Генетический контроль регуляции генов метаболизма метанола у дрожжей Pichia pastoris тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.07, кандидат наук Румянцев Андрей Михайлович

• Румянцев Андрей Михайлович
• кандидат наук
• 2016

Оглавление диссертации кандидат наук Румянцев Андрей Михайлович

Оглавление

№ стр.

1. Введение

2. Обзор литературы Генетический контроль метаболизма азота и углерода у дрожжей

2.1. Метаболизм азота у дрожжей и механизмы его регуляции

2.2. Регуляция метаболизма углерода у дрожжей & cerevisiae и Р. pastoris

2.3. Взаимодействие сигнальных путей, вовлеченных в регуляцию азотного и углеродного метаболизма

2.4. Метаболизм фосфора у дрожжей & cerevisiae и механизмы его регуляции

3. Материалы и методы

3.1. Среды и условия культивирования

3.2. Плазмиды

3.3. Штаммы дрожжей и бактерий

3.4. Олигонуклеотиды

3.4. Методы

4. Результаты и обсуждение

4.1 Изучение влияния разных типов источников азота и углерода на рост штамма GS115 Р. pastoris

4.2 Влияние источников азота на экспрессию генов метаболизма метанола

4.3 Изучение регуляции промоторов генов АОХ1 и АОХ2 в зависимости от типа источника азота

4.4 Влияние ингибитора TOR-киназы рапамицина на уровень активности промотора гена АОХ1

4.5 Получение штаммов Р. pastoris устойчивых к рапамицину

4.6 Влияние делеции в гене PpURE2 на регуляцию промотора гена АОХ1

4.7 Пролин и глутамат как комплексные источники азота и углерода для P. pastoris

4.8 Делеционный анализ промотора гена AOX1

4.9 Изучение экспрессии гена АОХ1 в популяции клеток P. pastoris

4.10 Анализ активности промотора гена АОХ1 P. pastoris с использованием дрожжей S. сerevisiae

4.11 Влияние концентрации фосфата в среде на активность промоторов генов АОХ1 и АОХ2

4.12 Изучение влияния концентрации ортофосфата на экспрессию генов DAS, FLD, DAK, PpPEX5

4.13 Анализ влияния делеций в промоторе гена АОХ1 на его регуляцию фосфатом

4.14 Влияние ингибитора циклинзависимых киназ флавопиридола на уровень активности промотора гена АОХ1

4.15 Оптимизация условий культивирования штаммов P. pastoris

5. Заключение

6. Выводы

7. Список используемых сокращений

8. Список цитируемой литературы

9. Приложения

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Генетический контроль регуляции генов метаболизма метанола у дрожжей Pichia pastoris»

1. Введение

Актуальность темы исследования. Клетки прокариот и эукариот постоянно сталкиваются с изменениями условий окружающей среды, в частности, концентрации и доступности основных биогенных элементов. Чувствительность к подобным изменениям и быстрая реакция на них критичны для жизнеспособности клетки. Изучение генетических механизмов, лежащих в основе адаптации организмов к условиям окружающей среды, является фундаментальной проблемой биологии.

В живой клетке множество рецепторов обеспечивают постоянный контроль состава среды. Дальнейшая передача сигнала о наличии питательных веществ осуществляется с помощью различных регуляторных путей. Для обеспечения специфичности ответа эти пути взаимодействуют между собой на всех этапах передачи сигнала, формируя единую регуляторную сеть. Подобная интеграция обеспечивает согласованную регуляцию не просто отдельных генов, а целых генных комплексов, контролирующих различные метаболические пути и состояние клеточных органелл.

В клетках дрожжей питательные вещества и их метаболиты служат не только ресурсом для биосинтеза и получения энергии, но также сами участвуют в регуляции метаболической и транскрипционной активности. Изучение двойственной роли питательных веществ как источников основных биогенных элементов и как сигнальных молекул, является необходимым для понимания механизмов регуляции в клетке.

Азот является одним из основных биогенных элементов. Он входит в состав нуклеиновых кислот и белков, служащих основой существования живой клетки. Качество и доступность источника азота оказывает влияние на все метаболические процессы, что ведет к изменению скорости роста и деления клеток, индуцирует биогенез или, наоборот, деградацию клеточных органелл. Общий ответ клетки на изменение количества и качества источника азота в среде назван азотной регуляцией (Magasanik& Kaiser, 2002).

Исследование механизмов азотной регуляции у дрожжей имеет как теоретическую, так практическую значимость. Дрожжи, в частности Saccharomyces cerevisiae, зарекомендовали себя как прекрасная модельная система. Полученные с их помощью фундаментальные знания об организации биохимических и регуляторных процессов применимы и для клеток других организмов, например человека (Botstein et al., 1997). Так же дрожжи широко применяются в биотехнологии, поскольку позволяют сочетать преимущества бактериальных и эукариотических систем экспрессии чужеродных генов (Cereghino & Cregg, 2000; Cregg et al, 1993). Они растут на средах относительно простого состава и при этом способны осуществлять основные посттрансляционные модификации. При культивировании дрожжей -продуцентов рекомбинантных белков, необычайно важна возможность поддержания оптимального баланса между скоростью роста, жизнеспособностью культуры и уровнем синтеза целевого белка. Для этого необходимо создание целостной картины, отражающей координированную регуляцию метаболизма клетки в ответ на сочетание различных факторов среды, таких как тип и доступность источников азота, фосфора и углерода.

Метилотрофные дрожжи Pichia pastoris широко известны в качестве системы для гетерологичной экспрессии генов. Они используются для производства самых разнообразных белков в больших объемах, начиная от столбнячного токсина и мышиного эпидермального фактора роста и заканчивая мембранными белками, включающими человеческие ABC транспортеры, аквапорины и тетраспанины (Cereghino & Cregg, 2000; Cregg et al, 1993). Изучение механизмов регуляции азотного и углеродного метаболизма и взаимодействия сигнальных путей у P. pastoris позволит оптимизировать условия культивирования этих дрожжей и тем самым увеличить эффективность их применения в качестве продуцентов рекомбинантных белков.

Генетический контроль метаболизма основных биогенных элементов изучен у дрожжей Saccharomyces cerevisiae (Magasanik & Kaiser, 2002; Самбук, 2006). Однако эти дрожжи имеют ряд особенностей, отличающих их от других

родов и видов, даже таких близкородственных как Kluyveromyces. S. cerevisiae являются факультативными анаэробами, и способны получать энергию за счёт спиртового брожения. При этом показано, что при высоких концентрациях глюкозы в среде, S. cerevisiae синтезируют этанол даже в аэробных условиях. Подобное явление, названное Крэбтри эффектом, также сопровождается ингибированием активности митохондрий и ферментов цикла трикарбоновых кислот (Crabtree, 1928).

В отличие от S. cerevisiae дрожжи P. pastoris относятся к группе Крэбтри-негативных дрожжей (Crabtree negative yeast) и являются облигатными аэробами (Подгорский, 1982). Дрожжи P. pastoris - метилотрофы и способны использовать метиловый спирт в качестве единственного источника углерода в среде (Anthony, 1982; Троценко, Трогонская, 2012). Промоторы генов метаболизма метанола, в частности промотор гена алкогольоксидазы I, широко используются для экспрессии чужеродных генов (Mattanovich et al., 2012). Регуляция этих промоторов в зависимости от типа источника углерода в среде изучена с помощью репортерных систем (Tschopp et al., 1987). Выявлен ряд регуляторных элементов в составе их последовательностей и связывающихся с ними транскрипционных факторов (Vogl & Glieder, 2013). Однако, несмотря на огромную практическую значимость, до сих пор не существует цельного представления о молекулярных механизмах, обеспечивающих подобную регуляцию. Так же остаётся совершенно неизученным, как на экспрессию генов метаболизма метанола влияют качественные и количественные изменения других компонентов среды - типа источника азота или концентрации ортофосфата.

В связи с особенностями метаболизма пероксисомы играют огромную роль в функционировании клеток P. pastoris. Эти дрожжи являются одним из модельных объектов для изучения биогенеза и деградации пероксисом (Klei et al., 2006). При этом на сегодняшний день влияние типа источника азота на функционирование этих клеточных органелл у P. pastoris практически не изучено.

Важнейшую роль в адаптации клеток к условиям среды играют митохондрии. Механизмы координированной регуляции экспрессии ядерных и

митохондриальных генов эукариот отличаются высокой степенью консервативности. Для грибов, растений и животных ретроградные сигнальные системы являются важным регуляторным механизмом, который охватывает большое число клеточных процессов, обеспечивающих метаболический гомеостаз клетки и органелл. Изучение механизмов митохондриально-ядерной коммуникации в клетках дрожжей используют как модель сигналинга о концентрации кислорода в клетке, формирования оксидативного стресса, старения, апоптоза и развития нейродегенеративных заболеваний человека (Ryan et al, 2007).

Генетический контроль ретроградной регуляции был изучен у дрожжей S. cerevisiae, вследствие лабильности их энергетического обмена и способности переключаться с аэробного дыхания на брожение, а также жизнеспособности митохондриальных мутантов и клеток, полностью утративших мтДНК (Физикова, 2011). Подобные исследования у P. pastoris осложнены тем, что эти дрожжи являются облигатными аэробами и неспособны существовать при нарушении функций митохондрий. Исследование механизмов координированной регуляции углеродного и азотного метаболизма позволит предложить новые подходы к изучению ретроградной регуляции у дрожжей P. pastoris, основанные на применении сочетаний различных источников азота и углерода, используемых при культивировании.

Целью данной работы является изучение влияния источников азота и углерода, а так же концентрации ортофосфата в среде на экспрессию генов метаболизма метанола и биогенеза пероксисом у дрожжей P. pastoris и поиск регуляторных генов, вовлеченных в эти процессы.

Для достижения цели были сформулированы следующие задачи исследования:

1. Определить уровни экспрессии генов метаболизма метанола (AOX1, AOX2, CAT1, DAK, DAS, FLD, FGH) и биогенеза пероксисом (PpPEX1, PpPEX5, PpPEX8 и PpPEX14) в зависимости от типа источника азота и углерода в среде.

2. Определить уровни экспрессии генов метаболизма метанола и биогенеза пероксисом при различных концентрациях ортофосфата в средах с сульфатом аммония в качестве источника азота.

3. Установить области промотора гена АОХ1, ответственные за регуляцию его активности в зависимости от типа источника азота, а так же от концентрации ортофосфата.

4. Изучить влияние ингибиторов циклинзависимых и Тог-киназ на экспрессию гена АОХ1.

Научная новизна диссертационной работы. Впервые для дрожжей P. pastoris исследована регуляция экспрессии генов метаболизма метанола, а так же генов, вовлечённых в функционирование пероксисом, в ответ на изменение различных факторов среды - типа источника азота и концентрации фосфата. Впервые в составе промотора гена AOX1 выявлены участки, вовлечённые в его азотную и фосфатную регуляцию. Продемонстрировано, что ингибитор Тог-киназного комплекса рапамицин и ингибитор циклин-зависимых киназ флавопиридол, влияют на уровень экспрессии гена алкогольоксидазы I, кодирующего ключевой фермент метаболизма метанола. В ходе работы созданы тестерные штаммы P. pastoris, с помощью которых была проведена оптимизация условий культивирования метилотрофных дрожжей - продуцентов рекомбинантных белков.

Основные положения, выносимые на защиту. 1. Гены метаболизма метанола и гены, вовлеченные в функционирование и биогенез пероксисом, представляют собой регулон и координированно отвечают на изменение источника азота и концентрации ортофосфата в среде. 2. В регуляции экспрессии гена алкогольоксидазы АОХ1 принимают участие TOR-киназы и киназы, ингибируемые флавопиридолом.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы представлены в виде четырёх статей, опубликованных в ведущих журналах, рекомендованных ВАК, а так же в виде устных и стендовых докладов на следующих конференциях: на V съезде ВОГиС (Москва, Россия, 2009г.), на 14-й

Пущинской международной школе-конференции молодых ученых "Биология -наука XXI века" (Пущино, Россия, 2010 г.), на VI Всероссийской конференции молодых учёных "Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой" (Саратов, Россия, 2012 г.), на III и VI Всероссийских форумах студентов, аспирантов и молодых ученых "Наука и инновации в технических университетах" (Санкт-Петербург, 2009 и 2012 г.), на V Международной школе молодых ученых по молекулярной генетике "Непостоянство генома" (Звенигород, Россия, 2012 г.), на III Международной научной интернет-конференции "Биотехнология. Взгляд в будущее" (2014 г.), на Международной научно-практической конференции "Актуальные вопросы современных математических и естественных наук" (Екатеринбург, Россия, 2015 г.), Международном симпозиуме "VII Symposium on Applied Microbiology" (Сан-Паулу, Бразилия, 2015 г.). Работа выполнялась при поддержке грантов ИАС 3.37.222.2015 и 0.37.235.2015.

Внедрение результатов работы. С использованием полученных данных, а так же с помощью созданных тестерных штаммов были оптимизированы среды и условия культивирования метилотрофных дрожжей P. pastoris.

Объём и структура диссертации. Текст диссертации состоит из следующих разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и обсуждение", "Заключение", "Выводы", "Список используемых сокращений", "Список цитируемой литературы" и "Приложения". Диссертация представлена на 141 странице и содержит 46 рисунков и 8 таблиц. В "Списке цитируемой литературы" представлены 176 источников.

2. Обзор литературы Генетический контроль метаболизма азота и углерода у дрожжей

2.1. Метаболизм азота у дрожжей и механизмы его регуляции

Метаболизм азота у дрожжей S. cerevisiae. Адаптация микроорганизмов к изменению условий среды происходит, в значительной степени, на транскрипционном уровне. При этом гены, кодирующие ключевые ферменты метаболических путей, как правило, способны изменять уровень экспрессии в ответ на дефицит нескольких биогенных элементов. Азот - важный компонент клеточных макромолекул, выполняющих центральные функции в живых системах. В связи с этим прокариотические и эукариотические организмы выработали сложные механизмы для обеспечения клеток азотом.

