Разработка биотехнологии рекомбинантной фосфолипазы А2 Komagataella phaffii тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Бытяк Денис Сергеевич

• Бытяк Денис Сергеевич
• кандидат наук
• 2024

Оглавление диссертации кандидат наук Бытяк Денис Сергеевич

ВВЕДЕНИЕ

1. ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Классификация и свойства фосфолипаз

1.2. Специфичность фосфолипазы А2 и ее применение

1.3. Синтез фосфолипазы А2

1.4. Перспективные платформы для экспрессии рекомбинантных белков

1.5. Дрожжевые экспрессионные системы

1.6. Komagataella phaffii - как экспрессионная система

1.7. Метаболизм метанола в клетках Komagataella phaffii

1.8. Особенности культивирования Komagataella phaffii

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы

2.2. Методы исследований

ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА ШТАММА-ПРОДУЦЕНТА ФОСФОЛИПАЗЫ А2

3.1. Получение ауксотрофного штамма KomagataellaрИа$И У1В-А!еы2

3.2. Получение штамма-продуцента фосфолипазы А2 на основе ауксотрофного штамма Komagataella phaffii YIB /\leu2

3.3. Молекулярно-генетическое исследование штамма-продуцента

3.4. Исследование морфологических характеристик штамма-продуцента

ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ФОСФОЛИПАЗЫ_А2

4.1. Повышение растворимости питательной среды BSM

4.2. Исследование влияние кукурузного экстракта на прирост биомассы

4.3. Определение оптимальных параметров ведения культивирования Komagataella phaffii YIB /\ley2_PLA2Sv

4.4. Исследование удельной скорости роста и потребления глицерина

4.5. Разработка стратегии индукции AOX1-промотора

4.6. Оценка селективности керамических фильтров

4.7. Определение оптимальной степени концентрирования

4.8. Восстановление фильтрующей способности фильтров

4.9. Удаление ДНК штамма-продуцента

4.10. Схема получения фосфолипазы А2

ГЛАВА 5. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА «ФОСФОЛИПАЗА А2» И ПРАТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ

5.1. Исследование влияния pH на ферментативную активность

5.2. Исследование условий инактивации ферментативной активности

5.3. Исследование влияния температуры на активность фосфолипазы А2

5.4. Исследование стабильности ферментного препарата «Фосфолипаза А2» в процессе хранения

5.5. Практическое применение полученного ферментного препарата «Фосфолипаза А2»

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка биотехнологии рекомбинантной фосфолипазы А2 Komagataella phaffii»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. В настоящее время использование ферментов обеспечивает более высокие качественные показатели продукта по сравнению с аналогами, производимыми с использованием традиционных технологий. В связи с этим растет спрос на микробиологические ферментные препараты, которые все чаще заменяют классические химические катализаторы в ряде промышленных процессов. Однако, российский рынок промышленных ферментов продолжает оставаться ненасыщенным, при этом промышленные предприятия отдают предпочтение импортным ферментным препаратам. [1]

Важную роль в пищевой промышленности играет фосфолипаза А2 (PLA2), которая применяется в производстве пищевых масел, комбинированных сычужных сыров, сырных продуктов, хлебобулочных изделий, эмульгаторов, в том числе, при производстве энзиматически-модифицированного яичного желтка, применяемого в качестве эмульгатора в рецептуре майонеза. [109]

Емкость мирового рынка фосфолипазы A2 в натуральном выражении составила более 350 тонн в 2018 году в соответствии с данными компании Future Market Insights (FMI), при этом 68,3 % PLA2 производится микробиологическим путем, что подчеркивает предпочтительность данного способа получения фермента, 23,1 % PLA2 получают из животного сырья и 8,6 % PLA2 из растительного сырья. Емкость мирового рынка фосфолипазы А2 в стоимостном выражении составила 224 млрд $ в 2021-м году, и ожидается совокупный годовой темп роста на уровне 6,15 % в течение прогнозного периода (2022-2032). [2]

На территории Российской Федерации наиболее широко используется PLA2 микробиологического происхождения. В соответствии с Техническим регламентом Таможенного союза ТР ТС 021/2011 о безопасности пищевой продукции, рекомбинантная PLA2 микробиологического происхождения относится к продукции нового вида и подлежит государственной регистрации.

Предпочтительность микробиологического способа получения рекомбинантной фосфолипазы А2 объясняется оптимальными физико-

химическими характеристиками фермента, обеспечивающими возможность ведения эффективного технологического процесса производства продуктов с заданными реологическими свойствами. Однако на сегодняшний день в Российской Федерации не существует технологии получения секреторной фосфолипазы А2 микробного происхождения. В связи с этим, в рамках повышения продовольственной безопасности страны и развития потенциала импортозамещения ферментативной продукции, актуальным является разработка технологии получения отечественного ферментного препарата «Фосфолипаза А2».

Степень разработанности темы. Значительный вклад в исследования в области биотехнологического синтеза рекомбинантных белков, в том числе обладающих ферментативной активностью с помощью Komagataella, внесли ведущие отечественные и зарубежные ученые: Падкина М. В., Самбук Е. В. [3], Тюрин О. В., Козлов Д. Г [4], Rachel Daly [5], G Gellissen [6], Cletus Paul Kurtzman [7], James M. Cregg [8], Kevin J. Barringer [8].

Однако, несмотря на достаточно большое количество исследований и экспериментальных данных, на сегодняшний день не существует технологии получения секреторной фосфолипазы А2 посредством рекомбинантного генно-инженерного штамма Komagataella phaffii, что требует углубления и расширения научных данных, направленных на практическую реализацию.

Цель работы: Разработка технологии получения высокоактивной отечественной фосфолипазы А2, с применением генно-инженерно-модифицированного штамма Komagataella phaffii. Задачи научного исследования:

1. Получить ауксотрофный штамм Komagataella phaffii YIB-Aleu2, на основе штамма-реципиента Komagataella phaffii Y-3489.

2. Создать генно-инженерно-модифицированный штамм-продуцент рекомбинантного белка PLA2, на основе ауксотрофного штамма Komagataella phaffii YIB-Aleu2.

3. Оптимизировать состав питательной среды и условия культивирования генно-инженерно-модифицированного штамма-продуцента фосфолипазы А2 в лабораторных условиях.

4. Исследовать индукцию AOX1-промотора и экспрессию рекомбинантного белка PLA2.

5. Получить ферментный препарат, на основе штамма-продуцента, обладающий фосфолиполитической активностью.

6. Исследовать физико-химические характеристики ферментного препарата.

7. Наработать экспериментальную партию пищевой продукции с использованием ферментного препарата фосфолипазы А2.

Научная новизна. Впервые получен штамм дрожжей Komagataella phaffii YIB А1еи2, ауксотрофный по лейцину (депонирован в ВКПМ Y-4761) и доказана возможность его использования в качестве штамма-реципиента при сборке коммерческого штамма-продуцента фосфолипазы А2.

Впервые разработан и охарактеризован штамм Komagataella phaffii У1В /\ley2_PLA2Sv (депонирован в ВКПМ Y-4513), обеспечивающий синтез рекомбинантной фосфолипазы А2 в культуральную жидкость.

Установлено, что использование Komagataella phaffii YIB /\ley2_PLA2Sv (депонирован в ВКПМ Y-4513) обеспечивает получение ферментного препарата «Фосфолипаза А2», обладающего ферментативной активностью, сопоставимой с коммерческими аналогами.

Определены оптимальные параметры культивирования Komagataella phaffii YIB /\ley2_PLA2Sv, в том числе установлено, что при температуре в диапазоне от 28,2 °С до 31,0 °С и pH в диапазоне от 6,1 до 6,3 концентрация биомассы в колбах достигает более 87 г/л. Показано, что содержание метанола в среде от 0,6 % до 2 % способствует индукции AOX1 промотора и синтезу рекомбинантного белка «Фосфолипаза А2» в концентрации не менее 1,87 г/л.

Установлено, что применение ПолиДАДМАХ обеспечивает удаление ДНК штамма-продуцента из раствора ферментного препарата.

Показано, что применение керамических фильтрационных модулей Таш1, селективностью 10 кДа, обеспечивает концентрирование и получение ферментного препарата активностью 17 979 ед/мл.

Исследованы физико-химические характеристики произведенного ферментного препарата, в том числе показано, что при значениях рН субстрата 8,5 и температуре 55 °С, фосфолипаза А2 обладает наибольшей ферментативной активностью. Также установлено, что полное подавление активности фермента достигается при 67,37 °С и времени экспозиции 56 минут. Продемонстрировано, что через 12 месяцев хранения ферментного препарата, активность составляет более 10 500 ед/мл.

Теоретическая и практическая значимость. Получены новые и расширены существующие знания о экспрессии рекомбинантных белков, при культивировании Komagataella phaffii. Результаты исследовательской части могут быть использованы для более глубокого изучения экспрессии фосфолипазы А2, в составе плазмиды pSEA-LEU-PLA2Sv под контролем промотора гена АОХ1, содержащего области, обеспечивающие активацию транскрипции в присутствии метанола в культуральной среде.

Разработанная в ходе выполнения работы методика определения ферментативной активности фосфолипазы А2 позволяет исследовать остаточную ферментативную активность в пищевой продукции.

