Разработка молекулярных методов выявления в воде и клинических образцах вирусов - этиологических агентов заболеваний с фекально-оральным механизмом передачи тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, кандидат биологических наук Оксанич, Алексей Сергеевич

• Оксанич, Алексей Сергеевич
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Оксанич, Алексей Сергеевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Краткая характеристика клинически значимых кишечных вирусов.

1.1.1. Общая характеристика семейства Picornaviridae.

1.1.2. Эпидемиология и клиника заболеваний, вызываемых кишечными вирусами семейства Picornaviridae.

1.1.2.1. Полиовирусы.

1.1.2.2. Вирусы Коксаки, ECHO и Энтеровирусы 68-71.

1.1.2.3. Парэховирусы.

1.1.2.4. Вирус гепатита А.

1.1.3. Устойчивость энтеровирусов к воздействию физических и химических факторов.

1.1.4. Общая характеристика семейства Adenoviridae.

1.1.5. Ротавирусы, астровирусы, коронавирусы и калицивирусы.

1.2. Методы выявления кишечных вирусов в воде.

1.2.1. Методы концентрирования вирусов из воды.

1.2.2. Диоксид кремния. Принципы адсорбции белков и вирусов на силикагелях.

1.2.3. Методы выявления кишечных вирусов.

1.2.4. Молекулярные методы исследования.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Культуральные штаммы вирусов.

2.1.2. Клинические образцы и образцы сточных вод.

2.1.3. Клеточные линии.

2.1.4. Реактивы.

2.2. Методы.

2.2.1. Молекулярно-биологические методы.

2.2.2. Синтез сорбента для концентрирования безоболочечных вирусов из воды.

2.2.3. Концентрирование кишечных вирусов из воды.

2.2.4. Пробоподготовка.

2.2.4.1. Приготовление фекальных суспензий.

2.2.4.2. Выделение вирусных нуклеиновых кислот из биологического материала.

2.2.5. Реакция обратной транскрипции (ОТ).

2.2.6. Полимеразная цепная реакция с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени О^-Мап).

2.2.7. Количественная ПЦР-РВ.

2.2.7.1. Приготовление калибраторов.

2.2.7.2. Построение калибровочных прямых.

2.2.8. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

2.2.9. Метод трансмиссивной электронной микроскопии.

2.2.10. Методы выявления и идентификации кишечных вирусов.

2.2.11. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей.

2.2.12. Статистическая обработка результатов исследований.

Глава 3. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ

ВИРУСОВ ИЗ ВОДЫ.

3.1. Синтез сорбента для концентрирования безобол очечных вирусов из воды.

3.2. Определение емкости сорбента ММ при концентрировании белков и выделении нуклеиновых кислот.

3.3. Концентрирование кишечных вирусов из воды на сорбентах

ММ и ММ+.

Глава 4. РАЗРАБОТКА МЕТОДА МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР-РВ

С ВПК ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК И РНК

КИШЕЧНЫХ ВИРУСОВ.

4.1. Подбор праймеров и зондов.

4.2. Оценка специфичности праймеров и зондов с использованием лабораторных штаммов вирусов.

4.3. Оптимизация условий ОТ и ПЦР.

4.4. Оценка чувствительности мультиплексной ПЦР-РВ.

4.5. Разработка методов количественной оценки ДНК и РНК кишечных вирусов.

Глава 5. ИССЛЕДОВАНИЕ КЛИНИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ И

ОБРАЗЦОВ СТОЧНЫХ ВОД МЕТОДОМ ПЦР-РВ.

5.1. Анализ клинических образцов методом ПЦР-РВ.

5.2. Анализ сточных вод методом ИКМ-ПЦР-РВ.

5.3. Анализ образцов сточных вод методом ПЦР-РВ.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка молекулярных методов выявления в воде и клинических образцах вирусов - этиологических агентов заболеваний с фекально-оральным механизмом передачи»

Актуальность проблемы.

В начале 70-х годов была доказана вирусная этиология небактериальных гастроэнтеритов. С тех пор стало известно, что возбудителями кишечных заболеваний человека могут быть энтеровирусы (ЭВ), ротавирусы, аденовирусы (АВ), калицивирусы, астровирусы, коронавирусы и другие. Все эти вирусы, за исключением коронавирусов, являются безоболочечными, что обусловливает их высокую устойчивость к факторам внешней среды и способность сохранять инфекционность вне организма (например, в воде или на пищевых продуктах) до нескольких месяцев, тс есть дольше, чем колибактерии [55]. Кишечные вирусы имеют фекально-оральный механизм передачи. Порядка 35% от всех острых кишечных инфекций (ОКИ) в РФ имеют водный путь передачи [16]. Вирусы выделяются в очень больших количествах с фекалиями инфицированного человека - больной гастроэнтеритом или гепатитом может экскретировать от 105 до 10'12 вирионов с каждым граммом фекалий [18, 34]. Энтеровирусы выделяются из водопроводной воды даже после дезинфекции-[56, 78]. При оптимальных условиях вирусы способны проникать через почву на глубину более 100 метров [55].

