Количественное определение вируса гепатита C методом ПЦР в реальном времени и его генотипирование с использованием флуорогенных бинарных зондов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат биологических наук Ведерников, Виталий Евгеньевич

• Ведерников, Виталий Евгеньевич
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Ведерников, Виталий Евгеньевич

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Строение вируса гепатита С.

1.2. Жизненный цикл ВГС.

1.3. Вариабельность генома ВГС и его генотипы.

1.4. Алгоритмы диагностики и лечения вирусного гепатита С.

1.5. Полимеразная цепная реакция с регистрацией продуктов амплификации в режиме реального времени (ПЦР-РВ).

1.6. ПЦР в режиме реального времени и схемы флуоресцентной детекции.

1.7. Методы анализа графиков накопления ДНК.

1.7.1. Алгоритмы сглаживания.

1.7.2. Вычитание фоновой составляющей.

1.7.3. Определение значения Сц.

1.7.4. Пороговый метод сравнения графиков накопления ДНК (О;).

1.7.5. Метод максимума второй производной - нахождение Сц по форме кривой.

1.7.6. Методы оценки эффективности амплификации.

1.7.7. Метод серийных разведений.

1.7.8. Определение Е по приросту флуоресценции в экспоненциальной фазе.

1.7.9. Аппроксимация сигмоидой или логистической функцией.

1.7.10. Оценка эффективности амплификации в экспоненциальной фазе с использованием сложных моделей.

1.7.11. Обсуждение методов определения Сц и Е.

1.8. Общий дизайн количественного ПЦР-исследования с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени.

1.9. Общие рабочие характеристики тестов для выявления и количественного определения РНК ВГС.

1.10. Генотипирование ВГС.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Количественное определение вируса гепатита C методом ПЦР в реальном времени и его генотипирование с использованием флуорогенных бинарных зондов»

Актуальность проблемы

Несмотря на значительные усилия, предпринимаемые в течение многих лет службами здравоохранения большинства государств по предотвращению распространения гепатита С (ГС), эта инфекция и в настоящее время является актуальной мировой проблемой. По данным экспертов на земном шаре насчитывается более 500 млн. человек, инфицированных вирусом гепатита С (ВГС), в Российской Федерации их число приближается к 5 млн. Количество новых случаев заболевания ГС, регистрируемых в США, ежегодно достигает около 175 тыс., в Западной Европе - 170 тыс., в Японии — более 350 тыс. Только в США каждый год умирает около 10 тыс. человек, инфицированных ВГС [149; 216]. Ситуацию в значительной мере осложняют отсутствие вакцины против ГС, циркуляция большого количества разных генотипов вируса, способность его к ускользанию от иммунного контроля человека за счет непрерывного обновления антигенной структуры, а также высокая частота протекания инфекции в скрытой бессимптомной форме. Поэтому актуальными задачами для здравоохранения всех стран являются: профилактические меры по снижению риска заражения ВГС здорового населения, повышение эффективности выявления инфицированных лиц и проведение действенной противовирусной терапии.

Для диагностики гепатита С в настоящее время применяется комплекс методов, включающих определение в сыворотке крови обследуемых людей антител к вирусным антигенам с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) и иммуноблота, а также обнаружение вирусной РНК ВГС с использованием технологий амплификационного тестирования нуклеиновых кислот (NAT) [14]. Одним из широко распространенных NAT-методов является полимеразная цепная реакция (ПЦР) с флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени (ПЦР-РВ), благодаря простоте исполнения, высокой чувствительности, специфичности и надежной интерпретации результатов анализа. Высокая чувствительность этого метода особенно актуальна в трансфузиологии для обеспечения учреждений здравоохранения безопасной донорской кровью и ее компонентами, поскольку он (метод) позволяет выявлять нуклеиновую кислоту ВИЧ и вирусных гепатитов В (ВГВ) и С (ВГС) в ИФА-отрицательных пробах крови [44], полученных в период сероконверсионного окна [6]. Применение ПЦР в службе крови в США, Канаде, Великобритании, Франции и ряде других стран уже привело к снижению риска трансфузионной передачи ВГС в 6 раз [113]. В настоящее время ПЦР-тестирование активно внедряется в донорскую службу нашей страны. Согласно приказу Минздрава N 364 "Об утверждении Порядка медицинского обследования донора крови и ее компонентов" РФ от 14.09.2001 в редакции от 06.06.2008 «образцы крови с отрицательными результатами ИФА-тестов, объединенные в минипулы, должны подвергаться исследованию на наличие нуклеиновых кислот ВГВ, ВГС и ВИЧ» [222].

Комплексное применение методов ИФА и ПЦР позволяет не только значительно повысить эффективность диагностики гепатита С, но также более точно дифференцировать стадии заболевания и определять репликационную активность вируса в организме больного.

Количественные тесты для определения вирусной нагрузки незаменимы при принятии решения о проведении противовирусной терапии, а также определить перинатальное заражение ребенка от матери инфицированной ВГС.

Сопоставление результатов количественного анализа РНК ВГС, полученных с использованием ЫАТ-тестов различных производителей, стало возможным после разработки и сертификации Национальным институтом биологических стандартов и контролей совместно с Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ) унифицированного стандарта для измерения РНК ВГС в международных единицах (МБ) [153].

Эффективность противовирусной терапии гепатита С, как установлено в результате многочисленных исследований [154; 156; 157], зависит от генотипа вируса, которым инфицирован больной. Генотип во многих случаях определяет продолжительность терапии и дозу препаратов, именно поэтому наряду с количественным анализом необходимо проводить генотипирование ВГС [217].

Таким образом, для комплексной ПЦР-диагностики ВГС необходимы тесты для выявления, количественного определения и генотипирования ВГС.

В настоящее время не разработаны нормативные документы, содержащие перечень требований, предъявляемых к диагностическим тестам с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени для диагностики ВГС [5]. Тем не менее, при разработке т-Иоше тестов для диагностики ГС можно ориентироваться на параметры наборов реагентов зарубежных аналогов, прошедших широкие клинические испытания.

Представленные на Российском рынке тесты для ПЦР-диагностики ВГС уступают по чувствительности зарубежным аналогам, а также не лишены недостатков в дизайне.

Представленные на отечественном рынке импортные диагностические тесты ведущих мировых производителей ограниченно доступны вследствие высокой стоимости. Поэтому для существенного улучшения ситуации с диагностикой ВГС в России актуальна разработка и внедрение новых отечественных диагностических наборов.

Цель исследования

Целью настоящего исследования является разработка, валидация и апробация наборов реагентов для количественного определения и дифференциации генотипов 1, 2, 3 вируса гепатита С на основе ПЦР в реальном времени.

Задачи исследования

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. подобрать специфические праймеры и зонды для выявления РНК ВГС; выполнить оптимизацию условий проведения ОТ-ПЦР в режиме реального времени; совместить этапы обратной транскрипции и ПЦР;

2. провести оптимизацию методики проведения количественного анализа путем разработки алгоритмов обработки исходных флуоресцентных данных.

3. разработать композицию праймеров и генотип-специфичных флуорогенных зондов, обеспечивающую максимальную специфичность и позволяющую в одной пробирке одновременно выявлять генотипы 1, 2 и 3 ВГС; провести оптимизацию условий проведения ОТ-ПЦР в режиме реального времени;

4. на основе проведенных исследований разработать диагностические наборы для выявления РНК и генотипирования ВГС; определить их основные аналитические и диагностические характеристики; провести апробацию.

Научная новизна

В рамках разработки процедуры проведения количественного анализа предложен алгоритм устранения разрывов/выбросов в графиках флуоресцентных кривых с последующей обработкой фильтром высокочастотного шума. Такой алгоритм позволяет значительно повысить точность анализа при наличии в флуоресцентных кривых скачков и разрывов.

Предложен оригинальный алгоритм введения поправки на внутренний контрольный образец (ВКО) для учета потерь РЖ в процессе пробоподготовки, суть которой заключается в смещении значения Сс/ ВГС на А Сд ВКО относительно среднего Cq ВКО по всей постановке.

При достигнутой воспроизводимости анализа (80<0,3 1о§ю(конц., МЕ/мл) и линейности (с эффективностью амплификации около 100% во всем диапазоне определяемых концентраций) предложен метод определения вирусной нагрузки с одним образцом сравнения, что позволило повысить производительность теста.

