вегетативных клеток (В. subtilis №3 и < В. licheniformis №31), высокой антагонистической активностью бактерий-компонентов, которые синтезируют при росте и спорообразовании аминокислоты, антибиотики, другие биологически активные вещества. Этот биопрепарат отвечает современным требованиям (включая не только высокую специфическую активность по отношению к возбудителям ОКИ, но и продолжительность гарантийного срока хранения при комнатной температуре - не менее 3 лет), что свидетельствует о его перспективности и необходимости расширения производства.

Учитывая перспективность препарата «Биоспорин» и необходимость его внедрения в практику здравоохранения и ветеринарии РФ, реальность выпуска новых более удобных форм препарата, расширение областей применения этого пробиотика /11, 18, 25, 62, 64, 67, 81, 83, 86, 102/, проблема разработки принципиально новой отечественной технологии выпуска данного препарата является весьма актуальной.

Принятая на сегодняшний день опытно-промышленная технология производства препарата «Биоспорин», в которой используются выращенные на поверхности агаризованных ПС (сусло-агар, обогащенный гидролизатом мяса) микроорганизмы, обуславливает известные ограничения возможности значительного увеличения выпуска данного препарата для удовлетворения существующего спроса на него со стороны министерства здравоохранения и ветеринарной службы.

В этом плане, судя по имеющимся литературным данным и учитывая опыт работы с вакцинными и другими биопрепаратами бактериальной природы, глубинное выращивание микроорганизмов позволяет существенно повысить не только производственные возможности соответствующих предприятий микробиологической промышленности по выпуску готовой продукции, но и их рентабельность.

Цель работы - разработка технологии глубинного способа культивирования микроорганизмов В. subtilis №3 и В. licheniformis №31 для производства пробиотиков.

Для решения были поставлены следующие задачи:

1. Конструирование сбалансированного компонентного состава питательной среды для глубинного способа выращивания микроорганизмов В. subtilis №3 и В. licheniformis №31;

2. Разработка глубинного способа выращивания микроорганизмов - компонентов препарата «Биоспорин»;

3. Создание ATJI производства препарата биоспорин;

4. Оценка антагонистической активности готовых лекарственных форм препарата «Биоспорин» полученных из глубинных культур микроорганизмов - продуцентов.

5. Определение экономической эффективности разработанной технологии производства препарата «Биоспорин» в сравнении с существующей.

Научная новизна

Впервые проведен глубинный способ культивирования В. subtilis №3 и В. Licheniformis №31.

Разработана технология глубинного выращивания бацилл-компонентов биоспорина, с использованием отечественного сырья и оборудования.

В технологии производства обоснованы составы ПС прописей №4 и №7, изготавливаемые из дешевого недефицитного сырья. При культивировании В. subtilis №3 и В. Licheniformis №31 использованы серийно выпускаемые в РФ материалы и реактивы, аналитические и контрольно-измерительные приборы и технологическое оборудование (КМ-ОД, БИОР-ОД, БИОР-0,25), а также отдельные изготовленные в Центре ВТП БЗ нестандартные установки.

Впервые разработана отечественная экспериментально-производственная технология выпуска в ампулах (флаконах) нового перспективного лечебно-профилактического препарата «Биоспо-рин» на основе глубинных культур антагонистически активных аэробных спорообразующих бактерий.

Впервые определена антагонистическая активность глубинных культур В. Subtilis №3 и В. Licheniformis №31. Определена эффективность препарата «Биоспорин» в качестве профилактического и терапевтического средства при желудочно-кишечных заболеваниях у сельскохозяйственных животных.

Определены характеристики глубинного культивирования В. Subtilis №3 и В. Licheniformis №31 и параметры оценки качества форм препарата. Создан и скомпонован оптимальный состав АТЛ производства препарата «Биоспорин».

Создана, аттестована (сертификат производства № 000582/9973024) и лицензирована (Лицензия Минздрава РФ № 009547, регистрационный номер 64/872/99) экологически безопасная технология производства препарата «Биоспорин».

Практическая значимость

1. Создан экспериментально-производственный регламент «Биоспорин сухой» (инв.№ 580-96), утвержденный начальником Центра ВТП БЗ и согласованный с ГИСК им. JI.A. Тарасевича;

2. Разработана и утверждена фармакопейная статья (ФС 423476-98);

3. Разработан сборник стандартов предприятия по оценке качестве препарата «Биоспорин» (Арх. Центра ВТП БЗ, инв.№ Д-106);

4. Получено заключение комиссии по Государственным испытаниям препарата «Биоспорин», приготовленного по технологии Центра ВТП БЗ.

5. В процессе приготовления по указанной технологии опытных и установочных серий пробиотика подтверждена правомерность и удовлетворительная воспроизводимость разработанных процессов и операций, режимов, а также методологии входного, операционного и приемочного видов контроля качества. Характеристики опытных и установочных серий препарата «Биоспорин», полученных из глубинных культур В. subtilis №3 и В. licheniformis №31, отвечали предъявляемым требованиям, что подтверждено положительными результатами испытаний их качества в ГИСК им. JI.A. Тарасевича.

7. Установочные серии препарата «Биоспорин» во флаконах (№>№ 6,7 и 8), изготовленные из глубинных культур бактерий после заключения ГИСК им.Л.А.Тарасевича об их соответствии ВФС 42-366ВС-92 успешно прошли Государственные клинические испытания.

10

8. Разработано наставление по применению препарата «Био-спорин» для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний у сельскохозяйственных животных.