Грибы могут использовать самые разнообразные соединения в качестве источников азота и синтезируют множество ферментов для разных путей ассимиляции и биосинтеза азотсодержащих веществ. Ряд соединений азота является более предпочтительными для использования грибами.

Лучше всего азотный метаболизм и его регуляция изучены у дрожжей S. cerevisiae. Центральный путь азотного метаболизма (Рис. 1) у этих дрожжей включает реакции превращения и биосинтеза глутамата (Glu) и глутамина (Gln) с участием солей аммония (NHH4+). Глутаминсинтетаза (продукт гена GLN1) катализирует реакцию образования глутамина из глутамата и аммония. НАДФ-И-зависимая глутаматдегидрогеназа (GDH1) контролирует синтез глутамата из аммония и а-кетоглутарата, который поступает из цикла трикарбоновых кислот. НАД+-зависимая дегидрогеназа (GDH2) запускает обратную реакцию с образованием аммония и необходима для роста на среде с глутаматом в качестве единственного источника азота. Важную роль играет продукт гена GAP1 -основная пермеаза аминокислот дрожжей, транспортирующая почти все виды аминокислот внутрь клетки (по Magasanik & Kaiser, 2002). Субстраты для синтеза

глутамата и глутамина поступают из реакций «боковых» путей азотного метаболизма, в ходе которых усваиваются менее предпочтительные источники азота - мочевина (Urea), пролин (Pro), аргинин (Arg). Для каждого из них в дрожжевой клетке существует специфический набор катаболических ферментов.

Рисунок 1. Центральный путь метаболизма азота у S. cerevisiae. Мочевина, пролин, аргинин, соли аммония, а также промежуточное соединение цикла трикарбоновых кислот - а-кетоглутарат - превращаются в глутамат и глутамин, из которых синтезируются все азотсодержащие компоненты клетки (по Magasanik & Kaiser, 2002). Богатые источники азота - Gln и соли аммония -обозначены зеленым цветом, бедные - Pro, Arg и Urea - красным, а занимающий промежуточное положение Glu - жёлтым. Цифрами обозначены основные реакции азотного метаболизма и гены ферментов, контролирующих эти реакции: 1 - НАДФ-Н-зависимая глутаматдегидрогеназа (продукт гена GDH1), 2 -глутаминсинтетаза (GLN1), 3 - НАД+-зависимая дегидрогеназа (GDH2), 4 -глутаматсинтаза (GLT1), 5 - амидолиаза мочевины (DUR1,2), 6 -

кислородзависимая пролиноксидаза (PUT1), V - пирролин-5-карбоксилатдегидрогеназу (PUT2), 8 - аргиназа (CAR1), 9 -орнитинаминотрансфераза (CAR2).

Для пролина катаболические ферменты кодируются генами семейства PUT. Ген PUT4 кодирует специфическую пермеазу пролина, которая синтезируется только при отсутствии хороших источников азота в среде. PUTS кодирует транскрипционный фактор, который конститутивно синтезируется в клетке, независимо от наличия пролина. Гены PUT1 и PUT2 кодируют пролиноксидазу и пирролин-5-карбоксилатдегидрогеназу, соответственно. Пролин не может быть усвоен дрожжевыми клетками в отсутствие кислорода, так как первый этап его деградации катализирует 02-зависимая пролиноксидаза Put1p. Так же дрожжи могут использовать в качестве источника азота аргинин, являющийся предшественником пролина в цепи катаболитных реакций (Magasanik & Kaiser, 2002). Катаболизм аргинина включает гидролиз аргиназой (CAR1) с образованием мочевины и орнитина, трансаминирование орнитина продуктом гена CAR2 с выходом глутамата и пирролин-5-карбоксилата (P5C), который восстанавливается до пролина НАДФ-Н-зависимой Р5С-редуктазой, продуктом гена PROS. И только в аэробных условиях, в митохондриях белок Put2 превращает P5C в глутамат (Martin et al, 2003).

Специфические ферменты работают в катаболизме мочевины и аллантоина. Ген DURS кодирует мембранный переносчик мочевины. Деградация мочевины до диоксида углерода и аммиака катализируется амидолиазой мочевины, обладающей активностями карбоксилазы и аллофанатгидролазы (продукт гена DUR1,2 ). Транспорт аллантоина через мембрану осуществляется продуктом гена DAL4; ген DAL7 кодирует малатсинтазу аллантоинового катаболизма (Cooper et al., 1980).

Регуляция азотного метаболизма у дрожжей. Качество источника азота в среде влияет на состояние клетки в целом, и у дрожжей существует сложная

сигнальная система, обеспечивающая координированную регуляцию многих метаболических путей в ответ на смену источника азота. Для лабораторных штаммов S. cerevisiae, которые в основном являются производными штамма S288C, наиболее предпочтительным источником азота является глутамин (Gln). Штаммы производные штамма D1278b, применяемые при изучении ассимиляции азота, наравне с глутамином используют и соли аммония (NH4+). Для дрожжей S. cerevisiae бедными источниками азота являются пролин (Pro), мочевина (Urea), орнитин и аллантоин. Промежуточное положение в этом ряду занимает глутамат (Glu) (Magasanik & Kaiser, 2002). Критерием для классификации источников азота на более и менее предпочтительные является продолжительность стадий клеточного цикла, а так же наличие азотной катаболитной репрессии (NCR -nitrogen catabolite repression), которая заключается в подавлении генов и остановке процессов утилизации бедных источников азота при наличии в среде глутамина или солей аммония (Magasanik, 1992).

В культурах дрожжей выращенных на бедном источнике азота наблюдаются процессы автофагии, а так же псевдомицелиальный и инвазивный рост. При переносе клеток в среду, содержащую глутамин наблюдается активация биогенеза рибосом и репрессия генов пермеаз различных аминокислот. При отсутствии источника азота в среде гаплоидные клетки дрожжей переходят в состояние покоя, а диплоидные клетки претерпевают мейоз и споруляцию (Beeser & Cooper, 2000). Перенос клеток со среды с бедным источником азота на среды с глутамином или солями аммония приводит к изменениям в транскрипции множества генов (Magasanik, 1992).

У дрожжей S. cerevisiae экспрессия более 90 генов азотного метаболизма регулируется системой, основу которой составляют четыре транскрипционных фактора относящихся к семейству факторов GATA-типа (Marzluf, 1997). Два из них - Gln3p и Gat1p являются активаторами, а другие два - Dal80p и Gzf3p репрессорами. Азотная катаболитная репрессия осуществляется в основном за счёт изменения внутриклеточной локализации активаторов транскрипции. При росте на среде с бедным источником азота Gln3p и Gat1p локализуются в ядре, где

они связаны с GATA-последовательностями внутри промоторов регулируемых генов, тогда как при росте на среде с глутамином или солями аммония оба транскрипционных фактора остаются в цитоплазме. Gln3p является активатором транскрипции генов GAT1 и DAL80, что обеспечивает положительную и отрицательную обратную связь при регуляции индукции генов азотного метаболизма (Coffman et al., 1997; Cunningham & Cooper, 1991). Белок Ure2p связывает Gln3p, чем определяет его локализацию в цитоплазме клетки. В клетках дрожжей, несущих мутацию ure2, белок Gln3p локализуется в ядре и азотная катаболитная репрессия полностью нарушена. Другой активатор Gat1p при этом остаётся в цитоплазме, что позволяет предположить, что его локализация в цитоплазме обеспечивается наличием другого белка подобного Ure2p (Stanbrough et al., 1995). Схема взаимной регуляции GATA-факторов представлена на рисунке 2.

Gin NH4 Glu Pro

t^NCR-гены^?

Рисунок 2. Модель регуляции транскрипции генов, подверженных азотной катаболитной репрессии (NCR-генов) и взаимодействия GATA-факторов в зависимости от типа источника азота в среде. Gln3p и Gat1p являются транскрипционными активаторами, Gzf3p и Dal80p - репрессорами (по СоГГтап е1 а1, 1997).

Дрожжи S. cerevisiae определяют качество источника азота в среде исходя из внутриклеточной концентрации глутамина и/или глутамата. Так у мутантов со сниженной активностью гена GLN1, кодирующего глутаминсинтетазу, гены, подверженные азотной катаболитной репрессии, активны при росте клеток на среде с солями аммония, тогда как при использовании глутамина в качестве источника азота репрессия этих генов сохраняется. Обработка клеток дрожжей, растущих на среде с солями аммония ингибитором глутаминсинтетазы сульфоксимином, так же приводит к нарушению азотной катаболитной репрессии (Crespo et al., 2002; Mitchell & Magasanik, 1984). Эти данные позволяют предположить, что концентрация глутамина внутри клетки влияет на взаимодействие белков Gln3p и Ure2p. Обработка клеток дрожжей сульфоксимином не влияет на локализацию другого активатора Gatlp, что согласуется с гипотезой о регуляции его работы в зависимости от концентрации глутамата внутри клетки (Kulkarni et al., 2006; Magasanik& Kaiser, 2002). Данная система позволяет клеткам дрожжей осуществлять очень точную регуляцию генов азотного метаболизма. При снижении внутриклеточной концентрации глутамина активируется транскрипционный фактор Gln3p и снимается азотная катаболитная репрессия. Когда же происходит снижение уровня внутриклеточного глутамата, активируется ТФ Gatlp, что приводит к ещё большему усилению экспрессии генов, обеспечивающих использование альтернативных источников азота (Kulkarni et al., 2006).

Малоизученными остаются молекулярные механизмы, обеспечивающие чувствительность клетки к концентрации глутамина и глутамата и контролирующие локализацию Gln3p и Gatlp внутри клетки. Предложена модель, связывающая внутриклеточные уровни глутамина и глутамата с активностью белков Tor, являющихся серин-треониновыми протеинкиназами, входящими в семейство фосфатидилинозитол-3-киназ. Дрожжи S. cerevisiae обладают двумя белковыми комплексами TORC1 и TORC2, содержащими протеинкиназу Tor (Wullschleger et al., 2006; De Virgilio & Loewith, 2006). У большинства эукариотических организмов Tor-киназа кодируется одним геном, тогда как S.

cerevisiae обладают двумя различными киназами - Torlp и Tor2p (Cardenas et al., 1999). Подобная особенность S. cerevisiae связана с тем, что эти дрожжи в процессе эволюционного развития претерпели дупликацию генома. Комплекс TORC1, куда помимо Tor1p, входят ещё пять различных белков, участвует в регуляции пролиферации клетки, а также обеспечивает переход клетки в состояние покоя при неблагоприятных условиях. Комплекс TORC2 регулирует организацию актинового цитоскелета и полярность клетки (Wullschleger et al., 2005).

При обработке клеток антибиотиком рапамицином, который нарушает работу комплекса TORC1, наблюдаются эффекты, сходные с азотным голоданием: автофагия, синтез пермеаз различных аминокислот, а также переход клеток в стадию G0 (Hardwick et al., 1999; Cox et al., 2004). Помимо этого при обработке рапамицином, также как и при азотном голодании, в клетке изменяется экспрессия нескольких сотен NCR-чувствительных генов (Shamji et al., 2000). Эти данные свидетельствуют о том, что TORC1 является важнейшим участником сигнального пути, обеспечивающего азотную регуляцию (Lorberg & Hall, 2004).

Существуют данные, говорящие о возможности наличия других путей регуляции генов в ответ на тип источника азота в среде. Во-первых, азотное голодание является легкообратимым процессом и клеткам необходимо не более часа, чтобы вновь перейти к нормальному росту при изменении условий среды. В то же время для перехода к нормальному росту после обработки рапамицином клетке может потребоваться более длительное время (Dubouloz et al., 2005). Во-вторых, хотя и дефицит азота, и обработка клеток рапамицином приводят к снятию азотной катаболитной репрессии, фосфорилирование Gln3p в ответ на эти два стимула осуществляется по-разному (Cox et al., 2004).

Одной из основных мишеней TORO-киназного комплекса является белок Tap42p, который является регулятором фосфатазы 2А (РР2А) и других подобных ей фосфатаз (Di Como & Arndt, 1996; Duvel & Broach, 2004). Фосфатаза 2А функционирует в виде гетеротримера, состоящего из каталитической субъединицы кодируемой генами PPH21, PPH22, и PPH3, а так же связующей и

регуляторной субъединиц. РР2А-подобная фосфатаза состоит только из двух субъединиц - каталитической, кодируемой геном SIT4, и регуляторной. Именно РР2А и подобные ей фосфатазы обеспечивают дефосфорилирование Gln3p, что приводит к его перемещению внутрь ядра и снятию азотной катаболитной репрессии (Jiang & Broach, 1999) (Рис. 3).

Рисунок 3. Модель контроля внутриклеточной локализации Gln3p с участием комплекса TORC1 в клетках дрожжей (по Conrad et al., 2014). При наличие богатых источников азота в среде активность Тог-киназного комплекса приводит к ингибированию ряда фосфатаз (PPA2, Sit4p). В результате комплексы Ure2p с белками Gln3p и Gatlp оказываются гиперфосфорилированы и неактивны (Ptacek et al., 2005). При азотном голодании или наличии только бедных источников азота в среде Tor-киназный комплекс инактивируется, что приводит к высвобождению Tap42p - фосфатазных комплексов. Последующее дефосфорилирование белков Ure2p, Gln3p и Gatlp индуцирует транслокацию последних в ядро. Далее транскрипционные активаторы Gln3p и Gatlp индуцируют экспрессию генов, подверженных азотной катаболитной репрессии (NCR - генов).

Количество белка Tap42p в клетке примерно в пять-десять раз меньше, чем каталитических субъединиц фосфатазы 2А, а значит, он может связаться не более чем с 20% всех молекул РР2А в клетке. Это опровергло первоначально предложенные модели стехиометрической регуляции активности РР2А белком Tap42p. Недавно была предложена новая модель, согласно которой комплекс Tap42p-PP2A в неактивном состоянии прикрепляется к комплексу TORC1 на поверхности внутриклеточных мембран. Азотное голодание или обработка клеток рапамицином высвобождает комплекс Tap42p-PP2A в цитоплазму, где он медленно дефосфорилируется и диссоциирует, что приводит к активации РР2А (Jiang & Broach, 1999; Yan et. al., 2006).