Практическая значимость исследования достигается созданием генетической конструкции в виде рекомбинантного вектора pSEA-LEU-PLA2Sv и штамма Komagataella phaffii (Р1сЫа pastoris) У1В Aleu2_PLA2Sv, обеспечивающих индуцируемый синтез с высоким и стабильным выходом рекомбинантной фосфолипазы А2 в культуральную среду. На основании проведенных исследований, разработан технологический процесс, обеспечивающий получение ферментного препарата фосфолипазы А2, который может быть интегрирован в промышленное производство. Технологическая новизна подтверждена соответствующими патентами: Яи2746817С1 «Способ получения штамма-продуцента фосфолипазы А2 Коша§а1ае11а рИаГ1:11 У1В Aleu2_PLA2Sv»,

RU2676321С1 «Способ получения ферментного препарата фосфолипазы А2 с применением рекомбинантного штамма-продуцента Pichia pastoris Х-33/ pPICZaA-Р^А2^У». Показана возможность применения полученного ферментного препарата в процессе производства ферментированного яичного желтка, применяемого при производстве майонезной продукции. Положения, выносимые на защиту.

1. Ауксотрофный штамм Komagataella phaffii У1Б-А1еи2, не способный к росту на питательной среде без лейцина.

2. Генно-инженерно-модифицированный штамм на основе ауксотрофного штамма Komagataella phaffii УШ-А1еи2, продуцент высокоактивной рекомбинантной PLA2.

3. Состав питательной среды и условия культивирования генно-инженерно-модифицированного штамма-продуцента фосфолипазы А2 в лабораторных условиях.

4. Индукция AOX1-промотора обеспечивает экспрессию рекомбинантного белка PLA2.

5. Ферментный препарат, на основе штамма-продуцента, обладающий фосфолиполитической активностью.

6. Максимальная ферментативная активность ферментного препарата достигается при pH 8,5 ±0,5 и температуре 50 - 55 °С, а полная инактивация ферментного препарата обеспечивается при 67,37 °С за 56 минут.

7. Ферментный препарат фосфолипазы А2 обеспечивает получение майонеза с заданными реологическими свойствами.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности.

Диссертационное исследование соответствует п.п. 1, 2, 6, 7 паспорта специальности 2.7.1 - «Биотехнологии пищевых продуктов, лекарственных и биологически активных веществ».

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста, содержит 55 таблиц, 42 рисунка, 14 формул и состоит из введения, аналитического обзора литературы, объектов и методов исследований,

результатов исследований, заключения и списка используемой литературы, включающего 113 наименований, в том числе 110 на иностранном языке.

Личный вклад автора. Автор провел поиск и анализ информации по исследуемой проблеме, сформулировал цель и задачи исследования, выполнил выбор объектов исследования, экспериментальных установок и методик проведения исследований. Выполнил основную часть экспериментальных исследований, направленных на разработку технологии получения фосфолипазы А2. Автором проведена апробация результатов предлагаемых технологических решений.

Публикации. По материалам диссертационного исследования опубликовано 10 научных работ, из них: 4 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК, 1 статья в Scopus, 2 тезисов докладов, 2 патента РФ и 1 свидетельство об аттестации методики измерений.

1. ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Классификация и свойства фосфолипаз

Фосфолипазы - это группа ферментов, относящихся к классу гидролаз, катализирующих гидролиз фосфоглицеридов. В соответствии с международной классификацией ферментов присвоен шифр «ЕС 3.1.». В зависимости от позиционной специфичности фосфолипазы (положения гидролизуемой связи в фосфолипиде), различают следующие семейства фосфолипаз: А1, А2, В, С и D (рис. 1.1.1. [9]

PLC ОН

Рисунок. 1.1.1. Позиционная специфичность фосфолипаз.

R1 и R2 - алкильные цепи жирных кислот; X - полярная группа фосфолипида Фосфолипаза А1 (PLA1) - катализирует гидролиз сложноэфирной связи фосфолипида в sn-1 положении, в результате чего высвобождается свободная жирная кислота и 1-ацил-лизофосфолипид. На сегодняшний день известны PLA1 животных, растений и микроорганизмов. При этом молекулярные массы PLA1 варьируются в диапазоне от 15 кДа до 90 кДа.

PLA1 млекопитающих представлены шестью внеклеточными ферментами (PS-PLA1), и тремя внутриклеточными ферментами (PS-PLA1, MPA-PLA1a, MPA-PLA1P). [10], [11]

Известна PLA1 DAD1 (Defectivein Anther Dehiscence), полученная из Резуховидки Таля (лат. Arabidopsis thaliana) участвующая в синтезе жасминовой кислоты [12], Также PLA1 обнаружена в бактериях (Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Escherichia coli, Mycobacterphlei) дрожжах и грибках. [13]

Известно, что PLA1 участвуют в различных биохимических реакциях, так внутриклеточные PLA1 участвуют в везикулярном транспорте и сперматогенезе, а внеклеточные PLA1 участвует в процессах апоптоза и свертывания крови. [10]

Несмотря на то, что PLA1 изучена достаточно слабо, механизм действия PLA1 позволяет применять ее в пищевой промышленности, в сыроделии. Так известен способ повышения выхода сыра, при использовании коммерческого препарата PLA1 «YieldMax», за счет повышения удержания жира во время отделения сыворотки. Однако промышленное применение PLA1 ограничено из-за низкой коммерческой доступности. [2]

Фосфолипаза А2 (PLA2) содержит множество различных ферментов, которые подразделяются на несколько отдельных семейств по структурному и биохимическому признаку. PLA2 катализируют гидролиз сложноэфирной связи sn-2 во множестве различных фосфолипидов. При этом в sn-2 положении глицеринового остатка фосфолипида могут быть локализованы различные жирные кислоты, в том числе арахидоновая и эйкозапентаеновая кислоты. Таким образом в ходе реакции высвобождаются жирные кислоты и лизофосфолипиды, которые играют множество различных важных физиологических ролей. [23]

В настоящее время выделяют три основные класса PLA2:

1. Секреторные;

2. Цитозольные;

3. Са2+-независимые. [25]

Секреторные фосфолипазы А2 (sPLA2) являются водорастворимыми ферментами с молекулярной массой 10 - 19 кДа, каталитическая активность которых проявляется в присутствии ионов Са2+, при pH от 7 до 9. [26] Благодаря наличию достаточно большого числа серосодержащих остатков цистеина, sPLA2 содержат 6 - 8 дисульфидных связей, обеспечивающих стабильность структуры

фермента. На сегодняшний день известны шестнадцать групп sPLA2 (IA, IB, IIA, IIB, IIC, IID, IIE, IIF, III, V, IX, X, XIA, XIB, XII, XIV) с различной первичной структурой, выделенные из яда кобр, желез человека, свиньи, быка, улитки, растений и микроорганизмов. [27] Вне зависимости от различий первичной структуры, в активном центре обнаружены остатки гистидина и аспарагиновой кислоты [28] обеспечивающие идентичную структурную укладку. На рисунке 1.1.2. показана трехмерная структура свиной панкреатической секреторной фосфолипазы А2 группы IB по данным ЯМР (PDB ID 1PIR). Кальций-связывающий центр выделен красным цветом, остатки активного центра His48 и Asp49 выделены зеленым, ион кальция выделен серым.

Рисунок 1.1.2. Трехмерная структура свиной панкреатической секреторной фосфолипазы А2 группы 1В по данным ЯМР (PDB ГО 1РГО)

Фосфолипазы А2 групп I, II, V, X содержат три длинные альфаспирали, два бета-тяжа и консервативную Са2+-связывающую петлю. Растительные sPLA2 группы XI не содержат бета тяжей. Для групп III и XIV характерны уникальные укладки полипептидных цепей. Пространственная структура фосфолипаз группы ХНА выделяется необычной кальций-связывающей петлей.

Группа IA является наиболее изученной группой фосфолипаз А2 и рассматривается как важная модель для всей энзимологии фосфолипаз А2. На её примере можно оценить, какими необычными для ферментов структурными характеристиками обладают PLA2. sPLA2 группы IA содержат 7 высоко консервативных дисульфидных мостов. Связывание иона кальция осуществляется за счет консервативного остатка аспартата, карбонильных кислородов тирозина и глицинов кальций связывающей петли. Присутствие кальция критично для гидролиза. sPLA2 не образуют классического интермедиата ацил-фермент, характерного для сериновых протеаз. Гистидин при поддержке остатка аспарагиновой кислоты поляризует молекулу воды, которая атакует карбонильную группу фосфолипида. Ион кальция позволяет стабилизировать переходное состояние, координируя карбонильную группу и отрицательный заряд фосфата. Предполагается, что только 9-10 углеродов цепи sn-2 фосфолипида взаимодействуют с ферментом, остальная часть погружена в липидный бислой. Таким образом объясняется отсутствие специфичности sPLA2 к отдельным жирным кислотам в положении sn-2 фосфолипида. Гидрофобные остатки Leu-2, Phe-5, Trp-19, Tyr-52, Tyr-69 окружают ацильную цепь липида. Образуя участок, в который входит молекула фосфолипида после ее связывания с белком. [31] Активность большинства PLA2 зависит от их способности взаимодействовать с липидными агрегатами. Способность проявлять ферментативную активность на границе двух фаз - отличительная способность фосфолипаз как ферментов. PLA2 группы IA способны гидролизовать биполярно-заряженные липиды. Мембран-связывающий участок PLA2 группы IA образован прежде всего гидрофобными остатками Tyr-3, Tpr-61, Tyr-63, Phe-64, проникающими в липидный бислой. Это позволяет получить доступ к липидному субстрату. [31]