Предложен оригинальный подход к дизайну генотип-специфичных зондов. Зонды с новым дизайном, названные бинарными, позволяют дифференцировать последовательности, содержащие одиночные замены. Основными преимуществами бинарных зондов является высокая специфичность и возможность типирования мононуклеотидного полиморфизма, расположенного в пределах непротяженного консервативного участка 10-12 нуклеотидов (по сути, альтернатива коротким зондам с дорогостоящими модификациями, повышающими Тш, такими как ЬЫА, МСВ [162]).

Практическая значимость

1. Разработанный подход для выявления и количественного определения РНК вируса гепатита С в сыворотке (плазме) крови с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени лег в основу коммерчески доступного набора реагентов «РеалБест РНК ВГС», выпускаемого ЗАО «Вектор-Бест» и прошедшего государственную регистрацию. Разработанный тест может использоваться как для высокочувствительного скринирования донорской крови, так и в клинической практике для:

• подтверждения диагноза гепатит С,

• ведения больных с хроническим гепатитом С,

• определения активности ВГС-инфекции, принятия решения о начале терапии,

• прогнозирования исхода терапии и необходимости ее продолжения,

• определения вирусологического ответа на противовирусную терапию.

2. Разработан подход к дизайну бинарных генотип-специфичных зондов, позволяющих типировать мононуклеотидный полиморфизм, в пределах непротяженного консервативного участка 10-12 нуклеотидов.

3. Разработанный набор для дифференциации генотипов 1, 2 и 3 с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени лег в основу коммерчески доступных наборов реагентов «РеалБест РНК ВГС-1/2/3» и «РеалБест РНК ВГС-генотип», выпускаемых ЗАО «Вектор-Бест» и прошедших государственную регистрацию.

4. Разработанный набор «РеалБест РНК ВГС-генотип» для комплексной ПЦР-диагностики ВГС включает реакционную смесь для выявления, количественного определения РНК и реакционную смесь для генотипирования ВГС. Набор с такой комплектацией удобен для применения в клинической практике на этапе обследования пациентов до начала проведения противовирусной терапии для комплексной ПЦР-диагностики ВГС.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработанный алгоритм проведения количественного анализа, позволяет достигнуть высокой воспроизводимости результатов анализа за счет предложенной системы обработки исходных флуоресцентных данных и процедуры определения вирусной нагрузки с возможностью учета потерь НК в процессе пробоподготовки, а также эффективности амплификации.

2. Зонды с оригинальным дизайном, названные бинарными, позволяют дифференцировать последовательности, содержащие одиночные замены.

3. Набор реагентов «РеалБест РНК ВГС» обладает следующими характеристиками:

-аналитическая чувствительность 15 МЕ/мл

-аналитическая специфичность -100%

-линейный диапазон измеряемых концентраций -10—10 МЕ/мл

-сходимость (прецизионность) - коэффициент вариации количественных оценок в логарифмических единицах варьировал от 0,5 до 3,5% при концентрациях вирусной РНК 104-107МЕ/мл и от 2,5 до 12% при концентрациях вирусной РНК 102-103 МЕ/мл.

4. Набор реагентов «РеалБест РНК ВГС 1/2/3» обладает следующими характеристиками:

-аналитическая чувствительность - 400 МЕ/мл -аналитическая специфичность -100%. Апробация работы и публикации

На основе разработок, проведенных в ходе настоящего исследования налажено серийное производство наборов на базе ЗАО «Вектор-Бест». Для наборов «РеалБест РНК ВГС», «РеалБест РНК ВГС-1/2/3» и «РеалБест РЖ ВГС-генотип» получены государственные регистрационные удостоверения № ФСР 2008/02288, № ФСР 2010/09021 и № ФСР 2010/09022, соответственно. По результатам исследований опубликовано 4 работы в научных журналах, 3 из которых входят в перечень ВАК. Работа была представлена на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов в 2008 г. в Новосибирске и на V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров в 2009 г. в Москве, а также доложена на отчетной сессии Института цитологии и генетики СО РАН в 2009 г.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», Ведерников, Виталий Евгеньевич

ВЫВОДЫ

1. Для выявления и количественного определения РНК ВГС подобраны специфические праймеры и. зонды в пределах района 5'-UTR, совмещены этапы обратной транскрипции и ПЦР; разработан подход для; обработки исходных флуоресцентных данных, обеспечивающий высокую устойчивость алгоритма определения значения Cq к скачкам и разрывам в флуоресцентных кривых, а также оптимизирована процедура проведения количественного анализа с одним образцом сравнения.

2. , Разработан диагностический набор «РеалБест РНК ВГС» со следующими характеристиками: аналитическая чувствительность 15 МЕ/мл; аналитическая специфичность 100%; линейный диапазон измеряемых

О 7 концентраций 10—10 МЕ/мл; коэффициент вариации количественных оценок от 0,5 до 3,5% при концентрациях вирусной РНК 104-107МЕ/мл и от 2,5 до 12%

2 3 при концентрациях вирусной РНК 10-10 МЕ/мл. Коэффициент корреляции количественных оценок разработанного теста с наборами «Abbott RealTime™ HCV» и «ОТ-Гепатоген-С количественный» составляет 0,96 и 0,9, соответственно.

3. Предложен оригинальный подход к дизайну генотип-специфичных бинарных зондов, позволяющих дифференцировать однонуклеотидные замены в пределах консервативного участка 10-12 нуклеотидов.

4. Подобраны генотип-специфичные флуорогенные зонды, обеспечивающие максимальную специфичность и позволяющие в одной пробирке одновременно выявлять генотипы 1, 2 и 3 ВГС; проведена, оптимизация условий ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Разработан диагностический набор «РеалБест РНК ВГС-1/2/3» с аналитической чувствительностью 400 МЕ/мл; диагностической чувствительностью 100%; аналитической и диагностической, специфичностью 100%.

5. При сравнительном анализе 200 пациентов с моноинфекцией ВГС и 187 коинфицированных ВИЧ/ВГС установлено, что 9% коинфицированных содержат РНК ВГС, но отрицательны по ИФА на анти-ВГС, чего не наблюдается у пациентов только с ВГС. У больных с моноинфекцией ВГС преобладает генотип 3, у ВИЧ-инфицированных с коинфекцией ВГС генотипы 1 и 3 присутствуют в равном соотношении.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для комплексной ПЦР-диагностики ВГС необходимы тесты для выявления, количественного определения и генотипирования ВГС.

Основным результатом настоящей работы является разработка наборов реагентов на основе ПЦР-РВ для комплексной диагностики ВГС: выявления, количественного определения и генотипирования.

В ходе работ по созданию теста для выявления и количественного определения РНК ВГС особое внимание было уделено:

1. Тщательному подбору праймеров и зондов, в большей степени определяющих специфичность анализа. На основании множественного выравнивания для дизайна композиции праймеров и зонда был выбран 5'-иТЯ, как наиболее консервативный участок.

2. Оптимизации состава реакционной смеси. Совмещение этапов-обратной транскрипции и ПЦР было осуществлено за счет подбора буфера, соотношения трегалозы и бетаина, добавления в реакционную смесь БСА для стабилизации ферментов и антител к активному центру Тая-полимеразы, обеспечивающих горячий старт. Для приготовления готовых реакционных смесей (ГРС) была использована технология лиофильного высушивания, обеспечивающая высокую стабильность при транспортировке и хранении.

3. Разработке алгоритма обработки исходных флуоресцентных данных. В программном обеспечении «РеалБест-диагностика» реализован предложенный нами алгоритм устранения разрывов/выбросов в графиках флуоресцентных кривых и обработки с помощью фильтра высокочастотного шума с последующим нахождением максимума второй производной (БОМ) путем аппроксимации девяти значений положительного пика полиномиальной функцией. Значение ЭОМ используется в качестве характеристической точки (Сд), описывающей флуоресцентную кривую. Предложенный алгоритм позволяет значительно повысить точность анализа при наличии в флуоресцентных кривых скачков и разрывов.

4. Разработке экзогенного внутреннего контрольного образца. В систему выявления! РНК ВГС был введен неконкурентный ВКО для контролирования этапов пробоподготовки и амплификации. Отсутствие конкуренции стандарта и целевой реакции было достигнуто за счет дизайна последовательности ВКО, заключающегося в пошаговом подборе олигонуклеотидов, не влияющих на амплификацию ВГС, с последующим их использованием для конструирования последовательности контроля. Для приготовления стабильного препарата ВКО была применена технология защищенной РНК.

