Разработка системы испытаний наборов реагентов на основе ПЦР для выявления ДНК/РНК вирусов гепатитов B и C тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.02, кандидат биологических наук Эльберт, Елизавета Викторовна

• Эльберт, Елизавета Викторовна
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Эльберт, Елизавета Викторовна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I. Эпидемиология и этиологические факторы.

1. Вирус гепатита В.

2. Вирус гепатита С.

II. Лабораторная диагностика вирусных гепатитов В и С.

1. Серологическая диагностика ВГВ.

2. Серологическая диагностика ВГС.

3. Молекулярно-биологические методы.

4. Выявление ДНК/РНК вирусов гепатита В и С в крови, плазме, сыворотке.

III. Валидация аналитических методов.

IV. Стандартные образцы.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Разработка системы испытаний наборов реагентов на основе ПЦР для неколичественного выявления ДНК вируса гепатита В и РНК вируса гепатита С.

3.1.1. Изучение наборов реагентов для выявления ДНК вируса гепатита В методом ПЦР с электрофоретической детекцией.

3.1.2 Изучение наборов реагентов для выявления ДНК вируса гепатита В с гибридизационно-флуоресцентной детекцией результатов ПЦР в процессе амплификации в режиме «реального времени» или по окончании амплификации по «конечной точке».

3.1.3. Изучение наборов реагентов для выявления РНК вируса гепатита С методом ПЦР с электрофоретической детекцией.

3.1.4. Изучение наборов реагентов для выявления РНК вируса гепатита С с гибридизационно-флуоресцентной детекцией результатов ПЦР в процессе амплификации в режиме «реального времени» или по окончании амплификации по «конечной точке».

3.2 Разработка системы испытаний наборов реагентов для количественного определения РНК вируса гепатита С.

3.2.1. Разработка отраслевого стандартного образца содержания РНК вируса гепатита С.

3.2.2. Изучение набора реагентов для количественного определения РНК вируса гепатита С с гибридизационно-ферментной детекцией результатов амплификации.

3.2.3. Изучение набора реагентов для количественного определения РНК вируса гепатита С с гибридизационно-ферментной детекцией результатов амплификации

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка системы испытаний наборов реагентов на основе ПЦР для выявления ДНК/РНК вирусов гепатитов B и C»

АКТУАЛЬНОСТЬ

Вирусные гепатиты представляют собой серьезную проблему для здравоохранения ввиду их повсеместного распространения. Наибольшего внимания требуют гепатиты В и С [Соринсон С.Н., 1998, Sypsa V, Touloumi G. et al, 2005, WHO Fact Sheet, 2000]. По последним данным в России на смену резкому подъему заболеваемости острыми формами вирусных гепатитов, наблюдавшемуся в 1995-1999 гг., [Шахгильдян И.В., Михайлов М.И. с соавт., 1999] пришла эпидемия хронических вирусных гепатитов [Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Онищенко Г.Г., 2003]. Для выявления этиологических агентов вирусных гепатитов все большее значение приобретает лабораторная диагностика, она позволяет выявлять возбудителя на ранних стадиях инфицирования и оценивать эффективность проводимой противовирусной терапии. Одним из перспективных методов в этом отношении является метод на основе амплификации нуклеиновых кислот, в частности, полимеразная цепная реакция [Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Онищенко Г.Г., 2003, Михайлов М.И., 2001, Момыналиев К.Т., Говорун В.М., 2000].

Активная разработка изделий медицинского назначения (наборов реагентов) на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) как для качественного, так и количественного определения ДНК и РНК возбудителей инфекционных заболеваний и организация их производства требует стандартизации проведения их испытаний и оценки качества. При оценке качества наборов для выявления культивируемых микроорганизмов используют чистые культуры. С этой точки зрения стандартизация наборов для выявления ДНК/РНК вирусов гепатитов В и С, затруднена.

В настоящее время в нашей стране проблемам обеспечения качества лабораторных исследований уделяется большое внимание [ГОСТ Р ИСО 175112007, ГОСТ Р ИС015193-2007, ГОСТ Р ИСО 15194-2007]. Порядок проведения испытаний наборов реагентов изложен в ГОСТ Р 51352-99. Однако раздел, относящийся к наборам реагентов для «микроанализа нуклеотидных последовательностей» предусматривает оценку качества наборов только по положительному и отрицательному контрольным образцам [ГОСТ Р 51352-99 п.4.2.2], что недостаточно для объективной оценки наборов.

Таким образом, разработка системы проведения испытаний наборов реагентов на основе ГТЦР с целью обеспечения единства требований к ним на модели вирусов гепатитов В и С является актуальной задачей. Цель исследования

Разработка системы испытаний наборов реагентов для выявления ДНК/РНК вирусов гепатитов В и С методом ПЦР. Задачи исследования 1. Разработать на основе принципов валидации аналитических методик систему лабораторных испытаний наборов реагентов для выявления и определения ДНК/РНК вирусов гепатита В/С методом ПЦР, а именно: для неколичественного выявления нуклеиновых кислот:

- специфичности (специфической активности)

- предела обнаружения (аналитической чувствительности); для количественного определения нуклеиновых кислот:

- специфичности;

- линейного диапазона определяемых величин;

- прецизионности;

- правильности.

2. Разработать отраслевой стандартный образец содержания РНК НСУ для определения аналитической чувствительности, специфичности, воспроизводимости соответствующих наборов реагентов методом ПНР.

3. Провести оценку диагностической эффективности изученных наборов реагентов на клинических образцах.

Научная новизна

Впервые разработана система лабораторных испытаний ПЦР наборов реагентов, позволяющая по единому плану оценивать ПЦР наборы реагентов для выявления ДНК вируса гепатита В и РНК вируса гепатита С, включающая оценку специфичности, аналитической чувствительности, линейного диапазона определяемых величин, прецизионности, правильности и воспроизводимости.