Ферменты sPLA2 не проявляют избирательности в отношении жирнокислотного состава фосфолипидов, но показывают большее сродство к субстратам, содержащим отрицательно заряженные фосфолипиды (фосфатидную кислоту и фосфатидилглицерол). [32], [33] В 1989 г. была открыта и клонирована фосфолипаза группы IIA, содержащаяся в секреторных гранулах тромбоцитов, и

концентрация которой значительно увеличивается в местах воспаления, в синовиальной жидкости при ревматоидном артрите. [34] Фосфолипазы, обнаруженные в ядах пчел и ящериц, были отнесены к группе III. Открытие белков групп IIC и V привело к пересмотру роли этого семейства белков в регуляции функций клеток и интенсивному поиску новых аналогов. [35], [36] Секреторные фосфолипазы А2 являются важным компонентом змеиного яда. [37] Благодаря им обеспечиваются значительные цитотоксические эффекты, а некоторые из них обладают также нейротоксическими, гемотоксическими и антикоагулянтными активностями. [38]

Кальций-независимые фосфолипазы а2. Впервые кальций-независимая фосфолипаза А2, относящаяся к группе VIA, выделена и очищена в 1994 году из линии макрофагоподобных клеток P388D1. [39] Классическая кальций-независимая фосфолипаза А2 (iPLA2-VIA) существует в олигомерной форме и имеет несколько сплайс-вариантов, из которых, по крайней мере, два (VIA-1 и VIA-2) обладают ферментативной активностью. Белок iPLA2-VIA-1 имеет молекулярную массу 85 - 88 кДа, содержит 8 анкириновых повторов в области N-конца, каталитический домен с характерной аминокислотной последовательностью GXSXG, где S - серин-465 действует как центр катализа. Имеется также ATP-связывающая последовательность GXGXXG. Около С-конца (в области аминокислотных остатков 694-705) существует связывающая область для калмодулина. Образование комплекса белка iPLA2-VIA с активированным калмодулином (т. е. в присутствии ионов Ca2+) приводит к инактивации данной фосфолипазы. Хотя обе сплайс-формы VIA-1 и VIA-2 имеют ATP- связывающие последовательности, показано, что только белок iPLA2-VIA-2, но не iPLA2-VIA-1, повышает свою активность в несколько раз в присутствии ATP. [40] На рисунке 1.1.3. показана трехмерная структура кальций-независимой фосфолипазы А2 ß (PDB ID 6AUN).

г ф?

Рисунок 1.1.3. Трехмерная структура кальций-независимой фосфолипазы А2 в

(РББ ГО 6АЦЫ).

Зеленым выделен каталитический домен, красным выделены остатки активного центра Бег465 и Авр598. Желтым выделен анкириновый домен и синим выделен неразрушенный участок анкиринового домена.

Анкириновые повторы встречаются более чем в 400 протеинах, включая регуляторы клеточного цикла, факторы транскрипции, токсины, ингибиторы и энзимы. [41] Считается, что общей функцией данного мотива является посредничество белок - белковых взаимодействий. Фосфолипаза iPLA2-VIA не специфична к природе жирных кислот в положении бп-2 и заместителю в положении sn-3 фосфолипида, полностью активна в отсутствие кальция и осуществляет межфазный катализ. Фермент также проявляет лизофосфолипазную активность по положению sn-1, трансацилазную активность и активность, характерную для белка РАБ-АН. [42]

Белок iPLA2-VIB содержит липазный мотив GVSTG, где серин-483 находится в каталитическом центре; АТР-связывающий мотив; мотив сигнала локализации в пероксисомах на С- конце молекулы. Обе кальций-независимые фосфолипазы (iPLA2-VIA и iPLA2-VIB) являются мембраносвязанными белками. Белки данного семейства играют большую роль в передаче трансмембранных сигналов, регулировании функций миокарда и ЦНС, апоптозе клеток. [42], [43] Начальное представление о функциях iPLA2 было получено при помощи

ингибитора iPLA2 бромоеноллактона. [44] Удалось установить, что iPLA2 играет важную роль в формировании костей, апоптозе, регуляции секреции инсулина, развитии сперматозоидов. При помощи нокаутных по iPLA2 мышей удалось прояснить роль кальций-независимой фосфолипазы А2 в развитии валлеровой дегенерации нервной ткани и регенерации аксонов. [45]

Цитозольные фосфолипазы а2. История цитозольных фосфолипаз группы А2 началась в 1991 г., когда из нейтрофилов и тромбоцитов человека был выделен и клонирован белок молекулярной массой 85 кДа, который кроме молекулярной массы отличался от известных к тому времени фосфолипаз отсутствием дисульфидных мостиков и чувствительностью к кальцию. Цитозольные PLA2 относят к группе VI. Сегодня cPLA2 получен из мозга, почек, селезенки, легких, макрофагов, нейтрофилов, альвеолярных эпителиальных клеток и др. [46]

Называясь «цитозольным», фермент действует тем не менее на субстраты, локализованные на мембранах цитоплазматического ретикулума и ядра, а не находящиеся в мономерной форме в растворе. Основной особенностью этого изотипа фермента является то, что он наиболее активно гидролизует фосфолипидные субстраты, содержащие во втором положении арахидоновую кислоту. Указанные свойства cPLA2 определяются пространственной структурой, включающей в себя амфифильную «крышку» (аминокислотный участок 415 - 432), которая не позволяет остатку жирной кислоты проникнуть в туннель активного центра. Однако при взаимодействии с анионными липидами мембраны, «крышка» открывается. [47]

Цитозольные PLA2, также, как и sPLA2, относят к кальций-зависимым ферментам. Однако, как правило, cPLA2 значительно крупнее (700 аминокислот и более) и содержат специфичный С2 домен, обеспечивающий гидрофобное взаимодействие фермента с мембраной, или фосфолипидными мицеллами, а не осуществления каталитического механизма, как в случае с sPLA2. [48] На рисунке 1.1.4. показана трехмерная структура цитозольной человеческой фосфолипазы А2 (PDB ГО 1CJY).

у

«УС

Рисунок 1.1.4. Трехмерная структура цитозольной человеческой фосфолипазы А2 (PDB ID 1CJY). Кальций-связывающий домен C2cPLA2 выделен желтым цветом, каталитический домен cPLA2_Grp-IVA - фиолетовым. Ионы кальция - серым.

При этом цитозольные PLA2 становится активным по отношению к липид-белковым взаимодействиям в результате фосфорилирования митоген-активируемыми протеинкиназами и протеинкиназой С. Фосфорилированию подвергаются остатки Ser 505, Ser 515, Ser 727. За счет фосфорилирования cPLA2 повышается сродство к ионам Са2+, тем самым понижается концентрация кальция, необходимая для связывания с мембраной. [49]

Фермент практически не различает группы в положении sn-1, но обладает специфичностью к фосфолипидам, содержащим арахидоновую кислоту в положении sn-2. Олеиновая (18:1) и линолевая (18:2) кислоты под действием cPLA2a слабо отщепляются от соответствующих фосфолипидов, но а-линолевая (18:3) и эйкозапентаеновая (20:5) кислоты имеют преимущества перед арахидоновой кислотой. Поскольку указанные кислоты находятся в клетках в крайне низких концентрациях, то фосфолипиды с арахидоновой кислотой в положении sn-2 становятся основным субстратом. [50]

Помимо фосфолипазной активности cPLA2 способна отщеплять ацильную цепь из положения sn-1 лизофосфолипида, тем самым проявляя липазную активность. Лизофосфолипазная активность обеспечивает сохранение функций клеточных мембран клетки при повышенных концентрациях лизофосфолипидов. На проявление и интенсивность лизофосфолипазной активности не влияет концентрация Ca2+, при этом фермент может также проявлять трансацилазную активность. Биологическое значение этой активности изучается. [50]

Цитозольная PLA2 значительно отличается от sPLA2 и фермента, содержащегося в ядах змей и пчел. Обладает в 6 раз большей молекулярной массой и на порядок более низкой потребностью в ионах кальция. [51]

Таким образом, из представленного описания видно, что первичная последовательность и пространственная структура фосфолипаз оказывает значимое влияние на проявление ферментативной активности, субстратной специфичности и потребности в наличии ко-фактора. Важно учитывать, что различия в структурных и биохимических признаках формируют предпочтения для применения в промышленности. Учитывая это, наибольший коммерческий интерес проявляется к синтетическим Ca+2-зависимым фосфолипазам и является ключевым объектом исследования в настоящей работе. [56]

Фосфолипаза B (PLB) - катализирует последовательное отщепление жирных кислот как в sn-1, так и в sn-2 положениях фосфолипида, тем самым проявляя свойства PLA1 и PLA2 одновременно. PLB выделены из тканей млекопитающих, ядов животных, растений и микроорганизмов. [15] При этом молекулярные массы PLB варьируются в диапазоне от 15 кДа до 65 кДа. PLB катализируют лизис биологических мембран, чем и обусловливается их токсическое действие. Некоторые микроорганизмы и растения «используют» PLB в качестве фактора вирулентности за счет литической активности. PLB применяется при дегуммировании растительных масел и производстве сыров. [9]