Структура диссертационной работы.

Диссертация изложена на ^ ЩУ страницах машинописного текста, иллюстрирована 10 рисунками и 32 таблицами. Библиографический список представлен 108 источниками, из них 23 - зарубежных автора.

Вопросы, выносимые на защиту:

На защиту выносится научное положение о том, что разработанная технология глубинного способа культивирования микроорганизмов В. subtilis №3 и В. licheniformis №31, позволяет сократить в 6 раз продолжительность выращивания микроорганизмов и в 10 раз увеличить объем выпуска препарата, удовлетворяющего требованиям ВФС 42-366ВС-92.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Существующая технология производства препарата «Биоспорин», разработанная сотрудниками ИМВ НАН Украины и Днепропетровского химфармзавода /55, 57, 58/, основывается на применении микроорганизмов В. subtilis №3 и В. licheniformis №31 (в виде смеси вегетативных клеток и споровых форм), выращенных на поверхности агаризованных ПС (сусло-агар, обогащенный гидролиза-том мяса) в биологических матрацах при температуре 28°С в течение соответственно 18чи7-12 суток.

Данная технология является малопроизводительной и дорогостоящей прежде всего из-за использования указанного способа репродукции бактерий, сопряженного с высокими материальными и трудозатратами, большим числом операций с применением ручного труда, продолжительностью выращивания клеток до образования спор.

Альтернативой поверхностному выращиванию бактерий является разработка новой технологии глубинного культивирования в ферментерах различной вместимости, позволяющей получать требуемое количество биомассы с необходимым качеством и обеспечивающей потребности в препарате биоспорин Минздрава РФ и ветеринарии РФ.

При разработке глубинного способа выращивания бактерий в ферментерах для получения максимального выхода целевого продукта необходимо подобрать сбалансированный по питательным веществам компонентный состав питательной среды и создать оптимальные условия ведения процесса биосинтеза.

Исследованиями различных авторов установлена зависимость признаков спорообразования от источников питания и условий культивирования, в том числе и бактерий рода Bacillus /5, 21, 22, 27, 29, 39, 50, 51, 52, 70, 71, 89, 90, 96, 98, 99, 103, 104/.

Микроорганизмы видов В. subtilis и В. licheniformis могут развиваться на белковых и синтетических ПС с аммонийными солями или нитратами. К бактериям, восстанавливающим нитраты, относят многие штаммы В. licheniformis /21, 22, 70/. Основным источником азотного питания для В. subtilis и В. licheniformis, как и для других непатогенных аэробных спорообразующих бактерий, является белковое сырье, в частности: пептон, соя, казеин, горох и некоторое другое /5, 21, 27, 39, 52, 54, 71, 82/.

Изучение потребностей аэробных спорообразующих бактерий в аминокислотах показывает значительные различия в них для разных штаммов, в том числе и для В. subtilis и В. licheniformis /5, 39/. Так, для ряда штаммов В. subtilis, включая и используемый в препарате «Биоспорин», было установлено, что они не ауксотрофны в отношении какой-либо из 20 аминокислот, содержащихся в испытанных ПС. В тоже время, при использовании белковых субстратов в составе ПС происходит преимущественная утилизация определенных аминокислот. Например, при культивировании В. subtilis №№ 110, 16 и 39 в течение 18 ч на ПС, содержащей депротеинези-рованную сыворотку крови, преимущественно используется аргинин, треонин и серин. В тоже время, культуры В. licheniformis, в частности, штамма №58, требуют для своего развития обязательного присутствия в составе ПС таких аминокислот, как аланин, аргинин, глицин, гистидин и глутаминовая кислота /21/. Что касается В. Н-cheniformis, то этот штамм также не является ауксотрофом /2, 54, 72, 73/.

Бациллы в качестве субстратов окисления используют простые углеводы (моно- и дисахариды), некоторые полисахариды (декстрин, крахмал), органические кислоты и спирты, а также сложные высокомолекулярные углеводы, в частности пектин /5, 39, 70/. В зависимости от условий культивирования аэробные спорооб-разующие бактерии могут окислять субстраты при участии кислорода воздуха в процессе дыхания или вызывать брожение /5, 30, 70/.

Интенсивность процессов спорообразования зависит от наличия в ПС минеральных солей, содержащих ионы Са, Mg, К, Mn, Fe, Zn, Си и других металлов /5, 21, 30, 70/. В отсутствии некоторых из них, прежде всего Са, Mg, Mn спорообразование может происходить замедленно или же вообще не наблюдаться /21, 33, 34, 70, 93, 100/. Установлена роль иона марганца в процессе спорообразования у В. subtilis. Этот ион необходим в качестве К0-фактора фосфатгли-церомутазы, которая является ферментом, участвующим в процессе споруляции /5, 70/. При изучении влияния катионов Na, Са, Mg, К, Li, Zn на синтез экзопротеазы и спорообразование В. licheniformis №28КА были определены оптимальные концентрации этих катионов для получения максимального выхода фермента и спор /21, 22/. Выход фермента и спор возрастает при увеличении концентрации NaCl до 80 мМ и снижается при дальнейшем увеличении концентрации соли. Подобным действием обладают соли других металлов (Са, Mg, К, Li). Катионы с одной и той же валентностью имеют одинаковую эффективность. Оптимальные концентрации одновалентных металлов в 20-30 раз выше, чем для двухвалентных и в 400-800 раз выше, чем для трехвалентных. Предполагается, что испытанные катионы, нейтрализуя поверхностный отрицательный заряд на цитоплазматической мембране, регулируют образование эк-зопротеазы и связанное с этим процессом спорообразование В. licheniformis.