5. Разработке алгоритма количественного определения РНК ВГС. В программном обеспечении «РеалБест-диагностика» для нахождения концентрации анализируемого образца реализован подход с использованием одного образца сравнения в каждой постановке. Эффективность амплификации предложено определять в одной «валидационной» постановке для серии набора реагентов с использованием калибровочных образцов. Такой подход позволил значительно сократить количество контрольных точек в индивидуальной постановке (3 ПКО, 1 ОКО), что позволило снизить себестоимость анализа. Для учета возможных потерь НК в процессе пробоподготовки нами был разработан оригинальный подход введения поправки на ВКО, суть которой заключается в смещении значения Cq ВГС на А Сц ВКО относительно среднего по всей постановке. Такая поправка корректна только для сдвигов, вызванных потерей НК в процессе пробоподготовки, а не влиянием ингибиторов. Для подтверждения возможности использования такой поправки в серии экспериментов с двумя ВКО (ЦРА-ВКО и ВКО-И) было показано что система «РеалБест НК экстракция 100»/ «РеалБест РНК ВГС» не ингибируется веществами, содержащимися в препаратах НК, выделенных из сывороток и плазм с различными физическими свойствами.

6. Валидации (определению характеристик набора реагентов). Характеристики набора «РеалБест РНК ВГС» определяли с использованием контролных образцов (СОН, СОШЬ, СОП2а, СОПЗа), охарактеризованных относительно международного стандарта WHO Second International; Standard-for Hepatitis С virus RNA for Genomic Amplification Technology Assay, NIB SC 96/798. Аналитическую чувствительность определяли путем анализа, серии разведений СОП, приготовленных на ВГС-отрицательной ЭДТА-плазме или сыворотке человека. По результатам пробит-анализа чувствительность

2 7 составила 15 ME/мл. Линейный диапазон составил 10-10' ME/мл с отклонением от теоретических значений не более 0,2 log10. Коэффициент вариации количественных оценок как внутри индивидуальной постановки, так и между различными постановками, в логорифмических единицах варьировал от 0,5 до 3,5% при концентрациях вирусной РНК 104-107МЕ/мл и от 2,5 до 12%

3 2 при концентрациях вирусной РНК 10-10 ME/мл. Специфичность анализа на выборке отрицательных сывороток и ЭДТА-плазм составила 100%. На серии разведений СОШЬ, СОП2а, СОПЗа было показано, что наиболее распространенные в РФ генотипы выявляются с равной эффективностью. Количественные оценки, полученные с использованием «РеалБест РНК ВГС» хорошо согласуются с референсным набором Abbott RealTime™ HCV и набором ОТ-Гепатоген-С количественный (коэффициент корреляции 0,96 и 0,9, соответственно) и в меньшей степени согласуются с АмплиСенс HCV-Монитор-FRT (коэффициент корреляции 0,663).

В ходе работ по созданию теста для выявления РНК и генотипирования ВГС особое внимание было уделено:

1. Разработке подхода для создания генотип-специфичных зондов. Зонды с новым дизайном, названные бинарными, структурно и функционально отличаются от линейных зондов и состоят из 5'- и 3'-сегментов, соединенных линкером. Более длинный 3'-сегмент обеспечивает посадку зонда на матрицу до гибридизации праймеров, более короткий 5'-сегмент, содержащий флуорофор и гаситель, обеспечивает специфичность зонда (в участке его гибридизации содержится типируемый полиморфизм); Основными преимуществами бинарных зондов является высокая специфичность и возможность типирования мононуклеотидного полиморфизма, расположенного в пределах непротяженного консервативного участка 10-12 нуклеотидов (по сути, альтернатива коротким зондам с дорогостоящими модификациями, повышающими Тш, такими как LNA, MGB). Принцип функционирования бинарного зонда был подтвержден in sil ico с использованием программного обеспечения UNA-Fold, которые заключались в моделировании дуплексов, образуемых зондом с различными генотипами, а также в экспериментах по плавлению бинарного зонда с олигонуклеотидами, соответствующими участку посадки всего зонда и составляющих его сегментов.

2. Подбору зондов для выявления генотипов 1, 2, 3 ВГС. За основу системы генотипирования была взята реакционная смесь «РеалБест РНК BFC». Подбор зондов осуществляли в пределах ампликона, ограниченного праймерами F и R, зонд Z4C использовали в качестве контроля для оценки эффективности расщепления генотип-специфичных зондов. На каждый генотип было подобрано 4-5 стандартных и бинарных зондов. Основные критерии, по которым проводили подбор зондов: специфичность детекции, амплитуда флуоресцентного сигнала, значение цикла для количественных оценок и расположение в пределах выбранного района. В результате были подобраны зонды для выявления генотипов 1, 2 и 3, так расположенные в пределах ампликона F-R, что можно их использовать одновременно в одной реакции (каждый генотип регистрируется в отдельном канале регистрирующего амплификатора). Подобранные зонды обеспечивают высокую специфичность генотипирования (отсутствуют перекрестные реакции между генотипами). Зонд для выявления генотипа 1 уникален тем, что дискриминация генотипов 2, 3, 4, 5 достигается за счет мисматчей, расположенных в участке посадки 5'-сегмента, а генотипа 6 за счет инсерций в участке гибридизации 3'-сегмента (в остальных бинарных зондах специфичность определяется только 5'-сегментом).

3. Выявлению изолятов; имеющих мисматчи-в участках гибридизации генотип-специфичных зондов. В ходе работ по поиску мутантных изолятов, была установлена нуклеотидная последовательность 5'-UTR 188 геновариантов, циркулирующих на территории Западной Сибири. Из штаммов, имеющих мисматчи в участках посадки генотип-специфичных зондов, была собрана база, которая использовалась для проверки влияния мисматчей на амплитуду прироста флуоресценции и значение Cq при проведении генотипирования. В базу вошли штаммы субтипа За, имеющие мононуклеотидные полиморфизмы, не встречающиеся в Los Alamos HCV Sequence Database. С учетом именно этих штаммов для выявления генотипа 3 ВГС было подобрано 2 зонда на различные районы 5'-UTR. В результате для генотипов 1, 2, 3 было показано, что наличие мисматчей не приводит к значительному увеличению значения Cq и снижению амплитуды флуоресцентного сигнала.

4. Определению аналитических характеристик и апробации. Аналитическая чувствительность генотипирования составила 400 ME/мл. Для апробации системы генотипирования было использовано 188 образцов сыворотки крови инфицированных ВГС пациентов, из Сибирского региона, вирусная нагрузка у которых, определенная с помощью «РеалБест РНК ВГС», варьировала в диапазоне 10—10 ME/мл. В результате анализа ВГС генотипа 1 был выявлен в 45 % (п=85) проб, генотипа 2 — в 6 % (n=l 1), генотипа 3 — в 49 % (n=92), а 4-6 генотипы не были обнаружены. При исследовании сывороток этой выборки с использованием референсного метода — прямого секвенирования 5'-UTR области РНК ВГС с последующим филогенетическим анализом — дискордантных результатов получено не было, что подтвердило высокую специфичность разработанной системы генотипирования (100%). В рамках проведения расширенных клинических испытаний набора реагентов «РеалБест

РНК ВГС-генотип» было проанализировано 885 клинических образцов (440 сывороток и 445 ЭДТА-плазм), предоставленных «Новосибирским центром крови», «Станцией переливания крови» г. Рубцовск и «Томской областной станцией переливания- крови». В результате анализа, ВГС генотипа 1 был выявлен в 39 % проб, генотипа 2 — в 7 %, генотипа 3 — в 52 % и микст инфекция 1+3 в 2%, т. е. выявлено преобладание генотипа 3. Полученные данные согласуются с исследованиями по распределению генотипов в Томской области, где также показано преобладание генотипа 3.