Азотная регуляция у метилотрофных дрожжей мало изучена. У H. polymorpha обнаружено несколько генов, вовлечённых в азотную катаболитную репрессию (Rossi et. al., 2005). Ген NMR2 кодирует транскрипционный фактор, сходный по выполняемым функциям с белками NmrA из Aspergillus nidulans, Кшг1р из Neurospora crassa и Ure2p из S. cerevisiae, и участвует в репрессии NCR-чувствительных генов. Продукт гена NMR4 является сенсором концентрации аммония в среде и/или переносит аммоний внутрь клетки. Мутации в гене NMR1 приводят к дерепресии ассимиляции нитратов клетками дрожжей даже при наличии глутамата в среде. Если в среде присутствует глутамин, то гены, отвечающие за ассимиляцию нитратов, у мутантов nmr1 остаются репрессированными, что позволяет предположить наличие различных механизмов репрессии NCR-чувствительных генов у H. polymorpha. Особый интерес вызывает взаимодействие пути утилизации метанола как источника углерода и метаболических путей различных источников азота у метилотрофных дрожжей. Для дрожжей H. polymorpha было показано, что существуют независимые пути, регулирующие биогенез и деградацию пероксисом в ответ на качество источника азота и углерода (Bellu et al., 2001).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Румянцев Андрей Михайлович, 2016 год

Рго -

Рго

1т2- 1тА- trB- tгC- 1;гО-4^115 4-С5115 4-С5115 4-С5115 4-С5115

Рисунок 31. Удельная активность КФ Р^5р (OD41o/OD55o), секретируемой штаммами ^2-4^115, trДА-4-GS115, trДB-4-GS115, trДC-4-GS115 и GS115 в средах ММ с метанолом, в зависимости от типа источника азота в среде. Символом * обозначено достоверное различие удельной активности КФ (р^а1ие < 0,02).

Показано, что делеция участка D не влияла на активность промотора АОХ1, тогда как удаление других фрагментов снижало удельную активность репортерной КФ. При этом регуляция промотора АОХ1 в зависимости от типа используемого источника азота сохранялась для вариантов с делециями фрагментов А, В и D. Удельная активность КФ у штаммов й-ДА-4^115, й-ДВ-4^115 и й-ДО-4^115, как и у контрольного штамма tr2-4-GS115, была заметно выше в средах с

сульфатом аммония. В случае штамма trДC-4-GS115 удельная активность КФ была необычайно низкой и составляла менее 3% от уровня демонстрируемого контрольным штаммом tr2-4-GS115. При столь низкой активности промотора, несущего делецию фрагмента С, не было выявлено достоверных различий удельной активности КФ при культивировании штамма trДC-4-GS115 в средах ММ с сульфатом аммония и пролином. Таким образом было показано, что для регуляции промотора АОХ1 пролином необходим и достаточен участок от -168 до -98 н., соответствующий фрагменту С без участков перекрывания с фрагментами В и D.

4.9. Изучение экспрессии гена АОХ1 в популяции клеток Р. pastoris

Современные исследования показали, что при кардинальных изменениях условий среды клетки дрожжей в культуре могут неоднородно реагировать на подобное воздействие. Даже если речь идет о генетически однородных популяциях клеток, при изменении источника биогенных элементов часть клеток будет продолжать использовать предыдущий источник, несмотря на то, что он представлен в следовых количествах. Подобное явление позволяет популяциям клеток дрожжей быстрее реагировать на изменения состава среды и эффективнее конкурировать с другими микроорганизмами. В частности при возврате к предыдущим условиям такая неоднородная популяция, за счёт части клеток уже нацеленных на использование исходного источника биогенных элементов, быстрее вернется к усвоению исходных питательных веществ.

Для того, чтобы изучить динамику экспрессии гена АОХ1 в популяции клеток P. pastoris был создан штамм, несущий репортерную конструкцию, позволяющую оценить уровень активности промотора АОХ1 в отдельной клетке. При этом в качестве репортерного гена был использован ген mRFP, кодирующий структуру красного флуоресцентного белка.

Конструирование плазмиды pPIC9-АОХ1-mRFP проводили аналогично плазмиде pPIC9-АОХ1-РНО5. Последовательность гена mRFP, кодирующая

красный флуоресцентный белок, была амплифицирована с помощью ПЦР с плазмидойpCMV6-AC-mR в качестве матрицы. В состав праймеров введены сайты рестрикции BamHI и EcoRI, которые были использованы для встраивания данного фрагмента под контроль промотора гена АОХ1 в составе плазмиды pPIC9. Линеаризованным с помощью рестриктазы StuI фрагментом плазмиды pPIC9-АОХ1-mRFP трансформировали исходный штамм GS115. Трансформантов отбирали по восстановлению прототрофности по гистидину. Полученные штаммы проверяли методами ПЦР, секвенирования и с помощью флюоресцентной микроскопии (Рис. 32). У всех полученных трансформантов синтез флюоресцентного белка наблюдался только в результате индукции промотора АОХ1 в средах с метанолом. Один из них - ^7^115 (his4::PAOX1-mRFP HIS4) был использован для дальнейшей работы.

Среда с глюкозой Среда с метанолом

Рго

# * *> ■а*

Рисунок 32. Флуоресценция штамма tr7-GS115 (his4::PAOX1-mRFP HIS4) после 10 часов роста в жидких средах с различными источниками углерода и азота.

Далее клетки штамма tr7-GS115 (his4::PAOX1-mRFP HIS4) выращивали в течение 40 часов в средах с метанолом (ММ) и сульфатом аммония или пролином.

Флуоресценцию детектировали с помощью спектрофлюориметра '^упе^у2" в лаборатории регуляции липидного обмена Института Экспериментальной Медицины (ИЭМ РАН). Оценивали удельную флуоресценцию штамма tr7-GS115 (Рис. 33). Результаты согласуются с данными, полученные с помощью системы с репортерным геном РН05 и методом ПЦР в режиме реального времени. При росте культур штамма tr7-GS115 в средах с метанолом уровень экспрессии репортерного гена под контролем промотора АОХ1 выше при использовании сульфата аммония в качестве источника азота, чем при использовании пролина.

с*. с;

15

I

<и

Ф 10 О.

0

>-

! 5 и; го

1

л ц

ф

5 0

Рго

й7-СБ115

0

^

л

з

и -3

0

1

ш

Р 2

X ГО

и;

? 1

л ц

ф

5 о

*

В

|\]Н4+

мм

среда с N44+

ММ

среда с пролином

Рго

Ы54::Раох1 -тЯРР Н154 Ы54::Раох1 -РНР5 Н154 рИох

Рисунок 33. Сравнение значений удельной флуоресценции штамма (ед. фл./OD550) й-7^115 (his4::PAOX1-mRFP НШ4) (А) и удельной активности КФ (е.а./OD550) у штамма ^2-4^115 (р^х his4::PAOX1-PHO5 НШ4) (В) при росте в средах ММ с метанолом и сульфатом аммония или пролином в качестве источников азота. Символом * обозначено достоверное различие удельной активности КФ (р^а!ие < 0,05).

Чтобы изучить динамику экспрессии гена АОХ1 в популяции клеток P. pastoris культуру штамма штамма tr7-GS115 (his4::PAOX1-mRFP HIS4) выращивали в жидкой среде YPD до стационарной фазы. Клетки центрифугировали и переносили в среду для голодания (М), в которой отсутствовали источники углерода и азота. После 24 часов культивирования клетки переносили в среды ММ с метанолом и пролином или сульфатом аммония. Каждые 10 часов проводили измерение флуоресценции клеток с помощью проточного цитофлуориметра. На рисунке 34 представлены гистограммы, отражающие долю флуоресцентных клеток после 10 часов индукции метанолом.

Рисунок 34. Флуоресценция клеток штамма tr7-GS115 (his4::PAOX1-mRFP HIS4) при росте в средах ММ с метанолом и сульфатом аммония или пролином (0,46%) в качестве источников азота. На среде с пролином заметно разделение клеток в культуре на флуоресцирующие и несинтезирующие белок mRFP.

При росте штамма tr7-GS115 в среде с метанолом и сульфатом аммония после 10 часов индукции практически все клетки синтезируют флуоресцентный белок. А при его культивировании в среде с метанолом и пролином активация синтеза репортерного белка наблюдается лишь у части клеток. При этом клетки в культуре можно строго разделить на две группы - у части клеток произошла индукция промотора АОХ1 и флуоресцентный белок накапливается в цитоплазме, у другой части клеток промотор АОХ1 остаётся неактивным.

На рисунке 35 показано как меняется доля флуоресцирующих клеток штамма tr7-GS115 при росте в средах с метанолом и сульфатом аммония или пролином.

Рисунок 35. Доля флуоресцирующих клеток штамма tr7-GS115 (his4::PAOX1-mRFP Н^4) при росте в средах ММ с метанолом и сульфатом аммония или пролином в качестве источников азота.

Таким образом, в среде, содержащей пролин, культура штамма tr7-GS115 оказалась неоднородна в отношении активности промотора АОХ1. Несмотря на

то, что часть клеток начинает использовать метанол довольно быстро, в целом все клетки культуры переключаются на его утилизации только после 20 часов культивирования. На среде с сульфатом аммония индукция промотора АОХ1 происходит гораздо быстрее.

Создание штамма P. pastoris синтезирующего внутриклеточный флуоресцентный белок, который накапливается в цитоплазме, необходимо так же и для решения практических задач. В биотехнологии с помощью дрожжей P. pastoris синтезируют как внутриклеточные, так и секреторные белки (Barr et al, 1992, Celik & Calik, 2012). Полученный нами штамм tr2-4-GS115 (phox his4::PAOX1-PHO5 HIS4), несущий ген репортерной КФ PHO5 под контролем промотора АОХ1, проявил себя как необычайно удобная система для оптимизации условий синтеза рекомбинантных белков. Однако, поскольку у данного штамма при индукции метанолом КФ секретируется в среду, полученные с его помощью результаты будут более применимы для подбора условий культивирования штаммов - продуцентов секреторных белков. Для оптимизации синтеза цитоплазматических более подходящей окажется именно система на основе внутриклеточного флуоресцентного белка.

4.10. Анализ активности промотора гена АОХ1 P. pastoris с использованием дрожжей S. cerevisiae

Одним из подходов к изучению механизмов регуляции в клетке является использование модельных объектов. Дрожжи S. сerevisiae являются близкородственными с дрожжами P. pastoris, но при этом изучены в большей степени (Hahn & Young, 2011). Поэтому в данной работе мы использовали дрожжи S. сerevisiae в качестве гетерологичного хозяина для изучения механизмов регуляции гена АОХ1. Для этого на основе вектора pRS425 была создана плазмида, содержащая репортерный ген PHO5 КФ дрожжей S. сerevisiae под контролем промотора гена AOX1 P. pastoris (Рис. 36). Последовательность

РА0Х1-РН05 была получена в ходе ПЦР с праймерами FAOX1 и RPHO5 с плазмидой рР1С9-А0Х1-РН05 в качестве матрицы. Её встраивание в вектор pRS425 проводили по двум сайтам клонирования - PstI и NotI.

Рисунок 36. Основные этапы конструирования плазмиды pRS425-PAOX1-РН05, содержащей кодирующую последовательность гена РН05 под контролем промотора гена АОХ1.

Плазмидой pRS425-PAOX1-PHO5 трансформировали штамм дрожжей X cerevisiae. В связи с тем, что плазмида pRS425-PAOX1-PHO5 содержит маркерный ген LEU2, трансформанты отбирали на селективной среде по восстановлению способности синтезировать лейцин. Активность КФ у

LEU2

Атр'

трансформантов анализировали с использованием сред, содержащих глюкозу или глицерин в качестве источника углерода.

Показано, что у полученных трансформантов активность КФ появляется только на среде с глицерином в качестве источника углерода в результате индукции промотора АОХ1 (Табл. 8). Это свидетельствует о том, что в отличие от P.pastoris у S. cerevisiae глицерин не репрессирует промотор гена АОХ1. Интересно, что глицерин не репрессирует гены метаболизма метанола у некоторых других метилотрофных дрожжей, в частности H. polymorpha (Hartner & Glieder, 2006).

Таблица 8.

Активность КФ на средах различного состава у штамма 1-GRF18 и трансформанта 1-GRF18, несущего генетическую конструкцию pRS425-PAOX1-PHO5.

Среда

Md с

глюкозой

Md с глицерином

Наличие активности КФ у штаммов

1-GRF18

1-GRF18/pRS425-

PAOX1-PHO5

Был исследован характер экспрессии репортерного гена PHO5 под контролем промотора АОХ1 у полученных трансформантов X cerevisiae в средах с глицерином и разными источниками азота (Рис. 37).

Рисунок 37. Удельная активность КФ Р^5р (OD410/OD550), секретируемой штаммом X cerevisiae, несущим плазмиду pRS425-PAOX1-PHO5, при его

выращивании в средах MG с глицерином и разными источниками азота. Достоверных различий удельной активность КФ не наблюдали.

Не было выявлено статистически значимых различий в активности и КФ и, следовательно, в регуляции промотора гена AOX1 при его работе в гетерологичном хозяине - дрожжах X сerevisiae. Это свидетельствует о том, что регуляция активности гена AOX1 источником азота в среде является отличительной чертой дрожжей P. pastoris и её наличие возможно связано именно с особенностями метаболизма метилотрофных дрожжей.

4.11. Влияние концентрации фосфата в среде на активность промоторов

генов АОХ1 и АОХ2

Результаты предыдущих исследований показали, что сульфат аммония и глутамин являются лучшими источниками азота для обеспечения экспрессии генов метаболизма метанола и, в частности, АОХ1. Известно, что на экспрессию некоторых генов метаболизма азота и углерода влияет уровень неорганического

фосфата. Поэтому мы иследовали влияние концентрации ортофосфата на экспрессию генов метаболизма метанола. Для этого использовали среды с сульфатом аммония и различными концентрациями фосфата.

