Исследование и инженерия метаболизма сорбитола у дрожжей KOMAGATAELLA KURTZMANII для продукции рекомбинантных ферментов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Акентьев Филипп Игоревич

• Акентьев Филипп Игоревич
• кандидат наук
• 2024

Оглавление диссертации кандидат наук Акентьев Филипп Игоревич

1.2 Цель и задачи

1.3. Научная новизна и практическая значимость

1.4. Методология и методы исследования

1. 5. Положения, выносимые на защиту

1.6. Личный вклад автора

1.7. Публикации и апробация работы

1.8. Структура и объем диссертации

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Использование дрожжей для рекомбинантной продукции белков

2.2. Генотипическое и фенотипическое разнообразие дрожжей Komagataella

2.3. Особенности и преимущества использования Komagataellaphaffn в качестве платформы для синтеза рекомбинантных белков

2.4. Применение Komagataella phaffn для рекомбинантной экспрессии

2.4.1. Ферментные препараты

2.4.2. Вакцины

2.4.3. Небелковые молекулы

2.4.4. Применение К. phaffii в качестве дрожжей второго поколения

2.5. Метаболизм метанола и сорбитола у К. phaffn

2.5.1. Метаболизм метанола

2.5.2. Метаболизм сорбитола

2.6. Генетическая инженерия К. phaffn

2.6.1. Промоторы и терминаторы

2.6.1.1. Регулируемая экспрессия

2.61.2. Конститутивная экспрессия

2.6.2. Терминаторы

2.6.3. Сигнальные последовательности

2.6.4. Селективные маркеры и копийность

2.7. Ферментация продуцентов К. phaffn

2.7.1. Методы ферментации с использованием дополнительных источников углерода

2.7.2. Применение сорбитола при Раж-зависимой экспрессии генов

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Штаммы

3.2. Микробиологические среды

3.3. Культуральные методы работы с микроорганизмами

3.3.1. Методы работы с E. coli

3.3.2. Подготовка компетентных клеток K. kurtzmanii Y-727

3.3.3. Трансформация и селекция K. kurtzmanii Y-727

3.3.4. Индукция метанолом трансформантов с P^oxi-зависимой рекомбинантной экспрессией

3.3.5. Индукция смесью сорбитол/метанол в пробирках

3.3.6. Ферментация продуцентов в биореакторе

3.4. Методы работы с ДНК и конструирование плазмид

3.4.1. Наработка и выделение плазмидной ДНК в клетках E. coli

3.4.2. Выделение хромосомной ДНК из клеток дрожжей

3.4.3. ПЦР, рестрикция, лигирование и электрофорез ДНК

3.4.4. Конструирование плазмид

3 5 Аналитические и биохимические методы

3.5.1. Электрофорез белков в ПААГ

3.5.2. Очистка и определение концентрации рекомбинантных белков

3.5.3. Оценка уровня экспрессии lacZ

3.5.4. Определение кинетических параметров сорбитолдегидрогеназ

3.5.5. Определение концентрации сорбитола в культуральной жидкости

3.5.6. Оценка максимальной удельной скорости роста дрожжей Komagataella

3.5.7. Измерение активности эндогликозидазы (Egh12) Thielavia terrestris в культуральной жидкости

3 .Ь. Программное обеспечение, базы данных и статистика

3.6.1. Базы данных и электронные интернет-ресурсы

3.6.2. Программы

3.6.3. Статистическая обработка данных

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Комплементационный анализ и исследование метаболизма сорбитола у K. kurtzmanii

4.1.1. Секвенирование генома дрожжей K. kurtzmanii ВКПМ Y-727

4.1.2. Поиск генов, способных участвовать в метаболизме сорбитола у K. phaffii и их ортологов в геноме K. kurtzmanii

4.1.3. Комплементационный анализ

4.1.4. Анализ штаммов K. kurtzmanii с нокаутом SDH727

4.1.5. Сравнительная характеристика ферментов Sdh115 и Sdh727

4.1.5.1. Получение препаратов

4.1.5.2. Стабильность ферментных препаратов Sdh115 и Sdh727, очищенных методом Ni-NTA

4.1.5.3. Определение физико-химических параметров Sdh 115 и Sdh727

4.1.6. Оценка экспрессии SDH115 и SDH727

4.1.6.1. Сравнительная оценка экспрессии lacZ в окружении регуляторных элементов генов SDH115 и SDH727

4.1.6 .2. Оценка активности промоторов Psdhus и Psdh727

4.1.6 .3. Влияние терминаторов Tsdhus и Tsdh727 на экспрессию

4.1.7. Дополнительная экспрессия SDH727 также приводит к повышению интенсивности метаболизма сорбитола у K. kurtzmanii

4.1.8. Влияние клеточного окружения на экспрессию SDH115

4.1.9. Активность PSDH в сравнении с PAOX1 и PGAP

4.2. Оценка влияния скорости метаболизма сорбитола на рекомбинантную продукцию клетками K. kurtzmanii

4.2.1. Получение штаммов-продуцентов K. kurtzmanii с улучшенным усвоением сорбитола

4.2.2. Влияние соотношения метанола и сорбитола на синтез целевых белков

4.2.3. Влияние концентрации сорбитола в среде на эффективность индукции метанолом

4.2.4. Индукция смесью сорбитол/метанол штамма Y_Egh12o2 в биореакторе

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

6. ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование и инженерия метаболизма сорбитола у дрожжей KOMAGATAELLA KURTZMANII для продукции рекомбинантных ферментов»

1. ВВЕДЕНИЕ 1.1. Актуальность и степень разработанности темы

Развитие современной биотехнологии тесно связано с разработкой и использованием рекомбинантных технологий. В частности, с их помощью осуществляют инженерию микроорганизмов с целью производства ферментов, метаболитов различного назначения и пищевых добавок, улучшающих качество кормов для сельскохозяйственных животных и пищевых продуктов для человека.

В список белков, актуальных для производства с использованием рекомбинантных технологий, входят ферменты целлюлазного комплекса и протеазы. К первым относятся эндоглюканазы семейства 12 гликозид гидролаз (GH12), расщепляющие (1,4)-P-D-глюкозидные связи в линейных (1,4)-Р^-глюканах (целлюлоза, карбоксиметилцеллюлоза), смешанных (1,3;1,4)-Р^-глюканы (злаковые Р-глюканы и лихенан), или разветвленных ксилоглюканах клеточных стенок растений. Они широко используются во многих технологических процессах, например, для осахаривания суспензий растительной биомассы или снижения вязкости целлюлозы в процессе биоконверсии в кормовой промышленности. Протеазы, в частности, катепсины, применяются в пищевой и фармацевтической промышленности [10].

На сегодняшний день на основе метилотрофных дрожжей рода Komagataella сконструированы одни из самых высокоэффективных систем экспрессии генов, используемых для производства рекомбинантных белков, включая ферменты для агробиотехнологии и промышленности, а также других биологически и химически активных молекул [42, 71]. Дрожжи данного рода способны к быстрому усвоению метанола, дешевого и доступного источника углерода, и к росту в биореакторах до высоких плотностей. Кроме того, они обладают эффективной системой секреции и посттрансляционной модификации белков, а также мощными конститутивными и регулируемыми промоторами. Всё это позволило дрожжам Komagataella занять достойное место среди микроорганизмов, широко применяемых для решения задач современной биотехнологии, таких как бактерии Escherichia coli и пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae, [97, 149]. В этом контексте интенсивное развитие за последние три десятилетия получили представители вида Komagataella phaffii (ранее известный как Pichia pastoris).

Для экспрессии целевых генов в дрожжах K. phaffii наиболее часто используется промотор PAOX1 гена алкогольоксидазы АОХ1. Индукция промотора происходит в присутствии метанола и подавляется при наличии практически любых других источников углерода в среде, включая глюкозу и глицерин. Проявление у промотора таких регуляторных свойств приводит к тому, что в процессе биосинтеза рекомбинантных белков метанол часто используется в качестве единственного источника углерода. Это создает определенные неудобства, поскольку эффективность метаболизма метанола у дрожжей в значительной степени зависит от доступности кислорода для клеток, а также от отвода тепла от биореакторов, что накладывает конструктивные ограничения на способы культивирования [55, 75]. Более того, метанол является крайне токсичным веществом, и его использование строго контролируется в пищевой промышленности в России и во многих других странах.

Сорбитол является одним из немногих источников углерода, который не подавляет активность PAOX1 и может служить дополнительным субстратом во время метанол -зависимого биосинтеза [60]. Более того, как было показано, в результате совместного использования сорбитола и метанола наблюдается увеличение синтеза рекомбинантного белка [13, 44], снижение клеточного стресса и доли погибших клеток в культуре [157], уменьшение потребления кислорода и протеолитической деградации секретируемых белков [21, 112]. Кроме того в ряде исследовании было отмечено, что промежуточный продукт метаболизма метанола, формиат, также способен индуцировать Paox1 и в перспективе может стать заменой токсичному метанолу [90, 138, 150]. Но формиат является бедным источником углерода и энергии для клеток по сравнению с метанолом; его использование в качестве индуктора требует дополнительного субстрата для клеток дрожжей. Это увеличивает потенциальную ценность сорбитола, совместимого с такой индукцией формиатом.

Как было установлено в результате мультигенного филогенетического анализа, K. kurtzmanii и K. phaffii являются близкородственными видами метилотрофных дрожжей [109]. На основе штамма дрожжей K. kurtzmanii ВКПМ Y-727 (CBS 12817) в ГосНИИгенетика (Москва) была разработана конкурентоспособная система экспрессии генов, превосходящая по эффективности систему на основе K. phaffii [48, 103]. Однако, в отличие от K. phaffii, дрожжи K. kurtzmanii не способны использовать сорбитол, маннитол или трегалозу в качестве единственного источника углерода [109]. Данная особенность

снижает конкурентные преимущества и ограничивает применение K. kurtzmanii для производства рекомбинантных белков, поскольку не позволяет использовать эти субстраты, и в частности, сорбитол, для реализации ряда эффективных стратегий культивирования [167].

Таким образом, можно заключить, что исследования, направленные на повышение эффективности производства ферментов с использованием метилотрофных дрожжей, имеют важное промышленное значение. С этой точки зрения отечественная система экспрессии на базе K. kurtzmanii обладает хорошими перспективами, и ее развитие путем инженерии метаболизма сорбитола позволит расширить возможности ее применения для синтеза рекомбинантных белков и других органических молекул.

12 Цель и задачи

Целью настоящей работы является изучение и модификация метаболизма сорбитола у дрожжей Komagataella kurtzmanii для повышения эффективности биосинтеза промышленно значимых белков, в том числе рекомбинантных ферментов ксилоглюканазы Xgh12b Aspergillus cervinus, эндоглюканазы Egh12 Thielavia terrestris и катепсина L Tribolium castaneum.