В рамках апробации «РеалБест РНК ВГС» и «РеалБест РНК ВГС-1/2/3» было проведено обследование ВИЧ-инфицированных с коинфекцией ВГС. Оказалось, что среди ВИЧ-инфицированных 43,5% коинфицированы ВГС; 9% ВИЧ-инфицированных, у которых выявляется РНК ВГС, отрицательны по ИФА на анти-ВГС. Эти данные указывает на необходимость ранней ПЦР-диагностики ВГС у ВИЧ-инфицированных. Для всех образцов, положительных по «РеалБест РНК ВГС», удалось определить генотип, таким образом, диагностическая чувствительность «РеалБест РНК ВГС-1/2/3» составила 100%. Было показано, что в выборке больных с моноинфекцией ВГС преобладает генотип 3, тогда как у ВИЧ-инфицированных с коинфекцией ВГС генотипы 1 и 3 присутствуют в равном соотношении.

В результате настоящей работы были разработаны, наборы для-комплексной ПЦР-диагностики ГС с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени: набора для выявления и количественного определения вирусной РНК и набора для дифференциации генотипов 1, 2, 3. Предложен вариант набора для комплексной диагностики ВГС - «РеалБест РНК ВГС-генотип», который укомплектован реакционной смесью для выявления и количественного определения РНК ВГС, соответствующей ГРС

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Ведерников, Виталий Евгеньевич, 2011 год

1. Брагин A.F. Стехиометрия минорных последовательностей; и гетероплазмия митохондриального. генома Beta Vulgaris: дис. . канд. биологических наук. Новосибирск., 2010. 145с.

2. Генотипирование вируса гепетита С при помощи ПЦР-РВ с использованием 5'-гидролизуемых зондов с олигодезоксиинозиновыми линкерами / В.Е. Ведерников и др. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2009. Т. 4. С. 32 38.

3. Глинщикова O.A. Внутренний стандарт для конкурентной полимеразной цепной реакции на основе ретровирусного вектора: дис. . канд. биологических наук. М., 2004. 96 с.

4. Елов A.A., Федоров H.A. и Суханов Ю.С. Критерии для отбора систем генотестирования, используемых при контроле вирусной безопасности крови и ее продуктов // Вестн. службы крови России. 1998. № 1. С. 18-20.

5. Жибурт Е.Б., Федоров H.A., Рейзман П.В. NAT скрининг вирусных инфекций у доноров повышает безопасность крови // Клиническая лабораторная диагностика. 2006. № 12. С. 22-23.

6. Иванов А. В., Кузякин А. О., Кочетков С. Н. Молекулярная биология вируса гепатита С // Успехи'биологической химии. 2005. Т. 45. С. 3786

7. HCV в рутинной лабораторной практике / О.Ю. Шипулина и др.: тез. докл. 6iй всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика»., М., 2007. Т. 1. С. 289-293.

8. Маркеры вируса гепатита С при коинфицировании ВИЧ у больных из пермского края / Л.И. Николаева и др.: тез. докл. 6-й всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика», М., 2007. Т. 1. С. 132-134.

9. Метод повышения точности ПЦР «в реальном времени» Д.Ю. Трофимов и др. // Доклады академии наук, 2008. Т. 419. № 3. С. 421-424.

10. Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции / В.В. Покровский и др.. М., 1995. 5с.

11. Михайлов М.И. Лабораторная диагностика гепатита С (серологические маркеры и методы их выявления) // Вирусные гепатиты: достижения и перспективы. Информационный бюллетень. 2001. Т. 2. № 12.

12. Момыналиев К.Т, Говорун В.М. Перспективы применения методов ДНК-диагностики в лабораторной службе. //Клиническая лабораторная диагностика. 2000. № 4. С.25-32.

13. Никонова A.A. Выявление и идентификация респираторных вирусов методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени: дис. . канд. биологических наук. М., 2008. 141 с.

14. Окончательны ли результаты скрининга антител к вирусу гепатита С у доноров крови? / Е.Б. Жибурт и др. // Вестн. службы крови России. 2004. № 4. С. 17-19.

15. Определение ДНК-полимеразной и нуклеазной активностей ДНК-зависимых полимераз с использованием флуоресцентной детекции в режимереального времени / А.Г. Брагин и др. // Биохимия. 2008. Т. 73. №. 9. С. 12521264.

16. Плясунова И.В. Изучение генетического разнообразия изолятов вируса гепатита С и факторов риска инфицирования у пациентов с острыми и хроническими гепатитами в Новосибирске: автореф. дис. . канд. медицинских наук. Кольцово., 2009. 23 с.

17. Потапова Н.И. разработка тест-систем на основе полимеразной цепной реакции (ПНР) в реальном времени для диагностики туберкулеза: дис. . канд. биологических наук. М., 2006. 163 с.

18. ПЦР "в реальном времени" / Д.В. Ребриков и др.. М.-.БИНОМ, 2009. 223с.

19. Разработка неконкурентного экзогенного внутреннего контроля ПЦР с детекцией в режиме реального времени по принципу UFA / М.К. Иванов и др. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология 2009. № 3. С. 813.

20. Распространение генотипов вируса гепатита С, циркулирующих на территориях Северо-Западной и Центральной частей России/ Д.К. Львов и др. //Вопросы вирусологии. 1995. № 6. С. 251-253.

21. Распространение гепатита С и отдельных генотипов вируса гепатита С в регионе с умеренной активностью эпидемического процесса. / С.Н. Кузин и др. // Вопросы вирусологии. 1999. № 2. С.79-82.

22. Ребриков Д. В., Трофимов Д. Ю. ПЦР «в реальном времени»: подходы к анализу данных // Прикладная биохимия и микробиология. 2006. Т. 42. С. 520-528.

23. Спектр генотипов вируса гепатита С, циркулирующих на территории томской области / С.В. Вожаков и др.: тез. докл. 7-й всероссийской* научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика»., М., 2010, Т. 1. С. 206-208.

24. Шустов А.В. Генотипическое разнообразие изолятов и молекулярная вариабельность вируса гепатита С у населения новосибирской области: дис. . канд. биологических наук. Кольцово., 2003. 209 с.

25. Щербаков Д.Н. Метод видоспецифичной идентификации патогенных для человека ортопоксвирусов на основе мультиплексной ПЦР в реальном времени: автореф. дис. . канд. биологических наук. Кольцово., 2010. 27 с.

26. A data-driven clustering method for time course gene expression data / P. Ma et al. //Nucleic Acids Res. 2006. 34. (4). P. 1261-1269.

27. A novel sequence found at the 3' terminus of hepatitis С virus genome / T. Tanaka et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. 215. (2). P. 744-749.

28. A real-time Taqman method for hepatitis С virus genotyping / K.J. Rolfe et al. // Methods Mol. Biol. 2009. 510. P. 55-71

29. Ailenberg M., Silverman M. Controlled hot start and improved specificity in carrying out PCR utilizing touch-up and loop incorporated primers (TULIPS) // Biotechniques 2000. 29. P. 1018-1024.

30. Alfaresi M.S., Elkoush A.A. Determination of hepatitis C virus genotypes by melting-curve analysis of quantitative polymerase chain reaction products // Indian J Med-Microbiol. 2007. 25. (3). P. 249-252.

31. Alter J. Epidemiology of viral hepatitis and HIV coinfection // J. Hepatol. 2006. 44. P. 56-59.

32. Amplification efficiency of thermostable DNA polymerases / B. Arezi et al. // Anal Biochem., 2003. 321. (2). P. 226-235.

33. Amplification efficiency: linking baseline and bias in the analysis of quantitative PCR data / J.M. Ruijter // Nucleic Acids Res. 2009. 37. (6) P. e45.

34. An overview of real-time quantitative PCR: applications to quantify cytokine gene expression / A. Giulietti et al. // Methods. 2001. 25. (4). P. 386-401.

35. Andonov A., Chaudhary R. K. Genotyping of Canadian Hepatitis C Virus Isolates by PCR // Journal Of Clinical Microbiology 1994. 32. (8). P. 20312034.

36. Assessment of spontaneous fluctuations of viral load in untreated patients with chronic hepatitis C by two standardized quantitation methods: branched DNA and Amplicor Monitor / P. Halfon et al. // J. Clin. Microbiol. 1998. 36. (7). P. 2073-2075.

37. Assumption-free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data / C. Ramakers et al. //Neurosci. Lett. 2003. 339. (1). P. 62-66.

38. At least five related, but distinct, hepatitis C viral genotypes exist / T.A. Cha et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1992. 89. (15). P. 7144-7148.