Впервые с целью стандартизации наборов реагентов на основе ПЦР введен принцип оценки аналитической чувствительности по минимальной концентрации, выявляемой со 100 % воспроизводимостью при десятикратной постановке анализа.

Впервые разработан отраслевой стандартный образец содержания РНК вируса гепатита С (ОСО РНК НСУ ОСО 42-28-366-04П), с помощью которого, стандартизован контроль наборов реагентов для выявления РНК НСУ. Практическая значимость

Методы контроля внесены в стандарты качества ФСП, а с 2007 г в ТУ, на наборы реагентов: для выявления ДНК вируса гепатита В:

- с электрофоретической детекцией результатов амплификации: «АмплиСенс НВУ-240/ВКО-770» (ТУ 9398-040-01897593-2009 ФСР 2007/00813 от 14.08. 2009);

Биоком-НВУскрин-пзПЦР-тест» (ФСП 42-0114-0276-00); «ДиаГен-НВУ» (ФСП 42-0040-0053-00) и «Авиценна-НВУ-ПЦР» (ФСП 42-0116-0279-00);

- с гибридизационно-флуоресцентной детекцией: «АмплиСенс НВУ-РКТ»( ТУ 9398-030-01897593-2007.ФСР 2007/00585 от 09.08. 2007) и «АмплиСенс НВУ-¥ЕР»(ТУ 9398-032-01897593-2007.ФСР 2007/00586 от 09.08. 2007); для выявления РНК вируса гепатита С:

- с электрофоретической детекцией результатов амплификации: «АмплиСенс НСУ-240-/ВКО-440» (ФСП 42-0155-1135-01);

- с гибридизационно-флуоресцентной детекцией: «АмплиСенсНСУ-ЕКТ» (№ ФС 01032006/5667-06 от 26 декабря 2006 г) и «АмплиСенс НСУ-РЕР»(№ ФС 01032006/5670-06 от 27 декабря 2006 г); для количественного определения РНК вируса гепатита С:

- с гибридизационно-ферментной детекцией: «АмплиСенс НСУ-Монитор» (ФСП 42-0115-6363-05; № ЛС-000918 от 18.11.2005 г.);

- с гибридизационно-флуоресцентной детекцией:

АмплиСенс НСУ-Монитор- БЯТ (№ ФСР 2007/00577 от 9 октября 2007 г).

Наборы реагентов зарегистрированы в РФ и разрешены к применению в диагностической практике.

Материалы диссертации были использованы при подготовке Методических указаний 3.3.2.1886-04 «Валидация методов контроля химических и физико-химических показателей качества МИБП: организация, порядок проведения и представления результатов», М. 2004

Разработанный и аттестованный Отраслевой стандартный образец содержания РНК вируса гепатита С (ОСО РНК НСУ) 42-42-366-06П внесен в Реестр Национальных стандартов МИБП.

Совокупность новых научных результатов и положений, выносимых на защиту

1. На основе принципов валидации аналитических методов разработана система лабораторных испытаний наборов реагентов на основе ПЦР, позволяющая по единому плану оценивать наборы реагентов для выявления ДНК вируса гепатита В и РНК вируса гепатита С в отношении специфичности, предела обнаружения, линейного диапазона, прецизионности и правильности.

2. Разработанный отраслевой стандартный образец содержания РНК вируса гепатита С (ОСО РНК НСУ) позволяет оценивать качество наборов реагентов для выявления РЕПС НСУ в отношении аналитической чувствительности, воспроизводимости, линейного диапазона определяемых величин, прецизионности и правильности

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ Диссертация изложена на 154 страницах машинописного текста, включает 49 таблиц и 9 рисунков. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, заключений, выводов и списка цитированной литературы. Библиография включает 30 отечественных и 130 зарубежных источников.

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Эльберт, Елизавета Викторовна

выводы

1.Впервые разработана система испытаний наборов реагентов на основе ПЦР для неколичественного выявления ДНК/РНК вирусов гепатита В и С, включающая оценку специфичности, аналитической чувствительности и воспроизводимости с использованием стандартных образцов.

2. Впервые разработана система испытаний наборов реагентов на основе ПЦР для количественного определения РНК вируса гепатита С на основе принципов валидации аналитических методов, включающая оценку специфичности, линейного диапазона определяемых величин, правильности и прецизионности с использованием стандартных образцов.

3. С целью стандартизации наборов реагентов впервые введена оценка аналитической чувствительности по минимальной концентрации ДНК или РНК, которая выявляется с воспроизводимостью 100 % при 10-кратной постановке анализа.

4. Разработанный и аттестованный отраслевой стандартный образец содержания РНК вируса гепатита С (ОСО РНК НСУ) позволил провести валидацию и унифицировать методы контроля наборов реагентов для неколичественного и количественного определения РНК НСУ методом полимеразной цепной реакции.

5. На основании разработанной системы испытаний установлена аналитическая чувствительность наборов реагентов на основе ПЦР для выявления ДНК/РНК вирусов гепатита В и С: 7 наборов с

2 3 электрофоретической детекцией 5x10 - 5x10 копий/мл и 4 набора с

2 2 гибридизационно-флуоресцентной детекцией -10 - 5x10" МЕ/мл.