Таким образом, микроорганизмы В. subtilis и В. licheniformis способны образовывать споры, используя для своего питания органические и неорганические источники азота, различные углеродсо-держащие субстраты, минеральные элементы. Одним из условий спорообразования для ряда видов аэробных бактерий является недостаточность азотистого питания при достаточном количестве других необходимых компонентов ПС /70, 78/.

Для поверхностного выращивания В. subtilis №3 и В. licheniformis №31 наряду с обогащенным гидрализатом мяса сусло-агаром, используемым первоначально при производстве бактерина-CJI и биоспорина /3, 51, 55/, в последующем была предложена модификация ПС, заключающаяся в частичной замене (50%) гидроли-зата мяса на хлоропластную фракцию люцерны, а также исключения дефицитных и дорогостоящих медно-калиевой соли оксиэти-лендифосфоновой кислоты и марганцево-калиевой соли оксиэти-лендифосфоновой кислоты /3/. Данные, приведенные в этом изобретении применительно к производству ветеринарного пробиотика бактерина CJI), на наш взгляд, противоречивы и малоприемлемы для глубинного культивирования.

Следовательно, при разработке ПС для глубинного культивирования исследования необходимо направить на выбор менее дефицитного и более дешевого сырья, чем мясо: казеина, сои, кукурузного экстракта.

Важное значение для спорообразующих бактерий В. subtilis и В. licheniformis имеют такие показатели, как начальный рН и буферная емкость ПС. Это связано с тем обстоятельством, что в процессе культивирования этих микроорганизмов в первые 12 ч происходит значительное закисление КЖ. В случае если это закисление превышает определенную величину рН, то часто наблюдается негативное влияние на спорогенез /35/. Исходя из этого, при разработке состава ПС особое внимание необходимо уделить включению в состав ПС компонентов, обеспечивающих соответствующий показатель рН и буферную емкость позволяющих держать показатель рН в диапазоне значений, оптимальном для нормального развития и спорообразования микроорганизмов. С другой стороны, включение в состав таких сред буферных растворов на основе солей калия и фосфора /54/, также приводит к неудовлетворительному спорообразованию, причиной которого, по всей видимости является включение в метаболизм Р5+ и К+.

Наряду с составом используемых ПС при глубинном культивировании развитие и спорообразование микроорганизмов в значительной мере определяются выбором оптимального режима аэрации в ферментере. При этом в ряде случаев по мере повышения обогащенности ПС источниками питания возрастает зависимость роста и развития микроорганизмов от условий аэрирования. Условия аэрирования в ферментерах определяются оптимальной комбинацией двух факторов аэрации: объемом подаваемого в культиватор воздуха и эффективностью работы перемешивающего устройства (скорость вращения мешалки ее конструктивные особенности и в конечном счете, - интенсивностью перемешивания жидкости в культиваторе и дробления пузырьков воздуха) /10, 16, 17, 40, 46, 80, 87, 91, 92, 95/. Однако в реальных условиях производства увеличение количественных характеристик этих факторов имеет определенные ограничения вследствие высокого ценообразования и возможности повреждения бактерий.

Подбор оптимальных условий подачи воздуха и скорости перемешивания ПС сокращают продолжительность культивирования /71/. Так, для В. subtilis №39 В.В. Смирновым и соавторами установлено, что с повышением аэрации увеличивается выход микробных клеток, степень использования ими субстрата, а также удельная скорость роста /71, 94, 105, 107/. При интенсивной аэрации 4,4-5,8 г

3 1

02 дм" ч" создаются наиболее оптимальные условия для роста бактерий. При аэрации, равной 3,2 г 02 дм"3 ч"1 и ниже, снижается удельная скорость роста и выход жизнеспособных клеток. Для спорообразования необходимо повышение, как скорости вращения мешалки, так и подачи воздуха, в период вегетации и начальных этапов споруляции с последующим их уменьшением.

Установлено, что споруляция наступает вслед за экспоненциальной фазой роста, когда наблюдается лимитирование питательных веществ в среде, в частности, глюкозы /6, 27, 43/. В этот период, как показано на примере В. Subtilis, спорулируют только те клетки, в которых закончился цикл синтеза ДНК /70/. В связи с этим, для получения спор обычно применяют два метода: использование для культивирования «бедной» по составу ПС, содержащей порядка 0,03 г.дм"3 азота и перенесение экспоненциально растущей культуры с «богатой» ПС на «бедную» /6, 43,. 70/.

Температура выращивания бактерий является важной составляющей условий спорообразования, которая определяет скорость метаболизма и продолжительность собственно культивирования. Поверхностное культивирование В. subtilis и В. licheniformis осуществляют при 28°С в течение 8-12 суток, глубинное - при 37°С /35, 54/. Эти микроорганизмы способны расти и развиваться в широком диапазоне температур. В каждом конкретном случае необходимо определить температуру, при которой накопление биомассы и спорообразование будут максимальными.