В процессе работы решались следующие задачи:

1) Проанализировать особенности метаболизма сорбитола у метилотрофных дрожжей K. kurtzmanii и K. phaffii;

2) Предложить кандидатные молекулярно-генетические мишени, отвечающие за дефект K. kurtzmanii в усвоении сорбитола, и провести их экспериментальный анализ;

3) Используя методы генетической инженерии, сконструировать штаммы K. kurtzmanii с улучшенным усвоением сорбитола;

4) На базе штаммов K. kurtzmanii с улучшенным усвоением сорбитола сконструировать продуценты рекомбинантных ферментов: эндоглюканазы Egh12 T. terrestris, ксилоглюканазы Xgh12b A. cervinus и катепсина L T. castaneum, и изучить влияние сорбитола на продукцию этих ферментов в условиях шейкерного культивирования;

5) Оценить преимущества полученных продуцентов в условиях культивирования в биореакторе с использованием подпитки с сорбитолом.

1.3. Научная новизна и практическая значимость

В настоящей работе было проведено сравнительное изучение особенностей метаболизма сорбитола у дрожжей ^ phaffli и ^ kurtzmanii, в ходе которого было подтверждено, что ^ kurtzmanii обладали сниженной способностью к усвоению сорбитола. Были клонированы и синтезированы рекомбинантные сорбитолдегидрогеназы дрожжей ^ kurtzmanii и ^ phaffii, определены их физико-химические характеристики. Показано, что оба фермента обладали NAD+ - зависимой активностью на сорбитоле и имели близкие биохимические свойства.

Далее гены сорбитолдегидрогеназ (SOR1) штаммов ^ phaffli GS115 и ^ kurtzmanii Y-727 будут обозначены SDH115 и SDH727, соответственно.

Было установлено, что дефект в усвоении сорбитола у ^ kurtzmanii был обусловлен пониженной экспрессией гена SDH727 и удлиненным периодом адаптации клеток к росту на минимальной среде с сорбитолом, когда последний использовался в качестве единственного источника углерода. Было показано, что слабая экспрессия гена SDH727 в дрожжах ^ кurtzmanii определялась низкой активностью слабого конститутивного промотора PsDH727.

В ходе работы было продемонстрировано, что метаболизм сорбитола был лимитирован экспрессией генов сорбитолдегидрогеназ у обоих видов дрожжей ^ kurtzmanii и ^ phaffli. С использованием генетической инженерии были получены модифицированные штаммы ^ kurtzmanii и ^ phaffii с повышенной скоростью роста на сорбитоле Цmax = 0,06, что в 3 раза выше аналогичного показателя базового коммерческого штамма ^ phaffli GS115.

Изучено влияние скорости усвоения сорбитола на уровень экспрессии PAoXl-зависимых рекомбинантных генов, кодирующих ферменты термостабильной эндголюканазы Egh12 T. terrestris, ксилоглюканазы Xgh12b A. cervinus и катепсина L CathL T. castaneum в дрожжах ^ kurtzmanii и ^ phaffii. Было показано, что практически во всех случаях увеличение скорости усвоения сорбитола клетками штаммов -продуцентов оказывало негативное влияние на уровень метанол-зависимого синтеза ферментов и позитивное влияние на рост клеточной биомассы. Однако, было обнаружено, что существует «компромиссная» скорость усвоения сорбитола (концентрация сорбитола в среде), способная стимулировать рост клеток без потери удельной продуктивности, что позволяет увеличить выход целевого белка на 15-30%.

Показано, что в условиях индукции метанолом удельная продуктивность штамма K. kurtzmanii - продуцента Egh12 в биореакторе может быть увеличена более чем в 2 раза за счет использования сорбитола в качестве дополнительного субстрата. При использовании сорбитола было достигнуто 2,5-кратное абсолютное увеличение количества синтезированного Egh12 по сравнению с базовыми условиями культивирования.

Таким образом, в ходе выполнения диссертационной работы были получены результаты, которые расширяют знания об особенностях метаболизма сорбитола у дрожжей K. kurtzmanii и K. phaffii, в частности о регуляции генов SDH, свойствах ферментов, кодируемых этими генами, а также о влиянии сорбитола и скорости его усвоения на эффективность метанол-зависимой индукции. Полученные результаты могут найти применение при конструировании продуцентов на основе K. phaffii и K. kurtzmanii, предназначенных для синтеза промышленно-значимых белков и ферментов, а также при выборе условий для их промышленного культивирования.

1.4. Методология и методы исследования

В ходе выполнения работы применялись стандартные методики молекулярной биологии и биоинформатики. Для создания плазмид использовались традиционные методы генетической инженерии. В рамках исследования были разработаны генетически модифицированные штаммы-продуценты на основе дрожжей K. kurtzmanii и K. phaffii. Для них проводили анализ ростовых свойств и продуктивности в зависимости от условий культивирования. Были получены и изучены препараты рекомбинантных ферментов, включая анализ их физико-химических свойств. В исследовании проводилась оценка активности промоторов и терминаторов, основываясь на уровне синтеза Р-галактозидазы (lacZ).

1.5. Положения, выносимые на защиту

1. Экспрессия SDH лимитирует метаболизм сорбитола у дрожжей K. kurtzmanii и K. phaffii.

2. Сорбитолдегидрогеназы Sdh727 и Sdh115 штаммов K. kurtzmanii и K. phaffii являются NAD+ - зависимыми ферментами и имеют сходные физико-химические характеристики.

3. Промотор PsDH727гена SDH727 ^ kurtzmanii обладает в 2 раза меньшей активностью по сравнению с промотором PsDHll5 гена SDH115 ^ phaffli. Данный эффект, а также более длительный период адаптации к сорбитолу определяют снижение ростовых показателей дрожжей ^ kurtzmanii по сравнению с ^ phaffii на среде с сорбитолом.

4. Интеграция в геном дополнительных копий рекомбинантного гена SDH115 ^ phaffii приводит к получению модифицированных штаммов ^ kurtzmanii и ^ phaffii с улучшенным усвоением сорбитола и повышенной скоростью роста на средах с сорбитолом.

5. Использование модифицированных штаммов ^ kurtzmanii в условиях шейкерного культивирования позволяет на 15-30% увеличить уровень биосинтеза эндоглюканазы Egh12 за счет оптимизации соотношения метанола и сорбитола в среде и улучшения роста клеток. В условиях культивирования в биореакторе использование сорбитола в 2 раза повышает удельную продуктивность модифицированных штаммов и приводит к 2,5-кратному увеличению производства фермента.

1. (1. Личный вклад автора

В данной научной работе автором лично были получены следующие результаты:

1. Выполнен сравнительный анализ геномов ^ kurtzmanii и ^ phaffii и предложен набор кандидатных генов для проверки их влияния на метаболизм сорбитола в дрожжах ^ kurtzmanii;

2. Осуществлены все генно-инженерные работы и сконструированы все трансформанты, описанные в данной работе;

3. Получены препараты и изучены свойства рекомбинантных сорбитолдегидрогеназ;

4. Проведена оценка сравнительной активности промоторных и терминаторных областей генов сорбитолдегидрогеназ дрожжей ^ kurtzmanii и K. phaffii;

5. Проанализирован биосинтез рекомбинантных ферментов клетками модифицированных штаммов в условиях шейкерного и биореакторного культивирования на средах различного состава;

Секвенирование и аннотация генома штамма ^ kurtzmanii ВКПМ У-727 были

выполнены Корженковым А.В., сотрудником лаборатории биоинформатики

НИЦ «Курчатовский институт». Эксперименты по ферментации модифицированных

штаммов были проведены в сотрудничестве с Преображенским Р.М., сотрудником лаборатории технической микробиологии НИЦ «Курчатовский институт».

1.7. Публикации и апробация работы

Результаты диссертационной работы представлены в 9 научных публикациях, в том числе в 4 статьях в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК, и в 1 патенте.

Материалы диссертации были опубликованы в виде стендовых и устных докладов на XX Зимней молодежной школы ПИЯФ по биофизике и молекулярной биологии (Гатчина, 2019); XVI Всероссийской конференции молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием "Пищевые технологии и биотехнологии" (Казань, 2019); 25-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых с международным участием «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2022); XXII Зимней молодежной школе ПИЯФ по биофизике и молекулярной биологии (Гатчина, 2023).

1.8. Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из 7 разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Общие выводы» и «Список литературы». Работа изложена на 120 страницах, включая 31 рисунок и 14 таблиц. Список литературы содержит 174 источника.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Использование дрожжей для рекомбинантной продукции белков

Среди множества организмов, используемых для производства рекомбинантных белков, бактерия Escherichia coli приобрела высокую популярность как наиболее предпочтительный организм благодаря широкому спектру доступных и простых методов работы с культурой клеток. Однако использование E. coli может быть затруднено или вовсе невозможно в случае, когда целевым рекомбинантным белком является белок из эукариотического организма. Как правило, это связано с тем, что после трансляции в E. coli такие белки должны быть подвержены посттрансляционным модификациям или требуют протеолитического процессинга. В этих случаях полученные белки обычно подвергают дополнительным процедурам модификации in vitro, что делает процесс получения конечного препарата трудоёмким и дорогостоящим. Кроме того, значительное количество полученных таким способом эукариотических белков требует этапов денатурации и ренатурации in vitro для корректного фолдинга.

В этой связи, в качестве альтернативы, эукариотические организмы, среди которых дрожжи, насекомые, клеточные линии растений и млекопитающих, были адаптированы для рекомбинантного синтеза [57, 101, 122, 163]. Дрожжи сочетают в себе преимущества как прокариот, так и эукариот. С одной стороны, культура одноклеточных дрожжей не требует сложных методов культивирования и комплексных сред, как в случае с клеточными линиями растений и млекопитающих. С другой стороны, дрожжи способны осуществлять большинство типов посттрансляционных модификаций, необходимых для получения биологически активных эукариотических рекомбинантных белков.

Исторически сложилось так, что основным дрожжевым организмом для получения рекомбинантных белков преимущественно является Saccharomyces cerevisiae. Достоинства этих дрожжей были многократно продемонстрированы, хотя они и не лишены недостатков при использовании [110]. В связи с этим, на рынке появились различные рекомбинантные белковые препараты, полученные в клетках S. cerevisiae [67]. Эффективность использования S. cerevisiae в конечном счёте привела к тому, что в последнее десятилетие множество белков, синтезированных в альтернативных дрожжевых организмах, стали коммерчески доступными.

Другой вид дрожжей, Komagataella phaffii (ранее использовалось название Pichia pastoris), привлёк к себе внимание благодаря выходу на рынок новых рекомбинантных

терапевтических препаратов, полученных в этих организмах: человеческого инсулина, человеческого сывороточного альбумина, вакцины против гепатита В, интерферона -альфа 2Ь, трипсина, коллагена и других ЩЦр://р1сЫа.сот/8с1епсе-сеп1ег/сомМегс1аП7е^ рго^ис^/). ^ phaffli — облигатные аэробные дрожжи, которые способны использовать метанол в качестве единственного источника углерода. За последние несколько лет по результатам филогенетического анализа P. pastoris были классифицированы как Komagataella phaffii [78]. Однако в работах, вышедших до новой классификации, под названием P. pastoris исследователи могли не всегда использовать именно штамм ^ phaffii; могли быть использованы и другие виды, которые были не дифференцированы от ^ phaffii, и все определялись как P. pastoris. В данной работе далее в качестве названия организма будет использовано только ^ phaffii.