Фосфолипаза C (PLC) - катализирует гидролиз глицерофосфата, в результате чего образуется фосфат-содержащая полярная группа и диацилглицерин. PLC подразделяют на две категории: 1) фосфатидилинозитол-

специфичные (PI-PLC) и 2) фосфатидилхолин-неспецифичные (PC-PLC). Молекулярные массы PLC варьируются в диапазоне от 23 кДа до 51 кДа. PI-PLC растений принимают участие в стрессовых реакциях и ростовых регуляциях. [16] PI-PLC млекопитающих участвует в метаболизме фосфатидилинозитола и передаче сигналов. PI-PLC микроорганизмов (Clostridium spp., Bacillus spp., Pseudomonas spp.) выполняет роль патогена. [17] PC-PLC также обнаружены в животных, растениях и микроорганизмах. PC-PLC вовлечены в процессы гормональной регуляции, метаболизм фосфолипидов и стресс-сигнализации. [18]

В пищевой промышленности PLC применяется в процессе рафинирования различных растительных масел, с целью удаления фосфолипидов, способствующих порче продукта. Например, для этих целей используют ферментный препарат Purifine, Verenium, полученный из B. anthracis. [2]

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Бытяк Денис Сергеевич, 2024 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Толкочева А. А. Ферменты промышленного назначения - обзор рынка ферментных препаратов и перспективы его развития/ А. А. Толкочева, Д. А. Черенков, О. С. Корнеева, П. Г. Пономарев // Вестник Воронежского государственного университета инженерных технологий. 2017 (79) №4. С. 197-203.

2. Phospholipase Enzyme Market by Product Type (phospholipase A1 A2, C, B, D), Source (animal, microbial, botanical) & Region - Forecast 2022 - 2032. January 2022 REP-GB-2043

3. Падкина М. В. Сравнительный анализ экспрессии гетерологичных генов в дрожжах Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris и изучение условий повышения продукции рекомбинантных белков: 03.00.15 "Генетика»: диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук / Падкина Марина Владимировна; Санкт-Петербургский государственный университет. - Санкт-Петербург, 2005. - 394 с.

4. Tyurin O. V. Amplification of leader proregions as a mean to increase the secretion of antibody fragments in the Pichia pastoris yeast. / O. V. Tyurin, I. I. Gubaydulin, S. E. Cheperegin, B. D. Efimov, D. G. Kozlov // Applied Biochemistry and Microbiology. 2013. - Vol. 49 (7). - PP. 656 - 659.

5. Daly R. Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production / R. Daly, T. W. Milton Hearn // J Mol Recognit. 2005. - Vol. 18 (2). - PP. 119 - 138. doi: 10.1002/jmr.687.

6. Gellissen G. Heterologous protein production in methylotrophic yeasts / G. Gellissen // Applied Microbiology and Biotechnology. 2000. - Vol. 54. - PP. 741 -750. doi: 10.1007/s002530000464.

7. Kurtzman C. P. Biotechnological strains of Komagataella (Pichia) pastoris are Komagataella phaffii as determined from multigene sequence analysis / Cletus Paul Kurtzman // J Ind Microbiol Biotechnol. 2009. - Vol. 36 (11). - PP. 1435 - 8. doi: 10.1007/s10295-009-0638-4.

8. Cregg J. M. Pichia pastoris as a Host System for Transformations / James M. Cregg, K. J. Barringer, A. Y. Hessler, K. R. Madden // Molecular and Cellular Biology. 1985. - Vol. 5 (12). - PP. 3376 - 3385. doi: 10.1128/mcb.5.12.3376

9. Borrelli G. Recombinant lipases and phospholipases and their use as biocatalysts for industrial applications / Grazia M. Borrelli, D. Trono // International journal of molecular sciences. 2015. - Vol. 16 (9). - PP. 20774 - 20840. doi: 10.3390/ijms160920774

10.Richmond G. S. Phospholipases A1 / G. S. Richmond, T. K. Smith // International journal of molecular sciences. 2011.- Vol. 12 (1). - PP. 588 - 612. doi: 10.3390/ijms12010588

11.Arpigny J. L. Bacterial lipolytic enzymes: classification and properties / J. L. Arpigny, K. E. Jaeger //Biochemical journal. 1999. - Vol. 343 (1). - PP. 177 - 183 doi: 10.1042/0264-6021:3430177

12.Wasternack C. Jasmonates: biosynthesis, perception, signal transduction and action in plant stress response, growth and development. Anupdate to the 2007 review in Annals of Botany / C. Wasternack, B Hause // Annals of botany. 2013. - Vol. 111 (6). -PP. 1021 - 1058. doiI: 10.1093/aob/mct067

13.Murayama K. Crystal structure of phospholipase A1 from Streptomyces albidoflavus NA297 / K. Mureyama, K. Kano, Y. Matsumoto, D. Sugimori // Journal of structural biology. 2013. - Vol. 182 (2). - PP. 192 - 196. doi.org/10.1016/j.jsb.2013.02.003

14.Schaloske R. H. The phospholipase A 2 superfamily and its group numbering system / R. H. Schaloske, E. A. Dennis // Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids. 2006. - Vol. 1761 (11). - PP. 1246 - 1259. doi: 10.1016/J.BBALIP.2006.07.011

15.Xu Shengyuan.The identification of a phospholipase B precursor in human neutrophils / S. Xu, L. Zhao, A. Larsson, P. Venge // The FEBS journal. 2009. -Vol. 276 (1). - PP. 175 - 186. doi: 10.1111/j.1742-4658.2008. 06771.x

16.Rupwate S. D. Plant phosphoinositide-specific phospholipase C: an insight / D. S. Rupwate, R. Rajasekharan // Plant signaling and behavior. 2012. - Vol. 7 (10). -PP. 1281 - 1283. doi: 10.4161/psb.21436

17.Djordjevic J. Role of phospholipases in fungal fitness, pathogenicity, and drug development-lessons from Cryptococcus neoformans / Julianne Teresa Djordjevic // Frontiers in microbiology. 2010. - Vol. 1 (125). doi: 10.3389/fmicb.2010.00125

18.Pokotylo I. Plant phosphoinositide-dependent phospholipases C: variations around a canonical theme / I. Pokotylo, Y. Kolesnikov, V. Kravets, A. Zachowski, E. Ruelland. // Biochimie. 2014. -Vol. 96. - PP. 144 - 57. doi: 10.1016/j.biochi.2013.07.004.

19.Woolley P. Lipases: their structure, biochemistry and application / P. Woolley, S. B. Petersen // The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 1996. -Vol. 28. - PP. 831-832.

20.Selvy P. E. Phospholipase D: enzymology, functionality, and chemical modulation / P. E. Selvy, R. R. Lavieri, C. W. Lindsley, H. A. Brown // Chemical reviews. 2011. - Vol. 111 (10). - PP. 6064 - 6119. doi: 10.1021/cr200296t

21.Nakazawa Y. Streptomyces phospholipase D cloning and production / Yozo Nakazawa // In Lipases and Phospho lipases. 2012. - Vol. 861. - PP. 179-200. doi: 10.1007/978-1 -61779-600-5_12

22.Pokotylo I. The plant non-specific phospholipase C gene family. Novel competitors in lipid signalling / I. Pokotylo, P. Pejchar, M. Potocky, D. Kocourkova, Z. Krckova, E. Ruelland, J. Martinec // Progress in lipid research. 2013. - Vol. 52 (1). - PP. 62 - 79. doi: 10.1016/j.plipres.2012.09.001

23.Aloulou A. Phospholipases: an overview. In Lipases and phospholipases / A. Aloulou, Y. B. Ali, S. Bezzine, Y. Gargouri, M. H. Gelb // In Lipases and Phospho lipases. 2012. - Vol. 861. - PP. 63-85. doi: 10.1007/978-1-61779-600-5_4

24.Murakami M. Regulatory Functions of Phos pholipase A2 / M. Murakami, Y. Nakatani, G. Atsumi, K. Inoue, I. Kudo // Critical Reviews in Immunology. 2017. - Vol. 37. - PP. 121-195. doi: 10.1615/CritRevImmunol.v37. i2-6.20.

25.Schaloske R. H. The phospholipase A 2 superfamily and its group numbering system / R. H. Schaloske, E. A. Dennis // Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids. 2006. - Vol. 1761 (11). - PP. 1246 - 1259. doi: 10.1016/J.BBALIP.2006.07.011

26.Van den Bergh C. J. Secretion of biologically active porcine prophospholipase A2 by Saccharomyces cerevisiae. Use of the prepro sequence of the alphamating factor / C. J. van deb Bergh, A. C. Bekkers, P. De Geus, H. M. Verheij, G. H. de Haas // European Journal of Biochemistry. 1987. - Vol. 170. - PP. 241 - 246. doi: 10.1111/j.1432-1033.1987.tb13691.x.