6. Установленные на основе разработанной системы испытаний характеристики двух наборов реагентов на основе ПЦР для количественного

3 6 определения РНК вируса гепатита С: линейный диапазон 10 - 10 МЕ/мл л о набор на основе ГИФА) 5x10 - 10е МЕ/мл (набор на основе П1Т), коэффициент вариации не более 36 % (набор на основе ГИФА) и не более 56 % (набор на основе ЖТ) и правильность - смещение результатов относительно референтного набора не более 0,5 ^ - позволили рекомендовать их к регистрации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании проведенных исследований разработана система испытаний наборов реагентов на основе ПЦР, позволяющая по единому плану оценивать наборы реагентов для неколичественного выявления и количественного определения ДНК вирусного гепатита В и РНК вирусного гепатита С методом ПЦР, включающая оценку:

- специфичности, предела обнаружения, диагностической эффективности (диагностическую специфичность, чувствительность и воспроизводимость на клинических образцах) наборов реагентов для неколичественного выявления генетического материала методом ПЦР;

- специфичность, линейность, линейность в диапазоне определяемых величин, прецизионность и правильность наборов реагентов для количественного выявления ДНК/РНК на основе ПЦР.

Таким образом, показана возможность использования принципов валидации метода при изучении наборов реагентов, как для неколичественного, так и для количественного определения ДНК НВУ и РНК НСУ.

Для стандартизации наборов реагентов на основе ПЦР впервые введено для установления аналитической чувствительности определение минимальной концентрации нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), выявляемой с воспроизводимостью 100 % при 10-кратной постановке.

Кроме того, при оценке диагностической эффективности введена оценка воспроизводимости с использованием модельных образцов, концентрация которых соответствует аналитической чувствительности набора реагентов.

Если наборы реагентов в лабораторных испытаниях показали удовлетворительную специфичность, то результат, полученный при оценке воспроизводимости на зашифрованных отрицательных образцах (90,0 - 95,5,0 %) в условиях диагностической лаборатории при использовании наборов с электрофоретической детекцией, свидетельствует о возможной контаминации в процессе анализа. Таким образом, ложноположительные результаты, полученные при проведении оценки диагностической эффективности наборов реагентов для выявления ДНК вируса гепатита В и РНК вируса гепатита С методом ПЦР с электрофоретической детекцией на клинических образцах должны учитываться при интерпретации результатов. В сомнительных случаях требуется повторная постановка анализа на новых образцах и дальнейшее наблюдение за пациентом.

Полученные результаты свидетельствуют о целесообразности оценки воспроизводимости наборов реагентов на модельных образцах с известной концентрацией определяемой нуклеиновой кислоты с обязательной шифровкой анализируемых образцов. Кроме того, использованную схему можно рекомендовать не только при проведении медицинских испытаний, но и для организации внутрилабораторного и внешнего контроля качества ПЦР-анализов, так как данная схема позволяет оценить работу оператора при условии использования сертифицированных наборов реагентов. Критерием для положительной оценки качества работы оператора или лаборатории в отношении контаминации может, видимо, стать воспроизводимость не менее 95 % при использовании отрицательных образцов. Критерием качества работы оператора в отношении чувствительности должна быть способность выявлять ДНК или РНК на пределе обнаружения, характерной для данного набора реагентов.

В результате проведенных исследований установлены валидационные характеристики наборов реагентов для неколичественного выявления ДНК вируса гепатита В и РНК вируса гепатита С (табл. 48) и количественного определения РНК НСУ методом ПЦР (табл.49).

Из таблицы 48 видно, что аналитическая чувствительность наборов реагентов для неколичественного выявления ДНК вируса гепатита В составила 102 - 103 копий/мл; для РНК вируса гепатита С - 102 - 5x103 копий/мл Все наборы реагентов были специфичны и показали удовлетвоврительную диагностическую эффективность. Воспроизводимость на отрицательных образцах составила 87,0 - 95,5 % (для наборов реагентов с электрофоретической детекцией результатов амплификации) и 100 % (для наборов реагентов с гибридизационно-флуоресцентной детекцией). Таким образом, наборы реагентов с гибридизационно-флуоресцентной детекцией показали более высокую аналитическую чувствительность и диагностическую эффективность.

Из таблицы 49 видно, что для наборов реагентов для количественного л п определения РНК НСУ характерна линейность в диапазоне 5x10 - 10 МЕ/мл; удовлетворительную правильность (смещение относительно результатов референтного набора реагентов и МСО не более 0,5 и прецизионность (коэффициент вариации в верхнем и нижнем диапазонах не более 56 %).

Разработанный и аттестованный нами ОСО РНК НСУ (ОСО 42-28-366-06П) позволил оценить валидационные характеристики 2-х наборов реагентов для неколичественного выявления РНК НСУ в отношении:

- специфичности;

-аналитической чувствительности;

- воспроизводимости и 2-х наборов реагентов для количественного определения РНК НСУ:

- линейности в диапазоне определяемых величин;

- правильности;

- прецизионности.

Таким образом, проведенная работа показала возможность и целесообразность использования принципов валидации аналитических методов при изучении наборов реагентов, как для качественного, так и для количественного определения ДНК НВУ и РНК НСУ. При исследовании ПЦР наборов реагентов установлены валидационные харатеристики наборов для неколичественного выявления и наборов для количественного определения ДНК/РНК вирусов гепатита В и С.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Эльберт, Елизавета Викторовна, 2011 год

1. Аммосов А.Д., Гришаев М.П., Рукавишников М.Ю., Порьшаева В.А., Данилюк Н.К., Биоинженерные методы в разработке и производстве иммуноферментных и ПЦР-зондовых тест-систем для определения маркеров гепатита В., Вопр.вирусол., 1997, № 5, С. 200-202.

2. Балаян М.С, Михайлов М.И., Энциклопедический Словарь Вирусные Гепатиты (Второе издание), М., "Амипресс", 1999.

3. Вирусные гепатиты (методическое пособие для врачей) под редакцией главного инфекциониста МЗ РФ профессора М.Х. Турьянова., Москва: Агар, 1992, С. 13.

4. Гепатит С: Консенсус 2002., Вирусные гепатиты: достижения и перспективы: Информ. бюл., 2002, № 2, С. 3-11.

5. Гланц С., Медико-биологическая статистика, М., Практика, 1999, 455 С.