39. Automated Multiplex Assay System for Simultaneous Detection of Hepatitis B Virus DNA, Hepatitis C Virus RNA, and Human Immunodeficiency Virus Type 1 RNA / Q. Meng et al. // J. Clin. Microbiol. 2001. 39. (8). P: 29372945.

40. Ball T.B., Plummer F.A., HayGlass K.T. Improved mRNA quantitation in LightCycler RT-PCR// Int. Arch. Allergy Immunol. 2003. 130. (1). P. 82-86.

41. Berger A., Preiser W., Doerr H.W. The role of viral load determination for the management of human immunodeficiency virus, hepatitis B virus and hepatitis C virus infection // Journal of Clinical Virology 2001. 20. (.1-2). P. 23-30.

42. Bergstrom D.E., Zhang P., Johnson W.T. Comparison of the base pairing properties of a series of nitroazole nucleobase analogs in the oligodeoxyribonucleotide sequence 5'- d(CGCXAATTYGCG)-3' // Nucleic Acids Res. 1997. 25. (10). P. 1935-1942.

43. Bhagani S. HIV/hepatitis C co-infection and hepatic fibrosis: looking beyond HIV-associated immune suppression; the contribution of hepatic steatosis and insulin resistance// Gut. 2009. 58. (12). P. 1579-1581.

44. Bostan N., Mahmood T. An overview about hepatitis C: a devastating virus // Crit. Rev. Microbiol. 2010. 36. (2). P. 91-133.

45. Bukh J., Miller R.H., Purcell R.H. Genetic heterogeneity of hepatitis C virus: quasispecies and genotypes. // Semin. Liver Dis. 1995. 15. (1). P. 41-63.

46. Bukh J., Purcell R.H, Miller R.H. Importance of primer selection for the detection of hepatitis C virus RNA with the polymerase chain reaction assay // Proc. Natl. Acad. ScL USA. 1992. 89. (1). P. 187-191.

47. Bukh J., Purcell R.H., Miller R.H. At least 12 genotypes of hepatitis C virus predicted by sequence analysis of the putative El gene of isolates collected worldwide // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. 90. (17). P. 8234-8238

48. Bullock G.C., Bruns D.E., Haverstick D.M. Hepatitis C Genotype Determination by Melting Curve Analysis with a Single Set of Fluorescence Resonance Energy Transfer Probes // Clinical Chemistry. 2002. 48. (12). 2147-2154.

49. Bustin S.A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays // J. Mol. Endocrinol. 2000. 25. (2). P." 169-193.

50. Caruntu F.A., Benea L. Acute hepatitis C virus infection: Diagnosis, pathogenesis, treatment // J. Gastrointestin Liver Dis. 2006. 15. (3). 249-256.

51. Cellular glycosaminoglycans and low density lipoprotein receptor are involved in hepatitis C virus adsorption / R. Germi et al. // J. Med. Virol. 2002. 68. (2). P. 206-215.

52. Chayama K. Genotyping Hepatitis C Virus by type-specific primers for PCR based on NS5 region. // Hepatitis C Protocols, Edited by Johnson Yiu-Nam Lau, MD, Humana Press. 1998. P. 165-173.

53. Chen Z., Week K.E. Hepatitis C virus genotyping: interrogation of the 5' untranslated region cannot accurately distinguish genotypes la and lb // J. Clin. Microbiol. 2002. 40. (9). P. 3127-3134.

54. Chevaliez S., Pawlotsky J.M. Hepatitis C virus: Virology, diagnosis and management of antiviral therapy // World J. Gastroenterol. 2007. 13. (17). P. 24612466.

55. Classification of hepatitis C virus into six major genotypes and a series of subtypes by phylogenetic analysis of the NS-5 region / P. Simmonds et al. // J. Gen. Virol. 1993. 74. (Pt 11). P. 2391-2399

56. Clinical evaluation of the COBAS Ampliprep/COBAS TaqMan for HCV RNA quantitation in comparison with the branched-DNA assay / F. Pittaluga et al. // J. Med. Virol. 2008. 80. (2). P. 254-260.

57. Clinical evaluation of two methods for genotyping Hepatitis C virus based on analysis of the 5'noncoding region / F.S. Nolte et al. // J. Clin. Microbiol. 2003.41.(4). P. 1558-1564.

58. Comparison of conventional PCR with real-time PCR and branched DNA-based assays for hepatitis C virus RNA quantification and clinical significance for genotypes 1 to 5 / C. Sarrazin et al. // J. Clin. Microbiol. 2006. 44. (3). P. 729737.

59. Comparison of performance characteristics of three real-time reverse transcription-PCR test systems for detection and quantification of hepatitis C virus / M.F. Sábato et al. //J. Clin. Microbiol. 2007. 45. (8). P. 2529-2536.

60. Complete 5' noncoding region is necessary for the efficient internal initiation of hepatitis C virus RNA / S. Fukushi et al. // Biochem. Biophys. Res, Commun. 1994. 199. (2). P. 425-432.

61. Consensus proposals for wunified system of nomenclature of hepatitis-G virus genotypes / P. Simmond's et al. // Hepatology. 2005. 42. (4). P.962-973.

62. Cooper J.P., Hagerman P.J. Analysis of fluorescence energy transfer in duplex and branched DNA molecules // Biochemistry. 1990. 29. (39). P. 9261-9268.

63. Correlates of hepatitis C virus (HCV) RNA negativity among HCV-seropositive blood donors / M.P. Busch et al. // Transfusion 2006. 46. (3). P. 46975.

64. Definition of false positive reaction in screening for hepatitis C virus antibodies / M. Schröter et al. // J. Clin. Microbiol. 1999:37. (1). P. 233-234.

65. Delayed anti-HCV antibody response in HIV-positive men acutely infected with HCV/E.C. Thomson et al.//AIDS. 2009. 23. (1). P. 89-93.

66. Detection of multiple hepatitis C virus genotypes in a cohort of injecting drug users / S. Bowden et al. // Journal of Viral Hepatitis. 2005. 12. (3). P. 322-324.

67. Detection of nucleic acid hybridization by nonradiative fluoresence resonance energy transfer / R.A. Cardullo et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1988. 85. (23). P. 8790-8794.

68. Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence / D. Whitcombe et al. //Nat. Biotechnol. 1999. 17. P. 804-807.

69. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'—3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase / P.M. Holland et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1991. 88. (16) P. 7276-7280.

70. Determination of hepatitis C virus genotype by Pyrosequencing / E. Elahi et al. //J. Virol. Methods. 2003. 109. (2). P. 171-176.

71. Development of a simple restriction fragment length polymorphism (RFLP) based assay for HCV genotyping and comparative analysis with geno-typing and serotyping tests / V. Thiers et al. // J. Virol. Methods. 1997. 65. (1). P. 9-17

72. Diagnosis, management, and treatment of hepatitis C: an update / M.G. Ghany et al. //Hepatology. 2009. 49. (4). P. 1335-1374.

73. Differences in virological response to pegylated interferon and ribavirin between hepatitis C (HCV)-monoinfected and HTV-HCV coinfected patients / C. Tural et al. // Antivir. Ther. 2008. 13. (8). P. 1047-1055.

74. DNA damage reduces Taq DNA polymerase fidelity and PCR amplification efficiency / J.A. Sikorsky et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007. 355.(2). P. 431-437.

75. Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene / J.Y. Chun et al. // Nucleic Acids Res. 2007. 35. (6). P. 1-6.

76. Effect of Hepatitis C Virus (HCV) Genotype on HCV and HIV-1 Disease / T.W. Yoo et al. // J. Infect. Dis. 2005. 191. (1). P. 4-10.

77. Evaluation of absolute quantitation by nonlinear regression in probe-based real-time PCR / R. Göll et al. // BMC Bioinfonnatics. 2006. 7. P. 107.

78. Evaluation of an automated, highly sensitive, real-time PCR-based assay (COB AS Ampliprep/COBAS TaqMan) for quantification of HCV RNA / C. Sarrazin et al. // J. Clin. Virol. 2008. 43. (2). P.162-168.

79. Evaluation of the COBAS TaqMan HCV test with automated sample processing using the MagNA pure LC instrument / J.J. Germer et al. // J. Clin. Microbiol. 2005. 43. (1). P. 293-298.