27.Dennis E.A. Phospholipase A2 enzymes: physical structure, biological function, disease implication, chemical inhibition, and therapeutic intervention / E. A. Dennis, J. Cao, E. Hsu, H. Y.-H, V. Magrioti, G. Kokotos // Chemical Reviews. 2011. - Vol. 111 (10). - PP. 6130-6185. doi: 10.1021/cr200085w

28.Rogalska E. Stereoselective hydrolysis of triglycerides by animal and microbial lipases / E. Rogalska, C.Cudrey, F. Ferrato, R. Verger // Chirality. 2000. - Vol. 5 (1). - PP. 24 - 30. doi: 10.1002/chir.530050106

29.Soragni E. A nutrient-regulated, dual localization phospholipase A(2) in the symbiotic fungus Tuber borchii / E. soragni, A. Bolchi, R. Balestrini, C. Gambaretto, R. Percudani, P. Bonfante, S. Ottonello // EMBO Journal. 2001. - Vol. 20. - PP. 5079 - 90. doi: 10.1093/emboj/20.18.5079.

30.Valentin E. Novel human secreted phospholipase A(2) with homology to the group III bee venom enzyme / E. Valentin, F. Ghomashchi, M. H. Gelb, M. Lazdunski, G. Lambeau // Journal of Biological Chemistry. 2000. - Vol. 275. - PP. 74927496. doi: 10.1074/JBC.275.11.7492

31.Burke J.E. Interaction of Group IA Phospholipase A2 with Metal Ions and Phospholipid Vesicles Probed with Deuterium Exchange Mass Spect rometry / J. E. Burke, N. J. Karbarz, R. A. Deems, S. Li, V. L. Woods, E. A. Dennis // Biochemistry. 2008. - Vol. 47. - PP. 6451-6459. doi: 10.1021/bi8000962

32.Bollinger J. G. Interfacial Binding of Bee Venom Secreted Phospholipase A2 to Membranes Occurs Predominantly by a Nonelectrostatic Mechanism / J. G.

Bollinger, K. Diraviyam, F. Ghomashchi, D. Murray, M. H. Gelb // Biochemistry.

2004. - Vol. 43. - PP. 13293 - 304. doi: 10.1021/BI049390I

33.Murakami M. A new era of secreted phospholipase A2 (sPLA2) / M. Murakami, H. Sato, Y. Miki, K. Yamamoto, Y. Taketomi // Journal of Lipid Research. 2015. - Vol. 56. - PP. 1248-1261. doi: 10.1194/jlr.R058123

34. Sato H. Metabolic regulation by secreted phospholipase A 2 / H. Sato, Y. Taketomi, M. Murakami // Inflammation and Regeneration. 2016. - Vol. 36. - PP. 7. DOI: 10.1186/s41232-016-0012-7

35.Nambi V. Lipoprotein-associated phos pho lipase A 2: Pathogenic mechanisms and clinical utility for predicting cardiovascular events / V. Nambi, C. M. Ballantyne // Current Athero sclerosis Reports. 2006. - Vol. 8. - PP. 374-381. doi: 10.1007/s11883-006-0034-8.

36.Lambeau G. Cloning and expression of a membrane receptor for secretory phospholipases A2 / G. Lambeau, P. Ancian, J. Barhanin, M. Lazdunski // Journal of Biological Chemistry. 1994. - Vol. 269. - PP. 1575-1578. doi: 10.1016/S0021-9258(17)42060-6

37.Hanasaki K. Phospholipase A2 receptor: a regulator of biological functions of secretory phospholipase A2 / Kohji Hanasaki, H. Arita // Prostaglandins & Other Lipid Mediators. 2002. - Vol. 68. - PP. 71-82. doi: 10.1016/S0090-6980(02)00022-9

38. Fry B.G. From genome to «venome»: Molecular origin and evolution of the snake venom proteome inferred from phylogenetic analysis of toxin sequences and related body proteins/ Bryan G Fry // Genome Research. 2005. - Vol. 15 (3). - PP. 403-420. doi: 10.1101/gr.3228405

39.Kini R.M. Structure-function relationships and mechanism of anticoagulant phospholipase A2 enzymes from snake venoms / R Manjunatha Kini // Toxicon.

2005. - Vol. 45 (8). - PP. 1147-1161. doi: 10.1016/j.toxicon.2005.02.018

40.Ackermann E. J. Ca(2+)-indepen dent cytosolic phospholipase A2 from macrophage-like P388D1 cells. Isolation and characterization / E. J. Ackermann,

E. S. Kempner, E. A. Dennis // Journal of Biological Chemistry. 1994. - Vol. 269 (12). - PP. 9227-9233. doi: 10.1016/S0021-9258(17)37098-9

41.Sedgwick S. G. The ankyrin repeat: a diversity of interactions on a common structural framework / S.G. Sedgwick, S.J. Smerdon // Trends Biochem. Sci. 1999. - Vol. 24 (8). - PP. 311-316. doi: 10.1016/s0968-0004(99)01426-7

42.Burke J. E. Phospholipase A2 structure/function, mechanism, and signaling / J. E. Burke, E. A. Dennis // Journal of Lipid Research. 2009. - Vol. 50. - PP. 237-242. doi: 10.1194/jlr.R800033-JLR200

43.Elimam H. Complementmediated Activation of Calciumindependent Phospholipase A2y role of protein kinases and phosphorylation / H. Elimam, J. Papillon, T. Takano, A. V. Cybulsky // Journal of Biological Chemistry. 2013. -Vol. 288 (6). - PP. 3871-3885. doi: 10.1074/jbc.M112.396614

44.Ramanadham S. Calcium-independent phospholipases A2 (iPLA2s) and their roles in biological processes and diseases / S. Ramanadham, T. Alo, J. W. Ashley, R. N. Bone, W. D. Hancock, X. Lei // Journal of Lipid Research. 2015. - Vol. 56 (9). -PP. 1643-1668. doi: 10.1194/jlr.R058701

45.Frei E. Phospholi pase A2 from sheep erythrocyte mem brane Ca2+ dependence and localization / E. Frei, P. Zahler // Biochimica et Bio physica Acta (BBA) -Biomem bra nes. 1979. - Vol. 550 (3). - PP. 450-463. doi: 10.1016/0005-2736(79)90148-2

46.Lopez-Vales R. Intracellular phospholipase A2 group IVA and group VIA play important roles in Wallerian degeneration and axon regeneration after peripheral nerve injury / R. Lopez-Vales, X. Navarro, T. Shimizu, C. Baskakis, G. Kokotos, V. Constantinou-Kokotou, D. Stephens, E. A. Dennis, S. David // Brain. 2008. -Vol. 131 (10). - PP. 2620-2631. doi: 10.1093/brain/awn188

47.Kramer R. M. Structure, function and regulation of Ca2+-sensitive cytosolic phospholipase A2 (cPLA2) / R. M. Kramer, J. D. Sharp // FEBS Letters. 1997. -Vol. 410 (1). - PP. 49-53. doi: 10.1016/s0014-5793(97)00322-0

48.Leslie C. C. Cytosolic phospholipase A2: physiological function and role in disease / Christina C. Leslie // Journal of Lipid Research. 2015. - Vol. 56 (8). - PP. 13861402. doi: 10.1194/jlr.R057588

49.Dessen A. Crystal structure of human cytosolic phospholipase A2 reveals a novel topology and catalytic mechanism / A. Dessen, J. Tang, H. Schmidt, M. Stahl, J. D. Clark, J. Seehra, W. S. Somers // Cell. 1999. - Vol. 97 (3). - PP. 349-360. doi: 10.1016/s0092-8674(00)80744-8

50.Murakami M. Lipoquality control by phospholipase A2 enzymes / Makoto Murakami // Proceedings of the Japan Academy, Ser. B. 2017. - Vol. 93 (9). - PP. 677-702. doi: 10.2183/pjab.93.043

51.Sun G. Y. Role of cytosolic phospholipase A2 in oxidative and inflam matory signaling pathways in different cell types in the central nervous system / G. Y. Sun, D. Y. Chuang, Y. Zong, J. Jiang, J. C. Lee, Z. Gu, A. Sti mo nyi // Molecular Neurobio logy. 2014. - Vol. 50. - PP. 6-14. doi: 10.1007/s12035-014-8662-4

52.Slotboom A. J. Regulation of phospholipase A2 activity by different lipid water interfaces / Arend J. Slotboom, C. E. Maria, H. Gerard // The journal of Biological Chemistry. 1977. - Vol. 252 (9). - PP. 2948-2951. DOI: 10.1016/S0021-9258(17)40453-4

53.Jain M. K. Kinetics of binding of phospholipase A2 to lipid/ water interfaces and its relationship to interfacial activation / M. K. Jain, I. Rogers, G. H. DeHaas // Biochemical et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1988. - Vol. 940 (1). -PP. 51-62. doi: 10.1016/0005-2736(88)90007-7

54.Verger R. Action of phospholipase A2 at interfaces /R. Verger, Maria C. E. Mieras, G. H. de Haas // The Kournal of biological chemistry. 1973. - Vol. 248 (11). - PP. 4023-4034

55.Van Dam-Mieras M. C. E. Regulation of Pancreatic Phospholipase A2 Activity by Different Lipid-Water Interfaces / M. C. E. van Dam-Mieras, A. J. Slotboom, H. M. Verheij, R. Verger, G. H. de Haas // Structure of Biological Membranes. 1977. - Vol. 34. - PP. 177-197. doi: 10.1007/978-1-4684-8127-3 11