6. ГОСТ Р 52249-2004 Национальный стандарт Российской Федерации. Правила производства и контроля качества лекарственных средств. М., 2004, С. 211.

7. ГОСТ Р 51352-99 Наборы реагентов для клинической лабораторной диагностики. Методы испытаний

8. ГОСТ Р ИСО 17511-2006 Изделия медицинские для диагностики in vitro. Измерение величин в биологических пробах. Метрологическая прослеживаемость значений, приписанных калибраторам и контрольным материалам

9. ГОСТ Р ИСО 15193-2007, Национальный стандарт Российской Федерации. Изделия медицинские для диагностики in vitro. Измерение величин в пробах биологического происхождения. Описание референтных методик выполнения измерений"

10. ГОСТ Р ИСО 15194-2007 Изделия медицинские для диагностики in vitro. Измерение величин в пробах биологического происхождения. Описание стандартных образцов.

11. Государственный отчет «О санитарно-эпидемиологической обстановке в Российской Федерации в 2004 году».

12. Государственный отчет «О санитарно-эпидемиологической обстановке в Российской Федерации в 2005 году».

13. Деррфель К., Статистика в аналитической химии, М., Мир, 1994, 270 С.

14. Иванов A.B., Кузякин А.О., Кочетков С.Н. Молекулярная биология вируса гепатита С, 2005, Т. 45, С. 37-86.

15. Исаева О.Н. Разработка системы внешней оценки качества лабораторных исследований при диагностике вирусных гепатитов В и С: Автореф. дис. канд. биол. наук., М., 2003, С. 11-12

16. Львов Д.К. Вирусные гепатиты от А до G и далее. Журн. микробиол., 1997, № 1, С. 70-77.

17. Михайлов М.И. Лабораторная диагностика гепатита С (Серологические маркеры и методы их выявления), Вирусные гепатиты: Достижения и перспективы, 2001, № 2(12).

18. Момыналиев К.Т., Говорун В.М. Перспективы применения методов ДНК-диагностики в лабораторной службе. Клиническая лабораторная диагностика, 2000, № 4, С.25-32.

19. Мукомолов С.Л., Калинина О.В. Молекулярная эпидемиология вирусных гепатитов (часть 2). Мир вирусных гепатитов, 2003, № 12 (декабрь), С.3-10.

20. Нетесова И.Г., Swenson P.D., Осипова О.Л., Посух М.А., Казаковцева М.А., Питомец Г.А., Четырена A.A., Киселев H.H., Нетесов C.B., Фаворов М.О. Субтипы HBsAg в Западной Сибири, Информационный бюллетень «Новости «Вектор-Бест», июнь 2000, № 2(16).

21. Петухов В.Г. Метод параллельных линий для количественной оценки качества стандартных образцов и других медицинских иммунобиологических препаратов в иммуноферментном анализе, Биопрепараты, 2004, № 1 (март), С. 19-23.

22. Рахманова А.Г.Яковлев А.А., Виноградова Е.Н., Демиденко Т.П., Стуков Б. В. Хронические вирусные гепатиты (вопросы классификации и регистрации) . Эпидемиология и инфекционные болезни, 1999, № 1, С. 3825 42.

23. Самуилов В.Д. Иммуноферментный анализ. Соросовский образовательный журнал, 1999, Т 5, № 2, С. 9-15.

24. Соринсон С.Н. Вирусные гепатиты, Теза, 1998.

25. Попова О.В., Семененко Т.А., Михайлов М.И. Молекулярная эпидемиология вирусных гепатитов. Мир вирусных гепатитов, 2003,12 (декабрь), С.3-13.

26. СП 3.3.2.1.1288 03 «Надлежащая практика производства медицинских иммунобиологических препаратов», Минздрав России, М., 2003, С 80.

27. Флетчер Р., Флетчер С., Вагнер Э. «Клиническая эпидемиология. Основы доказательной медицины» глава 3 диагноз, М., Медиа Сфера, 1998,С. 60-97.

28. Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Оншценко Г.Г. Парентеральные вирусные гепатиты (эпидемиология, диагностика, профилактика), М., ГОУ ВУНЦ МЗ РФ, 2003, С. 13; 24-26;76-77;101; 132.

29. Abravaya К., Carrino J.J., Muldoon S., Lee H.H. Detection of point mutation with a modified ligase chain reaction (GAP-LCR), Nucleic Acids Research, 1995, V. 23, P. 675-682.

30. Alter M.J., Epidemiology of hepatitis С in the West., Semin. Liver Desis., 1995, V. 15(1), P. 5-14.

31. Aoyagi K., Iida K., Ohue C., Matsunaga Y.,Tanaka E, Kiyosawa K, Yagi S. Performance of a conventional enzyme immunoassay for hepatitis С virus core antigen in the early phases of hepatitis С infection., Clin Lab., 2001,V. 47(3-4), P.119-127.

32. Arauz-Ruiz P., Norder H., Robertson ВН., Magnius L.O.Genotype H: a new American genotype of hepatitis В vims revealed in Central America. J.Gen. Virol, 2002, V. 83 (Pt 8), P. 2059-73.

33. Arnheim N, Erlich H. Polymerase chain reaction strategy. Annu Rev Biochem., 1992; V. 61, P. 131-156.

34. Arrieta J J, Rodriguez-Inigo E, Casqueiro M, Detection of hepatitis C virus replication by In situ hybridization in epithelial cells of anti-hepatitis C viruspositive patients with and without oral lichen planus. Hepatology., 2000, V. 32(1), P.97-103.

35. Arrieta J J, Rodriguez-Inigo E, Ortiz-Mo villa N, Bartolome J, In situ detection of hepatitis C virus RNA in salivary glands.Am J Pathol., 2001, V. 158(1), P. 259264.