Важное значение для получения однородной популяции спор, а также продолжительности культивирования имеет качество посевного материала /26/. Для культивирования спорообразующих бактерий приемлемы два типа рабочих посевных культур: споровые и вегетативные. Каждый из них имеет свои преимущества и недостатки. Согласно принятой в Центре ВТП БЗ методологии /54/, в качестве посевных культур В. subtilis и В. licheniformis используются выращенные на среде Гаузе № 2 в биологических матрацах споровые материалы /35/. Следует отметить, что в производственных технологиях, используемых для получения антибиотика грамицидина, отдельные авторы отдают предпочтение подобным посевным культурам. Так, А.Н. Выпшеч и соавторы /12/ отмечают, что «.применение спор позволило значительно упростить технологию получения грамицидина глубинным способом» (в работе использовались вегетативные клетки, лиофилизированные споры и споры, хранившиеся на пшене). Особенно благоприятным является использование спор, активированных теплом. Такие термоактивированные споровые культуры обладают минимальной гетерогенностью, что обеспечивает синхронизацию роста и развития микроорганизмов. Споровые материалы сохраняют жизнеспособность длительное время в пробирках на агаровых ПС, а также в ампулах в лиофили-зированной форме. Это позволяет заранее приготовить достаточное количество качественных культур и обеспечивать продолжительные производственные работы с использованием одной и той же серии качественного спорового материала.

Кроме этого, особое внимание необходимо уделить уточнению величины посевной дозы культуры.

При производственном культивировании большое значение имеют вопросы, связанные с определением критериев оценки готовности нативной культуры. В этом случае, когда конечным продуктом являются споры, особое внимание обращают на степень их зрелости. Спорообразование начинается вслед за экспоненциальной фазой роста, затем споры проходят различные фазы созревания до состояния полной зрелости. При этом микроскопирование мазков, окрашенных по Цилю-Нильсену, позволяет наблюдать эти переходы и определить состояние зрелости спор. Этот метод является основным экспресс-тестом при определении продолжительности культивирования. Помимо этого, косвенно о готовности культуры можно судить, наблюдая изменение в процессе развития культур таких показателей, как рН и оптическая плотность НК /35, 54/.

Основными же показателями эффективности культивирования являются такие, как определение количества жизнеспособных клеток в НК, а также определение количества терморезистентных спор. Известно, что споры, в сравнении с вегетативными клетками, обладают значительной более высокой терморезистентностью и сохраняют свою жизнеспособность при температурах, значительно более высоких, чем 60°С, при которых вегетативные клетки большинства спорообразующих бактерий погибают /34, 43/. Это явление используют для определения спор в НК путем подсчета количества жизнеспособных клеток после прогрева НК при температуре не выше 83°С.

Перечисленные показатели являются достаточными для оценки готовности НК и их целесообразно использовать для определения продолжительности культивирования при разработке технологии глубинного выращивания В. subtilis и В. licheniformis.

Таким образом, на основании анализа данных литературы и результатов выполненных ранее в Центре ВТП БЗ исследований /35, 54/ при разработке глубинного способа выращивания антагонистически активных аэробных спорообразующих бактерий В. subtilis и В. licheniformis применительно к созданию экспериментально-производственной технологии выпуска препарата «Биоспорин» в ампулах (флаконах) предстояло изучить ряд вопросов. Такими, на наш взгляд, являлись, прежде всего, задачи, связанные с обеспечением в ферментерах КМ-0,1, БИОР-0,1 и БИОР-0,25 достаточно высокого выхода качественных спор при глубинном культивировании

Q 1

ОК - не менее 2,0.10" .кл.см", спорообразование- не менее 50%), исключение технологического брака из-за атипичного развития культур бактерий (низкие уровни накопления биомассы, неудовлетворительная споруляция и т.п.) по причине, прежде всего, нестандартности ПС и условий выращивания.

В числе основных вопросов, требующих экспериментального изучения и стандартизации для их реализации в соответствующих технологических операциях и процессах, необходимо провести исследование по следующим направлениям: уточнить состав, и стандартизировать качество жидких ПС (по критериям накопления биомассы, спорообразования и степени гетерогенности глубинных культур бактерий), предназначенных для выращивания В. subtilis и В. licheniformis; стандартизировать порядок приготовления посевных материалов и уточнить величину ПД; выбрать оптимальные условия собственно глубинного культивирования бактерий (температура, аэрация, продолжительность цикла и т.п.) в жидких ПС при воспроизводимости параметров процесса выращивания и качества получаемых НК; определить критерии оценки готовности нативных культур бактерий и стандартизовать порядок завершения процесса глубинного их выращивания в ферментерах.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Лиморенко, Анатолий Петрович

5. ВЫВОДЫ

1. Разработанная технология глубинного культивирования микроорганизмов В.subtilis № 3 и В .licheniformis № 31 для производства препарата "Биоспорин" позволяет получить стандартизированные жидкие питательные среды, состоящие из недефицитного отечественного сырья и полуфабрикатов (гидролизат казеина, кукурузный экстракт, глюкоза, минеральные соли). Стоимость таких сред в 8 раз ниже, чем полученных из традиционного сырья.

2. Разработанная технология глубинного культивирования позволяет повысить объем выпуска препарата "Биоспорин" по сравнению с существующей в 10 раз. Если по технологии Днепропетровского химфармзавода получают до 2 млн. доз в год, то по разработанной нами технологии объем выпуска пробиотика увеличен до 20 млн. доз в год.

3. Технология глубинного культивирования имеет преимущества перед существующей по стандартности и трудоемкости и позволяет сократить в 6 раз продолжительность выращивания микроорганизмов (1-2 суток против 9-12 суток).

4. Создано, аттестовано и лицензировано современное высокопроизводительное, экологически безопасное производство пробиотика "Биоспорин", обеспечивающее выпуск в количестве до 20 млн. доз препарата в год.