Энтеровирусы оказывают самое различное воздействие на организм. Известно

66 серотипов энтеровирусов способных вызывать более 20 различных синдромов: полиомиелит, миокардит, перикардит, плевралгия, респираторные заболевания, конъюнктивит, гепатит, асептический менингит, энцефалит, ящур, диабет и др.

111]. Около 90-95% случаев полиовирусной инфекции и примерно 50% случаев

ECHO и коксакивирусной инфекции протекают бессимптомно [55]. Ротавирусы высококонтагиозны и являются главной причиной детских заболеваний, которые заканчиваются госпитализацией, в очень редких случаях летальным исходом. Более чем у 90% детей антитела к ротавирусам появляются до трехлетнего возраста. Вирус Норволк и другие калицивирусы являются частой причиной вспышек гастроэнтеритов в школах, семьях, больницах, лагерях отдыха [11, 110, 115]. Большинство подростков имеют антитела к энтеральным калицивирусам. Аденовирусы и астровирусы чаще вызывают гастроэнтериты у детей и ограниченно патогенны для взрослых.

В- настоящее время известно более 100 патогенных для человека вирусов, циркулирующих в водных объектах, 37 из них обнаруживаются; непосредственно е питьевой воде [57].

В этих условиях необходимость постоянного контроля; за степенью контаминации кишечными вирусами вод поверхностных водоемов, грунтовых вод, сточной и питьевой воды не вызывает сомнений. Данные мероприятия; необходимо проводить также в связи; с тем, что во многих регионах России-качество питьевой водьь не соответствует показателям, регламентируемым санитарными^ правилами и нормами №2.1.4.1074-01 «Питьевая; вода: Гигиенические требования к качеству воды- централизованных систем питьевого*' водоснабжения: Контроль качества» [14]. Зачастую причиной? возникновения вспышек ОКИ является? загрязнение водопроводной воды сточными водами:

В последние; годы на территории России, имели место многочисленные вспышки инфекционных заболеваний с водным путем; передачи,! в частности; гепатита А, ротавирусного гастроэнтерита, энтеровирусного менингита й др. В то же время: часто регистрировались/ вспышки: инфекционных; кишечных-заболеваний с неясной этиологией. Затруднения при определении возбудителей этих заболеваний отчасти связаньь с: несовершенством используемых методов выявления кишечных вирусов.

Наиболее, сложным и несовершенным этапом вирусологического контроля» воды является процесс концентрирования вирусов; В настоящее время- в: распоряжении санитарных вирусологов,имеется ряд методов концентрирования вирусов из воды |1, 6], которые нуждаются в оптимизации, в. основном за счет применения новых,, доступных и высокоэффективных адсорбирующих материалов. В этой связи - поиск и изучение новых сорбентов на сегодняшний? день является весьма актуальной задачей.

Значимость кишечных вирусов в инфекционной патологии человека определяет необходимость их своевременного выявления. До настоящего времени «золотым стандартом» лабораторной диагностики энтеровирусной и аденовирусной инфекции и выявления энтеровирусов в окружающей среде остается реакция нейтрализации (РН) с типоспецифическими сыворотками в культуре, чувствительных клеток. В 8 научных исследованиях эффективно применяют реакции прямой и непрямой иммунофлуоресценции (ИФ), характеризующиеся меньшими затратами времени по сравнению с РН. Сложность, длительность и трудоемкость РН обусловлена различной чувствительностью клеточных культур к отдельным представителям рода Enterovirus и множеством их антигенных вариантов. По этой причине затруднена и разработка унифицированных диагностикумов, позволяющих быстро и эффективно проводить выявление и дифференциацию энтеровирусов. Кроме того, ряд кишечных вирусов (например, калицивирусы и вирус гепатита А) с трудом поддаются культивированию. Решение данной проблемы в последние годы связывают с развитием молекулярно-биологических лабораторных методов, таких как ПЦР с гибридизационной идентификацией^ продуктов амплификации,1 мультиплексная ПЦР, а также ПЦР в режиме реального времени [3, 48, 53, 97].