80. Evolutionary analysis of variants of hepatitis C virus found in South-East Asia: Comparison with classifications based upon sequence similarity / P. Simmonds et al. // J. Gen. Virol. 1996. 77 (Pt 12). P. 3013-3024

81. Experience of mandatory nucleic acid test (NAT) screening across all blood organizations in Germany: NAT yield versus breakthrough transmissions / CM. Nübling et al. // Transfusion, 2009. 49. (9). P. 1850-1858.

82. Expression of hepatitis C virus non-structural 5A protein in the liver of transgenic mice / M. Majumder et al. // FEBS Lett. 2003. 555. (3). P. 528-532.

83. False-positive reaction between syphilis and hepatitis C infection / Sonmez E. et al. // Isr. J. Med. Sei. 1997. 33. (11). P. 724-727.

84. False-positive tests for syphilis associated with human immunodeficiency virus and hepatitis B virus infection among intravenous drug abusers / I. Hernandez-Aguado et al. // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1998. 17.(11). P. 784-787.

85. Genotype 3 is associated with accelerated fibrosis progression in chronic hepatitis C / P.Y. Bochud et al. // J Hepatol. 2009. 51. (4). P. 655-666.

86. Genotypic and Epidemiologic Characteristics of Hepatitis C Virus Infections among Recent Injection Drug User and Nonuser Populations / L. Krekulova et al. // The Journal of Infectious Diseases, 2001. 33. (8). P. 1435-1438.

87. Genotyping Hepatitis C Virus by Heteroduplex Mobility Analysis Using Temperature Gradient Capillary Electrophoresis / R.L. Margraf et al. // J. Clin. Microbiol. 2004. 42. (10). P. 4545-4551.

88. Genotyping of hepatitis C virus by melting curve analysis with SYBR Green I / H. Fujigaki et al. // Ann. Clin. Biochem. 2004. 41. (Pt 2). P. 130-132.

89. Genotyping of hepatitis C virus types 1, 2, 3 and 4 by a one-step LightCycler method using three different pairs of hybridization probes / M. Schröter et al. // J. Clin. Microbiol. 2002. 40. (6). P. 246-250.

90. Gentle A., Anastasopoulos F., McBrien N.A. High-resolution semiquantitative real-time PCR without the use of a standard curve // Biotechniques. 2001. 31(3). P. 502, 504-506, 508.

91. Geographical distribution of hepatitis C virus genotypes in blood donors: An international collaborative survey / F. McOmish et al. // J. Clin. Microbiol. 1994. 32(4). P. 884-892.

92. Germer J.J., Zeindoi N.N. Advances in the molecular diagnosis of hepatitis C and their clinical implications // Mayo Clin. Proc. 2001. 76. (9). P. 911920.

93. Haverstick D.M., Bullock G.C., Bruns D.E. Genotyping of hepatitis C virus by melting curve analysis: analytical characteristics and performance // Clin. Chem. 2004. 50. (12). 2405-2407.

94. Hepatitis C prevalence among Australian injecting drug users in the 1970s and profiles of virus genotypes in the 1970s and 1990s / A J. Freeman et al. // Med. J. Aust. 2000. 172. (12). P. 588-591.

95. Hepatitis C Viral Kinetics During Treatment With Peg IFN-alpha-2b in HIV/HCV Coinfected Patients as a Function of Baseline CD4+ T-Cell Counts / N.U. Avidan et al. // Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes 2009. 52. (4). P. 452-458.

96. Hepatitis C virus genotypes and hepatitis G virus in hemodialysis patients from Syria: identification of two novel hepatitis C virus subtypes / A.S. Abdulkarim et al. // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1998. 59. (4). P. 571-576.

97. Hepatitis C virus genotypes: An investigation of type-specific differences in geographic origin and disease / G. Dusheiko et al. // Hepatology. 1994. 19. (1). P. 13-18.

98. Hepatitis C virus load in associated with human immunodeficiency virus type 1 disease progression in hemophiliacs / E.S. Daar et al. // J.Infect.Dis. 2001. 183.(4). P. 589-595.

99. Hepatitis C virus types 7, 8 and 9 should be classified as type 6 subtypes / M. Mizokami et al. // J. Hepatol. 1996. 24. (5). P. 622-624.

100. Hepatitis C virus variants from Jakarta, Indonesia classifiable into novel genotypes in the second (2e and 2f), tenth (10a) and eleventh (11a) genetic groups / H. Tokita etal. //J. Gen. Virol. 1996. 77. (Pt2 ). P. 293-301.

101. Hepatitis C virus variants from Vietnam are classifiable into the seventh, eighth, and. ninth major genetic groups / H. Tokita et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. 91. (23). P. 11022-11026

102. Higher rate of sustained virologic response in chronic hepatitis C genotype 6 treated with 48 weeks versus 24 weeks of peginterferon plus ribavirin / M.H. Nguyen et al. // Am. J. Gastroenterol. 2008. 103. (5). P. 1131-1135.

103. Humoral immune response in acute hepatitis C virus infection / D.M. Netski et al. // Clin. Infect. Dis. 2005. V. 41. (5). P. 667-675.

104. Identification of genotypes of hepatitis C virus by sequence comparisons in the core, El and NS-5 regions / P. Simmonds et al. // J. Gen. Virol. 1994. 75. (Pt 5) P. 1053-1061.

105. Impact of HCV 3.0 EIA Relative to HCV 2.0 EIA on Blood-Donor Screening / L.H. Tobler et al. // Transfusion. 2003. 43. (10) P. 1452-1459.

106. Incidence and estimated rates of residual risk for HIV, hepatitis C, hepatitis B and human T-cell lymphotropic viruses in blood donors in Canada, 19902000 / J.A. Chiavetta et al. // Canadian Medical Association Journal. 2003. 169. (8). P. 767-773.

107. Internal ribosome entry site within hepatitis C virus RNA / K. Tsukiyama-Kohara et al. //J. Virol. 1992. 66. (3). P. 1476-1483.

108. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome / Q.L. Choo et al. // Science. 1989. 244. P. 359-362.

109. Jayaraj S., Reid R., Santi D.V. GeMS: an advanced software package for designing synthetic genes // Nuc. Acids Res. 2005. 33. (9). P. 3011-3016.

110. Jorgensen, P.A., Neuwald, P.D. Standardized hepatitis C virus RNA panels for nucleic acid testing assays// J. Clin. Virol. 2001. 20. P. 35-40.

111. Khuroo M.S., Khuroo M.S., Dahab-S.T. Meta-analysis: a randomized trial of peginterferon plus ribavirin for the initial treatment of chronic hepatitis C genotype 4 // Aliment Pharmacol. Ther. 2004. 20. (9). P. 931-938.

112. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions / R. Higuchi et al. // Biotechnology (N Y). 1993. 11. (9). P. 1026-1030.

113. Koch J.O., Bartenschlager R. Modulation of hepatitis C virus NS5A hyperphosphorylation by nonstructural proteins NS3, NS4A, and NS4B // J. Virol. 1999. 73. (9). P. 7138-7146.

114. Larionov A, Krause A, Miller W. A standard curve based method for relative real time PCR data processing // BMC Bioinformatics. 2005. 6. P. 62.

115. Laughlin T.S., Nuccie B., Rothberg P.G. Genotyping of Hepatitis C Virus by Sequence Analysis of the Amplicon from the Roche Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan Viral Load Assay // J. Clin. Microbiol. 2010. 48. (2). P 671 672.

116. Le Guillou-Guillemette H., Lunel-Fabiani F. Detection and Quantification of Serum or Plasma HCV RNA: Mini Review of Commercially Available Assays // Methods Mol. Biol. 2009. 510. P. 3-14.

117. LightCycler qPCR optimisation for low copy number target DNA / I.A. Teo et al. // J. Immunol. Methods. 2002. 270. (1). P. 119-133.

118. Lindh M., Hannoun C. Genotyping of hepatitis C virus by Taqman realtime PCR// J. Clin. Virol. 2005. 34. (2). P. 108-114.

119. Liu W., Saint D.A. A new quantitative method of real time reverse transcription polymerase chain reaction assay based on simulation of polymerase chain reaction kinetics // Anal. Biochem. 2002. 302. (1). P. 52-59.

120. Liu W., Saint D.A. Validation of a quantitative method for real time PCR kinetics // Biochem. Biophys. Res .Commun. 2002. 294. (2). P. 347-353.