5. Готовая лекарственная форма препарата "Биоспорин", полученная из глубинных культур В.subtilis № 3 и В.licheniformis № 31,

129 обладает высокой антагонистической активностью к возбудителям ОКИ.

6. Разработанная технология глубинного культивирования обеспечивает выпуск препарата по 1, 2, 5 и 10 доз, в то время как существующая технология позволяет выпускать препарат по 1, 2 дозы, в результате поверхностного культивирования микроорганизмов.

7. Трудозатраты на приготовление препарата "Биоспорин" снижены в 1,9 раза. Годовой экономический эффект от внедрения разработанной технологии составляет 24 млн. рублей.

6. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

Результаты исследований реализованы разработкой, согласованием и утверждением следующей нормативно-технологической документации:

1. Экспериментально-производственный регламент "Биоспорин сухой" № 580-96;

2. Фармакопейная статья ФС42-3476-98;

3. Инструкция по применению препарата "Биоспорин";

4. Наставление по применению препарата "Биоспорин" для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний у сельскохозяйственных животных;

5. Сертификат производства препарата "Биоспорин", выданный Госкомсанэпиднадзором РФ № 000582/99-73024;

6. Лицензия на производство, хранение и реализацию препарата "Биоспорин", выданная Минздравом РФ № 009547, регистрационный № 64/872/99.

Кроме того, в технологии производства обоснованы к использованию составы ПС №4 и №7, изготавливаемые из дешевого недефицитного сырья, выпускаемые в РФ серийно материалы и реактивы, аналитические и контрольно-измерительные приборы и технологическое оборудование (КМ-0,1, БИОР-ОД, БИОР-0,25), а также отдельные изготовленные в Центре ВТП БЗ нестандартные установки.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Лиморенко, Анатолий Петрович, 2002 год

1. Аиба Т., Хемфри А., Миллис Н. Биохимическая технология и аппаратура. Пер.с англ. М., Пищевая промышленность, 1975.

2. А.С. 1722502 А1 СССР, МКИ А61 К39/02,35/74. Препарат биоспорин для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний человека / В.В. Смирнов, С.Р. Резник, И.Б. Сорокулова и др.

3. А.С. 1708832 СССР, МКИ AIC12 №1/20. Питательная среда для выращивания спорообразующих бактерий Bacillus subtillis и Bacillus licheniformis/Чаплинский В.Я., Новиков Ю.Ф., Коганов М.М. и др.

4. Артюхин В.И., Шепелин А.П., Кисилева Н.В. Белковые гид-ролизаты в производстве питательных сред. Производство и применение продуктов микробиологических производств.: Обзорн. ин-форм.-М., 1990.-Вып.10.

5. Бациллы. Генетика и биотехнология / Пер.с англ. под ред. А.А. Прозорова. М., 1992.

6. Биология Bacillus brevis var. G-B.-(Экспериментальное изуче-ние)-М.1968.

7. Бургасов П.Н., Поисков Г.И. Сибиреязвенная инфекция.-М.,1984

8. Бирюков В.В. Планирование экспериментов при оптимизации сложных процессов по схемам ортогональных латинских прямоугольников // Хим. фармацевт.журн. - 1968, № 1 - с.57-62.

9. Брусиловский Л.П., Банникова Л.А., Вайнберг И.А. Управление процессами культивирования микроорганизмов заквасок и кисломолочных продуктов. М., Легкая и пищевая промышленность, 1972.

10. Войчишина Л.А., Чаплинский В.Я., Вьюницкая В.А. Применение спорообразующих бактерий в лечении больных дисбактерио-зом // Врачебное дело.-1991.-№6.-с.73-75.

11. Выпшеч А.Н., Зарубина А.Т., Маркелова С.И. Получение гентамицина С при глубинном культивировании нового штамма Bacillus brevis 101//тез. докл. Всесоюз. Сов. Москва, 28-29 ноября 1984г.-М.,1984.-c.90-91 .-ДСП.

12. Ванек 3., Винтер В. Процессы регуляции при делении, спо-руляции и синтезе метаболитов у микроорганизмов//Микробиол.ж.-1977.-т.39,№6.-с.683-695.

13. Ванек 3., Винтер В. Микробная дифференциация, споруля-ция и синтез метаболитов // Микробиологический журнал 1977. -т.39, № 3. - с.275-280.

14. Воробьев А.А. Теоретические и практические аспекты проблемы пероральной иммунизации на современном этапе// Журнал микробиология, эпидемиология и иммунобиология-1973.-№3.-с.3-15.

15. Виестур У.Э. Аэрация и перемешивание в процессах культивирования микроорганизмов. М., 1972.

16. Васильцов Э.А., Ушаков В.Г. Аппараты для перемешивания жидких сред. Ленинград, Машинстроение, 1979.

17. Горшевикова Э.В., Фурманова Ю.А., Слабоспицкая А.Т. Применение биоспорина в лечении экспериментальной гнойной раны// Клиническая хирургия.- 1992.-№9-10.-с.30-32.

18. Дзагуров С.Г., Быченко Б.Д., Сумароков А.А. Современные принципы стандартизации вакцинных препаратов.//Журн. Микро-биол.-1982, №12, с. 7-12.

19. Добрица С.В. Бактериальная ДНК в процессе образования и прорастания спор//Успехи микробиологии,-1980,№15.-с. 197-223.

20. Егоров И.С., Выборных С.Н., Лорин Т.К. Влияние катионов на синтез экзопротеазы и спорообразования // Журн. Микробиология.- 1984, т.53, № 4, - с.568-571.