Цели.и задачи исследования.

Целью настоящего исследования была разработка методов концентрирования энтеровирусов (ЭВ), аденовирусов (АВ) и вируса гепатита А (ВГА) из воды, а также их выявления в сточных водах и фекальных суспензиях методом мультиплексной* ПЦР в режиме реального времени.

Для реализации поставленной цели необходимо было решить- следующие задачи:

1. Синтезировать несколько вариантов сорбентов для концентрирования вирусов из воды.

2. Отработать методы количественного учета ДНК и РНК вирусов для оценки эффективности концентрирования вирусов из воды.

3. В модельных экспериментах оценить эффективность концентрирования вирусов из воды с применением синтезированных сорбентов.

4. Подобрать праймеры и зонды для ПЦР с флуоресцентной- детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ) для выявления аденовирусов, энтеровирусов и вируса гепатита А в мультиплексном формате и тестировать их на лабораторных штаммах вирусов.

5. Провести сравнительный анализ клинических образцов от пациентов с ОКИ методами мультиплексной ПЦР-РВ и культуры клеток. 9

6. Проанализировать образцы элюатов, полученных в результате концентрированйя.вирусов из образцов сточных вод; на. наличие АВ, ЭВ и ВРА методами мультиплексной ПЦР-РВ и ПЦР интегрированной с культуральным методом.

Научная новизна работы.

Г. Впервые показана возможность с высокой- эффективностью концентрировать кишечные вирусы из воды с использованием магнитных микрочастиц, покрытых модифицированным аминогруппами полимером диоксида кремния.

2. Впервые в- России; разработан метод для одновременного выявления аденовирусов, энтеровирусов и вируса гепатита А с использованием внутреннего положительного контроля, основанный < на мультиплексной ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.

3. Для;оценки-эффективности концентрирования кишечных вирусов из воды был предложен оригинальный метод, основанный' на' количественном определении вирусных нуклеиновых кислот с помощью ПЦЕ-РВ;,

Практическая значимость.

1. Сорбент на основе магнитных микрочастиц; покрытых модифицированным? аминогруппами; полимером диоксида кремния; может быть использован для высокоэффективного концентрирования кишечных вирусов из воды. Магнитные свойства сорбента позволяют собирать его проточным методом» с помощью сильных магнитов, описанным в настоящей работе, не прибегая к центрифугированию больших объемов воды. Метод может быть использован для контроля за санитарным состоянием источников водоснабжения.

2. Мультиплексная ПЦР с флуоресцентной детекцией; в режиме реального времени для одновременного выявления аденовирусов, энтеровирусов и вируса гепатита А может использоваться в качестве тест-системы как для контроля, за вирусной контаминацией воды (после стадии концентрирования вирусов), так и для анализа лизатов клеточных культур, зараженных вирусным материалом, а также в диагностике ОКИ.

3. Разработанные методы количественного определения вирусных ДНК и РНК могут быть использованы для контроля за активностью вирусной репродукции и эффективностью противовирусной терапии у пациентов, а также в научных исследованиях при испытании противовирусных препаратов в культурах клеток и на лабораторных животных.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Магнитные микрочастицы, покрытые модифицированным аминогруппами полимером диоксида кремния, позволяют с достаточно высокой степенью эффективности концентрировать кишечные вирусы из воды.

2. Разработанная мультиплексная ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени позволяет выявлять аденовирусы, энтеровирусы и вирус гепатита А в клинических образцах, лизатах зараженных клеточных культур, и элюатах, полученных в результате концентрирования вирусов из воды.

3. Применение метода выделения нуклеиновых кислот из образцов фекальных суспензий и элюатов, полученных в результате концентрирования вирусов из воды, с использованием в качестве сорбента магнитных микрочастиц, покрытых полимером диоксида кремния, обеспечивает получение препаратов нуклеиновых кислот (НК), свободных от ингибиторов ОТ и ПЦР.

4. Количественная ПЦР-РВ может быть использована как метод оценки эффективности концентрирования кишечных вирусов из воды.

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Оксанич, Алексей Сергеевич

выводы.

1. Впервые показана возможность с высокой эффективностью концентрировать кишечные вирусы из воды с использованием магнитных микрочастиц, покрытых модифицированным аминогруппами полимером диоксида кремния.

2. Разработан метод мультиплексной ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ) для одновременного выявления в клинических образцах и образцах сточных вод аденовирусов, энтеровирусов и вируса гепатита А с использованием внутреннего положительного контроля.