56.De Maria L. Phospholipases and their industrial applications / L. Maria, J. Vind, K. M. Oxenboll, A. Svendsen, S. Patkar // Applied Microbiology and Biotechnology. 2007. - Vol. 74 (2). - PP. 290 - 300. doi: 10.1007/s00253-006-0775-x

57.Dijkstra J. Enzymatic degumming / Albert J. Dijkstra // European Journal of Lipid Science. 2010. - Vol. 112 (11). - PP. 1178-1189. doi: 10.1002/ejlt.201000320

58.Casado V. Phospholipases in food industry: a review / V. Casado, D. Martin, C. Torres, G. Reglero // Lipases and Phospholipases. 2012. - Vol. 861. - PP 495-523. doi: 10.1007/978-1-61779-600-5_29

59.Casas-Godoy L. Lipases: An Overview: Methods and Protocols / L. Casas-Godoy, S. Duquesne, F. Bordes, G, Sandoval, A. Marty // Methods in Molecular Biology. 2018. - Vol. 1835. - PP. 3-38. doi: 10.1007/978-1-4939-8672-9_1

60.Lilbaek H.M. Improving the yield of Mozzarella cheese by phospholipase treatment of milk / H. M. Lilbaek, M. L. Broe, E. Hoier, T. M. Fatum, R. Ipsen, N. K. S0rensen // Journal of Dairy Science. 2006. - Vol. 89. - PP. 4114-4125. doi: 10.3168/JDS.S0022-0302(06)72457-2

61.Karray A. Phospholipase A2 purification and characterization: a case study / Y. Gargouri, R. Verger, S. Bezzine // Methods in Molecular Biology. 2012. - Vol. 861. - PP. 283-297. doi: 10.1007/978-1-61779-600-5_17

62.Tanaka T. Recent developments in yeast cell surface display toward extended applications in biotechnology / T. Tanaka, R. Yamada, C. Ogino, A. Kondo // Applied microbiology and biotechnology. 2012. - Vol. 95 (3). - PP. 577 - 591. doi: 10.1007/s00253-012-4175-0

63.Stahl E. A. Dynamics of disease resistance polymorphism at the Rpm 1 locus Arabidopsis / Eli A. Stahl, G. Dwyer, R. Mauricio, M. Kreitman, J. Bergelson // Nature. 1999. - Vol. 400. - PP. 667-671. doi: 10.1038/23260 64.Kim S. H. Using decoys to expand the recognition specificity of a plant disease resistance protein / S. H. Kim, D. Qi, Y. Ashfield, M. Helm, R. Innes // Science. 2016. - Vol. 351 (6274). - PP. 684-687. doi: 10.1126/science.aad3436

65.Mansfeld J. Plant phospholipases A2: Perspectives on biotechnological applications / Johanna Mansfeld // Biotechnology Letters. 2009. - Vol. 31 (9). - PP. 1373 - 1380. doi: 10.1007/s10529-009-0034-1

66.Guo Z. Enzymatic modification of phospholipids for functional applications and human nutrition / Z. Guo, A. F. Vikbjerg, X. Xu // Biotechnolgy Advances. - Vol. 23 (3). - PP. 203-259. doi: 10.1016/j.biotechadv.2005.02.001

67.Kramer R. M. Structure and properties of a human non-pancreatic phospholipase A2 / C. Hession, B. Johansen, G. Hayes, P. McGray, E. P. Chow, R. Tizard, R. B. Pepinsky // Journal of Biological Chemistry. 1989. - Vol. 264 (10). - PP. 57685775. doi: 10.1016/s0021-9258(18)83616-x

68.Roberts I. N. Heterologous gene expression in Aspergillus niger: a glucoamylase-porcine pancreatic prophospholipase A2 fusion protein is secreted and processed to yield mature enzyme / I. N. Roberts, D. J. Jeenes, D. A. MacKenzie, A. P. Wilkinson, I. G. Sumner, D. B. Archer // Gene. 1992. - Vol. 122 (1). - PP. 155161. doi: 10.1016/0378-1119(92)90043-o

69.Liu A. Streptomyces violaceoruber phospholipase A2: expression in Pichia pastoris, properties, and application in oil degumming / A. Liu, Y. Xiao-Wei, C. Sha, Y. Xu // Applied Biochemistry and Biotechnology. 2015. - Vol. 175. - PP. 3195-3206. doi: 10.1007/s12010-015-1492-7

70.Yu X. Identification of novel factors enhancing recombinant protein production in multicopy Komagataella phaffii based on transcriptomic analysis of overexpression effects / Xiao-Wei Yu, W-H. Sun, Y. Z. Wang, Y. Xu // Scientific Reports. 2017. - Vol. 7. - PP. 12. doi: 10.1038/s41598-017-16577-x

71.Sugiyama M. A novel prokaryotic phospholipase A2 - Characterization, gene cloning, and solution structure / N. A. Sugiyama, K. Ohtani, M. Izuhara, T. Koike, K. Suzuki, S. Imamura, H. Misaki // Journal of Biological Chemistry. 2002. - Vol. 277 (22). - PP. 20051-8. doi: 10.1074/jbc.M200264200 72.Stasyk O. Methylotrophic Yeasts as Producers of Recombinant Proteins / Oleh Stasyk // Biotechnology of Yeasts and Filamentous Fungi. 2017. - PP. 325-350. doi: 10.1007/978-3-319-58829-2 11

73.Sujin K. Promoters inducible by aromatic amino acids and y-aminobutyrate (GABA) for metabolic engineering applications in Saccharomyces cerevisiae / K. Sujin, L. Kyusung, B. Sang-Jeong, J. Hahn // Applied Microbiology and Biotechnology. 2015. - Vol. 99. - PP. 2705-2714. doi: 10.1007/s00253-014-6303-5

74.Kim H. Yeast synthetic biology for the production of recombinant therapeutic proteins / H. Kim, S. J. Yoo, H. A. Kang // FEMS Yeast Res. 2015. - Vol. 15 (1). -PP. 1-16. doi: 10.1111/1567-1364.12195

75.Petranovic D. Prospects of yeast systems biology for human health: integrating lipid, protein and energy metabolism / D. Petranovic, K. Tyo, G. Vemuri, J. Nielsen // FEMS Yeast Res. 2010. - Vol. 10 (8) 1046-1059. doi: 10.1111/j.1567-1364.2010.00689.x

76.Darby R. A. Which yeast species shall I choose Saccharomyces cerevisiae versus Pichia pastoris / Richard A. J. Darby, S. P. Cartwright, M. V. Dilworth, R. M. Bill // Methods Mol Biol. 2012. - Vol. 866. - PP. 11-23. doi: 10.1007/978-1-61779-770-5_2.

77. Sudbery P. E. The expression of recombinant proteins in yeast / Peter e. Sudbery // Current Opinion Biotechnology. 1996. - Vol. 7 (5). - PP. 517-524. doi: 10.1016/s0958-1669(96)80055-3

78.Mattanovich D. Recombinant protein production in yeasts / D. Mattanovich, P. Branduardi, L. Dato, B. Gasser, M. Sauer, D. Porro // Methods Mol Biol. 2012. -Vol. 824. - PP. 329-358. doi: 10.1007/978-1-61779-433-9_17

79.Sturmberger L. Refined Pichia pastoris reference genome sequence / L. Sturmberger, T. Chappell, M. Geier, F. Krainer, K. Day, U. Vide, S. Trstenjak, A. Schiefer, T. Richardson, L. Soriaga, B. Darnhofer, R. Birner-Gruenberger, B. Glick, I. Tolstorukov, J. Cregg, K. Madden, A. Glieder // Journal of Biotechnology. 2016. - Vol. 235. - PP. 121-131. doi: 10.1016/j.jbiotec.2016.04.023

80.Cereghino G.P.L. Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris / Geoff P. Lin Cereghino, J. L. Cereghino, C. Ilgen, J. M.

Cregg // Curr Opin Biotechnol. 2002. - Vol. 13. - PP. 329-332. doi: 10.1016/s0958-1669(02)00330-0

81.Cregg J. Expression in the yeast Pichia pastoris / J. Cregg, I. Tolstorukov, A. Kusari, J. Sunga, K. Madden, T. Chappell // Methods in enzymology. 2009. - Vol. 463. - PP. 169 - 189. doi: 10.1016/S0076-6879(09)63013-5

82.Macauley-Patrick S. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system / S. Macauley-Patrick, M. L. Fazenda, B. McNeil, L. M. Harvey // Yeast. 2005. - Vol. 22 (4). - PP. 249-270. doi: 10.1002/yea.1208.