21. Егоров Н.С., Лория Ж.К., Выборных С.Н. Влияние ионов марганца и цинка на синтез бацитрацина и спорообразование Bacillus lechineformis 28 КА / Вест.МГУ, Сер.Биология. 1985. - № 2, -с.56-58.

22. Иконников Н.П., Маринин Л.И., Степанов А.В. Технология получения сибиреязвенной вакцины СТИ-ЛР // Актуальные вопросы профилактики опасных инфекционных заболеваний. Киров, 1991,-с.93-94.-ДСП.

23. Кафаров В.В., Винаров А.Ю., Гордеев Л.С. Моделирование биохимических реакторов.-М.,1979.

24. Козлова Н.В., Спирина Т.С., Жилепко М.И. Состояние кишечного микробиоценоза и его коррекция у беременных, проживающих в условиях повышенного радиационного загрязнения // Антибиотики и химиотерапия.- 1994.-t.39, №6.-с.39-43.

25. Кислухина В.В. Посевной материал для выращивания глубинной культуры Bacillus subtilis в заводских условиях // Микробиологическая промышленность. 1972,№ 6. - с.20-23.

26. Кудрявцев В.А., Сафронова Л.А., Осадчая А.И., Козачко И.А. Подбор состава среды для оптимизации аминосинтетической активности аэробных бацилл // Микробиол.журн. 1991, т.53, № 4. - с.68-72.

27. В.А. Кейлер Экономика предприятия. М. 2001.

28. Колтукова Н.В., Бондарчук А.А., Левитина Т.Л. Специфичность щелочной сериновой протеиназы Bacillus mesentericus / Прикл.биохимия и микробиол. 1985. - т.11, № 3, - с.361-364.

29. Кичакова Н.А. Влияние источников углерода и ионов кальция на активность термостабильной L амилазы Bacillus 86 / Мик-робиол.ж. - 1991, - т.53, № 1, - с.44-48.

30. Козлов Ю.А. Питательные среды в медицинской микробио-логии.-М. 1950.

31. Калакуцкий JI.B. Прорастание спор// Успехи микробиологии.- 1966, №3 .-с.24-27.

32. Логинова Л.Г., Головочева Р.С., Егорова Л.А. Жизнь микроорганизмов при высоких температурах.-М.,1966.

33. Логинова Л.Г., Головочева Р.С. Современные представления о термофилии микроорганизмов.-М.-1973.

34. Лабораторный регламент/ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ.-1993.-Арх. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ-Инв. №373/3.

35. Методические указания по применению физико-химических методов контроля питательных сред: М., 1977.

36. Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям. / Методические указания МУК 4.1/4.2.588-96.

37. Методические рекомендации к контролю питательных сред по биологическим показателям. // Москва, 1980.

38. Методы общей бактериологии/Пер. с англ. под ред. Е.Н. Кондратьевой, Л.В. Калакуцкого.-Мю;1984,с.1-9.

39. Мельникова В.А. Ингибирование и стимуляция жизнедеятельности микроорганизмов в процессах культивирования. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии, 1983, № 10, с.3-8.

40. Методы общей бактериологии, в 3 томах / Пер.с англ. под ред Е.Н. Кондратьевой, JI.B. Калакучного, 1984.

41. Мейнелл Дж., Мейнелл Э. Экспериментальная микробиология / Пер.с англ. под ред. Кривинского А.С. и Урбаха В.Н. М., 1967.

42. Маркелова С.И., Выпшеч А.Н., Егоров Н.С. спорообразование и проростание спор Bacillus brevis var. G-B. в связи с антибио-тикообразованием//Антибиотики.-1984.№1-с.62-72.

43. Мирзоев В.А. Бактерии группы сенной и картофельной па-лочки.-М.,1959.

44. Налимов В.В., Чернова Н.А. Статистические методы планирования экспериментов. М., 1965.

45. Непрерывное культивирование микроорганизмов, теоретические и методические основы / Под ред. М. Малека, 3. Фенцеля. -М. Пищевая пром-сть, 1968.

46. Об унификации методов контроля медицинских иммунобиологических препаратов: Приказ МЗ СССР №31 от 13.01.83.

47. Осадчая А.И., Кудрявцев В.А., Резник С.Р. Влияние условий аэрации на синтез и коррекцию полисахаридов бактериями рода Bacillus при их глубинном культивировании.//Биотехнология.-1993.-№3.-с. 12-14.

48. Осадчая А.И., Подгорский B.C., Михновская Н.Д. и др. Влияние модифицированных пирогенных кремнеземов на рост и развитие продуцента бактокулицида // Биотехнология. 1991, № 4. - с.31-34.

49. Осадчая А.И., Прокопченко С.Ф., Костюченко И.П. Интенсификация роста и развитие Bacillus thuringiensis Hi4 266/2-1 путем оптимизации питательной среды. // Микробиол. журн. 1989. -т.51, № 5. - с.20-25.

50. Осадчая А.И., Прокопченко С.Ф., Михновская И.Д. Влияние некоторых минеральных солей на рост и развитие штамма Bacillus thuringiensis Н14 266/2-1 // Микробиол.журн. 1989. - т.51, № 5 -с.26-28.

51. Осадчая А.И., Кудрявцев В.А., Сафронова JI.A. Роль аминокислот в интенсификации биосинтеза экзополисахзаридов Bacillussubtillis в глубинных условиях роста / Микробиология. 1995. т.64, №> 1. - с.44-50.