121. Livak K.J. Relative quantification of gene expression // User Bulletin №2. 1997. 36 p.

122. Liver fibrosis progression in human immunodeficiency virus and hepatitis C virus coinfected patients. The Multiviric Group / Y. Benhamou et al. // Hepatology. 1999. 30. (4). P. 1054-1058.

123. Lyamichev V., Brow M.A.D., Dahlberg J.E. Structure-Specific Endonucleolytic Cleavage of Nucleic Acids by Eubacterial DNA Polymerases // Science. 1993. 260. (5109). P. 778-783

124. Mackay I.M. Real-Time PCR in Microbiology. Norfolk, UK: Caister Academic Press 2007. 454 p.

125. Mackay I.M., Arden K.E., Nitsche A. Real-time PCR in virology // Nucleic Acids Res. 2002. 30. (6). P. 1292-1305.

126. Maertens G., Stuyever L. HCV Genotyping by the Line Probe Assay INNO-LiPA HCV II // Hepatitis C Protocols, Edited by Johnson Yiu-Nam Lau M.D., Humana Press. 1998. P. 183-198

127. Marino J.H., Cook P., Miller K.S. Accurate and statistically verified quantification of relative mRNA abundances using SYBR Green I and real-time RT-PCR // J. Immunol. Methods. 2003. 283. (1-2). P.291-306.

128. Marked sequence diversity in the putative envelope proteins of hepatitis C viruses / N. Kato et al. // Virus Res. 1992. 22. (2). P. 107-123.

129. Marras S.A. Selection of fluorophore and quencher pairs for fluorescent nucleic acid hybridization probes // Methods Mol. Biol. 2006. 335. P. 3-16.

130. Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight (Mass Spectrometry) for Hepatitis C Virus Genotyping / E.N. Ilina et al. // J. Clin. Microbiol. 2005. 43. (6). P. 2810-2815.

131. Meta-Analysis: Increased Mortality Associated with Hepatitis C in HIV-infected Persons Is Unrelated to HIV Disease Progression / T.Y. Chen et al. // Clinical Infectious Diseases. 2009. 49. (10). P. 1605-1615.

132. Method of detecting specific fragments of DNA or RNA with the aid of a polymerase chain reaction. / A.V. Chemeris et al. // European Patent EP1780291. 2007.

133. Moradpour D., Penin F., Rice C.M. Replication of hepatitis C virus // Nat. Rev. Microbiol. 2007. 5. (6). P. 453-463

134. Morrison L.E., Haider T.C., Stols L.M. Solution-phase detection of polynucleotides using interacting fluorescent labels and competitive hybridization // Anal. Biochem. 1989 183. (2). P. 231-244.

135. Morrison T.M., Weis J.J., Wittwer C.T. Quantification of low-copy transcripts by continuous SYBR green I monitoring during amplification // Biotechniques. 1998. 24. (6). P. 954-962.

136. Mortality from liver cancer and liver disease in hemophilic men and boys in UK given blood products contaminated with hepatitis C. UK Hemophilia Center Director's Organization / S.C. Darby et al. // Lancet. 1997. 350. (9089). P. 1425-1431.

137. Multiplex Real-Time Reverse Transcription-PCR Assay for Determination of Hepatitis C Virus Genotypes / L. Cook et al. // Journal Of Clinical Microbiology. 2006. 44. (11). P. 4149-4156.

138. Nazarenko I.A., Bhatnager S.K., Hohman R.J. A closed tube format for amplification and detection of DNA based on energy transfer // Nucleic Acids Res. 1997. 25.(12). P. 2516-2521.

139. Neddermann P., Clementi A., De Francesco R. Hyperphosphorylation of the Hepatitis C Virus NS5A Protein Requires an Active NS3 Protease, NS4A, NS4B, and NS5A Encoded on the Same Polyprotein // J. Virol. 1999. 73. (12). P. 9984-9991.

140. New hepatitis C virus (HCV) genotyping system that allows for identification of HCV genotypes la, lb, 2a, 2b, 3a, 3b, 4, 5a, and 6a / O. Ohno et al. //J. Clin. Microbiol. 1997. 35. (1). P. 201-207.

141. Nizar N.Z. Clinical Significance of Hepatitis C Virus Genotypes // Clin. Microbiol. Rev. 2000. 13. (2). P. 223-235.

142. Orland J.R., Wright T.L., Cooper S. Acute hepatitis C // Hepatology. 2001.33.(2). P. 321-327.

143. Overestimation and underestimation of hepatitis C virus RNA levels in a widely used real-time polymerase chain reaction-based method. / S. Chevaliez et al. // Hepatology. 2007. 46. P. 22-31.

144. Pawlotsky J.M. Measuring hepatitis C viremia in clinical samples: can we trust the assays? // Hepatology. 1997. 26. (1). P. 1-4.

145. Pawlotsky J.M., Bouvier-Alias M., Hezode C., Darthuy F., Remire J., Dhumeaux D. Standardization of hepatitis C virus RNA quantification. // Hepatology. 2000. 32. (3). P. 654-659.

146. Peginterferon alfa-2a plus ribavirin for chronic hepatitis C virus infection / M.W. Fried et al. //N. Engl. J. Med. 2002. 347. (13). P. 975-982.

147. Peginterferon alfa-2b and weight-based or flat-dose ribavirin in chronic hepatitis C patients: a randomized trial / I.M. Jacobson et al. // Hepatology. 2007. 46. (4). P. 971-981.

148. Peginterferon alfa-2b plus ribavirin compared with interferon alfa-2b plus ribavirin for initial treatment of chronic hepatitis C: a randomised trial / M.P. Manns et al. // Lancet. 2001. V. 358. (9286). P. 958-965.

149. Peginterferon-alpha2a and ribavirin combination therapy in chronic hepatitis C: a randomized study of treatment duration and ribavirin dose / S.J. Hadziyannis et al. // Ann Intern Med. 2004. 140. (5). P. 346-355.

150. Pegylated interferon alpha-2b plus ribavirin in patients with genotype 4 chronic hepatitis C: The role of rapid and early virologic response / S.M. Kamal et al. //Hepatology. 2007. 46. (6). P. 1732-1740.

151. Peirson S.N., Butler J.N., Foster R.G. Experimental validation of novel and conventional approaches to quantitative real-time PCR data analysis // Nucleic Acids Res. 2003. 31. (14). P. e73.

152. Performance characteristics of a quantitative TaqMan hepatitis C virus RNA analyte-specific reagent / J.M. Barbeau et al. // J. Clin. Microbiol. 2004. 42. (8). P. 3739-3746.

153. Performance evaluation of the Abbott RealTime HCV Genotype II for hepatitis C virus genotyping / Y.H. Sohn et al. // Clin. Chem. Lab. Med. 2010. 48. (4). P. 469-474.

154. Peterson M., Wengel J. LNA: a versatile tool for therapeutics and genomics // Trends Biotechnol. 2003. 21. (2). P. 74-81.

155. Pfaffl M.W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR//Nucleic Acids Res. 2001. 29. (9). P. e45.

156. Polymerase chain reaction for the detection of HCV-RNA: cryoglobulinaemia as a cause for false negative results / A. Colantoni et al. // Ital. J. Gastroenterol. Hepatol. 1997. 29. (3). P. 273-274.

157. Population genotyping of hepatitis C virus by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis of short DNA fragments/Kim Y.J. et al.//Clin. Chem. 2005.51.(7). P. 1123-31.

158. Prevalence and route of transmission of infection with a novel DNA virus (TTV), hepatitis C virus, and hepatitis G virus in patients infected with HIV / F. Puig-Basagoiti et al. // J.Acquir. Immune. Defic. Syndr. 2000. 23. (1). P. 89-94.

159. Prince A.M., Huima-Byron T., Parker T.S., Levine D.M. Visualization of hepatitis C virions and putative defective interfering particles isolated from low-density lipoproteins // J. Viral. Hepat. 1996. 3. (1). P. 11-17.

160. Processing of gene expression data generated by quantitative real-time RT-PCR / P.Y. Muller et al. // Biotechniques 2002. 32. (6). P. 1372-1378.

161. Rapid genotyping of hepatitis C virus by primer-specific extension analysis / N.A. Antonishyn et al. // J. Clin. Microbiol. 2005. 43. (10). P. 51585163.