3. Установлено, что выделение нуклеиновых кислот из образцов фекальных суспензий и элюатов, полученных в результате концентрирования вирусов из воды, с использованием в качестве сорбента магнитных микрочастиц, покрытых полимером диоксида кремния, обеспечивает получение препаратов НК свободных от ингибиторов ОТ и ПЦР.

4. Разработаны оригинальные методы оценки эффективности концентрирования кишечных вирусов из воды с использованием количественной ПЦР-РВ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Автор выражает глубокую благодарность научным руководителям работы: академику РАМН, профессору, доктору биологических наук Звереву Виталию Васильевичу и кандидату биологических наук Файзулоеву Евгению Бахтиёровичу за построение логики работы и помощь в интерпретации результатов.

Автор выражает особую благодарность кандидату биологических наук Кривцову Георгию Георгиевичу за помощь в подборе и синтезе сорбентов для концентрирования вирусов из воды.

Кроме того, автор выражает благодарность руководителю лаборатории вирусологии полиомиелита и других энтеровирусных инфекций Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН, кандидату медицинских наук Ивановой Ольге Евгеньевне за предоставление лабораторных штаммов энтеровирусов и клинических образцов для исследований, а также за содействие в проведении работы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Оксанич, Алексей Сергеевич, 2008 год

1. Амвросьева Т.В., Дьяконова О.В., Гудков В.Г. и др. Активный оксид алюминия новый адсорбент для концентрирования кишечных вирусов из воды. Вопр. вирусол., 1999, 2: 92-95.

2. Вирусология. Методы: Пер. с англ./Под ред. Б. Мэйхи. М.: Мир, 1988. -344 е., ил.

3. Голицына Л.Н., Новикова H.A., Домбровская Л.К. и др. Оценка разработанного «nestec^-варианта полимеразной цепной реакции при выявлении энтеровирусов у больных. Вопр. вирусол. 2002, 5: 41-43.

4. Иммуноферментный анализ: Пер. с англ./Под ред. Т. Нго и Г. Ленхоффа -М.: Мир, 1988. 446 е., ил.

5. Карякин Ю. В., Ангелов И. И. Чистые химические реактивы: М., Госхимиздат, 1955, 141-142.

6. Конторович В.Б., Иванова O.E., Еремеева Т.П., Ширман Г.А.,,Казанцева

7. B.А. Метод концентрирования вирусов в водных объектам окружающей среды. Вопр. вирусол., 1996, 1: 40-42.

8. Круглов И.В., Сабанин Ю.В., Кузин С.Н. Вирусные гепатиты: характеристика возбудителей, исходы заболеваний и перспективы исследований. Эпидемиология и вакцинопрофилакгика. 2006, 5": 31-34.

9. Лакин Г.Ф. Биометрия: Учеб. пособие для биол. спец. вузов 4-е изд., перераб. и доп. - М.: Высш. шк., 1990. - 352 е.: ил.

10. Методические указания №4.2.2029-05 «Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Санитарно-вирусологический контроль водных объектов».

11. Молекулярная клиническая диагностика. Методы: Пер. с англ./Под ред.

12. C. Херрингтона, Д. Макги. М.: Мир, 1999, 558 е., ил.

13. Мухина А.А, Шипулин Г.А., Боковой А.Г., Яцышина С.Б. Первый опыт изучения калицивирусной инфекции у детей в Москве. Вопр. вирусол., 2002,6: 33-37.

14. Остерман JI.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). М.: Наука, 1981,288 с.

15. Ройт А., Бростофф Д., Мейл Д. Иммунология. Пер. с англ., М.: Мир, 2000, 592 е., ил.

16. СанПиН №2.1.4.1074-01 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества».

17. Файзулоев Е.Б., Никонова А.А., Оксанич А.С. и др. Разработка ПЦР тест-системы для выявления аденовирусной инфекции у человека. Вопр. вирусол. 2005, 6: 44-47.

18. Фролочкина Т.И., Марков В.Ю. Водные вспышки кишечных инфекций. Актуальные проблемы эпидемиологии и профилактики инфекционных болезней в России и странах ближнего зарубежья. Самара 2006. Сб. тезисов в 1 т, 316-318.

19. Abbaszadegan М., Stewart P., Le Chevallier М. A strategy for detection of viruses in groundwater by PCR. Appl. Environ. Microbiol. 1999, 65(2): 444449.