Оценили наличие регуляции промотора АОХ1 в зависимости от концентрации ортофосфата в среде. Для этого штамм tr2-1-GS115 (р^х his4::PAOX1-PHO5 Н1Ш4) выращивали в средах с метанолом при различных концентрациях ортофосфата в среде в диапазоне от 10 мг/л до 1,5 г/л. При увеличении концентрации фосфата удельная активность КФ возрастает примерно в 1,3 раза при сравнении крайних значений, что свидетельствует о наличии регуляции фосфатом промотора АОХ1 (Рис. 38). Для дальнейших исследований были выбраны две концентрации фосфата, при которых удельная активность КФ статистически достоверно различалась — 30 мг/л и 1000 мг/л.

Далее сравнили активности промоторов генов АОХ1 и АОХ2 при различных концентрациях ортофосфата в среде. Штаммы tr2-1-GS115 (phox his4::PAOX1-РН05 Н1Ш4) и ^3-1^115 (р^х his4::PAOX2-PHO5 Н1Ш4) культивировали 40 часов при концентрациях ортофосфата 30 мг/л и 1000 мг/л, после чего измеряли удельную активность КФ. В качестве источника азота использовали сульфат аммония.

Как видно из рисунка 40, активность КФ штаммов tr2-1-GS115 (р^х his4::PAOX1-PHO5 Н1Ш4) и ^3-1^115 (р^х his4::PAOX2-PHO5 Н1Ш4) при увеличении концентрации ортофосфата увеличивается примерно в два раза.

В

О

О X

аз

sc аз

ее: пз I xi

с; а

5

о

*

мм

0,03 г/л КН2Р04

мм

1 г/л

КН2Р04

* *

tr2-4-GS115 tr3-4-GS115

his4::PA0Xl-PH05 his4::PA0X2-PH05 HIS4 phox HIS4 phox

Рисунок 38. Удельная активность КФ (OD410/OD550) штаммов 1x2-4^8115 (phox his4::PAOX1-PHO5 ИШ4) и tг3-4-GS115 (phox his4::PAOX2-PHO5 ИШ4) в средах с метанолом при концентрациях ортофосфата 30 и 1000 мг/л. Обозначено достоверное различие удельной активности КФ при концентрации ортофосфата 1000 мг/мл по сравнению с 30 мг/мл (* - р^а1ие < 0,01, ** - р^а1ие < 0,02).

Полученные данные свидетельствуют о том, что на среде с метанолом и сульфатом аммония в качестве источника азота активность промоторов генов АОХ1 и АОХ2 зависит и от концентрации ортофосфата. Уровни экспрессии генов АОХ1 и АОХ2 возрастают с увеличением концентрации ортофосфата в среде.

4.12. Изучение влияния концентрации ортофосфата на экспрессию генов

DAS, FLD, DAK, PpPEX5

Ранее было показано, что гены, кодирующие ферменты метаболизма метанола - AOX1, AOX2, CAT1, DAK, DAS, FLD, FGH, а так же гены, кодирующие белки, вовлеченные в биогенез и функционирование пероксисом PpPEX5,

PpPEX8, PpPEX14 и PpPEXl, координированно реагируют на изменение типа источника азота в среде. Активность всех этих генов подавляется в присутствии пролина, что говорит о сходстве механизмов, обеспечивающих их регуляцию. Для изучения влияния концентрации ортофосфата из этой группы генов были выбраны DAS, FLD, DAK и PpPEX5 и их активность была исследована с помощью метода ПЦР в режиме реального времени. В качестве референсных генов использовали гены АСТ1 и ТВР1, кодирующие актин и белок, связывающийся с ТАТА - последовательностью, соответственно. Исходный штамм GS115 культивировали в средах ММ с метанолом и сульфатом аммония в качестве источника азота. Использовали среды с разными концентрациями ортофосфата -30 и 1000 мг/л. Результаты оценки уровней мРНК исследуемых генов представлены на рисунке 39.

о4

»V

X о_

i ш

0

CL

CJ

Si

1 x¡ с: ш н

(j

0

1

DAS FLD DAK PpPEXS

Рисунок 39. Уровни мРНК генов DAK, DAS, FLD и, PpPEX5 в среде с метанолом, сульфатом аммония и разными концентрациями ортофосфата в среде (30 и 1000 мг/л). Символом * обозначено достоверное различие уровней мРНК

при концентрации ортофосфата 1000 мг/мл по сравнению с 30 мг/мл (для DAS, FLD и PpPEX5 p-value < 0,01, для DAK p-value < 0,05).

Как видно из рисунка 41 уровень экспрессии генов DAS, FLD, PpPEX5 и DAK повышается при увеличении концентрации фосфата в среде. Экспрессия гена DAS возросла в 1,7 раз, гена FLD - в 2 раза, генов DAK и PpPEX5 - 1,5, 1,4 и 1,3 раза, соответственно.

На основании полученных данных можно заключить, что уровень экспрессии генов DAS1, FLD, PpPEX5 и DAK, как и активность промоторов генов АОХ1 и АОХ2 зависит от концентрации фосфата. При этом уровень экспрессии этих генов прямопропорционален концентрации фосфата в среде. Данные гены, кодирующие ключевые ферменты метаболизма метанола и белки пероксисом, координировано регулируются не только источником азота - пролином, но и конценрацией ортофосфата в среде.

4.13. Анализ влияния делеций в промоторе гена АОХ1 на его регуляцию

фосфатом

Для поиска регуляторных элементов в составе последовательности промотора гена AOX1, участвующих в его регуляции в зависимости от концентрации фосфата были использованы созданные ранее штаммы, содержащие репортерный ген РНО5 под контролем усечённых вариантов промотора AOX1. Были выбраны следующие штаммы: trASac/-4-GS115, который содержит делецию 226 нуклеотидов и штамм trAASi/-4-GS115 (делеция 735 н.).

Для оценки влияния делеций промоторной области гена АОХ1 на регуляцию ортофосфатом, штаммы культивировали 40 часов в жидкой среде ММ с метанолом и различными концентрациями ортофосфата, после чего измеряли удельную активность КФ. В качестве контроля использовали штамм tr2-4-GS115 (phox his4::PAOX1-PHO5 H/S4) с полным промотором. Результаты представлены на рисунке 40.

§

О X

СП ^

£ 2 го ск го

X £

£ о

ММ

0,03 г/л КН2РО4

ММ 1 г/л КН2РО^

1x24- \xLSacI- \xLNsiI--65115 4-55115 4-65115

Рисунок 40. Удельная активность КФ (OD410/OD550) штаммов, несущих делеционные варианты промотора АОХ1 при культивировании в средах с метанолом и различными концентрациями ортофосфата (30 и 1000 мг/л). Символом * обозначено достоверное различие удельной активности КФ при концентрации ортофосфата 1000 мг/мл по сравнению с 30 мг/мл (р^а!ие < 0,01).

У штамма с делецией, затрагивающей область -997-771,

удельная активность КФ возрастает примерно в 3 раза при концентрации фосфата 30 мг/л и почти в 1,5 раза при концентрации 1000 мг/л по сравнению с контролем. Так же меняется регуляция: при полном промоторе экспрессия КФ выше при концентрации фосфата 1000 мг/л. Следовательно, мы можем говорить о том, что данная область длиной в 266 (-997-771) нуклеотидов необходима для регуляции фосфатом активности промотора гена АОХ1.

При удалении более протяженных участков промотора удельная активность репортерной КФ заметно снижается по сравнению с контролем. О наличии

достоверных отличий в экспрессии промотора гена при таких уровнях активности говорить затруднительно.

4.14. Влияние ингибитора циклинзависимых киназ флавопиридола на уровень активности промотора гена АОХ1

Флавопиридол является специфическим блокатором циклинзависимых киназ, в частности киназы Рho85p, которая является ключевым регулятором метаболизма ортофосфата в клетках дрожжей S. cerevisiae (Carrol et al., 2001, Senderowicz, 1999).

Для определения активной концентрации флавопиридола клетки штамма GS115 высевали разведениями (от 106 до 103 кл/мл) на среду с разным количеством антибиотика. Как видно из рисунка 41, ингибирование роста наблюдается только начиная с концентрации флавопиридола в 100 мкМ. Концентрация 200мкМ была использована для определения влияния флавопиридола на активность промотора гена AOX1.

Рисунок 41. Рост штамма GS115 при различных концентрациях флавопиридола в среде. Треугольником схематично изображено уменьшение концентрации клеток от 106 кл/мл до 103 кл/мл.

Измерение активности промотора АОХ1 при добавлении флавопридола проводили у штамма tr7-GS115 (his4::PAOX1-mRFP НШ4). Так же, как и при добавлении рапамицина, культивирование производилось в два этапа. Результаты показали (рис. 42), что при добавлении флавопиридола достоверная разница в удельной флуоресценции исчезает.

Рисунок 42. Удельная флуоресценция штамма GS115-RFP при добавлении флавопиридола и концентрациях фосфата 30 и 1000 мг/л. Символом * обозначено достоверное различие удельной активности КФ при концентрации 1000 мг/мл по сравнению с 30 мг/мл (р^а1ие < 0.05). При добавлении флавопиридола статистически достоверное различие исчезало (р^а1ие = 0.2).

В контрольной пробе активность промотора гена АОХ1 достоверно различалась (р^а1ие < 0.05) при концентрациях фосфата 30 мг/л и 1000 мг/л. При добавлении флавопиридола статистически достоверное различие исчезало (р-value = 0.2). Стоит также отметить, что, в отличие от воздействия рапамицина, активность в опытной пробе сопоставима по уровню с контрольной.

Таким образом, можно предположить, что у Р. pastoris существует белок, вовлеченный в регуляцию промотора АОХ1 фосфатом, активность которого

ингибируется добавлением флавопиридола. Т.к. флавопиридол связывается с циклинзависимыми киназами (Sedlacec et al, 2001), возможно, этот белок обладает киназной активностью.

4.15. Оптимизация условий культивирования штаммов P. pastoris

Полученный в ходе исследований штамм tr2-4-GS115 (phox his4::PAOX1-PHO5 HIS4) имеет фенотип Mut+, тогда как при синтезе рекомбинантных белков чаще используются Mut штаммы. Поэтому для оптимизации условий культивирования штаммов P. pastoris - продуцентов рекомбинантных белков был создан штамм tr1-4-GS115 (phox aox1::PAOX1-PHO5 HIS4). Для этого трансформировали штамм 4-GS115 плазмидой pPIC9-PHO5, линеариаризованной с помощью рестриктазы BgllI. Такой способ трансформации обеспечивает замещение локуса АОХ1 на репортерную конструкцию и полученные трансформанты будут иметь фенотип Muts. Отобранные клоны были проанализированы с помощью ПЦР и секвенирования. У всех отобранных трансформантов активность КФ проявлялась только при индукции метанолом. Один из них - tr1-4-GS115 (phox aox1::PAOX1-PHO5 HIS4) был использован для дальнейшей работы.

Культивирование штамма tr1-4-GS115 проводили в две стадии: (1) сначала наращивали биомассу, после чего проводили (2) индукцию метанолом. Подобная схема часто используется в биотехнологии при синтезе рекомбинантных белков.

На первом этапе выращивали культуры штамма tr1-4-GS115 в колбах объёмом 100 мл до стационарной фазы в среде MG, содержащей глицерин в качестве источника углерода. Далее переносили клетки в среды для индукции, содержащие 1% метанола и проводили измерение удельной активности КФ в культуре. Максимальные значения удельной активности КФ в культуре достигались после 40 часов индукции.

Данный эксперимент был масштабирован, для чего использовался ферментер объёмом 5 л. Проводили наращивание биомассы штамма tr1-4-GS115 в среде с

глицерином в качестве источника углерода. Через 50 часов роста, когда культура достигала стационарной фазы, проводили индукцию промотора АОХ1 добавлением метанола в среду до концентрации в 1%. Максимальные значения удельной активности КФ у тестерного штамма tr1-4-GS115 Р. pastoris при культивировании в ферментёре достигались всего за 30 часов и были значительно выше, чем при культивировании в колбах малого объёма. Скорее всего, это является следствием более интенсивной аэрации и перемешивания в условиях ферментера.

В ходе дальнейших экспериментов с помощью штамма tr1-4-GS115 подбирали оптимальную схему индукции промотора АОХ1 метанолом, позволяющую получить максимальные значения удельной активности КФ в культуре (рис. 43). Было показано, что повторное добавление метанола для усиления активности промотора АОХ1 выгоднее проводить примерно через 22 часа после первой индукции, когда удельная активность КФ ещё не достигает своих максимальных значений, но уже идёт замедление её роста, что является следствием исчерпания метанола в культуре. При этом на более поздних стадиях культивирования время между индукциями следует сократить ещё больше - до 15 часов.

Рисунок 43. Оптимальная схема индукции синтеза репортерной КФ штаммом tr1-4-GS115 (phox аох1::РАОХ1-РН05 НШ4) добавлением метанола в среду. В

среду добавляется 1% метанола в начале через 22 часа (индукции №1,2,3,4), далее через каждые 15 часов (индукции №5,6,7,8).

Используя подобранную схему индукции промотора АОХ1 метанолом, исследовали влияние источника азота на уровень синтеза рекомбинантного белка в больших объёмах. В качестве источников азота использовали сульфат аммония и мочевину, поскольку было показано, что они не ингибируют активность промотора АОХ1. Выбор мочевины так же был связан с её относительной дешевизной, а так же с тем фактом, что в ряде работ она используется для повышения выхода рекомбинантных белков за счёт их стабилизации. На рисунке 44 приведены результаты оценки удельной активности КФ при культивировании штамма tr1-4-GS115 в течение 72 часов в ферментере объёмом 5 л в средах с сульфатом аммония и мочевиной.

Рисунок 44. Сравнение удельных активностей КФ (OD410/OD550), синтезируемой штаммом tr1-4-GS115 при культивировании 72 часа в большом объёме в зависимости от типа источника азота в среде.