83.Waterham H. R. Isolation of the Pichia pastoris glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene and regulation and use of its promoter / H. R. Waterham, M. E. Digan, P. J. Koutz, J. M. Cregg // Gene. 1997. - Vol. 186 (1). - PP. 37-44. doi: 10.1016/s0378-1119(96)00675-0

84.Bano M. C. Beta-galactosidase activity assay for yeast / M. C. Babo, J. C. Igual, I. Quilis // Protocol Exchange. 2019

85.De Schutter K. Genome sequence of the recombinant protein production host Pichia pastoris / K. De Schutter, Y-C. Lin, P. Tiels, A. V. Hecke, S. Glinka, J. Weber-Lehmann, P. Rouze, Y. V. Peer // Nature Biotechnology. 2009. - Vol. 27. -PP. 561-566. doi: 10.1038/nbt. 1544

86.Sturmberger L. Refined Pichia pastoris reference genome sequence / T. Chappell, M. Geier, F. Krainer, K. J. Day, U. Vide, S. Trstenjak, A. Schiefer, T. Richardson, L. Soriaga, B. Darnhofer, R. Birner-Gruenberger, B. S. Glick, I. Tolstorukov, J. Cregg, K. Madden, A. Glieder // Journal of Biotechnology. 2016. - Vol. 235. - PP. 121-131. doi: 10.1016/j.jbiotec.2016.04.023 87.Cereghino J. L. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris / J. L. Cereghino, J. M. Cregg // FEMS Microbiology Reviews. 2000. -Vol. 24. - PP. 45-66. doi: 10.1111/J.1574-6976.2000.TB00532.X 88.Ozimek P. Alcohol oxidase: a complex peroxisomal, oligomeric flavoprotein / P. Z. Ozimek, M. Veenhuis, J. Van der Klei // FEMS Yeast Research. 2005. - Vol. 5. - PP. 975 - 983. doi: 10.1016/J.FEMSYR.2005.06.005

89.Horiguchi H.Antioxidant System within Yeast Peroxisome; Biochemical and Physiological Characterization of CbPmp20 in the methylotrophic yeast Candida boidinii / H. Yurimoto, N. Kato, Y. Sakai // The Journal of Biological Chemistry. 2001. - Vol. 276 (17). - PP. 14279-14288. doi: 10.1074/jbc.M011661200

90.Van der Klei Ida J. The significance of peroxisomes in methanol metabolism in methylotrophic yeast / H. Yurimoto, H. Yurimoto, Y. Sakai, M. Veenhuis // Biochimica et Biophysica Acta. 2006. - Vol. 1763 (12). - PP. 1453-1462. doi: 10.1016/j.bbamcr.2006.07.016

91.Sakai Y. Regulation of peroxisomal proteins and organelle proliferation by multiple carbon Sources in the methylotrophic yeast, Candida boidinii / Y. Saki, H. Yurimoto, H. Matsuo, N. Kato // Yeast. 1998. - Vol. 14. - PP. 1175-1187. doi: 10.1002/(SICI)1097-0061(19980930)14:13<1175::AID-YEA319>3.0.CO;2-7 92.Negruta O. Methylotrophic yeasts: Diversity and methanol metabolism / O. Negru, O. Csutak, I. Stoica, E. Rusu, T. Vassu // Romanian Biotechnological Letters. 2010.

- Vol. 15 (4). - PP. 5369 - 5375

93.Sibirny A. A. Reactions of Direct Formaldehyde Oxidation to C02 Are Nonessential for Energy Supply of Yeast Methylotrophic Growth / A. A. Sibirny, V. M. Ubiyvovk, M. V. Gonchar, V. I. Titorenko, A. Y. Voronovsky, Y. G. Kapultsevich, K. M. Bliznik // Archives of Microbiology. 1990. - Vol. 154 (6). -PP. 566-575. doi: 10.1007/BF00248838 94.Sakai Y. Yap1-Regulated Glutathione Redox System Curtails Accumulation of Formaldehyde and Reactive Oxygen Species in Methanol Metabolism of Pichia pastoris / Y. Sakai, H. Yasuyoshi, E. Takigami, T. Yano // Eukaryotic Cell. 2009.

- Vol. 8 (4). - PP. 540-549. doi: 10.1128/EC.00007-09

95.Yurimoto H. Assimilation, dissimilation, and detoxification of formaldehyde, a central metabolic intermediate of methylotrophic metabolism / N. Kato, Y. Sakai // The Chemical Record. 2005. - Vol. 5 (6). - PP. 367-375. doi: 10.1002/tcr.20056

96.Brierley R. A. Fermentation development of recombinant Pichia pastoris expressing the heterologous gene: bo-vine lysozyme / R. A. Brierley, C. Bussineau, R. Kosson, A. Melton, R. S. Siegel // Annals of the New York Academy of

Sciences. 1990. - Vol. 589 (1). - PP. 350-362. doi: 10.1111/j.1749-6632.1990.tb24257.x

97.Dagar V. K. Combined effect of gene dosage and process optimization strategies on highlevel production of recombinant human interleukin-3 (hIL-3) in Pichia pastoris fed-batch culture / V. K. Dagar, Y. P. Khasa // Journal of Biological Macromolecules. 2018. - Vol. 108. - PP. 999-1009.

98.Zhang W. Fermentation Strategies for Recombinant Protein Expression in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris / W. Zhang, M. Inan, M. Meagher // Biotechnology and Bioprocess Engineering. 2000. - Vol. 5 (4), - PP. 275-287. doi: 10.1007/BF02942184

99.Curless C. Phosphate glass as a phosphate source in high cell density Escherichia coli fermentations / C. Curless, J. Baclaski, R. Sachdev // Biotechnology Progress 1996. - Vol. 12: - PP. 22-25. doi: 10.1021/bp9500369

100. Liu W. Demonstration-Scale High-Cell-Density Fermentation of Pichia pastoris / Wan-Cang Liu, P. Zhu // Methods in Molecular Biology. 2018. - Vol. 1674. - PP. 109-116. doi: 10.1007/978-1-4939-7312-5_9

101. Chiruvolu V. Effects of glycerol concentration and pH on growth of recombinant Pichia pastoris / K. M. Eskridge, J. M. Cregg, M. M. Meagher // Applied Biochemistry and Biotechnology. 1998. - Vol. 75 (1). - PP. 163-173. doi: 10.1007/BF02787771

102. Stratton J. High cell-density fermentation / J. Stratton, V. Chiruvolu, M. Meagher // Methods in Molecular Biology. 1998. - Vol. 103. - PP. 107-120. doi: 10.1385/0-89603-421-6:107

103. Chiruvolu V. Recombinant protein production in an alcohol oxidase-defective strain of Pichia pastoris in fed-batch fermentations / V. Chiruvolu, J. M. Cregg, M. M. Meagher // Enzyme and Microbial Technology. 1997. - Vol. 21. - PP. 277-283. doi: 10.1016/S0141-0229(97)00042-2

104. Ohashi R. High-level expression of the methanol-inducible beta-galactosidase gene by perfusion culture of recombinant Pichia pastoris using a shaken ceramic membrane flask / R. Ohashi, E. Mochizuki, Y. Kamoshita, T.

Suzuki // Journal of Fermentation and Bioengineering. 1998. - Vol. 86 (1). - PP. 44-48. doi: 10.1016/S0922-338X(98)80032-9

105. Chen Y. Continuous production of thrombomodulin from a Pichia pastoris fermentation / Yinliang Chen, J. Krol, J. Cino, D. Freedman, C. White, E. Komives // Journal of Chemical Technology & Biotechnology. 1996. - Vol. 67 (2). - PP. 143-148. doi: 10.1002/(SICI)1097-4660(199610)67:2<143::AID-JCTB561>3.0.CO;2-S

106. Mood M. J. Production of large quantities of isotopically labeled protein in Pichia pastorisby fermentation / Matthew J. Wood, E. A. Komives // Journal of Biomolecular NMR. 1999. - Vol. 13. - PP. 149-159. doi: 10.1023/A:1008398313350

107. Kurtzman C. P. Description of Komagataella phaffii sp. nov. and the transfer of Pichia pseudopastoris to the methylotrophic yeast genus Komagataella / Cletus P. Kurtzman // International journal of systematic and evolutionary microbiology. 2005. - Vol. 55 (2). - PP. 973-976. doi: 10.1099/ijs.0.63491-0

108. Lin-Cereghino G. P. Mxr1p, a Key Regulator of the Methanol Utilization Pathway and Peroxisomal Genes in Pichia pastoris / G. P. Lin-Cereghino, L. Godfrey, B. J. de la Cruz, S. Johnson, S. Khuongsathiene, I. Tolstorukov, M. Yan, J. Lin-Cereghino, M. Veenhuis, S. Subramani, J. M. Cregg // Molecular and Cellular Biology. 2006. - Vol. 26 (3). - PP. 883-897. doi: 10.1128/MCB.26.3.883-897.2006

109. European Commission Safety evaluation of the food enzyme Phospholipase A2 from the genetically modified Trichoderma reeseistrainRF8793 / V. Silano, J. M. Barat, C. Bolognesi, P. S. Cocconcelli, R. Crebelli, D. M. Gott, K. Grob, E. Lampi, A. Mortensen, G. Rivieere, I. Steffensen, C. Tlustos, H. V. Loveren, L . Vernis, H. Zorn, B. Glandorf, L. Herman, J. Aguilera, M. Andryszkiewicz, Y. Liu, S. Rainieri, A. Chesson // EFSA Journal. 2020. - Vol. 18 (11). - PP 6310-6323. doi: 10.2903/j.efsa.2020.6310

110. Способ выделения фосфолипазы А2: пат. 8416 BY, МПК C 12N 9/16 / Н. М. Литвико; заявитель и патентообладатель Государственное научное

учреждение "Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси" - № 20001171; заявл. 27.12.2000; опубл. 30.08.2006; бюл. № 6.