По сравнению с S. cerevisiae, ^ phaffii известны тем, что, как правило, производят более высокие титры рекомбинантных белков, что далее будет рассмотрено детальнее. Также стоит отметить, что распространены и другие виды дрожжей, на основе которых организованы системы рекомбинантной экспрессии. Среди них часто встречаются дрожжи Kluyveromyces и Yarrowia lipolytica, последние из которых, в частности,

известны своей способностью использовать в качестве источника углерода парафин и различные масла [16, 141].

2.2. Генотипическое и фенотипическое разнообразие дрожжей Komagataella

Род Komagataella включает в себя семь метилотрофных видов, классифицированных на основе анализа последовательностей маркерных генов [52, 109]. Филогенетическое дерево, построенное с использованием расстояний Маша, демонстрирует кластеризацию трёх штаммов ^ pastoris и двух штаммов ^ phaffli. В этом дереве ^ ulmi и ^ pastoris, а также ^ kurtzmanii и ^ phaffii располагаются в качестве сестринских групп в двух различных поддеревьях. Виды ^ mondaviorum, ^ populi и ^ pseudopastoris сгруппированы в отдельную кладу. Секвенирование штаммов ^ phaffii, ^ kurtzmanii, ^ pastoris и & ulmi выявило глобальные различия в структуре их геномов, ранее описанные для ^ phaffli и ^ pastoris [52, 94].

Фенотипическое разнообразие внутри рода Komagataella было исследовано с использованием ростовых тестов на различных источниках углерода и в разнообразных стрессовых условиях [52, 109]. Результаты показали схожий рост для большинства

тестируемых условий, особенно на таких источниках углерода, как глюкоза, глицерин и метанол. Однако на средах с этанолом при 30 °C некоторые штаммы демонстрировали улучшенный рост. Также были выявлены значительные различия в устойчивости к высокому pH и окислительному стрессу. При температуре 37 °C рост всех штаммов снижался, однако штаммы K. kurtzmanii CBS 12817 и K. mondaviorum CBS 15017 не способны расти при этой температуре в любых из протестированных условий, что согласуется с предыдущими данными о росте на глюкозе. Штамм K. populi CBS 12362 показал наибольшую скорость роста на всех источниках углерода и в большинстве стрессовых условий. Несмотря на некоторые фенотипические различия, штаммы рода Komagataella в целом демонстрируют высокую степень сходства, что поднимает вопрос о возможности дифференциации видов Komagataella исключительно на основе фенотипического анализа.

2.3. Особенности и преимущества использования Komagataella phaffii в качестве платформы для синтеза рекомбинантных белков

В ходе эволюции у дрожжей возникло широкое множество видов, обладающих различными свойствами. Представители этой группы обитают в самых разных условиях, ассимилируют углерод и другие необходимые элементы из широкого спектра веществ, синтезируют разнообразные метаболиты. Komagataella phaffii относится к дрожжам типа Ascomycota из класса Saccharomycetes [54]. Примечательным свойством этих организмов является способность использовать, помимо других соединений, метанол в качестве единственного источника углерода и энергии.

Komagataella phaffii является одним из предпочтительных организмов для производства рекомбинантных белков, а в последнее время и для синтеза небелковых продуктов [42, 119, 174]. Привлекательность K. phaffii как биотехнологического хозяина и модельного организма тесно связана с особенностями, которые выгодно отличают его от других дрожжей в контексте биотехнологического производства.

K. phaffii уникален среди дрожжей своей способностью к метаболизму метанола, который катализируется алкогольоксидазой (Aox1 и Aox2) и дигидроксиацетонсинтазой (Das1 и Das2) [115]. В отличие от других метилотрофных дрожжей, K. phaffii обладает двумя генами, кодирующими Aox, которые образуют гомооктамер, содержащий восемь кофакторов FAD [154]. Цикл XuMP для ассимиляции метанола локализован в

пероксисомах и катализируется набором изоферментов, кодируемых дублированными копиями генов с сигналами пероксисомного таргетинга [129]. Это позволяет предположить, что пероксисомная локализация является необходимым признаком метилотрофии у дрожжей. Набор генов, необходимых для роста на метаноле, включает гены ферментов пути ассимиляции метанола, гены, отвечающие за пероксисомальный таргетинг, и гены, кодирующие пероксисомальные структурные белки.

^ phaffii может расти на глюкозе, но ее поглощение ограничено по сравнению с S. cerevisiae [31, 104]. S. cerevisiae имеет больше гексозных транспортеров, что обеспечивает более высокое поглощение глюкозы и снижение выхода биомассы и производства этанола [35]. ^ phaffii имеет меньшее количество транспортеров гексозы и осуществляет дыхание исключительно в полностью аэробных условиях, что делает его каноническим Кребтри-отрицательным организмом [12, 102]. Также, в отличие от S. cerevisiae, ^ phaffli может расти на глицерине на минимальной среде с большей скоростью (цтах = 0,37), не требуя дополнительных добавок [65]. Наличие четырех Н+/глицериновых симпортеров в дополнение к глицериновому посреднику Бр81-типа свидетельствует о более интенсивном метаболизме ассимиляции глицерина по сравнению со многими другими дрожжами [102].

Одним из основных преимуществ ^ phaffii является то, что он секретирует сравнительно небольшое количество собственных белков, что облегчает последующую переработку и, соответственно, снижает производственные затраты. Прогнозируемый размер секретома S. cerevisiae составляет на 50%, а Y. lipolytica, еще одного популярного хозяина для производства рекомбинантных белков, на 300% больше, чем у ^ phaffii [95]. Для характеристики секретома & phaffii в промышленно значимых условиях было проведено несколько исследований [20, 32, 56]. В одной из работ изучалось изменение секретома ^ phaffii в ходе типичного процесса производства рекомбинантных белков и влияние выбора источника углерода на секрецию нативных белков [20]. Всего был идентифицирован 51 белок, что согласуется с предыдущими наблюдениями.

Ключевое преимущество использования ^ phaffii в качестве системы -хозяина заключается в том, что она сочетает в себе способность эффективно экспрессировать гетерологичные белки с уникальной способностью расти в минимальной среде с высокой плотностью клеток при низком уровне секреции эндогенных белков.

Вид K. phaffii также обладает некоторыми особенностями катаболизма аминокислот, способны расти на минимальной среде, содержащей аспартат или глутамат в качестве единственных источников азота и углерода, имеют альтернативные механизмы регуляции генов скрещивания и строение аппарата Гольджи [53, 83, 106, 131]. Благодаря описанным особенностям, в настоящее время K. phaffii зарекомендовал себя как ценный вид для рекомбинантной продукции и в качестве модельного организма, поэтому исследования в этой области являются актуальной задачей.

2 4 Применение Komagataella phaffii для рекомбинантной экспрессии 2.4.1. Ферментные препараты

Ферменты находят коммерческое применение в различных отраслях промышленности, таких как химическое производство, фармацевтика, производство продуктов питания, текстильная промышленность, производство потребительских товаров и пр. [135]. Особенно прогресс в оптимизации биотехнологических процессов и развитие технологии рекомбинантных ДНК стимулирует отрасль производства [2]. Бактериальные клеточные фабрики, среди которых Escherichia coli, Pseudomonas putida, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae и др. последние четыре десятилетия демонстрируют высокую экономическую целесообразность их применения для производства ферментов [15, 39]. Однако при производстве рекомбинантных белков возникает множество проблем, ассоциированных с самыми различными аспектами такого высокотехнологичного процесса [128, 152]. Эффективность дрожжей как хозяина для синтеза рекомбинантных белков многократно продемонстрирована, и последние стали одной из наиболее распространенных альтернатив для крупномасштабного производства [38]. В частности, K. phaffii рассматривается как одна из наиболее успешных эукариотических экспрессионных систем, в первую очередь из -за особенностей, которые были описаны в предыдущем разделе.

Существует значительное количество исследований, демонстрирующих высокую эффективность использования K. phaffii для производства ферментов, среди которых фосфолипаза, ксиланаза, изоамилаза и множество других [5, 84]. С помощью K. phaffii получают целый ряд ферментов, гидролизующих лигноцеллюлозу, включая гемицеллюлазу, целлюлазу и лакказу [37]. Ген хитозаназы, которая широко используется для получения биологически активного хитоолигосахарида, CSN5 Streptomyces griseus

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Акентьев Филипп Игоревич, 2024 год

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Abdulrachman D., Thongkred P., Kocharin K., Nakpathom M., Somboon B., Narumol N. [et al.] Heterologous expression of Aspergillus aculeatus endo-polygalacturonase in Pichia pastoris by high cell density fermentation and its application in textile scouring // BMC Biotechnol. -2017. - Vol. 17. № 1. - P. 15. https://www. doi.org/10.1186/s 12896-017-0334-9

2. Adrio J. L., Demain A. L. Recombinant organisms for production of industrial products // Bioeng Bugs. - 2010. - Vol. 1. № 2. - P. 116-31. https://www.doi.org/10.4161/bbug. 1.2.10484

3. Ahmad M., Hirz M., Pichler H., Schwab H. Protein expression in Pichia pastoris: recent achievements and perspectives for heterologous protein production // Appl Microbiol Biotechnol. - 2014. - Vol. 98. № 12. - P. 5301 -17. https://www.doi.org/10.1007/s00253-014-5732-5

4. Ahn J., Hong J., Lee H., Park M., Lee E., Kim C. [et al.] Translation elongation factor 1 -alpha gene from Pichia pastoris: molecular cloning, sequence, and use of its promoter // Appl Microbiol Biotechnol. - 2007. - Vol. 74. № 3. - P. 601-8. https://www.doi.org/10.1007/s00253-006-0698-6

5. Akishev Z., Kiribayeva A., Mussakhmetov A., Baltin K., Ramankulov Y., Khassenov B. Constitutive expression of Camelus bactrianus prochymosin B in Pichia pastoris // Heliyon. -2021. - Vol. 7. № 5. - P. e07137. https://www.doi.org/10.1016/j.heliyon.2021.e07137

6. Alper H., Fischer C., Nevoigt E., Stephanopoulos G. Tuning genetic control through promoter engineering // Proc Natl Acad Sci USA. - 2005. - Vol. 102. № 36. - P. 12678 -83. https://www.doi.org/10.1073/pnas.0504604102

7. Araya-Garay J. M., Ageitos J. M., Vallejo J. A., Veiga-Crespo P., Sanchez-Perez A., Villa T. G. Construction of a novel Pichia pastoris strain for production of xanthophylls // AMB Express. - 2012. - Vol. 2. № 1. - P. 24. https://www.doi.org/10.1186/2191-0855-2-24