Показано, что уровни синтеза КФ при культивировании в больших объёмах использовании мочевины в качестве источника азота сопоставимы с уровнями демонстрируемыми штаммом tr1-4-GS115 при росте в средах с сульфатом аммония. Так же было обнаружено, что при культивировании дрожжей Р. pastoris в среде с мочевиной происходит изменение рН культуры с 6.0 до 9.0.

Далее была проведена оценка влияния различных типов источников азота на продукцию целевого рекомбинантного белка. Для этого был использован штамм y-GS115 (аох1::РАОХ1-^ШЩ НШ4), созданный ранее в лаборатории биохимической генетики. Данный штамм содержит в своём геноме последовательность кДНК структурного гена куриного интерферона-гамма (ИФН-у) под контролем промотора АОХ1. В течение 40 часов нарабатывали биомассу клеток штамма y-GS115 в средах с MG глицерином, после чего индуцировали синтез белка, перенося культуры в среды ММ с метанолом. В качестве источников азота использовали сульфат аммония, пролин, мочевину и пептон. Индукцию проводили в течение 60 часов, добавляя 1% метанола через каждые 22 часа. Затем центрифугировали клетки и отбирали 15 мл среды, содержавшей секретированный штаммом-продуцентом ИФН-у. Среду переносили в диализные мешки, которые затем помещали в сефадекс. Концентрирование белка проводили в течение 24 часов за счёт адсорбции воды из диализного мешка. Для того чтобы убрать остатки токсичного метанола пробы помещали в буфер ТЕ рН 8.0. После 10 часов диализа пробы разводили до одинаковых объёмов - 2 мл.

На следующем этапе проводили культивирование клеток первичных фибробластов курицы. К пробам добавляли равные объёмы (100 мкл) растворов ИФН-у, синтезированного в средах с разними источниками азота. После 24 часов культивирования проводили выделение тотальной РНК, которую затем использовали для постановки реакции обратной транскрипции и проведения ПЦР в режиме реального времени.

В качестве мишеней были выбраны гены, экспрессия которых индуцируется в ответ на интерфероны. Один из них - РКК, кодирует дцРНК-зависимая протеинкиназу, которая фосфорилирует фактор инициации трансляции эукариот

еГР2 и участвует в обеспечении противовирусного действия интерферона, служит посредником при активации транскрипции генов, экспрессия которых зависит от интерферона (Окитига et а1., 2013). Еще одним геном, активность которого индуцируется интерфероном, является ген OASL 2'-5'-олигоаденилатсинтетазы. Так же использовали ген МХ1, который кодирует интерферон-индуцируемую ГТФ-азу. Оценка уровня экспрессии гена МХ1 человека используется в клинических исследованиях в качестве маркера дифференциации вирусных и бактериальных инфекций, а также надежного маркера для оценки биодоступности интерферонов I типа (УеАеМ et а1, 2013). Ген глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) использовали в качестве референсного.

Результаты, представленные на рисунке 45, показывают, что в присутствии ИФН-у курицы уровень экспрессии генов PKR, OASL и МХ1 относительно контрольного гена GAPDH возрастает по сравнению с контрольным образцом, содержащим белки культуральной среды исходного штамма.

Рисунок 45. Относительные уровни мРНК генов PKR, OASL и МХ1 в клетках КЭФ в присутствии рекомбинантного интерферона курицы ИФН-у, синтезированного с помощью штамма y-GS115 в средах с сульфатом аммония,

пептоном или пролином. В качестве контроля использовали среду, в которой культивировали исходный штамм GS115, не синтезирующий интерферон. Символом * обозначено достоверное различие удельной активности КФ (р^а1ие < 0.05).

Уровни экспрессии исследуемых генов были максимальными в пробах, в которые был добавлен рекомбинантный интерферон курицы, синтезированный при культивировании штамма y-GS115 в средах с сульфатом аммония. Добавление в среду для синтеза белка пролина или пептона приводило к снижению уровня синтеза белка, что в итоге приводило к низким уровням экспрессии генов индуцированных интерфероном в культурах фибробластов курицы.

Полученные результаты имеют важное практическое значение для биотехнологии. Добавление пептона в среду для культивирования шаммов продуцентов является одним из способов снижения уровня протеолиза рекомбинантного белка. Пролин так же в ряде случаев добавляют в среды для синтеза белков в качестве агента, позволяющего снизить стрессорное воздействие, оказываемое на клетки штамма-продуцента синтезируемым белком.

5. Заключение

У бактерий согласованная экспрессия генов метаболических путей достигается на уровне транскрипции за счет организации генов в опероны. У эукариот классических оперонов не обнаружено, но гены, кодирующие ферменты одного метаболического пути, как правило, имеют в промоторных областях общие регуляторные последовательности и таким образом формируют регулоны (Johnson & Carlson, 1992). Кроме того, в настоящее время становится очевидным, что существуют надрегулонные механизмы, координирующие экспрессию разных метаболических путей в ответ на изменение условий среды.

В ходе исследования мы показали, что экспрессия генов, кодирующих основные ферменты пути утилизации метанола у P. pastoris (AOX1, AOX2, СAT1, DAK, DAS, FLD, FGH), а так же генов, кодирующие белки, вовлеченные в биогенез и функционирование пероксисом (PpPEX5, PpPEX8, PpPEX14 и PpPЕХ1), строго регулируется в зависимости от типа источника азота в среде. Для всех исследованных генов наблюдается репрессия в средах с пролином, а для гена AOX1 показано так же снижение активности в средах с глутаматом и аспарагином. Обнаруженная регуляция предположительно осуществляется на транскрипционном уровне за счёт изменения активности промоторов MUT- и PEX- генов.

Поскольку наличие пролина в среде изменяет экспрессию ключевых PEX-генов, следует ожидать, что его действие проявится на уровне самих пероксисом. Метилотрофные дрожжи зарекомендовали себя как удобный модельный объект для изучения этих клеточных органелл (Cregg et al., 1993). Однако в основном исследования затрагивали механизмы индукции их биогенеза метанолом и пексофагии при появлении богатых источников углерода. Дальнейшие исследования с использованием пролина и других аминокислот позволят выявить новые аспекты тонкой регуляции функционирования этих органелл при изменении условий среды.

У дрожжей основные этапы утилизации пролина локализованы в матриксе митохондрий. В ряде исследований были показано наличие взаимодействия

пероксисом и митохондрий внутри клетки. В частности у X сerevisiae в процессах деления этих органелл участвуют одни и те же белки ^пт1р и Fis1p). Так же была показана возможность их прямого физического контакта (К1ескег et а1., 2014). Однако подобные исследования у Р. pastoris оказываются сильно затруднены, поскольку эти дрожжи являются облигатными аэробами и не способны существовать без митохондрий. Полученные в нашей работе данные о влиянии пролина на активность генов пероксисом открывают новый подход к изучению координированной регуляции пероксисом и митохондрий у дрожжей.

Обработка клеток Р. pastoris рапамицином приводила к полному исчезновению регуляции промотора АОХ1 на средах с разными источниками азота. Это позволяет предположить, что Тог-киназа играет ключевую роль в установлении подобной регуляции. Добавление рапамицина приводило к увеличению активности промотора АОХ1 в средах ММ с пролином до уровней, наблюдаемых в средах с сульфатом аммония в качестве источника азота. Можно сделать вывод, что промотор гена АОХ1 регулируется пролином за счёт механизмов репрессии.

Делеции различной протяженности в составе промотора гена АОХ1 изменяли его активность, но не влияли на его регуляцию пролином. Делеция в участке от -168 до -98 н. приводила к столь сильному снижению активности промотора, что не удалось получить достоверных различий между результатами измерения его активности в средах ММ с сульфатом аммония и пролином. Это связано с тем, что данный фрагмент промотора АОХ1 содержит сайты связывания белка Мхг1 и является критичным для его индукции метанолом. Таким образом участок С промотора АОХ1 оказался достаточен для репрессии его активности в средах с пролином. Можно предположить, что репрессия промотора осуществляется либо за счёт регуляции активности самого белка Мхг1, либо за счёт связывания некоего ТФ, распознающего те же последовательности, что и Мхг1, но являющегося репрессором. Косвенным подтверждением этих предположений могут служить результаты, полученные с помощью репортерных систем, содержавших ген КФ под контролем промоторов АОХ1 и АОХ2. Несмотря на то, что последовательности этих

промоторов абсолютно различны, их регуляция пролином осуществляется сходным образом.

Недавно был обнаружен белок 14-3-3, который регулирует активность Мхг1р у P. pastor is, и ингибирует экспрессию MUT- и PEX- генов. Этот белок является гомологом белка Bmh1 дрожжей S. cerevisiae, который участвует в обеспечении ретроградной регуляции в клетке и работе рапамицин-чувствительных сигнальных путей (Parua et al, 2012). Другим кандидатом на роль белка, осуществляющего репрессию MUT- и PEX- генов в средах с пролином является недавно обнаруженный белок Rop1, являющийся репрессором фосфоенолпируваткарбоксилазы. Показно, что данный белок осуществляет репрессию генов, вовлеченных в метаболизм метанола в полных средах содержащих пептон и дрожжевой экстракт. Данный белок распознаёт тот же сайт связывания в составе промотора АОХ1, что и транскрипционный активатор Mxr1 и конкурирует с ним (Kumar & Rangarajan, 2012).

Помимо наличия регуляции MUT- и PEX- генов источником азота было обнаружено, что экспрессия этих генов так же изменяется в ответ на дефицит ортофосфата в среде. Активность генов АОХ1, АОХ2, DAK, DAS, FLD и PpPEX5 возрастает в средах с высокими концентрациями ортофосфата. Анализ активности репортерной КФ у штаммов, содержавших делеции различной протяженности в составе промотора гена АОХ1 показал, что делеция области, ограниченной сайтом рестрикции SacI изменяет его регуляцию в зависимости от концентрации ортофосфата.

У дрожжей S. œrevisiae ключевую роль в регуляции метаболизма фосфора играет циклинзависимая киназа Pho85p. При этом одной из мишеней Pho85p является упомянутый ранее белок Bmh1 (регуляторный белок 14-3-3) (Sopko et al., 2006).

На рисунке 46 представлена модель регуляции экспрессии гена АОХ1 у P. pastoris построенная исходя из данных, полученных в данной работе.

Рисунок 46. Модель регуляции экспрессии MUT- и PEX- генов у P. pastoris в зависимости от типа источника азота и концентрации ортофосфата в среде. 1) В средах с метанолом добавление глутамата или пролина приводит к снижению активности промоторов MUT- и PEX- генов. Участок от -168 до -98 н. в промоторе АОХ1 достаточен для обеспечения его регуляции пролином. Данная регуляция осуществляется на уровне транскрипции по механизму репрессии. Предположительно в роли репрессоров могут выступать белок семейства 14-3-3 (гомолог белка Bmh1 дрожжей S. cerevisiae) или ТФ Rop1p. Ключевую роль в передаче сигнала о наличие пролина в среде играет Tor-киназа. У S. cerevisiae она участвует в обеспечении регуляции генов азотного метаболизма, генов, кодирующих ферменты цикла Креббса, а так же генов, чьи белковые продукты

вовлечены в функционирование митохондрий. Полученные нами данные о репрессии PEX- генов P. pastoris пролином, который метаболизируется в митохондриях, позволяют предположить наличие координированной регуляции митохондрий и пероксисом у этих дрожжей. При этом ключевую роль в обеспечении подобной регуляции играет Tor-киназа. 2) В средах с высокими концентрациями ортофосфата активность промотора АОХ1 возрастает. Таким образом недостаток ортофосфата является лимитирующим фактором, регулирующим активность генов метаболизма метанола у P. pastoris. Участок промотора АОХ1 от -997 до -771 н. связан с его регуляцией ортофосфатом. Эксперименты с использованием ингибитора флавопиридола позволяют предположить, что в обеспечение данной регуляции у дрожжей P. pastoris вовлечена циклинзависимая киназа.

Метилотрофные дрожжи P. pastoris широко используются в биотехнологии для синтеза белков различного происхождения. При этом очень важно иметь возможность поддерживать оптимальный баланс между уровнями экспрессии гетерологичного гена, ростом и жизнеспособностью клеток дрожжей. Для решения этих задач важно понимание молекулярных механизмов, обеспечивающих регуляцию генов у P. pastoris. Наши результаты показали, что дрожжи P. pastoris обладают сигнальной системой, которая координированно регулирует экспрессию генов ферменов метаболизма метанола и генов, кодирующих белки пероксисом. Эта система не только реагирует на изменение источника азота в среде, но и обеспечивает оптимальные уровни экспрессии MUT- и PEX- генов в средах с различными концентрациями ортофосфата. Всё это позволяет предположить, что данные гены формируют регулон.

6. Выводы

1. Экспрессия MUT-генов (АОХ1,2, САТ, DAK, DAS1, FLD и FGH), а так же PEX-генов (PpPEX5, PpPEX8, PpPEX14, и PpPEXl) зависит от типа источника азота в среде. Репрессия MUT- и PEX-генов наблюдается в средах с пролином и глутаматом.

2. Уровни экспрессии генов MUT-генов (AOX1, AOX2, DAS, DAK, FLD), а так же PEX-генов (PpPEX5) зависят от концентрации фосфата в среде и возрастают по мере её увеличения.

3. Анализ промотора AOX1 выявил участки, необходимые для его регуляции источником азота и концентрацией фосфата. Участок промотора от -168 до -98 н. достаточен для установления его регуляции в зависимости от типа источника азота. Участок от -997 до -771 н. важен для установления его регуляции в зависимости от концентрации фосфата в среде.

4. Изучение влияния ингибиторов киназ рапамицина и флавопиридола на регуляцию промотора гена АОХ1 азотом и фосфатом позволяет предположить участие в Тог и циклинзависимых киназ в этих процессах.

5. MUT- и PEX-гены, кодирующие ферменты, участвующие в метаболизме метанола и белки пероксисом, координировано регулируются в ответ на изменение типа источника азота и изменение концентрации фосфата и формируют регулон.