52. Отчет о НИР (заключительный)/ ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. Руководители В.А. Филин, И.А. Поберий.-1995.- Арх. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ-Инв. №Д-64.

53. Отчет о НИР (внепланов.) Центр ВТП БЗ, ИМВ НАН Украины. Руководители А.Т. Харечко, Г.И. Архангельский, А.И. Фролов. 1993. - Арх. Центра ВТП БЗ. - Инв. № 226/3.

54. Опытно-промышленный регламент. Биоспорин сухой / ИМВ им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Днепрпетровский хим-фармзавод.-1989. Арх. ГИСКа им. JI.A. Тарасевича.

55. Онищенко Г.Г. Эпидемиологическая обстановка в Российской Федерации в период 1991-1996гг.//Антибиотики и химиотерапия.-1997.-т.42,№8.-с.З-13.

56. Пат. РФ 1722502 МКИ А61 К39/02 35/74. Препарат биоспорин для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний человека / В.В. Смирнов, С.Р. Резник, И.Б. Сорокулова и др.

57. Пат. Украины 689 МКИ А61 К39/02, 35/74. Препарат биоспорин для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний человека / В.В. Смирнов, С.Р. Резник, И.Б. Сорокулова и др.

58. Паспорт/ИМВ HAH Украины.-199l.-Apx. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ-Инв. №181,1993.-с.94-97.

59. Паспорт/ИМВ НАН Украины.-199l.-Apx. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ-Инв. №181,1993.-с. 101-104.

60. Перт С. Основы культивирования микроорганизмов и клеток / Пер.с англ. М., 1978.

61. Поберий И.А., Харечко А.Т., Садовой Н.В. Новый комплексный эубиотик «Биоспорин» для детей и взрослых.-Уральское медицинское обозрение, 1998, с.97-99.

62. Раскин Б.М., Калина Калина Г.П. Проблема питательных сред на современном этапе// Журнал микробиология, эпидемиология и иммунобиология-1988.-№6.-с.84-90.

63. Резник С.Р., Слабоспицкая А.Т., Каган А.Ф. Влияние бактерий на содержание свободного аргенина крови при заболеваниях желудочно-кишечного тракта. // Микробиол.журн.-1979.-Т.11, №4.-с. 378-381.

64. Роуз Э. Химическая микробиология. Пер. с англ., М.,1971.

65. Сборник инструкций по оценке качества биоспорина на стадиях его приготовления/СТП-ОБТК-096-116-96.- Арх. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ-Инв. №181,1996.-с.94-97

66. Слабоспицкая А.Т., Виноградов В.П., Крымовская С.С. Новый препарат биоспорин и его влияние на микрофлору кишечника при дисбактериозах новорожденных детей.// Микробиол.журн. -1995. -т.57, № 1.-с. 71-76.

67. Семенов С.М. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов. Справочник.-М., 1980.

68. Смирнова Г.А., Раскин Б.М., Мельникова В.А. Изучение пептидного и аминокислотного состава различных белковых основ питательных сред.//Журнал микробиология, эпидемиология и им-мунобиология-1988.-№6.-с.84-88.

69. Смирнов В.В., Резник С.Р., Васильевская Н.А., Спорообра-зующие аэробные бактерии продуценты биологически активных веществ. - Киев, 1993.

70. Смирнов В.В., Осадчая А.И., Кудрявцев В.А. Рост и спорообразование Bacillus subtillis в различных условиях аэрации // Мик-робиолог.журн. 1993. - т.55, № 3, - с.38-43.

71. Смирнов В.В., Резник С.Р., Вьюницкая В.А. Современные представления о механизмах лечебно-профилактического действия пробиотиков из бактерий рода Bacillus subtillis // Микробиол.журн. 1993. - т.55, № 4. - с.92-108.

72. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б., Вьюницкая В.А. Дискусионные вопросы создания и применения бактериальных препаратов для коррекции микрофлоры теплокровных // Микробиол.журн. 1992. - т.54, № 6. - с. 82-94.

73. Тарков М.И. Микробиологические методы оценки искусственных питательных сред. // Кишинев: Штиинца, 1972.

74. Ферментация и технология ферментов./ Пер.с англ., Уонг Д., Кооней Дж., Дейман А. и др.// Легкая и пищевая промышленностью- М., 1983.

75. Фармакопейная статья. Биоспорин сухой. ФС 42-3476-98.

76. Федосеев К.Г. Физические основы и аппаратура микробного синтеза биологически активных соединений. М., Медицина, 1977.

77. Филиппова М.С. О хранении культуры Bacillus brevis var. G-В//Микробиология.-1965 .-т.34, №3 .-с.546-549.

78. Храмов М.В. Разработка питательной среды для глубинного культивирования антибиотика резистентного вакцинного сибиреязвенного штамма // Журнал микробиология, эпидемиология и иммунобиология-1984.-№8-с.76-81.

79. Хмель И.А., Коршунов И.С. Влияние аэрации на жизнедеятельность микроорганизмов. Прикл. биохимия и микробиология, 1966, вып.2, с.713-742.

80. Чернякова В.И., Береза И.М., Селезнева С.И. Бактериологическая и иммунологическая эффективность биоспорина при неспецифическом язвенном колите // Микробиол.журн. 1993. - т.55, № З.-с. 63-67.

81. Чупринина Р.П., Скорикова И.Г., Евлашкина В.Ф. Препарат для профилактики и лечения дисбактериозов различной этиологии. -М, 1993.