8. Araya-Garay J. M., Feijoo-Siota L., Rosa-dos-Santos F., Veiga-Crespo P., Villa T. G. Construction of new Pichia pastoris X-33 strains for production of lycopene and beta-carotene // Appl Microbiol Biotechnol. - 2012. - Vol. 93. № 6. - P. 2483 -92. https://www.doi.org/10.1007/s00253-011-3764-7

9. Arnau C., Ramon R., Casas C., Valero F. Optimization of the heterologous production of a Rhizopus oryzae lipase in Pichia pastoris system using mixed substrates on controlled fed-batch bioprocess // Enzyme Microb Technol. - 2010. - Vol. 46. № 6. - P. 494-500. https://www. doi. org/ 10.1016/j. enzmictec.2010.01.005

10. Arshad Z. I., Amid A., Yusof F., Jaswir I., Ahmad K., Loke S. P. Bromelain: an overview of industrial application and purification strategies // Appl Microbiol Biotechnol. - 2014. - Vol. 98. № 17. - P. 7283-97. https://www.doi. org/10. 1007/s00253 -014-5 889-y

11. Ata O., Prielhofer R., Gasser B., Mattanovich D., Calik P. Transcriptional engineering of the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter for improved heterologous protein production in Pichia pastoris // Biotechnol Bioeng. - 2017. - Vol. 114. № 10. - P. 2319 -2327. https://www.doi.org/10.1002/bit.26363

12. Ata O., Rebnegger C., Tatto N. E., Valli M., Mairinger T., Hann S. [et al.] A single Gal4-like transcription factor activates the Crabtree effect in Komagataella phaffii // Nat Co MMun. -2018. - Vol. 9. № 1. - P. 4911. https://www. doi. org/10.103 8/s41467-018-07430-4

13. Azadi S., Mahboubi A., Naghdi N., Solaimanian R., Mortazavi S. A. Evaluation of Sorbitol-Methanol Co-Feeding Strategy on Production of Recombinant Human Growth Hormone in Pichia Pastoris // Iran J Pharm Res. - 2017. - Vol. 16. № 4. - P. 1555-1564.

14. Azadi S., Sadjady S. K., Mortazavi S. A., Naghdi N., Mahboubi A., Solaimanian R. Bioprocess and downstream optimization of recombinant human growth hormone in Pichia pastoris // Res Pharm Sci. - 2018. - Vol. 13. № 3. - P. 222-238. https://www.doi.org/10.4103/1735-5362.228953

15. Baghban R., Farajnia S., Rajabibazl M., Ghasemi Y., Mafi A., Hoseinpoor R. [et al.] Yeast Expression Systems: Overview and Recent Advances // Mol Biotechnol. - 2019. - Vol. 61. № 5. - P. 365-384. https://www.doi.org/10.1007/s12033-019-00164-8

16. Bankar A. V., Kumar A. R., Zinjarde S. S. Environmental and industrial applications of Yarrowia lipolytica // Appl Microbiol Biotechnol. - 2009. - Vol. 84. № 5. - P. 847-65. https://www.doi.org/10.1007/s00253-009-2156-8

17. Berrios J., Flores M. O., Diaz-Barrera A., Altamirano C., Martinez I., Cabrera Z. A comparative study of glycerol and sorbitol as co-substrates in methanol-induced cultures of Pichia pastoris: temperature effect and scale-up simulation // J Ind Microbiol Biotechnol. - 2017. - Vol. 44. № 3. - P. 407-411. https ://www.doi. org/ 10.1007/s10295-016-1895-7

18. Besada-Lombana P. B., McTaggart T. L., Da Silva N. A. Molecular tools for pathway engineering in Saccharomyces cerevisiae // Curr Opin Biotechnol. - 2018. - Vol. 53. - P. 39 -49. https://www.doi.org/10.1016/icopbio.2017.12.002

19. Bisson L. F., Fraenkel D. G. Involvement of kinases in glucose and fructose uptake by Saccharomyces cerevisiae // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1983. - Vol. 80. № 6. - P. 1730 -4. https://www. doi. org/10.1073/pnas. 80.6.1730

20. Burgard J., Grunwald-Gruber C., Altmann F., Zanghellini J., Valli M., Mattanovich D. [et al.] The secretome of Pichia pastoris in fed-batch cultivations is largely independent of the carbon source but changes quantitatively over cultivation time // Microb Biotechnol. - 2020. -Vol. 13. № 2. - P. 479-494. https://www.doi.org/10.1111/1751-7915.13499

21. Celik E., Calik P., Oliver S. G. Fed-batch methanol feeding strategy for recombinant protein production by Pichia pastoris in the presence of co-substrate sorbitol // Yeast. - 2009. - Vol. 26. № 9. - P. 473-84. https://www.doi.org/10.1002/yea.1679

22. Cereghino J. L., Cregg J. M. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris // FEMS Microbiol Rev. - 2000. - Vol. 24. № 1. - P. 45-66. https://www.doi.org/10.1111/j.1574-6976.2000.tb00532.x

23. Chen L., Mohsin A., Chu J., Zhuang Y., Liu Y., Guo M. Enhanced protein production by sorbitol co-feeding with methanol in recombinant Pichia pastoris strains // Biotechnology and Bioprocess Engineering. - 2017. - Vol. 22. № 6. - P. 767 -773. https://www.doi.org/10.1007/s12257-017-0011-9

24. Cheperegin S. E., Malysheva A. V., Sannikova E. P., Gubaidullin, II, Efremov B. D., Kozlov D. G. Expression of Highly Active Bacterial Phospholipase A(2) in Yeast Using Intein-Mediated Delayed Protein Autoactivation // Appl Biochem Biotechnol. - 2021. - Vol. 193. № 5. - P. 1351-1364. https://www.doi.org/10.1007/s12010-020-03333-7

25. Cos O., Ramon R., Montesinos J. L., Valero F. Operational strategies, monitoring and control of heterologous protein production in the methylotrophic yeast Pichia pastoris under different promoters: a review // Microb Cell Fact. - 2006. - Vol. 5. - P. 17. https://www. doi. org/10.1186/1475-2859-5-17

26. Curran K. A., Karim A. S., Gupta A., Alper H. S. Use of expression-enhancing terminators in Saccharomyces cerevisiae to increase mRNA half-life and improve gene expression control for metabolic engineering applications // Metab Eng. - 2013. - Vol. 19. - P. 88-97. https://www.doi.org/10.1016/j.ymben.2013.07.001

27. de Almeida J. R., de Moraes L. M., Torres F. A. Molecular characterization of the 3-phosphoglycerate kinase gene (PGK1) from the methylotrophic yeast Pichia pastoris // Yeast. -2005. - Vol. 22. № 9. - P. 725-37. https://www.doi.org/10.1002/yea. 1243

28. de Lima P. B., Mulder K. C., Melo N. T., Carvalho L. S., Menino G. S., Mulinari E. [et al.] Novel homologous lactate transporter improves L-lactic acid production from glycerol in recombinant strains of Pichia pastoris // Microb Cell Fact. - 2016. - Vol. 15. № 1. - P. 158. https://www.doi.org/10.1186/s12934-016-0557-9

29. De Wachter C., Van Landuyt L., Callewaert N. Engineering of Yeast Glycoprotein Expression // Adv Biochem Eng Biotechnol. - 2021. - Vol. 175. - P. 93-135. https://www.doi.org/10.1007/10 2018 69

30. Delic M., Valli M., Graf A. B., Pfeffer M., Mattanovich D., Gasser B. The secretory pathway: exploring yeast diversity // FEMS Microbiol Rev. - 2013. - Vol. 37. № 6. - P. 872 -914. https://www.doi.org/10.1111/1574-6976.12020

31. Diderich J. A., Schepper M., van Hoek P., Luttik M. A., van Dijken J. P., Pronk J. T. [et al.] Glucose uptake kinetics and transcription of HXT genes in chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae // J Biol Chem. - 1999. - Vol. 274. № 22. - P. 15350 -9. https://www. doi. org/10.1074/jbc.274.22.15350

32. Dragosits M., Stadlmann J., Albiol J., Baumann K., Maurer M., Gasser B. [et al.] The effect of temperature on the proteome of recombinant Pichia pastoris // J Proteome Res. - 2009. - Vol. 8. № 3. - P. 1380-92. https://www.doi.org/10.1021/pr8007623

33. Du M., Battles M. B., Nett J. H. A color-based stable multi-copy integrant selection system for Pichia pastoris using the attenuated ADE1 and ADE2 genes as auxotrophic markers // Bioeng Bugs. - 2012. - Vol. 3. № 1. - P. 32-7. https://www.doi.org/10.4161/bbug.3.1.17936

34. Dvoryakova E. A., Klimova M. A., Simonyan T. R., Dombrovsky I. A., Serebryakova M. V., Tereshchenkova V. F. [et al.] Recombinant Cathepsin L of Tribolium castaneum and Its Potential in the Hydrolysis of IMMunogenic Gliadin Peptides // Int J Mol Sci. - 2022. - Vol. 23. № 13. https://www.doi.org/10.3390/ijms23137001

35. Elbing K., Larsson C., Bill R. M., Albers E., Snoep J. L., Boles E. [et al.] Role of hexose transport in control of glycolytic flux in Saccharomyces cerevisiae // Appl Environ Microbiol. -2004. - Vol. 70. № 9. - P. 5323-30. https://www.doi.org/10.1128/AEM.70.9.5323-5330.2004

36. Ergun B. G., Berrios J., Binay B., Fickers P. Recombinant protein production in Pichia pastoris: from transcriptionally redesigned strains to bioprocess optimization and metabolic modelling // FEMS Yeast Res. - 2021. - Vol. 21. № 7. https://www. doi. org/10.1093/femsyr/foab0 5 7

37. Ergun B. G., Calik P. Lignocellulose degrading extremozymes produced by Pichia pastoris: current status and future prospects // Bioprocess Biosyst Eng. - 2016. - Vol. 39. № 1. - P. 1 -36. https://www.doi.org/10.1007/s00449-015-1476-6

38. Ergun B. G., Lacin K., Caloglu B., Binay B. Second generation Pichia pastoris strain and bioprocess designs // Biotechnol Biofuels Bioprod. - 2022. - Vol. 15. № 1. - P. 150. https://www.doi.org/10.1186/s13068-022-02234-7

39. Ferrer-Miralles N., Villaverde A. Bacterial cell factories for recombinant protein production; expanding the catalogue // Microb Cell Fact. - 2013. - Vol. 12. - P. 113. https://www.doi.org/10.1186/1475-2859-12-113

40. Fu Y., Xiao W. Study of transcriptional regulation using a reporter gene assay // Methods Mol Biol. - 2006. - Vol. 313. - P. 257-64. https://www.doi.org/10.1385/1-59259-958-3:257