162. Real-Time PCR / edited by M.T. Dorak. UK: Taylor & Francis Group, 2006. 333 p.

163. Real-time PCR assays for hepatitis C virus (HCV) RNA quantitation are adequate for clinical management of patients with chronic HCV infection / P. Halfon et al. // J. Clin. Microbiol. 2006. 44, 2507-2511.

164. Rutledge R.G. Sigmoidal curve-fitting redefines quantitative real-time PCR with the prospective of developing automated high-throughput applications // Nucleic Acids Res. 2004. 32. (22). P. el78.

165. Rutledge R.G., Cóté C. Mathematics of quantitative kinetic PCR and the application of standard curves //Nucleic Acids Res. 2003. 31. (16). P. e93.

166. SantaLucia J Jr. Physical principles and visual-OMP software for optimal PCR design // Methods Mol. Biol. 2007. 402. P. 3-34.

167. SantaLucia J.Jr., Hicks D. The thermodynamics of DNA structural motifs // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2004. 33. P. 415-440

168. Savitzky A., Golay MJ. Smoothing and Differentiation of Data by Simplified Least Squares Procedures // Anal. Chem. 1964. 36. (8). P. 1627-1639.

169. Scott J.D., Gretch D.R. Molecular diagnostics of hepatitis C virus infection: a systematic review // JAMA. 2007. 297. (7). P. 724-732.

170. Sensitivity of second-generation enzyme immunoassay for detection of hepatitis C virus infection-among oncology patients / A. Macedo de Oliveira et al:. // J. Clin. Virol. 2006 Jan;35. (1). P. 21-25.

171. Simmonds P. Genetic diversity and evolution of hepatitis C virus 15 years on //J. Gen. Virol. 2004. 85. (Pt 11). P. 3173-3188

172. Simplified hepatitis C virus genotyping by heteroduplex mobility analysis / P.A. White et al.7/ J. Clin. Microbiol. 2000. 38. (2). P. 477-482.

173. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences / R. Higuchi et ah. //Biotechnology. 1992. 10. P. 413-417.

174. Simultaneous fitting of real-time PCR data with efficiency of amplification modeled as Gaussian function of target fluorescence / A. Batsch et al. // BMC Bioinformatics 2008. 9. P. 95.

175. Standardization of hepatitis C virus RNA quantification / J.M. Pawlotsky et al. //Hepatology, 2000. 32. (3). P. 654-659.

176. Standardized determination of real-time PCR efficiency from a single reaction set-up / A. Tichopad et al. //Nucleic acids Res. 2003. 31. (20). P. el22.

177. Storage conditions of-blood samples and primer selection affect the yield of cDNA polymerase chain reaction products of hepatitis C virus. / H.T. Cuypers et al. // J. Clin. Microbiol. 1992. 30. (12). P.3220-3224.

178. Structure of the 3' terminus of the hepatitis C virus genome / T. Tanaka et al. //J. Virol. 1996. 70. (5). P. 3307-3312.

179. Survey of major genotypes and subtypes of hepatitis C virus using RFLP of sequences amplified from the 5' non-coding region / F. Davidson et al. // J. Gen; Virol. 1995. 76. P. 1197-1204.

180. Sy T., Jamal M. Epidemiology of Hepatitis C Virus (HCV) Infection // Int. J. Med. Sei. 2006. 3. (2). P. 41-46.

181. The association between hepatitis C virus genotype and human immunodeficiency virus disease progression in a cohort of hemophilic men / C.A. Sabin et al.//J. Infect. Dis. 1997. 175.(1). P. 164-168.

182. The complete coding sequence of hepatitis C virus genotype 5a, the predominant genotype in South Africa / R.W. Chamberlain et al. // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1997. 236. (1). P. 44-49.

183. The elimination of primer-dimer accumulation in PCR / J. Brownie et al. //Nucleic Acids Res. 1997. 25. (16). P.3235-3241.

184. The impact of chronic hepatitis C virus infection on HIV disease and progression in intravenous drug users / G.H. Haydon et al. // Eur.J.Gastroenterol.Hepatol. 1998. 10. (6). P. 485-489.

185. The management of chronic viral hepatitis: a Canadian consensus conference / M. Sherman et al. // Can. J. Gastroenterol. 2004. 18. (12). P. 715-728.

186. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments / S.A. Bustin et al. // Clin. Chem. 2009. 55. (4). P. 611-622.

187. The particle size of hepatitis C virus estimated by filtration through microporous regenerated cellulose fibre / T. Yuasa et al. // J. Gen. Virol. 1991. 72. (Pt 8). P. 2021-2024.

188. The prognostic value of a single hepatitis C virus RNA load measurement taken early after human immunodeficiency virus seroconversion / E. Herrero-Martinez et al. //J. Infect. Dis. 2002. 186. (4). P. 470-476.

189. The significance of third-generation HCV RIBA-indeterminate, RNA-negative results in voluntary blood donors screened with sequential third-generation immunoassays / P. Kiely et al. // Transfusion. 2004. 44. (3). P. 349-358.

190. The unique HCV genotype distribution and the discovery of a novel subtype 6u among IDUs co-infected with HIV-1 in Yunnan, China / X. Xia et al. // J. Med. Virol. 2008. 80. (7). P. 1142-1152.

191. The use of a thermally activated DNA polymerase PCR gives improved specificity, sensitivity and product yield without additives or extra process steps / D.E. Birch et al. //Nature 1996. 381. P. 445-446.

192. Tichopad A., Didier A., Pfaffl M.W. Inhibition of real-time RT-PCR quantification due to tissue specific contaminants // Mol. Cel. Probes, 2004. 18. (1) P: 45-50.

193. Tissue donation and virus safety: more nucleic acid amplification testing is needed / A. Pruss et al. // Transpl. Infect. Dis. 2010. 12. (5). P. 375-386.

194. Tyagi S., Bratu D.P., Kramer F.R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination//Nat. Biotechnol. 1998. 16. (1). P. 49-53.

195. Typing hepatitis C virus by polymerase chain reaction with type-specific primers: application to clinical surveys and* tracing infectious sources / H. Okamoto et al. // J. Gen. Virology. 1992. 73 (Pt3). P. 673-679.

196. Typing of hepatitis C virus isolates and characterization of new subtypes using a line probe assay / L. Stuyver et al. // J. Gen. Virol. 1993. 74. P. 10931102.

197. Visualization of hepatitis C virions and putative defective interfering particles isolated from low-density lipoproteins / A.M. Prince et al. // J. Viral. Hepat. 1996.3.(1). P. 11-17.

198. Walter N.G., Burke J.M. Real-time monitoring of hairpin ribozyme kinetics through base-specific quenching of fluorescein-labeled substrates // RNA. 1997. 3. (4). P. 392-404.

199. Wang C., Sarnow P., Siddiqui A. Translation of human hepatitis C virus RNA in cultured cells is mediated by an internal ribosome-binding mechanism // J.Virol. 1993. 67. (6). P. 3338-3344.

200. Watkins N.E. Jr., SantaLucia J. Jr. Nearest-neighbor thermodynamics of deoxyinosine pairs in DNA duplexes // Nucleic Acids Res. 2005. 33. (19). P. 62586267.

201. Wetmur,J.G. DNA probes: applications of the principles of nucleic acid hybridization // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1991. 26. (3-4). P. 227-259.

202. Wilhelm J., Pingoud A., Hahn M. SoFAR: software for fully automatic evaluation of real-time PCR data // Biotechniques. 2003. 34. (2). P. 324-332.

203. Wittwer C.T., Gutekunst M., Lohmann S. Method for quantification of an analyte US patent 6503720 B2.

204. Wong M.L., Medrano J.F. Real-time PCR for mRNA quantitation // Biotechniques. 2005. 39. (1). P. 75-85.

205. Wong T., Lee S.S. Hepatitis C: a review for primary care physicians // CMAJ. 2006. 174. (5). P. 649-659

206. Yoo< H.Y., Maheshwari A., Thuluvath P.J. Retransplantation of liver: primary graft nonfunction and hepatitis С virus are associated with worse outcome // Liver Transpl. 2003. 9. (9). P. 897-904.

207. Zein N.N. Clinical significance of hepatitis С virus genotypes // Clin. Microbiol. Rev. 2000. 13. (2). P. 223-235

208. Zhao S., Fernald R.D. Comprehensive algorithm for quantitative realtime polymerase chain reaction // J. Comput. Biol. 2005. 12. (8). P. 1047-64.