82. Шагам Н.Л., Раскин Б.М., Мельникова В.А., и др. О физико-химических методах стандартизации микробиологических питательных сред. // Микробиология эпидемиологии и иммунобиологии., 1981, № 4, с.24-29.

83. Экспериментально-производственный регламент. Биоспорин №580-96/ ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ.-1996.-Арх. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ-Инв №Д84.-ДСП.

84. Dityatkovskaya Е.М., Chaplinskiy V.I. Biosporin while allergie itching dermatosis treatment // 1-st Int. Conf. on Immunorehabilitation "Rehabilitation of immune system" (Dagomys, 1-5 juli 1992).-Tskaltubo, 1992.

85. Erickson L.E., Selga S.W., Viesturs U.E. Application of Massing Energy Balance Regularities to Product Formation.-Biotechnol. and Bioeng. 1978, v.20,p. 1623-1638.

86. Fleuring H.P., Ordal Z.J. Responses of B. subtillis spores to ionic environments during sporulation and germination / J. Bacterial.-1964, v.88,№6.-p.l 529-1537.

87. Hanson R.S., Spinivasan V.R. and Halvorson H.O., 1963, Biochemistry of sporulation. I. Metabolism of acetate by vegetative and sporulating cells, I.Bacteriol.85:451-460.

88. Hanson R.S., Blicharska I. and Sulmajster I.,1984, Relationship between the tricarboxylic acid cycle enzymes and sporulation of B. sub-tillis, Biochem. Biophys.Res.Commun.l7:l-7.

89. Harrison O.E.F. Physiological effest of dissolved oxygen tension and redox potential on growing populations of microorganisms -I.Appl.Chem.Biotechnol. 1972,223.p.417-440.

90. Horkins T.R. Feed-on-demand control of fermentation by cyclic changes in dissolved oxygen tenson.-Biotechol. and Bio-eng.,1981,v.23,p.2137-2143.

91. Keynon A. Spore structure and its relations to resistance, dormancy and germination // Spores VII, papers presented at the Seventh International Spore Conference Madison, Wisconsin, 5-8 oktober 1977/Ed. Y Shambles, I.C. Vary.-Washington, \1974.-p43-53.

92. Kilburn D.G., Webb F.C. The cultivation of animal cells at controlled dissolved oxygen partial pressure.- Biotechnol. and Bio-eng., 1968,v. 10,№6,p.801-814.

93. Manfredini R., Cavallera V., Marcni L., Danat G. Mixing and Oxygen Transfer in Conventional stirred Fermentors. Biotechnol. and Bioeng., 1983 ,v.25, р.3115-3131.

94. Nakata H.M. and Halvorson H.O., 1960, Biochemical changers occurring during growth and sporulation of Bacillus cereus.I.Bacteriol.80:801-810.

95. Neilson N.E., Macgnillan M.F., Campbele L.L. Grout studies on B. stearothermiphillus // Canad. J. Microbiol.-1959,v.6, №5.-p.293-298.

96. Nihaski I. and Fujita V.,1984, Catabolic repression of inositol dehydrogenase and gluconate kinase synthesis in Bacillus subtillis, Bio-chem. Biophys.Acta. 798:88-95.

97. Ordal G.W., Parker H.M. and Kirbi I.R,1985, Complementation and characterization of chmotaxis mutants of Bacillus subtillis, Ibacte-riol. 164:802-810.

98. Prokor A., Humphrey A. Mechanism of thermal death of bacterial spores: Electronmicroscope observation// Folca microscopic.-1972.-Y.17,№6.-p.437-445.

99. Ristorph J.D., Ivins B.E. Production of high levels of B. an-thracis toxin antigens in a new, debited cooler medium//Report №AD-A116.827, publ. by NTIS, Springbield, VA,Iun.-1982.

100. Srokulova J.B. Translocation of exogenous microflora through mucous membranes of warmblooded // JUMS Congress: Bacteriology, Mycology.-Osaka, 1990.

101. Scheffer P., Millet I. and Aubert I., 1965 b, Catabolic repression of bacterial sporulation, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 54:704-711.

102. Scheffer P., 1969, Sporulation and the production of antibiotics, exonzymes and exotoxins, Bacteriol. Rex. 33: 48-71.

103. Shup. Control of oxygen uptake in deep tank fermentations.-Ind. Eng. Chem., 1956, v.48, p.2204-2209.

104. Sterlini I., Mandelstam I. Commitment to sporulation in Bacillus subtillis and its relationship to the development of actinomicin resistance // Biochem I.-1969.-t.45, y.l 13.-p.29-37.

105. Taguti N., Humphrey A. Methods of measuring oxygen transfer in submerged fermentation.-I. Ferment. Technol., 1966, v.44, №12, p.881-887.

106. Wei H., Kan E. Bacillus cereus "cereobiogen" as a growth promoter ol Bifidobacterium in infantile diarrhea therapy. // Rec.Adv.Germfree Res.-Toxai,-Univ. press, 1982.-p.475-480.

107. СИСТШ СЕРТИШЩШ МЕЩШШ ■MHVBOGHOUIH'iECUX IFUIFIIOI1. NUUI • -/• У

108. МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ^

109. НАЦИОНАЛЬНЫЙ ОРГАН КОНТРОЛЯ МИБП — >V ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СТАНДАРТИЗАЦИИ И КОНТРОЛЯ МЕДИЦИНСКИХ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ имени Л. А. ТАРАСЕВИЧА

110. Действителен до. Удостоверяется, что производство.1. РОСС RU. 0001. 01ИП0011