7. Список используемых сокращений

В настоящей работе приняты следующие сокращения: Arg - аргинин;

(NH4)2SO4 , NH4+ - сульфат аммония, аммоний; Glu - глутаминовая кислота, глутамат; Gln - глутамин;

Mut+ - methanol utilization plus, фенотип P. pastoris, характеризующийся нормальным ростом на среде с метанолом;

s

Mut - methanol utilization slow, замедленный рост на среде с метанолом; Mut- - methanol utilization minus, отсутствие роста на среде с метанолом; Urea - мочевина; Pi - ортофосфат; Pro - пролин;

НАД+ - никотинамидадениндинуклеотид;

НАДФ+ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат;

NCR - nitrogen catabolite repression, азотная катаболитная репрессия;

P5C - пирролин-5-карбоксилат

КФ - кислая фосфатаза;

п.о., т.п.о. - пар оснований, тысяч пар оснований; н. - нуклеотидов;

ПЦР - полимеразная цепная реакция; ТФ - транскрипционный фактор; ФАД - флавинадениндинуклеотида; ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота.

8. Список цитируемой литературы

1. Гланц, С. Б. Медико - биологическая статистика / С. Б. Гланц. - М.: Практика, 1998. - 459 с.

2. Ермилова, Е.В. Количественный анализ экспрессии генов / Е.В. Ермилова, Ж.М. Залуцкая, Т.В. Лапина, М.Ф.Шишова. - СПб.:Тесса, 2011. - 122 с.

3. Захаров, И.А. Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов / И. А. Захаров, С.А. Кожин, Т.Н. Кожина. - Л.: Наука, 1984. - 142 с.

4. Кожин, С.А. Изучение генетического контроля экспрессии генов, контролирующих синтез кислых фосфатаз у дрожжей / С.А. Кожин, М.Г. Самсонова, Е.В. Самбук // Исследования по генетике.- 1986. - Т. 10. - С. 41-52.

5. Кожин, С.А. Сравнительная генетика неспецифических фосфомоноэстераз у микроорганизмов / С.А. Кожин, М.Д. Тер-Аванесян // Исследования по генетике. - 1979. - Вып. 8. - С. 89-09.

6. Кулаев, И.С. Биохимия молекулярных полифосфатов / И.С. Кулаев. - М.: МГУ. - 1975. - 231 с.

7. Маниатис, Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. - М.: Мир. - 1984. - 480 с.

8. Музаев, Д.М., Новые штаммы дрожжей Р^Ша pastoris - продуценты гетерологичных белков / Д.М. Музаев, А.М. Румянцев, Е.В. Самбук, М.В. Падкина // Экологическая генетика. - 2015. - Вып. 13. - С. 10-15.

9. Остерман, Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот / Л.А. Остерман. - М.: МЦНМО. - 2002. - 248с.

10. Падкина, М.В. Генетико-биохимическое изучение кислых фосфатаз дрожжей. Характеристика кислых фосфатаз разных штаммов / М.В. Падкина, Н.Г. Краснопевцева, М.Г. Петрашень // Генетика. - 1974. - Т.10. - С. 100-111.

11. Подгорский, В.С. Физиология и метаболизм метанолусваивающих дрожжей / В.С. Подгорский, под ред. Е.И. Квасникова. - Киев: Наукова Думка. - 1982. -152 с.

12. Румянцев, А.М. Влияние источника азота на экспрессию генов, контролирующих первые этапы утилизации метанола у дрожжей Pichia pastoris / А.М. Румянцев, М.В. Падкина, Е.В. Самбук // Генетика . - 2013 . - Т. 49. - С. 454-460.

13. Савинов, В.А. Создание тест-системы для изучения генетического контроля регуляции гена алкогольоксидазы 1 дрожжей Pichia pastoris / В.А. Савинов, А.М. Румянцев, Е.В. Самбук, М.В. Падкина // Вестн. СПб. Ун-та. - 2009. -Сер. 3., Вып. 4. - С. 114-119.

14. Самбук, Е.В. Генетический контроль координированной регуляции метаболизма основных биогенных элементов у дрожжей Saccharomyces serevisiae: дис. ... докт. биол. наук / Самбук Елена Викторовна - Спб., 2006.

15. Самбук, Е.В. Дивергенция экспрессии паралогов PHO3, PHO5, PHO11, PHO12 дрожжей S. cerevisiae - механизм эволюции мультигенных семейств / Е.В. Самбук, М.В. Падкина // Экологическая генетика. - 2013. - Т. 11, №4. - С. 3444.

16. Самсонова, М.Г. Генетико-биохимическое изучение кислых фосфатаз дрожжей Saccharomyces cerevisiae / М.Г. Самсонова, М.В. Падкина, Н.Г. Краснопевцева // Генетика. - 1975. - Т. 11, № 9. - С. 104-115.

17. Троценко, Ю.А. Аэробные метилотрофы - перспективные объекты современной биотехнологии / Ю.А. Троценко, М.Л. Торгонская // Журнал Сибирского Государственного Университета. - 2012. - Сер. 3, №5. - С. 243279.

18. Урбах, В.Ю. Математическая статистика для биологов и медиков / В.Ю. Урбах. - М.: Изд. Академии наук СССР, 1963. - 324 с.

19. Физикова, А.Ю. Наследование митохондрий у дрожжей Saccharomyces serevisiae / А.Ю. Физикова. // Цитология. - 2011. - Т. 53, №5. - С. 383 - 391.

20.Anthony, C. The biochemistry of methylotrophs/ C. Anthony // Academic Press. -1982. - V. 17. - 254 p.

21. Barnes, W.M. Plasmid detection and sizing in single colony lysates / W.M. Barnes // Science. - 1977. - V. 195(4276). - P. 393-394.

22.Barr, K. A. Protocol for efficient secretion of HSA developed from Pichia pastoris/ K. A. Barr, S. A. Hopkins, K. Sreekrishna // Pharm. Eng. - 1992. - V. 12. - P. 4851.

23. Beers, F. R. A spectrophotometry method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase/ F. R. Beers, I. W.Sizer // J. Biol. Chem. - 1951. - V. 195. - P. 133-140.

24. Beeser, A.E. The dual-specificity protein phosphatase Yvh1p regulates sporulation, growth, and glycogen accumulation independently of catalytic activity in Saccharomyces cerevisiae via the cyclic AMP-dependent protein kinase cascade/ A.E. Beeser, T.G. Cooper // J. Bacteriol. - 2000. - V. 182, № 12. - P. 3517-3528.

25. Bellu, A.R. Glucose-induced and nitrogen-starvation-induced peroxisome degradation are distinct processes in Hansenula polymorpha that involve both common and unique genes/ A. R. Bellu, A. M. Kram, J. A. Kiel, M. Veenhuis, I. J. Van der Klei // FEMS Yeast Research. - 2001. - V. 1. - P. 23-31.

26. Berben, G. Studies on the structure, expression and function of the yeast regulatory gene PHO2/ G. Berben, M. Legrain, F. Hilger // Gene. - 1988. - V. 66(2). - P. 30712.

27. Bergwitz, C. Phosphate sensing/ C. Bergwitz, M. Jüppner // Adv Chronic Kidney Dis. - 2011. - V. 18, № 2. - P.32-144.

28. Blanco, P. Production of pectic enzymes in yeasts/ P. Blanco, C. Sieiro, T.G. Villa // FEMS Microbiol. Lett. - 1999. - V. 175. - P. 1-9.

29. Blumberg, H. Regulation of expression and activity of the yeast transcription factor ADR1/ H. Blumberg, T.A. Hartshorne, E.T. Young // Mol. Cell. Biol. - 1988. - V. 8. - P. 1868-1876.

30. Botstein, D. Yeast as a Model Organism / D. Botstein, S.A. Chervitz, J.M. Cherry // Science. - 1997. - V. 277(5330). - P. 1259-1260.

31. Bradford, M.M. Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding/ M.M. Bradford // Anal. Biochem. - 1976. - V. 72. - P. 248-254.

32. Bun-ya, M., The PHO84 gene of Saccharomyces cerevisiae encodes an in- organic phosphate transporter/ M. Bun-ya, M. Nishimura, S. Harashima, Y. Oshima // Mol. Cell. Biol. - 1991. - V. 11. - P. 3229-3238.

33. Busti, S. Glucose signaling-mediated coordination of cell growth and cell cycle in Saccharomyces cerevisiae / S. Busti, P. Coccetti, L. Alberghina // Sensors. - 2010. -V. 10. - P. 6195-6240.

34. Cardenas, M.E. The TOR signaling cascade regulates gene expression in response to nutrients / M.E. Cardenas, N.S. Cutler, M.C. Lorenz // Genes Dev. - 1999. - V. 13, № 24. - P. 3271-3279.

35. Carroll, A. S. Pho85 and signaling environmental conditions / A. S. Carroll, E. K. O'Shea // Trends in bioch. sc. - 2002. - V. 27(2). - P. 87-93.

36. Celik, E. Production of recombinant proteins by yeast cells / E. Celik, P. Calik // Biotechnology Advances. - 2012. - V. 30. - P. 1108-1118.

37. Cereghino, J.L. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris/ J.L. Cereghino, J.M. Cregg// FEMS Microbiol. Rev. - 2000. - V.24. -P.45-66.

38. Cereghino, G.P.L. Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast, Pichia pastoris/ G.P.L. Cereghino, J.L. Cereghino, C. Ilgen, J.M. Cregg // Curr. Opinion Biotechnol. -2002. - V. 13. - P. 329-332.

39. Cherry, J.R. Cyclic AMP-dependent protein kinase phosphorylates and inactivates the yeast transcriptional activator ADR1 / J.R. Cherry, T.R. Johnson, J.R. Dollard et al.// Cell. -1989. - Vol. 56. - P. 409-419.

40. Chi, Z. M. Gene expression and invertase secretion in yeasts / Z. M. Chi, J. F. Li, X. H. Wang et al.// Acta Biochimica et Biophysica Sinica. - 2004. - V. 36. - P. 443-449.

41. Chistoserdova, L. Modularity of methylotrophy, revisited / L. Chistoserdova // Environmental Microbiology. - 2011. - V. 13 №10. - P. 2603 - 2622.

42. Chung, B.K. Genome-scale metabolic reconstruction and in silico analysis of methylotrophic yeast Pichia pastoris for strain improvement / B.K. Chung, S. Selvarasu, C. Andrea et al.// Microb. Cell Fact. - 2010. - V. 9.

43. Ciriacy, M. Genetics of alcohol dehydrogenase in Saccharomyces cerevisiae. II. Two loci controlling synthesis of the glucose repressible ADHII / M. Ciriacy // Mol. Gen. Genet. - 1975. - V. 138. - P. 157-164.

44. Coffman, J.A. Cross regulation of four GATA factors that control nitrogen catabolic gene expression in Saccharomyces cerevisiae/ J.A. Coffman, R. Rai, D.M. Loprete et al.// J. of Bacteriol. - 1997. - V. 179, № 11. - P. 3416-3429.

45. Conrad, M. Nutrient sensing and signaling in the yeast Saccharomyces cerevisiae / M. Conrad, J. Schothorst, H.N. Kankipati, G. Van Zeebroeck, M. Rubio-Texeira, J.M. Thevelein // FEMS Microbiol Rev. - 2014. - V. 38(2). - P. 254-299.

46. Cook, W. J. Identification of three genes required for the glucose-dependent transcription of the yeast transcriptional activator ADR1 / W. J. Cook, C. L. Denis // Curr. Genet. - 1993. - Vol. 23. - P. 192-200.

47. Cooper, T.G. Structural analysis of the dur loci in S. cerevisiae: two domains of a single multifunctional gene / T.G. Cooper, C. Lam, V. Turoscy // Genetics. - 1980. - V. 94, № 3. - P. 555-580.

48. Couderc, R. Oxidation of methanol by the yeast Pichia pastoris: purification and properties of alcohol oxidase/ R. Couderc, J. Baratti // Agric. Biol. Chem. - 1980. -V. 44. - P. 2279-2289.

49. Cox, K.H. Gln3 phosphorylation and intracellular localization in nutrient limitation and starvation differ from those generated by rapamycin inhibition of Tor1/2 in Saccharomyces cerevisiae/ K.H. Cox, A.A. Kulkarni, J.J. Tate // J. Biol. Chem. -2004. - V. 279, № 11. - P. 10270-10278.

50. Crabtree, H.G. The carbohydrate metabolism of certain pathological overgrowths /

H.G. Crabtree // Biochem J. - 1928. - V.22,(5). - P. 1289-98.

51. Creasy, C. Negative transcriptional regulation of PH081 expression in Saccharomyces cerevisiae / C. Creasy, D. Shao, L. Bergman // Gene. - 1996. - V. 168 - P. 23-29.

52. Cregg, J.M. Pichia pastoris as a host system for transformations/ J.M. Cregg, K.J. Barringer, A.Y. Hessler, K.R. Madden // Mol.Cell Biol. - 1985. - V. 5(12). - P. 3376-3385.

53. Cregg, J.M. Functional characterization of the two alcohol oxidase genes from the yeast Pichia pastoris/ J.M. Cregg, K.R. Madden, K.J. Barringer, G. Thill, C.A. Stillman // Mol. Cell Biol. - 1989. - V. 9. - P. 1316-1323.

54. Cregg, J.M. Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris/ J.M. Cregg, T.S. Vedvick, W.C. Raschke // Biotechnology. - 1993. - V. 11. - P. 905-910.

55. Crespo, J.L.The TOR-controlled transcription activators GLN3, RTG1, and RTG3 are regulated in response to intracellular levels of glutamine/ J.L. Crespo, T. Powers, B. Fowler, M.N. Hall // Proc. Natl. Acad. Sci. - 2002. - V. 99. - P. 6784-6789.

56. Cunningham, T.S. Expression of the DAL80 gene, whose product is homologous to the GATA factors and is a negative regulator of multiple nitrogen catabolic genes in Saccharomyces cerevisiae, is sensitive to nitrogen catabolite repression/ T.S. Cunningham, T.G. Cooper // Mol. and Cell. Biol. - 1991. - V. 11, № 12. - P. 62056215.