41. Ganesh M., Senthamarai A., Shanmughapriya S., Natarajaseenivasan K. Effective production of low crystallinity Poly(3-hydroxybutyrate) by recombinant E. coli strain JM109 using crude glycerol as sole carbon source // Bioresour Technol. - 2015. - Vol. 192. - P. 677 -81. https: //www. doi. org/10.1016/j.biortech .2015.06.042

42. Gao J., Jiang L., Lian J. Development of synthetic biology tools to engineer Pichia pastoris as a chassis for the production of natural products // Synth Sys t Biotechnol. - 2021. - Vol. 6. № 2. - P. 110-119. https://www.doi.org/10.1016/j.synbio.2021.04.005

43. Gao M. J., Li Z., Yu R. S., Wu J. R., Zheng Z. Y., Shi Z. P. [et al.] Methanol/sorbitol co-feeding induction enhanced porcine interferon-alpha production by P. pastoris associated with energy metabolism shift // Bioprocess Biosyst Eng. - 2012. - Vol. 35. № 7. - P. 1125 -36. https://www.doi.org/10.1007/s00449-012-0697-1

44. Gao M. J., Zhan X. B., Gao P., Zhang X., Dong S. J., Li Z. [et al.] Improving Performance and Operational Stability of Porcine Interferon-alpha Production by Pichia pastoris with Combinational Induction Strategy of Low Temperature and Methanol/Sorbitol Co-feeding // Appl Biochem Biotechnol. - 2015. - Vol. 176. № 2. - P. 493 -504. https://www. doi.org/10.1007/s12010-015-1590-6

45. Gassler T., Heistinger L., Mattanovich D., Gasser B., Prielhofer R. CRISPR/Cas9-Mediated Homology-Directed Genome Editing in Pichia pastoris // Methods Mol Biol. - 2019. - Vol. 1923. - P. 211-225. https://www.doi.org/10.1007/978-1-4939-9024-5 9

46. Geier M., Brandner C., Strohmeier G. A., Hall M., Hartner F. S., Glieder A. Engineering Pichia pastoris for improved NADH regeneration: A novel chassis strain for whole-cell catalysis

// Beilstein J Org Chem. - 2015. - Vol. 11. - P. 1741-8. https://www.doi.org/10.3762/bjoc.11.190

47. Giesselmann E., Becker B., Schmitt M. J. Production of fluorescent and cytotoxic K28 killer toxin variants through high cell density fermentation of recombinant Pichia pastoris // Microb Cell Fact. - 2017. - Vol. 16. № 1. - P. 228. https://www.doi.org/10.1186/s12934-017-0844-0

48. Gorbunov A. A., Akentyev F. I., Gubaidullin I. I., Zhiganov N. I., Tereshchenkova V. F., Elpidina E. N. [et al.] Biosynthesis and Secretion of Serine Peptidase SerP38 from Tenebrio molitor in the Yeast Komagataella kurtzmanii // Applied Biochemistry and Microbiology. -2021. - Vol. 57. № 9. - P. 917-924. https://www.doi.org/10.1134/S0003683821090039

49. Gurramkonda C., Zahid M., Nemani S. K., Adnan A., Gudi S. K., Khanna N. [et al.] Purification of hepatitis B surface antigen virus-like particles from recombinant Pichia pastoris and in vivo analysis of their iMMunogenic properties // J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. - 2013. - Vol. 940. - P. 104-11. https://www.doi.org/10.1016/j.jchromb.2013.09.030

50. Ha S. H., Park J. J., Kim J. W., Jeong J. W., Noh K. S., Jeon Y. J. [et al.] Molecular cloning and high-level expression of G2 protein of hantaan (HTN) virus 76-118 strain in the yeast Pichia pastoris KM71 // Virus Genes. - 2001. - Vol. 22. № 2. - P. 167-73. https://www.doi.org/10.1023/a:1008173212708

51. Hartner F. S., Ruth C., Langenegger D., Johnson S. N., Hyka P., Lin-Cereghino G. P. [et al.] Promoter library designed for fine-tuned gene expression in Pichia pastoris // Nucleic Acids Res.

- 2008. - Vol. 36. № 12. - P. e76. https://www.doi.org/10.1093/nar/gkn369

52. Heistinger L., Dohm J. C., Paes B. G., Koizar D., Troyer C., Ata O. [et al.] Genotypic and phenotypic diversity among Komagataella species reveals a hidden pathway for xylose utilization // Microb Cell Fact. - 2022. - Vol. 21. № 1. - P. 70. https://www.doi.org/10.1186/s12934-022-01796-3

53. Heistinger L., Gasser B., Mattanovich D. Creation of Stable Heterothallic Strains of Komagataella phaffii Enables Dissection of Mating Gene Regulation // Mol Cell Biol. - 2018.

- Vol. 38. № 2. https://www.doi.org/10.1128/MCB.00398-17

54. Heistinger L., Gasser B., Mattanovich D. Microbe Profile: Komagataella phaffii: a methanol devouring biotech yeast formerly known as Pichia pastoris // Microbiolo gy (Reading). - 2020.

- Vol. 166. № 7. - P. 614-616. https://www.doi. org/10.1099/mic.0.00095 8

55. Hensing M. C., Rouwenhorst R. J., Heijnen J. J., van Dijken J. P., Pronk J. T. Physiological and technological aspects of large-scale heterologous-protein production with yeasts // Antonie

Van Leeuwenhoek. - 1995. - Vol. 67. № 3. - P. 261-79. https://www. doi. org/10.1007/BF00873690

56. Huang C. J., Damasceno L. M., Anderson K. A., Zhang S., Old L. J., Batt C. A. A proteomic analysis of the Pichia pastoris secretome in methanol-induced cultures // Appl Microbiol Biotechnol. - 2011. - Vol. 90. № 1. - P. 235 -47. https://www.doi.org/10.1007/s00253-011-3118-5

57. Ikonomou L., Schneider Y. J., Agathos S. N. Insect cell culture for industrial production of recombinant proteins // Appl Microbiol Biotechnol. - 2003. - Vol. 62. № 1. - P. 1 -20. https://www.doi.org/10.1007/s00253-003-1223-9

58. Imamachi N., Salam K. A., Suzuki Y., Akimitsu N. A GC-rich sequence feature in the 3' UTR directs UPF1-dependent mRNA decay in maMMalian cells // Genome Res. - 2017. - Vol. 27. № 3. - P. 407-418. https://www.doi.org/10.1101/gr.206060.116

59. Inan M., Meagher M. M. The effect of ethanol and acetate on protein expression in Pichia pastoris // J Biosci Bioeng. - 2001. - Vol. 92. № 4. - P. 337-41. https://www. doi. org/ 10.1263/jbb.92.337

60. Inan M., Meagher M. M. Non-repressing carbon sources for alcohol oxidase (AOX1) promoter of Pichia pastoris // J Biosci Bioeng. - 2001. - Vol. 92. № 6. - P. 585-9. https://www.doi.org/10.1263/jbb.92.585

61. Ito Y., Kitagawa T., Yamanishi M., Katahira S., Izawa S., Irie K. [et al.] Enhancement of protein production via the strong DIT1 terminator and two RNA-binding proteins in Saccharomyces cerevisiae // Sci Rep. - 2016. - Vol. 6. - P. 36997. https://www. doi. org/10.103 8/srep3 6997

62. Ito Y., Terai G., Ishigami M., Hashiba N., Nakamura Y., Bamba T. [et al.] Exchange of endogenous and heterogeneous yeast terminators in Pichia pastoris to tune mRNA stability and gene expression // Nucleic Acids Res. - 2020. - Vol. 48. № 22. - P. 13000-13012. https://www. doi. org/10.1093/nar/gkaa1066

63. Ito Y., Yamanishi M., Ikeuchi A., Imamura C., Tokuhiro K., Kitagawa T. [et al.] Characterization of five terminator regions that increase the protein yield of a transgene in Saccharomyces cerevisiae // J Biotechnol. - 2013. - Vol. 168. № 4. - P. 486-92. https://www.doi.org/10.1016/j.jbiotec.2013.09.024

64. Jacobs G. H., Chen A., Stevens S. G., Stockwell P. A., Black M. A., Tate W. P. [et al.] Transterm: a database to aid the analysis of regulatory sequences in mRNAs // Nucleic Acids Res. - 2009. - Vol. 37. № Database issue. - P. D72 -6. https://www.doi.org/10.1093/nar/gkn763

65. Jahic M., Rotticci-Mulder J., Martinelle M., Hult K., Enfors S. O. Modeling of growth and energy metabolism of Pichia pastoris producing a fusion protein // Bioprocess and Biosystems Engineering. - 2002. - Vol. 24. № 6. - P. 385-393. https://www.doi.org/10.1007/s00449-001-0274-5

66. Jordan P., Choe J. Y., Boles E., Oreb M. Hxt13, Hxt15, Hxt16 and Hxt17 from Saccharomyces cerevisiae represent a novel type of polyol transporters // Sci Rep. - 2016. - Vol. 6. - P. 23502. https://www. doi. org/10.103 8/srep23502

67. Jozala A. F., Geraldes D. C., Tundisi L. L., Feitosa V. A., Breyer C. A., Cardoso S. L. [et al.] Biopharmaceuticals from microorganisms: from production to purification // Braz J Microbiol. - 2016. - Vol. 47 Suppl 1. № Suppl 1. - P. 51 -63. https://www.doi.org/10.1016/j.bjm.2016.10.007

68. Jungo C., Schenk J., Pasquier M., Marison I. W., von Stockar U. A quantitative analysis of the benefits of mixed feeds of sorbitol and methanol for the production of recombinant avidin with Pichia pastoris // J Biotechnol. - 2007. - Vol. 131. № 1. - P. 57-66. https://www.doi.org/10.1016/jjbiotec.2007.05.019

69. Karaoglan M., Karaoglan F. E., Inan M. Comparison of ADH3 promoter with co MMonly used promoters for recombinant protein production in Pichia pastoris // Protein Expr Purif. -2016. - Vol. 121. - P. 112-7. https://www.doi. org/10.1016/j.pep.2016.01.017

70. Karaoglan M., Karaoglan F. E., Inan M. Functional analysis of alcohol dehydrogenase (ADH) genes in Pichia pastoris // Biotechnol Lett. - 2016. - Vol. 38. № 3. - P. 463 -9. https://www. doi.org/10.1007/s10529-015-1993-z

71. Karbalaei M., Rezaee S. A., Farsiani H. Pichia pastoris: A highly successful expression system for optimal synthesis of heterologous proteins // J Cell Physiol. - 2020. - Vol. 235. № 9. - P. 5867-5881. https://www.doi.org/10.1002/jcp.29583

72. Kim S.-I., Ha B.-S., Kim M.-S., Park M., Ro H.-S. Evaluation of copper-inducible fungal laccase promoter in foreign gene expression in Pichia pastoris // Biotechnology and Bioprocess Engineering. - 2016. - Vol. 21. № 1. - P. 53 -59. https://www.doi.org/10.1007/s12257-015-0567-1