111. Способ выделения фосфолипазы а2 из яда кобры: пат. 1188948 SU, МПК A61K 37/48 / А. А. Тара, Ю. Р. Сийгур, А. А. Аавиксаар; заявитель и патентообладатель Институт химической и биологической физики АН ЭССР и Опытный завод органического синтеза биопрепаратов Института химии АН ЭССР - № 3718820; заявл. 02.04.1984; опубл. 30.11.1990; бюл. № 44.

112. Phospholipase and method of producing it: Pat. W02004097012 DK, IPC A21D 8/04 2006.1; A23C 19/032 2006.1; C12N 9/20 2006.1 / M. A. Stringer, T. M. Fatum, S. A. Patkar; applicants Novozymes, CHR. Hansen - № PCT/DK2004/000279; International filing date 23.04.2004; Publication date 11.11.2004

113. Biochemical conversions by yeast fermentation at high cell densities: Pat. 4617274A US, IPC С12Т 1/16 / E. H. Wegner, B. Okla; Burns Philp Food Inc - № 534,848; International filing date 22.09.1983; Publication date 14.10.1986

ПРИЛОЖЕНИЯ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕС КОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И

МЕТРОЛОГИИ

Федеральное бюджетное учреждение «Государственный региональный центр стандартизации, метрологии и испытаний

в Воронежской области»

394018. г. Воронеж, ул. Станкевича, д. 2 тел./факс: [phone]-09

СВИДЕТЕЛЬСТВО

об аттестации методики измерений Л» 142/09-01.00272-2020

Методика (метод) определения остаточной активности фермента фосфолнпаш А2

титриметрнческим методом

Разработанная ООО «Инновационный центр «Ьнрюч-новыс технологии» в г.Алексеевка Белгородской обл. и регламентированная в документе Желток яичный ферментированный. Определение остаточной активности фермента фосфолипаза А2 т нтриметрнческнм методом Год утверждения 2020 Количество страниц 11

Аттестована в соответствии с ГОСТ Р 8.56Л-2009

Аттестация осуществлена по результатам метрологической экспертизы материалов по разработке методики измерений

В результате аттестации установлено, что методика измерений соответствует предъявляемым к ней метрологическим требованиям и обладает следующими основными метрологическими характеристиками:

Таблица I - Диапазон измерений, границы абсолютной погрешности, значения предела повторяемости и критической разности

Наименование показателя Диапазон измерения. % Границы абсолютной погрешности, ±Д,% Предел повторяемости, (абс. значение), Критическая разность, (абс.значение), СО0.95,%

Массовая доля свободных жирных кислот н жире яичного желтка в пересчёте на олеиновую кислоту 2,0- 14,0 включ. 0,5 03 0.9>

Дата выдачи свидетельства 30 нюня 2020 г,

И.о. директора, заместитель директора по метрологии *

П.В. Воронин

2 В холе проверки установлено:

2.1 Партия № 1 экспериментальных образцов пищевой продукции, полученной с использованием экспериментальных образцов ЦП1, наработана в соответствии с рецептурой 6А производства жидкого ферментированного яичного желтка с солью.

2.2 Партия № 1 экспериментальных образцов пищевой продукции, полученной с использованием экспериментальных образцов ЦП 1, исследована в соответствии с «Программа и методика оценки экспериментальной пищевой продукции, полученной с использованием экспериментальных образцов ЦП1».

Параметры качества соответствуют ожидаемым, приведенным в указанном документе, и отражены в «Протоколе оценки качества экспериментальной партии пищевой продукции, полученной с использованием экспериментальных образцов ЦП1 Партия №1 от 17 декабря.

3 Заключение комиссии:

В ходе исследований получена Партия № 1 экспериментальной партии пищевой продукции, полученная с использованием экспериментальных образцов ЦП1, пригодная для дальнейших исследований.

Комиссия в составе:

1. Объект исследования: опытный образец пищевой продукции из партии № 1, полученной с использованием фермента Р1.А2

2. Цель исследования: испытания для оценки качества пищевой продукции

из партии №1, полученной с использованием фермента РЬА2

4. Дата окончания экспериментальных исследований: «06» декабря

5. Место проведения исследования: ООО «ИЦ «Бирюч-НТ»

6. Нормативный документ, по которому проводились исследования

«Программа и методика оценки качества пищевой продукции»

7. Результаты исследования

Наименование показателя Метод анализа Требования Результаты Заключе нне

1 2 3 4 5

Внешний вид ГОСТ 30363-2013 Однородный продукт, без посторонних примесей, остатков скорлупы, пленок. Однородный продукт, без посторонних примесей, остатков скорлупы, пленок. Соответствует

Консистенция ГОСТ 30363-2013 Жидкая в охлажденном или размороженно мсостоянии Жидкая в охлажденном или размороженно м состоянии Соответст вует

Цвет ГОСТ 30363-2013 От светлого до оранжевого Желто-орапжевый Соответст вует

Запах и вкус ГОСТ 30363-2013 Свойственные яичному, без посторонних запаха и окуса Свойственные яичному, без посторонних запаха и вкуса Соответст вует

Массовая доля сухого вещества, %, не менее ГОСТ 30363-2013 46 48,7 Соответст вует

Массовая доля жира, %, не менее ГОСТ 30363-2013 26 26,2 Соответст вует

Массовая доля белковых веществ, %, не менее ГОСТ 30363-2013 13 13,7 Соответст вует

Массовая доля хлористого натрия, % ГОСТ 30363-2013 6,0-8,0 7,9 ^ Соответст вует

Массовая доля свободных жирных кислот, % ГОСТ 30363-2013 7,0-14,0 8,9 Соответст вует

Альфа-амнлазный тсст ГОСТ 30363-2013 Отрицательный Отрицательный Соответст вует

Посторонние примеси ГОСТ 30363-2013 Не допускаются Не обнаружены Соответст вует

БГКН, в 0,1 г ГОСТ 32149-2013 Не допускается Не обнаружены Соответст вует

КМАФАяМ, КОЕ/г, не более ГОСТ 32149-2013 S.OxlO2 9,0x10' Соответст вует

Патогенные, в т.ч. Salmonellae, в 25г ГОСТ 32149-2013 Не допускается Не обнаружены Соответст вует

S.aureus, в 1.0 г ГОСТ 32149-2013 Не допускается Не обнаружены Соответст вует

Протей, в 1,0 г ГОСТ 32149-2013 Не допускается Не обнаружены Соответст вует

Мезофильные молочнокислые бактерии. КОЕ/г ГОСТ 10444.112013 Не допускается Не обнаружены Соответст вует

Дрожжи и плесени, КОЕ/г, не более ГОСТ 10444.122013 l.OMO1 Не обнаружены Соответст вует

Срок годности: при температуре от +4 до +20 С, суток ГОСТ 30363-2013 28 28 Соответст вует

8. Замечания и рекомендации: отсутствуют.

9. Заключение: объект исследования - опытный образец пищевой продукции из партии № I, полученной с использованием фермента РЬА2, по всем показателям качества соответствует требованиям. Исследования прояодигси:

- Руководитель проекта Биотехнология С.В.Кирьянова

- Биотехнолог 2 категории И.В.Василевич

(подпись.)

- Биотехнолог 3 категории Е.И.Самойлова

Общество с ограниченной ответственностью «Инновационный центр «Бирюч - Новые Технологии»

УТВЕРЖДАЮ

Программа испытаний на соответствие техническим требованиям пищевой продукции, полученной с использованием

фермента РЬЛ2

Испытания на соответствие техническим требованиям образцов фермента РГА2 проводят по следующим показателям:

1. Согласно методике, описанной в ГОСТ 30363-2013 «Продукты яичные жидкие и сухие пищевые. Технические условия.» проводят исследования следующих показателей:

• Внешний вид

• Консистенция

• Цвет

• Запах и вкус

• Массовая доля сухого вещества

• Массовая доля жира

• Массовая доля белковых веществ

• Массовая доля хлористого натрия

• Массовая доля свободных жирных кислот

• Лльфа-амилазный тсст

• Посторонние примеси

2. Согласно методике, описанной в ГОСТ 32149-2013 «Межгосударственный стандарт. Иишсвыс продукты переработки яиц сельскохозяйственной птицы. Методы микробиологического анализа.» проводят исследования следующих показателей:

• Б1ТСГ1

• КМЛФЛнМ, КОЕ/г

• Патог енные, в т.ч. Salmonellae

• S.aureus

• Протей

3. Согласно методике, описанной в ГОСТ 10444.11-2013 «Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Методы выявления и подсчета количества мезофильных молочнокислых микроорганизмов.» проводят исследования следующего показателя:

• Мезофильные молочнокислые бактерии, КОЕ/г

4. Согласно методике, описанной в ГОСТ 10444.12-2013 «Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Методы выявления и подсчета количества дрожжей и плесневых грибов.» проводят исследования следующего показателя:

• Дрожжи и плесени, КОЕ/г

Описание методик, которые применялись при испытаниях на соответствие техническим требованиям образцов фермента PLA2 прилагается к протоколу испытаний на соответствие техническим требованиям фермента PLA2 в «Программа и методика оценки качества пищевой продукции, полученной с использованием фермента PLA2»