57. David, M. Development of genetic maps of non-conventional yeasts / M. David, J. Ogrydziak // Journal of Basic Microbiology. - 1988. - V. 28(3). - 185-196.

58. De Virgilio, C. Cell growth control: little eukaryotes make big contributions/ C. De Virgilio, R. Loewith // Oncogene - 2006. - V. 25. - P. 6392-6415.

59. De Schutter, K. Genome sequence of the recombinant protein production host Pichia pastoris/ K. De Schutter, Y.C. Lin, P. Tiels, A. Van Hecke, S. Glinka, J. Weber-Lehmann, P. Rouze, Y. Van de Peer, N. Callewaert // Nat. Biotechnol. -

2009. - V. 27. - P. 561-566.

60. Di Como, C.J. Nutrients, via the Tor proteins, stimulate the association of Tap42 with type 2A phosphatases/ C.J. Di Como, K.T. Arndt // Genes Dev. - 1996. - V. 10. - P. 1904-1916.

61. Douma, A. C. Dihydroxyacetone synthase is localized in the peroxisomal matrix of methanol-grown Hansenula polymorpha/ A. C. Douma, M. Veenhuis, W. De Koning, M. Evers, W. Harder // Arch. Microbiol. - 1985. - V. 143. - P.237-243.

62. Dragosits, M. The effect of temperature on the proteome of recombinant Pichia pastoris/ M. Dragosits, J. Stadlmann, J. Albiol, K. Baumann, M. Maurer, B. Gasser, M. Sauer, F. Altmann, P. Ferrer, D. Mattanovich // J. Proteome Res. - 2009. - V. 8.

- P.1380-1392.

63. Dubouloz, F. The TOR and EGO protein complexes orchestrate microautophagy in yeast/ F. Dubouloz, O. Deloche, V. Wanke, E. Cameroni, C. De Virgilio // Mol. Cell

- 2005. - V. 19. - P. 15-26.

64. Duvel, K. The role of phosphatases in TOR signaling in yeast/ K. Duvel, J.R. Broach / K. Duvel // Curr. Top. Microbiol. Immunol. - 2004. - V. 279. - P. 19-38.

65. Eisen, A. The yeast regulatory protein ADR1 binds in a zinc-dependent manner to the upstream activating sequence of ADH2 / A. Eisen, W.E. Taylor, H. Blumberg et al.// Mol. Cell. Biol. - 1988. - V. 8. - P. 4552-4556.

66. Elble, R. A simple efficient procedure for transformation of yeast/ R. Elble // Biotechniques. -1992. - V. 13(1). P. - 18-20.

67. Ellis, S.B. Isolation of alcohol oxidase and two other methanol regulatable genes from the yeast Pichia pastoris/ S.B. Ellis, P.F. Brust, P.J. Koutz, A.F. Waters, M.M. Harphold, T.R. Gingeras // Mol. Cell Biol. - 1985. - V. 5. - P. 1111-1121.

68. Entian, K.D. Saccharomyces cerevisiae mutants provide evidence of hexokinase PII as a bifunctional enzyme with catalytic and regulatory domains for triggering carbon catabolite repression / K.D. Entian, K.U. Frohlich // J. Bacteriol. - 1984. - V. 158 .

- P. 29-35.

69. Ferreira, C. A member of the sugar transporter family, Stl1p is the glycerol/H1 symporter in Saccharomyces cerevisiae / C. Ferreira, F. Van Voorst, A. Martins // Mol. Biol. Cell. - 2005. - Vol. 16. - P. 2068-2076.

70. Gancedo, J.M. Yeast carbon catabolite repression / J.M. Gancedo // Microbiol. Mol. Biol. Rev. - 1998. - V. 62. - P. 334-361.

71.Gancedo, J.M. The early steps of glucose signalling in yeast / J.M. Gancedo // FEMS Microbiol. Rev. - 2008. - V. 32. - P. 673-704.

72. Gasser, B. Monitoring of transcriptional regulation in Pichia pastoris under protein production conditions/ B. Gasser, M. Maurer, J. Rautio, M. Sauer, A. Bhattacharyya, M. Saloheimo, M. Penttilä, D. Mattanovich // BMC Genomics. -2007. - V. 19;8. - P.179.

73. Ghillebert, R. Differential roles for the low-affinity phosphate transporters Pho87 and Pho90 in Saccharomyces cerevisiae / R. Ghillebert, E. Swinnen, P. De Snijder, B. Smets, J. Winderickx // The Biochemical journal. - 2011. - V. 434(2). - P. 243251.

74. Goodman, J.M. Dihydroxyacetone synthase is an abundant constituent of the methanol-induced peroxisome of Candida boidinii / J.M. Goodman // J. Biol. Chem. - 1985. - Vol. 260. - P. 7108-7113.

75. Goodman, J.M. Alcohol oxidase assembles post-translationally into the peroxisome of Candida boidinii / J.M. Goodman, C.W. Scott, P.N. Donahue, J.P. Atherton // J. Biol. Chem. - 1984. - Vol. 259. - P. 8485-8493.

76. Guthrie, C. Guide to yeast genetics and molecular biology / C. Guthrie, G.R. Fink // Academic Press. - 1991. - V. 194. - 933 p.

77. Hahn, S. Transcriptional regulation in Saccharomyces cerevisiae: transcription factor regulation and function, mechanisms of initiation, and roles of activators and coactivators / S. Hahn, E.T. Young // Genetics. - 2011. - V. 189. - P. 705-736.

78. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids/ D. Hanahan // J. Mol. Biol. - 1983. - V. 166. - P. 557-580.

79. Hardwick, J.S., Rapamycin-modulated transcription defines the subset of nutrient-sensitive signaling pathways directly controlled by the Tor proteins/ J.S. Hardwick,

F.G. Kuruvilla, J.K. Tong et al.// PNAS. - 1999. - V. 96. - P. 14866-14870.

80. Hartner, F.S. Regulation of methanol utilisation pathway genes in yeasts/ F.S. Hartner, A. Glieder // Microb. Cell. Fact. - 2006. - V. 5. - P. 39-67.

81. Hartner, F.S. Promoter library for fine-tuned gene expression in Pichia pastoris/ F.S. Hartner, C. Ruth, D. Langenegger, S.N. Jonson, P. Hyka, G.P. Lin-Cereghino, J. Lin-Cereghino, K. Kovar, J.M. Cregg, A. Glieder // Nucleic Acids Res. - 2008. -V. 36, № 12. - P. 31-46.

82. Hazeu, W. Methanol assimilation by yeasts / W. Hazeu, J.C. de Bruyn, P. Bos // Arch. Mikrobiol. - 1972. - V. 87. - P. 185-188.

83. Hong, S.P. Activation of yeast Snf1 and mammalian AMP-activated protein kinase by upstream kinases / S.P. Hong, F.C. Leiper, A. Woods et al.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2003. - V. 100. - P. 8839-8843.

84. Hristozova, T., Mutant Hansenula polymorpha strain with constitutive alcohol oxidase and peroxisome biosynthesis/ T. Hristozova, L. Michailova, D. Tuneva, V. Gotcheva, A. Angelov, Z. Roshkova // Z Naturforsch. - 2002. - V. 57. - P. 858862.

85. Hung, G.C. Degradation of the gluconeogenic enzymes fructose-1,6-bisphosphatase and malate dehydrogenase is mediated by distinct proteolytic pathways and signaling events/ G.C. Hung, C.R. Brown, A.B. Wolfe, J. Liu, H.L. Chiang // J Biol Chem. - 2004. - V. 19;279(47). - P. 49138-50.

86. Jiang, R. Glucose regulates protein interactions within the yeast SNF1 protein kinase complex / R. Jiang, M. Carlson // Genes Dev. - 1996. - V. 10. - P. 31053115.

87. Jiang, Y. Tor proteins and protein phosphatase 2A reciprocally regulate Tap42 in controlling cell growth in yeast/ Y. Jiang, J.R. Broach // EMBO J. - 1999. - V. 18. -P. 2782-2792.

88. Johnson, M.A. Positive selection of novel peroxisome biogenesis-defective mutants of the yeast Pichia pastoris / M.A. Johnson, H.R. Waterham, G.P. Ksheminska et al.// Genetics. - 1999. - V. 151. - P. 1379-1391.

89. Johnston, M. Regulation of carbon and phosphate utilization. Mol. And Cell. Biol. of the yeast Saccharomyces cerevisiae: Gene expression / M. Johnston, M. Carlson.

- NY: Cold Spring Harbor, 1992. - P. 283-317.

90. Kaiser, C. Methods in yeast genetics/ C. Kaiser, S. Michaelis, A. Mitchell. - NY: Cold Spring Harbour laboratory press, 1994.

91. Kaniak, A. Regulatory network connecting two glucose signal transduction pathways in Saccharomyces cerevisiae / A. Kaniak, Z. Xue, D. Macool // Eukaryot. Cell. - 2004. - V. 3. - P. 221-231.

92. Kim, S. Regulation of alcohol oxidase 1 ( AOX1 ) promoter and peroxisome biogenesis in different fermentation processes in Pichia pastoris / S. Kim, S. Warburton, I. Boldogh, C. Svensson, L. Pon, T. A. Stadheim, B. Choi // Journal of Biotechnology. - 2013. - V. 166(4). - P. 174-181.

93. Klei, I. J. The significance of peroxisomes in methanol metabolism in methylotrophic yeast / I. J. Van Der Klei, H. Yurimoto, Y. Sakai, M. Veenhuis // Biochimica et Biophysica Acta. - 2006. - V. 1763. - P. 1453-1462.

94. Klein, C.J. Glucose control in Saccharomyces cerevisiae: the role of Mig1 in metabolic functions/ C.J. Klein, L. Olsson, J. Nielsen // Microbiology. - 1998. -V.144. - P. 13-24.

95. Koutz, P. Structural comparison of the Pichia pastoris alcohol oxidase genes / P. Koutz, G.R. Davis, C. Stillman et al.// Yeast. - 1989. - V. 5. - P. 167-177.

96. Kranthi, B.V. Isolation of a single-sranded DNA-binding protein from the methylotrophic yeast, Pichia pastoris and its identification as zeta crystalline / B.V. Kranthi, N. Balasubramanian, P.N. Rangorajan // Nucl. Acids Res. - 2006. - V. 34.

- P. 4060-4068.

97. Kranthi, B.V. Identification of Mxr1p-binding sites in the promoters of genes encoding dihydroxyacetone synthase and peroxin 8 of the methylotrophic yeast Pichia pastoris / B.V. Kranthi, H.R. Kumar, P.N. Rangarajan // Yeast. - 2010. - V. 27. - P. 705-711.

98. Kranthi, B.V. Identification of key DNA elements involved in promoter recognition by Mxr1p, a master regulator of methanol utilization pathway in Pichia pastoris /

B.V. Kranthi, R. Kumar, N.V. Kumar et al. // Biochim. Biophys. Acta. - 2009. - V. 1789. - P. 460-468.

99. Kulkarni, A. Differing responses of Gat1 and Gln3 phosphorylation and localization to rapamycin and methionine sulfoximine treatment in Saccharomyces cerevisiae/ A. Kulkarni, T.D. Buford, R. Rai, T.G. Cooper // FEMS Yeast Res. - 2006. - V. 6 -P. 218-229.

100. Kumar, N.V. The zinc finger proteins Mxr1p and repressor of phosphoenolpyruvate carboxykinase (ROP) have the same DNA binding sSpecificity but regulate methanol metabolism antagonistically in Pichia pastoris / N.V. Kumar, P.N. Rangarajan // J. Biol. Chem. - 2012. - V. 287. - P. 34465-34473.

101. Kurtzman, C. P. Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit (26S) ribosomal DNA partial sequences/ C. P. Kurtzman, C. J. Robnett // Antonie van Leeuwenhoek. - 1998. - V. 73. - P. 331371.

102. Lau, W. A genetic study of signaling processes for repression of PHO5 transcription in Saccharomyces cerevisiae / W.Lau, K.R. Schneider, E.K. O'Shea // Genetics. - 1998. -V. 150. - P.1349-1359.

103. Leao-Helder, A. N. Transcriptional down-regulanion of peroxisome number affects selective peroxisome degradation in Hansenula polymorpha/ A. N. Leao-Helder, A. M. Krikken, I. J. Van der Klei, J. A. Kiel, M. Veenhuis // J. Biol. Chem. - 2003. - V. 278. - P. 40749-40756.

104. Lenburg, M. E. Signaling phosphate starvation/ M. E. Lenburg, E. K. O'Shea // Trends Biochem. Sci. - 1996. - V. 21. - P. 383-387.

105. Lin-Cereghino, G.P. Mxr1p, a key regulator of the methanol utilization pathway and peroxisomal genes in Pichia pastoris / G.P. Lin-Cereghino, L. Godfrey, B.J. De la Cruz et al.// Mol. Cell. Biol. - 2006. - V. 26. - P. 883-897.

106. Lin Cereghino G.P. New selectable marker/auxotrophic host strain combinations for molecular genetic manipulation of Pichia pastoris/ G.P. Lin-Cereghino, J. Lin-Cereghino, A.J. Sunga, M.A. Johnson, M. Lim, M.A. Gleeson, J.M. Cregg // Gene. - 2001. - V. 24;263(1-2). - P. 159-69.

107. Loewith, R. Target of rapamycin (TOR) in nutrient signaling and growth control / R. Loewith, M. N. Hall // Genetics. - 2011. - V. 189(4). - P. 1177-201.

108. Lorberg, A. TOR: the first 10 years / A. Lorberg, M.N. Hall // Curr. Top Microbiol. Immunol. - 2004. - V. 279. - P. 1-18.

109. Lüers, G. H. The Pichia pastoris dihydroxyacetone kinase is a PTS1-containing, but cytosolic, protein that is essential for growth on methanol / G. H. Lüers, R. Advani, T. Wenzel, S. Subramani // Yeast. -1998. - V. 14(8). - P. 759-771.