36. Beer N., Shinar E., Novack L.,Safi J., Soliman U., Yaari A., Goldman-Levi R, Yahalom V, Bolotin A, Sarov B .Accuracy of hepatitis C virus core antigen testing in pools among seroconverters. Transfusion, 2006, V. 46 (10), P. 1822-1828.

37. Beck J, Nassal M. Hepatitis B virus replication. World J Gastroenterol., 2007, V.13(l), P.48-64.

38. Blum H.E., Galum E., Liang T.J., von Weizsäcker F., Wands J.R. Naturally 2occurring missense mutation in the polymerase gene terminating hepatitis B virus replication. J Virol., 1991, V. 65, P. 1836-1842.

39. BLAST www.ncdi.nim.nih.gov; EMBL www.ebi.ac.uk./embl.html

40. Bockisch B,Grunwald T, Spillner E, Bredehorst R.Immobilized stem-loop structured probes as conformational switches for enzymatic detection of microbial 16S rRNA. Nucleic Acids Res., 2005, V. 33(11), P. 101.

41. Boom R, Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL, Wertheim-van Dillen PM, van der Noordaa J. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 1990, V. 28(3), P.495-503.

42. Bukh J., Miller RH., Purcell R.H. Genetic heterogeneity of hepatitis C virus: quasispecies and genotypes. Semin Liver Dis, 1995, V. 15(1), P.41-63.

43. Bukh J., Purcell R.H., Miller R.H. At least 12 genotypes of hepatitis C virus predicted by sequence analysis of the putative El gene of isolates collected worldwide. Proc. Nat.l Acad. Sei. USA., 1993, V 90, P. 8234-8238.

44. Bukh J., The hepatitis C virus. American Association for the Study of Liver Diseases Post-graduate Course 2000, Update on Viral Hepatitis, October 27-28, Dallas, Texas. 2000, P. 102-111.

45. Bustin S.A., Benes V., Nolan T., Pfaffl M.W. Quantitative real-time RT-PCR a perspective. J Mol Endocrinol., 2005, V. 34(3), P. 597-601.

46. Cai Z., Liang T.L., Luo G. Effect of mutations of the initiation nucleotides on hepatitis C virus RNA replication in the cell., 2004, V 78, V. 7, P. 3633-3643.

47. Carman W.F., Jacyna M.R., Hadziyannis S., Karayiannis P, McGarvey MJ, Makris A, Thomas HC.Mutation preventing formation of hepatitis B e antigen in patients with chronic hepatitis B infection. Lancet, 1989, V. 2(8663), P. 588-591.

48. Chamberlain RW, Adams N, Saeed AA, Simmonds P, Elliott RM. Complete nucleotide sequence of a type 4 hepatitis C virus variant, the predominant genotype in the Middle East. J Gen Virol., 1997 Jun.,78 (Pt 6), P. 1341-1347.

49. Chang L.J., Hirsch RC., Ganem D., Varmus H.E. Effects of insertionaland point mutations on the functions of the duck hepatitis B virus polymerase. J. Virol., 1990, V. 64, P.5553-5558.

50. Chang M., Marquardt A.P., Wood B.L., Williams O. In situ distribution of hepatitis C virus replicative-intermediate RNA in hepatic tissue and its correlation with liver disease. J Virol., 2000, V. 74(2), P. 944-955.

51. Chen W.N., Oon C.J. Changes in the antigenicity of a hepatitus B virus mutant stemming from lamivudine therapy. Antimicrob Agents Chemother., 2000, V. 44(6), P. 1765.

52. Chen W.N., Oon C.J. Hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) mutants in Singapore adults and vaccinated children with high anti-hepatitis B virus antibody levels but negative for HBsAg. J Clin Microbiol., 2000, V. 38(7):2793-2794, ;

53. Cheng S., Fockler C., Barnes W.M., Higuchi R. Effective amplification of longtargets from cloned inserts and human genomic DNA.Proc Natl Acad Sci V. 91(12):5695-5699,1994.

54. Choo Q.L., Kuo G., Weiner A.J. Overby LR, Bradley DW, Houghton M. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis geno38me. Science., 1989,V. 244(4902), P.359-362.

55. Clarke B. Molecular virology of hepatitis C virus: review. J. Gen. Virol., 1997, V 78, № 10, P. 2397-2410.

56. Coleman PF. Surveillance for hepatitis B surface antigen mutants. J Med Virol., 2006, 78 Suppl 1, P.56-58.

57. Deiman B, van Aarle P, Sillekens P. Characteristics and applications of nucleic acid sequence-based amplification (NASBA). Mol Biotechnol., 2002, V. 20(2), P. 163-179.

58. Don R.H., Cox P.T., Wainwright B.J., Baker R„ Mattick J.S. "Touchdaun" PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucleic. Acids Res.,1991,V. 19 (14), P. 4008.

59. EURACHEM Guide. The fitness for purpose of analytical methods. A laboratory guide to method validation and related topics., 1998.

60. Fabris P, Biasin MR, Infantolino D, Tositti G, Venza E, Floreani A, Zanetti A, de Lalla F., TTV infection in patients with acute hepatitis of defined aetiology and in acute non-A-E hepatitis. J.Hepatol., 2000, V. (32)4, P.661-665.

61. Fahy E., Kwoh D.Y., Gingeras T.R. Self-sustained sequence replication (3SR): ai isothermal transcription-based amplification system alternative to PCR. PCF Methods Appl., 1991, V. 1(1), P.25-33.

62. Francois G., Rew M., Van Damme P., Mphahlele MJ, Meheus A. Mutant Hepatitis B viruses: a matter of academic interest only or a problem with farreaching implications?, Vaccine, 2001,V. 19, P. 3799-3815.

63. Gerlich W.H. Diagnostic problems caused by HBsAg mutants-a consensus report of an expert meeting. Intervirology., 2004, V. 47, P. 310-313.