73. Kim T. S., Patel S. K., Selvaraj C., Jung W. S., Pan C. H., Kang Y. C. [et al.] A highly efficient sorbitol dehydrogenase from Gluconobacter oxydans G624 and improvement of its stability through iMMobilization // Sci Rep. - 2016. - Vol. 6. - P. 33438. https://www. doi. org/10.103 8/srep3343 8

74. Koller A., Valesco J., Subramani S. The CUP1 promoter of Saccharomyces cerevisiae is inducible by copper in Pichia pastoris // Yeast. - 2000. - Vol. 16. № 7. - P. 651 -6. https://www.doi.org/10.1002/(SICI)1097-0061(200005)16:7<651::AID-YEA580>3.0.C0;2-F

75. Krainer F. W., Dietzsch C., Hajek T., Herwig C., Spadiut O., Glieder A. Recombinant protein expression in Pichia pastoris strains with an engineered methanol utilization pathway // Microb Cell Fact. - 2012. - Vol. 11. - P. 22. https://www.doi.org/10.1186/1475-2859-11-22

76. Kranthi B. V., Kumar H. R., Rangarajan P. N. Identification of Mxr1p-binding sites in the promoters of genes encoding dihydroxyacetone synthase and peroxin 8 of the methylotrophic yeast Pichia pastoris // Yeast. - 2010. - Vol. 27. № 9. - P. 705-11. https://www.doi.org/10.1002/yea.1766

77. Kruckeberg A. L. The hexose transporter family of Saccharomyces cerevisiae // Arch Microbiol. - 1996. - Vol. 166. № 5. - P. 283-92. https://www.doi.org/10.1007/s002030050385

78. Kurtzman C. P. Biotechnological strains of Komagataella (Pichia) pastoris are Komagataella phaffii as determined from multigene sequence an alysis // J Ind Microbiol Biotechnol. - 2009. - Vol. 36. № 11. - P. 1435-8. https://www.doi.org/10.1007/s10295-009-0638-4

79. Kuwae S., Ohyama M., Ohya T., Ohi H., Kobayashi K. Production of recombinant human antithrombin by Pichia pastoris // J Biosci Bioeng. - 2005. - Vol. 99. № 3. - P. 264 -71. https://www.doi.org/10.1263/jbb.99.264

80. LaeMMli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. - 1970. - Vol. 227. № 5259. - P. 680 -5. https://www. doi. org/10.103 8/227680a0

81. Lages F., Silva-Graca M., Lucas C. Active glycerol uptake is a mechanism underlying halotolerance in yeasts: a study of 42 species // Microbiology. - 1999. - Vol. 145 ( Pt 9). - P. 2577-2585. https://www.doi.org/10.1099/00221287-145-9-2577

82. Landes N., Gasser B., Vorauer-Uhl K., Lhota G., Mattanovich D., Maurer M. The vitaminsensitive promoter P(THI11) enables pre-defined autonomous induction of recombinant protein production in Pichia pastoris // Biotechnol Bioeng. - 2016. - Vol. 113. № 12. - P. 2633 -2643. https://www.doi.org/10.1002/bit.26041

83. League G. P., Slot J. C., Rokas A. The ASP3 locus in Saccharomyces cerevisiae originated by horizontal gene transfer from Wickerhamomyces // FEMS Yeast Res. - 2012. - Vol. 12. № 7. - P. 859-63. https://www.doi.org/10.1111/i.1567-1364.2012.00828.x

84. Li Y. Y., Zhong K. X., Hu A. H., Liu D. N., Chen L. Z., Xu S. D. High-level expression and characterization of a thermostable xylanase mutant from Trichoderma reesei in Pichia pastoris // Protein Expr Purif. - 2015. - Vol. 108. - P. 90-96. https://www. doi.org/10.1016/j.pep.2014.11.014

85. Liang S., Li C., Ye Y., Lin Y. Endogenous signal peptides efficiently mediate the secretion of recombinant proteins in Pichia pastoris // Biotechnol Lett. - 2013. - Vol. 35. № 1. - P. 97 -105. https://www.doi.org/10.1007/s10529-012-1055-8

86. Liang S., Zou C., Lin Y., Zhang X., Ye Y. Identification and characterization of P GCW14 : a novel, strong constitutive promoter of Pichia pastoris // Biotechnol Lett. - 2013. - Vol. 35. № 11. - P. 1865-71. https://www.doi.org/10.1007/s10529-013-1265-8

87. Lin-Cereghino G. P., Godfrey L., de la Cruz B. J., Johnson S., Khuongsathiene S., Tolstorukov I. [et al.] Mxr1p, a key regulator of the methanol utilization pathway and peroxisomal genes in Pichia pastoris // Mol Cell Biol. - 2006. - Vol. 26. № 3. - P. 883 -97. https://www.doi.org/10.1128/MCB.26.3.883-897.2006

88. Liu B., Cong W., Zhao Y., Zhou H., Zhang J. An inducible Komagataella phaffii system for protein expression using sorbitol dehydrogenase promoter // Biotechnol Lett. - 2023. - Vol. 45. № 5-6. - P. 667-677. https://www.doi.org/10.1007/s10529-023-03370-2

89. Liu B., Zhang Y., Zhang X., Yan C., Zhang Y., Xu X. [et al.] Discovery of a rhamnose utilization pathway and rhamnose-inducible promoters in Pichia pastoris // Sci Rep. - 2016. -Vol. 6. - P. 27352. https://www.doi.org/10.1038/srep27352

90. Liu B., Zhao Y., Zhou H., Zhang J. Enhancing xylanase expression of Komagataella phaffii induced by formate through Mit1 co-expression // Bioprocess Biosyst Eng. - 2022. - Vol. 45. № 9. - P. 1515-1525. https://www.doi.org/10.1007/s00449-022-02760-6

91. Liu X. B., Liu M., Tao X. Y., Zhang Z. X., Wang F. Q., Wei D. Z. Metabolic engineering of Pichia pastoris for the production of daMMarenediol-II // J Biotechnol. - 2015. - Vol. 216. - P. 47-55. https://www.doi.org/10.1016/j.jbiotec.2015.10.005

92. Liu Y., Gong X., Wang C., Du G., Chen J., Kang Z. Production of glucaric acid from myoinositol in engineered Pichia pastoris // Enzyme Microb Technol. - 2016. - Vol. 91. - P. 8-16. https://www. doi. org/ 10.1016/j. enzmictec.2016.05.009

93. Looser V., Bruhlmann B., Bumbak F., Stenger C., Costa M., Camattari A. [et al.] Cultivation strategies to enhance productivity of Pichia pastoris: A review // Biotechnol Adv. - 2015. - Vol. 33. № 6 Pt 2. - P. 1177-93. https://www.doi. org/10.1016/j.biotechadv.2015.05.008

94. Love K. R., Shah K. A., Whittaker C. A., Wu J., Bartlett M. C., Ma D. [et al.] Comparative genomics and transcriptomics of Pichia pastoris // BMC Genomics. - 2016. - Vol. 17. - P. 550. https://www. doi. org/10.1186/s12864-016-2876-y

95. Lum G., Min X. J. FunSecKB: the Fungal Secretome KnowledgeBase // Database (Oxford). - 2011. - Vol. 2011. - P. bar001. https://www.doi.org/10.1093/database/bar001

96. Luo Z., Miao J., Luo W., Li G., Du Y., Yu X. Crude glycerol from biodiesel as a carbon source for production of a recombinant highly thermostable beta-mannanase by Pichia pastoris // Biotechnol Lett. - 2018. - Vol. 40. № 1. - P. 135-141. https://www.doi.org/10.1007/s10529-017-2451-x

97. Macauley-Patrick S., Fazenda M. L., McNeil B., Harvey L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system // Yeast. - 2005. - Vol. 22. № 4. - P. 249-70. https://www.doi.org/10.1002/yea. 1208

98. Marx H., Mattanovich D., Sauer M. Overexpression of the riboflavin biosynthetic pathway in Pichia pastoris // Microb Cell Fact. - 2008. - Vol. 7. - P. 23. https://www.doi.org/10.1186/1475-2859-7-23

99. Massahi A., Calik P. Endogenous signal peptides in recombinant protein production by Pichia pastoris: From in-silico analysis to fermentation // J Theor Biol. - 2016. - Vol. 408. - P. 22-33. https://www.doi.org/10.1016/i.itbi.2016.07.039

100. Massahi A., Calik P. In-silico determination of Pichia pastoris signal peptides for extracellular recombinant protein production // J Theor Biol. - 2015. - Vol. 364. - P. 179 -88. https://www.doi.org/10.1016/j.jtbi.2014.08.048

101. Mattanovich D., Branduardi P., Dato L., Gasser B., Sauer M., Porro D. Recombinant protein production in yeasts // Methods Mol Biol. - 2012. - Vol. 824. - P. 329-58. https://www. doi. org/10.1007/978-1-61779-433-9 17

102. Mattanovich D., Graf A., Stadlmann J., Dragosits M., Redl A., Maurer M. [et al.] Genome, secretome and glucose transport highlight unique features of the protein production host Pichia pastoris // Microb Cell Fact. - 2009. - Vol. 8. - P. 29. https://www.doi.org/10.1186/1475-2859-8-29

103. Matveeva A. Y., Gubaidullin I. I., Fedorov A. S., Kozlov D. G. Optimization of the Expression of 1,3-1,4-0-glucanase Gene from Rhizomucor miehei in the Komagataella kurtzmanii yeast // Biotechnologiya. - 2019. - Vol. 35. № 5. - P. 3-11. https://www.doi.org/10.21519/0234-2758-2019-35-5-3-11

104. Maurer M., Kuhleitner M., Gasser B., Mattanovich D. Versatile modeling and optimization of fed batch processes for the production of secreted heterologous proteins with Pichia pastoris // Microb Cell Fact. - 2006. - Vol. 5. - P. 37. https://www.doi.org/10.1186/1475-2859-5-37

105. Miao T., Basit A., Liu J., Zheng F., Rahim K., Lou H. [et al.] Improved Production of Xylanase in Pichia pastoris and Its Application in Xylose Production From Xylan // Front Bioeng Biotechnol. - 2021. - Vol. 9. - P. 690702. https://www.doi.org/10.3389/fbioe.2021.690702

106. Mowbrey K., Dacks J. B. Evolution and diversity of the Golgi body // FEBS Lett. - 2009. - Vol. 583. № 23. - P. 3738-45. https://www.doi.org/10.1016/j.febslet.2009.10.025

107. Naatsaari L., Mistlberger B., Ruth C., Hajek T., Hartner F. S., Glieder A. Deletion of the Pichia pastoris KU70 homologue facilitates platform strain generation for gene expression and synthetic biology // PLoS One. - 2012. - Vol. 7. № 6. - P. e39720. https://www. doi. org/10. 1371/journal.pone.003 9720