110. Lutfiya, L.L. Characterization of three related glucose repressors and genes they regulate in Saccharomyces cerevisiae / L.L. Lutfiya, V.R. Iyer, J. de Risi et al. // Genetics. - 1998. - V. 150. - P. 1377-1391.

111. Magasanik, B. Regulation of nitrogen utilization / B. Magasanik // Mol. and Cel. Biol. of the yeast Sacch.: Gene expression. - NY: Cold Spring Harbor, 1992. -P.283-317.

112. Magasanik, B. Nitrogen regulation in Saccharomyces cerevisiae/ B. Magasanik,

C.A. Kaiser // Gene. - 2002. - V. 290. - P. 1-18.

113. Martin, O. Improved anaerobic use of arginine by Saccharomyces cerevisiae/ O. Martin, M.C. Brandriss, G. Schneider et al.// App. and Env. Microbiol. - 2003. - V. 69, № 3. - P. 1623-1628.

114. Marzluf, G.A. Genetic regulation of nitrogen metabolism in the fungi/ G.A. Marzluf // Microb. and Mol. Biol. Rev. - 1997. - V. 61, № 1. - P. 17-32.

115. Mattanovich, D. Recombinant Gene Expression: Reviews and Protocols, Third Edition. Recombinant Protein Production in Yeasts / D. Mattanovich, P. Branduardi, L. Dato, B. Gasser, M. Sauer, D. Porro // Methods in Molecular Biology. - 2012. -V.824. - P. 329 - 358.

116. Mattanovich, D. Genome, secretome and glucose transport highlight unique features of the protein production host Pichia pastoris/ D. Mattanovich, A. Graf, J. Stadlmann, M. Dragosits, A. Redl, M. Maurer, M. Kleinheinz, M. Sauer, F. Altmann, B. Gasser // Microbial Cell Factories. - 2009. - V.8. - P. 29.

117. Mattanovich, D. Open access to sequence: Browsing the Pichia pastoris genome/

D. Mattanovich, N. Callewaert, P. Rouze, Y.C. Lin, A. Graf, A. Redl, P. Tiels, B.

Gasser, K. De Schutter // Microbial Cell Factories. - 2009. - V. 8. - P. 53.

118. Mitchell, A.P. Regulation of glutamine-repressible gene products by the GLN3 function in Saccharomyces cerevisiae/ A.P. Mitchell, B. Magasanik // Mol. Cell Biol. - 1984. - V. 4. - P. 2758-2766.

119. Nakagawa, T. Physiological role of the second alcohol oxidase gene MOD2 in the methylotrophic growth of Pichia methanolica/ T. Nakagawa, T. Mizumura, H. Mukaiyama, T. Miyaji, H. Yurimoto, N. Kato, Y. Sakai, N. Tomizuka // Yeast. -2002. - V. 19. - P. 1067-1073.

120. Nazarko, V.Y. Differences in glucose sensing and signaling for pexophagy between the baker's yeast Saccharomyces cerevisiae and the methylotrophic yeast Pichia pastoris / V.Y. Nazarko, K.O. Futej, J.M. Thevelein et al.// Autophagy. -2008. - V. 4. - P. 381-384.

121. Ogata, K. Yeast capable of utilizing methanol/ K. Ogata, H. Nishikawa, M. Ohsugi // Agric. Biol. Chem. - 1969. - V. 33. - P. 1519-1520.

122. Ohi, H. The positive and negative cis-acting elements for methanol regulation in the Pichia pastoris AOX2 gene / H. Ohi, M. Miura, R. Hiramatsu et al.// Molecular and General Genetics. - 1994. - V. 243. - P. 489-99.

123. Okumura, F. Activation of double-stranded RNA-activated protein kinase (PKR) by interferon-stimulated gene 15 (ISG15) modification down-regulates protein translation/ F. Okumura, A.J. Okumura, K. Uematsu, S. Hatakeyama, D.E. Zhang, T. Kamura // J Biol Chem. - 2013. - V. 288(4). - P. 2839-47.

124. Ozimek, P. Alcohol oxidase: A complex peroxisomal, oligomeric flavoprotein / P. Ozimek, M. Veenhuis, I.J. Van der Klei // FEMS Yeast Res. - 2005. - V. 5. - P. 975-983.

125. Paiva, S. Utilization of green fluorescent protein as a marker for studying the expression and turnover of the monocarboxylate permease Jen1p of Saccharomyces cerevisiae / S. Paiva, A.L. Kruckeberg, M. Casal // Biochem. J. - 2002. - V. 363. -P. 737-744.

126. Parua, P.K. Pichia pastoris 14-3-3 regulates transcriptional activity of the methanol inducible transcription factor Mxr1 by direct interaction / P.K. Parua, P.M.

Ryan, K. Trang, E.T. Young // Molecular Microbiology. - 2012. - V. 85. - P. 28298.

127. Pavlik, P. The glycerol kinase (GUT1) gene of Saccharomyces cerevisiae: cloning and characterization / P. Pavlik, M. Simon, T. Shuster et al.// Curr. Genet. -1993. - V. 24. - P. 21-25.

128. Payne, W.E. An inducible acid phosphatase from the yeast Pichia pastoris: characterisation of the gene and it's product/ W.E. Payne, P.M. Gannon, C.A. Kaiser, // Gene. - 1995. - V. 163, № 1. - P. 19-26.

129. Ptacek, J. Global analysis of protein phosphorylation in yeast/ J. Ptacek, G. Devgan, G. Michaud, H. Zhu, X. Zhu, J. Fasolo, H. Guo, G. Jona, A. Breitkreutz, R. Sopko, et al. // Nature. - 2005. - V. 438. - P. 679-84.

130. Reifenberger, E. Kinetic characterization of individual hexose transporters of Saccharomyces cerevisiae and their relation to the triggering mechanism of glucose repression / E. Reifenberger, E. Boles, M. Ciriacy / Eur. J. Biochem. - 1997. - V. 245. - P. 324-333.

131. Riballo, E. Catabolite inactivation of the yeast maltose transporter occurs in the vacuole after internalization by endocytosis / E. Riballo, M. Herweijer, D.H. Wolf, R. Lagunas // J. Bacteriol. - 1995. - V. 177. - P. 5622-5627.

132. Roa, M. Biosynthesis of peroxisomal enzymes in the methylotrophic yeast Hansenulapolymorpha/ M. Roa, G. Blobel // Proc. Nat. Acad. Sci. - 1983. - V. 80. - P. 6872-6876.

133. Roggenkamp, R. Alcohol oxidase and catalase in peroxisomes of methanol-grown Candida boidinii // Eur. J. Biochem. - 1975. - V. 59. - P. 231-236.

134. Rose, M. Glucose repression in Saccharomyces cerevisiae is directly associated with hexose phosphorylation by hexokinases PI and PII / M. Rose, W. Albig, K.D. Entian // Eur. J. Biochem. - 1991. - V. 199. - P. 511-518.

135. Rossi, B. Hansenula polymorpha NMR2 and NMR4, two new loci involved in nitrogen metabolite repression/ B. Rossi, S. Manasse, F. Serrani, E. Berardi // FEMS Yeast Res. - 2005. - V. 5. - P. 1009-1017.

136. Rumiantsev, A.M. Effect of nitrogen source on gene expression of first steps of methanol utilization pathway in Pichia pastoris / A.M. Rumiantsev, M.V. Padkina, E.V. Sambuk // Genetika. - 2013. - V. 49. - P. 454-460.

137. Ryan, M.T. Mitochondrial-nuclear communications/ M.T. Ryan, N.J. Hoogenraad // Annu Rev Biochem. - 2007. - V. 76. - P. 701-22.

138. Sacksteder, K. A. Peroxisome biogenesis in yeast/ K. A. Sacksteder, S. J. Gould // Annu. Rev. Genet. - 2000. - V. 34. - P. 623-652.

139. Sakai, Y. Environmental response of yeast peroxisomes. Aspects of organelle assembly and degradation/ Y. Sakai, S. Subramani // Cell. Biochem. Biophys. -2000. - V. 32. - P. 51-61.

140. Sambrook, J. Molecalar Cloning - Laboratory manual/ J. Sambrook, E.F. Fritsh, T. Maniatis. - NY: Cold Spring Harbour laboratory press. - 1989.

141. Schuller, H.J. Transcriptional control of nonfermentative metabolism in the yeast Saccharomyces cerevisiae / H.J. Schuller // Curr. Genet. - 2003. - V. 43. - P. 139160.

142. Schutter, K. Genome sequence of the recombinant protein production host Pichia pastoris. / K. Schutter, Y.-C. Lin, P. Tiels, A. Van Hecke, S. Glinka, J. WeberLehmann, N. Callewaert // Nature biotechnology. - 2009. - V. 27(6). - P. 561-6.

143. Senderowicz, A. M. Flavopiridol: the first cyclin-dependent kinase inhibitor in human clinical trials/ A. M. Senderowicz // Investigational new drugs. - 1999. - V. 17(3). - P. 313-20.

144. Shamji, A.F. Partitioning the transcriptional program induced by rapamycin among the effectors of the Tor proteins/ A.F. Shamji, F.G. Kuruvilla, S.L. Schreiber // Curr. Biol. - 2000. - V. 10. - P. 1574-1581.

145. Shen, S. A strong nitrogen source-regulated promoter for controlled expression of foreign genes in the yeast Pichia pastoris/ S. Shen, G. Sulter, T.W. Jeffries, J.M. Cregg // Gene. - 1998. - V. 216. - P. 93-102.

146. Sibirny, A. A. Reactions of direct formaldehyde oxidation to CO# are nonessential for energy supply of yeast methylotrophic growth/ A. A. Sibirny, V. M.

Ubiyvovk, M. V. Gonchar, V. I. Titorenko, A. Y. Voronovsky, Y. G. Kapultsevich, K. M. Bliznik // Arch Microbiol. - 1990. - V. 154. - P. 566-575.

147. Simon, M.M. The Saccharomyces cerevisiae ADR1 gene is a positive regulator of transcription of genes encoding peroxisomal proteins / M.M. Simon, G. Adam, W. Rapatz et al.// Mol. Cell. Biol. - 1991. - V. 11. - P. 699-704.

148. Sopko, R. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression/ R. Sopko, D. Huang, N. Preston, G. Chua, B. Papp, K. Kafadar, M. Snyder, S.G. Oliver, M. Cyert, T.R. Hughes, C. Boone, B. Andrews // Mol Cell. - 2006. - V. 21(3). - P. 319-30.

149. Stanbrough, M. Role of the GATA factors Gln3p and Nil1p of Saccharomyces cerevisiae in the expression of nitrogen-regulated genes/ M. Stanbrough, D.W. Rowen, B. Magasanik // Biochem. - 1995. - V. 92. - P. 9450-9454.

150. Stern, K.G. On the absorption spectrum of catalase / K.G. Stern // J. Biol. Chem. - 1937. - V. 121. - P. 561-572.

151. Tachibana, C. poised initiation complex is activated by SNF1/ C. Tachibana, R. Biddick, G.L. Law, E.T. Young // J Biol Chem. - 2007. - V. 28;282(52). - P. 37308-15.

152. Takagi S, Tsutsumi N, Terui Y, Kong XY, inventors; Novozymes A.S., Bagsvaerd D.K, assignee. Method for methanol independent induction from methanol inducible promoters in Pichia. United States patent US 8,143,023. - 2012.

153. Toh-E, A. PHO85, a negative regulator of the PHO system, is a homolog of the protein kinase gene, CDC28, of Saccharomyces cerevisiae / A. Toh-E, K. Tanaka, Y. Uesono, R.B. Wickner // Mol Gen Genet. - 1988. - V. 214. - P. 162-164.

154. Trumbly, R.J. Glucose repression in the yeast Saccharomyces cerevisiae / R.J. Trumbly // Molecular Microbiology. - 1992. - V. 6. - P. 15-21.

155. Tschopp, J. F. High level secretion of glycosylated invertase in the methylotrophic yeast Pichia pastoris/ J. F.Tschopp, G. Sverlow, R. Kosson, W. Craig, L. Grinna // Biotechnology. - 1987. - V. 5. - P. 1305-1308.

156. Tschopp, J.F. Expression of the lacZ gene from two methanol-regulated promoters in Pichia pastoris/ J.F. Tschopp, P.F. Brust, J.M. Cregg, C.A. Stillman, T.R. Gingeras // Nucleic Acids Res. -1987. - V. 15. - P. 3859-3876.

157. Unrean, P. Pathway analysis of Pichia pastoris to elucidate methanol metabolism and its regulation for production of recombinant proteins/ P. Unrean // Biotechnology progress. - 2013. - V. 30(1). - P. 28-37.

158. Van Dijken, J. P. Dihydroxyacetone : an intermediate in the assimilation of methanol by yeasts? / J. P. Van Dijken, W. Harder, A. J. Beardsmore, J. R. Quale // FEMS Microbiology Letters. - 1978. - V. 4. - P. 97-102.

159. Van der Klei, I.J. Biosynthesis and assembly of alcohol oxidase, a peroxisomal matrix protein in methylotrophic yeasts: a review/ I.J. Van der Klei, W. Harder, M. Veenhuis // Yeast. - 1991. - V. 7. - P. 195-209.

160. Verhelst, J. Mx Proteins: Antiviral Gatekeepers That Restrain the Uninvited/ J. Verhelst, P. Hulpiau, X. Saelens // Microb. and Mol. Biol. Rev. 2013 V. 77. P. 551-566.

161. Veenhuis, M.Metabolic significance and biogenesis of microbodies in yeast/ M. Veenhuis, W. Harder // Springer-Verlag. - 1987. - V. 34. - P. 436-458.

162. Veenhuis, M. The significance of peroxisomes in the metabolism of one-carbon compounds in yeasts/ M. Veenhuis, J. P. van Dijken, W. Harder // Adv. Microb. Physiol. - 1983. - V. 24. - P. 1-82.

163. Verstrepen, K.J. Glucose and sucrose: hazardous fast-food for industrial yeast? / K.J. Verstrepen, D. Iserentant, P. Malcorps et al.// TRENDS in Biotechnology. -2004. - V. 22.