64. Gerlich W.H., Lu X., Heerman K.H. Studies on the attachment and penetration of hepatitis B virus . J. Hepatol., 1993, 17 suppl V. 3, P. 10 14.

65. Ghendon Y.Z. World health organization strategy for control jn Hepatitis B In: Control of virus disease. Ed .E Kustran 2nd ed. Marcel Dekker Inc. N.-Y., 1993, P. 141-164.

66. Gilbert F., Mandart E., Fitoussi F., Tiollais P., Charnay P. Nucleotide sequence of hepatitis B virus genome (subtype ayw) cloned in E.col. Nature, 1979, V. 281, P. 646-650.

67. Grethe S., Monazahian M., Bohme I., Thomssen R. Characterization of unusual escape variants of hepatitis B surface antigen-negative subject. J. Virol., 1998,V. 72(9), P. 7692-7696.

68. Hasegawa K., Huang J., Rogers S.A ., Blum HE, Liang TJ. Enhanced replication of a hepatitis B virus mutant associated with an epidemic of fulminant hepatitis. J Virol., 1994, V. 68(3), P. 651-1659.

69. He Y., Yan W., Coito C., Li Y., Gale M. J.r, Katze M.G. The regulation of hepatitis C virus (HCV) internal ribosome-entry site-mediated transletion by HCV replicons and nonstructural proteins. J Gen Virol., 2003, V. 84 № 3, P. 535543.

70. Heid C.A., Stevens J., Livak K.J., Williams P.M. Real time quantitative PCR. Genome Res., 1996, V. 6, P. 986-994.

71. Hijikata M, Kato N, Ootsuyama Y, Nakagawa M, Ohkoshi S, Shimotohno K. Hypervariable regions in the putative glycoprotein of hepatitis C vims. Biochem Biophys Res Commun., 1991, V. 175(1), P.220-228.

72. Hou J., Liu Z., Gu F. Epidemiology and prevention of hepatitis B virus infection. Int J Med Sci., 2005,V. 2(1), P.50-55.

73. Hou J., Wang Z., Cheng J., Lin Y. Prevalence of naturally occurring surface gene variants of hepatitis B virus in nonimmunized surface antigen-negative Chinese carriers. Hepatology., 2001,V. 34(5), P. 10271034.

74. Houghton M., Weiner A., Han J., Kuo G., Choo Q.L. Molecular biology of the heptitis C viruses: implications for diagnosis, development and control of viral disease. Hepatology ,199,. V.14, P. 381-388.

75. Hsu H.Y, Chang M.H, Lee C.Y, Hsieh K.H., Ni Y.H., Chen P.J., Chen D.S. Precore mutant of hepatitis B virus in childhood fulminant hepatitis B: an infrequent association. J Infect Dis., 1995, V. 171, P. 776-781.

76. Hunt C.M., McGill J.M., Allen M.I., Condreay L.D. Clinical relevance of hepatitis B virus mutations. Hepatology, 2000, V. 31, P. 1037-1044.

77. International Conference on Harmonization (ICH) of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use, Validation of analytical procedures, ICH-Q2A. 1994, 5p.

78. International Conference on Harmonization (ICH) of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use, Validation of analytical procedures: Methodology, ICH-Q2B. 1996, 8p.

79. Kamisango K., Kamogawa C., Sumi M., Goto S, Hirao A, Gonzales F, Yasuda K, lino S. Quantitative detection of hepatitis B virus by transcription-mediated amplification and hybridization protection assay. J. Clin. Microbiol., 1999, V. 37 (2), P. 310-314.

80. Karthigesu V.D., Mendy M., Fortutin V., Whittle HC, Howard CR, Allison LM. The ligase chain reaction distinguishes hepatitis B virus S-gene variants. FEMS Microbiol. Lett., 1995, V. 131 (2), P. 127-132.

81. Kato N., Oosueama Y., Ohkoshi S., Nakazawa T, Sekiya H, Hijikata M, Shimotohno K. Characterisation of hypervariable regions in the putative envelope protein of hepatitis C virus. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1992, V. 189(1), P. 119-127.

82. Kato N., Ootsueama Y. , Tanaka T., Nakagawa M., Nakazawa T., Muraiso K.,

83. Ohkoshi S., Hijikata M., Shimotohno K. Marked sequence diversity in the putative envelope proteins of hepatits C virus. Virus Res., 1992, V. 22(2), P. 107-123.

84. Komatsu F., Takasaki K. Determination of serum hepatitis C virus (HCV) core protein using a novel approach for quantitative evaluation of HCV viraemia in anti-HCV-positive patients. Liver., 1999,V. 19(5), P.375-380.

85. Krajden M., Comanor L., Rifkin O., Grigoriew A., Minor J.M., Kapke G.F. Assessment of hepatitis B virus DNA stability in serum by the Chiron Quantiplex branched-DNA assay. J Clin Microbiol., 1998, V. 36(2), P.382-386.

86. Kramvis A., Kew M.C. The core promoter of hepatitis B virus. J. Viral. Hepat., 1999,V.6, P. 415-427.

87. Kuo G., Choo Q.L., Alter H.J., Gitnick G.L. An assay for circulating antibodies to a major etiologic virus of human non-A, non-B hepatitis. Science., 1989, V. 244(4902), P. 362-364.

88. Lang T.J., Hasegawa K., Rimon N., Wands J.R., Ben-Porath E. A hepatitis B virus mutant associated with an episode of fulminant hepatitis. N Engl J Med., 1991,V. 324, P. 1705-1709.

89. Laperche S., Le Marrec N., Simon N., Bouchardeau F., Defer C. A new HCV core antigen assay based on disassociation of immune complexes: an alternative to molecular biology in the diagnosis of early HCV infection. Transfusion., 2003,V.43(7), P.958-962.