108. Nascimento C. E. O., Simoes L. C. O., Pereira J. C., da Silva R. R., de Lima E. A., de Almeida G. C. [et al.] Application of a recombinant GH10 endoxylanase from Thermoascus aurantiacus for xylooligosaccharide production from sugarcane bagasse and probiotic bacterial growth // J Biotechnol. - 2022. - Vol. 347. - P. 1-8. https://www. doi. org/10.1016/j .jbiotec.2022.02.003

109. Naumov G. I., Naumova E. S., Tyurin O. V., Kozlov D. G. Komagataella kurtzmanii sp. nov., a new sibling species of Komagataella (Pichia) pastoris based on multigene sequence analysis // Antonie Van Leeuwenhoek. - 2013. - Vol. 104. № 3. - P. 339-47. https://www. doi. org/10.1007/s10482-013 -9956-7

110. Nielsen J. Production of biopharmaceutical proteins by yeast: advances through metabolic engineering // Bioengineered. - 2013. - Vol. 4. № 4. - P. 207-11. https://www.doi.org/10.4161/bioe.22856

111. Nielsen J., Keasling J. D. Engineering Cellular Metabolism // Cell. - 2016. - Vol. 164. № 6. - P. 1185-1197. https ://www. doi.org/ 10.1016/j. cell.2016.02.004

112. Niu H., Jost L., Pirlot N., Sassi H., Daukandt M., Rodriguez C. [et al.] A quantitative study of methanol/sorbitol co-feeding process of a Pichia pastoris Mut(+)/pAOX1-lacZ strain // Microb Cell Fact. - 2013. - Vol. 12. - P. 33. https://www.doi.org/10.1186/1475-2859-12-33

113. O'Riordan A. A., Morales V. A., Mulligan L., Faheem N., Windle H. J., Kelleher D. P. Alkyl hydroperoxide reductase: a candidate Helicobacter pylori vaccine // Vaccine. - 2012. -Vol. 30. № 26. - P. 3876-84. https://www.doi.org/10.1016/j.vaccine.2012.04.002

114. Otterstedt K., Larsson C., Bill R. M., Stahlberg A., Boles E., Hohmann S. [et al.] Switching the mode of metabolism in the yeast Saccharomyces cerevisiae // EMBO Rep. - 2004. - Vol. 5. № 5. - P. 532-7. https://www.doi.org/10.1038/sj.embor.7400132

115. Ozimek P., Veenhuis M., van der Klei I. J. Alcohol oxidase: a complex peroxisomal, oligomeric flavoprotein // FEMS Yeast Res. - 2005. - Vol. 5. № 11. - P. 975 -83. https://www. doi. org/10.1016/j. femsyr.2005.06.005

116. Paifer E., Margolles E., Cremata J., Montesino R., Herrera L., Delgado J. M. Efficient expression and secretion of recombinant alpha amylase in Pichia pastoris using two different signal sequences // Yeast. - 1994. - Vol. 10. № 11. - P. 1415-9. https://www. doi. org/10.1002/yea.320101104

117. Paulova L., Hyka P., Branska B., Melzoch K., Kovar K. Use of a mixture of glucose and methanol as substrates for the production of recombinant trypsinogen in continuous cultures with Pichia pastoris Mut+ // J Biotechnol. - 2012. - Vol. 157. № 1. - P. 180-8. https://www. doi. org/10.1016/j .jbiotec.2011.10.010

118. Payne W. E., Gannon P. M., Kaiser C. A. An inducible acid phosphatase from the yeast Pichia pastoris: characterization of the gene and its product // Gene. - 1995. - Vol. 163. № 1. -P. 19-26. https://www.doi.org/10.1016/0378-1119(95)00379-k

119. Pena D. A., Gasser B., Zanghellini J., Steiger M. G., Mattanovich D. Metabolic engineering of Pichia pastoris // Metab Eng. - 2018. - Vol. 50. - P. 2-15. https://www.doi.org/10.1016/j.ymben.2018.04.017

120. Peng B., Williams T. C., Henry M., Nielsen L. K., Vickers C. E. Controlling heterologous gene expression in yeast cell factories on different carbon substrates and across the diauxic shift: a comparison of yeast promoter activities // Microb Cell Fact. - 2015. - Vol. 14. - P. 91. https://www. doi. org/10.1186/s 12934-015-0278-5

121. Periyasamy S., Govindappa N., Sreenivas S., Sastry K. Isolation, characterization and evaluation of the Pichia pastoris sorbitol dehydrogenase promoter for expression of heterologous

proteins // Protein Expr Purif. - 2013. - Vol. 92. № 1. - P. 128 -33. https://www.doi.org/10.1016/j.pep.2013.09.008

122. Plasson C., Michel R., Lienard D., Saint-Jore-Dupas C., Sourrouille C., de March G. G. [et al.] Production of recombinant proteins in suspension-cultured plant cells // Methods Mol Biol. - 2009. - Vol. 483. - P. 145-61. https://www.doi.org/10.1007/978-1-59745-407-0 9

123. Prabhu A. A., Veeranki V. D. Metabolic engineering of Pichia pastoris GS115 for enhanced pentose phosphate pathway (PPP) flux toward recombinant human interferon gaMMa (hIFN-gaMMa) production // Mol Biol Rep. - 2018. - Vol. 45. № 5. - P. 961 -972. https://www. doi. org/10.1007/s11033-018-4244-2

124. Prielhofer R., Maurer M., Klein J., Wenger J., Kiziak C., Gasser B. [et al.] Induction without methanol: novel regulated promoters enable high-level expression in Pichia pastoris // Microb Cell Fact. - 2013. - Vol. 12. - P. 5. https://www.doi.org/10.1186/1475-2859-12-5

125. Puxbaum V., Mattanovich D., Gasser B. Quo vadis? The challenges of recombinant protein folding and secretion in Pichia pastoris // Appl Microbiol Biotechnol. - 2015. - Vol. 99. № 7. -P. 2925-38. https://www.doi.org/10.1007/s00253-015-6470-z

126. Qin X., Qian J., Yao G., Zhuang Y., Zhang S., Chu J. GAP promoter library for fine-tuning of gene expression in Pichia pastoris // Appl Environ Microbiol. - 2011. - Vol. 77. № 11. - P. 3600-8. https://www.doi.org/10.1128/AEM.02843-10

127. Resina D., Cos O., Ferrer P., Valero F. Developing high cell density fed-batch cultivation strategies for heterologous protein production in Pichia pastoris using the nitrogen source-regulated FLD1 Promoter // Biotechnol Bioeng. - 2005. - Vol. 91. № 6. - P. 760-7. https://www.doi.org/10.1002/bit.20545

128. Rosano G. L., Ceccarelli E. A. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges // Front Microbiol. - 2014. - Vol. 5. - P. 172. https://www.doi.org/10.3389/fmicb.2014.00172

129. Russmayer H., Buchetics M., Gruber C., Valli M., Grillitsch K., Modarres G. [et al.] Systems-level organization of yeast methylotrophic lifestyle // BMC Biol. - 2015. - Vol. 13. -P. 80. https://www.doi. org/10.1186/s 12915-015-0186-5

130. Rykov S. V., Selimzyanova A. I., Nikolaeva A. Y., Lazarenko V. A., Tsurin N. V., Akentyev P. I. [et al.] Unusual substrate specificity in GH family 12: structure-function analysis of glucanases Bgh12A and Xgh12B from Aspergillus cervinus, and Egh12 from Thielavia

terrestris // Appl Microbiol Biotechnol. - 2022. - Vol. 106. № 4. - P. 1493-1509. https://www.doi.org/10.1007/s00253-022-11811-7

131. Sahu U., Rangarajan P. N. Methanol Expression Regulator 1 (Mxr1p) Is Essential for the Utilization of Amino Acids as the Sole Source of Carbon by the Methylotrophic Yeast, Pichia pastoris // J Biol Chem. - 2016. - Vol. 291. № 39. - P. 20588 -601. https://www. doi. org/10.1074/jbc.M116.740191

132. Saitua F., Torres P., Perez-Correa J. R., Agosin E. Dynamic genome-scale metabolic modeling of the yeast Pichia pastoris // BMC Syst Biol. - 2017. - Vol. 11. № 1. - P. 27. https://www. doi. org/10.1186/s12918-017-0408-2

133. Sanchooli A., Aghayipour K., Naghlani S. K., Samiee Z., Kiasari B. A., Makvandi M. Production of Human Papillomavirus Type-16 L1 VLP in Pichia pastoris // Applied Biochemistry and Microbiology. - 2020. - Vol. 56. № 1. - P. 51 -57. https://www.doi.org/10.1134/S0003683820010147

134. Sarthy A. V., Schopp C., Idler K. B. Cloning and sequence determination of the gene encoding sorbitol dehydrogenase from Saccharomyces cerevisiae // Gene. - 1994. - Vol. 140. № 1. - P. 121-6. https://www.doi. org/10.1016/0378 -1119(94)90741 -2

135. Schafer T., Borchert T. W., Nielsen V. S., Skagerlind P., Gibson K., Wenger K. [et al.] Industrial enzymes // Adv Biochem Eng Biotechnol. - 2007. - Vol. 105. - P. 59-131. https://www.doi.org/10.1007/10 2006 039

136. Shen S., Sulter G., Jeffries T. W., Cregg J. M. A strong nitrogen source-regulated promoter for controlled expression of foreign genes in the yeast Pichia pastoris // Gene. - 1998. - Vol. 216. № 1. - P. 93-102. https ://www.doi. org/10.1016/s03 78-1119(98)00315-1

137. Sherry L., Grehan K., Snowden J. S., Knight M. L., Adeyemi O. O., Rowlands D. J. [et al.] Comparative Molecular Biology Approaches for the Production of Poliovirus Virus-Like Particles Using Pichia pastoris // mSphere. - 2020. - Vol. 5. № 2. https://www.doi.org/10.1128/mSphere.00838-19

138. Singh A., Narang A. The Mut(+) strain of Komagataella phaffii (Pichia pastoris) expresses P(AOX1) 5 and 10 times faster than Mut(s) and Mut(-) strains: evidence that formaldehyde or/and formate are true inducers of P(AOX1) // Appl Microbiol Biotechnol. - 2020. - Vol. 104. № 18. - P. 7801-7814. https://www.doi.org/10.1007/s00253-020-10793-8

139. Singh A., Narang A. P (AOX1) expression in mixed-substrate continuous cultures of Komagataella phaffii (Pichia pastoris) is completely determined by methanol consumption

regardless of the secondary carbon source // Front Bioeng Biotechnol. - 2023. - Vol. 11. - P. 1123703. https://www.doi.org/10.3389/fbioe.2023.1123703

140. Singh V., Braddick D., Dhar P. K. Exploring the potential of genome editing CRISPR-Cas9 technology // Gene. - 2017. - Vol. 599. - P. 1-18. https://www.doi.org/10.1016/j.gene.2016.11.008

141. Spohner S. C., Schaum V., Quitmann H., Czermak P. Kluyveromyces lactis: An emerging tool in biotechnology // J Biotechnol. - 2016. - Vol. 222. - P. 104-16. https://www. doi. org/10.1016/j .jbiotec.2016.02.023