20. Abd el-Galil K., Sokkary M. A., Kheira S. M. Real-time nucleic acid sequence-based amplification assay for detection of hepatitis A virus. Appl. Environ. Microbiol. 2005, 71(11): 7113-7116.

21. Adam E., Nasz I., Medveczky P. Comparative studies on the soluble proteins of adenovirus type 1. Acta. Microbiol. Acad. Sci. Hung. 1977, 24(3):181-187.

22. Adenoviruses: Basic Biology to Gene Therapy ./edited by Prem Seth. 1999.

23. Agrez M.V., Shafren D.R., Gu X., et al. Integrin alpha V beta 6 enhances coxackievirus B1 lytic infection of human colon cancer cells. Virology, 1997, 239: 71-77.

24. Alexander L., Lu H.H., Wimmer E. Polioviruses containing picornavirus type 1 and/or type 2 internal ribosomal entry site elements: Genetic hybrids and the expression of a foreign gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91: 14061410.

25. Allard A., Albinsson B., Wadell G. Detection of adenoviruses in stools from healthy persons and patients with diarrhea by two-step polymerase chain reaction. J. Med. Virol., 1992, 37: 149-157.

26. A-Z of quantitative PGR./edited by Bustin S.A., 2004;

27. Baltimore D., Girard M., Darnell J.E. Aspects of the synthesis of poliovirus RNA and the formation of virus particles, Virology, 1966, 29: 179-189.

28. Bass D.M., Upadhyayula U. Characterization of human serotype 1 astrovirus-neutralizing epitopes. J. Virol., 1997, 71: 8666-8671.

29. Benko M., Harrach B., Russell W. C. Family Adenoviridae. In: Virus Taxonomy. Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of

30. Viruses; Van Regenmortel M.H.V., Bishop C.M.F., Carstens E.B^.Estes M.K.,.:' Lemon S.M., Maniloff J., Mayo M.A., McGeoch D.J., Pringle C.R., Wickner R.B: Eds. Academic Press Inc.: New York, 1999, 227-238.

31. Bock H.G., Skene P., Fleischer S., Cassidy P., Harshman S. Protein purification: adsorption chromatography on controlled pore glass with the use of chaotropic buffers. Scince, 1976, 191: 380-383.

32. Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M. et al. Rapid» and; simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 1990,' 28: 495-503.

33. Borodina T.A., Lehrach H., Soldatov A.V. DNA purification on homemade silica spin-columns. Anal. Biochem., 2003, 321(1): 135-137.

34. Bosch A. Human enteric viruses in the water environment: a minireview. Internatl. Microbiol. 1998 1:191-196.

35. Brown M., Grydsuk J.D., Fortsas E., Petric M: Structural features unique to enteric adenoviruses. Arch;.Virol; Suppl., 1996, 12: 301-307.

36. Brundage S.C., Fitzpatrick A.N. Hepatitis A. Am. Fam. Physician., 2006, 73(12): 2162-2170.

37. Bustin S.A., Mueller R. Real-time revers transcription PGR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clin. Sci., 2005, 109: 365-379.

38. Carter: M.J., Willcocks M.M. The molecular biology of asrtoviruses. Arch. Virol. Suppli, 1996, 12: 277-285.

39. Chow M., Newman J.F., Filman D., et al. Myristylation of picornavirus capsid protein VP4 and its structural significance. Nature, 1987, 327:482^486.

40. Cuthbcrt J.A. Hepatitis A: old and new. Clin. Microbiol. Rev., 2001, 14(1): 3858.f

41. Desselberger U. Genome rearrangements of rotaviruses. Arch. Virol. Suppl;.1996; 12: 37-51.

42. Donaldson; K.A., Griffin D;W., Paul J.II. Detection, quantitation and; identification of<enteroviruses* from surface waters and sponge tissue from the Florida Keys using real-time RT-PCR. Water Res:, 2002, 36: 2505-2514.

43. Dorsey S.G., Rogers, S.D. Review: chromatographic silanol; activity test procedures: the quest for a universal test. J; Chrom. A., 2000; 892: 57-65.

44. Duke G.M., Osorio J.E., Palmenberg A.G. Attenuation of Mengo virus through genetic engineering ofthe 5: noncoding poly(C) tract. Nature, 1990, 343: 474476.

45. Edwards K., Logan J., Saunders N. Real-time PGR. An essential^ guide. London, 2004;

46. Edy V.G., Braude I.A., De Clercq E., Billiau A., De Somer P: Purification of interferon by adsorption chromatography on controlled pore glass. J. Gen. Virol. 1976, 33: 517-521.48