90. Laskus T., Persing D.H., Nowicki M.J., Mosley JW, Rakela J. Nucleotide sequence analysis of the precore region in patients with fulminant hepatitis B inthe United States. Gastroenterology, 1993, V. 105(4), P. 1173-1178.

91. Lau J.Y.N., Wright T.L. Molecular virology and pathogenesis of hepatitis B. LANCET, 1993, V. 342, P. 1335-1340.

92. Lauer G., Walker B. Hepatitis C virus infection. Review. N Engl J Med., 2001, V. 345(1), P. 41-52.

93. La'ulu S.L., Roberts W.L. The analytic sensitivity and mutant detection capability of six hepatitis B surface antigen assays. Am J Clin Pathol., 2006, V. 125(5), P.748-51.

94. LeBouvier GL, McCollum RW. Australia (hepatitis associated) antigen: physcochemical and immunological characteristics, Adv. Virus Res. V. 16: 357396, 1970.

95. Lee J.W., Kim K., Jung S.H., Lee K.J., Choi E.C., Sung Y.C., Kang C.Y. Identification of a domain containing B-cell epitopes in hepatitis C virus E2 glycoprotein by using mouse monoclonal antibodies. J Virol., 1999, Jan;73(l), P. 11-18.

96. Ling R, Mutimer D., Ahmed M., Boxall E.H., Elias E., Dusheiko G.M., Harrison T.J. Selection of mutations in the hepatitis B virus polymerase during therapy of transplant recipients with lamivudine. Hepatology., 1996, V. 24(3), P. 711-713.

97. Loeffler J., Henke N., Hebart H., Schmidt D., Hagmeyer L., Schumacher U., Einsele H. Quantification of fungal DNA by using fluorescence resonance energy transfer and the light cycler system. J Clin Microbiol., 2000, V. 38(2), P. 586- 590.

98. Lok A.S.F., McCachon D.J. Chronic Hepatitis B. Hepatology., 2007, V. 45(2), P.507-539.

99. Lunel F., Cresta P., Vitour D., Payan C., Dumont B., Frangeul L., Reboul D., Brault C., Piette J.C., Huraux J.M. Comparative evaluation of hepatitis C virus

100. RNA quantitation by branched DNA, NASBA, and monitor assays. Hepatology., 1999 Feb, V. 29(2), P.528-535.

101. Ly T.D., Servant-Delmas A., Bagot S. Sensitivities of four new commercial hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) assays in detection of HBsAg mutant forms. J Virol Methods., 2006, V. 135(1), P. 109-117.

102. Mackay I.M., Arden K.E., Nitsche A. Survey fad Summary Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Research., 2002,V. 30(6), P. 1292-1305.

103. Magnius L.O., Norder H. Subtypes, genotypes and molecular epidemiology of the hepatitis B virus as reflected by sequence variability of the S-gene. Intervirology., 1995,V. 38, P.24-33.

104. Matsumoto M., Hwang S.B., Jeng K.S., Zhu N., Lai M.M. Homotypic interaction and multimerization of hepatitis C virus core protein. Virology., 1996 Apr., V. 218(1), P.43-51.

105. Mizokami M., Ohba K., Gojobori T., Lau J. Y. At least 7 types and 16 subtypes of hepatitis C virus based on molecular evolutionary analysis. Hepatology., 1994,V. 20, P. 245A.

106. Morishima C., Gretch D.R. Clinical use of hepatitis C virus tests for diagnosis and monitoring during therapy.Clin Liver Dis., 1999Nov., V.3(4), P. 717-740.

107. Nassal M. Hepatitis B virus replication; Novel roles for virus-host interactions. Intervirology., 1999,V .42, P. 100-116.

108. Nolandt O., Kern V., Muller H. et al. Análisis of hepatitis C virus core protein interaction domains. J Gen Virol., 1997,V. 6, P. 1331-1340.

109. Nouri Aria K.T., Sallie R., Sangar D., Alexander G.J, Detection of genomic and intermediate replicative strands of hepatitis C virus in liver tissue by in situ hybridization. J Clin Invest., 1993,V. 91(5), 2226-2234.

110. Ogata N. Miller R.H., Ishak K.G., Purcell R.H. The complete nucleotidesequence of a precore mutant of hepatitis B virus implicated in fulminant hepatitis and its biological characterization in chimpanzees. Virology, 1999, V. 194 (1), P. 263-276.

111. Ohba K., Mizokami M., Ohno T. et al. Relationships between serotypes and genotypes of hepatitis B virus: genetic classification of HBV by use of surface genes. Virus Res., 1995, V. 39, P.25-34.

112. Okamoto H., Mishiro S. Genetic heterogeneity of hepatitis C virus. Intervirology., 1994,V. 37(2), P. 68-76.

113. Omata M, Ehata T., Yokosuka O., Hosoda K., Ohto M. Mutations in the precore region of hepatitis B virus DNA in patients with fulminant and severe hepatitis. N Engl J Med., 1991, V. 324(249), P. 1699-1704.

114. Onganer PU. Genotypes of the hepatitis B virus: Basic aspects. Ann. Microbiol., 2004, V. 54 (3), P. 325-334.

115. Peterson J., Green G., Iida K., Caldwell B. Detection of hepatitis C core antigen in the antibody negative 'window' phase of hepatitis C infection. Vox Sang., 2000, V. 78(2), P. 80-85.

116. Pileri P., Uematsu Y., Campagonoli S., Galli G, Falugi F, Petracca R, Weiner AJ, Houghton M, Rosa D, Grandi G, Abrignani S. Binding of gepatitis C virus to CD81. Science., 1998, V. 282 (5390), P. 938-941.

117. Robinson W.S., The role of hepatitis B virus in the development of primary hepatocellular carcinoma: Part I. J. Gastroenterol. Hepatol., 1992, V. 7(6), P. 622-638.