142. Stadlmayr G., Mecklenbrauker A., Rothmuller M., Maurer M., Sauer M., Mattanovich D. [et al.] Identification and characterisation of novel Pichia pastoris promoters for heterologous protein production // J Biotechnol. - 2010. - Vol. 150. № 4. - P. 519-29. https://www. doi. org/10.1016/j .jbiotec.2010.09.957

143. Sunga A. J., Cregg J. M. The Pichia pastoris formaldehyde dehydrogenase gene (FLD1) as a marker for selection of multicopy expression strains of P. pastoris // Gene. - 2004. - Vol. 330. - P. 39-47. https://www.doi.org/10.1016/j.gene.2003.12.015

144. Tan L., Wang H., Tan X., Zou J., Yao Z. Yeast expressed foldable quadrivalent Abeta15 elicited strong iMMune response against Abeta without Abeta-specific T cell response in wild C57BL/6 mice // Hum Vaccin IMMunother. - 2012. - Vol. 8. № 8. - P. 1090-8. https://www. doi. org/10.4161/hv.20472

145. Tao H., Guo D., Zhang Y., Deng Z., Liu T. Metabolic engineering of microbes for branched-chain biodiesel production with low-temperature property // Biotechnol Biofuels. -2015. - Vol. 8. - P. 92. https://www.doi.org/10.1186/s13068-015-0270-7

146. Tian M., Wang Z. Y., Fu J. Y., Li H. W., Zhang J., Zhang X. F. [et al.] Crude glycerol impurities improve Rhizomucor miehei lipase production by Pichia pastoris // Prep Biochem Biotechnol. - 2021. - Vol. 51. № 9. - P. 860-870. https://www.doi.org/10.1080/10826068.2020.1870135

147. Tschopp J. F., Brust P. F., Cregg J. M., Stillman C. A., Gingeras T. R. Expression of the lacZ gene from two methanol-regulated promoters in Pichia pastoris // Nucleic Acids Res. -1987. - Vol. 15. № 9. - P. 3859-76. https://www.doi.org/10.1093/nar/15.9.3859

148. Tschopp J. F., Emr S. D., Field C., Schekman R. GAL2 codes for a membrane-bound subunit of the galactose permease in Saccharomyces cerevisiae // J Bacteriol. - 1986. - Vol. 166. № 1. - P. 313-8. https://www.doi.org/10.1128/jb.166.1.313-318.1986

149. Turkanoglu Ozcelik A., Yilmaz S., Inan M. Pichia pastoris Promoters // Methods Mol Biol. - 2019. - Vol. 1923. - P. 97-112. https://www.doi.org/10.1007/978-1-4939-9024-5 3

150. Tyurin O. V., Kozlov D. G. Deletion of the FLD gene in methylotrophic yeasts Komagataella phaffii and Komagataella kurtzmanii results in enhanced induction of the AOX1 promoter in response to either methanol or formate // Microbiology. - 2015. - Vol. 84. - P. 408411. https://www.doi.org/10.1134/S0026261715030212

151. Vianna Bernardi A., Kimie Yonamine D., Akira Uyemura S., Magnani Dinamarco T. A Thermostable Aspergillus fumigatus GH7 Endoglucanase Over-Expressed in Pichia pastoris Stimulates Lignocellulosic Biomass Hydrolysis // Int J Mol Sci. - 2019. - Vol. 20. № 9. https://www.doi.org/10.3390/ijms20092261

152. Vieira Gomes A. M., Souza Carmo T., Silva Carvalho L., Mendonca Bahia F., Parachin N. S. Comparison of Yeasts as Hosts for Recombinant Protein Production // Microorganisms. -2018. - Vol. 6. № 2. https://www.doi. org/10.3390/microorganisms602003 8

153. Vivek N., Sindhu R., Madhavan A., Anju A. J., Castro E., Faraco V. [et al.] Recent advances in the production of value added chemicals and lipids utilizing biodiesel industry generated crude glycerol as a substrate - Metabolic aspects, challenges and possibilities: An overview // Bioresour Technol. - 2017. - Vol. 239. - P. 507-517. https://www. doi.org/10.1016/j .biortech .2017.05.056

154. Vonck J., Parcej D. N., Mills D. J. Structure of Alcohol Oxidase from Pichia pastoris by Cryo-Electron Microscopy // PLoS One. - 2016. - Vol. 11. № 7. - P. e0159476. https://www. doi. org/10.1371 /journal.pone.015 9476

155. Wang M., Jiang S., Liu X., Wang Y. Expression, purification, and iMMunogenic characterization of Epstein-Barr virus recombinant EBNA1 protein in Pichia pastoris // Appl Microbiol Biotechnol. - 2013. - Vol. 97. № 14. - P. 6251 -62. https://www.doi.org/10.1007/s00253-013-4967-x

156. Wang X., Wang Q., Wang J., Bai P., Shi L., Shen W. [et al.] Mit1 Transcription Factor Mediates Methanol Signaling and Regulates the Alcohol Oxidase 1 (AOX1) Promoter in Pichia pastoris // J Biol Chem. - 2016. - Vol. 291. № 12. - P. 6245 -61. https://www. doi. org/10.1074/jbc.M115.692053

157. Wang Z., Wang Y., Zhang D., Li J., Hua Z., Du G. [et al.] Enhancement of cell viability and alkaline polygalacturonate lyase production by sorbitol co-feeding with methanol in Pichia

pastoris fermentation // Bioresour Technol. - 2010. - Vol. 101. № 4. - P. 1318-23. https://www.doi.org/10.1016/j.biortech.2009.09.025

158. Waterham H. R., Digan M. E., Koutz P. J., Lair S. V., Cregg J. M. Isolation of the Pichia pastoris glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene and regulation and use of its promoter // Gene. - 1997. - Vol. 186. № 1. - P. 37-44. https://www.doi.org/10.1016/s0378-1119(96)00675-0

159. Weinhandl K., Winkler M., Glieder A., Camattari A. Carbon source dependent promoters in yeasts // Microb Cell Fact. - 2014. - Vol. 13. - P. 5. https://www.doi.org/10.1186/1475-2859-13-5

160. Weninger A., Hatzl A. M., Schmid C., Vogl T., Glieder A. Combinatorial optimization of CRISPR/Cas9 expression enables precision genome engineering in the methylotrophic yeast Pichia pastoris // J Biotechnol. - 2016. - Vol. 235. - P. 139 -49. https://www. doi. org/10.1016/j .jbiotec.2016.03.027

161. Wriessnegger T., Augustin P., Engleder M., Leitner E., Muller M., Kaluzna I. [et al.] Production of the sesquiterpenoid (+)-nootkatone by metabolic engineering of Pichia pastoris // Metab Eng. - 2014. - Vol. 24. - P. 18-29. https://www.doi.org/10.1016/j.ymben.2014.04.001

162. Wu X., Bartel D. P. Widespread Influence of 3'-End Structures on MaMMalian mRNA Processing and Stability // Cell. - 2017. - Vol. 169. № 5. - P. 905-917 e11. https://www.doi.org/10.1016/j.cell.2017.04.036

163. Wurm F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated maMMalian cells // Nat Biotechnol. - 2004. - Vol. 22. № 11. - P. 1393-8. https://www.doi.org/10.1038/nbt1026

164. Xuan Y., Zhou X., Zhang W., Zhang X., Song Z., Zhang Y. An upstream activation sequence controls the expression of AOX1 gene in Pichia pastoris // FEMS Yeast Res. - 2 009. - Vol. 9. № 8. - P. 1271-82. https://www.doi.org/10.1111/j.1567-1364.2009.00571.x

165. Xue Y., Kong C., Shen W., Bai C., Ren Y., Zhou X. [et al.] Methylotrophic yeast Pichia pastoris as a chassis organism for polyketide synthesis via the full citrinin biosynthetic pathway // J Biotechnol. - 2017. - Vol. 242. - P. 64-72. https://www. doi. org/10.1016/j .jbiotec.2016.11.031

166. Yamanishi M., Ito Y., Kintaka R., Imamura C., Katahira S., Ikeuchi A. [et al.] A genome-wide activity assessment of terminator regions in Saccharomyces cerevisiae provides a "terminatome" toolbox // ACS Synth Biol. - 2013. - Vol. 2. № 6. - P. 337-47. https://www. doi. org/10.1021 /sb300116y

167. Yang Z., Zhang Z. Engineering strategies for enhanced production of protein and bio-products in Pichia pastoris: A review // Biotechnol Adv. - 2018. - Vol. 36. № 1. - P. 182-195. https://www. doi. org/10.1016/j .biotechadv.2017.11.002

168. Yoshimasu M. A., Ahn J. K., Tanaka T., Yada R. Y. Soluble expression and purification of porcine pepsinogen from Pichia pastoris // Protein Expr Purif. - 2002. - Vol. 25. № 2. - P. 229-36. https://www.doi.org/10.1016/s1046-5928(02)00003-1

169. Zepeda A. B., Pessoa A., Jr., Farias J. G. Carbon metabolism influenced for promoters and temperature used in the heterologous protein production using Pichia pastoris yeast // Braz J Microbiol. - 2018. - Vol. 49 Suppl 1. № Suppl 1. - P. 119-127. https://www.doi.org/10.1016/i.bim.2018.03.010

170. Zhan R., Mu W., Jiang B., Zhou L., Zhang T. Efficient secretion of inulin fructotransferase in Pichia pastoris using the formaldehyde dehydrogenase 1 promoter // J Ind Microbiol Biotechnol. - 2014. - Vol. 41. № 12. - P. 1783-91. https://www.doi. org/10.1007/s10295-014-1516-2

171. Zhang J. G., Wang X. D., Zhang J. N., Wei D. Z. Oxygen vectors used for S-adenosylmethionine production in recombinant Pichia pastoris with sorbitol as supplemental carbon source // J Biosci Bioeng. - 2008. - Vol. 105. № 4. - P. 335-40. https://www. doi. org/10.1263/ibb.105.335

172. Zhang P., Chen Q., Fu G., Xia L., Hu X. Regulation and metabolic engineering strategies for permeases of Saccharomyces cerevisiae // World J Microbiol Biotechnol. - 2019. - Vol. 35. № 7. - P. 112. https://www.doi.org/10.1007/s11274-019-2684-z

173. Zhang W., Zhou J., Gu Q., Sun R., Yang W., Lu Y. [et al.] Heterologous expression of GH5 chitosanase in Pichia pastoris and antioxidant biological activity of its chitooligosacchride hydrolysate // J Biotechnol. - 2022. - Vol. 348. - P. 55 -63. https://www. doi. org/10.1016/i .ibiotec.2022.03.005

174. Zhu T., Sun H., Wang M., Li Y. Pichia pastoris as a Versatile Cell Factory for the Production of Industrial Enzymes and Chemicals: Current Status and Future Perspectives // Biotechnol J. - 2019. - Vol. 14. № 6. - P. e1800694. https://www.doi.org/10.1002/biot.201800694