118. Roccasecca R., Ansuini H., Vitelli A. Binding of the hepatitis С virus E2 glycoprotein to CD81 is strain specific and is modulated by a complex interplay between hypervariable regions 1 and 2. J Virol., 2003, V. 77(3), P. 1856-1867.

119. Saldahna J., Gerlich W., Lelie P.N., Heerman К and Heath A. An International$

120. Collaborative Study to esteblish a World Health Organization International Standard for Hepatitis В virus DNA Nucleic acid Amplification Techniques. Vox Sanquinis, 2001, V. 80, P. 63-71.

121. Saldahna J., Lelie P.N., Heath A., and the WHO collaborative study group. Establishment of the First International Standard for Nucleic Acid Amplification Technology (NAT) assays for HCV-RNA. Vox. Sang, 1999, V. 76, P. 149-158.

122. Saldanha J, Heath A., Collaborative Study Group.Collaborative study to calibrate hepatitis С virus genotypes 2-6 against the HCV International Standard, 96/790 (genotype 1). Vox Sang., 2003 Jan., V. 84(1), P.20-27.

123. Saldanha J. Standardization: a progress report. Biologicals, 1999 Dec., V. 27(4), P. 285-289.

124. J.Sambrook, E.F.Fritsch, T. Maniatis, «Молекулярное клонирование», 1989

125. Santolini E, Migliaccio G, La Monica N. Biosynthesis and biochemical properties of the hepatitis С virus core protein. J Virol., 1994 Jun., V. 68(6), P. 3631-3641.

126. Scaglioni P.P., Melegari M., Wands J.R. Biologic properties of hepatitis В viral genomes with mutations in precore promoter and precor open reading frame. Virology, 1997, V. 233, P. 374-381.

127. Seeger C., Ganem D„ Varmus H,E. Biohemical and genetic evidence for hepatitis В virus replication strategy. Science, 1986,V. 232, P.477-484.

128. Seeger C., Mason WS. Hepatitis В virus biology. Mycrobiol Mol Biol Rev., 2000,V. 64, P.51-68.

129. Sherlok S., Dooley J. Diseases of the liver and biliary system. 10th edition. Blackwell Science, 1997, P. 714

130. Simmonds P. Variability of hepatitis C virus. Hepatology., 1995, V. 21, P. 570-583.

131. Soguero C., Joo M., Chianese-Bullock K.A., Nguyen D.T., Tung K., Hahn Y.S. Hepatitis C virus core protein leads to immune suppression and liver damage in a transgenic murine model. J Virol., 2002, V. 76 (18), P. 9345-9354.

132. Sykes P.J., Neoh S.H., Brisco M.J., Hughes E., Condon J., Morley A.A. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques, 1992 Sep., V. 13(3), P.444-449.

133. Taswell C. Limiting dilution assays for the determination of immunocompetent cell frequencies. J. Immunology., 1981, V. 126 (4) , P. 1614-1619.

134. Tiolais P., Charmay .P, Vyas Gn. Biology of hepatitis B virus. Science, 1981,V. 213, P.406-411.

135. Triyanti M., Saunier B., Maruvada P., Davis AR, Ulianich L, Heller T, Patel A, Kohn LD, Liang TJ Interaction of hepatitis C virus-like particles and cells: a model system for studying viral binding and entry. J Virol., 2002, V. 76 (18), P. 9335-9344.

136. Tsukiyama-Kohara K., Iizuka N., Kohara M., Nomoto A. Internal ribosome entrysite within hepatitis C virus RNA. J Virol. V. 66: 1476-1483, 1992.

137. Tyagi S, Kramer FR. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nat Biotechnol., 1996, V.14(3), P.303-308.

138. Umemura T, Yeo AE, Sottini A, Moratto D, Tanaka Y, Wang RY, Shih JW, Donahue P, Primi D, Alter HJ. SEN virus infection and its relationship to transfusion-associated hepatitis. Hepatology, 2001, V. 33(5), P. 1303-1311.

139. Walker G.T. Empirical aspects of strand displacement amplification. PCR Methods Appl., 1993, V. 3, P. 1-6.

140. Wang A.M., Doyle M.V., Mark D.F. Quantitation of mRNA by the polymerase chain reaction.Proc Natl Acad Sci U S A., 1989, V. 86(24), P. 9717-9721.

141. Weber B. Genetic variability of the S gene of hepatitis B virus: clinical and diagnostic impact. J Clin Virol., 2005, V. 32(2), P. 102-112.

142. Weber B., Dengler T., Berger A., Doerr H.W., Rabenau H. Evaluation of two new automated assays for hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) detection: IMMULITE HBsAg and IMMULITE 2000 HBsAg.J Clin Microbiol., 2003, V. 41(1), P.135-143.

143. Wu D.Y., Wallace R.B. The ligation amplification reaction (LAR)--amplification of specific DNA sequence s using sequential rounds of template-dependent ligation. Genomics., 1989, V. 4(4), P. 560-569

144. Xie L., Wu XD., Huang DZ., Chen HL., He LX, Wang J, Han DK.

145. Clinical application and analysis of hepatitis C virus NS3 antigen detection by ELISA in human serum. Chin Med J (Engl)., 2007; V. 120(4), P.294-299.

146. Zarski JP, Bohn B, Bastie A, Pawlotsky JM, Baud M, Bost-Bezeaux F, Tran van Nhieu J, Seigneurin JM, Buffet C, Dhumeaux D. Charakteristics of patients with dual infection by hepatitis B and C viruses. J. Hepatol., 1998, 28(1), P. 27-33.

147. Перечень наборов реагентов, испытания которых проводились в соответствии с разработанной системойп/п набор реагентов аналитиеская чувствительность специфичность суммарная воспроизводимость (%) диагностическая